Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование молекулярно-генетических причин аутосомно-рецессивного эритроцитоза в Чувашии

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование молекулярно-генетических причин аутосомно-рецессивного эритроцитоза в Чувашии"

На правах рукописи 003058185

Вассерман Наталья Наумовна

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРИЧИН АУТОСОМНО-РЕЦЕССИВНОГО ЭРИТРОЦИТОЗА В ЧУВАШИИ

03 00 15 «Генетика» АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА, 2007

003058185

Работа выполнена в ГУ Медико-генетический научный центр РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор A.B. Поляков Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Р.Ф. Гарькавцева кандидат медицинских наук В.О. Бобрынина

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится « ft> » ¿fcW 2007 г в -/■/часов на заседании Диссертационного совета Д 001 016 01 при ГУ МГНЦ РАМН по адресу Москва, 115478, ул Москворечье, д 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ МГНЦ РАМН Автореферат разослан «_»_2007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Л.Ф. Курило

J

Актуальность темы

Картирование, идентификация и исследование генов, ответственных за возникновение наследственных заболеваний, являются одним из важных источников знаний о функционировании организма человека Знание гена и его локализации, кроме того, делает возможным прямую и косвенную ДНК-диагностику болезни Становится возможным проведение дифференциальной диагностики сходных клинических заболеваний, а также предсказание развития определенной патологии до появления клинических признаков, в том числе у плода, т е проведение дородовой диагностики Также можно разработать адекватную терапию на основе знания этиологии заболевания, в том числе генотерапию До настоящего времени нет ясного представления о регуляции процессов кроветворения, в частности, эритропоэза Исследование генов, приводящих к наследственным эритроцитозам, может помочь понять ключевые этапы этого процесса

Эритроцитозы характеризуются увеличенным количеством эритроцитов в единице объема крови В литературе описано несколько клинически отличающихся форм эритроцитоза Среди них выделяют ненаследственные формы и семейно-наследственные эритроцитозы, которые являются редкими заболеваниями Они представляют собой гетерогенную по патогенезу группу заболеваний с различным типом наследования Известны следующие причины семейно-наследственных эритроцитозов нарушение функциональных свойств гемоглобина, метаболизма эритроцитов, автономное повышение продукции эритропоэтина В ряде случаев патогенез семейно-наследственых эритроцитозов остается невыясненным

Среди семейно-наследственных эритроцитозов выделяют аутосомно-рецессивную доброкачественную полицитемию Это редкое заболевание, характеризующееся эритроцитозом, нормальным количеством лейкоцитов и тромбоцитов, увеличенной продукцией эритропоэтина (OMIM 263400) Заболевание выявляется преимущественно в детском и юношеском возрасте В мировой литературе описано небольшое число случаев этого заболевания (Adamson et al, 1973, Whitcomb et al, 1980)

В северо-восточных районах Чувашии были обнаружены случаи эритроцитоза, носившие семейный характер Клиника этих случаев не совпадала ни с одной из известных нозологических форм для которых были известны мутации в генах, приводящие к заболеванию (Полякова, 1977) Но клиническая картина при данной форме заболевания напоминает клиническую картину семейной доброкачественной полицитемии (OMIM 263400) Эритроцитоз в чувашских семьях является эндемической формой описанных семейно-наследственных эритроцитозов Его распространенность среди чувашей составляет 1 4450 человек

Мутация, приводящая к развиппо эритроцитоза у чувашей, выявлена в гене VHL, который является геном-супрессором опухолевого роста При мутациях в нем у больных с синдромом VHL развиваются опухоли Однако, ни у больных эритроцитозом (гомозиготных носителей мутации), ни у их родственников - гетерозиготных носителей опухоли не обнаружены Возможно, у них присутствует изменение в другом гене, являющимся модификатором, которое не позволяет развиться опухолям Идентификация этого гена может помочь в понимании процесса опухолеобразования, а также в разработке генотерапии ряда опухолей

Цель исследования

Изучение молекулярно-генетической природы аутосомно-рецессивного эритроцитоза в Чувашии, картирование и исследование области локализации гена, ответственного за развитие заболевания

Задачи исследования

1 Провести картирование локуса аутосомно-рецессивного эритроцитоза на выборке семей с больными из Чувашии

2 Определить популяционную частоту мутации Arg200Trp в гене VHL, распочоженном в локусе Зр25, среди чувашей и близких им народностей

3 Разработать эффективную систему регистрации указанной мутации, пригодную для проведения популяционного скрининга

4 Установить причину и время распространения мутации Arg200Trp в гене VHL среди чувашей

5 Провести анализ независимости сегрегации картированных локусов в семьях с аутосомно-рецессивнымэритроцитозом

Научная новизна

Определены популяционные частоты мутации Arg200Trp в гене VHL, приводящей к развитию аутосомно-рецессивного эритроцитоза, среди чувашей и народов Волго-Уральского региона Определен возраст этой мутации у чувашей Установлена популяционная частота носительства мутации среди народов Волго-Уральского региона чувашей, марийцев, удмуртов и башкир

Показано сцепление локуса аутосомно-рецессивного эритроцитоза с хромосомой llq23 Показана зависимая сегрегация хромосомных локусов Зр25, несущего ген VHL, и llq23 в семьях со случаями заболевания В районе llq23, вероятно наличие модифицирующего фактора, ответственного за разное течение заболевания и отсутствие опухолей у носителей мутации

Практическая значимость

В отягощенных семьях из Чувашии возможно проведение уточняющей, пресимптоматической диагностики, а также выявление гетерозиготного носительства в семьях чувашей, марийцев и удмуртов и на популяционном уровне Разработана система быстрого скрининга носительства мутации Arg200Trp в гене VHL среди большого количества человек на основе real-time PCR Результаты популяционных исследований распространенности мутации при эритроцитозе, возможно, внесут дополнения в понимание процесса этногенеза народов Волго-Уральского региона

Положения, выносимые на защиту

1 Существует генетическое сцепление аутосомно-рецессивного эритроцитоза в Чувашии с хромосомными локусами 1 lq23 и Зр25

2 Популяционная частота мутации Arg200Trp в гене VI IL в чувашской популяции составляет 1 84%, у марийцев - 0 87%, у удмуртов - 0 47% Среди башкир и русских мутация Arg200Trp не выявлена

3 Разработана система простой и быстрой идентификации мутации Arg200Trp в гене VHL на основе real-time PCR

4 Время распространения мутации Arg200Trp в чувашской популяции составляет 1250±733 лет

5 Показана зависимая сегрегация хромосомных локусов Зр25 и llq23 в семьях со случаями аутосомно-рецессивного эритроцитоза, что может указывать на наличие гена-модификатора в области llq23

Апробация работы

По материалам исследования опубликовано 13 научных работ, включая 4 статьи и 1 главу в монографии Материалы диссертации доложены на 29, 30, 32, 37 съездах Европейского общества генетики человека (Генуя, 1997, Лиссабон, 1998, Амстердам, 2000, Прага, 2005), конференции "Геном человека - 99", съезде HGM (Шанхай, 2002), на V съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005) и на Всероссийской научно-практической конференции "Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний возможности и перспективы" (Москва, 2006)

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, приложения и списка литературы (143 источника, из них 9 отечественных и 134 зарубежных) Диссертация иллюстрирована 25 таблицами и 17 рисунками

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Работа была выполнена на образцах ДНК людей, являющихся пациентами Чувашского Государственного Университета Были использованы образцы от 42 больных и 39 их здоровых родственников из 22 семей Также использованы образцы ДНК чувашей, марийцев, удмуртов, башкир, предоставленные лабораторией генетической эпидемиологии ГУ МГНЦ РАМН, образцы ДНК чувашей из лаборатории молекулярной генетики человека Уфимского научного центра института биохимии и генетики РАН, и образцы ДНК русских из банка лаборатории ДНК-диагностики ГУ МГНЦ РАМН

Для выделения геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови использовали готовый набор реактивов DIA torn DNA PreplOO (Isogene Lab ltd , Россия) по протоколу производителя

Для исследования использовали 27 микросателлитных маркеров для геномного скрининга, 29 полиморфных маркеров на хромосоме llq23 для исследования картированного локуса аутосомно-рецессивного эритроцитоза, 11 микросателлитных маркеров, фланкирующих ген VHL на хромосоме Зр25

Амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК проводили методом полимеразной цепной реакции на программируемом термоциклере МС2 производства фирмы "ДНК-технология" (Россия) с использованием ДНК-полимеразы Biotaq ("БиоМастер")

Исследование микросателлитных и SNPs маркеров проводилось методами ПДАФ-и ПДРФ-анализа, соответственно Результаты оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD (США) в УФ-свете В работе использовались эндонуклеазы производства Fermentas (Литва)

Для выявления изменений нуклеотидной последовательности генов FXY D2, FXY D6 и VHL использовались метод SSCP-анализа (Onta et al, 1989) со щелочной денатурацией амплифицированных фрагментов ДНК с последующим разделением в неденатурирующем полиакриламидном геле, окраской 0 5*Sibr® Gold nucleic acid gel stain (Invitrogene™Molecular Probes , США) и регистрацией с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD (США) в УФ-свете, а также

автоматическое секвеиирование по протоколу производителя на приборе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems, США) В качестве матрицы для прямого сиквенса использовали фрагменты, полученные после проведения ПЦР Анализ результатов секвенирования проводился с помощью программ Chromas и BLAST (http //www ncbi nlm nih gov/blast)

Прямую идентификацию мутации Arg200Trp в гене VlIL проводили с помощью разработанных тест-систем методом ПДРФ-анализа и методом Real-time PCR (для популяционных исследований гетерозиготного носительства среди башкир) на термоциклере с Real-time PCR детектирующей системой lCycler ThermalCycler фирмы BIO-RAD Пробы типа TaqMan и праймеры синтезировались в НПО SYNTOL

Оценку сцепления локуса заболевания с полиморфными ДНК-маркерами проводили на основании статистического анализа сегрегации заболевания в семье с аллелями маркеров, используя метод максимального правдоподобия (Ott, 1991)

Двухлокусный анализ сцепления осуществлялся с помощью программы MLINK, входящей в пакет программ "LINKAGE", версия 5 1 (Rockfeller University, URL=http /linckage rockfeller edu) Значение частоты рекомбинации 0, которому соответствовало максимальное значение LOD-балла, вычислялось с помощью программы MLINK За область исключения принималась область, прилежащая к ДНК-маркеру, внутри которой значения LOD-балла было меньше или равно -2

Для статистического сравнения частот аллелей полиморфных маркеров, расположенных на хромосомах, несущих мутацию, и на хромосомах без мутации, использовали стандартный критерий %2 для двупольной таблицы, а также точный критерий Фишера для случаев, когда критерий х2 не применим при малом числе наблюдений

