Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование некоторых биохимических механизмов трансмембранной передачи инсулинового сигнала

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование некоторых биохимических механизмов трансмембранной передачи инсулинового сигнала"

рга о

2 5 }ЛЛГ №\

Российская академия медицинских наук ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ

На правах рукописи УДК 615.844.6.015.4:612.И1].07

ДЕМИДОВА Валентина Семеновна

ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ БИОХИМИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ ТРАНСМЕМБРАННОЙ ПЕРЕДАЧИ ИНСУЛИНОВОГО СИГНАЛА (на примере плазматической мембраны эритроцита человека).

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в институте хирургам им.А.В.Вишневского РАМН НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор - КАРЕЛИН А.А.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук, профессор,

член-корреспондент Российской АМН - ТКАЧУК В.А. доктор биологических наук, профессор - ЛЕВАЧЕВ М.М.

Ведущая организация - Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения.

Защита состоится " СЫС /ц^^Л^ 1994 г. в часов

на заседании специализированного совета Д.001.02.01. при Институте питания РАМН по адресу: 109240 Москва, Устьинский проезд, д.2/14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института питания РАМН.

Автореферат разослан "_ -/£> " . ; а РПЩСЬ 1994 г.

,М й ЬтиСи

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук

В.М.ЖМИНЧЕНКО

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность темы.

До настоящего времени не расшифрованы механизмы, посредством которых клетки принимают и передают внешние информационные сигналы, а также биохимические реакции, обеспечивающие преобразование сигнала.

Полипептидные гормоны и факторы роста представляют собой класс регуляторов пролиферации и диффереицировки клеток, обладающих специфическими рецепторами на плазматической мембране (ПМ) (Кусень С.И. и др., 1985; Веренинов A.A. и 1986; Ullrich et al., 1990). Помимо ведущей роли в клеточном метаболизме инсулин является важнейшим универсальным фактором клеточной пролиферации (Rechler et al., 1974; Hayashi et al., 1978; Rosengurt, 1980; King et al., 1981, 1983; Balk et al., 1982; Brodshaw et al., 1983; Kan et al., 1982; Libly et al., 1983; Sun et al., 1985; Soler et al., 1989).

Долгосрочные эффекты инсулина на внутриклеточный метаболизм хорошо известны, и показано широкое разнообразие пострецепторных путей гормонального сигнала (Кучеренко Н.Е., 1986; Мертвецов Н.П., 1986; King et al., 1981, 1983; Lanier et al., 1982; Kahn et al., 1988, 1989; Rosen, 1989; Ullrich et al., 1990). Однако, самые ранние события, протекающие в ПМ клетки-мишени при взаимодействии инсулина с клеточным рецептором, в настоящее время недостаточно изучены. Специализированный механизм инсулин-рецепторного взаимодействия расшифрован не полностью, тем не менее неоспоримо доказано, что в нем не принимают участие известные вторичные мес-сенджеры: сАМР, кальций, иновитолтрифосфат и диацнлглицерол (Берридж М.Д., 1985). Поэтому выявление плазмамембранных медиаторов, непосредственно возникающих при взаимодействии инсулина с клеточным рецептором, представляет большой интерес.

В литературе имеются сообщения о неоднородности распределения АТР как в клеточных (Jones, 1986), так и во внутриплаэмамембранных (Aw et al., 1985) компартментах, а в трансформирующихся клетках концентрация АТР вблизи ПМ падает до нуля (Anafi et al., 1992). При исследовании ин-сулинового рецептора показано, что тироэин-киназа ß-субъединицы обладает АТР-свяаывающим центром, но не имеет доступа к цитоплазматическому АТР (Van Obberghen et al., 1984).

В 1979 году А.А.Карелин предположил, что в каскаде биохимических реакций, происходящих в ПМ клетки после формирования инсулин-рецептор-ного комплекса, должен присутствовать химический посредник и/или промежуточный эффекторный элемент, обеспечивающий трансмембранное сопряжение внешнего стимула с клеточным ответом. Экспериментально был показан быстрый - в течение первой минуты взаимодействия - синтез АТР в обогащенных плазматическими мембранами частицах (ОПМЧ) из скелетных мышц крысы при взаимодействии с инсулином (Карелин A.A., 1979, 1979(a), 1981, 1982, 1983).

Это предположение нашло свое подтверждение в серии работ группы Карелина A.A. за 1985-1993 годы по изучению феномена образования АТР при взаимодействии родственных инсулину полипептидных факторов с ПМ различных тканей-мишеней. Показано, что интактные ПМ обладают базаль-ным синтезом АТР до 10 нмоль/мг белка - мин~1, а при действии полипептидных факторов роста уровень биосинтеза АТР увеличивался в среднем до 30 нмоль/мг белка • мин-1. Этот стимулированный АТР получил название плазмамембранного "сигнального" АТР (псАТР).

