Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование полимеризации прионных белков дрожжей in vivo методом полуденатурирующего электрофореза

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование полимеризации прионных белков дрожжей in vivo методом полуденатурирующего электрофореза"

На правах рукописи

АЛЕКСАНДРОВ ИЛЬЯ МИХАЙЛОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ ПРИОННЫХ БЕЛКОВ ДРОЖЖЕЙ IN VIVO МЕТОДОМ ПОЛУДЕНАТУРИРУЮЩЕГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2006

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Института экспериментальной кардиологии Федерального Государственного учреждения «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, г. Москва.

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук, в.н.с. В. В. Кушннров Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, член корреспондент РАН О. А. Донцова кандидат биологических наук А. А. Белогуров

Ведущая организация: ФГУП ГосНИИ Генетика

Защита состоится «26» октября 2006 года в 11 часов на заседании диссертационного совета К 208.073.02 в ФГУ РКНПК Росздрава по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская улица, 15 А.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института экспериментальной кардиологи ФГУ РКНПК Росздрава.

Автореферат разослан «25» сентября 2006 года.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Венгерова Т.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Прионы — это инфекционные агенты белковой природы, вызывающие неизлечимые нейродегенеративные заболевания человека и животных, такие как болезнь Крейцфельда-Якоба, синдром Герстмана-Штраусслера-Шейнкера, скрэйхш овец и губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота, также известная как коровье бешенство. Эти заболевания сопровождаются морфологическими изменениями тканей мозга и появлением в них амилоидоподобных структур, содержащих фибриллярные нерастворимые белковые агрегаты, которые и представляют собой инфекционное начало. Это придает им сходство с, так называемыми, амилоидными нейродегенеративными заболеваниями (болезнь Хантингтона, Альцгеймера, Паркинсона и т.д.), при которых также происходит образование подобных структур. Необходимо добавить, что все заболевания такого рода на данный момент неизлечимы и являются смертельными для человека.

Обнаружение прионных белков у низших эукариот существенным образом расширило представление о феномене прионов. Стало ясно, что это не просто принципиально новое, но и достаточно общее явление, встречающееся у различных организмов. Изучение дрожжевых прионов дало дополнительную информацию о явлении в целом, а также подтвердили принципиальное сходство прионов с амилоидными фибриллами. В настоящее время прионно-амилоидный феномен интенсивно изучается во -многих лабораториях, возрастает список болезней, для которых подтверждена амилоидная природа.

У дрожжей и грибов существование белков с прионными свойствами, по всей видимости, имеет адаптивное значение. Обнаруживаются новые прионоподобные и амилоидные белки млекопитающих, участвующих в различных биологических процессах. Весьма вероятно, что подобные белки распространены еще более широко, чем известно сейчас.

Прионы дрожжей явились весьма удобной модельной системой для изучения явления прионов в целом. Они имеют неоспоримые преимущества перед животными системами по скорости постановки экспериментов, доступности и безопасности для исследователей. Можно надеяться, что результаты, полученные в дрожжевой системе, будут использованы в дальнейшем для исследования прионных свойств патогенных белков, вызывающих прионные или амилоидные заболевания человека и животных, а также прионоподобных белков, имеющих значение для жизнедеятельности клетки.

Центральным моментом в исследовании поддержания прионного состояния белков в клетке является понимание динамики их полимеризации и разборки прионных фибрилл. Однако, представления о механизмах полимеризации, фрагментации, структуре фибрилл и т.д. до сих пор не сформировано. Таким образом, весьма актуальной представляется попытка найти новые подходы к исследованию структурной организации прионных и прионоподобных агрегатов. Новая информация в этой области весьма важна для понимания связи структуры фибрилл с динамикой их полимеризации/разборки и роли различных факторов в регуляции этих процессов.

Цели и задачи работы. Целью настоящей работы являлось исследование полимеризации различных прионных белков. Для достижения этой цели были поставлена следующая задача:

Разработать метод определения размера прионных полимеров и использовать его для:

1. Анализа структурной организации прионных агрегатов белка Бир35 дрожжей БассЪаготусез сеге^гае.

2. Изучения зависимости параметров полимеризации прионов от уровня шаперона НэрКМ.

3. Изучения полимеризации белков, содержащих полиглутаминовые области.

4. Исследования влияния на полимеризацию белков остатков тирозина в их полиглутаминовых областях.

Научная новизна и практическая значимость работы. В результате данной работы были разработаны способы выявления прионных и амилоидных белков дрожжей и млекопитающих и методы анализа их размеров. Методы позволили обнаружить новую структурную единицу прионного макроагрегата белка 8ир35 - прионный полимер, размером 10-50 мономеров. Показано, что подобные полимеры могут менять свой размер в зависимости от различных физиологических условий. Исследовано влияние шаперона Шр104 на размер полимеров 8ир35. Показано, что дестабилизация наследования приона в результате изменения уровня Нзр104 сопровождаются изменением размера прионных полимеров. С помощью новой методики белкового электрофореза в агарозном геле впервые исследована динамика агрегации белков, содержащих искусственные полиглутаминовые домены ро1у(370, ро!уС?85 и ро1у(261 У15. Показано, что наличие тирозиновых остатков сильно повышает узнавание и фрагментацию прионных полимеров полиглутаминовых белков шапероном Нзр104. Обнаружено, что белки Бир35 Р. теЛапоИса, РиЫ, а также белки, содержащие

полиглутаминовые фрагменты, способны образовывать в клетках дрожжей прионоподобные полимеры. Данный метод можно использовать для исследования прионных и амилоидных белков разных организмов, а также для быстрого выявления прионоподобного состояния белков-кандидатов. На сегодняшний день данный метод и используется во многих лабораториях мира, занимающихся прионной и амилоидной тематикой.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на межлабораторном семинаре Института экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Росздрава (2006); Третьем съезде биохимического общества, Санкт-Петербург, Россия, июнь 2002; III съезде ВОГиС 6-12 июня 2004, Москва; 8-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых 17-21 мая 2004г., Пущино; 2nd International Yeast Prion Meeting. Calistoga, CA, USA. 25-28 Aug. 2002; XXIst International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, Gothenburg, Sweden, July 2003; FEBS International Summer School on "Molecular Mechanisms in Homeostasis and Disease", Spetses, Greece, Sept 2003; EURESCO Conference "Biology of Molecular Chaperones. Mechanisms and regulation of chaperones" Tomar, Portugal, Aug 2003; 14th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Prague, Czech Republic, 1-4 May 2004; HHMI Meeting of International Research Scholars, Merida, Mexico, June 22 - 25,2005; Prion Biology - Joint Cold Spring Harbor Laboratory/ Wellcome Trust Conference, Hinxton, UK, September 7- 11,2005

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи и 10 тезисных сообщений, 1 статья находится в печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Результаты», «Обсуждение», «Материалы и методы», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 121 страницах и включает 16 рисунков и список литературы, содержащий 163 ссылки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы S. cerevisiae, Е. coli и культура клеток человека. В работе использовали штаммы дрожжей: 5V-H19 (МАТа ade2-l SUQ5 canl-100 Ieu2-3,U2 ura3-52 [PSf] или /psfJXDagkesamanskaya and Ter-Avanesyan 1991); 74-D694 (MATar игаЗ-52 leu2-3,112 trpl-289 his3-A200 adel-lA) (Chernoff et. al., 1995) [делеции генов SUP35, RNQln HSP104 в этом штамме получены в данной работе]; BY4742 (MAT« his3 А 1еи2 A lys2 А игаЗ Atrpl )

(Meriin et. al., 2003). В работе использовали стандартные методы генетики дрожжей (Sherman et al., 1986). Трансформацию дрожжей S. cerevisiae проводили согласно опубликованным протоколам (Gietz et al., 1995). Трансформацию Е. coli DH5a (Sambrook et al., 1989) осуществляли в соответствие с методом Inoue et al. (1990). В работе использовали человеческую эмбриональную почечную культуру клеток — НЕК293. Конструирование плазмид осуществляли согласно методам, описанным ранее (Sambrook et al., 1989). Электрофорез белков в полиакриламидном геле проводили по методике, описанной Лэммли (Laemmli, 1970). Для электрофоретического разделения прионных полимеров использовали разработанный в данной работе метод SDD-AGE (semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis) (Kryndushkin et al., 2003). Для анализа белков методом иммуноблоттинга проводили их электрический перенос на нитроцеллюлозную мембрану или вакуумный перенос на мембрану PVDF для метода SDD-AGE.

Для выявления детерминанта [PiS*/] использована генетическая система, основанная на супрессии мутации ade2-l и adel-14. Эта система позволяет определять наличие детерминанта [PSf] визуально по фенотипу колоний. Колонии клеток, не содержащих детерминант [PST4"], то есть [рлГ], имеют красный цвет и не растут на среде без аденина. Колонии клеток [PS/"] имеют розовый или белый цвет в зависимости от варианта [PST*] и растут при отсутствии аденина в среде.

Для изгнания детерминанта [AST*] клетки выращивали на среде, содержащей ЗмМ гидрохлорида гуанидина (Tuite et al., 1981).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ структурны* свойств прионных агрегатов белка Sup35. Обнаружение того, что белок Sup35 образует in vitro фибриллы амилоидного типа (Glover et.al, 1997) позволило предположить, что прионные агрегаты в клетках дрожжей состоят из аналогичных фибрилл. До начала нашей работы вся информация о структуре фибрилл Sup35 была получена для фибрилл, образованных in vitro. Взаимосвязь прионных агрегатов, обнаруживаемых в клетках дрожжей, и амилоидных фибрилл, образованных in vitro, продемонстрирована не была. Для анализа прионных частиц в клетках дрожжей в основном использовались два метода: ультрацентрифугирование в градиенте сахарозы и анализ химерных прионных белков, сшитых с зеленым флуоресцирующим белком (GFP). Оба метода позволяют определять только наличие прионных агрегатов в клетке.

Единственным белком, помимо Sup35, необходимым для поддержания состояния [AS/*-] является шаперон Hspl04 (Chemoff et al., 1995). Ранее в нашей лаборатории была

предложена модель, согласно которой Hspl04 осуществляет фрагментацию прионных фибрилл, что является необходимым, как для их дальнейшего роста, так и для передачи в дочерние клетки. Исходя из этой гипотезы, мы предположили, что дрожжевые прионные агрегаты состоят из фрагментируемых фибрилл амилоидного типа, подобных фибриллам Sup35, наблюдаемым in vitro.

В задачу настоящего исследования входила проверка данной модели и ее уточнение, для чего потребовалась разработка принципиально нового метода.