Для оценки степени неравновесия по сцеплению использовали предложенный Bengtsson and Thomson в 1981 году параметр 5 = (Pu-Pn-)/(1-Pn), где PD и Рк - частоты аллеля на хромосомах, несущих мутацию, и на нормальных хромосомах, соответственно, с доверительным интервалом по Diaz et al (2000)

Для определения возраста мутации Arg200Trp в гене VHL использовался подход, основанный на понятии «генетических часов» (Labuda et al, 1997) и оценивающий количество поколений g с момента появления мутации в популяции до настоящего времени, исходя из изменения неравновесия по сцеплению полиморфных маркеров с локусом заболевания за этот период времени Risch et al (1995) Для более точной оценки учитывали поправку go на растущую популяцию (Labuda et al, 1997)

logS

S= log(l-G) ,go=-l/dln(9fd),

где 9 - рекомбинационная фракция, fj = e /(e -1) для популяции, растущей со скоростью d

Результаты и обсуждение Геномный скриннинг

В 2002 году Ang с соавторами была идентифицирована мутация Arg200Trp в гене VHL у чувашских больных с АРЭ Однако при исследовании чувашских семей с бодьными АРЭ нами было обнаружено сцепление локуса АРЭ с двумя локусами 1 lq23 и Зр25

Нами был проведен аналог полногеномного скриннинга с использованием полиморфных микросателлитных маркеров, имеющихся в лаборатории ДНК-диагностики ГУ МГНЦ РАМН Было проанализировано 25 полиморфных микросателлитных маркеров, расположенных на хромосомах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,

11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 21, 22, а также маркер в интроне 12 гена СОЫА2 на хромосоме 7q21 3 для исключения сцепления с геном-кандидатом Еро и повтор на 5'-конце гена-кандидата ЕРОЯ на хромосоме 19р13 2 Исследование сцепления с указанными полиморфными маркерами позволило исключить область генома с генетическим размером 277 сМ (8 4% генома)

При проведении анализа сцепления положительные ЬОО-баллы были получены для двух маркеров ЬОГ)=2 47 получен с маркером П1181294 на хромосоме 11 для десяти семей

Было проведено исследование дополнительных полиморфных маркеров 01184175, находящегося на расстоянии 18 млн п н от 01151294 в сторону центромеры, и 01181356 - на расстоянии 9 52 млн п н в сторону теломеры По обоим маркерам были получены положительные Ьоё-баллы, равные 1 20 и 3 38 для Б1184175 и 01131356, соответственно Это указывает на сцепление гена, ответственного за развитие АРЭ, с интервалом 01181294-01181356 Дальнейший анализ сцепления с маркерами из данного интервала позволил локализовать ген эритроцитоза в районе 11ц23 Максимальный ЬСЮ=4 23 при 0тах=О 05 был получен для маркера АР757/98 (табл 1)

Таблица 1 Значения ЬСЮ-баллов для полиморфных маркеров на хромосоме 11

Маркер\ в 0 001 0 05 0 10 0 20 0 30 0 40 0 50

Е)1184175 -00 -4 71 -0 49 0 78 1 20 0 80 0 25 0

01181294 -со -1 83 1 62 2 47 2 29 1 36 041 0

АР2342/02 -00 0 29 3 11 3 63 2 96 1 67 0 50 0

Ш184127 -00 0 29 2 53 2 93 2 36 1 31 0 38 0

РХУЛ -оо -0 45 2 88 3 54 2 94 1 67 0 49 0

АР757/98 -00 3 54 4 23 3 94 2 77 1 48 0 43 0

01181356 -00 -1 36 2 54 3 38 2 90 1 66 0 49 0

Е)1184171 -00 -4 36 -0 03 1 26 1 59 1 02 0 32 0

Также получен ЬОО=11 5 при 6=0 для маркера 0381597 из локуса Зр25 При использовании маркера 0381263, находящегося на расстоянии 6 18 сМ от маркера 0381597, ЬОО=12 4

Мутация Лг$200Тгр в гене УНЬ в семьях с больными АРЭ

В 2002 году Ащ с соавторами была выявлена замена С598Т в гомозиготном состоянии, ведущая к изменению аминокислоты А^200Тгр в экзоне 3 гена УНЬ, находящегося в локусе Зр25, у всех исследованных больных АРЭ Нами было проведено исследование ДНК 34 больных и 39 их здоровых родственников из 14 больших семей на наличие мутации А^200Тгр в гене УНЬ Все больные, для которые был поставлен клинический диагноз эритроцитоз, оказались гомозиготными носителями мутации А^200Тгр в гене УНЬ, за исключением отца из семьи № 6 Показатели красной крови у него находятся на верхней границе нормы, однако фенотипические характеристики

подходят под описание больных эрнтроцитозом. При анализе его ДНК мутация Arg200Trp была выявлена в гетерозиготном состоянии.

Кроме больных из 14 больших семей у нас были изолированные пациенты, для которых диагноз полицитемии стоял под вопросом. Из 8 таких больных мутация Arg200Trp была выявлена в гомозиготном состоянии у 4 человек, т.о. диагноз для них был подтвержден. Для четырех человек, для которых мутация Arg200Trp не была найдена, а также для отца из семьи № 6 был проведен поиск мутаций во всей кодирующей области гена VHL и экзон-интронных соединениях. Ни для кого из исследованных людей изменения нуклеотидной последовательности обнаружены не были.

Молекуяярио-генетические методы идентификации мутации Arg200Trp

Для идентификации мугации Arg200Trp в гене VHL нами была разработана система ПДРФ-анализа для прямого выявления мутации (рис. 1). Дтя идентификации мутации фрагмент экзона 3 амплифицировался с праймеров 3F и 3R1, в последний была введена замена Д1Я создания сайта узнаваиия рестриктазы Hinöl, Эта система была использована при исследовании носителъства мутации в семьях с больными АРЭ, а также при проведении популяционных исследований среди чувашей, марийцев, удмуртов и русских. Однако данный метод удобен при проведении анализа небольшого количества образцов. Для одновременного анализа большого количества образцов был разработан быстрый способ выявления мутации, основанный на методе real-time PCR.

Данная система позволяет одновременно выявлять два фрагмента: содержащий мутацию Arg200Trp в гене VHL и экзон 6 гена ТВР в качестве рсфсрснсного фрагмента. Разработанная дшшексная система состоит из двух пар специфичных праймеров и двух флуоресцентно меченых зондов типа TaqMan. Для фрагмента с мутацией обратный прайм ер специфичен но отношению к мутации (рис, 2),

197 п.н. 182 п.н.

uuyu ь t

m/N m/m m/m m/m N/N m/N

Рисунок 1. ПДРФ-алализ мутации Arg200Trp m/m: мутация в гомозиготном состоянии у больных АРЭ, m/N: гетерозиготный носитель мутации, N/N: норма.

VHL BHJ **

Рисунок 2. Система real-time PCR для выявления мутации

MüLS Aig200Trp в гене

ТВР

ВН1 R6G

Я_Р

VHL.

Система используется как качественный тест на наличие мутации и позволяет выявлять людей, имеющих в генотипе хотя бы один мутантный аллель (рис. 3). С помощью данной системы было проведено исследование частоты гетерозиготного носительства мутации Arg200Trp в популяции башкир Республики Башкортостан.

Рисунок 3, Результаты анализа мутации Arg20QTrp с помощью real-time PCR: представлена зависимость интенсивности флуоресценции от количества циклов ПЦР фрагмента с мутацией Arg20üTrp (слева) и фрагмента рсференсного гена (справа).

Популяцианные исследования мутации Arg200Trp

Для определения частоты распространения мутации Arg200Trp в гене VHL нами были исследован],1 образцы ДНК 572 здоровых чувашей. Среди них выявлен 21 гетерозиготный носитель мутации, приводящей к АРЭ, а также одна гомозиготная бессимптомная носительница данной мутации. Исходя из полученных данных, аллельная частота мутации Arg200Trp составила 1.84% (95% ДИ 1.23-2.63а расчетная частота заболевания - 1:3 ООО человек.

Также нами было проанализировано наличие мутации Arg200Trp в гене VHL в соседних с чувашами популяциях Волго-Уральского региона и у русских. Среди 344 обследованных марийцев выявлено 6 гетерозиготных носителей мутации: аллельная частота 0.87% (95% ДИ 0.38-4.71), расчетная частота заболевания - 1:13 150 человек. Из 317 удмуртов гетерозиготными носителями являются 3 человека: аллельная частота

0 47% (95% ДИ 0 13-1 23), расчетная частота заболевания - 1 44 600 человек Среди 271 башкира, а также среди 271 русского не было выявлено носителей мутации А^200Тгр

Неравновесие по сцеплению полиморфных маркеров, фланкирующих ген VIIЬ, и

АРЭ

Для выявления неравновесия по сцеплению АРЭ с полиморфными маркерами в локусе Зр25 в чувашских семьях нами было проведено исследование 10 микросателлитных маркеров в районе гена УНЬ Кроме того, был проведен анализ некоторых полиморфных маркеров в популяционной выборке, которою составили хромосомы 72 здоровых чувашей, не являющихся родственниками больных АРЭ и не несущих мутацию А^200Тгр в гене УНЬ В число хромосом без мутации также вошли хромосомы родителей больных аутосомно-рецессивным эритроцитозом, которые не были им переданы Неравновесие выявлено для 9 из исследованных маркеров Для маркера 0383611, находящегося на расстоянии 0 38 сМ, выявлено два аллеля 2 и 7, для которых обнаружено неравновесие по сцеплению, т е, вероятно, произошла ранняя рекомбинация или мутация в предковом гаплотипе

В таблице 2 представлены аллельные частоты исследованных маркеров

Таблица 2 Аллельные частоты полиморфных маркеров из области гена УНЬ >1-количество исследованных хромосом, подчеркнуты значения частот аллелей, характеризующихся наибольшим неравновесием по сцеплению Ген | УНЬ

Маркер 0331537 038369! 0381597 I 0333611 I 13383594 0383601 1)383589 | 0381263 | Б381259 | ОЗЭЗбЮ

N Бол 29 Зд 25 Ьол 29 Зд 85 Бол 29 Зд | Бол 169 29 Зд | Бол 74 29 Зд 84 Боп 29 Зд 86 Бол 29 Зд | Бол 82 1 29 Зд 78 Бол 29 Зд | Бол 81 29 Зд 84

Аллель 1 0,31 04 0 0,01 0,03 0 08 0 03 0 31 0,07 0 25 0 0 03 0,10 0 05 0,07 004 0 0,02 0 27 0 39

2 0,03 0 I 0,07 02 0 0,14 0,24 0,03 0 0 12 0,14 0,28 0,24 0,24 0 07 0,15 0 03 0,02 0 24 0,08

3 0 0,16 0 0 11 0,83 0,18 0 001 0 0,03 0,03 0,13 0,07 0,41 0 09 ) 0 0 07 0,03 0,15

