Исследование митохондрий на уровне одиночных частиц методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии

Перевощикова, Ирина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование митохондрий на уровне одиночных частиц методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование митохондрий на уровне одиночных частиц методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии"

На правах рукописи

ПЕРЕВОЩИКОВА Ирина Владимировна

ИССЛЕДОВАНИЕ МИТОХОНДРИЙ НА УРОВНЕ ОДИНОЧНЫХ ЧАСТИЦ МЕТОДОМ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ КОРРЕЛЯЦИОННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ

03.00.02 - Биофизика

003480341

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003480341

Работа выполнена на Факультете Биоинженерии и Биоинформатики и в Научно-исследовательском институте физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Московского Государственного Университета имени М.В .Ломоносова

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Антоненко Юрий Николаевич

доктор биологических наук, профессор Потапенко Александр Яковлевич

доктор биологических наук, профессор Максимов Георгий Владимирович

Институт Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН

Защита состоится «12» ноября 2009 г. в 16 ч 30 мин на заседании Диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991 г. Москва, Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра биофизики, «новая» аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «9» октября 2009 г. Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 501.001.96 доктор биологических наук, профессор Т.Е. Кренделева

Общая характеристика работы Актуальность темы. Источником энергии для большинства биохимических процессов в клетке является АТФ, синтезируемый в митохондриях. На внутренней мембране митохондрий в результате окисления субстратов и векторного переноса протонов и электронов генерируется разность электрохимических потенциалов ионов водорода, используемая впоследствии для работы АТФ-синтазы. Митохондрии также выполняют ряд других важных функций и играют центральную роль в таких процессах как старение и апоптоз. В ходе традиционных измерений различных функциональных параметров митохондрий, в том числе мембранного потенциала, с применением флуоресцентных и радиоактивных меток, а также ион-селективных электродов, регистрируются изменения соответствующего сигнала, усредненного по всем частицам в суспензии выделенных органелл. Однако сложность структуры и уникальность выполняемых функций делает актуальной задачу поиска методов характеристики митохондрий на уровне отдельных частиц в физиологических и патологических условиях. Попытки использования методов цитологических исследований для решения такой задачи не принесли значительных результатов в виду малых размеров органелл по сравнению с размерами клетки. В последние годы для исследования биологических объектов на микроуровне успешно применяется метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС), позволяющий следить за временной и пространственной динамикой отдельных частиц. Однако до сих пор не существовало подхода для изучения субклеточных мембранных структур, таких как митохондрии, методом ФКС. В связи с этим представлялось весьма перспективным разработать вариант метода ФКС, применимый для анализа флуктуаций флуоресценции, связанных с движением одиночных окрашенных митохондрий в объеме пространства, соизмеримого с их размерами, и изучить функциональное состояние митохондрий в суспензии с помощью такого подхода.

Г —Ч / \

Цель и основные задачи исследования. Целью работы явилось определение параметров функционального состояния выделенных митохондрий на уровне одиночных частиц в суспензии модифицированным методом ФКС с применением различных флуоресцентных индикаторов. В работе планировалось решить следующие задачи:

1. С использованием модельной системы флуоресцирующих сфер разработать метод анализа флуктуаций интенсивности флуоресценции в микроскопическом объеме с целью определения параметров флуоресценции (в том числе, яркости) одиночных частиц.

2. Провести измерения временной зависимости и автокорреляционной функции флуоресценции выделенных митохондрий в суспензии методом ФКС в зависимости от энергизации митохондрий.

3. Применить разработанный на модельной системе подход для определения параметров одиночных флуоресцирующих частиц в суспензии выделенных митохондрий, окрашенных различными флуоресцентными маркерами; оценить величину мембранного потенциала из яркости одиночных митохондрий.

4. Изучить действие модуляторов порина внешней мембраны митохондрий на его функциональное состояние в физиологических условиях с помощью модифицированного в настоящей работе метода ФКС.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В диссертационной работе впервые применена техника ФКС для изучения суспензии выделенных митохондрий на уровне отдельных частиц. Прямое измерение сигнала флуоресценции от одиночных молекул красителя и окрашенных органелл позволило разобраться в механизмах взаимодействия сафранина О с митохондриями в различных энергетических состояниях. Разработан метод анализа амплитуд пиков флуоресценции, позволяющий определить яркость единичной флуоресцирующей частицы в суспензии. Этот подход использован для вычисления мембранного потенциала единичной митохондрии в энергизованном состоянии в суспензии выделенных органелл и числа митохондрий в миллиграмме митохондриального белка. Впервые на

суспензии выделенных органелл показано влияние различных модуляторов на функциональное состояние порина внешней мембраны митохондрий в физиологических условиях. Аналитическое выражение для вычисления яркости одиночной частицы может быть использовано для изучения различных процессов, приводящих к изменению ее величины. Более того, описанный алгоритм математического анализа амплитуд пиков флуоресценции может быть применен для обработки данных ФКС в других лабораториях.

Публикация и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них: две в реферируемом научном российском журнале («Биохимия»), одна в реферируемом научном зарубежном журнале («Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes») и 3 в тезисах конференций: 6-го конгресса Европейского Биофизического Общества (Лондон, Великобритания, 2007), 7-го конгресса Европейского Биофизического Общества (Генуя, Италия, 2009) и 48-го съезда Американского Биофизического Общества (Лонг Бич, США, 2008).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и включает Введение, Литературный обзор, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Выводы, Заключение и Список цитируемой литературы из ссылок. В работе содержится рисунка и таблицы.

Во Введенин дано обоснование актуальности темы диссертационной работы и указаны ее цели и задачи.

В Литературном обзоре проанализированы имеющиеся данные о роли митохондрий в жизнедеятельности клетки и методах изучения их функционального состояния. Обсуждено применение различных флуоресцентных индикаторов мембранного потенциала и флуорометрических методов его измерения как в клетках, так и в суспензии выделенных органелл. Рассмотрено влияние порина внешней мембраны митохондрий на функциональное состояние органелл и клетки в целом. Проанализированы работы по исследованию митохондрий на уровне одиночных частиц. Дано описание метода ФКС и применения его для исследования отдельных биомолекул.

В Экспериментальной части описаны основные объекты и методы

исследования.

Выделение митохондрий.

Митохондрии из печени крыс выделяли методом дифференциального центрифугирования (три осаждения по 10 минут при 1100 g, 12000 g и 13300 g). Среда выделения (pH 7,4) содержала 250 мМ сахарозы, 20 мМ MOPS, 1 мМ ЭГТА, 1,2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА). Белок определяли по стандартной методике с использованием бицинхониновой кислоты и БСА в качестве стандарта.

Флуоресцентная корреляционная спектроскопия.

Прибор для ФКС представляет собой микрофлуориметр, в котором с высоким временным разрешением (до 1,5 не) регистрируются отдельные фотоны флуоресценции, испускаемые частицами, движущимися в маленьком объеме пространства (рис.1 А). Для возбуждения красителя в нашей установке использовался твердотельный лазер Nd:YAG 532 нм, сопряженный с эпифлуоресцентным инвертированным микроскопом Olympus IMT-2 (США) с водно-иммерсионным объективом 40х, 1,2 NA («Carl Zeiss», Германия). Флуоресцентный сигнал проходил через соответствующий дихроический разделитель и проецировался на сердцевину световода (50 мкм), связанного с лавинным фотодиодом (SPCM-AQR-13-FC, «PerkinElmer Optoelectronics», Канада). Сигнал преобразовывался с помощью интерфейсной карты (Flex02-01D/C, «Correlator.com», США). Для корректной работы прибора перед опытом проводилась настройка положения световода относительно оптической оси. Для этого измерялась автокорреляционная функция флуктуации флуоресценции раствора 10 нМ родамина 6G, которая в оптимуме характеризовалась временем трехмерной диффузии Tj=180 мкс. Эта величина позволяет охарактеризовать значение радиуса (в горизонтальной плоскости) конфокального эллипсоида (рис. 1 Б) как г0 = ■ D ■ rd = 0,42 мкм, предполагая коэффициент диффузии родамина 6G равным D=2,5-10"6 см2/с (объем конфокального эллипсоида равен 11 фемтолитрам). Данные фиксировались в

течение 30 с. Большинство опытов проводилось в условиях перемешивания

суспензии с помощью вращающейся лопасти (скорость вращения 600 об./мин), прикрепленной к электромотору, расположенному сверху столика микроскопа. Регистрировалась флуоресценция от конфокального объема, расположенного в 50 мкм над покровным стеклом, на которое наносилось 60 мкл исследуемой суспензии.

*" '

40х 1,2 МЛ водно-

иммерсионный объектив

Дихроический разделитель

Лазер 532 нм

Конфокальная диафрагма

Лавинный фотодиод

Рис.1. А - Схема прибора для ФКС. Б - Форма и параметры конфокального объема (поперечный срез). Обработка сигнала.

Преобразованный сигнал от детектора представляется в виде зависимости интенсивности флуоресценции от времени (F(t)), соответствующей автокорреляционной функции (G(t)) и гистограммы распределения интенсивностей флуоресценции, а также среднего значения флуоресценции, регистрируемой от конфокального объема за данный интервал времени измерения.

Автокорреляционная функция G(i) является способом количественной обработки флуктуирующего сигнала F(t) интенсивности флуоресценции:

(SF(t)-SF{t + г))

G(r) = '

(1)

где - средняя интенсивность флуоресценции, а = -

отклонение от среднего значения.

Для случая трехмерной диффузии частиц в конфокальном объеме аналитическое выражение для функции б/г) имеет вид:

где N - среднее число флуоресцирующих частиц в конфокальном объеме; r0, zo - геометрические характеристики конфокального объема; td - время диффузии частицы. Справедливо следующее соотношение N=l/G(x—»0).

Основными параметрами, получаемыми при аппроксимации экспериментальных кривых уравнением (2), являются время диффузии частиц

Tj и число частиц в конфокальном объеме N. Параметр та обратно

пропорционален коэффициенту диффузии xd = , а следовательно, прямо

к-т

пропорционален размеру частицы D =-, где к - постоянная Больцмана,

ь-тс-ri-R

Т - температура, т| - вязкость раствора, R — радиус частицы.

Временная зависимость интенсивности флуоресценции F(t) для суспензии ярких частиц характеризуется появлением скачков (или пиков) сигнала на фоне практически постоянного (низкоамплитудного) сигнала базового уровня. Каждый скачок соответствует прохождению отдельной частицы через конфокальный объем. На рис.2А представлена запись F(t) для суспензии флуоресцирующих сфер одинаковой яркости диаметром 1 мкм. Пики сигнала в записи F(t) анализировались с помощью программы WinEDR Strathclyde Electrophysiology Software (J. Dempster, Великобритания), Программа, первоначально разработанная для анализа электрофизиологических данных, дает возможность производить подсчет числа событий N(F>F0), для которых значение F(t) становится больше заданного порога (F0). На рис.2Б представлена полученная с помощью программы WinEDR зависимость числа событий от амплитуды пиков для записи F(t), представленной нарис.2А.