Первой задачей, которую требовалось решить, было нахождение условий, которые могли бы разрушить связи между прионными агрегатами и другими белками, но не затрагивали внутри-прионные взаимодействия. Для этого нами были опробованы различные агенты, такие как мочевина, высокая концентрация соли (KCl), гуанидин гидрохлорид и различные ионные и неионные детергенты в частности N-лаурил саркозил, додецил сульфат натрия (SDS). Лучшие результаты по очистке прионных агрегатов были достигнуты при обработке SDS при комнатной температуре. Для анализа размера прионных частиц мы использовали электрофорез как наиболее точный и технологичный подход к такому анализу. Полиакриламидные гели оказались непригодными для данного анализа в виду большого размера прионных частиц, поэтому в качестве форетической среды был использован агарозный гель. Использование SDS оказалось не только необходимым, но и удобным обстоятельством, поскольку SDS, связываясь с белковыми частицами, придает им электрофоретическую подвижность приблизительно пропорциональную массе частиц. SDS также обеспечивает разборку подавляющего большинства макромолекулярных комплексов и, таким образом обеспечивает «очистку» прионных агрегатов от связанных с ними белков. При этом прионные агрегаты устойчивы к SDS, то есть не распадаются на мономеры. Этот метод был назван «Полуденатурирующим электрофорезом в агарозном геле» (SDD AGE; «Semi-Denaturating Detergent Agarose Gel Electrophoresis»). Таким образом, прионные агрегаты в лизатах клеток дрожжей устойчивы к обработке SDS, что подтверждает их сходство с амилоидами, образованными in vitro.

Стандартный эксперимент проводили следующим образом: клетки выращивали в жидкой среде до логарифмической фазы и готовили лизат. Перед электрофорезом добавляли буфер для образцов, содержащий 2% SDS, используемый для ПААГ электрофореза, инкубировали 10 мин. при 37°С и наносили на горизонтальный 1,8% агарозный гель. После электрофореза проводили блотганг и иммуноокрашивание антителами к исследуемому белку. В результате были обнаружены прионные агрегаты в виде широкой полосы, с достаточно четкими границами сверху и снизу (Рис. 1).

[,psr][psr]\j>sr]

200 кДа

j

Кип

740 кДа

4200 кДа

Рисунок 1. Прионный бело к Sup35 образует высокомолекулярные прионные полимеры. Анализ лизатов клеток [PSI*] и [psf] с помощью SDD электрофореза в агарозном геле. Иммуноблотгинг антителами к белку Sup35. Проанализированы образцы лизата клеток [7>57f], как кипяченого в присутствии SDS, так и не кипяченого, а также образец лизата [/ш~]. Видна полоса прионных полимеров и снизу геля полоса мономерного неприонного белка Sup35. Стрелками обозначено положение маркеров: титин (4200 кДа), небулин (740 кДа), миозин (200 кДа).

Если такие образцы прокипятить в присутствии буфера для образцов и нанести па агарозный гель, то полимеры исчезнут, и останутся лишь мономеры (Рис. 1). Следовательно, прионные фибриллы не разрушаются при обработке SDS при температуре 37°С и разрушаются в присутствии SDS при кипячении. В лизате клеток [psi] при анализе этим методом обнаруживаютсчя только мономеры (Рис. 1). Таким образом, данный метод позволяет различать лизаты клеток [PST] и [psi ] более четко, чем прежние методы.

Для корректности анализа размера прионных фибрилл было необходимо показать, что при обработке SDS при 37°С никакие дополнительные белки не ассоциированы с ириошгыми фибриллами, за исключением прионных. Для этого был проведен эксперимент, в котором образец лизата клеток [.PS/*] инкубировали с SDS (37°С) и наносили на разделяющий ПААГ с последующим электрофорезом. В результате крупные нолимерь1 застревали в полиакриламидном геле на старте, а мономеры проходили дальше внутрь геля. После первой стадии электрофореза, верхнюю полоску полиакриламидного геля, содержащую застрявшие на старте прионные фибриллы отрезали и кипятили в буфере для образцов, содержащем SDS, далее накладывали на новый полиакриламидный гель. При этом прионные фибриллы диссоциировали до мономеров и при электрофорезе входили в гель. Гель окрашивали Coomassie Blue (Рис. 2).

В геле не обнаруживались белки отличные от белка Sup35. Это означает, что во-нервых, что практически все клеточные комплексы были растворены, во-вторых, что полимеры Sup35 не содержат значительного количества посторонних белков, что необходимо для корректного анализа размера полимеров в SDD электрофорезе.

[PSI+] r [PSI+] [psi-]

Рисунок 2. Большинство белковых макромолекулярных комплексов диссоциируют при воздействии SDS при 37°С.

Агрегатные фракции лизатов клеток [PST"], сверхгфодуцирующих белок Sup35 ([PST^f), а также лизатов клеток [РЖГ] и [psf] анализировали методом SDD электрофореза в ПААГ. Детекцию белка проводили окраской Coomassie Blue.

-о,

Для того, чтобы оценить молекулярную массу полимеров Бир35 был необходим маркер молекулярных масс. Для данного диапазона отсутствуют какие-либо коммерческие маркеры, поэтому для маркирования геля мы использовали экстракт мышцы кролика, содержащий гигантские белки титин (—4200 кДа) и небулин (~740 кДа). В результате мы смогли оценить размер полимеров Бир35 как приблизительно от 700 до 4000 кДа, что соответствует 10 — 50 мономерам белка Бир35.

Далее мы сопоставили размер полимерных частиц Бир35 в присутствии ББЗ и размер прион-содержащих агрегатов, наблюдаемых в стандартных условиях в отсутствии БОБ. Для этого размер частиц содержащих Бир35 сравнили ультрацентрифугированием в градиенте сахарозы в присутствии и отсутствии ББЗ. Сравнение показало, что в присутствии ББЭ частица 8ир35 седиментирует гораздо медленнее и подсчет продемонстрировал, что различие в размере в среднем составляет 35 раз (Рис. 3).

Рисунок 3. В присутствии SDS размер приоивых частиц значительно уменьшен. Анализ фракций, полученных при ультрацентрифугировании лизата клеток [PS7*] в градиенте сахарозы в присутствии и отсутствии SDS с помощью SDS PAGE. Иммуноблотгинг антителами к белку Sup35.

Такая значительная разница в массе между прионными полимерами и агрегатами может быть вызвана с двумя причинами: ассоциацей полимеров Sup35 в агрегаты с различными белками и макромолекулярными комплексами, такими как рибосома, а также присутствием множества прионных полимеров в агрегате. Как видно, прионные агрегаты

Без SDS SDS

1 2345 678 9 10 Осадок

Супернатант -► Осадок

белка Sup35 значительно различались по размеру. Самые малые из них были сравнимы с прионными полимерами.

Далее мы проанализировали корреляцию между размерами прионных агрегатов и прионных полимеров в разных фракциях с помощью электрофореза. Размер прионных полимеров различался при продвижении от фракции осадка в сторону легких фракций супернатанта (Рис. 4), хотя различие и не было очень значительным.

Рисунок 4. Фракции, содержащие агрегаты большей массы содержат более крупные прионные полимеры. Анализ фракций, полученных при ультрацентрифугировании лизата клеток варианта [PS/] с помощью SDD электрофореза в агарозном геле. Иммуноблотгинг антителами к белку Sup35. SI S2 S3 — фракции супернатанта, Р - фракция осадка.

Таким образом, из этих экспериментов следует, что дрожжевые прионные агрегаты, существующие in vivo, состоят из множественных коротких прионных фибрилл, аналогичных фибриллами, получаемым in vitro, а также, вероятно, содержат дополнительные белки и структуры, такие как рибосомы, функциональные партнеры Sup35 и шапероны.

В клетке прионные фибриллы существуют в виде макроагрегатов, состоящих из большого количества прионных полимеров, соединенных между собой детергент-неустойчивыми связями. Полимеры же состоят из мономеров прионного белка, соединенных между собой специфическими детергент-устойчивыми связями.

Таким образом, мы предложили новый метод анализа прионных агрегатов, образованных in vivo и охарактеризовали прионные агрегаты Sup35.

Уменьшение активности Hspl04 приводит к увеличению размера прионных полимеров из-за блокировании фрагментации. По гипотезе Kushnirov and Ter-Avanesyan (1998), делеция гена HSP104 приводит к элиминации [P.S7*] из-за того, что прионная фибрилла перестает фрагментироваться, что необходимо для ее эффективного наследования при делении клеток. Когда в клетке имеется один крупный макроагрегат, во время митоза он остается в одной клетке и [PSi4] фенотип легко теряется при росте

*- 4200 кДа

S1 —1

740кДа

Р3 -Ю

200 кДа SI S2 S3 Р Тотальный

дрожжевой культуры. Согласно гипотезе при уменьшении количества НэрКИ в клетке размер прионных полимеров должен увеличиваться.

Чтобы это проверить был сконструирован штамм, в котором экспрессия гена Н8Р104 регулировалась наличием высоких концентраций тетрациклина в среде. Однако, следует отметить, что НэрЮД практически не деградирует, и при репрессии соответствующего гена уровень шаперона уменьшается лишь в 2 раза за поколение.

Клетки для образцов собирали через каждое поколение после начала репрессии Н5Р104 (Рис. 5). Использование метода ЭОО электрофореза позволило показать, что при уменьшении уровня Пэр 104 размер полимеров в образцах действительно постепенно увеличивался.

Известно, что выращивание клеток дрожжей в присутствии низких концентраций GuHCl приводит к элиминации прионного состояния [PS/1"]. Было высказано предположение, что GuHCl ингибирует функцию шаперона Hspl04, что вызывает изгнание [PiST*] (Ferreira et. al., 2001). Поэтому мы сравнили эффекты репрессии гена HSP104 с эффектом, наблюдаемым при росте клеток на среде с GuHCl. В эксперименте было проверено, как изменяется размер полимеров при росте клеток в присутствии GuHCl, и после переноса в среду, не содержащую данный реагент. Образцы собирали через каждое поколение после добавления GuHCl. После этого клетки промыли буфером TBS, перенесли в среду без GuHCl и собрали еще три образца уже через каждый час.

Рисунок 5. Уменьшение уровня Нвр104 приводит к увеличению размера полимеров белка 8ир35. Анализ прионных полимеров белка Бир35 в клетках дрожжей, экспрессирующих ген Н8Р104 под регулируемым тетрациклиновым промотором, с помощью ББО электрофореза в агарозном геле. Иммуноблотгинг антителами к Бир35. Уровень ШрКИ был определен дополнительно с помощью электрофореза в ПААГ и иммунодетекцией при помощи антител к №р104.

0 4 5 6 7 8 ^поколения 200 20 12 8 6 4 % Hspl04

, 4200 кДа

"*~740 кДа

Рисунок 6. Рост клеток на среде с СиНС1 приводит к быстрому увеличению размера полимеров. Анализ белка Бир35 при росте клеток в присутствии ОиНС1 с помощью электрофореза в агарозном геле. Иммуноблотгинг антителами к БирЗ 5.

0 12 3 12 3

Поколения Часов после на ЭиНС! виНС!

В присутствии ОиНС1 размер полимеров быстро увеличивался. Подсчет показал, что средний размер полимеров увеличивался почти в два раза за поколение (Рис. 6). Такое увеличение возможно только при одновременном соблюдении двух условий, а именно, при полном прекращении фрагментации полимеров и полном включении вновь синтезированного Бир35 в полимеры. После отмывки от ОпНС1, размер полимеров уменьшался и снизился до исходного размера, что говорит об обратимости действия

Таким образом, получешше результаты показывают, что элиминация фенотипа [PS/*] за счет уменьшения количества Hspl04 или ингибирования его активности реализуется через значительный рост среднего размера полимеров, что подтверждает гипотезу Kushnirov and Ter-Avanesyan (1998), согласно которой Hspl04 фрагментирует прионные полимеры. Следует также отметить, что в эксперименте с GuHCl после отмывки реагента размер полимеров уменьшался до исходного уровня (Рис. 6), что свидетельствует о влиянии именно на процесс фрагментации, а не о дестабилизации прионной конформации (теоретически возможный процесс, который мог бы приводить к смене прионного варианта и изменению фенотипа).

GuIICl.

Сверхпродукция Нзр104 приводит к увеличепию размера прионных полимеров белка 8ир35. Известно, что сверхпродукция шаперона НврКН может элиминировать [РЗГ] (СИетой" а а!., 1995). Если предполагать, что Нзр104 фрагментирует прионные фибриллы, то при сверхпродукции Нвр 104 должно происходить фрагментирование прионных фибрилл до мономеров или очень малых полимеров, не способных инициировать дальнейшую полимеризацию. Косвенно это предположение было подтверждено в нашей лаборатории наблюдениями, что сверхэкспрессия Нэр104 уменьшает размер прионных агрегатов (КияЬшгоу ег.аЬ, 2000). Мы проверили с помощью БОБ электрофореза, какой эффект Нзр104 оказывает на размер прионных полимеров. Анализ проводили для сильного варианта [РЗТ*"], поскольку слабые варианты элиминируются при повышенных уровнях Нзр104. Хотя, как и ожидалось, количество свободных мономеров в образце с избытком Нзр104 возросло, неожиданно оказалось, что размер полимеров увеличивался относительно контроля (Рис. 7).

Г"™ " .

Рисунок 7. Увеличение экспрессии шаперона Няр104 приводит к увеличению размера полимеров вир35.

Анализ полимеров белка Бир35 в клетках дрожжей при сверхэкспрессии Шр104 и без нее с помощью ББО электрофореза в агарозном геле. Иммуноблоттинг антителами к Бир35. Шр104| - клетки со сверхэкспрессией Шр104.

НврЮ4Т [РЭГ]

Данному наблюдению можно предложить следующее объяснение. Размеры прионных полимеров определяются соотношением фрагментации и полимеризации. Если, несмотря на предполагаемую интенсификацию фрагментации полимеров при сверхэкспрессии Нзр104, их размер все же возрастает, это означает, что имеет место существенное увеличение скорости полимеризации. Вероятно, это можно объяснить тем, что действию №р104 в первую очередь подвержены прионные полимеры малого размера, которые он разбирает полностью до мономерного состояния. Увеличение количества мономеров, в свою очередь, способствует увеличению скорости

11

полимеризации, остающихся крупных полимеров, что и приводит к их дальнейшему росту.

Таким образом, в работе был предложен оригинальный метод анализа прионных агрегатов. С его помощью выявлены новые структурные свойства прионных полимеров и проанализированы эффекты основных факторов, влияющих на прионное состояние белка Sup35. Полученные результаты позволили сформулировать ряд гипотез о механизмах формирования, поддержания и наследования амилоидо-подобной структуры прионных агрегатов. Можно полагать, что прионный полимер представляет собой минимальную пряонную наследственную единицу и что его размер, задаваемый соотношением скорости полимеризации Sup35 и эффективности фрагментации полимеров с помощью Hspl04, является фактором, определяющим стабильность наследования приона.

Прионоподобные агрегаты белков Rnql, Sup35 P. methanolica, Publ и Htt(Q103)

состоят из прионных полимеров. Анализ прионных агрегатов белка Sup35 показал, что разработанный нами метод SDD-AGE позволяет обнаружить новые структурные свойства этого приона. Ранее для анализа прионных и амилоидных белков использовали достаточно ограниченный арсенал методов, а именно микроскопический анализ флюоресцентно-меченных прионных белков, а также седиментационный анализ их агрегатов. С помощью этих методов удавалось наблюдать только наиболее крупные прионные агрегаты, кроме того, клетки с такими агрегатами не очень сильно отличались от клеток без них. В связи с этим мы разработали принципиально новый электрофоретический подход, который позволил выявить двухуровневую структуру прионных агрегатов белка Sup35, а также другие важные их свойства. Мы предположили, что метод является универсальным и, что свойства, которые были продемонстрированы для приона Sup35, будут являться общей особенностью прионных и амилоидных белков.

Разработанный нами электрофоретический метод был использован для анализа амилоидного состояния следующих белков:

(1) Дрожжевой прионный белок Rnql. (2) Химерный белок, содержащий N-терминальный домен Sup35 Pichia methanolica, а домены МС Sup35 S. cerevisiae. Прионный домен Sup35 P. methanolica не имеет гомологии с аналогичным доменом Sup35 S. cerevisiae (Kushnirov et. al. 2000). (3) Дрожжевой белок Publ, играющий важпую роль в регуляции стабильности мРНК (Ruiz-Echevarria and Peltz 2000) и являющийся гомологом белка млекопитающих TIA1, для которого ранее были показаны прионоподобные свойства в клетках дрожжей (Gilks et. al2004). (4) Химерный амилоидный белок Htt(Q103) (часть первого экзона хантинггина млекопитающих, белка, ответственного за

патогенез при болезни Хантингтона) с удлиненной полиглутаминовой последовательностью, сшитой с GFP репортером. (5) Химерные белки I Itt(Q103) и Htt(Q25), сшитые с GFP репортером, были также экспрессированы в культуре клеток человека. Htt(Q25) использовали в качестве контроля, поскольку известно, что последовательность из 25 остатков глутамина не способна к агрегации, образованию амилоидов и, соответственно, не приводит к болезни (Meriin et. al. 2003).

АБВ Г Д

s:: •.

i.r.

Rnq1 Химерный Sup35

PuM

Htt (Q25 и Q103 в культуре клеток человека

Htt(Q103)

Рисунок 8. Белки Rnql, Sup35 Р. methanolica, Publ и Q103 образуют SDS-иерастворимые полимеры. Анализ следующих белков с помощью SDD электрофореза в агарозном геле: А. Rnql, иммуноблоттинг с антителами к белку Rnql; Б. Химерный Sup35 с прионным доменом Sup35 Р. methanolica, иммуноблоттинг с антителами к белку Sup35 S. cere\isiae\ В. Publ, клетки экспрессировали Publ, содержащий последовательность из трех гемаглютининовых эпитопов, иммуноблоттинг с антителами к гемаглютинину; Г. Химерные глутамин-богатые белки Htt(Q103) и Htt(Q25), представляющие часть первого экзона хантингтина человека, сшитую с GFP белком, иммуноблоттинг антителами к белку GFP. Эти белки были экспрессированы в культуре клеток человека; Д. Htt(Q103), сшитый с GFP белком, экспрессированный в дрожжах, иммуноблоттинг антителами к белку GFP.

Все эти белки образовывали характерные SDS-устойчивые полимеры. Таким образом, метод SDD электрофореза, по всей видимости, универсально применим для анализа прионных и амилоидных полимеров, образуемых различными белками разных организмов. Кроме того, этот метод можно использовать и для выявления прионоподобных свойств возможных белков-кандидатов.

Анализ искусственных прионов на основе полиглутамина и их сравнение с [P.S/*]. На

следующем этапе мы исследовали свойства белков, содержащих полиглутаминовые последовательностью с помощью метода SDD.

Известно, что дрожжевые прионные белки обогащены остатками глутамина и аспарагина. Так, прионный домен белка Sup35 содержит 27% Gin и 18% Asn. Кроме того, в нем содержится 17% Туг и 17% Gly, а заряженные аминокислоты практически не встречаются. Подобный аминокислотный состав прионного белка более важен для прионообразования, чем конкретная последовательность, как было показано в работе (Ross et. al., 2005). Последовательность полиглутамина достаточна для образования амилоидной структуры (Perutz et. al., 2003). Так, удлинение полиглутаминовой последовательности белка хантингтина приводит к амилоидной полимеризации и развитию болезни Хантингтона. Агрегацию полиглутаминовой последовательности также наблюдали в клетках дрожжей (Meriin et. al., 2003). Однако, последующий анализ показал, что эти агрегаты не наследуются, из-за плохого распознавания и фрагментации шалероном Hspl04 (Salnikova et. al, 2005). Для хорошего опознавания шапероном необходимо присутствие экспонированных гидрофобных остатков (Alberts et. al. 2002), а остатки глутамина таковыми не является.

Мы предположили, что распознавание амилоида шапероном Hspl04 может быть улучшено добавлением остатков тирозина, который представляет наиболее часто повторяющуюся гидрофобную аминокислоту в прионном домене белка Sup35.

Для этого мы изучили полимеризацию химерного белка, содержащего полиглутаминовую последовательность (polyQ) и последовательность глутаминов, смешанных с тирозинами (polyQY) в пропорции 4:1. Были созданы и изучены три химерные конструкции содержащие 70 и 85 глутаминов, а также 76 глутаминов/тирозинов (4:1), сшитых с МС-доменом белка Sup35, для краткости - Q70, Q85 и QY76 соответственно.

Црионоподобные характеристики Q70, Q8S и QY76. При экспрессии белков Q70, Q85 и QY76 в штамме дрожжей [P/JV*] оказалось, что все они сразу начинали образовывать полимеры (Рис. 9) и приводили к образованию колоний розового цвета, что означает наличие слабой супрессии нонсенс кодонов при трансляции (степень окраски обратно пропорциональна эффективности супрессии нонсенс мутации adel-14, мутации в этом гене приводят к ауксотрофности по аденину и накоплению красного пигмента). При экспрессии гена SUP35 в клетках такого штамма супрессии и появления прионного состояния не происходит (Chernoff et. al. 1993). [PST^] фенотип начинает возникать de novo только при сверхэкспрессии Sup35, причем с низкой частотой (10~б на клеточное деление). Таким образом, частота возникновения de novo прионоподобной конформации исследуемых полиглутаминовых белков существенно превосходит таковую у [Р5/1"].

Рисунок 9. Белки 070,085 и ОУ76 способны образовывать полимеры в клетках дрожжей. Анализ белков 010, (285, (ЗУ76 и Бир35 с помощью ББО электрофореза в агарозном геле. Иммуноблотгинг антителами к белку Бир35.

. г-

Q70|Q85|QY76|[PSr]

Эффективность нонсенс супрессии в клетках, экспрсссирующих химерные белки, нарастала в ряду <370 < С>85 < <2У76. Супрессия коррелировала с количеством мономерного белка (Рис. 10), то есть чем меньше было количество мономера, тем эффективнее была супрессия, хуже терминация трансляции.

Q70 Q85 QY76

Рисунок 10. Эффективность супрессии зависит от количества мономеров белков Q70, Q85 и QY76. Анализ белков Q70, Q85, QY76 с помощью SDD электрофореза в ПААГ. Иммуноблотгинг антителами к белку Sup35. Представлены мономеры, так как полимеры этих белков не входят в полиакриламидный гель.

При анализе SDD электрофорезом (Рис. 9) оказалось, что все эти белки образуют амилоидогенные полимеры, что не противоречит генетическим данным о прионоподобном характере свойств полиглутаминовых белков. Полимеры Q70 и Q85 намного превосходили по размеру полимеры QY76 (Рис. 9). Для сравнения, полимеры Sup35 в клетках [PST^] имели промежуточный размер между полимерами Q70/Q85 и QY76 (Рис. 9).

Возможно, малый размер полимеров QY76 объясняется увеличенной, по сравнению с Sup35, способностью фрагментироваться с помощью шаперона Hspl04. В случае Q70 и Q85 размер полимеров был достаточно велик, вероятно, из-за их низкой подверженности фрагментации Hspl04. В последующих экспериментах мы решили детально исследовать влияние Hspl04 на размер полимеров polyQ и polyQY.

Размер прионных полимеров белков Q70 и QY76 зависит от шапсроиа Hspl04.

Известно, что шаперон Hspl04 существенен для поддержания прионного состояния [PSI*]. Мы показали, что уменьшение его активности увеличивает размер полимеров Sup35, что соответствует представлению о том, что он осуществляет фрагментацию полимеров. Чтобы проверить влияние Hspl04 на полимеры Q70 и QY76 в клетках, экспрессирующих эти белки, был делегирован ген HSP104.

Агрегация белка Q70 зависит от гена HSP104, поскольку его делеция приводила к исчезновению соответствующих полимеров (Рис. 11). Это может означать либо то, что полимеры Q70 подвержены фрагментации с помощью Hspl04, либо, как это было предположено ранее (Meriin et. al., 2003), его поддержание может зависеть от приона [Р/ЛЛ], который не способен существовать в отсутствии Hspl04.

В отличие от Q70, полимеры QY76 не исчезали при делеция HSP104. Через 30 клеточных поколений (время, требуемое для роста дрожжевой колонии из одной клетки) после делеции HSP104 полимеры не обнаруживались, либо их количество было мало (Рис. 11). Полимеры QY76 были обнаружены после 150 генераций, однако их размер был значительно увеличен по сравнению с полимерами, образованными в присутствии Hspl04 (Рис. 11). Введение гена HSP104 в такие клетки привело к восстановлению исходного размера полимеров (Рис. 11). Таким образом, полимеры QY76 могут фрагментироваться и наследоваться и в отсутствии шаперона Hspl04, хотя в присутствии Hspl04 фрагментация происходит намного эффективнее.

Рисунок 11. Полимеризация белков Q70 и QY76 зависит от шаперона Hspl04. Анализ белков Q70 и QY76 с помощью SDD электрофореза в агарозном геле. Иммуноблотгинг с антителами к Sup35. Дорожка, отмеченная — dHspl04, означает, что в клетках с полимерами Q70 или QY76 делегирован ген HSP104. 30 и 150 - количество генераций, после делеции гена HSP104. +Hspl04 - в клетки с делецией HSP104 ген HSP104 был введен заново.

Полученные данные означают, что динамика полимеризации QY76 зависит от Hspl04. Однако делеция HSP104 не нарушает процесс полимеризации, как в случае Sup35 и Q70. Это можно объяснить как наличием lisp 104-независимой фрагментирующей активности, так и очень высокой эффективностью образования таких полимеров de novo. Во втором случае, эффективность образования полимеров не должна зависеть от времени, однако, это противоречит полученным данным (Рис. 11) и, значит, это объяснение можно исключить. Делеция HSP104 в клетках, экспрессируюпщх QY76, поначалу привела к практически полному прекращению полимеризации, что хорошо заметно через 30 поколений после делеции, однако полимеризация восстановилась в дальнейших клеточных поколениях. Видимо, исходные полимеры QY76 не были способны эффективно фрагментироваться и наследоваться в отсутствие Hspl04 и было необходимо время для образования повой структуры, которая могла бы наследоваться за счет IIspl 04-независимой фрагментации. Размер полимеров QY76 в клетках с делецией HSP104 был в 4-6 раза больше, чем без делеции. Это, вероятно, означает, что Нзр104-нсзависимая фрагментирующая активность была в несколько раз менее эффективна.

Чтобы подтвердить данные о влиянии шаперона Hspl 04 на исследуемые прионоподобные полиглутаминовые белки, мы исследовали кинетику полимеризации в

Q70

QY76

Q70| Q70 dHsp104

[PlhT\ 30 150 dHsp104

|+Hsp104

присутствии GuHCl, который, как ранее было показано, полностью ингибирует активность Hspl04 (Ferreira et. al., 2001). После внесения реагента в среду клетки собирали через 2 и 10 поколений. Присутствие в среде GuHCl приводило к увеличению размера полимеров Q70 (Рис. 12), однако это увеличение было незначительным. Отсутствие значительного увеличения может быть связано с техническими причинами. Полимеры Q70 велики и их наиболее крупная фракция в результате различных процедур может быть утеряна, например, она может оставаться в клеточном дебрисе при осветлении лизата, разрушена стеклянными бусами или недостаточно хорошо перенесена из агарозного геля на мембрану.

Q70 QY76

Рисунок 12. Ингибирование шаперона Шр104 с в присутствии СпНС1 приводит к увеличению размера полимеров белков <270 и <2У76. Анализ белков <270 и (?У76 с помощью БОБ электрофореза в 1,2% и 1,8% агарозном геле соответственно. Иммуноблоттинг с антителами к Бир35.

О | 2 |10 0 | 2 | 10 070 вина <ЭУ76 сина

Полимеры ОУ16 в присутствии ОиНС1 значительно увеличивались в размере, хотя и менее чем в два раза за поколение (Рис. 12). Это может означать неполное блокирование фрагментации, если Нэр 104-независимая фрагментация не ингибируется ОиНС1.

Эти данные демонстрируют, что как ро1у(2У, так и ро1у<3 белки подвержены фрагментации с помощью шаперона Нэр104 и вследствие этого способны наследоваться и проявлять прионные свойства.

Сверхэкспрессия шаперона Hspl04 приводит к увеличению размера прионных полимеров белков Q70, Q85 и QY76. Известно, что увеличение уровня шаперона Hspl04 иногда приводит к изгнанию приошюго состояния [PS/] (ChernofFet al., 1995).

Как было показано в этой работе, сверхэкспрессия шаперона Hspl04 увеличивает полимеры Sup35. Это можно объяснить исходя из того, что размер полимеров определяется соотношением темпов фрагментации и полимеризации, и поскольку при сверхэкспрессии IIspl04 частота фрагментации, вероятно, увеличивается, мы предположили, что одновременно увеличивается и скорость полимеризации. Это может происходить из-за появления большого пула мономеров, вследствие увеличенной фрагментации.

Рисунок 13. Увеличение экспрессии шаперона Hspl04 приводит увеличению размера полимеров белков QY76, Q70 и Q85, также как н белка Sup35.

Анализ белков Q70, Q85, QY76 с помощью SDD электрофореза в агарозном геле (1,2%). Иммуноблоттинг антителами к белку Sup35. Клетки, экспрессирующие данные белки, были трансформированы мультикопийной плазмидой, несущей ген HSP104 (дорожка с соответствующим образцом обозначена +) и контрольным вектором (-).

_ + _ + _ + м— fHspKM QY76 Q70 Q85

Поскольку оказалось, что Hspl04 в той или иной степени влияет также и на

1

исследуемые нами полиглутаминовые белки, мы решили выяснить, что будет происходить с полимерами Q70, Q85 и QY76 при его сверхэкспрессии. Во всех трех случаях поведение полимеров было аналогично поведению полимеров Sup35, то есть средний размер полимеров увеличивался (Рис. 13).

Белки Q70, Q85 и QY76 образуют полимеры, размер которых зависит от уровня экспрессии Hspl04. Однако, выявлены отличия, касающиеся среднего размера полимеров в клетке, эффективности образования de novo, а также наличия или отсутствия неприонного состояния. Таким образом, вариации аминокислотного состава прионного домена, влияя на основные динамические характеристики агрегата, такие как соотношение темпов полимеризации белка, фрагментации полимеров и образования

полимера de novo, определяют характеристики прионного процесса и дают возможность

создавать весьма различные по поведению прионы.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что прионные полимеры белка Sup35 отличаются от прочих клеточных макромолекулярных комплексов нерастворимостью в SDS при 37°С, что характерно для амилоидных фибрилл Sup35, образующихся in vitro.

2. Разработан метод полуденатурирующего электрофореза в агарозном геле для определения размера прионных полимеров.

3. Показано, что прионные агрегаты Sup35 представляют собой комплексы, состоящие из прионных полимеров. Полимеры гетерогенны по размеру и содержат от 10 до 50 мономеров Sup35.

4. Гидрохлорид гуанидина полностью блокирует фрагментацию прионных полимеров Sup35 в клетках дрожжей. Подтверждено предположение о фрагментации прионных полимеров шапероном Hspl 04.

5. Обнаружено, что химерные белки Q70-Sup35MC, Q85-Sup35MC и QY76-Sup35MC способны к полимеризации in vivo. Внедрение остатков тирозина в полиглутаминовые домены улучшает фрагментацию образуемых ими полимеров.

6. Метод полуденатурирующего электрофореза может быть использован для выявления амилоидного состояния разнообразных белков. Способность образовывать полимеры амилоидного типа in vivo показана для дрожжевых белков Rnql и Publ, химерного Sup35, содержащего N-концевой домен Sup35 Pichia methanolica, а также для химерного белка, содержащего полиглутаминовую последовательность хантингтина человека.

Список опубликованных работ.

1. D.S. Kiyndushkin, I.M. Alexandrov, M.D. Ter-Avanesyan and V.V. Kushnirov "Yeast [PSI+] Prion Aggregates Are Formed by Small Sup35 Polymers Fragmented by Hspl04" J Biol Chem 2003 Dec 5; 278(49): 49636-43.

2. Д.С. Крындушкин, И.М. Александров, B.B. Кушниров и М.Д. Тер-Аванесян "Дрожжи как модель для изучения молекулярных основ прионных и амилоидных заболеваний" Российский Физиологический Журнал им. И.М. Сеченова 2004 май; 90(5):645-57.

3. Vitaly V. Kushnirov, Uya М. Alexandrov, Olga V. Mitkevich, Irina S. Shkundina and Michael D. Ter-Avanesyan «Purification and analysis of prion and amyloid aggregates» Methods 2006 May;39(l):50-5.

4. M.D. Ter-Avanesyan, A.B. Vishnevskaya, I.M. Alexandrov and V.V. Kushnirov. «Prion and non-prion amyloids: a comparison inspired by the yeast Sup35 protein» (принято к публикации для книги In: Protein-Based Inheritance, Y.O. Chemoff ed. Landes Bioscience)

5. Крындушкин Д.С., Александров И.М., Тер-Аванесян М.Д., Кушниров В.В. "Новый метод анализа структуры прионных агрегатов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae" Третий съезд биохимического общества, Санкт-Петербург, Россия, июнь 2002, Санкт-Петербург, Тезисы научных докладов, стр. 496.

6. А.Б. Сальникова, Д.С. Крындушкин, И.М. Александров, В.В. Кушниров, М.Д. Тер-Аванесян "Нестандартные прионные состояния белка Sup35 дрожжей Saccharomyces cerevisiae" III съезд ВОГиС 6-12 июня 2004, Москва. Сборник трудов, Том 2, стр.343

7. А.Б. Сальникова, Д.С. Крындушкин, И.М. Александров, В.В. Кушниров, М.Д. Тер-Аванесян "Разнообразие амилоидоподобных состояний белка Sup35 дрожжей Saccharomyces cerevisiae" 8-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых 17-21 мая 2004г., Пущино. Сборник тезисов, стр. 31

8. V.V. Kushnirov, D.S. Kryndushkin, I.M. Alexandrov and M.D. Ter-Avanesyan. 2nd International Yeast Prion Meeting. Calistoga, CA, USA. 25-28 Aug. 2002.

9. Two-level structure of the {PS/] prion particles D.S. Kryndushkin, I.M. Alexandrov, V.V. Kushnirov and M.D. Ter-Avanesyan XXIst International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, Gothenburg, Sweden, July 2003, Vol.20, No.Sl, p.S390.

" 10. D.S. Kryndushkin, I.M. Alexandrov, V.V. Kushnirov and M.D. Ter-Avanesyan "Two-level structure of the [/>iS7+] prion particles" FEBS International Summer School on "Molecular Mechanisms in Homeostasis and Disease", Spetses, Greece, Sept 2003.

11. M. Ter-Avanesyan, V. Kushnirov, D. Kryndushkin and I. Alexandrov "Structural organization of yeast prion protein and the role of hspl04 chapcrone in its propagation" EURESCO Conference "Biology of Molecular Chaperones. Mcchanisms and regulation of chaperones" Tomar, Portugal, Aug 2003.

12. D. Kryndushkin, I. Alexandrov, V. Kushnirov and M. Ter-Avancsyan, "Purification and analysis of the structrure of prion aggregates from yeast Saccharomyces cerevisiae" 14th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Prague, Czech Republic, 1-4 May 2004, vol. 10, supl. 3, P1251.

13. Salnikova A., Shkundina I., Alexandrov I., Kushnirov V., Ter-Avanesyan M., HHMI Meeting of International Research Scholars, Merida, Mexico, June 22 - 25, 2005. Heritable and Nonheritable Amyloids in Yeast Are Distinguished by Susceptibility to Fragmentation. Book of abstracts, p. 80.

14. Shkundina I., Salnikova A., Alexandrov I., Kushnirov V., Tuite M. and Ter-Avanesyan M., Prion Biology — Joint Cold Spring Harbor Laboratory/ Wellcome Trust Conference, Hinxton, UK, September 7 - 11, 2005. Propagation and variability of the yeast Sup35 prion. Book of abstracts, p. 5.

Список сокращений.

ПЛАТ — Полиакриламидный гель кДа - Килодальтон

GFP - Зеленый флуоресцирующий белок GuIICl - Гидрохлорид гуанидина polyQ - полиглутами новые белки

polyQY — полиглутаминовые белки, перемежающиеся с остатками тирозина SDS - Додецил сульфат натрия

SDD AGE (SDD) - Полуденатурирующий SDS электрофорез в агарозном геле SDS-PAGE - SDS электрофорез в полиакриламидном геле ТАЕ - Буфер трис-ацетат ЭДТА TBS - Трис буфер с солью

Типография ООО "Алфавит 2000" Тираж 100 экз. Подписано в печать 18.09.2006 теп.: 623-93-18 www.alfavit2000.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Александров, Илья Михайлович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 ВВЕДЕНИЕ.

1.2 ПРИОНЫ МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

1.2.1 Прионы - новый класс инфекционных агентов.

1.2.2 Инфекционная активность прионов млекопитающих связана с белком PrPSc.

1.2.3 Молекулярные модели прионного превращения.

1.3 ПРИОНЫ НИЗШИХ ЭУКАРИОТ.

1.3.1 Нехромосомные детерминанты [PSt], [URE3] и [P/ZV*] дрожжей.

1.3.2 Цитоплазматический детерминант [Het-s] гриба Podospora anserina.

1.4 МОЛЕКУЛЯРНАЯ ПРИРОДА ДЕТЕРМИНАНТА [PSt]: ПРИОННЫЕ СВОЙСТВА БЕЖА SUP35.

1.4.1 Структура и функция белка Sup35.

1.4.2 Экспериментальные доказательства прионных свойств белка Sup35.

1.4.3 Возможность существования [PS/4"] у других организмов.

1.4.4 Амилоиды млекопитающих, их сходство с прионными белками дрожжей Sup35 и Ure2.

1.4.5 Амилоидные белки с экспансией полиглутамина, болезнь Хантингтона.

1.5 РОЛЬ ШАПЕРОНОВ В ПОДДЕРЖАНИИ ПРИОННОГО СОСТОЯНИЯ БЕЛКОВ.

1.5.1 Краткий обзор клеточных шаперонов.

1.5.2 Роль шаперона Hspl04 в поддержании детерминанта [PSI*] и других прионов.

1.5.3 Рост клеток на среде с GuHCl приводит к потере прионного фенотипа^.

1.6 РАСПРОСТРАНЁННОСТЬ ПРИОНОВ В ПРИРОДЕ.

1.6.1 Биологическое значение прионов.

1.7 ПЕРСПЕКТИВЫ ЛЕЧЕНИЯ ПРИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование полимеризации прионных белков дрожжей in vivo методом полуденатурирующего электрофореза"

Открытие феномена прионов позволило обнаружить существование нового типа наследственности, на основе белка. Термин "прион" появился в связи с исследованием ряда нейродегенеративных заболеваний с неизвестной этиологией, таких как скрэйпи овец и болезнь Крейцфельда-Якоба у человека. Несмотря на то, что эти болезни известны довольно давно, природа их оставалась загадкой достаточно долго. Объяснение столь медленного хода исследований заключалось в необычном способе возникновения этих болезней: они могут возникать спонтанно и в то же время могут наследоваться, а также передаваться инфекционным путем.Долгое время комбинация этих трех свойств казалась необъяснимой. В 1967 была предложена так называемая "белковая" гипотеза, согласно которой инфекционный агент, вызывающий эти заболевания, позже получивший название "прион", представляет собой обычный клеточный белок, принявший особое конформационное состояние. Это состояние способно самоподдерживаться за счет автокаталитического механизма. На сегодняшний день эту гипотезу можно считать доказанной. Ее подтверждают практически все экспериментальные данные, а также тот факт, что до сих пор не удалось найти какую-либо нуклеиновую кислоту, связанную с этими инфекционными заболеваниями.За последние десять лет появились работы, показывающие существование прионоподобных белков у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и гриба Podospora anserina. Если у млекопитающих существование прионов связано с патологией, то у низших эукариот наследуемое переключение активности белков, вызванное их переходом в прионное состояние, может иметь адаптивное значение. У дрожжей прионоподобные свойства белков лежат в основе механизмов эпигенетической наследственности и регуляции экспрессии генов на посттрансляционном уровне.Изучение прионов у дрожжей открывает новые перспективы в понимании сущности этого явления в целом. Феномен прионов относится к типу, так называемых, амилоидных белков, образующих фибриллярные агрегаты со специфической белковой укладкой. Похоже, что феномен прионов и амилоидов гораздо шире распространен в природе и играет существенно более важную роль у различных организмов, чем это предполагается на сегодняшний день. Поиск в банках генов выявляет значительное количество белков у различных организмов, структурно сходных с уже известными прионными белками у дрожжей. Это позволяет полагать, что белки, которые могут изменять свою конформацию и полимеризоваться, широко распространены и могут играть важную роль во внутриклеточной регуляции. Кроме того, до сих пор остается открытой проблема диагностики и лечения прионных болезней у человека и животных. Особое значение данная проблема получила в силу появившихся в последнее время сообщений о возможности передачи этих заболеваний от животных к человеку (при употреблении больных животных в пищу). Также, сходство свойств дрожжевых прионов и амилоидов млекопитающих выводит актуальность исследований в этой области на передний план.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Александров, Илья Михайлович

6. выводы

1. Показано, что прионные полимеры белка Sup35 отличаются от прочих клеточных макромолекулярных комплексов нерастворимостью в SDS при 37°С, что характерно для амилоидных фибрилл Sup35, образующихся in vitro.

2. Разработан метод полуденатурирующего электрофореза в агарозном геле для определения размера прионных полимеров.

3. Показано, что прионные агрегаты Sup35 представляют собой комплексы, состоящие из прионных полимеров. Полимеры гетерогенны по размеру и содержат от 10 до 50 мономеров Sup35.

4. Гидрохлорид гуанидина полностью блокирует фрагментацию прионных полимеров Sup35 в клетках дрожжей. Подтверждено предположение о фрагментации прионных полимеров шапероном Hsp 104.

5. Обнаружено, что химерные белки Q70-Sup35MC, Q85-Sup35MC и QY76-Sup35MC способны к полимеризации in vivo. Внедрение остатков тирозина в полиглутаминовые домены улучшает фрагментацию образуемых ими полимеров.

6. Метод полуденатурирующего электрофореза может быть использован для выявления амилоидного состояния разнообразных белков. Способность образовывать полимеры амилоидного типа in vivo показана для дрожжевых белков Rnql и РиЫ, химерного Sup35, содержащего N-концевой домен Sup35 Pichia methanolica, а также для химерного белка, содержащего полиглутаминовую последовательность хантингтина человека.

5.9 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанный в настоящей работе электрофоретический подход позволил выявить двухуровневую организацию прионных частиц белка Sup35 в клетках дрожжей. С использованием данного метода были получены убедительные доказательства способности шаперона Hsp 104 фрагментировать прионные полимеры Sup35. Продемонстрировано, что метод может быть использован для исследования различных прионо- и амилоидоподобных белков как в клетках дрожжей, так, по-видимому, и в клетках других организмов, например, млекопитающих. Можно полагать, что разработанный нами метод может быть в дальнейшем использован для выявления новых белков, проявляющих прионогенные или амилоидогенные свойства in vivo, а также для выявления воздействий ингибирующих амилоидогенез, но не влияющих на основные параметры физиологии клетки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Александров, Илья Михайлович, Москва

1. Захаров И. А., Кожин С. А., Кожина Т. Н., Федорова И. В. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л: Наука, 1984.

2. Инге-Вечтомов С. Г., Андрианова В. М. Рецессивные супер-супрессоры у дрожжей// Генетика. 1970. - Т. 11.-е. 103-115.

3. Тер-Аванесян М.Д., Паушкин С.В., Кушниров В.В., Кочнева-Первухова Н.В. Молекулярные механизмы "белковой" наследственности: прионы дрожжей// Молекулярная биология 1998,- том 32, №1, с. 36-46.

4. Agashe VR, Hartl FU. Roles of molecular chaperones in cytoplasmic protein folding// Semin Cell Dev Biol. 2000 Feb; 11(1): 15-25.

5. Aigle, M., Lacroute, F. Genetical aspects of URE3., a non-Mendelian, cytoplasmically inherited mutation in yeast// Mol. Gen. Genet. 1975. - V. 136. -P. 327 - 336.

6. Alberts В., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. Molecular Biology of the Cell Fourth Edition// 2002

7. Amsdorf, M. F., and Lindquist, S. L. Nucleated conformational conversion and the replication of conformational information by a prion determinant// Science. 2000 Aug 25;289(5483): 1317-21.

8. Bach S, Talarek N, Andrieu T, Vierfond JM, Mettey Y, Galons H, Dormont D, Meijer L, Cullin C, Blondel M. Isolation of drugs active against mammalian prions using a yeast-based screening assay// Nat Biotechnol. 2003 Sep;21(9): 1075-81.

9. Bagriantsev S, Liebman SW. Specificity of prion assembly in vivo. PSI+. and [PIN+] form separate structures in yeast// J Biol Chem. 2004 Dec 3;279(49):51042-8. Epub 2004 Sep 30.

10. Bates GP, Harper PS, Jones AL. Huntington's Disease. Oxford, UK: Oxford University Press// 2002

11. Bessen, R. A., and Marsh, R. F. Distinct PrP properties suggest the molecular basis of the strain variation in transmissible milk encephalopathy// J. Virol. -1994. V. 68. - P. 7859 - 7868.

12. Blake Т. The role of Hspl04 in stress tolerance and PSI+. propagation in Saccharomyces cerevisiaee// Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1995; 60: 45160.

13. Bonini NM. Chaperoning brain degeneration// Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Dec 10;99 Suppl 4:16407-11.

14. Bradford M. A dye binding assay for proteins// Anal Biochem 1976. - 72: 248254.

15. Brown DR, Wong BS, Hafiz F, Clive C, Haswell SJ, Jones IM. Normal prion protein has an activity like that of superoxide dismutase// Biochem J. 1999 Nov 15;344 Pt 1:1-5.

16. Bueler, H., Aguzzi, A., Greiner, R -A., Autenried, P., Aguet, M., and Weeissmann, C. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie// Cell. 1993. - V. 73.-P. 1339- 1347.

17. Bukau B, Horwich AL. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines // Cell. 1998 Feb 6; 92(3): 351-66.

18. Cha JH. Transcriptional dysregulation in Huntington's disease// Trends Neurosci. 2000 Sep;23(9):387-92.

19. Chai Y, Koppenhafer SL, Bonini NM, Paulson HL. Analysis of the role of heat shock protein (Hsp) molecular chaperones in polyglutamine disease// J Neurosci. 1999 Dec 1; 19(23): 10338-47.

20. Chernoff YO, Galkin AP, Lewitin E, Chernova ТА, Newnam GP, Belenkiy SM. Evolutionary conservation of prion-forming abilities of the yeast Sup35 protein// Mol Microbiol. 2000 Feb; 35(4): 865-76.

21. Chernoff YO, Lindquist SL, Ono B, Inge-Vechtomov SG, Liebman SW. Role of the chaperone protein Hspl04 in propagation of the yeast prion-like factor PSI+.// Science. 1995 May 12; 268(5212): 880-4.

22. Chernoff YO, Newnam GP, Kumar J, Allen K, Zink AD. Evidence for a protein mutator in yeast: role of the Hsp70-related chaperone ssb in formation, stability, and toxicity of the PSI. prion// Mol Cell Biol. 1999 Dec; 19(12): 8103-12.

23. Chernoff, Y. O., Derkatch, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. Multicopy SUP35 gene induced de novo appearance of psi. like factors in yeast Saccharomyces cerevisiaee// Curr. Genet. 1993. - V. 24. - P.268 - 272.

24. Chiti F, Stefani M, Taddei N, Ramponi G, Dobson CM. Rationalization of the effects of mutations on peptide and protein aggregation rates// Nature. 2003 Aug 14;424(6950):805-8.

25. Ciechanover A, Brundin P. The ubiquitin proteasome system in neurodegenerative diseases: sometimes the chicken, sometimes the egg// Neuron. 2003 Oct 9;40(2):427-46.

26. Cohen, F. E., Pan, К. M., Huang, Z., Baldwin, M., Fletterick, R. J., and Prusiner, S. B. Structural clues to prion replication// Science. - 1994. - V. 264. - P. 530 -531.

27. Collin P, Beauregard PB, Elagoz A, Rokeach LA.A non-chromosomal factor allows viability of Schizosaccharomyces pombe lacking the essential chaperone calnexin// J Cell Sci. 2004 Feb 29;117(Pt 6):907-18.

28. Cooper KF, Mallory MJ, Smith JB, Strich R. Stress and developmental regulation of the yeast C-type cyclin Ume3p(Srbllp/Ssn8p)//EMBO J 1997 Aug 1; 16(15): 4665-75

29. Cooper KF, Mallory MJ, Strich R. Oxidative stress-induced destruction of the yeast C-type cyclin Ume3p requires phosphatidylinositol-specific phospholipase С and the 26S proteasome// Mol Cell Biol 19996 May; 19(5): 3338-48

30. Cooper KF, Strich R. Functional analysis of the Ume3p/ Srbllp-RNA polymerase II holoenzyme interaction// Gene Expr 1999; 8(1): 43-57

31. Coschigano PW, Magasanik B. The URE2 gene product of Saccharomyces cerevisiaee plays an important role in the cellular response to the nitrogen sourceand has homology to glutathione s-transferases// Mol Cell Biol. 1991 Feb; ll(2):822-32.

32. Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., and Begueret, J. The protein product of the het-s heterocaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. - P. 9773 - 9778.

33. Cox, B. S.psi, a cytoplasmic supressor of super-supressor in yeast//Hevedity. -1965. V. 20. - P. 505-521.

34. Cox, B. S., Tuit, M. F., and McLaughlin, C. S. The W factor of yest: a problem of inheritance// Yeast. 1988. - V. 4. - P. 159 - 178.

35. Crozet C, Lin YL, Mettling C, Mourton-Gilles C, Corbeau P, Lehmann S, Perrier V. Inhibition of PrPSc formation by lentiviral gene transfer of PrP containing dominant negative mutations// J Cell Sci. 2004 Nov 1; 117(Pt 23):5591-7.

36. Dagkesamanskaya AR, Ter-Avanesyan MD. Interaction of the yeast omnipotent suppressors SUP1(SUP45) and SUP2(SUP35) with non-mendelian factors.//Genetics. 1991 Jul;128(3):513-20.

37. DebBurman SK, Raymond GJ, Caughey B, Lindquist S. Chaperone-supervised conversion of prion protein to its protease-resistant form// Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Dec 9; 94(25): 13938-43.

38. Derkatch, I. L., Chernoff, Y. O., Kushnirov, V. V., Inge-Yechtomov, S. G., and Liebman, S. W. Genesis and variability of prion-like PSP. factors in Saccharomyces cerevisiaee// Genetics. 1996. - V. 144. - P. 1375 - 1386.

39. Doel, S. M., McCready, J. S., Nierras, C. R., and Cox, B. S. The dominant PNM2 mutation wich eliminates the factor of Saccharomyces cerevisiaee is the result of a missense mutation in the SUP35 gene// Genetics. 1994. - V. 137. - P. 659 -670.

40. Eaglestone SS, Cox BS, Tuite MF. Translation termination efficiency can be regulated in Saccharomyces cerevisiaee by environmental stress through a prion-mediated mechanism// EMBO J. 1999 Apr 1; 18(7): 1974-81.

41. Eaglestone SS, Ruddock LW, Cox BS, Tuite MF. Guanidine hydrochloride blocks a critical step in the propagation of the prion-like determinant PSI(+). of Saccharomyces cerevisiaee// Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jan 4;97(l):240-4.

42. Edenhofer F, Rieger R, Famulok M, Wendler W, Weiss S, Winnacker EL. Prion protein PrPc interacts with molecular chaperones of the Hsp60 family// J Virol. 1996 Jul; 70(7): 4724-8.

43. Edskes, H. K., Gray, V. Т., and Wickner, R. B. The URE3. prion is an aggregated form of Ure2p that can be cured by overexpression of Ure2p fragments// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - P. 1498 - 1503.

44. Elghetany MT, Saleem A. Methods for staining amyloid in tissues: a review// Stain Technol. 1988 Jul;63(4):201-12.

45. Ferreira PC, Ness F, Edwards SR, Cox BS, Tuite MF. The elimination of the yeast PSI+. prion by guanidine hydrochloride is the result of Hspl04 inactivation// Mol Microbiol. 2001 Jun;40(6): 1357-69.

46. Firoozan M., Grant C.M., Duarte J.A., Tuite M.F. // Yeast. 1991. V. 7. P. 173-183.

47. Fowler DM, Koulov AV, Alory-Jost C, Marks MS, Balch WE, Kelly JW. Functional Amyloid Formation within Mammalian Tissue// PLoS Biol. 2005 Nov 29;4(l):e6

48. Fujita, A., Kikuchi, Y., Kuhara, S., Misumi, Y., Matsumoto, S., and Kobayashi, H. Domains of the SFL1 protein of yeasts are homologous to Мус oncoproteins or yeast heat-shock transcription factor// Gene 1989 - 85, 321-8.

49. Gafni J, Hermel E, Young JE, Wellington CL, Hayden MR, Ellerby LM. Inhibition of calpain cleavage of huntingtin reduces toxicity: accumulation ofcalpain/caspase fragments in the nucleus// J Biol Chem. 2004 May 7;279(19):20211-20.

50. Gajdusek, D. C., Gibbs, C. J., Jr., and Alpers, M. Experimentae transmission of a kuru-like syndrome to chimpanzees// Nature. — 1966. V. 209. - P. 794 - 796.

51. Ganusova EE, Ozolins LN, Bhagat S, Newnam GP, Wegrzyn RD, Sherman MY, Chernoff YO. Modulation of prion formation, aggregation, and toxicity by the actin cytoskeleton in yeast// Mol Cell Biol. 2006 Jan;26(2):617-29.

52. Gerstmann, Y., Straussler, E., and Scheinker, I. Uber eine egenartige hereditar-familliare Erkrankung des Zentalnervensystems zugeich ein Beitrag zur frage des vorzeitigen locaten Alterns// Z. Neurol. 1936. - V. 154. - P. 736 - 762.

53. Gietz RD, Schiestl RH, Willems AR, Woods RA. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure// Yeast. 1995 Apr 15; 11(4): 355-60.

54. Gietz RD, Sugino A. New yeast-Escherichia coli shuttle vectors constructed with in vitro mutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites// Gene. -1988-Dec 30; 74(2): 527-34.

55. Gilks N, Kedersha N, Ayodele M, Shen L, Stoecklin G, Dember LM, Anderson P. Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1// Mol Biol Cell. 2004 Dec;15(12):5383-98.

56. Glover JR, Lindquist S. Hspl04, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins// Cell. 1998 Jul 10; 94(l):73-82.

57. Glover, Y., Kowal, A., Schrimer, E., Patino, M., Liu, J., and Lindquist, S. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of PSI+., a heritable prion-like factor of Saccharomyces cerevisiaeell Cell. 1997. - V. 89. - P. 811 -819.

58. Griffith, J. S. Self-replication and scrapie// Nature. 1967. - V. 215. - P. 1043 -1044.

59. Grimminger V, Richter K, Imhof A, Buchner J, Walter S. The prion curing agent guanidinium chloride specifically inhibits ATP hydrolysis by Hspl04// J Biol Chem. 2004 Feb 27;279(9):7378-83.

60. Hake LE, Richter JD. CPEB is a specificity factor that mediates cytoplasmic polyadenylation during Xenopus oocyte maturation// Cell. 1994 Nov 18;79(4):617-27.

61. Henry, N. L., Campbell, A. M., Feaver, W. J., Poon, D., Weil, P. A., and Kornberg, R. D. TFIIF-TAF-RNA polymerase II connection// Genes And Development. 1994 - 8, 2868-78.

62. Horwich AL, Weber-Ban EU, Finley D. Chaperone rings in protein folding and degradation// Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Sep 28; 96(20): 11033-40.

63. Hunter, G. D., Collis, S. C., Millson, G. C., Kimberlin, R. H. Search for scrapie-specific RNA and attempts to detect an infectious DNA or RNA// J. Gen. Virol. -1976.-V. 32.-P. 157-162.

64. Jarrett, J. Т., and Lansbury, P. T. Seeding "one-dimensional-crystallization" of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie?// Cell. -1993. V. 73 - P. 1055 - 1058.

65. Jones JS, Prakash L. Yeast Saccharomyces cerevisiaee selectable markers in pUC18 polylinkers//Yeast. 1990 Sep-Oct; 6(5): 363-6.

66. Jung G, Jones G, Masison DC. Amino acid residue 184 of yeast Hspl04 chaperone is critical for prion-curing by guanidine, prion propagation, and thermotolerance// Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Jul 23;99(15):9936-41.

67. Klement IA, Skinner PJ, Kaytor MD, Yi H, Hersch SM, Clark HB, Zoghbi HY, Orr HT. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation: role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice// Cell. 1998 Oct 2;95(l):41-53.

68. Kochneva-Pervukhova NV, Chechenova MB, Valouev I A, Kushnirov VV, Smirnov VN, Ter-Avanesyan MD. Psi(+). prion generation in yeast: characterization of the 'strain' difference//Yeast. 2001 Apr;18(6):489-97.

69. Kocisko, D. A., Come, J. H. Priola, S. A., Chesebro, В., Raymond, G. J., Lansbury, P. Т., and Caughey, B. Cell-free formation of protease-resistant prion protein// Nature. 1994. - V. 370. - P. 471 - 474.

70. Krishnan R, Lindquist SL. Structural insights into a yeast prion illuminate nucleation and strain diversity// Nature. 2005 Jun 9;435(7043):765-72.

71. Kryndushkin DS, Alexandrov IM, Ter-Avanesyan MD, Kushnirov VV. Yeast PSI+. prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hspl04//

72. J Biol Chem. 2003 Dec5;278(49):49636-43.

73. Kushnirov VV, Kochneva-Pervukhova NV, Chechenova MB, Frolova NS, Ter-Avanesyan MD. Prion properties of the Sup35 protein of yeast Pichia methanolica//EMBO J. 2000a Feb 1; 19(3): 324-31.

74. Kushnirov VV, Kryndushkin DS, Boguta M, Smirnov VN, Ter-Avanesyan MD. Chaperones that cure yeast artificial PS/+. and their prion-specific effects// Curr Biol. 20006 Nov 1; 10(22): 1443-6.

75. Kushnirov, V. V. and Ter-Avanesyan, M. D. Structure and replication of yeast prions// Cell 1998,- V. 94. - P. 13 - 16.

76. Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D., Telkov, M. V., Surguchov, A. P., Smirnov, V. N., and Inge-Vechtomov, S. G. Nucleotide sequence of the sup2 (sup35) gene of Saccharomyces cerevisiaee// Gene. 1988. - V. 66. - P. 45 - 54.

77. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4// Nature. 1970. - V. 227. - P. 680 - 689.

78. Landles C, Bates GP. Huntingtin and the molecular pathogenesis of Huntington's disease. Fourth in molecular medicine review series// EMBO Rep. 2004 Oct;5(10):958-63.

79. Liao, S. M., Zhang, J., Jeffery, D. A., Koleske, A. J., Thompson, С. M., Chao, D. M., Viljoen, M., van Vuuren, H. J., and Young, R. A. A kinase-cyclin pair in the RNA polymerase II holoenzyme// Nature 1995 - 374, 193-6.

80. Lindquist S, Patino MM, Chernoff YO, Kowal AS, Singer MA, Liebman SW, Lee KH,1.pez N, Aron R, Craig EA. Specificity of class II Hsp40 Sisl in maintenance of yeast prion RNQ+.// Mol Biol Cell. 2003 Mar; 14(3): 1172-81.

81. Lorenz MC, Heitman J. Regulators of pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiaee identified through multicopy suppressor analysis in ammonium permease mutant strains//Genetics. 1998 Dec; 150(4): 1443-57.

82. Lowndes NF, Johnson AL, Johnston LH. Coordination of expression of DNA synthesis genes in budding yeast by a cell-cycle regulated trans factor// Nature. 1991 Mar 21; 350(6315): 247-50.

83. Ma J, Lindquist S. De novo generation of a PrPSc-like conformation in living cells//Nat Cell Biol. 1999 Oct;l(6):358-61.

84. Martin J, Hartl FU. Chaperone-assisted protein folding// Curr Opin Struct Biol. 1997 Feb; 7(1): 41-52.

85. Masison, D. С., and Wickner, R. B. Prion-inducing domain of yeast Ure2pprotease resistance of Ure2p in prion-containing cells// Science. 1995. V. 270. P. 93 95.

86. Meriin, А. В., X. Zhang, X. He, G. P. Newnam, Y. O. Chernoff, and M. Y. Sherman. Huntington toxicity in yeast model depends on polyglu-tamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnql// J. Cell Biol. 2002 157:9971004.

87. Meriin AB, Zhang X, Miliaras NB, Kazantsev A, Chernoff YO, McCaffery JM, Wendland B, Sherman MY. Aggregation of expanded polyglutamine domain in yeast leads to defects in endocytosis// Mol Cell Biol. 2003 Nov;23(21):7554-65.

88. Meyer, R. K., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Braufeld, M. В., Barry, R. A., and Prusiner, S. B. Separation and properties of cellular and scrapie prion proteins// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V. 83. - P. 2310 - 2314.

89. Miller JH // Experiments in molecular genetics, pp352-354, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1972.

90. Myers AM, Tzagoloff A, Kinney DM, and Lusty CJ. Yeast shuttle and integrative vectors with multiple cloning sites suitable for construction of lacZ fusions// Gene. 1986. - 45(3):299-310.

91. Ness F, Ferreira P, Cox BS, Tuite MF. Guanidine hydrochloride inhibits the generation of prion "seeds" but not prion protein aggregation in yeast// Mol Cell Biol. 2002 Aug;22(15):5593-605

92. Newnam GP, Wegrzyn RD, Lindquist SL, Chernoff YO. Antagonistic interactions between yeast chaperones Hspl04 and Hsp70 in prion curing// Mol Cell Biol. 1999 Feb; 19(2): 1325-33.

93. Orlowska-Matuszewska G and Wawrzycka D. A novel phenotype of eight spores asci in deletants of the prion-like Rnqlp in Saccharomyces cerevisiae// Biochem Biophys Res Commun. 2006 Feb 3;340(1): 190-3.

94. Osherovich LZ, Cox BS, Tuite MF, Weissman JS. Dissection and design of yeast prions//PLoS Biol. 2004 Apr;2(4):E86.

95. Pan, К- M., Baldwin, M., Nguyen, J., Gasset, M., Servban, A., Groth, D., Mehlhorn, I., Huang,

96. Z., Fletterick. R. J., Cohen, F. F., and Prusiner, S. B. Conversion of a-helices into b-sheets features in the formation of the scrapie prion proteins// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - P. 10962 - 10966.

97. Parsell DA, Kowal AS, Singer MA, Lindquist S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hspl04// Nature. 1994 Dec 1; 372(6505): 475-8.

98. Patino, M. M., Lui, J. J., Glover, J. R., and Lindquist, S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast// Science. 1996. - V. 273.-P. 622-626.

99. Paushkin, S. V., Kushnirov, V. V., Smirnov, V. N., and Ter-Avanesyan, M. D. Propagation of the yeast prion-like determinant is mediated by oligomerization of SUP35-encoded polypeptide chain release factor// The EMBO J.- 1996.-V. 12.-P. 3127-3134.

100. Paushkin, S. V., Kushnirov, V. V., Smirnov, V. N., and Ter-Avanesyan, M. D. In vivo propagation of the prion-like state of yeast Sup35 protein// Science. 1997b -V. 277. - P. 381 -383.

101. Perutz M. F., Finch J. Т., Berriman J., and Lesk A., Amyloid fibers are water-filled nanotubes// PNAS April 16, 2002, vol. 99, no. 8 5591-5595

102. Perutz MF, Johnson T, Suzuki M, Finch JT. Glutamine repeats as polar zippers: their possible role in inherited neurodegenerative diseases// Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Jun 7;91(12):5355-8.

103. Prusiner, S. B. Molecular biology of prion diseases// Science. 1991. - V. 252. P. 1515-1522.

104. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie// Science. -1982.-V. 216.-P. 136- 144.

105. Prusiner, S. В., Bolton, D. C., Groth, D. G., Bowman, K. A., Cocharn, S. В., and McKinley, M. P. Futher purification and characterization of scrapie prions// Biochemistry. 1982. - V. 21. - P. 6942 - 6950.

106. Prusiner, S. В., Groth, D. G., Bolton, D. C., Kent, S. В., and Hood, L. E. Purification and structural studies of a major scrapie prion protein// Cell. 1984. -V. 38.-P. 127-134.

107. Prusiner, S. В., Mckinly, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. G., and Glenner, G. G. Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefrigent rods// Cell. 1983. - V. 35. - P. 349 - 358.

108. Prusiner, S. В., Scott, M. R., DeArmond, S. J., and Cohen, F. E. Prion protein biology// Cell. 1998. - V. 93. - P. 337 - 348.

109. Robertson, L. S., and Fink, G. R. The three yeast A kinases have specific signaling functions in pseudohyphal growth// Proc Natl Acad Sci U S A 1998 -95, 13783-13787.

110. Ross ED, Edskes HK, Terry MJ, Wickner RB. Primary sequence independence for prion formation// Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Sep 6;102(36): 12825-30.

111. Ruiz-Echevarria, M. J., and S. W. Peltz. The RNA binding protein Publ modulates the stability of transcripts containing upstream open reading frames// Cell. 2000; 101:741-751.

112. Sakahira H, Breuer P, Hayer-Hartl MK, Hartl FU. Molecular chaperones as modulators of polyglutamine protein aggregation and toxicity// Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Dec 10;99 Suppl 4:16412-8.

113. Salnikova AB, Kryndushkin DS, Smirnov VN, Kushnirov VV, Ter-Avanesyan MD. Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids//J Biol Chem. 2005 Mar 11;280(10):8808-12

114. Sambrook, J., Fritsch, E. E., and Maniatis, T. Molecular cloning. A Laboratory Manual/ Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. - 1989.

115. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors// Proc Natl Acad Sci USA. 1977 Dec; 74(12): 5463-7.

116. Saudou F, Finkbeiner S, Devys D, Greenberg ME. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions// Cell. 1998 Oct 2;95(l):55-66.

117. Scheibel T, Kowal AS, Bloom JD, Lindquist SL. Bidirectional amyloid fiber growth for a yeast prion determinant// Curr Biol. 2001 Mar 6;ll(5):366-9.

118. Serio TR, Cashikar AG, Kowal AS, Sawicki GJ, Moslehi JJ, Serpell L, Arnsdorf MF, Lindquist SL. Nucleated conformational conversion and the replication of conformational information by a prion determinant// Science. 2000 Aug 25; 289(5483):1317-21

119. Serio, Т. R., Cashikar, A. G., Kowal, A. S., Sawicki, G. J., Moslehi, J. J., Serpell, Sherman, F., Fink, J.R., and Hicks, J.B. Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1986.

120. Shorter J, Lindquist S. Hspl04 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers// Science. 2004 Jun 18;304(5678): 1793-7.

121. Si K, Lindquist S, Kandel ER. A neuronal isoform of the aplysia CPEB has prion-like properties// Cell. 2003 Dec 26;115(7):879-91.

122. Sigurdsson EM, Sy MS, Li R, Scholtzova H, Kascsak RJ, Kascsak R, Carp R, Meeker HC, Frangione B, Wisniewski T. Anti-prion antibodies for prophylaxis following prion exposure in mice// Neurosci Lett. 2003 Jan 23;336(3): 185-7

123. Silveira JR, Raymond GJ, Hughson AG, Race RE, Sim VL, Hayes SF, Caughey B. The most infectious prion protein particles// Nature. 2005 Sep 8;437(7056):257-61.

124. Sondheimer N, Lindquist S. Rnql : an epigenetic modifier of protein function in yeast// Mol Cell. 2000 Jan;5(l): 163-72.

125. Sondheimer N, Lopez N, Craig EA, Lindquist S. The role of Sisl in the maintenance of the RNQ+. prion//EMBO J. 2001 May 15;20(10):2435-42.

126. Song W, Carlson M. Srb/mediator proteins interact functionally and physically with transcriptional repressor Sfll//EMBO J 1998 Oct 1; 17(19): 5757-65

127. Sparrer HE, Santoso A, Szoka FC Jr, Weissman JS. Evidence for the prion hypothesis: induction of the yeast PSI+. factor by in vitro converted Sup35 protein//Science. 2000 Jul 28; 289(5479): 595-9.

128. Strich R, Slater MR, Esposito RE. Identification of negative regulatory genes that govern the expression of early meiotic genes in yeast// Proc Natl Acad Sci USA 1989 Dec; 86(24): 10018-22

129. Sugars KL, Rubinsztein DC. Transcriptional abnormalities in Huntington disease// Trends Genet. 2003 May;19(5):233-8.

130. Sunde M, Blake С. The structure of amyloid fibrils by electron microscopy and X-ray diffraction// Adv Protein Chem. 1997;50:123-59

131. Tatzelt J, Prusiner SB, Welch WJ. Chemical chaperones interfere with the formation of scrapie prion protein// EMBO J. 1996 Dec 2; 15(23): 6363-73.

132. Taylor, K. L., Cheng. N. Williams, R. W., Steven, A. S., Wickner, R. B. Prion domain initiation of amiloid formation in virto from native Ure2p// Sciense. -1999. V. - 283. - P. 1339 - 1343.

133. Theis M, Si K, Kandel ER. Two previously undescribed members of the mouse CPEB family of genes and their inducible expression in the principal cell layers of the hippocampus// Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Aug 5; 100(16): 9602-7.

134. Towbin, H., Staehlin, Т., and Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins fron polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications// Proc. Natl. Acd. Sci. USA. 1979. - V. 76. - P. 4350 - 4354.

135. True HL, Lindquist SL. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity// Nature. 2000 Sep 28; 407(6803):477-83.

136. Tuite MF, Mundy CR, Cox BS. Agents that cause a high frequency of genetic change from psi+. to [psi-] in Saccharomyces cerevisiae// Genetics. 1981 Aug;98(4):691-711.

137. Tuite, M. F., Lund, P. M., Futcher, А. В., Dobson, M. J., Cox, B. S., and McLaughlin, C. S. Relationship of the psi. factor with oter plasmid of Saccharomyces cerevisiaee// Plasmid. 1982. - V. 8. - P. 103 -111.

138. Tuite, M. F., Mundy, C. R., and Сох, В. C. Agents that cause a high frequency of genetic charge from \psi+. to psi ] in Saccharomyces cerevisiaee// Genetics. -1981.-V. 98.- P. 691-711.

139. Uptain SM, Sawicki GJ, Caughey B, Lindquist S. Strains of PSI(+). aredistinguished by their efficiencies of prion-mediated conformational conversion// EMBO J. 2001 Nov 15;20(22):6236-45.

140. Vacher С, Garcia-Oroz L, Rubinsztein DC. Overexpression of yeast hspl04 reduces polyglutamine aggregation and prolongs survival of a transgenic mouse model of Huntington's disease// Hum Mol Genet. 2005 Nov 15;14(22):3425-33.

141. Valouev IA, Kushnirov VV, Ter-Avanesyan MD. Yeast polypeptide chain release factors eRFl and eRF3 are involved in cytoskeleton organization and cell cycle regulation// Cell Motil Cytoskeleton. 2002 Jul;52(3): 161-73.

142. Warrick JM, Chan HY, Gray-Board GL, Chai Y, Paulson HL, Bonini NM. Suppression of polyglutamine-mediated neurodegeneration in Drosophila by the molecular chaperone HSP70// Nat Genet. 1999 Dec;23(4):425-8.

143. Wegrzyn RD, Bapat K, Newnam GP, Zink AD, Chernoff YO. Mechanism of prion loss after Hspl04 inactivation in yeast// Mol Cell Biol. 2001 Jul;21(14):4656-69.

144. Welch WJ, Gambetti P. Chaperoning brain diseases// Nature. 1998 Mar 5; 392(6671): 23-4.

145. Wickner, R. B. URE3. as an aiterd Ure2p protein: evidence for prion analogue in Saccharomyces cerevisiaeell Science. 1994. - V. 264. - P. 566 - 569.

146. Yang Y, Turner RS, Gaut JR. The chaperone BiP/GRP78 binds to amyloid precursor protein and decreases Abeta40 and Abeta42 secretion// J Biol Chem. 1998 Oct 2;273(40):25552-5.

147. Yoo ВС, Kim SH, Cairns N, Fountoulakis M, Lubec G. Deranged expression of molecular chaperones in brains of patients with Alzheimer's disease// Biochem Biophys Res Commun. 2001 Jan 12; 280(l):249-58.

148. Zhang CC, Steele AD, Lindquist S, Lodish HF. Prion protein is expressed on long-term repopulating hematopoietic stem cells and is important for their self-renewal// Proc Natl Acad Sci USA. 2006 Feb 14;103(7):2184-9.

149. Zhou P, Derkatch IL, Liebman SW., The relationship between visible intracellular aggregates that appear after overexpression of Sup35 and the yeast prion-like elements PSI(+). and [PIN(+)]//Mol Microbiol. 2001 Jan;39(l):37-46.

150. Я более чем благодарен моему партнеру и коллеге по работе Александре

151. Вишневской за множество проведенных совместно экспериментов, зазамечательное планирование и обсуждение результатов, за переживание неудач.

152. Я очень благодарен Ивану Александрову за помощь в обдумывании и правке диссертации, а также обсуждении результатов.

153. Также хочу выразить глубокую благодарность своей жене и детям за терпение во время написания диссертации.