4 0 52 0 36 0,72 0,24 0 0 03 0 0,09 0 07 0 23 0,83 041 0,59 0 17 0 14 0,22 0 0,05 0 28 0,12

5 0 07 0 08 0 21 041 0 10 0,37 | 0 03 0,08 0,86 0,2о 0 0 07 0 0,11 0 03 0,11 I 0,45 0 22 | 0 14 0 20

6 0 07 0 0 0,02 0 03 0,07 0,03 0,11 0 0 09 0 0,01 0 0 02 0,07 0,05 0 24 0,18 0 03 0 01

7 0 0 01 0 0 05 0,62 0 08 0 0,01 0 0 03 0 0,04 0 03 0,08 010 0,21 0 0,01

8 0 0 01 0 001 0 0 03 0 0,01 0 03 0,09 0 10 0,06 0 0,01

9 0 0 04 0 0,07 0 0,01 0 14 0 09 0 07 0,07 0 0,01

10 1 0 0 03 0 0,04 0 0 01 0 0,04 0 0,01

п I 0,03 0 I I 1 0 0,03 0 0,06 1

12 1 0 0,04 1 о 0,01

13 0 0 01 | 1

14 1 0 0,04

15 | 0 0,03

16 ! 1 0 0 04 |

Для всех аллелей исследованных микросателлитных маркеров были определены значения параметра неравновесия по сцеплению 8 с 95% ДИ Для сравнения частот аллелей полиморфных маркеров, расположенных на хромосомах, несущих мутацию, и на хромосомах без мутации, был использован критерий %2 или точный критерий Фишера (табл 3) Как видно из таблицы, параметр 5 наибольший для маркеров, расположенных проксимально и дистально от гена УНЬ, и уменьшается для аллелей маркеров, удаленных от гена Это характерно для мутаций, распространившихся в результате

эффекта основателя Исходя из значений %2 и параметра неравновесия по сцеплению 5, гаплотип основателя представляется состоящим из аллелей 4-4-3-Т- 7-5-4-4-3-5-2 (для потиморфных маркеров 0381537-0353691-0381597-мутацня-0383611-0383594-0383601-0383589-0351263-0381259-0383610) Этот гаплотип выявлен в 5 хромосомах, несущих мутацию А^200Тгр в гене УВ£, среди хромосом без мутации данный гаплотип не встретился

Полные гаплотипы хромосом больных АРЭ, несущих мутацию А^200Тгр в гене УНЬ, представлены в таблице 4

Таблица 3 Неравновесие по сцеплению аллелей микросателлитных маркеров с локусом

АРЭ

маркер № аллеля у2 Р 5±95%ДИ

0331537 4 1 34 0 244 0 25±0 37

0383691 4 22 44 <0 001 0 64±0 22

0381597 3 52 74 <0 001 0 79±0 17

УНЬ шШ

0383611 2 <0 001* 0 22±0 17

7 33 95 <0 001 0 59±0 20

2+7 54 39 <0 001 0 85±0 14

0383594 5 31 96 <0 001 0 81±0 17

0383601 4 15 36 <0 001 0 71±0 24

0383589 4 18 37 <0 001 0 50±0 23

0381263 3 15 20 <0 001 0 36±0 21

0381259 5 5 39 0 020 0 29±0 25

ОЗЭЗбЮ 2 0 026* 017±0 18

звездочкой отмечены значения р для одностороннего варианта точного критерия Фишера

Таблица 4 Гаплотипы хромосом с мутацией А^200Тгр в гене УНЬ

Жирным шрифтом выделена сохранная область гаплотипа основателя сМ-генетические координаты по карте МагекйеМ, т п н -физические

Б384545 0381537 Ш83691 Б381597 ШвЗбИ ШЭ3594 Ш83601 Э383589 0381263 Ш81259 ЭЗЭЗбЮ

сМ 26 25 27 72 29 19 29 92 30 75 31 13 32 36 31 13 32 36 36 10 36 65 37 20

т п н 8 28 8 816 9 30 10 53 10 63 10 64 10 824 11 49 12 07 12 98

22 8 4 4 3 Т 7 5 4 4 3 5 2

8 1 8 4 4 3 Т 7 5 4 4 3 5 2

7 1 9 4 4 3 Т 7 5 4 4 3 5 2

72 9 4 4 3 Т 7 5 4 4 3 5 2

14 2 6 4 4 3 Т 7 5 4 4 з 5 2

14 1 1 1 4 3 Т 7 5 4 4 3 5 2

3 2 2 1 5 3 Т 7 5 4 4 3 5 5

6 1 4 1 5 3 Т 7 5 4 4 3 6 4

3 1 7 1 5 3 Т 7 5 4 4 6 5 2

10 1 4 5 4 3 Т 7 5 2 1 5 5 1

11 2 4 5 4 3 Т 7 5 2 1 1 5 5

4 1 2 6 4 3 Т 7 5 2 3 4 9 6

12 1 1 6 4 3 Т 7 1 4 4 9 7 1

1 1 6 4 4 3 Т г 5 4 2 9 8 4

5 1 8 4 4 3 Т 2 5 4 2 9 8 4

1 2 5 4 4 3 Т 2 5 4 2 9 5 1

52 8 4 4 3 Т 2 5 4 2 3 5 4

62 9 2 4 3 Т 2 5 4 2 4 7 4

9 1 7 4 4 3 т 2 5 4 2 7 6 1

42 7 4 4 3 т 5 1 3 4 8 9 1

9 26 2 4 5 3 Т 6 5 4 4 4 6 5

9 2а 2 1 5 3 Т 1 4 4 3 2 7 5

2 1 7 4 4 5 Т 7 5 4 4 3 6 1

122 7 4 4 5 Т 7 5 4 4 3 6 1

82 4 1 2 5 Т 7 4 4 4 2 2 4

11 1 8 1 5 1 Т 7 5 2 1 6 6 1

10 2 7 1 2 6 Т 11 5 4 4 1 6 3

Возраст мутации

При расчете возраста мутации Arg200Trp в гене VHL в чувашской популяции использовали значения параметра неравновесия по сцеплению для полиморфных маркеров, представленных в таблице 3 Для расчета поправки g0 для растущей популяции необходимо знать скорость d роста популяции Эта скорость была вычислена Близнец (2007) при оценке возраста мутации с 807+5G>A в гене TCIRG1, приводящей к развитию злокачественного аутосомно-рецессивного остеопетроза в чувашской популяции Скорость роста чувашской популяции составила d = 0 2272 [1п(чел )/поколение] Полученные значения числа поколений представлены в таблице 5 При расчете числа поколений для маркера D3S3611 мы объединили аллели №№ 2 и 7 и при анализе считали их за один аллель Маркер D3S1537 мы не включили в расчет числа поколений, т к полученные данные при сравнении частот аллеля №4 в выборке хромосом с мутацией и нормальных хромосом не являются достоверными (р=0 244)

Таблица 5 Число поколений, прошедших с момента распространения мутации А^200Тгр в чувашской популяции

Маркер В go g+gO

D3S3691 28 46 11 29 39 75

D3S1597 28 22 14 07 42 29

D3S3611 44 13 1751 61 64

D3S3594 12 74 11 16 23 90

D3S3601 90 23 1751 107 74

D3S3589 42 58 11 16 53 74

D3S1263 18 78 5 87 24 65

D3S1259 20 32 5 44 25 76

D3S3610 26 36 5 05 31 41

Среднее значение 45 65±26 77

Среднее значение числа поколений, прошедших после начала распространения мутации Arg200Trp в чувашской популяции после прохождения популяции через «бутылочное горлышко», составило 45 65 со стандартным отклонением 26 77 поколений В качестве средней продолжитечьности одного поколения у чувашей брали значение, характерное для сельского населения республики в настоящее время, равное 27 4 годам (Гинтер, Зинченко, 2006) Учитывая продолжительность одного поколения, время, за которое произошло распространение мутации Arg200Trp, составляет около 1250±733 лет Исходя из того, что средний год рождения больных АРЭ - 1972, период начала распространения мутации соответствует первой половине VIII века (722 год ± 733 лет)

В это время на территории современной Чувашии жили предки марийцев. При понуляционных исследованиях мутация Аг°200Тгр была найдена и у них. Кроме того, при обследования марийской семья с больным АРЭ нами показано наличие га плотил а общего с гаплотипами чувашски* больных. Т.о., показано общее происхождение мутации в этих популяциях. Возможно, что мутация появилась среди древних марийцев, а потом распространилась и среди чувашей.

Анализ рекомбинаций в локусе II<¡23у больных АРЭ

Для определения минимальной области, содержащей локус эритроцитоза, был проведен ре ком 6 и паи и онный анализ, для чего были построены гаплотипы хромосом, сегрегирующих и не сегрегирующих с заболеванием.

Нами были обнаружены 23 рекомбинации между хромосомами, сегрегирующими и пе Сегрегирующими с АРЭ, в районе 21.9 сМ внутри картированного локуса (рис. 4). Анализ рекомбинаций позволил установить, что маркер 01154111 является проксимальным маркером, фланкирующим локус АРЭ, а маркер 01181356 -днстальным. Т.о. определен интервал, содержащий локус АРЭ, с генетическим размером 4.8 сМ, физический размер которого равен 2,07 млн.п.н. между маркерами 01154111 и Ш 151356.

МагкййеЫ.сМ Физ, к-ты.

млн.п.н.

84175 91 47 89.89

Э384 107.50

52179 107.70

81294 107,90

Э1793 105.77 110,38

841 (1 108.59 115.35 '

Э4142 110.73 115.79

81340 113.40 116.09

829 116.99

АР7Ц/80

84092 112.33 117.02

АР834/04

84127 112.33 117.15

Б1998 113.13 117.20

АР757Ш

АР75 7/98

8939 112.87 117,31

41356 1 ¡3,40 117.42

54104 113,93 118.14

84171 115.53 118.88

54132 116.0? 119.45

5925 118.47 120.33

ш юо @ И ЕО ШШОФФ0 0 @

в

Рисунок 4. Рекомбинации в семьях с АРЭ.

участки хромосомы, сегрегирующей с заболеванием^

с заболеванием, I I не информативные участки.