(2),

При обработке сигнала с помощью программы \УтЕОЯ в сложных системах, включающих как свободный, так и связанный с другими частицами краситель, значение минимальной интенсивности флуоресценции определялось из максимума на гистограмме распределения интенсивностей флуоресценции. Это позволяло учитывать лишь вклад связанного красителя.

3000 2500

Л Ь-

о 5 2000

§ 1 П 2 1500

§ й

Я О '000

а к

£ о

* О 500

я >

■е о

Амплитуд)

1000

0.00

0.05 0.10

Время, с

0.15

0.20

200 400 600 800 1000 1200

Амплитуда пиков, кГц

Рис.2 А - Временная зависимость интенсивности флуоресценции суспензии флуоресцирующих сфер диаметром 1 мкм. Б - зависимость числа событий М(Р>Ро) от амплитуды пиков флуоресценции для 30 с записи, часть которой показана на рис.2 А.

Основные результаты работы Автокорреляционный анализ флуктуаций флуоресценции суспензии митохондрий, окрашенных флуоресцентными красителями.

Традиционно метод ФКС используется для исследования процессов, связанных с изменением подвижности биологических объектов, причем этот метод применим только для малых объектов (молекул, супрамолекулярных структур, размер которых меньше размеров конфокального объема). Поскольку подвижность объектов зависит от их размеров, метод ФКС позволяет с помощью флуоресцентных маркеров изучать такие процессы как агрегация частиц, связывание флуоресцирующих молекул с надмолекулярными комплексами, липидными везикулами и т.д. Мы применили автокорреляционный анализ для изучения диффузионных характеристик

митохондрий в неэнергизованном (в отсутствие субстратов окисления), энергизованном (после добавления сукцината) и деэнергизованном состоянии (после добавления разобщителя окислительного фосфорилирования 2,4-динитрофенола, ДНФ), используя различные флуоресцентные красители: этиловый эфир тетраметилродамина (ТМРЭ), сафранин О, родамин 123, митотрекер красный. Время диффузии митохондрий в энергизованном состоянии, окрашенных ТМРЭ, составило т(1=0,067±0,009 с, коэффициент диффузии 0=0,69 мкм2/с, что, исходя из сферической формы частицы и с учетом вязкости буферного раствора сахарозы, дает величину радиуса 11=0,23 мкм. Было показано, что подвижность митохондрий в энергизованном и неэнергизованном состоянии близка (добавка субстрата дыхательной цепи сукцината не оказывает значительного влияния на величину Та). Кроме того, оказалось, что в условиях свободной диффузии таких крупных объектов как митохондрии, за типичное время измерения (30 с) регистрируется число событий, недостаточное для точной статистической обработки. Поэтому основные параметры автокорреляционной функции (время диффузии и число частиц в конфокальном объеме) варьируют даже в идентичных экспериментальных условиях. Следует учесть, что в случае таких объектов, как выделенные митохондрии, которые быстро теряют функциональную активность, точность измерений невозможно повысить за счет длительного накопления данных. Таким образом, традиционный способ анализа данных, полученных методом ФКС, не может быть применен в случае суспензии митохондрий. Однако, в наших экспериментах было замечено, что амплитуда флуктуаций флуоресценции митохондрий, окрашенных ТМРЭ, значительно различается в зависимости от их энергетического состояния и, следовательно, может быть использована для оценки его главной характеристики, а именно, мембранного потенциала, на уровне отдельной митохондрии. Поскольку амплитуда флуктуаций интенсивности флуоресценции не должна зависеть от размера частиц, а определяется, при постоянных технических характеристиках прибора, числом молекул флуорофора на одну частицу, было предложено

использовать этот параметр в качестве критерия взаимодействия потеициалзависимых флуоресцентных красителей с митохондриями. Анализ зависимостей интенсивности флуоресценции от времени для суспензии митохондрий, окрашенных ТМРЭ.

На рис.3 А показана временная зависимость интенсивности флуоресценции красителя ТМРЭ, которая в данном масштабе представляет собой прямую линию (кривая 1, рис.3 А). Добавление митохондрий (неэнергизованное состояние) в раствор ТМРЭ приводит к появлению в записи флуоресценции пиков небольшой амплитуды, вследствие, по-видимому, неспецифической сорбции молекул красителя на поверхности митохондрий (кривая 2, рис.ЗА). Последующее добавление сукцината приводит к существенному увеличению амплитуды пиков, которое, очевидно, вызвано энергозависимым входом флуоресцентных молекул внутрь митохондрий в ответ на генерацию мембранного потенциала (кривая 3, рис.ЗА). Последующее добавление ДНФ приводит к падению числа и амплитуды пиков, связанному с выходом красителя из митохондрий при переходе в деэнергизованное состояние (кривая 4, рис.ЗА).

Для получения статистически достоверной оценки параметров системы необходимо увеличивать время измерения. Однако, длительное воздействие лазерного излучения может привести к выцветанию молекул флуорофора и разобщению митохондрий вследствие фотодинамического действия. Поэтому для увеличения числа событий без увеличения продолжительности измерений мы применили перемешивание суспензии митохондрий, которое не влияет на амплитуду флуктуаций флуоресценции.

V (■> : + сукцинат

КО кГц

* » »** * I*

ТШРЭ 4 Дезнергизованное

состояние

Рис.3. А - зависимость интенсивности флуоресценции от времени для суспензии митохондрий, окрашенных ТМРЭ 0,3 мкМ, в отсутствие перемешивания. 1 -контрольная запись в растворе ТМРЭ, 2 - неэнергизованное состояние, митохондрии 0,4 мг/мл, ротенон 3 мкМ, 2 - энергизованное состояние, добавка сукцината 5 мМ, 3 — дезнергизованное состояние, добавка ДНФ 100 мкМ. Б -схематическое представление цепи событий взаимодействия красителя ТМРЭ с отдельной митохондрией в различных энергетических состояниях.

На рис.4А приведены зарегистрированные в условиях перемешивания временные зависимости интенсивности флуоресценции суспензии митохондрий, окрашенных ТМРЭ. На рис.4Б приведены соответствующие гистограммы распределения интенсивностей флуоресценции для записей, изображенных на рис.4А. Из сравнения данных, представленных на рис.ЗА и 4А, видно, что перемешивание значительно увеличило число регистрируемых событий, тогда как качественный эффект увеличения числа и амплитуды пиков флуоресценции при энергизации митохондрий сохранился. Гистограмма распределения интенсивностей флуоресценции показывает вероятность нахождения частицы с определенной яркостью в конфокальном объеме. Так как энергизация приводит к увеличению яркости отдельных частиц, на гистограмме 2 (рис.4Б) появляется соответствующее правое плечо высоких интенсивностей флуоресценции.

Пики флуоресценции имеют большой разброс по амплитуде даже в случае одинаковых по яркости флуоресцирующих сфер (рис.2А).

Интенсивность флуоресценции, кГц

Рис.4. А - зависимость интенсивности флуоресценции от времени для суспензии митохондрий, окрашенных ТМРЭ (0,03 мкМ), в условиях перемешивания. 1 - митохондрии 0,26 мг/мл, ротенон 7 мкМ, 2 - добавка сукцината 7 мМ, 3 - добавка ДНФ 100 мкМ. Б — гистограмма распределения интенсивностей флуоресценции для условий рис.4А

Это связано с существенно неоднородной освещенностью конфокального объема. Поэтому для определения яркости отдельных митохондрий в суспензии мы разработали метод анализа амплитуд пиков флуоресценции, который позволяет вычислять интенсивность флуоресценции единичной частицы, проходящей через центр области освещения, где интенсивность лазерного возбуждения максимальна.

Вывод аналитического выражения для определения яркости частицы, проходящей через центр конфокального объема.

Аналитическое выражение функции распределения интенсивности флуоресценции для точечных частиц одинаковой светимости В0 (пропорциональной коэффициенту экстинкции и квантовому выходу флуоресценции красителя) было получено в предположении, что вероятность обнаружения частицы в конфокальном объеме описывается функцией Гаусса в трехмерном пространстве. Тогда максимальная яркость движущейся частицы определяется по уравнению (3):

Р = В0- А-ехр(-2гг/г0г) ■ ехр(-2гг /г„2), (3)

где А - максимальная интенсивность света в центре конфокального объема, г, г - координаты точки максимального сближения с центром конфокального объема.

Доля событий, для которых амплитуда больше Г0, т.е. Р(Р>Р0), составит

>/•,) = -Р0 • Ш0-5-) Для ^ < А ■ В0 и Рф > /•,) = 0для ^ > А ■ В0 (4)

А-В0

где Р0 - нормировочный множитель, пропорциональный концентрации частиц.

Экспериментально измерялась не вероятность обнаружения событий с амплитудой больше заданного порога, а число таких событий. При этом такое число событий Лг(7г>/го,' прямо пропорционально Р(Е>Р0). Рассмотрим производную функции Р(Г>Р0), характеризующую количество событий, происходящих в интервале около которую можно получить из уравнения (4) дифференцированием: <У(Г>Г0)_ Р0

Как было показано в литературе, функция Гаусса в трехмерном пространстве хорошо описывает распределение интенсивности света в области фокусировки в случае двухфотонного лазерного источника возбуждающего света. В нашей оптической схеме используется однофотонный лазер, для которого функция распределения вероятности обнаружения частицы в конфокальном объеме описывается комбинацией функций Гаусса и Лоренца. В некоторых случаях данная функция распределения в конфокальном объеме хорошо описывается функцией Лоренца в трехмерном пространстве:

Тогда функция Р(Р>Р0) и ее производная равны:

/»(/!•>) = для Г0<А-В„,и />(^>^) = 0для /•■„ > А-В0 (5)

Р0-А-Ва

Функции распределения (4) и (5) были использованы для аппроксимации экспериментальных данных для флуоресцентных сфер. Оказалось, что

уравнение (4) явно завышает число событий М(Р>Р0), а уравнение (5) занижает. Однако сходная функция (6) хорошо описывает данные:

= 1) для ^<Л-В0,и Р(Р>Ъ) = 0ддя Ъ>Л-В0 (6)

Р ■ А - В

Уравнение (6) было получено путем интегрирования функции —¡у-2-, которая

Р Р • А • В является промежуточной между — и ——-—--.