ПМ клеток нельзя выделить без контаминаций другими внутриклеточными мембранами, поэтому трудно утверждать, что полученные A.A. Карелиным результаты отражают только плазмамембранные эффекты. Оставались невыясненными точная клеточная топография, природа и механизм синтеза

псАТР, а также возможное клинико-диагностическое значение определения уровня псАТР при различных заболеваниях. Эритроциты лишены внутриклеточных мембран, а их плазматическая мембрана обладает интегральными свойствами ПМ животных клеток (Blank, 1980) и имеет специфические инсу-линовые рецепторы (Gambhir, 1978, 1988). Поэтому ПМ эритроцитов были выбраны в качестве объекта исследования для изучения механизма инсулин-стимулируемого синтеза псАТР в норме и при различных патологических состояниях.

Цель исследования.

Изучить условия и возможный механизм синтеза плазматическими мембранами эритроцитов человека плазмамембранного АТР после взаимодействия инсулина со специфическими рецепторами.

Задачи исследования.

1) Экспериментально установить адекватность объекта исследования -плазматической мембраны эритроциты человека - для изучения плазмамембранного инсулинстимулируемого синтеза АТР.

2) Изучить роль плазматической мембраны эритроцита в синтезе плазмамембранного АТР.

3) Определить условия, необходимые для биосинтеза АТР плазматическими мембранами эритроцитов и выбрать оптимальные значения концентрации инсулина, температуры и длительности инкубации.

4) Изучить роль ионов (Н+ и Na+) в процессе биосинтеза АТР плазматическими мембранами эритроцитов человека при специфическом взаимодействии инсулина с рецепторами.

5) Изучить возможность сопряжения ннсулинстамулнруемого синтеза АТР и функционирования редокс-цепи плазматических мембран эритроцитов (с использованием техники ингибнторного анализа).

6) Провести сравнительное изучение биосинтеза плазмамембранного "сигнального" АТР плазматическими мембранами эритроцитов здоровых доноров и больных с различными видами патологических состояний, отягощенных интоксикационным синдромом.

Научная новизна работы.

В представленной работе впервые изучены условия и возможный механизм биосинтеза плазмамембранного "сигнального" АТР в процессе взаимодействия инсулина с рецепторами плазматических мембран эритроцитов, что имеет важное значение для понимания ранних (первая минута) изменений, протекающих в клеточной мембране.

Доказано существование инсулинстимулируемого биосинтеза плазмамембранного "сигнального" АТР из ADP и неорганического фосфата в условиях аэробного NAD-H-зависимого окисления, сопряженного с переносом ионов через ПМ эритроцита человека.

Впервые с помощью ингибиторного анализа удалось установить сопряжение функционирования редокс-цепи и синтеза лсАТР в ПМ животной клетки. Изучена роль ионов Н+ и Na+ в процессе биосинтеза АТР. Показано, что при разрушении протонного градиента высокими концентрациями FCCP (10-4-Ю-Зм) и при удалении Na+ ионов из среды инкубации происходит полное исчезновение наблюдаемого накопления АТР.

Показано, что ПМ эритроцита человека сохраняет способность синтезировать псАТР у больных с интоксикационным синдромом при различных патологических состояниях, однако уровень биосинтеза псАТР у больных значительно ниже, чем у здоровых доноров.

Практическая ценность диссертации.

Изучен возможный механизм инсулинстимулируемого биосинтеза плаз-мамембранного "сигнального" АТР ПМ эритроцита, как вероятного универсального низкомолекулярного мессенджера при трансмембранной передаче внешнего полипептидного сигнала внутрь клетки.

Предложен клинико-диагностический тест на определение эффективности процедуры лечебного плазмафереза у больных с интоксикационным синдромом по измерению уровня биосинтеза псАТР ПМ эритроцитов.

Апробация работы.

Основные положения и материалы диссертации доложены на Всесоюзном симпозиуме "Энергетические аспекты клеточной физиологии" (Пущино, 1988); на VI Всесоюзном симпозиуме "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментных процессов" (Петрозаводск, 1988); на 19й конференции ФЕБО (Рим, Италия, 1989); на Всесоюзном совещании "Молекулярные механизмы энергетического обмена" (Пущино, 1990); на Всесоюзной школе "Биологические мембраны" (Пущино, 1990); на Всесоюзной школе-конференции "Проблемы мембраной биоэнергетики" (Пущино, 1991); на симпозиуме стран СНГ "Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации" (Москва, 1993); на симпозиуме "Неспецифический аорто-артериит с поражением ветвей дуги аорты и висцеральных ветвей брюшной аорты" (Ташкент, 1993), на Первой конференции Московского общества гемафереза" (Москва, 1993), на симпозиуме "Пути передачи внеклеточного сигнала" (Звенигород, 1993).