¡Хромосомы, не сегрегирующей

Исследование неравновесия по сцеплению маркеров на хромосоме II(¡23 иАРЭ

Подходом для более точной локализации гена является анализ неравновесия по сцеплению Мы провели анализ 29 маркеров из области локализации гена на наличие неравновесия по сцеплению Неравновесие по сцеплению для большинства маркеров не обнаружено Однако, для маркеров 01184127 (аллель №6), Б1181998 (аллель №3), АР757/98 (аллель №3) имеется неравновесие по сцеплению с р<0 05 (х2=5 50, 4 85 и 6 18, соответственно) Данное значение вероятности указывает на достоверность различий выборок хромосом, сегрегирующих и не сегрегирующих с заболеванием Исходя из предположения, что все сегрегирующие хромосомы произошли от одной хромосомы основателя, мы могли ожидать, что в выборке таких хромосом мы обнаружим преимущественно один аллель Такой маркер найден не был Мы можем предположить следующие основные причины отсутствия гаплотипа основателя

-Ложно-положительный результат сцепления с регионом 11я23 Однако получено значение ЬОБ-балла больше 3 для нескольких маркеров

-Диагностика людей с критической рекомбинацией не верна, и ген локализован вне картированного района, который мы сейчас считаем областью локализации гена Однако, некоторые маркеры, расположенные вне минимального региона были проанализированы, и с ними также не было обнаружено неравновесия по сцеплению

-Сохраненный район гашотипа основателя имеет малый размер из-за высокой частоты рекомбинаций на данном участке и большого возраста мутации в популяции

-В картированном районе расположен ген-модификатор, влияющий на разные проявления мутации в гене, лежащем в другой области Изменения в этом гене-модификаторе могут присутствовать не только у чувашей, и хромосомы больных с модифицирующим аллелем не произошли от одного основателя, либо данные аллели привнесены в популяцию чувашей очень давно

Анализ генов-кандидатов в области локализации гена-модификатора В области локализации гена, ответственного за возникновение АРЭ, из 21 гена мы выбрали два гена, которые могут рассматриваться в качестве кандидатов на роль интересующего нас гена Это ген РХУ £>2, кодирующий -у-субъединицу Ма+-К+-АТФазы, и ген РХУ Об Ген РХУ йб имеет гомологию с геном РХУ В2, однако его функция на сегодняшний день не известна

Ыа+-К+-АТФаза - мембраносвязанный фермент, поддерживающий градиент и К+ на плазматической мембране клеток Ыа+ играет важную роль в регуляции объема клетки, цитплазматического рН и концентрации Са++ при работе Ка7Са++ ионообменников, а также в различных транспортных процессах Согласно предложенной Фишером модели путей сигнальной трансдукции для регуляции мРНК

эритропоэтина кальций участвует в этой регуляции Т о, №+-К+-АТФаза опосредованно через регуляцию концентрации Са++, может быть, влияет на продукцию эритропоэтина

Никаких изменений в гене РХУ Ш в результате секвенирования ДНК больного найдено не было При анализе семей с помощью вБСР-метода были обнаружены четыре полиморфизма Один из них выявлен нами впервые

Также мы исследовали внутригенные полиморфные маркеры (ГХУ А, Б! 181998) и БЫРэ и гаплотипы по данным маркерам на наличие неравновесия по сцеплению с АРЭ Неравновесие по сцеплению обнаружено с маркером Б1181998 0^=4 85 р=0 028 для аллеля №3) Однако, при анализе полиморфных внутригенных маркеров и 8КРэ, локализованных в гене РХУ П2, гаплотипы, ассоциированные с заболеванием, обнаружены не были

В гене ЕХУИб ни мутация, ни БОТб найдены не были

Совместное наследование хромосом 3 и 11 у больных АРЭ

Выявление нами гетерозиготного носителя мутации А^200Тгр в гене УНЬ с клиническими признаками эритроцитоза, а также бессимптомной гомозиготной носительницы данной мутации может указывать на ее неполную пенетрантность Кроме того, мутации в гене УНЬ описаны при синдроме УНЬ и при спорадических опухотях Однако, у больных АРЭ и их родственников, являющихся носителями мутации в гетерозиготном состоянии, никаких опухолей выявлено не было Вместе с тем, полицитемия, наблюдающаяся у больных АРЭ, не является обязательным симптомом при синдроме УНЬ

Некоторые мутации, найденные у больных АРЭ (наиболее частая мутация А^200Тгр, УаПЗОЬеи и Ьеи188Уа1), также описаны у больных с синдромом УНЬ, в спорадических опухолях Мутация А^200Тгр приводит к развитию эритроцитоза обычно в гомозиготном состоянии, гетерозиготные носители имеют нормальный уровень гемоглобина, гематокрита и Еро Однако описаны больные с тяжелым эритроцитозом, являющиеся гетерозиготными носителями данной мутации Т о, исходя из наличия гетерозиготных больных эритроцитозом без признаков опухолей, а, также учитывая, что некоторые мутации, приводящие к развитию эритроцитоза, характерны для больных с синдромом УНЬ, можно предположить, что дополнительные изменения в других генах могут вносить вклад в развитие эритроцитоза

Синдром УНЬ - аутосомно-доминантное заболевание Однако в опухолях происходит инактивация нормального аллеля путем делеции короткого плеча или всей хромосомы 3, соматической мутации или гиперметилирования Было показано, что помимо потери части или всей хромосомы 3 в некоторых опухолях происходит потеря значительного участка или всей хромосомы 11, что способствует усиленному росту

опухоли Этот факт можно рассматривать как подтверждение того, что участие хромосомы 11 в развитии синдрома УНЬ может быть значительным

Исходя из изложенного выше можно предположить наличие гена, модифицирующего действие мутации Аг§200Тгр в гене УНЬ, у больных АРЭ Поскольку участие хромосомы 11 в развитии опухолей, развивающихся у больных с мутациями в гене УНЬ, показано по различным литературным данным, а также нами было выявлено сцепление фенотипа заболевания с локусом 1Ц23, мы проанализировали совместное наследование хромосом 3 и 11 у больных АРЭ Для этого были использованы полиморфные маркеры 011Э4111, 01184127 и 01181356 для хромосомы 1Ц23 и 0381597 и 0381263 для хромосомы Зр25 Анализ проведен для 32 больных и 39 их клинически здоровых родственников из 13 семей Контрольную группу составили 35 российских сечей, не имеющих больных АРЭ, с двумя и более детьми (всего 149 человек) В качестве референсной пары хромосом 3 и И, полученной от каждого из родителей, выбиралась та, которую получил первый больной ребенок в семье, отягощенной АРЭ, или первый по родословной ребенок в контрольных семьях Для остальных детей определялось совпадение (или отличие) передачи той же хромосомы 11 при условии передачи той же хромосомы 3 только от матери или только от отца

Всего мы смогли проанализировать 40 случаев передачи таких пар из хромосомы 11 с хромосомой 3, несущей мутацию А^200Тгр в гене УНЬ, и 23 случая передачи хромосомы 11 с хромосомой 3, не несущей мутацию Аг§200Тгр, у больных и здоровых сибсов в семьях с АРЭ из Чувашии Так же была проанализирована 81 передача данной пары хромосом в контрольной группе Все передачи, при которых регистрировались рекомбинации по хромосоме 3 или 11, из рассмотрения были исключены В 30 случаях из 40 при передаче хромосомы 3 с мутацией родители передавали детям ту же хромосому 11, которую получил в данной семье первый больной ребенок, т е совместная передача хромосом 3 и 11 осуществилась в 75% случаев Исходя из предположения, что при АРЭ существует зависимость расхождения хромосом в гаметогенезе, мы проанализировали, как с хромосомой 3 без мутации передается хромосома 11, отличная от той, которую каждый из родителей передал первому больному ребенку в семье В этой паре совместная передача произошла только в 10 случаях из 23, что составило 43% Теоретическая вероятность совместного наследования двух независимых хромосом в одном наборе, переданном ребенку от родителя, составляет 50% В группе семей, не отягощенных по АРЭ, наследование от каждого из родителей набора хромосом 3 и 11, аналогичного полученному первым ребенком в семье, наблюдалось в 34 случаях из 81 (42%) Суммарные данные, полученные в результате исследования, представлены в таблице 6

Таблица 6 Наследование хромосом Зр25 и 11ц23 у больных аутосомно-рецессивным эритропитозом и в контрольной группе

(п - количество передач)_

Совместное наследование хромосомы 11 Раздельное наследование хромосомы 11 всего

п % п %

Аутосомно-рецессивный эритроцитоз Хромосома 3 с мутацией А^200Тгр в гене УНЬ 30 75 10 25 40

Хромосома 3 без мутации 10 43 13 57 23

Контрольные семьи 34 42 47 58 81

Полученные результаты были оценены с использованием стандартного критерия у} При сравнении частоты совместного наследования областей хромосом Зр25 и 1^23 в наборе с хромосомой 3 с мутацией с частотой их совместного наследования в наборе с хромосомой 3, не несущей мутацию, получено значение у2 =16 14 (р<0 001), что указывает на достоверность различий в настедовании данной пары хромосом в зависимости от наличия мутации А^200Тгр в гене УНЬ Также достоверное различие между группами было получено при сравнении частоты совместного наследования участков Зр25 и 1^23 в случае хромосомы 3 с мутацией в семьях с АРЭ с частотой их совместного наследования в контрольных семьях, не отягощенных АРЭ (%2 =17 91, р<0 001) При сравнении данных, полученных для пары хромосомы 3, не несущей мутацию, и хромосомы 11, не сегрегирующей с заболеванием, в семьях с АРЭ и в контрольной группе семей, получено значение %г =0 07 (р>0 7), т е различий между группами нет

Таким образом, по результатам мшфосателлитного анализа полиморфных маркеров хромосом 3 (Зр25) и 11 (1Ц23) показано совместное наследование двух локусов у больных АРЭ Этот факт, в сочетании с уже описанными случаями совместной делеции хромосом 3 и 11 в различных опухолях, а также отсутствие у больных эритроцитозом и их родственников-гетерозиготных носителей мутации опухолей, характерных для синдрома УНЬ, позволяет предположить наличие на хромосоме 1Ц23 гена-модификатора, влияющего на развитие заболевания Кроме того, выделяют две формы заболевания у чувашей Одна из них протекает более доброкачественно и поддается коррекции Возможно, присутствие или отсутствие изменения в гене-модификаторе приводит к возникновению той или иной формы эритроцитоза

ВЫВОДЫ

1 В выборке чувашских семей, отягощенных аутосомно-рецессивным эритроцитозом, обнаружено сцепление заболевания с локусами llq23 и Зр25 Для локуса Зр25 максимальный Lod=12 4 при 6=0 для маркера D3S1263 Локус, возможно содержащий модифицирующий фактор, картирован в области 4,8 сМ между маркерами D11S4111 и D11S1356, максимальный Lod=4,23 при 9=0,05 для маркера АР757/98

2 Определена популяционная частота носительства мутации Arg200Trp в гене VHL среди чувашей Аллельная частота мутации равна 1 84%, расчетная частота эритроцитоза - 1 3000 человек, что выше распространенности заболевания, определенной в ходе клинико-эпидемиологических исследований (1 4450 человек) Выявлен бессимптомный носитель двух мутантных аллелей Полученные данные указывают на возможную неполную пенетрантность мутации Arg200Trp при эритроцитозе в Чувашии