Ъ К

Уравнение (6) дает информацию о двух важных параметрах системы: яркости частицы, проходящей через центр конфокального объема, АВ0, и величине Р0, пропорциональной концентрации частиц в суспензии.

Проверка аналитического выражения на модельных системах (метод ААП).

Для оценки применимости предложенного выше подхода были проанализированы временные зависимости интенсивности флуоресценции суспензий гомогенных по яркости флуоресцирующих сфер различного размера. Рис.5А показывает, что с увеличением диаметра яркость частицы возрастает. Это хорошо согласуется с информацией о зависимости яркости от размера, предоставленной производителем.

Мы также измерили зависимость числа событий Ы(Р>Р0) от амплитуды пиков для более сложной системы: нефлуоресцирующих сфер, проинкубированных с ТМРЭ в различной концентрации. На вставке к рис.5Б видно, что параметр АВ0 линейно растет с увеличением концентрации ТМРЭ, что отражает сорбцию молекул красителя на поверхность латексных частиц. Таким образом, полученное аналитическое выражение хорошо описывает основные свойства изучаемой системы.

Амплитуда пиков, кГц Амплитуда пиков, кГц

Рис.5 А - Зависимость числа событий М(Р>Г0) от амплитуды пиков для флуоресцирующих сфер различного диаметра. Сплошные линии -теоретические кривые, аппроксимирующие экспериментальные данные по уравнению (6). Значения АВ0 и Ро: 11700 кГц и 240 (диаметр 1 мкм, кривая 1), 1600 кГц и 190 (диаметр 0,5 мкм, кривая 2), 1080 кГц и 1010 (диаметр 0,17 мкм, кривая 3). Б - Зависимость числа событий от амплитуды пиков флуоресценции суспензии латексных частиц (диаметр 0,8 мкм), окрашенных ТМРЭ с различной концентрацией. Сплошные линии - теоретические кривые, аппроксимирующие экспериментальные данные по уравнению (6). Значения А-В0: 5400 кГц (кривая 1, 0,1 мкМ ТМРЭ), 1500 кГц (кривая 2, 0,03 мкМ ТМРЭ), 520 кГц (кривая 3, 0,01 мкМТМРЭ)

Зависимость числа частиц в конфокальном объеме, определенного методом ААП, от концентрации митохондрий.

Было обнаружено, что полученные зависимости числа событий от амплитуды пиков для эксперимента, представленного на рис.4А, плохо аппроксимируются уравнением (6). Это связано с высокой концентрацией белка и, как следствие, нахождением в конфокальном объеме больше одной частицы. На рис.бА, Б показаны зависимости параметров Р0 и АВ0 от концентрации белка в пробе. Линейный характер концентрационной зависимости параметра Р0 наблюдался вплоть до концентрации белка 0,04 мг/мл. При этом параметр яркости А-В0 (рис.бБ) оставался примерно одинаковым во всем диапазоне концентраций белка. Поэтому для дальнейших

исследований были выбраны условия нахождения в конфокальном объеме не более одной частицы.

7000 -бОМ • 50

<а

зооо \ гам юоо <

0,00 002 004 006 00« 0 10 012 0.14 0.16 белок, мгмл

0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 белок, мг/мл

Рис.6 А - Зависимость параметра Р0 от концентрации энергизованных митохондрий в пробе. Условия: ТМРЭ 0,03 мкМ, ротенон 7 мкМ, сукцинат 5 мМ. Б — Зависимость параметра А-В0 для условий эксперимента рис.6 А. Определение мембранного потенциала на уровне единичных митохондрий.

На рис.7А показаны записи интенсивности флуоресценции суспензии выделенных митохондрий, окрашенных ТМРЭ, на рис.7Б - зависимость числа событий АТ(Р>Р0) от амлитуды пиков и соответствующие теоретические кривые.

Среднее значение параметра АВ0 (характеризующего яркость одной митохондрии), измеренное для шести препаратов выделенных митохондрий в энергизованном состоянии при концентрации ТМРЭ 0,03 мкМ, составило 5950±390 кГц. Зная яркость одной молекулы родамина, можно посчитать мембранный потенциал по уравнению Нернста: ЯТ,

Д(Э :

-1оё(С,

енутр ^ ^ нар )

(7)

Яркость молекулы родамина была определена с помощью такого же подхода - анализа амплитуд пиков флуоресценции родамин-меченых липосом - и составила 1,3 кГц. Среднее значение параметра А-В0 для препаратов митохондрий в деэнергизованном состоянии, отражающее неспецифическое связывание ТМРЭ с митохондриями, составило 1905±237 кГц. Тогда число

молекул родамина, вошедших в результате энергизации в одну митохондрию,

5950кГц-1905 кГц ,,,„ составило =-——г-- = 3112 молекул.

1,3 кГц

>ЛМ<

ХЗГ

4000кГц

1000 2000 3000 4000 5000 0000 Амплитуда пиков, кГц

Рис.7. А — временная зависимость интенсивности флуоресценции суспензии митохондрий, окрашенных 0,03 мкМ ТМРЭ. Б - зависимость числа частиц от амплитуды пиков. 1 - митохондрии 0,0044 мг/мл, ротенон 7 мкМ, АВ0 =1882 кГц, Р0=400; 2 - добавка сукцината 5 мМ, АВ0 =6600 кГц, Р0=540; 3 - добавка ДНФ 100 мкМ, А В0=2757 кГц, Р0=314

Принимая внутренний объем митохондрии равным 0,17 мкм3 (такая величина измерена методом электронной микроскопии для митохондрий, выделенных из печени крыс), можно рассчитать концентрацию ТМРЭ внутри частицы:

3112 мол

С" „ =---— = 30 мкМ

6-10 л<ол/М-0,17 10 л

В виду очень низкой концентрации митохондриального белка в пробе, можно считать, что концентрация красителя в растворе не изменяется при добавлении митохондрий, т.е. Снар=0,03 мкМ ТМРЭ. Тогда можно рассчитать потенциал единичной митохондрии:

ру

&<р = -—г 1овЦС^ !Снар) = 59 • 1оё(30 мкМ/0,03 мкМ)в-Ш мВ

Разброс в яркости частиц приводит к разнице в значениях потенциала в несколько милливольт. Подобный расчет был использован для определения

изменений потенциала под действием различных разобщителей в суспензии энергизованных митохондрий. Было показано, что при добавлении 15 мкМ ДНФ потенциал уменьшается на 14 мВ. Определение числа митохондрий в миллиграмме белка.

Как было показано ранее, параметр Р0 уравнения (6) пропорционален концентрации флуоресцирующих частиц в суспензии. Мы использовали его, чтобы рассчитать важную характеристику суспензии выделенных митохондрий - число частиц в мг белка. Для этого в качестве калибровочной кривой была измерена зависимость Р0 от концентрации флуоресцирующих сфер диаметром 0,5 мкм (рис. 8). На основании этой зависимости, взяв Р0=540 для митохондрий из эксперимента, показанного на рис.7Б, удалось определить концентрацию флуоресцирующих частиц в суспензии митохондрий 1Ч/мл=[,3-Ю7. Подставив концентрацию митохондриального белка 0,0044 мг/мл, получаем число митохондрий в 1 мг белка Ы/мг=2-109 шт/мг.

Рис.8 Зависимость параметра Р0 от концентрации флуоресцирующих сфер диаметром 0,5 мкм.

Число частиц, шт/мл

Изучение взаимодействия сафранина О с митохондриями.

Традиционным методом измерения мембранного потенциала выделенных митохондрий является регистрация уменьшения флуоресценции сафранина О в ответ на энергизацию. Как предполагается, это падение флуоресценции связано с уменьшением концентрации красителя в растворе и накоплением молекул флуорофора в митохондриях в концентрации самотушения.

Для проверки данного утверждения мы провели прямые измерения сигнала флуоресценции от отдельных окрашенных митохондрии в суспензии методом ФКС.

80x106

4 5. 70x10е

з 60<109 3

2 2 50x10«

3 § 10x10°

Ч 40x1О6 = 30x10«

I 20x106

60<109

40x1О6

100 мс

0 2 4 б 8 10 12 Концентрация сафранина О, мкМ

Рис.9. А - Временная зависимость интенсивности флуоресценции суспензии митохондрий, окрашенных сафранином О (10 мкМ). 1 - 10 мкМ сафранина О в буфере, 2 - добавка митохондрий 0,39 мг/мл, ротенон 1 мкМ, 3 - добавка сукцината 5 мМ, 4 - добавка ДНФ 100 мкМ Б - Зависимость площади под пиками в энергизованном (кривая 1) и деэнергизованном (кривая 2) состоянии в присутствии различных концентраций сафранина О. Условия: митохондрии 0,51 мг/мл, ротенон 1 мкМ, сукцинат 5 мМ (кривая 1). Деэнергизованное состояние измерялось в присутствии ДНФ (100 мкМ).

На рис.9А показаны временные зависимости интенсивности флуоресценции красителя в присутствии митохондрий в различных энергетических состояниях. Для количественной характеристики взаимодействия сафранина О с митохондриями на микроуровне вычислялась общая площадь под пиками в записи флуоресценции в присутствии различных концентраций красителя по формуле 5 = - Г0) (рис.9Б). Было показано, что в случае высокой

начальной концентрации сафранина О (10 мкМ) энергизация не приводит к увеличению яркости отдельных частиц. Из этого можно сделать вывод, что видимое падение сигнала флуоресценции на макроуровне действительно связано с уменьшением концентрации свободного красителя в растворе и накоплением его в митохондриях в концентрации самотушения. При использовании сафранина О в концентрации 1 мкМ энергизация митохондрий приводила к появлению пиков высокой амплитуды и увеличению общей площади под пиками по сравнению с деэнергизованным состоянием.

Изучение функциональных свойств порина внешней мембраны выделенных митохондрий на уровне одиночных частиц.

Транспорт гидрофильных компонентов в митохондрии осуществляется

изучения функционального состояния порина по накоплению флуоресцентно меченого АТФ (АТФ-ВосПру) отдельными митохондриями в суспензии выделенных органелл. Большое число АТФ-связывающих центров внутри митохондрий обеспечивает высокую специфичность связывания АТФ-ВосМру. Контрольные опыты показали, что такой гидрофильный низкомолекулярный краситель как сульфородамин Б не накапливался в митохондриях. Свойства порина ранее изучались электрофизиологическими и биохимическими методами. Мы впервые исследовали действие известных модуляторов поринового канала (НАД+, НАДН, полианион Кёнига, гексокиназа) на его функциональное состояние в митохондриях в физиологических условиях. На рис.10 А показана зависимость числа событий Ы(Р>Р0) от амплитуды пиков для суспензии неэнергизованных митохондрий с открытым каналом порина, предварительно проинкубированных со специфическим искусственным ингибитором канала полианионом Кёнига.