Публикации.

Основные материалы диссертации опубликованы в центральных журналах и сборниках в 8 печатных работах. 2-750{

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 116 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4х глав, отражающих методы и результаты собственного исследования, обсуждения результатов работы, заключения, выводов н списка литературы. Основной материал иллюстрирован 20 таблицами и 22 рисунками. Литературный указатель включает отечественных и З'/г7 зарубежных публикаций. Работа выполнена в клинико-биохимической лаборатории Института хирургии им А.В.Вишневского РАМН, руководитель - профессор, доктор биологических наук А.А.Карелин.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Материалы и методы исследования.

В экспериментах использовали препарат ПМ эритроцитов человека, выделенный из свежевзятой венозной крови здоровых взрослых людей и больных с интоксикационным синдромом. Кровь получали из отделения переливания крови и отделения гемодиализа института хирургии им.А.В.Вишневского РАМН. Всего проведено 246 экспериментов. ПМ получали, применяя гипотонический лизис эритроцитов и многократно промывая мембраны 0.001М раствором НаНСОз рН 7.4 (Петрова М.П. и др., 1978; Албертс Б. и др., 1986). Полученный препарат ПМ исследовали на электронном микроскопе ЛЕМ-ЮОС (МеоГ, Япония) со сканирующей приставкой ^о1 ЛЕМА511)-4.

Чистоту препаратов ПМ контролировали по мембранному маркерному ферменту 5'-нуклеотидазе (Нерре1 е! а1., 1955). Количество белка определяли по методу Ьоюту Э. (Ьо^гу е! а1., 1951).

Исследование связывания 1251-ллсулина с рецепторами ПМ эритроцитов человека проводили по методу Нау-Тагип (11ау-Тагип е1 а1., 1986). Свя-

зывание инсулина определяли по разности между экспериментальными образцами, содержащими меченный 125]_,ШСуЛШ1 „ образцами, содержащими избыток немеченного инсулина. Результат использовали дм построения графика 8са1сЬаг<1 О. (5са1сЬап1, 1949) и определяли параметры связывания.

Хроматографическое выделение АТР осуществляли по методу Прохаз-ка 3. (Прохаэка 3. и др., 1982). Полноту выхода АТР контролировали с помощью радиоактивного свидетеля 14С-АТР. Количественное определение АТР проводили по модифицированному методу КогпЬег£ А. (КогпЬегй, 1950) и люциферин-лгоциферазным методом (Ладыгина М.Е., 1971). Два независимых метода определения АТР удовлетворительно коррелировали до значений 10_12м АТР, данные варьировали не более 5-10%.

Концентрацию ионов N0+ и К+ в инкубационной среде измеряли на пламенном фотометре фирмы "Весктоп", США. Измерение генерации супероксида осуществляли, используя ингибируемое супероксидднсмутазой восстановление цитохрома с (ВгсЛг е1 а1., 1974). Потребление кислорода в процессе синтеза псАТР ПМ эритроцитов определяли полярографическим методом (Шольц К.Ф. и др., 1975) с помощью стеклянного электрода Кларка на поля-рографе ЬР-7 (Чехословакия) с автоматической регистрацией данных на самописце прибора.

Для оценки достоверности полученных результатов использовали методы статистической обработки с применением {-критерия Стьюдента (Рокитский П.Ф., 1967).

Результаты п их обсуждение

Электронномикроскопическое исследование препарата ПМ эритроцитов выявило целые замкнутые мембраны - "тени" эритроцитов, диаметром 1012 мкм, а также более мелкие мембранные везикулы, как правильно ориентированные, так и вывернутые наизнанку.

Анализ специфического связывания инсулина с рецепторами ПМ эритроцитов проводили, используя графический метод ¡5са1с)тг<1 О. Форма полученной кривой (рис.1) свидетельствует о наличии двух классов инсу-линовых рецепторов: высокоаффинных с низкой константой диссоциации и низкоаффинных с высокой константой диссоциации Рассчитанные количества специфических рецепторов эритроцитов (высокоаффинных - 8.9 •юю на мг белка и низкоаффинных -1.2-ДО13 на мг белка) соответствуют данными литературы (Лау-Тагип е1 а1., 1986). Полученные результаты свидетельствуют о сохранении структуры и биологических свойств ПМ эритроцитов в процессе их выделения.