3 Разработана система молекулярно-генетических методов для простой и быстрой идентификации мутации Arg200Trp в гене VHL в целях диагностики заболевания, а также скрининговая тест-система на основе метода real-time PCR для выявления гетерозиготного носительства мутации

4 Определены популяционные частоты мутации Arg200Trp среди соседних с чувашами народностей Волго-Уральского региона Для марийцев аллельная частота составила 0 87%, расчетная частота заболевания - 1 13 150 человек, для удмуртов аллельная частота - 0 47%, расчетная частота заболевания - 1 44 600 человек Среди башкир и русских мутация Arg200Trp не выявлена

5 В группе больных аутосомно-рецессивным эритроцитозом из Чувашии выявлено неравновесие по сцеплению с полиморфными маркерами, тесно сцепленными с геном VHL Эти данные подтверждают влияние эффекта основателя на накопление эритроцитоза в Чувашии Время распространения мутации Arg200Trp среди чувашей составляет 1250±733 лет

6 Показана зависимая сегрегация хромосомных локусов Зр25 и 1 lq23 в семьях со случаями аутосомно-рецессивного эритроцитоза (х2=16 14 р<0 001 при сравнении наследования этих локусов у больных с их здоровыми сибсами и ^=17 91 р<0 001 при сравнении с контрольной выборкой семей) В локусе llq23 среди чувашей вероятно наличие модифицирующего фактора, ответственного за неполную пенетрантность эритроцитоза и отсутствие опухолевых процессов у носителей мутации Arg200Trp

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

1 N Vasserman, S Tverskaya, L Karzakova, О Evgrafov "Exclusion of linkage between autosomal recessieve erythrocytosis and erythropoietin receptor gene" // Medizmische Genetxk -1997- v 9-№2-p 120

2 Vasserman N , Tverskaya S , Karzakova L , Evgrafov О "Locus for autosomal recessive benign erythrocytosis maps to chromosome 1 Iq " // Europ J Hum Genet -1998-v 6-suppl 1-p 35

3 Вассерман H.H., Карзакова JIM, Поляков А В, Тверская С М, Евграфов О В "Картирование гена рецессивного эритроцитоза в семьях Чувашской популяции " // "Геном человека-99 "-1999-стр 133

4 N.Vasserman, L Karzakova, S Tverskaya, V Saperov, О Muchukova, G Pavlova, N Efimova, N Vankina, О Evgrafov "Localization of the gene responsible for familial benign polycythemia to chromosome 1 lq23 " // Human heredity -1999-v 49-pp 129-132

5 Vasserman N., Tverskaya S , Shagina I, Polyakov A, Karzakova L, Evgrafov О "Refined mapping of 2cM candidate region for autosomal recessive benign erythrocytosis " // Europ J Hum Genet-2000-v 8-suppl 1-p 146

6 Tverskaya S , Vasserman N., Polyakov A , Evgrafov О "The investigation of candidate genes for autosomal recessive benign erythrocytosis " // Human Genome Meeting -2002-Shanghai, China-p 174

7 N. Vasserman, S Tverskaya, R Zinchenko, A Polyakov "Frequencies of the C598T mutation m VHL associated with autosomal recessive erythrocytosis " // Europ J Hum Genet-2005-v 13-suppl 1-p 354

8 S Tverskaya, N Vasserman, A Polyakov "Associated transmission chromosomes 3+11 in patients with autosomal recessive benign erythrocytosis from Chuvashia " // Europ J Hum Genet -2005-v 13-suppl 1-p 327

9 Вассерман H H., Тверская С M, Зинченко Р А, Поляков А В "Популяционная частота мутации С598Т в гене VHL, приводящей к развитию аутосомно-рецессивного эритроцитоза" // Медицинская генетика-2005 -т4-№4-стр 165. (тезисы V съезда Российского общества медицинских генетиков, Уфа)

10 НН. Вассерман, СМ Тверская, А В Поляков "Совместное наследование хромосом 3 и 11 у больных аутосомно-рецессивным эритроцитозом из Чувашии " // Генетика - 2005-т 41 -№9-стр 1259-1264

11 N.N.Vasserman, S М Tverskaya , А V Polyakov "Comheritance of chromosomes 3 and 11 m the patients with autosomal recessive polycythemia from Chuvachia " // Russian Journal of Genetics -2005-v 41-№9-pp 1035-1039

12 Близнец Е А , Ваесермап Н Н, Поляков А В "Молекулярные методы диагностики распространенных наследственных «чувашских» болезней " // Медицинская генетика -2006-т 5-прилож 1-стр 10-13

13 Павлова ГП, Ефимова НК, Сметанина НС, Тверская СМ, Ваесермап Н.Н., Поляков А В "Наследственный эритроцитоз " // глава в монографии "Генетическая структура и наследственные болезни чувашской популяции" (под ред Гинтера Е К, Зинченко Р А ), ИД "Пегас", Чебоксары -2006-стр 202-212

СОКРАЩЕНИЯ

АРЭ - аутосомно-рецессивный эритроцитоз ДИ - доверительный интервал

ПДАФ - полиморфизм длин амплифицированных фрагментов

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

SNPs - single nucleotide polymorphisms

SSCP - smgle-strand conformation polymorphism

VHL - von Hippel-Lmdau syndrom

Заказ № 631 Объем 1п л Тираж ЮОэкз Отпечатано в ООО «Петроруш» г Москва,ул Палиха 2а тел 250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вассерман, Наталья Наумовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРА ТУРЫ.

ГЛАВА I. Картирование генов человека.

1. Принципы картирования.

1.1. Генетические маркеры и генетические карты.

1.2. Анализ сцепления.

1.3. Полиогеномный скрининг.

1.4. Тонкое генетическое картирование.

ГЛАВА И. Эритроцитоз.

2.1. Эритропоэз и гены, участвующие в его регуляции.

2.2. Характеристика эритроцитоза.

2.3. Наследственные формы эритроцитоза.

2.3.1. Гемоглобинопатии.

2.3.2. Недостаточность 2,3-ДФГ.

2.3.3. Polycythemia rubra vera.

2.3.4. ECYT1 (PFCP).

2.3.5. ECYT2.

2.3.6. ECYT3.

2.4. Семейный рецессивный эритроцитоз в Чувашии.

2.4.1. Клинические исследования.

2.4.2. Этногенез чувашей и эффект основателя.

2.5. Картирование и идентификация мутаций в гене VHL при аутосомно-рецессивном эритроцитозе.

2.5.1. Ген VHL.

2.5.2. Белок pVHL.

2.5.3. Функции pVHL.

2.5.3.1. HIF.

2.5.4. Синдром VHL.

2.5.5. Мутации в гене VHL приводят к аутосомно-рецессивному эритроцитозу.

2.5.5.1. Эффект основателя при мутации Arg200Trp.

MA ТЕ РИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Забор венозной крови.

2. Выделение геномной ДНК.

3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

4.Электрофорез в ПААГ.

5. SSCP-анализ.

6. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

7. Рестрикционный анализ.

8. Real-time PCR.

9. Анализ сцепления.

10. Анализ неравновесия по сцеплению.

11. Расчет возраста мутации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Генетическая эпидемиологиямейной полицитемии благоприятным течением (наследственного эритроцитоза).

2. Геномный скрининг.

3. Мутация Arg200Trp в гене VHL.

3.1. Мутация Arg200Trp в гене VHL в семьях с больными АРЭ.

3.2. Молекулярно-генетические методы идентификации мутации Arg200Trp.

3.3. Популяционные исследования мутации Arg200Trp.

3.4. Неравновесие по сцеплению полиморфных маркеров, фланкирующих ген VHL, и АРЭ.

3.5. Возраст мутации.

4. Анализ рекомбинаций в локусе llq23 у больных АРЭ.

5. Исследование неравновесия по сцеплению маркеров на хромосоме llq23 и АРЭ.

6. Анализ генов-кандидатов в области локализации гена-моднфикатора.

7. Совместное наследование хромосом 3 и 11 у больных АРЭ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование молекулярно-генетических причин аутосомно-рецессивного эритроцитоза в Чувашии"

Актуальность темы. Картирование, идентификация и исследование генов, ответственных за возникновение наследственных заболеваний, являются одним из важных источников знаний о функционировании организма человека. Знание гена и его локализации, кроме того, делает возможным прямую и косвенную ДНК-диагностику болезни. Становится возможным проведение дифференциальной диагностики сходных клинических заболеваний, а также предсказание развития определенной патологии до появления клинических признаков, в том числе у плода, т.е. проведение дородовой диагностики. Также можно разработать адекватную терапию на основе знания этиологии заболевания, в том числе генотерапию. До настоящего времени нет ясного представления о регуляции процессов кроветворения, в частности, эритропоэза. Исследование генов, приводящих к наследственным эритроцитозам, может помочь понять ключевые этапы этого процесса.

Эритроцитозы характеризуются увеличенным количеством эритроцитов в единице объема крови. В литературе описано несколько клинически отличающихся форм эритроцитоза. Среди них выделяют ненаследственные формы и семейно-наследственные эритроцитозы, которые являются редкими заболеваниями. Они представляют собой гетерогенную по патогенезу группу заболеваний с различным типом наследования. Известны следующие причины семейно-наследственных эритроцитозов: нарушение функциональных свойств гемоглобина (образование мутантных форм гемоглобина с повышенным сродством к кислороду), метаболизма эритроцитов (снижение концентрации 2,3-дифосфоглицерата, увеличение концентрации АТФ), автономное повышение продукции эритропоэтина. В ряде случаев патогенез семейно-наследственых эритроцитозов остается невыясненным.

Среди семейно-наследственных эритроцитозов выделяют аутосомно-рецессивную доброкачественную полицитемию. Это редкое заболевание, характеризующееся эритроцитозом, нормальным количеством лейкоцитов и тромбоцитов, увеличенной продукцией эритропоэтина (OMIM 263400). Заболевание выявляется преимущественно в детском и юношеском возрасте. В мировой литературе описано небольшое число случаев этого заболевания (Adamson et al., 1973; Whitcomb et al., 1980).

В северо-восточных районах Чувашии были обнаружены случаи эритроцитоза, носившие семейный характер. Клиника этих случаев не совпадала ни с одной из известных нозологических форм, для которых были известны мутации в генах, приводящие к заболеванию (Полякова, 1977). Но клиническая картина при данной форме заболевания напоминает клиническую картину семейной доброкачественной полицитемии (OMIM 263400). Эритроцитоз в чувашских семьях является эндемической формой описанных семейно-наследственных эритроцитозов. Его распространенность среди чувашей составляет 1:4450 человек.