Предварительная инкубация суспензии митохондрий с выделенной и очищенной митохондриальной гексокиназой также приводила к ингибированию входа меченого АТФ (рис.ЮБ). ), вследствие, по-видимому, ассоциации гексокиназы с порином. Однако в отличие от необратимого действия других модуляторов, действие фермента было обратимым при добавлении глюкозо-6-фосфата, что явно обусловлено диссоциацией фермента. Таким образом, наши данные показали, что связывание гексокиназы приводит к блокированию транспорта АТФ через пориновый канал.

АТФ-ВоШру через специальные белковые каналы в мембранах. Преобладающим по массе %ТЛГ> канальным белком внешней мембраны

о О митохондрий является порин. В нашей работе метод ФКС был применен для

А Б

1000 1500 2ГО0 2500 3000 3500 4000 1000 1500 2000 2500 3000 3500

Амлтуда пиков, г Гц Амплитуда пмксе. кГц

Рис.10 А - Зависимость числа событий Лr(F>Fa^ от амплитуды пиков флуоресценции суспензии митохондрий в присутствии АТФ-ВосКру: действие полианиона Кёнига. 1 - митохондрии 0,04 мг/мл, ротенон 2 мкМ, АТФ-ВосПру 25 нМ, 2 - митохондрии 0,04 мг/мл, ротенон 2 мкМ, 0,06 мг/мл полианион Кёнига, АТФ-ВосКру 25 нМ, 3 - добавка 0,1 мг/мл аламетицина, 4 - добавка 2 мМ АТФ. Б - Зависимость числа событий от амплитуды пиков суспензии митохондрий в присутствии АТФ-ВосНру: действие гексокиназы. 1 -митохондрии 0,04 мг/мл, ротенон 2 мкМ, АТФ-ВосИру 25 нМ, 2 - митохондрии

0.04 мг/мл, ротенон 2 мкМ, гексокиназа 0,27 мг/мл, АТФ-ВосНру 25 нМ, кривая 3 - добавка 1 мМ глюкозо-6-фосфат.

Было показано, что НАДН также подавляет активность канала, тогда как его окисленная форма НАД+ действует значительно слабее (данные не приведены). Результаты изучения действия перечисленных модуляторов на транспорт АТФ через канал хорошо коррелируют с электрофизиологическими данными по ионной проницаемости порина. Выводы

1. На основе метода флуоресцентной корреляционной спектроскопии, суть которого состоит в измерении флуктуации флуоресценции от микрообъема, составляющего несколько фемтолитров, разработан модифицированный экспериментальный подход, названный методом анализа амплитуд пиков (ААП) флуоресценции суспензии окрашенных частиц. Метод ААП позволяет оценить два основных параметра системы: яркость частицы и концентрацию флуоресцирующих частиц в суспензии. Выведено аналитическое выражение

для вычисления яркости одиночной частицы и параметра, пропорционального числу флуоресцирующих частиц в суспензии.

2. Метод ААП опробован на модельной системе, содержащей гомогенные по яркости и размеру флуоресцентные сферы (типичный размер 500 нм).

3. Показано, что метод ААП позволяет исследовать свойства отдельных митохондриальных частиц или их малых ансамблей. Разработанный подход применен для анализа функционального состояния выделенных митохондрий. С помощью анализа флуоресценции суспензии выделенных митохондрий, окрашенных потенциалзависимым флуоресцентным красителем, этиловым эфиром тетраметилродамина (ТМРЭ), измерен мембранный потенциал митохондрий, а также число частиц в миллиграмме белка. Преимущество данного подхода перед традиционными методами измерения мембранного потенциала состоит в том, что он позволяет проводить измерения при наличии менее 1 мкг белка в пробе, что делает доступным изучение митохондрий, выделенных из культур клеток.

4. Прямыми измерениями флуоресценции суспензии энергизованных митохондрий, окрашенных потенциалзависимым красителем сафранином О, показано уменьшение концентрации молекул флуорофора в растворе и накопление их в митохондриальных частицах в концентрации самотушения. При более низких концентрациях сафранина О энергизация митохондрий приводила к увеличению интенсивности флуоресценции отдельных частиц в согласии с результатами, полученными с использованием красителя ТМРЭ.

5. Метод ААП позволил исследовать влияние различных модуляторов порина внешней мембраны митохондрий на вход флуоресцентно меченного АТФ в интакгные органеллы в физиологических условиях. Показано, что наличие большого числа АТР-связывающих центров внутри митохондрий обеспечивает накопление флуоресцентно меченного АТФ внутри органелл в высоких концентрациях. Показано также, что связывание фермента гексокиназ т к блокированию транспорта АТФ через пориновый

канал.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Perevoshchikova I.V., Zorov D.B. Antonenko Y.N. Peak intensity analysis as a method for estimation of fluorescent probe binding to artificial and natural nanoparticles: Tetramethylrhodamine uptake by isolated mitochondria. Biochim. Biophys. Acta - Biomembranes, 1778 (10), 2182-2190,2008.

2. Перевощикова И.В., Сорочкина А.И., Зоров Д.Б., Антоненко Ю.Н. Сафранин О как флуоресцентный индикатор мембранного потенциала митохондрий: исследование на уровне суспензии и уровне отдельных митохондрий, Биохимия, 74 (6), 663-671,2009

3. Пашковская А.А., Перевощикова И.В., Майзлиш В.Е., Шапошников Г.П., Котова Е.А., Антоненко Ю.Н. Взаимодействие тетразамещенного катионного фталоцианина алюминия с искусственными и природными мембранами. Биохимия, 74 (9), 1252-1259,2009

4. Perevoshchikova I.V., Zorov D.B., Novoderezhkin V.I., Antonenko Y.N. Peak amplitude analysis as a simplified version of the method of photon counting histogram for estimation of binding of a probe to artificial and natural nano-particles. Abstracts of the 52th Annual Biophysical Society Meeting, Long Beach (USA), Biophys. J., 94,1584,2008.

5. Perevoshchikova I.V., Zorov D.B, Antonenko Y.N. Brightness analysis of isolated mitochondria doped with TMRE and Mitotracker. Abstracts of the 6th EBSA European Biophysics Congress, London (U.K.), Eur. Biophys. J., 36, S22,2007.

6. Perevoshchikova I.V., Zorov D.B., Antonenko Y.N. Fluorescently-labeled ATP as a probe of the outer mitochondrial membrane barrier: role of VDAC. Abstracts of the 7th European Biophysics Congress, Genova (Italy), Eur. Biophys. J., 38,201,2009.

Подписано в печать 08.10.09 Формат 60x88 1/16. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 863 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Перевощикова, Ирина Владимировна

Список условных сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1.Строение и функции митохондрий в клетке: роль разности электрохимических потенциалов ионов водорода.

1.1.1. Строение и функции митохондрий в клетке.

1.1.2. Хемиосмотическая теория Митчелла.

1.1.3. Гидрофобные катионные красители как маркеры митохондрий в клетке.

1.1.4. Применение современных методов флуорометрии для изучения структуры и функций отдельных митохондрий в клетках и суспензии выделенных органелл.

1.1.5. Строение и функции порина во внешней мембране митохондрий.

1.2. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия: теория и приложения.

1.2.1. Исторические аспекты развития метода.

1.2.2. Экспериментальная реализация метода.

1.2.2.1. Схема установки для флуоресцентной корреляционной спектроскопии.

1.2.2.2. Конфокальный объем и способы его определения.

1.2.2.3. Автокорреляционная функция.

1.2.2.4. Гистограмма распределения интенсивностей.

1.2.3. Применение техники флуоресцентной корреляционной спектроскопии в биофизике.*.

1.2.3.1.Изучение взаимодействия и агрегации биомолекул.

1.2.3.2. Использование метода ФКС для изучения кинетики химических реакций биологически-активных молекул.

1.2.3.3. Применение метода флуоресцентной корреляционной спектроскопии для изучения движения отдельных молекул в проточных системах.

1.2.3.4. Применение метода анализа гистограмм интенсивности флуоресценции.

1.2.3.5. Анализ пиков флуоресценции в суспензии ярких частиц.

1.3. Предпосылки изучения митохондрий методом ФКС.

Глава 2. Материалы и методы.

Глава 3. Результаты.

3.1. Автокорреляционный анализ флуктуаций флуоресценции суспензии митохондрий, окрашенных флуоресцентными красителями.

3.2. Временные зависимости интенсивности флуоресценции для суспензии митохондрий, окрашенных потенциалзависимыми флуоресцентными красителями сафранином О и этиловым эфиром тетраметилродамина.

3.2.1 .Исследование взаимодействия сафранина О с митохондриями методом ФКС.

3.2.2.Исследование взаимодействия этилового эфира тетраметилродамина с митохондриями методом ФКС.

3.3. Метод анализа амплитуд пиков флуоресценции (ААП).

3.3.1. Разработка подхода на модельных системах.

3.3.2. Применение метода анализа амплитуд пиков флуоресценции к суспензии выделенных митохондрий.

3.4. Определение мембранного потенциала выделенных митохондрий в суспензии и на уровне одиночных частиц.

3.5. Исследование взаимодействия флуоресцентных митохондриальных индикаторов потенциала и красителя оксонола VI с субмитохондриальными частицами.

3.6. Изучение функционального состояния порина внешней мембраны выделенных митохондрий.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование митохондрий на уровне одиночных частиц методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии"

Современную науку характеризирует постепенный переход от изучения« объектов на макроуровне (вещества в целом) к свойствам нанообъектов и даже одиночных молекул. Этот общий тезис особенно применим к современной биофизике, где в последнее время нашли применение^ такие методы изучения биомолекул как атомно-силовая микроскопия, флуоресцентная микроскопия отдельных молекул, измерение активности одиночных каналов и некоторые другие. Метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС) основан на регистрации флуктуаций флуоресценции отдельных частиц, возникающих в результате броуновского движения в освещенном лазером* объеме1 пространства, (конфокальном объеме). Современные объективы позволяют сфокусировать лазерный луч в пятно размером в доли микрона и регистрировать сигнал от объема в, несколько фемтолитров. Стандартная\ обработка- сигнала в виде автокорреляционной функции (О(т)) позволяет получить информацию о двух важных параметрах суспензии частиц: времени диффузии частицы» (т^) и числе частиц в конфокальном объеме (И), т^ обратно пропорционально коэффициенту диффузии и прямо пропорционально размеру частиц. Традиционно метод ФКС используется, для- исследования' биофизических процессов, связанных с изменением подвижности объектов, и позволяет изучать такие процессы как агрегация частиц, связывание флуоресцирующих молекул с надмолекулярными комплексами, связывание с липидными везикулами и т.д. Существенно, что такой подход имеет ограничение на размер исследуемых объектов, составляющее около 100 нм. Другим параметром суспензии флуоресцирующих частиц, измеряемым методом ФКС, является их яркость. Временная зависимость интенсивности флуоресценции для суспензии ярких частиц характеризуется появлением скачков (или пиков) сигнала на фоне практически постоянного (низкоамплитудного) сигнала базового уровня. Каждый скачок соответствует прохождению отдельной частицы через конфокальный объем. Важно отметить, что амплитуда флуктуаций флуоресценции не зависит от размера объекта, а определяется, числом молекул флуорофора на одну; частицу при постоянных технических; характеристиках прибора. Именно это свойство было использовано нами для определения яркости, отдельных частиц, в суспензии на основании анализа амплитуды пиков флуоресценции.