(фиоль/ыг Оелка/нМ)'Ю^

фиоль инсулннл/ыг

Рис.1. Специфическое связывание ^5[.инсуЛина ПМ эритроцитов при 22°С. Каждая точка - среднее 7 экспериментов (р<0.05). В/Р - отношение связанного 1251. инсулина к свободному инсулину.

Исследование оптимальных условий биосинтеза АТР ПМ эритроцитов выявило максимальные значения при 30°С в течение 45-60 сек, к 3-ей минуте АТР практически не выявляется. Поэтому температура 30°С и инкубация длительностью 60 сек были выбраны для проведения всех дальнейших экспериментов (рис.2а,Ь).

псАТР, нмоль/мг Велка^мин-!

0.2 -

0.1 -

0.0

псАТР, нмоль/мг белка*мин-1

0.2

0.1

20

25

30

35 t,°C

0.0

О 30 60 90 120150180

t, мин

Рис.2. Зависимость стимулируемого инсулином синтеза псАТР препаратом ПМ эритроцитов человека от температуры (А) и времени (Б) инкубации. Каждая точка - среднее 6 определений (р<0.05).

Важно было исследовать уровень биосинтеза АТР при различных концентрациях инсулина в инкубационной среде. Мы получили практически одинаковый уровень синтеза псАТР в диапазоне от физиологических концентраций до концентраций, используемых in vitro при культивировании клеток (рис.3). Выбранная нами концентрация инсулина 0.4 мкг/мл обеспечивала высокую скорость и полноту оккупации рецепторов.

псАТР, нмоль/ur Белка*мин~1

Рис.3. Зависимость образования псАТР препаратом ПМ эритроцитов от концентрации инсулина в инкубационной среде. Каждая точка - среднее 6 определений (р<0.05).

Оценка роли ПМ в биосинтезе инсулинстимулируемого АТР была проведена в экспериментах с солюбилизированными в 1% растворе Тритон Х-100 ПМ. В этих условиях разрушается структура ПМ, но рецептор сохраняет свои функционально-структурные свойства (Grigorescu, 1983). Показано, что в солюбилиэированных мембранах происходит полный блок как базального, так и инсулинстимулированного синтеза АТР.

Опираясь на эти данные, мы предположили, что инсулинстимулируемый синтез АТР может ассоциироваться с системой редокс-ферментов ПМ. Известно, что в ПМ животных клеток существует NAD • Н - специфичная протон-выкачивающая редокс-цепь (Crane et al., 1985). Она по своей молекулярной организации очень проста и состоит из NADH-специфичного флавопротеина и цитохром 1>5, а фермент строго специфичен для NAD-H (Карякин A.B. и

др., 1985). Используя 0.1 мМ NAD-H в реакции, мы наблюдали в течение первой минуты инкубации интенсивное падение оптической плотности инкубационной среды при 340 нм (максимум поглощения NAD-H). Инсулин ускорял исчезновение NAD-H из инкубационной среды (рис.4). Эти эксперименты подтвердили участие NAD-H в процессе синтеза АТР ПМ эритроцита человека в качестве донора протонов и электронов.

Е340

—0— контроль [ j инсулмн (0.4 ыкг/мл)

Рнс.4. Временная зависимость изменения оптической плотности полной инкубационной среды при взаимодействии инсулина с ПМ эритроцитов человек». Каждая точка - среднее 7 экспериментов (р<0.05). E34Q - оптическая плотность при 340 нм.

Далее было важно определить участие кислорода в процессе биосинтеза АТР ПМ эритроцитов человека. Прямое измерение потребления кислорода позволило установленовить, что инсулин увеличивает поглощение кислорода на 31.6% в процессе синтеза псАТР ПМ в течение первой минуты. Экспери-

менты, проведенные в атмосфере аргона свидетельствовали о полной остановке биосинтеза АТР ПМ эритроцита.

Полученные результаты являются важнейшим доказательством неглико-литического пути биосинтеза АТР. Этот синтез не связан с реакциями типа субстратного фосфорилирования, для которых необязательна целостность и замкнутость ПМ. Однако самым убедительным доказательством биосинтеза АТР служит включение неорганического фосфата в АТР de novo (табл.1). Применив аналог фосфата арсенат-ион в качестве ингибитора биосинтеза АТР в реакции аэробного фосфорилирования, также получили ингибирование синтеза АТР ПМ эритроцитов.

Таблица 1.

Включение 32р в АТР, синтезированный препаратом ПМ эритроцитов человека при специфическом взаимодействии с инсулином

Условия эксперимента Выход 32Р к 100% выхода 14С-АТР-свидетеля; (М+т)

имп/мин имп/мг белка

Контроль* сорбции 32р 1600+ 54.3

без инсулина 1471 + 157.0 200.2+15.6

с инсулином 4 мкг/мл 2550+318.7 п=3, р<0.01 372.0+48.1

* Потеря изотопа за счет его неспецифической сорбции компонентами инкубационной среды.

Данные свидетельствуют о достоверном участии неорганического фосфата в процессе синтеза АТР ПМ эритроцитов, усиливающемся при специфическом взаимодействии инсулина с рецепторами ПМ. Включение 32р в АТР убедительно доказывает, что ПМ эритроцитов синтезируют АТР de novo из

ADP и Pj, в условиях аэробного окисления NAD-H, а не происходит высвобождение АТР из мембранных пулов.

Мы пытались изучить возможный механизм синтеза АТР, основываясь на полученных результатах и литературных данных о том, что ПМ эритроцита обладают NAD-H-зависимой протон-выкачивающей редокс-цепью и Na+,K+-АТРаэой, способной к обращению своей функции (Post, 1989). Мы предположили, что эти два механизма могут функционировать на ПМ сопряженно при биосинтезе АТР под дейсТЬием инсулина.

В связи с этим мы изучйЯя участие трансмембранной NAD'H-дегидроге-назы (NAD-H-оксидазы) в инулин-стимулируемом синтезе АТР ПМ. Адриа-мицин (510-5М), иншбитор фермента, полностью блокировал синтез псАТР, т.е. происходит окисление NAD-H и, вероятно, формируется протонный градиент. Для исследования роли протонного градиента в синтезе АТР ПМ эритроцита использовали протонофор FCCP (в концентрациях от 10"' до Ю^М).

FCCP в концентрациях 1 и 5 мкМ резко увеличивал биосинтез псАТР, однако дальнейшее повышение Концентрации прспЪнофора (0.1-1 мМ FCCP) приводит к снижению образования АТР ПМ. Литературные данные свидетельствуют, что в высоких концентрациях FCCP разрушает структуру липид-ного бислоя мембраны и может рассеивать энергию протонного градиента (Benz et al., 1983). Эти результаты показывают, что инсулинстимулируемый синтез псАТР возможен только при существовании электрохимического потенциала протона на ПМ. Так Как ПМ животной клетки лишена Н+-АТРазы, то единственным источником образования градиента может быть NAD-H-окси-даза - дыхательный фермент ПМ. Известно, что окисление NAD-H hjiohcxo-дит при участии цитохром Ьд, который получает электрон от NAD-H через восстановленную форму флаволротеина, в результате чего образуется супероксид-анион радикал. Эта реакция протекает с минимальной затратой энергии при участии одного электрона (Либерман Е.А., 1975). Мы зафиксировали,

что в процессе биосинтеза псАТР ПМ эритроцитов инсулин повышает продукцию супероксид-анион радикала с 1.35 до 1.82 нмоль/мг белка • мин '. Кроме того, отравление флавопротеина мерсалиповой кислотой полностью блокировало биосинтез АТР в ПМ эритроцита. Эти результаты позволили нам сделать вывод о сопряжении инсулинстимулируемого биосинтеза псАТР с функционированием редокс-цепи ПМ эритроцита.

псАТР, нмоль/мг 6елка*ыин~1

12 -10 -В -а -

4 -2 -0 -0 20 40 60 80 100 120 140 .

КаТыМ

Рис.5. Уровень биосинтеза псАТР ПМ эритроцитов при различных концентрациях Na * Каждая точка - среднее 5 экспериментов (р<0.05).

Хорошо известно, что ПМ животной клетки является натриевой мембраной. Поэтому, при оценке возможного участия АТРазы ПМ эритроцита в иноулинстимулируемом биосинтезе АТР на основании полученных результатов предпочтение было отдано Na+ ,К+ -АТРазе, способной к обращению своей функции (Post, 1989). В инкубационной среде, не содержащей ионы натрия, синтез АТР не зарегистрирован, однако, повышение концентрации Na+ вое-

станавливает эффект, и максимальный синтез псАТР наблюдали при физиологических концентрациях ионов натрия в среде (рис.5).

Ингибиторы Na+,K+-АТРазы - оуабамн в концентрации 0.510-бм (Levin et al., 1988) и амнлорид в концентрации 2.5-10-Зм (Soltoff et al., 1983), вызывали: оуабаин - резкое снижение (на 92%) инсулннстимулируемого синтеза псАТР, амилорид - полный блок этого синтеза.

На основании полученных данных можно сделать вывод о причастности Na+.K^ ATPaau ПМ эритроцитов к инсулинстимулируемому биосинтезу псАТР. Скорее всего, ионы Na+ инкубационной среды участвуют в образовании AS - натрий-движущей силы за счет преходящего обращения натрий транспортирующей АТРазы.

Весьма вероятно, что синтезируемый ПМ АТР активно потребляется мембранными к л пазами. Добавление в инкубационную среду ингибитора ки-наэ - структурного аналога АТР 5'-фторсульфонилбензоиладенозина (FSBA) (Feige et al., 1983) в концентрации 1 мкМ приводило к увеличению количества псАТР с 0.24 до 8.0 нмоль/мг белка ■ мнн~1.

Подводя итог, можно предположить следующий механизм инсулннстимулируемого синтеза псАТР плазматическими мембранами эритроцитов. Вызванное инсулином окисление NAD-H под действием протон-выкачивающей NAD-H-дегидрогеназы на ПМ, вероятно, приводит к генерации Д*Р за счет движения протона через мембрану. Это событие, скорее всего, изменяет функцию, возможно, Na+,K+-ATPa3bi посредством прямого протонирования или по принципу дальнодействия таким образом, что натрий наружной среды может использоваться в качестве AS - натрий-движещей силы для совершения химической работы по синтезу псАТР при помощи преходящего обращения действия натрий-транспортирующей АТРазы. Короткоживущий псАТР быстро переносит свой у-фосфат, вероятнее всего, на тирозиновую киназу инсулннового рецептора и инициирует тем самым каскад фосфорилирования,

обеспечивающий передачу сигнала от инсулмн-рецепторного комплекса в клетку (Ullrich et al., 1990).

Хорошо известно, что ПМ эритроцита изменяет свои транспортные свойства при различных патологических состояниях (см. в кн: "Мембраны и болезнь", 1980). Поэтому важно было изучить, изменяется ли инсулинстиму-лируеМый биосинтез АТР ПМ эритроцитов человека при различных заболеваниях. В предварительных экспериментах нам удалось обнаружить значительное сйижеиие уровня псАТР у больных с интоксикационным синдромом по сравйбвню со здоровыми донорами. Известию, что ПМ эритроцита способна адссфбйровать на своей поверхности токсины, антитела и иммунные комплексы, что приводит к изменению ее функциональных свойств. Актуальность исследования обусловлена тем, что интоксикационный синдром является одной из основных причин гибели больных, находящихся в критическом состоянии.

В настоящее время в Клинической практике для удаления из организма токсических веществ и агрессивных иммунных комплексов применяется метод лечебного плаэмафереза, при проведении Roroporo из организма удаляются с плазмой различные патогенные субстанции с последующими трансфузиями плазмозамещающих растворов, лечебных препаратов и коррегирующих средств для восстановления нормального состава крови (Марчук А.И., 1990). Эффективность лечебного плаэмафереза оценивается совокупностью клинико-биохимических и иммунологических показателей. Однако, на сегодняшний день не существует объективного критерия по оценке эффективности этой лечебной процедуры.

Для создания модели интоксикационного синдрома мы иммунизировали здоровых доноров 4-Мя мл очищенного адсорбированного стафилококкового анатоксина в общей сложности. Уровень биосинтеза псАТР ПМ эритроцитов измеряли до и после процедуры плаэмафереза. Контрольную группу составили здоровые доноры. Показатель псАТР в данной группе после плаэмафереза

возрастал на 10%. Это увеличение можно объяснить удалением с плазмой

избыточных компонентов, которые могут присутствовать в крови практически

у всех здоровых людей (рис.6).

псАТР, нмоль/мг белка»мин-1

123456789 - до плашафереза ^004 - после плазыафереэа

Рис.6. Влияние плаэмафереза на уровень биосинтеза псАТР ПМ эритроцитов у доноров и больных с интоксикационным синдромом при различных заболеваниях: 1 - доноры, 2 - иммунизированные доноры, 3 - печеночная недостаточность, 4 - системная красная волчанка, 5 - миастения, 6 - перитонит, 7 - неспецифический аорто-артериит, 8 - токсическая энцефалопатия, 9'- бронхиальная астма. Среднеквадратаческая ошибка из результатов 5-11 экспериментов (р<0.001).

В группе иммунизированных доноров через 5-7 суток после введения стафилококкового анатоксина показатель псАТР ПМ эритроцитов был достоверно ниже (на 22.2%), чем у здоровых доноров. После плаэмафереза этот показатель практически соответствовал уровню здоровых доноров. Таким образом, опосредованные влиянием стафилококкового анатоксина изменения

функциональных свойств ПМ эритроцитов, носят обратимый характер и восстанавливаются после проведения лечебного плазмафереза.

При ряде заболеваний, сопровождающихся высокой интоксикацией уровень псАТР эритроцитов значительно снижен по сравнению со здоровыми донорами.

Показатели уровня биосинтеза псАТР у больных после плазмафереза имели четкую тенденцию к возрастанию, хотя были ниже чем у здоровых доноров (рис.6). В случаях, когда уровень псАТР сохранялся на низких значениях после выполнения лечебного плазмафереза можно было утверждать о неэффективности лечебных мероприятий или о необратимости нарушений функциональных свойств ПМ эритроцитов, что коррелировало с клинической оценкой состояния больных.

Проведя эти исследования мы сделали вывод, что уровень инсулинсти-мулируемого биосинтеза псАТР объективно отражает функциональное состояние ПМ эритроцитов и может служить критерием при оценке эффективности детоксикационной процедуры лечебного плазмафереза у больных с интоксикационным синдромом.

Заключение.

В представленной работе впервые установлено, что в ответ на связывание инсулина с рецепторным комплексом ПМ эритроцита человека синтезируется псАТР из ADP и неорганического фосфата в условиях аэробного фосфо-рилирования.

Методом ингибиторного анализа показано сопряжение синтеза псАТР с функционированием NAD-H-связанной системы окисления ПМ эритроцитов человека.

На основании экспериментов с протонофором - FCCP, с блокатором Na'+yH"'"-обмена в клеточной мембране - амилоридом, ингибитором Na+,K+-

АТРаэы - оуабаином и с использованием безнатриевой среды инкубации, можно с достаточным основанием предположить, что синтез короткоживущего "сигналтрансдуцирующего" АТР на ПМ осуществляется за счет энергии электрохимического Na+ градиента - Дц. Na+ в ходе Ка+/Н+-обменного нонтранс-лоцнрующего ADP-фосфорнлнрования, возможно, за счет преходящего обращения Na+,K+-ATPa3bi, или за счет обращешм действия некоей Н"'"-активируемой Na"1"-АТРаэы ПМ.

Показано, что псАТР потребляется плазмамембраннымн протеинкиназа-ми. Функционально этот тип АТР, вероятнее всего, является частью системы, обеспечивающей энергетически трансмембранный перенос информации от гормон-рецепторного комплекса на мембранные эффекторные системы клетки и, в первую очередь, на протеннкиназы или кинаэы мембранных фос-фолипидов. Иначе говоря, этот псАТР принимает участие в осуществлении трансмембранного контроля событий, с которыми ассоциируется требующее энергии преобразование внеклеточного регуляторного сигнала после связывания лиганда (инсулина) со своим специфическим рецептором. Точнее, псАТР может являться необходимым компонентом "сигналтрансдуцирующей частицы", известной как комплекс или ансамбль молекул, вовлеченный в трансдукцию сигнальной информации и ведущий к клеточным ответам (Маг-golis et a]., 1989b; Ullrich et al„ 1990).

При изучении уровня инсулинстимулнрованного биосинтеза псАТР в ПМ эритроцитов при различных заболеваниях показано резкое снижение накопления псАТР. Скорее всего это связано с нарушением функциональных свойств ПМ, вызванных интоксикационным синдромом, в некоторых случаях при ряде заболеваний эти изменения носят необратимый характер. Процедура лечебного плазмафереза эффективна только в случае обратимых изменений ПМ эритроцита.

Определение уровня инсулинстимулироваиного биосинтеза псАТР ПМ эритроцитов при заболеваниях, сопровождающихся интоксикационным синдромом, является объективной оценкой эффективности процедуры лечебного плазмафереза и может служить для прогнозирования характера течения данного заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Плазматические мембраны эритроцитов периферической крови человека в процессе выделения сохраняют высоко- и низкоаффинные рецепторы для инсулина, способные связывать инсулин. В выделенном нами препарате ПМ количество высокоаффинных рецепторов на 1 мг белка составило 8.911010 с Ка=1.23-10-9м, а количество низкоаффинных рецепторов на 1 мг белка - 1.15-Ю'З с K,j=0.6210-6m. Это явилось основанием для использования ПМ эритроцитов для изучения механизма ивсулинстимулируемого синтеза плазмамембранного "сигнального" АТР.

2. Плазматические мембраны эритроцитов человека в первую минуту инкуоации с инсулином (10-9М - 10-бМ) способны синтезировать de novo АТР из ADP и неорганического фосфата, что доказано включением 32р в синтезируемый АТР и при использовании арсенат иона - структурного аналога неорганического фосфата. Инсулинсгимулируемый АТР синтезируется плазматическими мембранами эритроцитов в аэробных условиях при +30°С в концентрации 8.0 нмоль/мг мембранного белка • мин"'.

3. Плазматические мембраны эритроцитов человека, обработанные не-ионнмми детергентом Тритон Х-100 (в конечной концентрации 1%), теряют способность синтезировать короткоживущий плазмамембранный "сигнальный" АТР из ADP и неорганического фосфата. Из этого следует, что для инсулин-стимулируемого синтеза АТР необходимы целостность структуры и замкнутость "теней" плазматических мембран эритроцитов.

4. Инсулинстимулируемый синтез псАТР в эритроцитарных мембранах сопряжен с окислением NAD-H молекулярным кислородом, что сопровождается одноэлектронным восстановлением цитохрома с участием супероксид-анион радикала. Измерение поглощения кислорода полярографическим методом с электродом Кларка показало, что инсулин увеличивает поглощение кислорода из инкубационной среды на 31.6%. Инсулин активирует продукцию супероксид- анион радикала ПМ эритроцитов на 0.472 нмоль/мг белка • мин"1.

5. Инсулинстимулируемый синтез псАТР ПМ эритроцитов активируется низкими концентрациями протонофора FCCP (10"6М) и подавляется высокими концентрациями протонофора FCCP (Ю'^М - ю-Зм). Инсулинстимулируемый синтез псАТР полностью блокируется ингибитором трансмембранной NAD-H-дегидрогеназы - адриамицином (510-5М); ингибитором NAD-H-cne-цифичног» флавопротеина - мерсалилом (10-^М); ингибитором Na+,K+-АТРазы - оуабаином (0.5-10"®М) и ингибитором натриевых путей в мембране (Na+/H+-o6MeH и Na+ -АТРаза) амилоридом (2.510-Зм). Образование псАТР не наблюдается при удалении из инкубационной среды NAD-H, ADP, неорганического фосфата, кислорода и Na+.

6. Синтез псАТР, наблюдаемый в течение 30-60 сек инкубации ПМ эритроцитов с инсулином, не связан с реакциями субстратного фосфорилиро-вания (т.е. с гликолитическим синтезом АТР), что подтверждено отсутствием синтеза псАТР в анаэробных условиях.

7. псАТР потребляется непосредственно на плазматической мембране мембраносвязанными протеинкиназами и фосфатазами, т.к. ингибирование мембранных фосфатаэ с помощью NaF (210-2M) увеличивает синтез псАТР на 17%, а ингибирование протеинкиназ с помощью аналога ATP - FSBA (10"6М) вызывает более чем 30-ти кратное увеличение инсулинстимулируе-мого синтеза ПМ эритроцитов человека (с 0.24 до 8.0 нмоль/мг мембранного белка • мин1).

8. Количественное определение инсулинстамулируемого синтеза псАТР ПМ эритроцитов может быть использовано в качестве клинико-лабораторного теста для оценки эффективности проведения лечебного плазмафереза у больных с интоксикационным синдромом.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Роль АТФ как вторичного мессенджера в трансмембранной передаче сигнала: пути утилизации. // Тез.докл. VI Всесоюзного симпозиума "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментных процессов", Петрозаводск, 1988, с.36-37. (соавт. Карелин А.А., Глоба А.Г.).

2. "Interrelationship between insulin-stimulated ATP production and ion transport events on plasma menbrane", 19th meeting of the FEBS, Rome, July 27, 1989 (TU 391 abstract), (соавт. Karelin A.A., Globa A.G.).

3. "ATP synthesis in plasma membrane enriched particles by the action of insulin and related Growth Factors". // Biochemistry International, 1992. -V.27. - N 1. - P.75-83. (соавт. Karelin A.A., Globa A.G.).

4. "Связь инсулинстамулируемого биосинтеза плазмамембранного АТР с амилоридчувствителышм Na+/H+-обменом в эритроцитах человека". // Вопросы мед. химии. - 1993. - Т.39. - No.6. - С.6-10. (соавт. Карелин А.А., Марчук А.И.).

5. "Стимулируемый инсулином синтез плазмамембранного АТР в плазматических мембранах эритроцитов человека как критерий эффективности лечебного плазмафереза". // Вопросы мед.химии. - 1993. - Т.39. - No.2. -С.15-19. (соавт. Марчук А.И., Ряполова И.В., Козинец Г.И., Карелин А.А.).

6. "Сигналтрансдуцирующий АТР: роль в передаче и усилении сигналов рецепторами факторов роста, содержащими тирозинкинаэы". //В сб.: "Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации", Тез. си мл.