Мутация, приводящая к развитию эритроцитоза у чувашей, выявлена в гене VHL, который является геном-супрессором опухолевого роста. При мутациях в нем у больных с синдромом VHL развиваются опухоли. Однако, ни у больных эритроцитозом (гомозиготных носителей мутации), ни у их родственников - гетерозиготных носителей опухоли не обнаружены. Возможно, у них присутствует изменение в другом гене, являющимся модификатором, которое не позволяет развиться опухолям. Идентификация этого гена может помочь в понимании процесса опухолеобразования, а также в разработке генотерапии ряда опухолей.

Целью данной работы являлось изучение молекулярно-генетической природы аутосомно-рецессивного эритроцитоза в Чувашии, картирование и исследование области локализации гена, ответственного за развитие заболевания.

При этом ставились следующие задачи:

1. Провести картирование локуса аутосомно-рецессивного эритроцитоза на выборке семей с больными из Чувашии.

2. Определить популяционную частоту мутации Arg200Trp в гене VHL, расположенном в локусе Зр25, среди чувашей и близких им народностей.

3. Разработать эффективную систему регистрации указанной мутации, пригодную для проведения популяционного скрининга.

4. Установить причину и время распространения мутации Arg200Trp в гене VHL среди чувашей.

5. Провести анализ независимости сегрегации картированных локусов в семьях с аутосомно-рецессивным эритроцитозом.

Научная новизна. Определены популяционные частоты мутации Arg200Trp в гене VHL, приводящей к развитию аутосомно-рецессивного эритроцитоза, среди чувашей и народов Волго-Уральского региона. Определен возраст этой мутации у чувашей. Установлена популяционная частота носительства мутации среди народов Волго-Уральского региона: чувашей, марийцев, удмуртов и башкир.

Показано сцепление локуса аутосомно-рецессивного эритроцитоза с хромосомой llq23. Показана зависимая сегрегация хромосомных локусов Зр25, несущего ген VHL, и 11 q23 в семьях со случаями заболевания. В районе llq23, вероятно, наличие модифицирующего фактора, ответственного за разное течение заболевания и отсутствие опухолей у носителей мутации.

Практическая значимость. В отягощенных семьях из Чувашии возможно проведение уточняющей, пресимптоматической диагностики, а также выявление гетерозиготного носительства в семьях чувашей, марийцев и удмуртов и на популяционном уровне. Разработана система быстрого скрининга носительства мутации Arg200Trp в гене VHL среди большого количества человек на основе real-time PCR. Результаты популяционных исследований распространенности мутации при эритроцитозе, возможно, внесут дополнения в понимание процесса этногенеза народов Волго-Уральского региона.

Положения, выносимые на защиту.

1. Существует генетическое сцепление аутосомно-рецессивного эритроцитоза в Чувашии с хромосомными локусами 1 lq23 и Зр25.

2. Популяционная частота мутации Arg200Trp в гене VHL в чувашской популяции составляет 1.84%, у марийцев - 0.87%, у удмуртов - 0.47%. Среди башкир и русских мутация Arg200Trp не выявлена.

3. Разработана система простой и быстрой идентификации мутации Arg200Trp в гене VHL на основе real-time PCR.

4. Время распространения мутации Arg200Trp в чувашской популяции составляет 1250±733 лет.

5. Показана зависимая сегрегация хромосомных локусов Зр25 и llq23 в семьях со случаями аутосомно-рецессивного эритроцитоза, что может указывать на наличие гена-модификатора в области 1 lq23.

Апробация работы.

По материалам исследования опубликовано 13 научных работ, включая 4 статьи и 1 главу в монографии. Материалы диссертации доложены на 29, 30, 32, 37 съездах Европейского общества генетики человека (Генуя, 1997; Лиссабон, 1998; Амстердам, 2000; Прага, 2005); конференции "Геном человека - 99"; съезде HGM (Шанхай, 2002); на V съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005) и на Всероссийской научно-практической конференции "Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний: возможности и перспективы" (Москва, 2006).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ГЛАВА I. Картирование генов человека.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Вассерман, Наталья Наумовна

Заключение.

Полного представления о процессах, регулирующих эритропоэз, нет. Поэтому картирование и исследование генов, повреждение в которых приводит к нарушению какого-либо этапа в процессе образования и функционирования эритроцитов, может помочь более полному пониманию этого процесса. Одним из таких заболеваний, приводящим к увеличению продукции эритроцитов, является аутосомно-рецессивный эритроцитоз, встречающийся преимущественно среди населения Чувашии. Картирование и идентификация гена VHL, мутация в котором приводит к данному типу эритроцитоза, позволило больше узнать о пути регулирования эритропоэза при недостатке кислорода. Локализация гена, ответственного за возникновение аутосомно-рецессивного эритроцитоза, позволяет проводить уточняющую и пресимптоматическую диагностику в отягощенных семьях из Чувашии с помощью прямой ДНК-д иагностики.

При проведении анализа сцепленных с геном VHL полиморфных маркеров выявлено неравновесие по сцеплению, а также общий предковый гаплотип. На основе данных о неравновесии по сцеплению определено время начала распространения мутации в чувашской популяции. Оно относится к VIII веку, что согласуется с историческими данными о резком сокращении численности чувашей в этот период. Также мутация Arg200Trp выявлена у соседних с чувашами народов Волго-Уральского региона: марийцев и удмуртов. В семье из Республики Мари Эл с больным АРЭ выявлен общий гаплотип с гаплотипом у чувашей. Это предоставляет дополнительные данные об общности происхождения этих народов.

Обнаруженное сцепление АРЭ у больных из Чувашии с еще одной областью в геноме (I lq23) может говорить о наличии модифицирующего фактора, влияющего на тяжесть течения заболевания, а также на отсутствие опухолей у больных и их родственников - носителей мутации в гене VHL, несмотря на то, что мутации в этом гене, в том числе и Arg200Trp, приводят к развитию опухолей у их носителей при синдроме VHL, а также к образованию спорадических опухолей.

1. В выборке чувашских семей, отягощенных аутосомно-рецессивным эритроцитозом, обнаружено сцепление заболевания с локусами llq23 и Зр25. Для локуса Зр25 максимальный LOD=12.4 при 9=0 для маркера D3S1263. Локус, возможно содержащий модифицирующий фактор, картирован в области 4,8 сМ между маркерами D11S4111 и D11S1356, максимальный LOD=4,23 при 0=0,05 для маркера АР757/98.

2. Определена популяционная частота носительства мутации Arg200Trp в гене VHL среди чувашей. Аллельная частота мутации равна 1.84%, расчетная частота эритроцитоза - 1:3000 человек, что выше распространенности заболевания, определенной в ходе клинико-эпидемиологических исследований (1:4450 человек). Выявлен бессимптомный носитель двух мутантных аллелей. Полученные данные указывают на возможную неполную пенетрантность мутации Arg200Trp при эритроцитозе в Чувашии.

3. Разработана система молекулярно-генетических методов для простой и быстрой идентификации мутации Arg200Trp в гене VHL в целях диагностики заболевания, а также скрининговая тест-система на основе метода real-time PCR для выявления гетерозиготного носительства мутации.

4. Определены популяционные частоты мутации Arg200Trp среди соседних с чувашами народностей Волго-Уральского региона. Для марийцев аллельная частота составила 0.87%, расчетная частота заболевания - 1:13 150 человек, для удмуртов аллельная частота - 0.47%, расчетная частота заболевания - 1:44 600 человек. Среди башкир и русских мутация Arg200Trp не выявлена.

5. В группе больных аутосомно-рецессивным эритроцитозом из Чувашии выявлено неравновесие по сцеплению с полиморфными маркерами, тесно сцепленными с геном VHL. Эти данные подтверждают влияние эффекта основателя на накопление эритроцитоза в Чувашии. Время распространения мутации Arg200Trp среди чувашей составляет 1250±733 лет.

6. Показана зависимая сегрегация хромосомных локусов Зр25 и llq23 в семьях со случаями аутосомно-рецессивного эритроцитоза (%2=16.14 р<0.001 при сравнении наследования этих локусов у больных с их здоровыми сибсами и х=17.91 р<0.001 при сравнении с контрольной выборкой семей). В локусе llq23 среди чувашей вероятно наличие модифицирующего фактора, ответственного за неполную пенетрантность эритроцитоза и отсутствие опухолевых процессов у носителей мутации Arg200Trp.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вассерман, Наталья Наумовна, Москва

1. Иванов В.П. "Чувашский этнос. Проблемы истории и этнографии." // Чебоксары.-1998-156с.

2. Иванов В.П., Николаев В.В., Дмитриев В.Д. "Чуваши. Этническая история и традиционная культура." // М.:ДИК.-2000-95с.

3. Лакин Г.Ф. "Биометрия." // Высшая школа-М-1980.

4. Ландер Э. "Картирование сложно наследуемых признаков человека." // В книге "Анализ генома. Методы," Под ред. К. Дэйвис.-Мир-М-1990-с.214-239.

5. Павлов А.Д. "Эритропоэтин: достижения и перспективы." // "Гематология и трансфузиология"-1997-т.42-№ 1 -с.25-29.

6. Полякова Л.А. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук "Семейно-наследственный эритроцитоз (по материалам наблюдений в Чувашской АССР)." // Чебоксары-1977.

7. Румянцев А.Г., Морщакова Е.Ф., Павлов А.Д. "Эритропоэтин в диагностике, профилактике и лечении анемий" // М-2003.

8. Третьяков П.Н. "Вопрос о происхождении чувашского народа в свете археологических данных." // "Советская этнография"-1950-№3.

9. Фишер Д. "Эритропоэтин: механизм гипоксической регуляции." // "Гематология и трансфузиология"-1997-т.42-№1 -с. 19-22.

10. Adamson J.W., Stamatoyannopoulos G., Kontras S., Lascari A., Detter J. "Recessive familial erythrocytosis: aspects of marrow regulation in two families." // Blood.-1973-v.41-p.641-652.

11. Adamson J.W., Fialkow P.J., Murphy S., Prchal J.F., Steinmann L. "Polycythemia vera: stem-cell and probable clonal origin of the disease." // The new England journal of medicine.-1976-v.295-p.913-916.

12. D'Andrea A.D., Yoshimura A., Youssoufian H., Zon L.I., Koo J.W., Lodish H.F. "The cytoplasmic region of the erythropoietin receptor contains nonoverlapping positive and negative growth-regulatory domains." // Mol.Cell.Biol.-1991-v.l 1-p. 1980-1987.

13. Ang S.O., Chen H., Gordeuk V.R., Sergueeva A.I., Polyakova L.A., Miasnikova G.Y., Kralovics R., Stockton D.W., Prchal J.T. "Endemic polycythemia in Russia: mutation in the VHL gene." // Blood Cells, Molecules, and Diseases.-2002a-v.28-p.57-62.

14. Arcasoy M.O., Degar B.A., Harris K.W., Forget B.G. "Familial erythrocytosis associated with a short deletion in the erythropoietin receptor gene." // Blood.-1997-v.89-p.4628-4635.