Объектом: исследования в настоящей работе, были изолированные митохондрии,, окрашенные различными флуоресцентными ' красителями. Митохондрии играют важную роль в функционировании клетки. Источником энергии! для, большинства1; биохимических процессов в клетке является; АТФ, синтезируемый в митохондриях. На внутренней мембране; митохондрий в результате окисления; субстратов и векторного переноса, протонов«: и электронов генерируется разность электрохимических потенциалов, ионов водорода, используемая« впоследствии? для работы АТФ-сиптазы. Митохондрии также выполняют ряд. других важных функций , и играют центральную роль в таких процессах как; старение: и апоптоз. Поддержание постоянной величины мембранного потенциала митохондрий; является необходим условием жизнедеятельности митохондрии и клетки в целом:. Трудности прямого измерения, мембранного: потенциала связаны,.в первую очередь, с малым размером митохондрий (около 0,5 мкм). Это не позволяет использовать- стандартную электродную,- технику. В ходе: традиционных измерений? различных, функциональных параметров митохондрий, в том числе мембранного потенциала, с применением флуоресцентных и радиоактивных меток, а также; ион-селективных электродов^ регистрируются изменения4 соответствующего1 сигнала,, усредненного- по всем частицам в. суспензии' выделенных' органелл. Однако, сложность структуры и уникальность выполняемых функций делает актуальной задачу поиска методов характеристики митохондрий на уровне отдельных частиц в физиологических и патологических, условиях. Попытки; использования методов цитологических исследований; для решения; такой задачи не принесли значительных результатов в виду малых размеров органелл по сравнению с размерами клетки. В связи с этим представлялось весьма перспективным разработать экспериментальный подход на основе метода ФКС, применимый для анализа флуктуаций флуоресценции, связанных с движением одиночных окрашенных митохондрий в малом объеме пространства, и изучить функциональное состояние митохондрий в суспензии с помощью такого подхода.

Автор выражает благодарность научному руководителю Антоненко Юрию Николаевичу, научному консультанту Зорову Дмитрию Борисовичу и Котовой Елене Аврамовне за помощь в проведении исследовательской работы, обсуждении результатов, написании статей. А также коллегам и сотрудникам НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского за плодотворное обсуждение текущих результатов на семинарах.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Перевощикова, Ирина Владимировна

Выводы.

1. На. основе метода флуоресцентной; корреляционной спектроскопии, суть которого состоит в измерении флуктуаций флуоресценции от микрообъема, составляющего несколько фемтолитров, разработан модифицированный экспериментальный подход, названный методом анализа амплитуд пиков (ААП) флуоресценции- суспензии окрашенных частиц. Метод ААП позволяет оценить два основных параметра системы: яркость частицы и концентрацию флуоресцирующих частиц в суспензии. Выведено аналитическое выражение для вычисления яркости: одиночной: частицы, и параметра, пропорционального числу флуоресцирующих частиц:в суспензии.

2. Метод ААП: опробован, на модельной системе; содержащей! гомогенные по яркости и размеру флуоресцентные сферы (типичный размер 500 нм).

3: Показано, что метод ААП позволяет исследовать свойства отдельных митохондриальных частиц или их малых ансамблей. Разработанный подход применен для анализа функционального; состояния выделенных митохондрий. С помощью анализа флуоресценции; суспензии выделенных . ' - ^ митохондрий, окрашенных потенциалзависимым флуоресцентным красителем, этиловым эфиром; тетраметилродамипа (ТМРЭ), измерен мембранный потенциал митохондрий, а также число частиц в миллиграмме белка. Преимущество, данного подхода перед традиционными методами измерения мембранного потенциала состоит в том, что он позволяет проводить измерения; при наличии менее 1 мкг белка в пробе, что делает доступным изучение митохондрий, выделенных из культур клеток.

4. Прямыми измерениями флуоресценции суспензии энергизованных митохондрий, окрашенных потенциалзависимым красителем сафранином О; показано уменьшение концентрации молекул флуорофора в растворе и накопление их в митохондриальных частицах в концентрации самотушения.

При более низких концентрациях сафранина О энергизация митохондрий приводила к увеличению интенсивности флуоресценции отдельных частиц в согласии с результатами, полученными с использованием красителя ТМРЭ.

5. Метод ААП позволил исследовать влияние различных модуляторов порина внешней мембраны митохондрий на вход флуоресцентно меченного АТФ в интактные органеллы в физиологических условиях. Показано, что наличие большого числа АТР-связывающих центров внутри митохондрий обеспечивает накопление флуоресцентно меченного АТФ внутри органелл в высоких концентрациях. Показано также, что связывание фермента гексокиназы приводит к блокированию транспорта АТФ через пориновый канал.

Заключение

Подведем некоторые итоги проделанной работе по применению техники ФКС к изучению выделенных митохондрий. Прежде всего, следует отметить переход от измерения усредненных характеристик флуоресценции системы в целом к измерениям флуоресценции от отдельных частиц: окрашенных митохондрий и несвязанного красителя. Одним из практических результатов этого методического достижения, полученным в нашей работе, является прямое измерение числа митохондриальных частиц в миллиграмме митохондриального белка. Благодаря такому анализу удалось разобраться в природе потенциалзависимых изменений флуоресценции суспензии митохондрий, окрашенных красителем сафранином О. Был подтвержден вывод о том, что снижение общего уровня флуоресценции в этом случае связано с уменьшением концентрации молекул флуорофора в растворе и накоплением их в митохондриальных частицах в концентрации самотушения. При более низких концентрациях сафранина О энергизация митохондрий приводила к увеличению интенсивности флуоресценции отдельных частиц в согласии с результатами, полученными с использованием красителя ТМРЭ. Следует отметить также, что высокая чувствительность метода ФКС позволила проводить измерения в случае ТМРЭ при очень низких количествах митохондриального белка (до 1 мкг). Это открывает новые возможности для оценки функционального состояния (в том числе мембранного потенциала) суспензии выделенных митохондрий, полученных из культур клеток тканей.

Помимо традиционных митохондриальных красителей, которые использовались в данной работе, был обнаружен новый перспективный краситель, а именно флуоресцентно-меченый АТФ (АТФ-ВосНру). Оказалось, что окрашивание митохондрий этим красителем существенно зависит от проницаемости внешней мембраны митохондрий. С помощью ингибиторного анализа было показано, что накопление АТФ-ВосНру определяется

1 * функциональным состоянием, поринаг внешней мембраны* митохондрий; Это направление работы является очень актуальным, поскольку было показано, что порин участвует в таких процессах как формирование неспецифической поры в митохондриях и апоптоз. Таким образом, порин оказывает существенное влияние на жизнедеятельность клетки в целом.

Помимо явных достижений данный подход обнаружил и свои слабости. В первую очередь здесь» следует сказать о неспособности метода оценивать гетерогенность суспензии митохондрий по яркости1 частиц. Следует сказать, что популяционный анализ выделенных митохондрий является весьма важной и актуальной, задачей в-силу того, что множество косвенных данных указывает на существование функционально* различных фракций митохондрий в суспензии; что существенно затрудняет анализ получаемых результатов [184]. По* своей; сути подход ФКС призван решать задачу о нахождении яркости в смеси частиц. И'действительно, в случае5 красителей и окрашенных белков подобные, задачи были решены [107-108-, 156, 158]. К сожалению, использованные2 в. данных работах подходы» не позволяют измерять »частицы такого большого размера как митохондрии. Примененный нами метод ААП оказался, к сожалению,4 малоэффективным' к обнаружению смесей частиц различной, яркости. Необходима дальнейшая^ работа над * совершенствованием данного подхода для решения-задачи о популяционном анализе митохондрий. Нам представляется, что одним из направлений решения этой задачи является совершенствование техники проведения экспериментов. В частности, планируется- применение специальных ячеек в виде, узких капилляров, которые позволят осуществлять направленный пролет митохондриальных частиц через центр конфокального объема. Можно надеяться, что это приведет к существенному уменьшению разброса наблюдаемых амплитуд пиков флуоресценции от одинаковых по яркости частиц, что позволит достоверно различать наличие частиц различной яркости. Эта сложная задача выходит за рамки данной работы и должна быть решена в ходе другого самостоятельного исследования.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Перевощикова, Ирина Владимировна, Москва

1. Johnson D., Lardy Н. Isolation of liver and kidney mitochondria. Methods Enzymol, 1967, 10: 94-96

2. Ленинджер А. Основы биохимии. M.: Мир, 1985, Т1, с. 36-38

3. Николе Д.Д. Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию. М.: Мир, 1985, с. 13-14

4. Зоров Д.Б., Исаев Н.К., Плотников Е.Ю., Зорова Л.Д., Стельмащук Е.В., Васильева А.К., Архангельская А.А., Хряпенкова Т.К., Митохондрия как многоликий Янус. Обзор. Биохимия, 2007, 72(10): 1371-1384

5. Mitchell P., Moyle J. Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation. Nature, 1967, 213(5072):137-139

6. Linnane A.W., Kios M., Vitetta L. Healthy aging: regulation of the metabolome by cellular redox modulation and prooxidant signaling systems: the essential roles of superoxide anion and» hydrogen peroxide. Biogerontology, 2007, 8(5): 445-467

7. Harman Di Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry. Gerontol, 1956, 11(3): 298-300

8. Bakeeva L.E., Chentsov Yu.S., Skulachev V.P. Intermitochondrial contacts in myocardiocytes J.Mol.Cell.Cardiol., 1983, 15(7):413-420

9. Amchenkova A.A., Bakeeva L.E., Chentsov Yu.S., Skulachev V.P., Zorov D.B. Coupling membranes as energy-transmitting cables. I. Filamentous mitochondria in fibroblasts and mitochondrial clusters in cardiomyocytes. J.Cell Biol., 1988, 107(2):481-495

10. O.Chang D.T., Reynolds I.J. Mitochondrial trafficking and morphology in healthy and injured neurons. Prog.Neurobiol., 2006, 80(5): 241-268

11. Zorov D.B., Krasnikov B.F., Kuzminova A.E., Vysokikh M.Yu., Zorova L.D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Biosci.Rep., 1997, 17(6): 507-520

12. Ленинджер А. Основы биохимии. M.: Мир, 1985, Т2, с. 447-500

13. Watford M. The urea cycle: two-compartment system. Essays.Biochem., 1991, 2: 649-658

14. Pellegrini L., Scorrano L. A cut «short to death: Pari and Opal in the regulation of mitochondrial morphology and apoptosis. Cell Death Differ., 2007, 14(7): 1275-1284

15. Zamzami N., Susin S.A., Marchetti P., Hirsch Т., Gomez-Monterrey I., Castedo M., Kroemer G. Mitochondrial control of nuclear apoptosis. J.Exp.Med., 1996, 183: 1533-1544

16. Liu X., Kim C.N., Yang J., Jemmerson N., Wang X. Introduction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and. cytochrome c. Cell, 1996, 86:147-157

17. Kroemer G., Petit P., Zamzami N., Vayssiere J.L., Mignotte B. The biochemistry of programmed cell death. FASEB J., 1995, 9:1277-1287

18. Bakeeva L.E., Grinius L.L., Jasaitis A.A., Kulene V.V., Levitsky D.O., Liberman E.A., Severina-I.L, Skulachev V.P. Conversion of biomembrane-produced energy into electric form. II. Intact mitochondria. Biochem. Biophys.Acta, 1970, 216(1):13-21

19. Скулачев В.П., Трансформация энергии в биомембранах. М.": Наука, 1972, с.203

20. Liberman Е.А., Topali V.P., Tsofina L.M., Jasaitis A.A., Skulachev V.P. Mechanism of coupling of oxidative phosphorylation and the membrane potential of mitochondria. Nature, 1969. 222:1076-1078

21. Мейсель M.H., Заварзина Н.Б. Флуоресцентно-микроскопические наблюдения над живыми клетками микроорганизмов. I. Дрожжевые и дрожжеподобные микроорганизмы. Микробиология, 1947,Т XVI, 5: 394402

22. Bereiter-Hahn J. Dimethylaminostyrylmethylpyridiniumiodine (DASPMI) as, a fluorescent probe for mitochondria in situ. Biochim.Biophys.Acta, 1976, 423:114

23. Морозова Г.И., Добрецов Г.Е., Дубур Г.Я., Голицин В.М., Баренбойм Г.М., Владимиров Ю.А. Флуоресценция 4-(п-диметиламиностирил)-1-метилпиридиния в животной клетке. Цитология, 1981, Т. 23: 916-923

24. Mewes H.W., Rafael J. The 2-(dimethylaminostyry 1)-1-methylpyridinium cation as indicator of the mitochondrial membrane potential. FEBS Lett., 1981, 131:7-10

25. Rafael J. 2-(dimethylaminostyryl)-l-ethylpyridiniumiodide: a fluorescent probe* of energetic condition in brown adipose tissue mitochondria. Hoppe-Seyler's Z. Physiol.Chem, 1980, 361:437-444

26. Rafael J. Nichols D.G. Mitochondrial' membrane potential monitored» in situ within isolated guinea brown adipocytes by a styryl pyridinium fluorescent indicator. FEBS Lett., 1984, 170:181-185

27. Johnson LV, Walsh ML, Chen LB Localization'of mitochondria* in!living cells with rhodamine 123*. Proc.Natl.Acad.Sci, USA, 1980, 77(»2):990-994

28. Мурванидзе Г.В., Северина И.И., Скулачев В.П. Этилродамин: проникающий катион* и прижизненный F флуоресцентный индикатор мембранного потенциала цианобактерий. ДАН СССР,' 1981', Т.26Г, 5: 1252-1254

29. Matzke М.А., Matzke A.J.M. Visualization-of mitochondria and nuclei in living cells by the use of a potential-sensitive fluorescent dye. Plant.Cell Environ., 1986,9:73-77

30. Septinus M., Seiffert W., Zimmermann H.W. Hydrophobic acridine dyes for fluorescence staining of mitochondria in living cells. 1. Thermodynamic and spectroscopic properties of 10-n-alkylacridine orange chloride. Histochemistry, 1983,79:443-456

31. Erbrich U., Septinus M. Naujok A., Zimmerman H.W. Hydrophobic acridine dyes for fluorescence staining of mitochondria in living cells.2.Comparison ofstaining of living and fixed HeLa-cells with NAO and DPP AO. Histochemistry, 1984, 80:385-388

32. Erbrich U., Naujok A., Petschel K., Zimmermann H.W. The fluorescent staining of mitochondria in living HeLa-and LM-cells with new acridine dyes. Histochemistry, 1982, 74:1-7

33. Erbrich U., Berthold Th., Zimmermann H.W. Effect of acridine dyes on the ultrastructure of mitochondria in HeLa-and LM-cells. Histochemistry, 1982, 76: 211-218

34. Waggoner A.S. Dye indicators of membrane potential. Ann.Rev.Biophys.Bioeng., 1979,f 8:47-68

35. Laris P.S., Bahr D.P., Chaffee R.RiJ. Membrane potentials in mitochondrial preparations as measured by means of cyanine dye. Biochim.Biophys. Acta, 1975, 376:415-425

36. Kinnally K.W., Maloff B.L., Tedeschi H. Use of dyes to estimate the electrical potential of the mitochondrial membrane. Biochemistry, 1978, 17: 3419-3428

37. Bunting J.R., Phan T.Y. Kamali E., Dowben R.M. Fluorescent cationic probes of mitochondria. Metrics andsmechanism of interaction. Biophys J'., 1989, 56: 979-993

38. Tomov T.Ch. Pyronin G as a fluorescent probe for quantitative determination of the membrane potentiaLof mitochondria. J. Biochem. Biophys. Methods, 1986, 13: 29-38

39. Waldmeier P.C., Feldtrauer J., Qian T., Lemasters J.J. Inhibition of the mitochondrial permeability transition by the nonimmuno suppressive cyclosporin derivate NIM811. Mol. Pharmacol., 2002, 62: 22-29

40. Millot J.M., Sharonov., Manfait M. Scanning microspectrofluorometry of rhodamine 123 in multidrug-resistant cells. Cytometry, 1994. 17:50-58

41. Salmeen Ii, Zacmanidis P., Jesion G., Feldkamp A. Motion of mitochondria: in cultered cellsquantificd by analysis.of digitized images. Biophys J. 1985. 48: 681-686

42. Medica-Napolitano J.S., Aprille J.R. Basis for the selective cytotoxicity of rhodamine 123 Cancer Res., 1987,47:4361-4365

43. Ehrenberg B., Montana V., Wei M.D., Wuskell J:P.,. Loew L.M. Membrane potential can be determined in individual cells from the Nernstian distribution of cationic dyes. Biophys J., 1988, 53:785-794 ,

44. Loew L.M., Tuft R.A., Carrington W. Fay F.S. Imaging- in five:dimentions: time-dependent membrane potentials in individual; mitochondrion. Biophys J., 1993, 65:2396-2407

45. Scaduto R.C., Grotyohann L.W. and- Jr. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J., 1999, 76:469-477 J

46. O'Reilly C:M., Fogarty K.E., Drummond R.M., Tult R.A., Walsh J.V.Jr. Quantitative analysis of spontaneous;mitochohdrial^depolarizations. Biophys.J.,2003, 85:3350-3357

47. Siemen D., Loupatatzis C., Borecky J., Gulbins E., Lang F. Ca activated K channel of the BK-type in the inner mitochondrial membrane of a human glioma cell line. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1999, 257:549-554

48. Petit P.X., O'Conner J.E., Grunwald D., Brown S.C. Analysis of the membrane potential of rat and mouse liver mitochondria by flow cytometry and possible applications. Eur. J. Biochem., 1990, 194:389-397

49. Shapiro H.M. Membrane potential estimation by flow cytometry. Methods, 2000,21:271-279

50. Bassoe C-F., Li N., Ragheb K., Lawler G., Sturgis J., Robinson J.P. Investigation of phagosomes, mitochondria, and acidic granules in human neutrophils using fluorescent probes. Cytometry Part B, 2003, 51B:21-29

51. Mathur A., Hong Y., Kemp B.K., Barrientos A.A., Erusalimsky J.D. Evaluation of fluorescent dyes for the detection of mitochondrial membrane potential changes in cultured cardiomyocytes. Cardiovascular Research, 2000, 46:126-138

52. Cossarizza A., Ceccarelli D., Masini A. Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level Exp.Cell.Res., 1996, 222:84-94

53. Medina J.M., Lopez-Mediavilla C., Orfao A. Flow- cytometry of isolated mitochondria during development and under some pathological conditions. FEBS Lett., 2002, 510: 127-132

54. Lecoeur H., Langonne A., Baux L., Rebouillat D., Rustin P., Prevost M-Ch., Brenner C., Edelman L., Jacotot E. Real-time flow cytometry analysis of permeability transition in isolated mitochondria. Exp.Cell Res., 2004, 294: 106117

55. Parsons D.F., Boner W.D., Verboon J.G. Electron microscopy of isolated plant mitochondria and plastids using both the thin-section and negative-staining techniques. Canad. J.Botany, 1965, 43:647-655

56. Schein J.S., Golombini M., FinkelsteinA: Reconstitution'in planar.lipid bilayers of a voltage-dependent anion-selective channel obtained from paramecium mitochondria. J.Membrane Biol., 1976, 30: 99-120

57. Zoratti Ml, Szabo I. The: mitochondrial permeability transitions Biochim.Biophys. Acta, 1995, 1241(2):139-176 ,

58. Biihler Sj. Michels:Jj, WendtiS*. Ruck A,.BrdiczkaiD| WelteïiW/ PrzylylskiM; Mass Spectrometric mapping ■ oê ion; channel' proteins (porins) and? idëntification • of their supramolecular membrane assembly . Proteins, 1998/2:63-73?