15. Ascensao J.L., Bilgrami S., Zanjani E.D. "Erythropoietin. Biology and clinical applications." // Am.J.Pediatr.Hematol.Oncol.-1991-v.l3-p.376-387.

16. Barichard F., Joulin V., Henry I., Garel M.C., Valentin C., Rosa R., Cohen-Solal M., Junien C. "Chromosomal assignment of the human 2,3-bisphosphoglycerate mutase gene (BPGM) to region 7q34-7q22." // Hun.Genet.-1987-v.77-p.283-285.

17. Bengtsson B.O., Thomson G. "Measuring the strength of associations between HLA antigens and diseases." // Tissue Antigens-1981-v.l8-p.356-363.

18. Bento M.C., Chang K.-T., Guan Y., Liu E., Caldas G., Gatti R.A., Prchal J.T. "Congenital polycythemia with homozygous and heterozygous mutations of von Hippel-Lindau gene: five new Caucasian patients." // Haematologica.-2005-v.90-p. 128-129.

19. Bern N., McDonald J., Lacombe C., Goldwasser E. "Expression of the erythropoietin gene." // Mol.Cell.Biol.-1986-v.6-p.2571 -2575.

20. Botstein D., White R.L., Skolnick M., Davis R.W. "Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms." // Am.J.Genet.-1980-v.32-p.314-331.

21. Budarf M., Huebner K., Emanuel В., Croce C.M., Copeland N.G., Jenkins N.A., D'Andrea A.D. "Assignment of the erythropoietin receptor (EPOR) gene to mouse chromosome 9 and human chromosome 19." // Genomics.-1990-v.8-p.575-578.

22. Collins A., Lonjou C., Morton N.E. "Genetic epidemiology of single-nucleotide polymorphisms." // Proc.Natl.Acad.Sci.US A.-1999-v.96-p. 15173-15177.

23. Cooper D.N., Smith B.A., Cooke H.J., Hiemann S., Schmidtke J. "An estimate of unique DNA sequence heterozygosity in the human genome." // Hum.Genet.-1985-v.69-p.201-205.

24. Cooper D.N., Schmidtke J. "Diagnosis of genetic disease using recombinant DNA." // Hum. Genet.-1986-v.71 -p. 1 -11.

25. Corn P.G., McDonald E.R., Herman J.G., El-Deiry W.S. "Tat-binding protein-1, a component of the 26S proteasome, contributing to the E3 ubiquitin ligase function of the von Hippel-Lindau protein."//Nature Genet.-2003-v.35-p.229-237.

26. Dai C.H., Krantz S.B., Zsebo K.M. "Human burst-forming units-erythroid need direct interaction with stem cell factor for further development." // Blood.-1991-v.78-p.2493-2497.

27. Ebert B.L., Bunn H.F. "Regulation of the erythropoietin gene." // Blood.- 1999-v.94-p. 1864-1877.

28. Economou E.P., Bergen A., Warren A.C., Antonarakis S.E. "The polydeoxyadenylate tract of Alu repetitive elements if polymorphic in the human genome." // Proc.Natl.Acad.Sci.USA.-1990-v.87-p.2951-2954.

29. Fandrey J., Seydel F.P., Siegers C.P., Jelkmann W. "Role of cytochrome P450 in the control of the production of the erythropoietin." // Life.Sci.-1990-v.47-p.l27-134.

30. Fedele A.O., Whitelaw M.L., Peet D.J. "Regulation of gene expression by the hypoxia-inducible factors." // Molecular Interventions.-2002-v.2-p.229-243.

31. Fisher J.W. "Erythropoietin physiologic and pharmacologic aspects." // Proc.Soc.Exp.Biol.Med.-1997-V.216-p. 3 58-369.

32. Friedrich C.A. "Genotype-phenotype correlation in von Hippel-Lindau syndrome." // Hum.Mol.Genet.-2001 -v. 10-p.763-767.

33. Glasker S., Sohn T.-S., Okamoto H., Li J., Lonser R.R., Oldfield E.H., Vortmeyer A.O., Zhuang Z. "Second hit deletion size in von Hippel-Lindau disease." // Ann. Neurol. ,-2006-v.59-p. 105-110.

34. Glickman M.H., Ciechanover A. "The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of the construction." // Physiological Reviews.-2002-v.82-p.373-428.

35. Goldberg M.A., Dunning S.P., Bunn H.F. "Regulation of the erythropoietin gene evidence that the oxygen sensor is a heme protein."// Science.-1988-v.242-p. 1412-1415.

36. Gordeuk V.R., Stockton D.W., Prchal J.T. "Congenital polycythemias/erythrocytoses." // Haematologica.-2005-v.90-p. 109-116.

37. Gordeuk V.R., Prchal J.T. "Vascular complications in Chuvash polycythemia." // Seminars in thrombosis and hemostasis.-2006-v.32-p.289-294.

38. Groulx I., Lee S. "Oxygen-dependent ubiquitination and degradation of hypoxia-inducible factor requires nuclear-cytoplasmic trafficking of the von Hippel-Lindau tumor suppressor protein." // Mol. and Cell.Biol.-2002-v.22-p.5319-5336.

39. Hastbacka J., de la Chapelle A., Kaitila I., Sistonen P., Weaver A., Lander E. "Linkage disequilibrium mapping in isolated founder populations: diastrophic dysplasia in Finland." // Nat.Genet.-1992-v.2-p.204-211.

40. Hergovich A., Lisztwan J., Barry R., Ballschmieter P., Krek W. "Regulation of microtubule stability by the von Hippel-Lindau tumour suppressor protein pVHL." // Nature Cell Biol.- 2003-V.5-p.64-70.

41. Но V., Acquaviva A., Duh E., Bunn H.F. "Use of a marked erythropoietin gene for investigation of its cis-acting elements." // J.Biol.Chem.-1995-v.270-p. 10084-10090.

42. Hoffman M., Ohh M., Yang H., Klco J.M., Ivan M., Kaelin W.G. "von Hippel-Lindau protein mutations linked to type 2C VHL disease preserve the ability to downregulate HIF." // Hum.Mol.Genet.-2001 -v. 10-p. 1019-1027.

43. Holmes N.G. "Microsatellite markers and the analysis of genetic disease." // Br.Vet.J.-1994-v.l50-p.411-421.

44. Iliopoulos O., Ohh M., Kaelin W.G. "pVHL 19 is a biologically active product of the von Hippel-Lindau gene arising from internal translation initiation." // Proc.Natl.Acad.Sci.USA.-1998-v.95-p.l 1661-11666.

45. Imagawa S., Izumi Т., Miura Y. "Positive and negative regulation of the erythropoietin gene." // J.Biol.Chem.-1994-v.269-p.9038-9044.

46. Iwai K., Yamanaka K., Kamura Т., Minato N., Conaway R.C., Conaway J.W., Klausner R.D., Pause A. "Identification of the von Hippel-Lindau tumor suppressor protein as part of an active E3 ubiquitin ligase complex" // PNAS.-1999-v.96-p. 12436-12441.

47. Juvonen E., Ikkala E., Fyhrquist F., Ruutu T. "Autosomal dominant erythrocytosis caused by increased sensitivity to erythropoietin." // Blood.-199l-v.78-p.3066-3069.

48. Kamura Т., Sato S., Iwai K., Czyzyk-Krzeska M., Conaway R.C., Conaway J.W. "Activation of HIF-la ubiquitination by a reconstituted von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor complex." // PN AS ,-2000-v.97-p. 10430-1043 5.

49. Koury S.T., Bondurant M.C., Koury M.J. "Localization of erythropoietin synthesizing cells in murine kidneys by in situ hybridization." // Blood.-1988-v.71-p.524-527.

50. Koury M.J., Bondurant M.C. "Erythropoietin retards DNA breakdown and prevents programmed death in erythroid progenitor cells." // Science.-1990-v.248-p.378-381.

51. Koury M.J. "Progress in understanding erythropoiesis." // "rhErythropoietin in cancer supportive treatment.'-New York-Basel-Hong Kong-1996-p.l-12.

52. Kralovics R., Indrak K., Stopka Т., Berman B.W., Prchal J.F., Prchal J.T. "Two new EPO receptor mutations: truncated EPO receptors are most frequently associated with primary familial and congenital polycythemias." // Blood.-1997a-v.90-p.2057-2061.

53. Kralovics R., Sokol L., Broxson E.H., Prchal J.T. "The erythropoietin receptor gene is not linked with the polycythemia phenotype in a family with autosomal dominant primary polycythemia." // Proc.Assoc.Am.Physicians.-1997b-v.l09-p.580-585.

54. Kralovics R., Prchal J.T. "Congenital and inherited polycythemia." // Curr.Opin.Pediatr.-2000-v.l2-p.29-34,

55. Kralovics R., Passamonti F., Buser A.S., Teo S.S., Tiedt R., Passweg J.R., Tichelli A., Cazzola M., Skoda R.C. "A gain-of-function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders." // New Eng. J.Med.-2005-v.352-p. 1779-1790.

56. Krieg M., Marti H.H., Plate K.H. "Coexpression of erythropoietin and vascular endothelial growth factor in nervous system tumors associated with von Hippel-Lindau tumor suppressor gene loss of function." // Blood.-1998-v.92-p.3388-3393.

57. Kvietikova I., Wenger R.H., Marti H.H., Gassmann M. "The transcrption factors ATF-1 and CREB-1 bind constitutively to the hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) DNA recognition site." // Nucleic.Acids.Res.-1995-v.23-p.4542-4550.

58. Kuster В., Shainskaya A., Pu H.X., Goldshleger R., Blostein R., Mann M., Karlish S.J.D. "A new variant of the у subunit of renal Na,K-ATPase." // J.Biol.Chem.-2000-v.275-p. 18441-18446.

59. Labuda D., Zietkiewicz E., Labuda M. "The genetic clock and the age of the founder effect in growing populations: a lesson from French Canadians and Ashkenazim." // Am.J.Hum.Genet.-1997-v.61-p.768-771.

60. Lando D., Gorman J.J., Whitelaw M.L., Peet D.J. "Oxygen-dependent regulation of hypoxia-inducible factors by prolyl and asparaginil hydroxylation." // Eur.J.Biochem.-2003-v.270-p.781-790.

61. Lathrop G.M., Lalouel J.M., Julier C., Ott J. "Multilocus linkage analysis in humans: detection of linkage and estimation of recombination." // Am.J.Hum.Genet.-1985-v.37-p.482-498.

62. Law M.L., Cai G.Y., Lin F.K., Wei Q., Huang S.Z., Hartz J.H., Morse H„ Lin C.H., Jones C., Kao F.T. "Chromosomal assignment of the human erythropoietin gene and its DNA polymorphism." // Proc.Natl. Acad.Sci.USA.-1986-v.83-p.6920-6924.

63. Lee Huang S. "Cloning and expression of human erythropoietin cDNA in Escherichia coli." // Proc.Natl.Acad.Sci.USA.-1984-v.81-p.2708-2712.

64. Lin F.K., Suggs S., Lin C.H., Browne J.K., Smalling R., Egrie J.C., Chen K.K., Fox G.M., Martin F., Stabinsky Z. et al. "Cloning and expression of the human erythropoietin gene." // Proc.Natl.Acad.Sci.USA.-1985-v.82-p.7580-7584.

65. Lisztwan J., Imbert G., Wirbelauer C., Gstaiger M., Krek W. "The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein is a component of an E3 ubiquitin-protein ligase activity." // Genes and Development -1999,-v. 13-p. 1822-1833.

66. Litt M., Luty J.A. "A hypervariable microsatellite reveald by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene." // Am.J.Hum.Genet.-1989-v.44-p.397-401.

67. Lui W.O., Chen J., Glasker S., Bender B.U., Madura C., Khoo S.K., Kort E., Larsson C., Neumann H.P.H., Teh B.T. "Selective loss of chromosome 11 in pheochromocytomas associated with the VHL syndrome." // 0ncogene.-2002-v.21 .-p. 1117-1122.

68. Mahon P.C., Hirota K., Semenza G.L. "FIH-1: a novel protein that interacts with HIF-la and VHL to mediate repression of HIF-1 transcriptional activity" // Genes and Developm.-2001-v.15-p.2675-2686.

69. Maxwell P. "HIF-1 an oxygen respons system with special relevance to the kidney." // J. Am.Soc.Nephrol.-2003-v. 14-p.2712-2722.

70. Messinezy M., Pearson T.C. "The classification and diagnostic criteria of the erythrocytoses (polycythaemias)." // Clic.Lab.Haematol.-1999-v.21-p.309-316.

71. Minor N.T., Sha Q., Nichols C.G., Mercer R.W. "The gamma subunit of the Na-K-ATPase induces cation channel activity." // Proc.Natl.Acad.Sci.USA.-1998-v.95-p.6521-6525.

72. Noguchi C.T., Bal K.S., Chin K., Wada Y., Schechter A.N., Hankins W.D. "Cloning of the human erythropoietin receptor gene." // Blood.-1991-v.78-p.2548-2556.

73. Orita M., Suzuki Y., Hayashi K. "Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction." // Genomics.-1989-v.5-p.874-879.

74. Orita M., Sekiya Т., Hayashi K. "DNA sequence polymorphisms in Alu repeats." // Genomics.-1990-v.8-p.271-278.

75. Ott J. "Analysis of human genetic linkage" // Johns Hopkins University Press.-Baltimore-1991.

76. Pastore Y.D., Jelinek J., Ang S., Guan Y., Liu E., Jedlickova K., Krishnamurti L., Prchal J.T. "Mutations in the VHL gene in sporadic apparently congenital polycythemia." // Blood. -2003a-v.l 01-p.1591-1595.

77. Pastore Y., Jedlickova K., Guan Y., Liu E., Fahner J., Hasle H., Prchal J.F., Prchal J.T. "Mutations of von Hippel-Lindau tumor suppressor gene and congenital polycythemia." // Am .J .Hum. Genet. -2003b-v. 73 -p. 412-419.

78. Penny L.A., Forget B.G. "Genomic organization of the human erythropoietin receptor gene.' // Genomics.-1991-v.l l-p.974-980.

79. Percy M.J., McMullin M.F., Lappin T.R.J. "Sequence analysis of the 3' hypoxia-responsive element of the human erythropoietin gene in patients with erythrocytosis." // Biochem.Mol.Med.-1997-v.62-p. 132-134.

80. Percy M.J., McMullin M.F., Roques A.W., Westwood N.B., Acharya J., Hughes A.E., Lappin T.R., Pearson T.C. "Erythrocytosis due to a mutation in the erythropoietin receptor gene." // Br. J.Haematol.-1998-v. 100-p.407-410.

81. Percy M.J., McMullin M.F., Jowitt S.N., Potter M., Treasy M., Watson W.H., Lappin T.R. "Chuvash type congenital polycythemia in 4 families of Asian Western European ancestry." // Blood.-2003-v.l02-p. 1097-1099.

82. Percy M.J., Zhao Q., Flores A., Harrison C., Lappin T.R.J., Maxwell P.H., McMullin M.F., Lee F.S. "A family with erythrocytosis establishes a role for prolyl hydroxylase domain protein 2 in oxygen homeostasis." // PNAS.-2006-v.l03-p.654-659.

83. Powell J.S., Berkner K.L., Lebo R.V., Adamson J.W. "Human erythropopietin gene: high level expression in stable transfected mammalian cells and chromosome localization." // Proc.Natl.Acad.Sci.USA.-1986-v.83-p.6465-6469.

84. Prchal J.T., Crist W.M., Goldwasser E., Perrine G., Prchal J.F. "Autosomal dominant polycythemia." // Blood.-1985-v.66-p. 1208-1214.

85. Prowse A.H., Webster A.R., Richards F.M., Richard S., Olschwang S., Resche F., Affara N.A., Maher E.R. "Somatic inactivation of the VHL gene in Von Hippel-Lindau disease tumors." // Am. J. Hum. Genet.-1997-v.60-p.765-771.

86. Randi M.L., Murgia A., Pitti M.K., Martella M., Casarin A., Opocher G., Fabris F. "Low frequency of VHL gene mutations in young individuals with polycythemia and high serum erythropoietin." // Haematologica.-2005-v.90-p.689-691.

87. Safran M., Kaelin W.G. "HIF hydroxylation and the mammalian oxygen-sensing pathway." // J.Clin.Invest.-2003-v.l 1 l-p.779-783.

88. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Schart S.J., Heguchi R., Horn G.T., Mullis K.B.,Erlich H.A. "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with thermostable DNA polymerase." // Science.-1988-v.239-p.487-491.

89. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors." // Proc.Natl.Acad.Sci.USA.-1977-v.74-p.5463-5467.

90. Schoenfeld A., Davidowitz E.J., Burk R.D. "A second major native von Hippel-Lindau gene product, initiated from an internal translation start site, functions as a tumor suppressor." // Proc. Nat. Acad. Sci.-1998-v.95-p.8817-8822.

91. Semenza G.L. "HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia." //J.Appl.Physiol.-2000a-v.88-p. 1474-1480.

92. Semenza G.L. "HIF-1 and human disease: one highly involved factor." // Genes and Development.-2000b-v. 14-p.l 983-1991.

93. Sergeyeva A., Gordeuk V.R., Tokarev Y.N., Sokol L., Prchal J.F., Prchal J.T. "Congenital polycythemia in Chuvashia." // Blood.-1997-v.89-p.2148-2154.

94. Service S.K., Lang D.W., Freimer N.B., Sandkuijl L.A. "Linkage-disequilibrium mapping of disease genes by reconstruction of ancestral haplotypes in founder populations." // Am.J.Hum.Genet.-1999-v.64-p. 1728-1738.

95. Sistonen P., Traskelin A.L., Lehvaslaiho H., de la Chapelle A. "Genetic mapping of the erythropoietin receptor gene." // Human.Genetics.-1993-v.92-p.299-301.

96. Spivak J.L. "Erythropoietin: a brief review." // Nephron.-1989-v.52-p.289-294.

97. Sutter C.H., Laughner E., Semenza G.L. "Hypoxia-inducible factor la protein expression is controlled by oxygen-regulated ubiquitination that is disrupted by deletions and missense mutations." // PNAS.-2000-v.97-p.4748-4753.

98. Sweadner K.J., Rael E. "The FXYD gene family of small ion transport regulators or channels: cDNA sequence, protein signature sequence, and expression." // Genomics.-2000-v.68-p.41-56.

99. Takeuchi M., Kobata A. "Structures and functional roles of the sugar chains of human erythropoietins." // Glycobiology.-1991-v.l-p.337-346.

100. Tefferi A. "JAK2 mutations in polycythemia vera molecular mechanisms and clinical applications." // N.Engl.J.Med.-2007-v.356-p.444-445.

101. Therien A.G., Blostein R. "Mechanisms of sodium pump regulation." // Am.J.Physiol.Cell.Physiol.-2000-v.279-p.541-566.

102. Wait S.D., Vortmeyer A.O., Lonser R.R., Chang D.T., Finn M.A., Bhowmick D.A., Pack S.D., Oldfield E.H., Zhuang Z. "Somatic mutations in VHL germline deletion kindred correlate with mild phenotype." // Ann. Neurol.-2004-v.55-p.236-240.

103. Weber J.L., May P.E. "Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction." // Am.J.Hum.Genet.-1989-v.44-p.388-396.

104. Weber J.L. "Informativeness of human (dC-dA)n(dG-dT)n polymorphisms." // Genomics.-1990-v.7-p.524-530.

105. Webster A.R., Richards F.M., MacRonald F.E., Moore A.T., Maher E.R. "An analysis of phenotypic variation in the familial cancer syndrome von Hippel-Lindau disease: evidence for modifier effects." // Am.J.Hum.Genet.-1998-v.63-p.l025-1035.

106. Wenger R.H. "Cellular adaptation to hypoxia: Ог-sensing protein hydroxylases, hypoxia-inducible transcription factors, and Ог-regulated gene expression." // FASEB J.-2002-v.l6-p.l 1511162.

107. Whitcomb W.H., Peschle C., Moore M., Nitschke R., Adamson J.W. "Congenital erythrocytosis: a new form, associated with an erythropoietin-dependent mechanism." // Br J.Haematol.-1980-v.44-p. 17-24.

108. Wiesener M.S., Eckardt K.-U. "Erythropoietin, tumors and the von Hippel-Lindau gene: towards identification of mechanisms and dysfunction of oxygen sensing." // Nephrol.Dial.Transplant.-2002-v.l7-p.356-359.

109. Woodward E.R., MacDonald F., Maher E.R. "VHL mutation analysis in sporadic haemangioblastoma." // Eur.J.ofHum.Genet.-2005-v.l3-p. 194.

110. Yamaguchi K., Akai K., Kawanishi G., Ueda M., Masuda S., Sasaki R. "Effects of side-directed removal of N-glycosylation sites in human erythropoietin on its production and biological properties." // J.Biol.Chem.-1991 -v.266-p.20434-20439.

111. Yang H., Kaelin W.G. "Molecular pathogenesis of the von Hippel-Lindau hereditary cancer syndrome." // Cell Growth and Differentiation.-2001-v.l2-p.447-455.

112. Yu F., White S.B., Zhao Q., Lee F.S. "Dinamic site-specific interaction of hypoxia-inducible factor-la with the von Hippel-Lindau tumor suppressor protein." // Cancer Research.-2001-v.61-p.4136-4142.