59. Beutner. G, Ruck A, Riede Bi, Welte; W, Brdiczka D. Complexes between kinases mitochondriaPporin and- adenylate translocator:in! ratibráin resemble the permeability transition pore. FEB SEett., 1996, 396:189-195

60. Crompton M., Virji S., Wand JIM; Cyclophilin-D binds strongly to complexes of the voltage-dependent anion'channel and the adenine nucleotide translocase to form the.permeability transition pore. Eur.J.Biochem, 1998, 258(2):729-35

61. Vyssokykli MY, Brdiczka D. The function of complexes between the outer mitochondrial membrane pore (VDAC) and the adenine nucleotide translocase in regulation of energy metabolism and apoptosis. Acta Biochim Pol., 2003, 50(2);389-404 '

62. Shimizu S., Shinohara Y., Tsujimoto Y. Bax and Dcl-xL independently regulate apoptotic changes of yeast mitochondria that require VDAC but not adenine nucleotide translocator. Oncogene, 2000, 19(38):4309-4318

63. Pastorino JG, Shulga N, Hoek JB. Mitochondrial binding of hexokinase II inhibits Bax-induced cytochrome c release and apoptosis. J.Biol.Chem., 2002, 277:7610-7618

64. Zorov D.B., Juhaszova M., Yaniv Y., Nuss H.B., Wang S., Sollott S.J. regulation and pharmacology of the mitochondrial permeability transition pore. Cardiovasc.Res., 2009, 83(2): 213-25

65. Azoulay-Zohar H., Israelson A., Abu-Hamad S., Shoshan-Barmatz V. In self-defence: hexokinase promotes voltage-dependent anion channel closure and prevent mitochondria-mediated apoptotic cell death. Biochim J., 2004, 37:347355

66. Mikhailov V, Mikhailova M., Pulkrabek D.J., Dong Z., Venkatachalam M.A., Saikumar P. Bcl-2 prevents Bax oligomerization in the mitochondrial outer membrane J.Biol.Chem., 2001, 276(21):18361-18374

67. Crompton M. The mitochondrial permeability transition pore and its role n cell death.'Biochim J., 1999, 341:233-249

68. Tan W., Colombini M. VDAC closure increases calcium ion flux. Biochim.Biophys.Acta, 2007, 1768(10):2510-2515

69. Baines C P, Kaiser R.A., Sheiko T., Craigen W.J:, Molkentin J.D. Voltage-dependent anion channels are dispensable for mitochondrial-dependent cell death. Nat.Cell.Biol., 2007, 9(5):550-555

70. D. Magde, E. Elson and W. W. Webb Thermodynamic fluctuations in a reacting system measurement by fluorescence correlation spectroscopy. Phys. Rev. Letters, 1972, 29: 705

71. Elson E.L., Magde D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolumers, 1974, 13:1-27

72. Magde D., Elson- E.L., Webb W.W. Fluorescence correlationspectroscopy.ir.An experimental realization. Biopolymers, 1974, 13:29-61

73. Magde Di-, Webb W.W., Elson E.L. Fluorescence correlation spectroscopy.III.Uniform translation and laminar flow. Biopolymers, 1978, 17:361-376

74. Elson E.L., Magde D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolumers, 1974, 13:1-27

75. Ehrenberg M., Rigler R. Fluorescence correlation spectroscopy applied to rotational diffusion of macromolecules Q.Rev.Biphys, 1976, 9(1) 69-81

76. Koppel D.E., Axelrod D., Schlessinger J., Elson E.L., Webb W.W. Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility Biophys J., 1976, 16:1315-1329,

77. Aragon S.R., Pecora R. Fluorescence correlation spectroscopy and Brownian rotational diffusion. Biopolymers, 1975, Y4: 119-139

78. Fahey P.F., Koppel D.E., Barak L.S., Wolf D.E., Elson E.L., Webb W.W. Lateral diffusion in planar lipid bilayers. Scince, 1977, 195(4275) 305-306

79. Webb W.W. Application of fluorescence correlation spectroscopy Q. Rev.Biophys, 1976, 9(l):49-68

80. Rigler R., Mets U., Widengren J., Kask P. Fluorescence correlation spectroscopy with high count rate and low background: analysis of translational diffusion. Eur. Biophys. J., 1993, 22:169-175

81. Eigen M., Rigler R. Sorting single molecules: application to diagnostics and evolutionary biotechnology. ProcNatlAcadSci, USA, 1994, 91(13): 5740-7

82. Rigler R., Pramanik A., Jonasson P., Kratz G., Jansson O.T., Nygren P.-A.,j

83. Stahl S., Ekberg K., Johansson B.-L., Uhlen S., Uhlen M., Jörnvall H., Wahren J. Specific binding of proinsulin C peptide to human cell membranes Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 1999, 96(23): 13318-13323

84. Koppel D! Statistical accuracy in fluorescence correlation spectroscopy Phys.Rev.A., 1974, 10:1935

85. Kask P. Günther R. Axhausen P. Statistical accuracy in fluorescence fluctuation experiments Eur.Biophys.J. Biophys Lett., 1997, 25:163-169

86. Qian H. On the statistics of fluorescence correlation spectroscopy Biophys. Chem., 1990,38:49-57

87. Meseth U., Wohland Т., Rigler R., Vogel H. Resolution of fluorescence correlation spectroscopy Biophys. J., 1999, 76:1619-31

88. Kask P., Palo K., Ullman D., Gall K. Fluorescence intensity distribution analysis and its application in biomolecular detection technology. PNAS, 1999, 96(24): 13756-13761

89. Chen Y., Müller J.D., So P.T.C., Gratton E. The photon counting histogram in fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J., 1999, 77:553-567

90. Chen Y., Müller J.D., Tetin S.Y., Tyner J.D., Gratton E. Probing liand protein binding equilibria with fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophys. J., 2000, 79:1074-1084

91. Denk W., Strickler JH, Webb W.W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science, 1990, 248 (4951): 73-76

92. Ремизов A.H., Максина А.Г., Потапенко А.Я:. Медицинская и биологическая физика. М.:Дрофа, 2003, с. 375-383

93. Enderlein» J., Gregor J., Patra D., Dertinger Т., Kaupp U.B. Performance of fluorescence correlation spectroscopy for measuring diffusion and concentration. ChemPhysChem., 2005, 6(11): 2324-36

94. Rüttinger S., Buschmann V., Krämer* В., Erdman R., Macdonald R., Koberling F. Determination of the confocal volume for quantitative fluorescence correlation spectroscopy. SPIE-OSA, 2007, 6630, 66300D-1

95. Sachl R., Mikhalyov I., Hof M., Johansson L. A comparative study oni * »/ » 1 f,'ganglioside micelles using electronic energy transfer, fluorescence correlation spectroscopy and light scattering techniques. Phys.Chem.Chem.Phys., 2009, 11: 4335-4343

96. Petrasek Z., Schwille P. Precise measurement of diffusion* coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J., 2008, 94: 14371448

97. Gendron P.O., Avaltroni F. Wilkinson K.J. Diffusion coefficients of several rhodamine derivatives as determined by pulsed field gradient-nuclean magnetic resonance and FCS. J. Fluoresc., 2008, 18(6): 1093-1101

98. Miiller J. D., Chen Y, Gratton E. Resolving heterogeneity on* the single molecular level with the photon-counting histogram. Biophys J., 2000, 78: 474486

99. Chen Y., Miiller J. D., Ruan Q.Q., Gratton E. Molecular brightness characterization of EGFP in vivo by fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophys. J., 2002, 82:133-144

100. Clamme J.P., Azoulay J., Mely Y. Monitoring of the formation and dissociation of polyethylenimine/DNA complexes by two photon fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J., 2003. 84: 1960-1968

101. Pramanik A., Thyberg P., Rigler R. Molecular interactions of peptides with phospholipid vesicle membrane as studied by FCS. Chem.Phys.Lipids, 2000, 104(1)35-47

102. Rhoades E., Ramlall T.F., Webb W.W., Eliezer D. Quantification of a-synuclein binding toiipid vesicles using FCS. Biophys J., 2006, 90:4692-4700

103. Schwille P., Korlach J., Webb W.W. FCS with single-molecular sensitivity on cell and model membranes. Cytometry, 1999, 36(3) 176-182

104. Korlach J., Schwille P., Webb W.W., Feigenson G.W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and FCS. Proc.Natl.Acad.Sci., USA. 1999, 96(15)8461-8466

105. Gerard M., Debyser Z., Desender L., Kahle P.J., Baert J., Baekelandt V., Engelborghs Y. The aggregation of alpha-synuclein is stimulated by FK506 binding proteins as shown by FCS. FASEBJ., 2006, 20(3): 524-526

106. Conway K.A., Harper J.D., Lansbury P.T. Accelerated in vitro fibril formation by a mutant alpha-synuclein liked to early-onset Parkinson disease. Nat.Med., 1998,4:1318-1320

107. Kinjo M., Rigler R. Ultrasensitive hybridization analysis using fluorescence correlation spectroscopy. Nucleic.Acids.Research, 1995, 23(10)» 1795-1799

108. Wetmur J.G., DNA probes: applications of the principles of nucleic acid hybridization. Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol., 1991, 26(3-4) 227-259

109. Sevenich F.W., Langawski J., Weiss V., Rippe K. DNA binding and oligomerization of NtrC studied by fluorescence anisotropy and FCS. Nucleic. Acids.Res., 1998, 26(6) 1373-1381

110. Politz J.C., Browne E.S., Wolf D.E. Pederson T. Intranuclear diffusion and hybridization state of oligonucleorides measured by FCS' in living cells. Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1998, 95(11) 6043-6048

111. Saffarian S., Li Y., Elson E.L., Pike L.J. Oligomerization of the EGF receptor investigated by the live cell'fluorescence intensity distributiomanalysis. Biophys J., 2007, 93: 1021-1031

112. Lieto A.M., Cush R.C., Thompson N.L. Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J., 2003, 85:3294-3302 ^

113. Allen N.W., Thompson N.L. Ligand binding by estrogen receptor Beta attached to nanospheres measured by fluorescence correlation spectroscopy. Cytometry Part A, 2006, 69A:524-532

114. Iannone M.A., Consler T.G., Pearce K. H., Stimmel L.B., Parks D.J., Gray J.G. Multiplexed molecular interactions of nuclear receptors using fluorescent microspheres. Cytometry, 2001, 44:326-337

115. Wohland T., Friedrich K., Hovius R., Vogel H. Study of ligand-receptor interections by FCS with different fluorophores evidence that the homopentameric 5-hydroxytryptamine type 3As receptor binds only one ligand. Biochemistry, 1999, 38(27) 8671-8681

116. Tairi A.P., Hovius R., Pick H., Blasey H., Bernard A., Surprenant A., Lundstrom K., Vogel H. Ligand binding to the serotonine 5HT3 receptor studied with a novel fluorescent ligand. Biochemistry, 1998, 37: 15850-15864

117. Oehlenschlanger F., Schwille P., Eigen M\ Detection of HIV-1 RNA by nucleic acid sequence-based amplification* combined with FCS. Proc.NatI.Acad.Sci., USA, 1996, 93(23) 12811-12816

118. Walter N.G., Schwille P., Eigen: M. Fluorescence correlation analysis of probe diffusion simplifies quantitative pathogen detection by PCR. Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1996, 93(23)12805-12810

119. Van Craenenbroeck E., Enqelborghs Y. Quantitative characterization of the binding of fluorescently labeled colchicine to tubulin in vitro using fluorescence correlation spectroscopy. Biochemistiy, 1999, 38(16): 5082-5088

120. Starchev K., Zhang J., Buttle J. Application of FCS-Particle size effect. Journal of colloid and interface science, 1998, 203: 189-196

121. Krichevsky O., Bonnet G. Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications. Rep.Prog.Phys., 2002. 65: 251-297164

122. Haupts U., Maiti S., Schwüle P., Webb W.W. Dynamics of fluorescence fluctuations in green fluorescent protein observed by FCS. Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1998, 95:13573-13578*

123. Dickson R.M., Cubitt A.B., Tsien R.Y., Moerner W.E. On/off blinking and switching behavior of single molecules of green fluorescent protein. Nature, 1997, 388(6640): 355-358

124. Persson G., Thyberg P., Widengren J. Modulated fluorescence correlation* spectroscopy with complete time range information. Biophys J., 2008, 94: 977985

125. Bonnet G., Krichevsky O., Libchaber A. Kinetics of conformational fluctuations in DNA hairpin-loops. Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1998; 95: 86028606

126. Magzoub M. Padmawar P., Dir J.A., Verkman A.S. Millisecond association kinetics of K+ with triazacryptand-based K+ indicator measured by FCS. J.Phys.Chem.B., 2006, 110(42):21216-2121

127. Gösclr M. Blom H., Holm J., Heino T., Rigler R. Hydrodynamic flow profiling in microchannel structures by single molecule fluorescence correlation spectroscopy. Anal.Chem., 2000, 72:3260-3265

128. Dittrich P.S. Schwille P. Special two-photon fluorescence cross-correlation spectroscopy for controlling molecular transport in microfluidic structures. Anal.Chem., 2002, 74: 4472-4479

129. Brister P.C., Kuricheti K. K.,Buschmann V., Weston K.D. FCS for flow rate imaging and monitoring-optimization, limitations and artifacts. Lab Chip, 2005, 5:785-791

130. Kuricheti K.K., Buschmann V., Weston K.D: Application of FCS for velocity imaging in microfluidic devisee. Appl.Spectrosc., 2004, 58(10): 11801186

131. Brinkmeier M., Dörre K., Stephan J., Eigen M. Two beam cross-correlation: a i method to characterize transport phenomena in micrometer-sized stuctures. Anal.Chem., 1999, 71: 609-616

132. Pan X., Shi X., Korzh V., Yu H., Wohland T. Line scan FCS for three-dimensional microfluidic flow velocity measurement. J.Biomed.Opt., 2009, 14(2): 024049

133. Pan X., Yu II., Shi X., Korzh V., Wohland T. Characterization of flow direction* in microchannels and zebrafish, blood vessels by scanning FCS. J.Biomed.Opt., 2007, 12(1):014034

134. Malone M.H., Sciaky N., Stalheim L., Hahn K.M., Linney E., Johnson G.L. Laser scanning velocimetry: a confocal microscopy method for quantitative measurement of cardiovascular performance in zebrafish embryos and larvae. BMS Biothechnol, 2007, 7:40

135. Okagbare P.I., Soper S.A. High throughput single molecule detection for monitoring biochemical reactions. Analyst, 2009, 134(1):97-106

136. SantaLucia J. Jr. A unified view of polymer, dumbbell and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1998, 95:1460-5

137. Edel J.B., de Mello A.J. Single particle confocal fluorescence spectroscopy in microchannels: dependence of burst width and burst area distribution on particle size and flow rate. Analytical Science, 2003, 19: 1065-1069

138. Park H:Y., Qie X., Rhoades E., Korlach J., Kwok L.W., Zipfel W.R., Webb W.W., Pollach L. Achieving uniform mixing in a microfluidic device: hydroydamic focusing prior to mixing. Anal.Chem., 2006, 78: 4465-4473

139. Qian H., Elson E.L. On the analysis of high order moment6 of fluorescence fluctuations. Biophys.J., 1990, 57: 375-380

140. Eid J.S., Mliller J.D., Gratton E. Data acquisition card for fluctuation correlation spectroscopy. Rev.Sci.Instrum., 2000, 71(2): 361-368

141. Qian H., Elson E.L. Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments. PNAS, 1990, 87: 5479-5483

142. Kask P., Palo K., Ullmann D., Gall K. Fluorescence-intensity distribution analysis and its application in biomolecular detection technology. Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1999, 96(24): 13756-13761

143. Kask P., Palo K., Fay N., Brand L., Mets U., Ullmann D., Jungmann J., Pschorr J., Gall K. Two-dimensional fluorescence intensity distribution analysis: theory and applications. BiophysJ., 2000, 78(4): 1703-1713

144. Chen Y., Wei L-N., Miiller J.D. Probing protein oligoinerization in living cells with fluorescence fluctuating spectroscopy. PNAS, 2003, 100(2): 1549215497

145. Egea P.F., Rochel N., Birch C., Vachette P., Timmins P.A., Moras D. Effect of ligand, binding on the association properties and conformation in solution of retinoic acid receptor RXR and RAR. J.Mol.Biol., 2001, 307:557-576

146. Huang B., PeiTOud T.D., Zare R.Nt Photon counting histogram: one photon excitation. Chem.Phys.Chem., 2004, 5: 1523-1531

147. Van Craenenbroeck E., Matthys G., Beirlant J., Engelborghs Y. A statistical analysis of fluorescence correlation data. Journal of Fluorescence, 1999, 9(4): 325-331

148. Van Rompaey E., Sanders N., De Smedt S.C., Demeester J., Craenenbroeck E., Engelborghs Y. Complex formation between cationic polymethacrylates and oligonucleotides. Micromolecules, 2000, 33: 8280-8288

149. Van Rompaey E., Engelborghs Y., Sanders N., De Smedt S.C., Demeester J. Interactions between oligonucleotides and cationic polymers investigated by FCS. Pharmaceutical research, 2001, 18(7): 928-936

150. Kendall D.A., MacDonald R.C. A fluorescence assay to monitor vesicle fusion and lysis. J.Biol.Chem., 1982, 257(23): 13892-13 895

151. Park S.C., KimJiY, ShimS:©;, JeongG.Y,, Kim,M.N., Shin S.Y., Gheong-. G.W., Park Y., Hahm K.S. Investigation^of toroidal pore and oligomerization by melittin using transmission . • electron microscopy. Biochem.Biophys.Res.Commun., 2006, 343:222-228

152. Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T., Mallia A.K., Gartner F.H., Provenzano M.D., Fujimoto E.K., Goeke N.M., Olson B.J., Klenk D.C. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 1985 150: 76-85

153. Hofmann G. ISCOtables: a handbook of data for biological and physicalhscientists. Lincoln, Nebraska, Instrumentation Specialties Company 7 ed, 1977

154. Schwerzman K., Cruz-Orive L.M., Eggman R., Sanger A., Weibel E.R. Molecular architecture of the inner membrane of mitochondria from rat liver: a combined biochemical and stereological study. J.Cell Biol., 1986, 102:97-103

155. Skulachev V.P. Transmembrane electrochemical H+-potential as a convertible energy source for the living cell. FEBS Lett., 1977, 74:1-9

156. Azzone G.F., Bragadin M., Pozzan T., Antone P.D. Proton electrochemical potential in steady state rat liver mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1977, 459:96-109

157. Chen R.F., Knutson J'. Mechanism of fluorescence quenching of carboxyfluorescein in liposomes: energy transfer to nonfluorescent dimmers. Analytical biochemistry, 1988, 172:61-77

158. Hess S.T., Webb W.W. Focal volume optics and experimental artifacts in confocal fluorescence correlation spectroscopy. Biophys.J., 2002, 83:23002317

159. Gear A.R., Bednarek J.M. Direct counting and sizing- of mitochondria in solution. J. Cell Biol., 1972, 54:325-345

160. J.Duszynski, L.Wojtczak, The apparent non-linearity of the relationship between the rate of respiration and the protonmotive force of mitochondria can be explained by heterogeneity of mitochondrial preparations, FEBS Lett., 1985, 182: 243-248.

161. Halestrap A.P., Quinlan P.T. The intramitochondrial volume measured using sucrose as an extramitochondrial marker overestimates the true matrix volume determined with mannitol. Biochem. J., 1983, 214: 387-393

162. Геннис Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. М. Мир, 1997, с. 105

163. Schonfeld P., Schild L., Kunz W. Long-chain fatty acids act as protonophoric uncouplers of oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1989, 977:266-272

164. Smith JC, Chance B. Kinetics of the potential-aenaitive extrinsic probe oxonol VI in beef heart submitochondrial particle. J. Membr. Biol., 1979, 46:255-82

165. Рубин А.Б. Биофизика. Биофизика клеточных процессов. Т.2 Наука, М., 2004, с. 9.1. Список публикаций.

166. Перевощикова И.В., Сорочкина А.И., Зоров Д.Б., Антоненко Ю.Н. Сафранин О как флуоресцентный индикатор мембранного потенциала митохондрий: исследование на уровне суспензии и уровне отдельных митохондрий, Биохимия, 74 (6), 663-671, 2009

167. Пашковская А.А., Перевощикова И.В., Майзлиш В.Е., Шапошников Г.П., Котова Е.А., Антоненко Ю.Н. Взаимодействие тетразамещенного катионного фталоцианина алюминия с искусственными и природными мембранами. Биохимия, 74 (9), 1252-1259, 2009

168. Perevoshchikova I.V., Zorov D.B, Antonenko Y.N. Brightness analysis of isolated mitochondria doped with TMRE and Mitotracker. Abstracts of the 6th EBSA European Biophysics Congress, London (U.K.), Eur. Biophys. J., 36, S22, 2007.

169. Perevoshchikova I.V., Zorov D.B., Antonenko Y.N. Fluorescently-labeled ATP as a probe of the outer mitochondrial membrane barrier: role of VDAC. Abstracts of the 7th European Biophysics Congress, Genova (Italy), Eur. Biophys. J., 38, 201,2009.

Информация о работе

Перевощикова, Ирина Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.02

Диссертация

Исследование митохондрий на уровне одиночных частиц методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы