Исследование микробных сообществ в районах естественных выходов нефти на озере Байкал

Ломакина, Анна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование микробных сообществ в районах естественных выходов нефти на озере Байкал
ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Исследование микробных сообществ в районах естественных выходов нефти на озере Байкал"

На правах рукописи

ЛОМАКИНА Анна Владимировна

ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ В РАЙОНАХ ЕСТЕСТВЕННЫХ ВЫХОДОВ НЕФТИ НА ОЗЕРЕ БАЙКАЛ

03.00.16 - экология 03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003493282

Улан-Удэ, 2010

003493282

Работа выполнена в лаборатории водной микробиологии Лимнологического института СО РАН г. Иркутска

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, в.н.с. Земская Тамара Ивановна

доктор биологических наук,

профессор Намсараев Баир Бадмабазарович

кандидат биологических наук Андреева Ирина Сергеевна

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь

Защита состоится «25» марта 2010 г. в 15® часов на заседании Диссертационного совета Д 212.022.03 при Бурятском государственном университете по адресу: 670000, г. Улан-Удэ, ул. Смолина, 24а, биолого-географический факультет, конференц-зал. Факс: (3012)21-05-88, e-mail: d21202203@mail.ru, lomakina@lin.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Бурятского государственного университета по адресу: 670000, г. Улан-Удэ, ул. Смолина, 24а.

Автореферат разослан «20» февраля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Н. А. Шорноева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Известно, что решающую роль в трансформации нефти до простых соединений выполняют микроорганизмы (Квасников, Клюшникова, 1981; Барышникова и др., 2001; Назина и др., 2002; Head et al., 2006; Muyzer et al., 2008). Углеводородокисляющие микроорганизмы (УВОМ) широко распространены в природе, их пищевые потребности разнообразны, среди них нет узкоспециализированных форм (Шлегель, 1987). В настоящее время известно, что, по крайней мере, 79 родов бактерий, 9 родов цианобактерий, 103 рода грибов и 14 родов водорослей способны использовать нефть и ее производные в качестве единственного источника углерода и энергии (Head et al., 2006).

На озере Байкал различными методами идентифицированы грязевые вулканы, метановые и нефтяные сипы (Кузьмин и др., 1998; Клерке и др., 2003; Конторович и др., 2007; Хлыстов и др., 2007). По оценкам А. Э. Конторовича с соавторами (2007), ежегодно из донных осадков районов естественных нефтепроявлений в воду озера Байкал поступает от 2 до 4 т. нефти. Несмотря на то, что нефть поступает на поверхность воды непрерывно, нефтяное пятно не увеличивается, что свидетельствует о ее биодеградации (Конторович и др., 2007; Хлыстов и др., 2007а). Районы нефтепроявлений на Байкале известны с XVIII века, тем не менее, исследования естественного микробного сообщества озера проводились лишь эпизодически (Талиев и др., 1985; Гоман и др., 1986; Петрова, Мамонтова, 1986; Павлова и др., 2008).

В связи с этим весьма актуально изучение распространения и определение численности УВОМ в комплексе с другими группами бактерий, а также исследование видового разнообразия микробного сообщества в разных по времени источниках формирования нефти и наличия ферментативных систем, обеспечивающих деградацию н-алканов в ультрапресном озере.

Цель работы: исследовать пространственно-временную и молекулярно-генетическую структуру микробных сообществ в двух районах естественных нефтепроявлений на озере Байкал и оценить их способность к биодеградации н-алканов нефти.

Задачи:

1. Исследовать численность и распределение УВОМ способных использовать в качестве единственного источника углерода нефть и н-алканы в районах естественных выходов нефти на озере Байкал.

2. Изучить молекулярно-генетическое разнообразие культивируемых аэробных микроорганизмов, выделенных из воды и донных осадков и суммарного микробного сообщества в двух районах естественных нефтепроявлений на озере Байкал с использованием анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК.

3. Оценить способность природного микробного сообщества и чистых культур байкальских микроорганизмов, изолированных из воды м. Горевой Утес деградировать н-алканы нефти в условиях лабораторного моделирования.

4. Исследовать у чистых культур аэробных бактерий наличие alk генов, обеспечивающих биодеградацию углеводородов с определенной длиной цепи.

Научная новизна. Впервые исследована численность микроорганизмов, способных деградировать нефть и н-алканы в районах естественных выходов нефти на озере Байкал. Установлено, что как в водной толще, так и в донных осадках по численности среди культивируемых микроорганизмов доминируют УВОМ. Их распределение определяется концентрацией углеводородов в воде и донных осадках.

Впервые в районах естественных нефтепроявлений на озере Байкал исследована генетическая структура природного микробного сообщества, Среди культивируемых бактерий выявлены представители следующих родов: Pseudomonas, Bacillus, Brevibacillus, Paenibacillus, Micromonospora, Acinetobacter, Rhodococcus, Sphingomonas, Mycobacterium, Bosea, Micrococcus, Microbacterium, Aeromonas, Kocuria, Enterobacter, Arthrobacter, Novosphingobium, Melhylobacterium, Curtobacterium, Acidovorax, Acinetobacter. В суммарном природном сообществе обнаружены представители филумов: Chlorobi, Chloroflexi, Acidobacteria, Nitrosirae, Bacteroides, Aclinobacteria, Proteobacteria, Firmicutes, Verrucomicrobia, Planctomycetes. У культивируемых штаммов УВОМ детектированы различные alk гены, ответственные за деградацию широкого спектра алканов.

Практическая значимость. Полученные данные показали увеличение численности УВОМ в нефтяных пятнах в зонах разгрузок углеводородов. Пятилетний мониторинг за состоянием этих районов свидетельствует о высокой самоочистительной способности экосистемы озера Байкал при существующих объемах разгрузок углеводородов. В лабораторных условиях подтверждена способность чистых культур и природного микробного сообщества окислять н-алканы нефти. Сформирована коллекция УВОМ, выделенных из двух районов нефтепроявлений, которая может быть использована в процессах биоремедиации. Данные по исследованию alk генов у культивируемых штаммов, могут быть использованы для понимания механизмов окисления нефти и ее производных в природных экосистемах, а также при создании биотехнологических препаратов.

Положения, выносимые на защиту:

1. В районах естественных нефтепроявлений на озере Байкал обитает динамичное микробное сообщество, способное использовать углеводороды нефти в качестве единственного источника углерода и энергии. Состав культивируемого микробного сообщества в давно известном районе нефтепроявления отличается большим генетическим разнообразием в сравнении с новым районом, где разгружается свежая и не биодеградированная нефть.

2. УВОМ, выделенные из районов естественных нефтепроявлений, имеют различный набор alk генов, ответственных за деградацию широкого спектра алканов. Способностью к окислению н-алканов нефти обладают как отдельные штаммы УВОМ, так и природное микробное сообщество.

водохранилищ» (Иркутск - п. Листвянка, 2007); международном симпозиуме «Контроль и реабилитация окружающей среды: КРОС - 2008» (Томск, 2008); Научно-практическом семинаре молодых ученых и специалистов, приуроченном к проведению технологической экспедиции ООО 'ВНИИГАЗ' 'Байкальские гидраты' (Иркутск - п. Листвянка, 2008); XIX Goldschmidt конференции (Давос, Швейцария, 2009); X съезде Гидробиологического общества при РАН (Владивосток, 2009), XVIII Международной школе морской геологии «Геология морей и океанов» (Москва. 2009). По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 2 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзорного анализа литературы, трех глав, изложенных на основании собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы (174 источников, из них 93 - зарубежных). Объем работы составляет iSl страниц машинописного текста, включающего 8 таблиц, 42 рисунка и 5 приложений.

Автор выражает благодарность и искреннюю признательность научному руководителю д.б.н. Земской Т. И., за постановку задач и помощь в проводимых исследованиях, а также к.б.н. Павловой О. Н., к.б.н. Шубенковой О. В., к.б.н. Черницыной С. М., к.х.н. Горшкову А. Г., Иванову В. Г., к.б.н. Морозову И. В., Хлыстову О. М., пилотам ГОА «Мир» за отбор проб воды и донных осадков, Фонду содействия сохранению озера Байкал и всем сотрудникам лаборатории водной микробиологии за оказанную помощь при выполнении работ.

Работа выполнена при финансовой поддержке Интеграционных проектов СО РАН № 27, 58, программ Президиума РАН 18.10, 17.9, гранта РФФИ 08-05-00709-а.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА 1. Обзор литературы

Приведены литературные данные по истории изучения естественных нефтепроявлений на озере Байкал, где рассмотрен химический состав нефти и дана характеристика районов естественных нефтепроявлений. Представлены результаты исследования разнообразия УВОМ в воде и донных осадках различных экосистем мира. Рассмотрены механизмы окисления углеводородов нефти микроорганизмами и наличие определенных ферментативных систем, обеспечивающих деградацию нефти.

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования

За период исследования с 2004 по 2008 гг. было отобрано и проанализировано более 1500 проб воды и донных отложений в двух районах естественных нефтепроявлений на озере Байкал-в районе устья р. Большая Зеленовская и м. Горевой Утес.

Водные образцы отбирали с водной поверхности, покрытой нефтяной пленкой и свободной от нее, а также с глубины 25, 50, 100, 150, 500 м и

придонного слоя системой батометров Rosetta по стандартной методике (Романенко, Кузнецов, 1974). Отбор осадков осуществляли с помощью гравитационной трубы (GC) с пластиковым вкладышем, бентосной трубкой (ВС) и дночерпателем «Океан» (Gr). Осадок из срединной части керна отбирали асептически и помещали в стерильные пакеты в жидкий азот до проведения молекулярных анализов в лаборатории. Часть пробы донных осадков использовали для учета численности и изолирования чистых культур УВОМ непосредственно в лаборатории на судне.

В 2008 г. кроме стандартных пробоотборников для получения образцов были использованы глубоководные обитаемые аппараты «Мир-1» и «Мир-2». Для молекулярных и микробиологических исследований в ходе погружений были отобраны образцы воды и донных осадков непосредственно в местах разгрузки нефти и газа, а также битумные постройки и нефть.

Микробиологические методы исследования. Для исследования численности УВОМ использовали минеральную среду (Raymond, 1961), где в качестве единственного источника углерода добавляли нефть или алканы С10Н22, С,2Н2б, С16Н34, 1 мл которых растирали по поверхности агаризованной среды. Учет органотрофных микроорганизмов проводили на рыбо-пептоном агаре, разбавленном в 10 раз (Горбенко, Дзюбан, 1992). Для определения численности микроорганизмов в донных осадках готовили суспензию, перемешивая 1 г донных отложений в 100 мл стерильной дистиллированной воды в течение 30 мин в колбах объемом 200 мл. Затем 1 мл исследуемой суспензии заливали охлажденной средой Раймонд.

В 2008 г. в донных осадках естественного нефтепроявления м. Горевой Утес исследовано распределение анаэробных УВОМ. Для учета численности анаэробных УВОМ в донных осадках фильтровали 20 мл дистиллированной воды с 1 г осадка, который пропускали через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Затем фильтр помещали на минеральную среду и инкубировали при 22°С в бескислородных условиях, используя пакеты (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd, HiAnaeroGas Pack).

Родовой состав чистых культур аэробных УВОМ устанавливали на основании их морфологических признаков (определитель Берджи, 1997). Из водной толщи и донных осадков двух районов естественных нефтепроявлений на озере Байкал было выделено 218 штаммов, у которых были исследованы следующие характеристики: размер и форма клеток, окраска по Граму, наличие спор, мицелия в соответствии с методиками (Родина, 1965; Романенко, Кузнецов, 1974). Из них для молекулярно-биологических исследований было отобрано 69 штаммов, различающихся по вышеуказанным признакам с целью выявления большего микробного разнообразия.

В районе м. Горевой Утес суммарная ДНК была выделена из 2 слоев осадка, насыщенных нефтью: из поверхностного окисленного слоя (0-5см) и из восстановленного слоя (180-190 см). Для молекулярного анализа использовали универсальные эубактериальные и архейные праймеры. Из этих образцов ДНК было получено 178 клонов, для 87 из них определены нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16S рРНК длиной от 850 до 1300 п.н.

В районе устья р. Б. Зеленовская была выделена суммарная ДНК также из 2 слоев осадка, насыщенных нефтью: из поверхностного окисленного слоя (0-3 см), и из восстановленного слоя осадка (40 см). С использованием универсальных эубактериальных праймеров было получено 215 клонов, для 66 из них определены нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16S рРНК длиной от 850 до 1300 п.н.

Выделение суммарной бактериальной ДНК и ДНК из чистых культур проводили по методу Рошель (Rochelle, 1992) с добавлением ТЕ-буфера и поливинилпирролидона (PVPP). Для синтеза фрагментов гена 16S рРНК использовали универсальные эубактериальные и архейные праймеры, а также 3 группы праймеров на alk гены. Полученные фрагменты гена 16S рРНК суммарной ДНК длиной от 850 до 1300 п.н. были клонированы в плазмидный вектор pGEM-T ("Promega"). Лигирование и трансформацию проводили согласно предложенной методике фирмы производителя. Идентификацию полученных фрагментов гена 16S рРНК чистых культур и природного микробного сообщества и alk генов чистых культур осуществляли с использованием поисковой программы BLAST сервера NCBI, включающая GenBank, EMBL и DDBJ базы данных (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) (Altschul et al., 1997). Редактирование последовательностей проводили с помощью редактора BioEdit. Выравнивание последовательностей проводили с помощью программы CLUSTALW. Филогенетический анализ проводили с использованием программы MEGA версия 4.0, Neighbor-Joining кластерного метода и Kimura two-parameters алгоритма. Показатель достоверности порядка ветвления (в %) определяли на основании «bootstrap»-an&mm 100 альтернативных деревьев.

Полученные в работе нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК были депонированы в GenBank под следующими номерами: EU443820-EU443829, EU449113-EU449122, EU487604-EU487613, EU496540-EU496554, EU521681-EU521688, EU5 81636-EU581637, FJ534524-FJ534533, FJ555263-555281, GU911365-GU911458.

Химические методы исследования. Деградация нефти чистыми культурами УВОМ. В эксперименте использовались суточные культуры УВОМ, выращенные на среде РПА. Бактериальные клетки суспендировали в пробирке со стерильной водой, затем 1 мл взвеси помещали в стерильные флаконы объемом 250 мл со 100 мл стерильной байкальской воды и добавляли 50 мкл стерильной нефти (месторождение Югринское, Западная Сибирь).

Деградация нефти природным микробным сообществом. В эксперименте использовали байкальскую воду, отобранную в зоне нефтяного пятна, за его пределами у м. Горевой Утес. В качестве контроля использовали поверхностную воду, отобранную в районе Баргузинского залива. В экспериментальные колбы объемом 250 мл добавляли стерильную нефть в концентрации 25, 50, 100 и 125 мкл (месторождение Югринское, Западная Сибирь) к 100 мл байкальской воды (3 колбы для каждой концентрации нефти и каждой зоны). В качестве контроля использовали смесь стерильной байкальской воды и нефти с соответствующими концентрациями. Опыты проводили при 4°С.

Прирост биомассы в экспериментальной среде оценивали с помощью изменения оптической плотности на приборе фотоколориметре КФК-2-УХЛ42 при длине волны 490 нм через определенные промежутки времени (0,5,15,30, 36 сутки).

Определение содержания н-алканов в культуральной среде проводили по методике предложенной в статье О. Н. Павловой с соавторами (2008). Измерение содержания н-алканов в культуральной среде проводили на 0, 5, 15, 36 сутки. Массу н-алканов в эксперименте после культивирования штамма в течение фиксированного интервала времени рассчитывали как среднее значение для трех параллельных опытов.

Статистическая обработка данных была проведена по стандартным методикам (Рождественский и др., 1974), с использованием программного обеспечения Microsoft Excel для Windows 2003. Для полученных данных рассчитывали среднее значение.

ГЛАВА 3. Численность культивируемых УВОМ в водной толще и донных осадках двух районов естественных нефтепроявлений

Исследовано пространственное распределение культивируемых УВОМ, выращенных на 4 различных источниках углеводородов (нефть, декан, додекан и гексадекан) и органотрофных микроорганизмов.

В давно известном районе выхода нефти у устья р. Б. Зеленовская численность УВОМ в поверхностном слое водной толщи с 2004 по 2007 гг. колебалась от 20 до 2600 кл/мл. Наиболее высокие значения численности всех исследуемых микроорганизмов отмечены в зонах нефтяных пятен. Подобная закономерность развития УВОМ характерна и для придонного слоя водной толщи, где количество УВОМ варьировало от 77 до 690 кл/мл.

Наибольшая численность УВОМ и органотрофов в водной толще этого района была зафиксирована в 2004 г., далее с 2005 г. по 2007 г. наблюдалось снижение численности всех исследуемых групп микроорганизмов. Сл едует отметить, что на фоновой станции в 2005 г. микроорганизмы, деградирующие нефть не были обнаружены, а в другие годы исследования составляли несколько кл/мл.

Исследование распределения УВОМ и органотрофов в водной толще устья р. Б. Зеленовская показало увеличение численности этих микроорганизмов в трофогенном слое, на глубине 25-50 м (рис. 1), где, как известно, отмечается наиболее высокая плотность и биомасса фитопланктона (Поповская, Белых, 2003). Это согласуется с данными T. V. Ramachandra с соавторами (2009), которые считают, что диатомовые водоросли являются главными составляющими в образовании некоторых н-акланов нефти.

Среди УВОМ в поверхностных слоях воды у устья р. Б. Зеленовская в 2004 и

2005 гг. доминировали нефтеокисляющие микроорганизмы (до 2600 кл/мл), в

2006 г. и 2007 г. - также эти бактерии (205 кл/мл) и микроорганизмы, окисляющие декан (280 кл/мл).

Подобная закономерность развития УВОМ и органотрофов характерна и для донных осадков данного района. Также наибольшая численность УВОМ была отмечена в поверхностных слоях донных отложений (60 х 102 кл/г в 2005 г. и 300 х 102 кл/г в 2007 г.). С глубиной керна численность микроорганизмов уменьшалась, и на горизонте 10-12 см она составляла 6-10 х 102 кл/г. Интересно отметить, что минимальные значения численности УВОМ и органотрофов были зафиксированы в 2005 г., что, скорее всего, обусловлено удаленностью исследованных кернов от зоны разгрузки нефти (рис. 2).

В поверхностных слоях донных осадков у устья р. Б. Зеленовская доминировали микроорганизмы, окисляющие дексадекан в 2004 г. (470 х 102 кл/г) и в 2005 г. (63 х 102 кл/г). В 2006 г. и 2007 г. - окисляющие нефть (205 х 102 кл/г) и до декан (330 х 102 кл/г), соответственно.

Численность микроорганизмов, кл/гхЮО 0 100 200 300 400

нефть

с-!.:

нв-органогрофы ¡

Численность микроорганизмов, кл/мл О 200 400 600 800 1000

Рис. 1. Распределение Рис. 2. Распределение

микроорганизмов в водной толще устья р. микроорганизмов в донных осадках устья р.

Б. Зеленовская в 2005 г. Б. Зеленовская в 2005 г.

В новом районе разгрузки нефти у м. Горевой Утес максимальные значения численности микроорганизмов также отмечены в нефтяных пятнах в поверхностных и в придонных слоях воды. Микробиологические исследования распределения УВОМ и органотрофов в этом районе показали, что численность колебалась в поверхностных слоях воды от 200 кл/мл (в 2005 г.) до 1500 кл/мл (в 2007 г.), в придонных - от 50 до 500 кл/мл (в 2007 г.). Вне зоны нефтяных пятен в этом же районе численность УВОМ была, как правило, минимальной (от 1 до 35 кл/мл) и сопоставимой с фоновыми районами, особенно в первые два года наблюдения (2005-2006 гг.). Следует отметить, что с 2005 по 2007 гг. в зоне нефтяных пятен этого района отмечалось повышение численности микроорганизмов, использующих нефть и н-алканы в качестве единственного источника углерода и энергии (от 200 до 1500 кл/мл), что вероятно, связано с

интенсивностью разгрузки нефти и ее производных и большими глубинами в этом районе (до 960 м). Кроме того, большое значение имеет точность отбора образцов. Так в 2008 г. у м. Горевой Утес придонные пробы воды были отобраны прицельно, с использованием ГОА «Мир». Результаты проведенных исследований были сопоставлены с данными, полученными обычными пробоотборниками.

2500 т

5 2000 -

га 1500 -

а о о п.

2 Л

1000

500 ■

Вода, отобранная над битумной постройкой

шею

ОС12

□ С16

Ш нефть

□ органотрофы

Рис. 3. Распределение микроорганизмов в придонном слое воды (860 м.), отобранных с помощью ГОА «Мир-1» (Горевой Утес, 10.08.08). 2-4-вода, отобранная над битумной постройкой; 1, 5-вода, отобранная вблизи битумной постройки

Наиболее высокие значения численности УВОМ (2152 кл/мл) отмечены в пробах, отобранных над битумными постройками, через которые разгружается нефть (рис. 3), причем среди исследуемых микроорганизмов доминировали нефтеокисляющие бактерии. Численность нефтеокисляющих микроорганизмов в придонных пробах воды, отобранных с помощью батометров, составила 500 кл/мл в 2007 г. и 8 кл/мл в 2008 г. Таким образом, полученные данные по содержанию УВОМ в придонной области с помощью «слэп-ганов» сопоставимы с численностью УВОМ в нефтяных пятнах на водной поверхности в этом районе (1560 кл/мл).

Среди УВОМ в 2005 и 2006 гг. в поверхностном слое воды доминировали микроорганизмы, окисляющие додекан (240 кл/мл) и нефть (315 кл/мл), в 2007 г. -использующие декан (1560 кл/мл).

В районе у м. Горевой Утес максимальные значения численности УВОМ отмечены в поверхностных слоях осадков. В 2005 г. их количество составило 4 х 102 кл/г, в 2006 - 90-100 х 102 кл/г, в 2007 - 224 х 102 кл/г. Численность микроорганизмов, окисляющих нефть и н-алканы, в 2008 г. осталось на уровне 2005-2.007 гг. В битумных постройках, отобранных с помощью ГОА «Мир»

численность УВОМ была на порядок выше и достигала 1400 х 102 кл/г. Следует отметить, что в некоторых исследованных кернах из этого района были обнаружены гидраты метана (ГГ), покрытые нефтью. В слоях осадка вмещающих ГГ, численность УВОМ превышала численность органотрофов в четыре раза (рис. 3:| Аналогичное распределение было отмечено и для других кернов, обильно насыщенных метаном и нефтью. Подобное распределение нефтеокисляющих микроорганизмов по вертикали можно объяснить достаточным количеством поступающей свежей нефти, служащей источником углерода и энергии.

Численность микроорганизмов, кл/г х 100

0 20 40 60 80

Рис. 3 .fРаспределение аэробных микроорганизмов в донных осадках м. Горевой Утес в

2008 г (Stl GC-7)

В 2008 г. была исследована численность анаэробных микроорганизмов, окисляющих нефть у м. Горевой Утес. Ее значения колебались от 400 кл/г в поверхностных слоях донных отложений до 30 кл/г в глубинных. Более низкие значения анаэробных микроорганизмов, способных деградировать нефть и ее производные, скорее всего, обусловлено тем, что была использована одна синтетическая среда, которая, не позволила выявить весь спектр анаэробных микроорганизмов. Кроме того, для фильтрации был использован фильтр с достаточно большим диаметром пор.

В поверхностных слоях донных осадков м. Горевой Утес в 2005 г и 2006 среди УВОМ доминировали микроорганизмы, окисляющие н-алканы (декан и додекан); их численность варьировалась от 440 до 467 х 102 кл/г, в 2007, 2008 гг. -окисляющие нефть (600-80 х 102 кл/г).

Исследования, проведенные нами в районах естественных.выходов нефти на озере Байкал, свидетельствуют о более высоких концентрациях УВОМ в зонах, содержащих углеводороды. Как правило, это поверхностные и придонные слои водной толщи, а также поверхностные слои донных отложений и слои, вмещающие ГГ. Можно отметить некоторое уменьшение численности УВОМ в

давно известном районе нефтепроявлений у устья р. Б. Зеленовская и увеличение численности УВОМ в новом районе нефтепроявления у м. Горевой Утес с 2005 по 2007 гг. О более стабильной ситуации в районе у устья р. Большая Зеленовская свидетельствует соотношение УВОМ и органотрофов, во все года наблюдений в этом районе оно было равно 2. В районе м. Горевой Утес это значение варьировало значительно от 14.6 до 24. В этом районе среди культивируемых микроорганизмов большая часть была способна деградировать нефть и ее производные, что свидетельствует о высокой потенциальной возможности к самоочищению данного района.

ГЛАВА. 4. Молекулнрно-генетнческан идентификация углеводородокисляющих микроорганизмов в районах нефтепроявлений

4.1. Филогенетическое разнообразие культивируемых УВОМ по данным анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК

По данным анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК чистые культуры УВОМ, выделенные из водной толщи двух районов естественных нефтепроявлений, принадлежат к разнообразным филогенетическим группам. В районе нефтепроявлений у устья р. Б. Зеленовская выявлены культивируемые представители a-, ß-, 7-Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes. В районе естественного нефтепроявления у м. Горевой Утес кроме этих филогенетических групп получена одна последовательность (штамм 6), имеющая неопределенное положение, поскольку ближайшим гомологом является некультивируемая бактерия, филогенетическое положение которой остается неясным. Среди исследованных штаммов из этого района не обнаружены представители класса ß-Proteobacteria. В донных осадках двух районов естественных нефтепроявлений на озере Байкал по нуклеотидным последовательностям фрагментов гена 16S рРНК выявлены представители филума Firmicutes, класса y-Proteobacteria, а у м. Горевой Утес кроме этих филогенетических групп обнаружены представители филума Actinobacteria. Пятьдесят пять нуклеотидных последовательностей байкальских культивируемых бактерий имеют 98-99% сходства с ближайшими родственниками из международного банка данных, 14-менее 97% (рис. 4, 5).

Наиболее широко среди исследуемых бактерий представлен филум Actinobacteria. Представители pp. Micromonospora, Mycobacterium, Rhodococcus, принадлежащие к этому филуму, выявлены в районе м. Горевого Утеса. Нуклеотидная последовательность штамма 18 имеет наибольший процент сходства с Mycobacterium sp. (99%), но, несмотря на высокий процент сходства на филогенетическом дереве данный штамм образует отдельную ветвь (рис. 4). Штамм 8, выделенный из водной толщи, показал наиболее высокий процент сходства с видом Micromonospora chokoriensis (99%), штамм 10 с видом Micromonospora sp. (98%). Среди штаммов, выделенных в районе устья р. Б. Зеленовская, пять, идентифицированы как представители р. Micromonospora с различной степенью сходства. Нуклеотидная последовательность штамма 51

имела 93% сходства с видом М'юготопоярога ти-оЬгщетгз, что не позволяет однозначно идентифицировать данный штамм как представителя р. Мкготопозрога. Филогенетический анализ показал, что штаммы этого рода (47, 51, 128), выделенные из разных районов, отличались по структуре нуклеотидных последовательностей и образовали на филогенетическом дереве отдельный

кластер (рис. 5).

f-Ч 0.01

-Ш

_1Ш

Rhodococcus erythropolisEF362636 12GÜW BU496S46

Rhodococcussp. FJ544265 Rhodococcus sp. DQ310477 inrtl6GUVV EU496547 18GUW EU496548

100

Mycobacterium austroaficanum AF544627 -Mycobacterium sp. AF544230 20GUW EU496549 pTOGtW EU449121 Micromonospora sp. EU714251 8GIJW EU496543 'Micromonospora chokoriensis FJ532390 wrasp. AY360154

Micromono, 14GUW

> §

3 о

100

1SGUW ETJ496S45 —Paenibacillus cntarcticus F.F45954S Paenibacillus sp. AB094470 3GUW EU496553

1GUW EU496552

4GUW EU496554

Paenibacillussp. AY289507 1ПП |13GU\V EU449122

Sphingomonas sp. SSU37345 |7GUW EU496542

,ЛА 1 MBosea sp. DQ664253

10Q|—6GUW EU496550

я ■is Я О н и О

п н и

я р

я 2 о в н и

JÜQfl.

-uncultured bacterium EF157085

9GTJW EU449119 Л

Pseudomonas aeruginosa EF599679 Q7T5GÜW EU496551

1Pseudomonas sp. EU365518 11GUW EU449118

Pseudomonas sp. AM410625 Pseudomonas sp. AY689083 2GUW EU449117

22GUW EU449120

21GUW EU496541

Pseudomonas sp. FJ424487 Pseudomonas putida AY512612 Pseudomonas sp. EF601816

Escherichia coli

Я О н я О

ю >

о н

Рис. 4. Филогенетическое положение аэробных микроорганизмов, шолированных из водной толщи района естественного нефтепровления озера Байкал у м. Горевой Утес. Масштаб соответствует 1 нуклеотидной замене на каждые 100 пуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность ветвления, определенная с помощью "bootstrap" анализа альтернативных деревьев. Значения менее 90 не указаны

Генетическая структура культивируемых УВОМ из района устья р. Б. Зеленовская отличается большим разнообразием в сравнении с районом м. Горевой Утес. Возможно, это связано с тем, что из донных осадков у м. Горевой Утес поступает значительное количество нефти и газообразных углеводородов, а микробное сообщество на данный момент еще находится на стадии

формирования. •—'

0.01 85TW EU443829 Л

Qs Micrococcus sp. EF522836 ~ir>6T\V EU443825 -пШШбЖ "Q238837

93 llArthrobacter sp. ЛМ412214 Arthrobacter sp. AF409001

-I132TW EU443821

_ Curtobacterium sp. DQ238838

IMicrobacterium trichotecenol AB167383 119TW EU443823

> n

100

таТУУ KU443827 ' Microbacterium sp. DQ985071 Micromonosporasp. EF544154 47TVV EU487607

51TW EII521687 Micromonospora mirobrigensis AJ626950 Micromonospora sp. AY360168 128TW EU449114

142TW EU449116 Micromonosporasp. EU158358 Micromonosporasp. AY360154 141TW EU443822 36TW EU48760S

Paenibacillus amviolylicus AM237376 133TW EU487609

Paenibacillus sp. AF395027 100 Paenibacillus sp. AB094470 . Paenibacillus sp. DQ514297 Paenibacillus sp. DQ444987

57TW EU4876Q8

-4QQNovosphing resinovorum AB237654 113TW EU487612

-тшшш AB22008°.

|— 77TWEU443826

--г 2

» 2

Р д

Ч В г а

о ч

eg в

> сй

н J

10 0-Acidovorax sp. AM084035 ~ Escherichia coli

О g

4 и

•V 50 О ч в о

п ч

Рис. 5. Филогенетическое положение аэробных микроорганизмов, изолированных из водной толщи района естественного нефтепровления озера Байкал у устья р. Б. Зеленовская. Масштаб соответствует 1 нуклеотидной замене на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность ветвления, определенная с помощью "bootstrap" анализа альтернативных деревьев. Значения менее 90 не указаны

Проведенный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК показал, что культивируемые УВОМ отмеченных нами родов широко распространены в водных экосистемах, как пресноводных, так и морских. Ближайшие родственники байкальских культивируемых УВОМ

были изолированы из почв, загрязненных углеводородами (Yu et al., 2000; Inagaki et al., 2003; Kim, Crowley, 2007).

Анализ структуры нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК свидетельствует о доминировании в водной толще и донных осадках м. Горевой Утес представителей класса у-Proteobacteria (р. Pseudomonas) и филума Actinobacteria (pp. Rhodococcus, Micromonospora), а у устья р. Б. Зеленовская филумов Firmicutes (pp. Bacillus, Brevibacillus, Paenibacillus) и Actinobacteria (p. Micromonospora).

4.2. Филогенетическое разнообразие природного микробного сообщества в районах естественных выходов нефти по данным анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16S рРНК

4.2.1. м. Горевой Утес. Филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей из двух слоев осадка у м. Горевой Утес показал, что состав микробного сообщества в окисленном и восстановленном слоях осадка различен.

Нуклеотидные последовательности из поверхностного окисленного слоя донных осадков м. Горевой Утес отнесены к следующим филогенетическим группам: Proteobacteria (классы ß, у, 6), Verrucomicrobia, Nitrospirales, Chloroflexi, Planctomycetes, Acidobacteria, CMorobi и Actinobacteria. Нуклеотидные последовательности, полученные из восстановленного слоя (180-190 см) отнесены к следующим филумам: Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria (cc, ß-, у-). Наиболее широко среди проанализированных последовательностей представлен филум протеобактерий. Следует отметить, что для 12 нуклеотидных последовательностей не был установлен филогенетических статус, поскольку их ближайшие гомологи имеют неопределенное положение. Процент сходства байкальских последовательностей, полученных из двух слоев донных осадков, составил 88-99% с ближайшими гомологами из международного банка данных.

Большая часть полученных нуклеотидных последовательностей сходна с некультивируемыми бактериями, изолированными из донных осадков различных рек и озер мира (Briee et al., 2007; Nercessian et al., 2005). Как в окисленных, так и в восстановленных осадках у м. Горевой Утес получены нуклеотидные последовательности сходные некультивируемым и культивируемым бактериям, выделенным из углеводородзагрязненных осадков, почв загрязненных нефтью (Winderl et al., 2008). Часть известных последовательностей участвует в окислении органических веществ, а также в окислении метана, как в аэробных, так и анаэробных условиях (Chen et al., 2008; Heijs et al., 2007). Одна нуклеотидная последовательность наиболее сходна с некультивируемой Magnetobacterium sp., участвующей в окислении бензина при сульфатредуцирующих условиях (Kleinsteuber et al., 2008). Следует отметить, что среди представителей у -Proteobacteria в поверхностном слое донных отложений были обнаружены нуклеотидные последовательности сходные метанотрофньш бактериям pp. Methylobacter и Methylomicrobium, участвующим в окислении метана в арктической почве и содовом озере в Бурятии (Wartianen et al., 2006).

Ранее нуклеотидные последовательности сходные метанотрофным бактериям I типа были получены при исследовании поверхностных горизонтов донных отложений грязевого вулкана «Маленький» (Шубенкова и др., 2005). Кроме того, из восстановленного слоя получена одна последовательность, ближайшим родственником которой является бактерия, выделенная из осадка, содержащего ГГ (залив Мехико) (Lanoil et al., 2001). Таким образом, полученные данные позволяют рассматривать некультивируемые бактерии донных осадков м. Горевой Утес как возможных деструкторов н-алканов нефти, метана и других органических соединений.

В ДНК из поверхностного слоя донных отложений м. Горевой Утес был исследован архейный компонент. Филогенетический анализ показал, что байкальские археи из донных осадков м. Горевой Утес относятся к царствам Euryarchaeola и Crenarchaeota, причем большинство клонов относится к первому царству. Процент сходства полученных последовательностей составил 88-99% с ближайшими гомологами из международного банка данных. Филогенетический анализ байкальских архей показал, что их ближайшие гомологи были выделены из природных сред, в том числе из донных осадков и водной толщи морских экосистем (Inagaki et al., 2003; Stein et al., 2001). Шесть полученных нуклеотидных последовательностей наиболее сходны некультивируемым археям, участвующим в процессах окисления метана и нефти в озере (Швейцария) (Raghoebarsing et al., 2006).

4.2.2. Устье р. Б. Зеленовская. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК из окисленного и восстановленного слоев донных отложений у устья р. Б. Зеленовская показал, что их ближайшими гомологами являются представители филумов: Proteobacteria, (классы Р-, у-, 5-) Bacteroidetes, Planctomycetes, Actinobacteria, Firmicutes. Семь нуклеотидных последовательностей не были отнесены ни к одному из полученных филумов. Процент сходства нуклеотидных последовательностей, полученных в окисленном и восстановленном слоях осадка в районе устья р. Большая Зеленовская, составил 88-99% с ближайшими родственниками из международного банка данных.

Ближайшими родственниками, полученных нуклеотидных последовательностей из этого района, являются бактерии, выделенные из различных регионов мира: из морской воды, озера Брина, озер в Канаде, Новой Зеландии, Японии, из образцов бактериальных матов (Мехико) (Ley et al., 2006). Одна нуклеотидная последовательность была сходна метанокисляющей бактерии, из поверхностного слоя донных отложений м. Горевой Утес. Также были детектированы нуклеотидные последовательности, принадлежащие различным филогенетическим группам бактерий, участвующим в окислении н-алканов нефти и других органических соединений (Yamane et al., 2008).

В отличие от водной толщи, в донных осадках в новом районе нефтепроявлений отмечен более разнообразный генетический состав микроорганизмов, и менее разнообразный в осадках района устья р. Б. Зеленовская. Скорее всего, менее разнообразный генетический состав микробного сообщества обусловлен тем, что нефть в донных осадках последнего района

является деградированной и в ней доминируют более тяжелые фракции нефти, которые способны разрушать лишь небольшое количество микроорганизмов.

4.3. Исследование alk генов у культивируемых углеводородокисляющнх микроорганизмов

Для исследования alk генов было отобрано 15 штаммов, которые на основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК были отнесены к следующим филумам: Actinohacteria, Firmicutes, классам а-, у-Proteobacteria. Среди них четыре штамма содержали alk гены II группы, способные окислять алканы с длиной цепи от С)2 до С2о- V 11 штаммов УВОМ были детектированы в геноме alk гены III группы, ответственные за окисление широкого спектра н-алканов. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей этих генов выявил сходство с alk генами грамположительных бактерий p. Rhodococcus, и грамотрицательных бактерий р. Pseudomonas и Acinetobacter.

Сравнение структуры alk генов у исследованных штаммов показало сходство исследованных штаммом с ДНК родококков. Это может свидетельствовать о том, что alkB гены могли появиться в геноме различных родов бактерий в результате горизонтального межвидового переноса. Подобное предположение было выдвинуто ранее J. V. van Beilen с соавторами (2001) и Т. П. Туровой с соавторами (2008). Известно, что alk гены являются адаптивными, то есть связанные с приспособлением к меняющимся условиям среды. Адаптивные гены не являются обязательными для всех представителей бактериальной популяции, они располагаются на плазмидах, что значительно повышает возможность их переноса между членами популяции, даже если эти члены не являются близкородственными (Турова, 2009).

Alk гены II группы были обнаружены только в геноме представителей р. Acinetobacter.

Таким образом, чистые культуры аэробных бактерий двух районов естественных нефтепроявлений обладают специфической ферментной системой и разной структурой alk генов, которые отвечают за деградацию различного спектра н-алканов.

ГЛАВА 5. Роль микроорганизмов в биодеградации нефти

5.1. Деградация нефти и ее производных в лабораторных условиях чистыми культурами

У пяти штаммов, изолированных из водной толщи естественного нефтепроявления м. Горевой Утес в лабораторных условиях исследована динамика потребления н-алканов и их качественный состав. Для эксперимента был и взяты штаммы Pseudomonas sp. (№5), Pseudomonas fluorescens (№11), Mycobacterium sp. (№18), показавшие положительную ПЦР-реакцию на III группу alk генов, один штамм Bosea sp. (№7) на I группу alk генов и один штамм

Pseudomonas sp. (№1), на I и III группы alk генов. В результате проведенного эксперимента установлено, что штаммы потребляли н-алканы с разной интенсивностью (рис. 6).

Наиболее активно окислял н-алканы представитель р. Pseudomonas, штамм Pseudomonas sp. (№5). За 36 суток эксперимента в присутствии данного штамма окислилось 35% алканов с длиной цепи С10-С2.|. При этом в среде не происходило накопления короткоцепочечных алканов, это дает основание считать, что данный штамм окисляет их до более простых соединений.

контроль

Штаммы

Рис. 6. Суммарное содержание н-алканов в экспериментальной среде

Менее активно деградировали н-алканы штаммы Pseudomonas fluorescens (№\\\Paenibacillus sp.(№l). Процент окисления в присутствии этих штаммов не превысил 10% за 36 суток эксперимента.

Во всех экспериментах качественный состав н-акланов нефти за 36 суток не изменялся, менялась лишь их доля в общей сумме углеводородов. Анализ полученных экспериментальных данных свидетельствует, что не всегда штаммы, выделенные на среде с определенным углеводородом, содержат alk гены, обеспечивающие деструкцию данного углеводорода. В некоторых случаях спектр используемых бактериями н-алканов в эксперименте был шире, чем набор детектируемых у них с помощью праймеров ферментных систем. Эти результаты в определенной степени могут свидетельствовать о существовании альтернативных систем окисления алканов, которые нами не были выявлены.

5.2. Деградация нефти и ее производных в лабораторных условиях природным микробным сообществом

Эксперименты по деградации н-алканов нефти, проведенные с природным микробным сообществом показали, что наиболее активно деградирует н-алканы микробное сообщество, отобранное из нефтяного пятна естественного нефтепроявления м. Горевой Утес. За первые 15 суток эксперимента уменьшение н-алканов не превышало 2.0-2.5 мкг/мл, что, очевидно, связано с формированием в этот период микробного сообщества, способного деградировать нефть и ее производные. В дальнейшем нефтеразрушающая способность микробного сообщества, отобранного в зоне нефтяного пятна, резко возрастает и через 35-60 суток конверсия н-алканов достигает 84-90%, причем количество внесенных н-

алканов нефти в начале эксперимента не влияют на способность микробного сообщества деградировать нефть (рис. 7).

Более длительный период в процессе биодеструкции отмечен в экспериментах с водой, отобранной в этом районе, но за пределами нефтяного пятна. В последнем случае за 60 суток конверсия не превышала 50% и зависела от количества добавленной нефти.

На фоновой станции вблизи Баргузинского залива уменьшение н-акланов за 60 суток эксперимента было незначительным и не превышало 35%.

0 15 36 60

Рис. 7. Содержание н-алканов в смесях в начале модельного эксперимента и их уменьшение в течение 60 суток. Вода отобрана в районе нефтепроявления м. Горевой Утес в зоне нефтяного пятна. Количество н-алканов в добавленной нефти (мкг/мл): I - 13,2-25,355 и 4-72

Таким образом, экспериментально подтверждена способность чистых культур и природного микробного сообщества использовать нефть в качестве единственного источника углерода и энергии.

ВЫВОДЫ

2. Молекулярно-генетическое биоразнообразие культивируемых УВОМ как в давно известном, так и в новом районах нефтепроявлений представлено

филумами Proteobacteria (классы a-, ß-, у-), Actinobacteria, Firmiertes; в последнем районе не обнаружены предст авители класса ß-Proteobacteria.

3. Молекулярно-генетическое биоразнообразие суммарного микробного сообщества в донных осадках у устья р. Большая Зеленовская представлено филумами Proteobacteria, Bacteroidetes, Planctomycetes, Actinobacteria, Firmicutes. У м. Горевой Утес кроме вышеперечисленных филумов обнаружены представители Verrucomicrobia, Nitrosrirales, Chloroflexi, Gemmatimonadete, Acidobacteria и Chlorobi. Филогенетический анализ байкальских архей показал, что они относятся к царству Euryarhaeota и Crenarchaeota.

4. В лабораторных экспериментах подтверждена способность культивируемого и природного микробного сообщества, из недавно открытого района естественного нефтепроявления, деградировать нефть и ее производные. Среди исследованных штаммов наиболее активно деградировал н-алканы штамм Pseudomonas sp. (№ 5), процент конверсии н-алканов составил 35% за 36 суток эксперимента. Природное микробное сообщество за 60 суток деградировало н-алканы нефти на 90%.

5. Впервые у культивируемых УВОМ с помощью специфических праймеров детектированы alk гены, отвечающие за окисление широкого спектра н-алканов. В результате анализа структуры генов установлено, что часть культивируемых УВОМ из двух районов нефтепроявлений на озере Байкал содержит alk гены III группы, которые, скорее всего, появились в геноме различных родов бактерий в результате горизонтального переноса. При этом донором этих генов, возможно, служили родококки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в рецензируемых научных 3!сурналах

1. Ломакина А. В., Павлова О. Н., Шубенкова О. В., Земская Т. И. Разнообразие культивируемых аэробных микроорганизмов в районах естественных выходов нефти на озере Байкал // Изв. РАН. Серия биологическая. -2009. -№5.- С. 515-522.

2. Хлыстов О. М., Земская Т. И., Ситникова Т. Я., Механикова И. В., Кзйгородова И. А. Горшков А. Г., Тимошкин О. А., Шубенкова О. В., Черницына С. М., Ломакина А. В., Лихошвай А. В., Сагалевич А. М.,. Москвин В. И, Пересыпкин В. И., Беляев Н. А, Слипенчук М. В., член-корреспондент РАН Тулохонов А. К., академик Грачев М. А. Донные битумные постройки и населяющая их биота по данным обследования озера Байкал с глубоководных обитаемых аппаратов «Мир» // ДАН. - 2009. - Т. 428. -№5. - С. 682-685.

Работы, опубликованные в материалах всероссийских и международных конференций

3. Ломакина А. В., Шубенкова О. В., Павлова О. Н., Земская Т. И. Генетический анализ микроорганизмов из района естественного нефтепроявлния на озере Байкал // II Международный Байкальский Микробиологический симпозиум «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ». -Иркутск. -2007. - С. 145.

4. Ломакина А. В., Земская Т. И., Павлова О. Н., Шубенкова О. В. Углеводородокисляющие микроорганизмы двух районов естественных нефтепроявлений на оз. Байкал // VI Международный симпозиум «Контроль и реабилитация окружающей среды». - Томск. - 2008. - С. 44-45.

5. Земская Т. И., Ломакина А. В., Павлова О. Н. Изучение углеводородокисляющих микроорганизмов двух районов естественных нефтепроявлений на оз. Байкал // Научно-практический семинар молодых ученых и специалистов, приуроченных к проведению технологической экспедиции ООО «ВНИИГАЗ» «Байкальские гидраты». - Листвянка. - 2008. - С. 8.

6. Lomakina А. V., Pavlova О. N. Gorshkov A. G., Zemskaya Т. I. Hydrocarbon oxidizing microorganisms and their ability to degrade oil and its derivatives et natural oil seepage sites (Central Baikal) // 19th Annual V.M. Goldschmidt Conference Davos. Special Supplement Geochimica et cosmochimica acta. - 2009. - Switzerland. - P. A789.

7. Земская Т. И., Ситникова Т. Я., Шубенкова О. В., Черницына С. М., Ломакина А. В., Павлова О. Н., Механикова И. В., Лихошвай А. В., Хлыстов О. М. Микробные сообщества и фауна холодных сипов и грязевых вулканов в осадках озера Байкал // X Съезд Гидробиологического сообщества при РАН. -2009. - Владивосток. - С. 154-155.

8. Ломакина А. В., Земская Т. И., Павлова О. Н., Шубенкова О. В., Горшков А. Г. Исследование углеводородокисляющих микроорганизмов и их способность деградировать нефть и ее производные в районах естественных выходов нефти на озере Байкал // XVIII Международная школа морской геологии «Геология морей и океанов». - 2009. - Москва. - С. 106-109.

Подписано в печать «19» февраля 2010г. Отпечатано: ООО «Аспринт» 664003 г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 18, оф. 67, тел. (3952)742-887 Формат 60*901/16, усл. печ. л. 1,5 Тираж 100 экз. Заказ № 201

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ломакина, Анна Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Физико-географическая характеристика озера Байкал

1.2. История изучения районов естественных нефтепроявлений на озере Байкал

1.3. Химический состав байкальской нефти и характеристика районов естественных нефтепроявлений на озере Байкал

1.4. Разнообразие углеводородокисляющих микроорганизмов в воде и донных осадках различных экосистем мира

1.5. Механизмы окисления углеводородов нефти микроорганизмами и ферментативные системы

1.6. История изучения углеводородокисляющих микроорганизмов на озере Байкале

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследования и методы отбора проб

2.2. Методы исследований

2.2.1. Микробиологические методы исследования

2.2.2. Молекулярно-биологические методы исследования

2.2.3. Химические методы исследования

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

ГЛАВА 3. Численность культивируемых углеводородокисляющих микроорганизмов в водной толще и донных осадках двух районов естественных нефтепроявлений

3.1. Естественное нефтепроявление у устья р. Б. Зеленовская

3.2. Естественное нефтепроявление у м. Горевой Утес

ГЛАВА 4. Молекулярно-генетическая идентификация углеводородокисляющих микроорганизмов в районах нефтепроявлений

4.1. Филогенетическое разнообразие культивируемых углеводородокисляющих микроорганизмов двух районов естественных нефтепроявлений по данным анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК

4.2. Филогенетическое разнообразие природных микробных сообществ в двух районах естественных нефтепроявлений по данным анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК

4.2.1. М. Горевой Утес

4.2.2. Устье р. Б. Зеленовская

4.3. Исследование alk генов у культивируемых углеводородокисляющих микроорганизмов

ГЛАВА 5. Роль микроорганизмов в биодеградации нефти

5.1. Деградация нефти и ее компонентов в лабораторных условиях чистыми культурами

5.2. Деградация нефти и ее компонентов в экспериментах природным микробным сообществом

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование микробных сообществ в районах естественных выходов нефти на озере Байкал"

Актуальность проблемы. Известно, что решающую роль в трансформации нефти до простых соединений выполняют микроорганизмы (Квасников, Клюшникова, 1981; Барышникова и др., 2001; Назина и др., 2002; Head et al., 2006; Muyzer et al., 2008). Углеводородокисляющие микроорганизмы (УВОМ) широко распространены в природе, их пищевые потребности разнообразны, среди них нет узкоспециализированных форм (Шлегель, 1987). В настоящее время известно, что, по крайней мере, 79 родов бактерий, 9 родов цианобактерий, 103 рода грибов и 14 родов водорослей способны использовать нефть и ее производные в качестве единственного источника углерода и энергии (Head et al., 2006).

На озере Байкал различными методами идентифицированы грязевые вулканы, метановые и нефтяные сипы (Кузьмин и др., 1998; Клерке и др., 2003; Конторович и др., 2007; Хлыстов и др., 2007 а). По оценкам А. Э. Конторовича с соавторами (2007), ежегодно из донных осадков районов естественных нефтепроявлений в воду озера Байкал поступает от 2 до 4 т. нефти. Несмотря на то, что нефть поступает на поверхность воды непрерывно, нефтяное пятно не увеличивается, что свидетельствует о ее биодеградации (Конторович и др., 2007; Хлыстов и др., 2007 а). Районы нефтепроявлений на Байкале известны с XVIII века, тем не менее, исследования естественного микробного сообщества озера проводились лишь эпизодически (Талиев и др., 1985; Гоман и др., 1986; Петрова, Мамонтова, 1986; Павлова и др., 2008).

Задачи:

Впервые в районах естественных нефтепроявлений на озере Байкал исследована генетическая структура природного микробного сообщества. Среди культивируемых бактерий выявлены представители следующих родов: Psendomonas, Bacillus, Brevibacillus, Paenibacilliis, Micromonospora, Acinetobacter, Rhodococcus, Sphingomonas, Mycobacterium, Bosea, Micrococcus, Microbacterium, Aeromonas, Kocuria, Enterobacter, Arthrobacter, Novosphingobium, Methylobacterium, Curtobacterium, Acidovorax. В суммарном природном сообществе обнаружены представители филумов: Chlorobi,

Chloroflexi, Acidobacteria, Nitrospirae, Bacteroides, Actinobacteria, Proteobacteria, Firmicntes, Verrucomicrobia, Planctomycetes. У культивируемых штаммов УВОМ детектированы различные alk гены, ответственные за деградацию широкого спектра алканов.

Положения, выносимые на защиту:

1. В районах естественных нефтепроявлений на озере Байкал обитает динамичное микробное сообщество, способное использовать углеводороды нефти в качестве единственного источника углерода и энергии. Состав культивируемого микробного сообщества в давно известном районе нефтепроявления отличается большим генетическим разнообразием в сравнении с новым районом, где нефть является не биодеградированной.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на следующих конференция и симпозиумах: II международном Байкальском микробиологическом симпозиуме «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ» (Иркутск - п. Листвянка, 2007); международном симпозиуме «Контроль и реабилитация окружающей среды: КРОС - 2008» (Томск, 2008); Научно-практическом семинаре молодых ученых и специалистов, приуроченном к проведению технологической экспедиции ООО 'ВНИИГАЗ' 'Байкальские гидраты' (Иркутск - п. Листвянка, 2008); XIX Goldschmidt конференции (Давос, Швейцария, 2009); X съезде Гидробиологического общества при РАН (Владивосток, 2009); XVIII Международной школе морской геологии «Геология морей и океанов» (Москва, 2009). По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 2 статьи в рецензируемых журналах.

Автор выражает благодарность и искреннюю признательность научному руководителю д.б.н. Земской Т. И., за постановку задач и помощь в проводимых исследованиях, а также зав. лабораторией водной микробиологии, к.б.н. Парфеновой В. В., к.б.н. Павловой О. Н., к.б.н. Шубенковой О. В., к.б.н. Черницыной С. М., к.х.н. Горшкову А. Г., Иванову В. Г., к.б.н. Морозову И. В., Хлыстову О. М., пилотам ГОА «Мир» за отбор проб воды и донных осадков, Фонду содействия сохранению озера Байкал и всем сотрудникам лаборатории водной микробиологии за оказанную помощь при выполнении работ.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Ломакина, Анна Владимировна

1. Содержание микроорганизмов в водной толще и донных осадках в зонах разгрузки нефти на озере Байкал на 1-2 порядка выше по сравнению с фоновыми районами. Численность УВОМ в поверхностных слоях воды у устья р. Б. Зеленовская составляла 1200-2600 кл/мл, для поверхностных слоев донных отложений - 470 х 10 кл/г. В районе нового нефтепроявления у м. Горевой Утес численность микроорганизмов, окисляющих нефть и н-алканы составляла 200 кл/мл в 2005 г. и 1560 кл/мл в 2007, 2008 гг.2. Молекулярно-генетическое биоразнообразие УВОМ как в давно известном, так и в новом районах нефтепроявлений представлено филумами Proteobacteria (классы а-, (3-, у-), Actinobacteria, Firmicutes', в последнем районе не обнаружены представители класса ^-Proteobacteria.3. Молекулярно-генетическое биоразнообразие суммарного микробного сообщества в донных осадках у устья р. Б. Зеленовская представлено филумами Proteobacteria, Bacteroidetes, Planctomycetes, Actinobacteria, Firmicutes. У м.Горевой Утес кроме вышеперечисленных филумов обнаружены представители Verrucomicrobia, Nitrospirae, Chloroflexi, Acidobacteria и Chlorobi.Филогенетический анализ байкальских архей показал, что они относятся к царствам Euryarhaeota и Crenarchaeota.4. В лабораторных экспериментах подтверждена способность культивируемого и природного микробного сообщества деградировать нефть и ее компоненты. Среди исследованных штаммов наиболее активно деградировал н-алканы штамм Pseudomonas sp. (5), процент конверсии н-алканов составил

35% за 36 суток эксперимента. Природное микробное сообщество за 60 суток деградировало н-алканы нефти на 90%.5. У культивируемых УВОМ с помощью специфических праймеров детектированы alk гены, отвечающие за окисление широкого спектра н-алканов.В результате анализа структуры генов установлено, что большая часть культивируемых УВОМ из двух районов нефтепроявлений на озере Байкал содержит alk гены III группы, которые, скорее всего, появились в геноме различных родов бактерий в результате горизонтального переноса. При этом донором этих генов, возможно, служили родококки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ломакина, Анна Владимировна, Иркутск

1. Альтовский, М. Е. Образование нефти и формирование ее залежейТекст. / М. Е. Альтовский, 3. И. Кузнецова, В. М. Швец // М.: Гостоптехиздат. 1958.-168 с.

2. Белькова, Н. Л. Таксономическое разнообразие микробного сообществаводной толщи озера Байкал Текст. : дис. .. канд. биол. наук : 03.00.16, 03.00.07 : защищена 6. 10. 04 / Белькова Наталья Леонидовна. - Владивосток, 2004. - 109 с.

3. Верещагин, Г. Ю. Происхождение и история Байкала, его фауны и флорыТекст. / Г. Ю. Верещагин // Тр. Байкал, лимнол. ст. АН СССР. - 1940. - Т. 10. 73-239.

4. Воробьева, Л. И. Археи : учеб. пособие для вузов / Л. И. Воробьева ; под.общ. ред. Н. Л. Немцова ; М. : Академкнига, 2007. — 447 с , ил.; 21 см. Библиогр.: с. 427-439. Предм. указ.: с. 440-447. - 2000 экз. - ISBN 978-5-94628277-2.

5. Вотинцев, К. К. Гидрохимия озера Байкал Текст. / К. К. Вотинцев;Академ, наук СССР, Сиб. отд., вост.- сиб. филиал, труды Байк. лимн. ст. - М.: Изд-во АН СССР, 1961. - Т. 20. - 302 с ; 26 см. - Библиогр.: с. 302-309. - 1000 экз.

6. Голубев, В. А. Очаги субаквальной гидротермальной разгрузки итепловой баланс Северного Байкала Текст. / В. А. Голубев // Доклады РАН. 1993. - Т. 328. - № 3. - 315-318.

7. Горбенко, А. Ю. О возможности количественного учетаолигокарбофильного (олиготрофного) бактериопланктона на богатой питательной среде Текст. / А. Ю. Горбенко, А. Н. Дзюбан // Микробиология. 1992. - Т. 6 1 . - № 3. - 531-532.

8. Готтшлак, Г. Метаболизм бактерий. М.: Мир, 1982. 310 с.

9. Гранина, Л. 3. Аномалии состава поровых вод донных осадков БайкалаТекст. / Л. 3. Гранина, Е. Каллендер, И. Ломоносов, В. Д. Мац, Л. П. Голобокова // Геология и геофизика - 2001. - Т. 42. - № 1-2. - 362-372.

10. Грачев, М. А. О современном состоянии экологической системы озераБайкал Текст. / М. А. Грачев // Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2002. - 156 с , ил.; 21,5 см. - Библиогр.: с.141-153. - 1000 экз. - ISBN 5-7692-0481-8.

11. Дагурова, О. П. Бактериальные процессы цикла метана в донныхосадках озера Байкал Текст. / О. П. Дагурова, Б. Б. Намсараев, Л. П. Козырева, Т. И. Земская, Л. Е. Дулов // Микробиология. - 2004. - Т. 74. - № 2. - 248257.

12. Ефремова, А. Г. О газах в осадках Байкала Текст. / А. Г. Ефремова, М.В. Андреева, Т. В. Левшенко, В. П. Царев // Геология и разведка газовых и газоконденсатных месторождений / Реф. Сборник. М., ВНИИГазпром. - 1980. — № 2 . - С . 15-23.

13. Жуков, Д. В. Механизмы деградации углеводородов нефтимикроорганизмами Текст. / Д. В. Жуков, В. П. Мурыгина, В. Калюжный // Успехи современной биологии. - 2006. - Т. 126. - № 3. - 285-296.

14. Исаев, В. П. Байкальская нефть Текст. / В. П. Исаев, Р. Н. Преснова //Нефть и газ в современном мире: Геолого-экономические и социальнокультурные аспекты. — Иркутск. — 2003. — 44—51.

15. Калмычков, Г. В. Генетические типы метана озера Байкал Текст. / Г. В.Калмычков, А. В. Егоров, М. И. Кузьмин, О. М. Хлыстов // Доклады Академии наук. - 2006. - Т. 411. - 672-675.

17. Каширцев, В. А. Терпаны нефтей озера Байкал Текст. / В. А.Каширцев, А. Э. Конторович, В. И. Москвин, В. П. Данилова, В. Н. Меленевский // Нефтехимия. - 2006. - Т. 46. - № 4. - 243-250.

18. Квасников, Е. И. Микроорганизмы - деструкторы нефти в водныхбассейнах Текст. / Е. И. Квасников, Т. М. Клюшникова. — Киев : Наукова думка, 1981.-132 с.

19. Кожов, М. М. Биология озера Байкал Текст. / М. М. Кожов // М.: Издво АН СССР. - 1962. - 315 с , ил.; 26 см. - Библиогр.: с. 295-313. - 2000 экз.

20. Кожов, М. М. Очерки по байкаловедению Текст. / М. М. Кожов //Иркутск: Вост.-Сиб. книж. из-во. - 1972. - 254 с , ил.; 26 см. - Библиогр.: с. 239252.-2000 экз.

21. Конторович, А. Э. Геохимия нафтидов и проблема генезиса байкальскойнефти Текст. / А. Э. Конторович, Д. И. Дробот, Р. Н. Преснова // Советская геология. - 1989. - № 2. - 21-29.

23. Красильников, Н. А. Усвоение нормальных алканов и сырой нефтиморскими бактериями Текст. / Н. А. Красильников, А. В. Цыбань, Т. В. Коронелли // Океанология. - 1973. - Т. 13. - № 5. - 877-882.

24. Кузьмин, М. И. Первая находка газогидратов в осадочной толще озераБайкал Текст. / М. И. Кузьмин, Г. В. Калмычков, В. Ф. Гелетий // Доклады РАН. - 1998. - Т. 362. - № 4. - 541-543.

25. Мизандронцев, И. Б. Химический состав грунтовых растворов БайкалаТекст. / И. Б. Мизандронцев // Круговорот вещества и энергии в озерных водоемах. - Изд-во Наука, 1975. - 250-253.

26. Миронов, О. Г. Микроорганизмы Черного моря, растущие науглеводородах Текст. / О. Г. Миронов // Микробиология. - 1969. - Т. 38. - № 4. - С . 728-731.

27. Намсараев, Б. Б. Разложение целлюлозы в донных осадках озера БайкалТекст. / Б. Б. Намсараев, Л. Е. Дулов, Т. И. Земская // Микробиология. - 1995. Т. 64. - № 4. - 553-558.

28. Наумова, Н. Б. Археи в неэкстремальных экосистемах Текст. / Н. Б.Наумова // Успехи современной биологии. - 2003. — Т. 123. - № 1. - 16-23.

29. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Текст. / Под ред. Дж. Хоулта,Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, Уилямса // М.: Мир. -1997. - 432 с. ил.; 25 см. -Библиогр.: с. 536-548. - 10000 экз. -ISBN 5-03-0031110-3.

30. Павлова, О. Н. Особенности распространения бактерий родаPseudomonas в озере Байкал Текст. / О. Н. Павлова, В. В. Дрюккер, Т. Я. Косторнова, И. Г. Никулина // Сибир. Экол. Журн. - 2003. - № 3. - 267-272.

31. Парфенова, В. В. Видовой состав фосформобилизующихмикроорганизмов, выделенных из воды и грунтов Байкала Текст. / В . В. Парфенова, А. Н. Илялетдинов // Микроорганизмы в экосистемах озер и водохранилищ. Н.: Наука, 1985. - 55-64 .

32. Парфенова, В. В. Микробиальные процессы круговорота азота ифосфора Текст. / В. В. Парфенова, В. А. Верхозина // Структура и функционирование сообществ водных микроорганизмов. Н.: Наука, 1986. - 136-140.

34. Поповская, Г. И. Этапы изучения автотрофного пикопланктона озераБайкал Текст. / Г. И. Поповская, О. И. Белых // Гидробиологический журнал. 2003. - Т. 39. - № 6. - 12-24.

35. Пуцилло, В. Г. Нефти, битумы и битумные породы района оз. БайкалТекст. / В. Г. Пуцилло, И. Миронов // Нефти и битумы Сибири. М. - 1958. 7-33.

36. Родина, А. Г. Методы водной микробиологии. Практическоеруководство Текст. / А. Г. Родина // АН СССР. Зоологический ин-т. - М.: Наука. - 1965. - 363 с ; 22 см. - Библиогр.: с. 348-360. - 2000 экз.

37. Рождественский, А. В. Статистические методы в гидрологии Текст. /А. В. Рождественский, А. И. Чеботарев // Л.: «Гидрометеоиздат». - 1974. — 424 с ; 21 см. - Библиогр.: с. 416-422. - 2000 экз.

38. Розанова, Е. П. Микрофлора нефтяных месторождений Текст. / Е. П.Розанова, И. Кузнецов // М.: Наука. - 1974. - 197 с : ил.; 21 см. - 3320 экз.

39. Романенко, В. И. Экология микроорганизмов пресных водоемов Текст./ В. И. Романенко, И. Кузнецов // М.: Наука, Ленингр. отд. - 1974. - 194 с ; 21,5 см.-Библиогр.: с. 181-188. - 1850 экз.

40. Рябухин, Г. Е. К изучению Байкальского месторождения нефти Текст. /Г. Е. Рябухин // Труды нефтяной неолог. Развитие института. Серия биологическая. Новосибирск. - 1934 а. — № 33. — 27с.

41. Рябухин, Г. Е. Байкальский нефтегазоносный район Текст. / Г. Е.Рябухин // Нефтяное хозяйство. - 1934 б. — Т. 26. — № 7. - 19-26.

42. Рябухин, Г. Е. Потоки нефти в Сибири Текст. / Г. Е. Рябухин // ВостСиб. Геолого-гидро-геофизический трест Иркутск. - 1934 в. - 45-58.

44. Самсонов, В. В. Перспективы нефтегазоносности Селенгинскойдепрессии в свете гидрогеологических исследований Текст. / В. В. Самсонов // Геология нефти. - 1959. - № 6. - 14-18.

46. Современная микробиология. Прокариоты. В 2 т. / под ред. И.Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля. - М. : Мир. - 2005. — 656 с. : ил., 16 с. цв. ил. ; 27 см. - ISBN 5-03-003707-1.

47. Суслова, М. Ю. Распространение и разнообразие спорообразующихбактерий рода в водных экосистемах оз. Байкал Текст. : Автореф. .. канд. биол. наук :03.00.16, 03.00.07 : защищена 16.05.07 / Мария Юрьевна Суслова Улан-Удэ,-2007.-22 с.

48. Талиев, Д. Углеводородокисляющие микроорганизмы в биоценозахнекоторых районах Байкала Текст. / Д. Талиев, О. М. Кожова, О. А. Моложавая // Микроорганизмы в экосистемах озер и водохранилищ. — Новосибирск: Наука - 1985. - 64-74.

49. Турова, Т. П. Гомологи гена alk термофильных бактерий родаGeobacilhis Текст. / Т. П. Турова, Т. Н. Назина, Е. М. Михайлова, Т. А. Родионова, А. Н. Екимов, А. В. Машукова, А. Б. Полтараус // Молекулярная Биология. - 2008. - Т. 42. - № 2. - 247-257.

50. Турова, Т. П. Применение методов геносистематики для решениявопросов таксономии и изучения биоразнообразия прокариот Текст. : дис. .. докт. биол. наук : 03.00.07 / Турова Татьяна Павловна. — М., 2009. — 86 с. — Библиогр.: с. 71-84.

51. Хлыстов, О. М. Новые находки газовых гидратов в донных осадкахозера Байкал Текст. / О. М. Хлыстов // Геология и геофизика. — 2006. - Т. 47. — № 8 . - С . 979-981.

52. Цыбань, А. В. Процессы микробного окисления нефти в море (обзор)Текст. / А. В. Цыбань, А. И. Симонов // Океанология. - 1978. - Т. 18. - Вып. 4. - С . 695-708.

53. Шкидченко, А. Н. Изучение нефтедеструктивной активностимикрофлоры прибрежной зоны Каспийского моря Текст. / А. Н. Шкидченко, М. У. Аринбасаров // Прикладная биохимия и микробиология. - 2002. - Т. 38. — № 5 . - С . 509-512.

54. Шлегель, Г. Общая микробиология Текст. / Г. Шлегель // М: Мир.1987.-567 с.

55. Amann, R. I. Molecular and microscopic identification of sulfate-reducingbacteria in multispecies biofilms Stromley Text. / R. I. Amann, J. Stromley, R. Devereux //Appl. Environ. Microbiol. - 1992. - V. 58. - № 2. - P. 614-623.

56. Altschul, S. F. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of proteindatabase search programs Text. / S. F. Altschul, T. L. Madden, A. A. Schaffer, J. Zhang, Z. Zhang, W. Miller, D. J. Lipman // Nucl. Acids Res. - 1997. - V. 5. - P. 3389-3402.

57. Atlas, R. M. Hydrocarbon biodegradation and oil spill bioremediation. Text./ R.M. Atlas, R.Bartha// Adv. Microb. Ecol. - 1972. -V. 12.-P. 180-209.

58. Brakstad, O. G. Microbial diversity during biodegradation of crude oil inseawater from the North Sea Text. / O. G. Brakstad, A. G. L0deng // Microbiol. Ecol. - 2005. - V. 49. - № 1. - p. 94-103.

60. Briee, C. Archaeal and bacterial community composition of sediment andplankton from a suboxic freshwater pond Text. / C. Briee, D. Moreira, P. LopezGarcia // Res. Microbiol. - 2007. - V. 158. - № 3. - P. 213-227.

61. Callender, E. Geochemical mass balances of major elements in Lake BaikalText. / E. Callender, L. Granina // Limnology and Oceanography. - 1997. - V. 42, № l . - P . 148-155.

62. Cavanagh, J. E. Hydrocarbon degradation by Antarctic coastal bacteriaText. / J. E. Cavanagh, P. D. Nichols, P. D. Franzmann, T. A. McMeekin // Antarctic. Sci. - 1998. - V.10. - P . 386-397.

63. Chen С L. Identification of important microbial populations in themesophilic and thermophilic phenol-degrading methanogenic consortia Text. / C. L. Chen, J. H. Wu, W. T. Liu // Water Res. - 2008. - V. 42. - № 8-9. - P. 1963-1976.

64. Colwell, R. R. Microbial ecological studies at the Metula spill in the Strait ofMagellan Text. / R. R. Colwell, A. L. Mills, J. D Walker, P. Garcia-Tello, V. Campos // J. Fish Res. Board Can. - 1978. - V. 35. - P. 573-580.

65. Cui, Z. Biodiversity of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteriafrom deep sea sediments of the Middle Atlantic Ridge Text. / Z. Cui, Q. Lai, C. Dong, Z. Shao // Environ. Microbiol. - 2008. -V. 10. - P. 2138-2149.

66. Delille, D. Natural attenuation of diesel-oil contamination in a subantarcticsoil (Crozet Island) Text. / D. Delille, E. Pelletier // Polar. Biol. - 2002. - V. 25. - P. 682-687.

67. Deppe, U. Degradation of crude oil by an arctic microbial consortiumText. / U. Deppe, H-H. Richnow, W. Michaelis, G Antranikian // Extremophiles. — 2005.-V. 9 .-P. 461-470.

68. Dojka, M. A. Microbial diversity in a hydrocarbon- and chlorinatedsolvent-contaminated aquifer undergoing intrinsic bioremediation Text. / M. A. Dojka, P. Hugenholtz, S. K. Haack, N. R. Pace //Appl. Environ. Microbiol. - 1998. V. 64.-P. 3869-3877.

69. Eriksson, M. Effects of low temperature and freeze-thaw cycles onhydrocarbon biodegradation Text. / M. Eriksson, J-O. Ka, W. W. Mohn // Appl. Environ. Microbiol. -2001 . -V. 67. - № 11. - P . 5107-5112.

70. Falkner, К. K. The major and minor element geochemistry of Lake BaikalText. / K. K. Falkner, С I. Measure, S. E. Herbelin, J. M. Edmond, R. F. Weiss // 1.mnology and Oceanography. - 1991. -V. 36. - № 3. - P. 413-^23.

71. Funhoff, E. G. CYP153A6, a soluble P450 Oxygenase catalyzing terminalalkane hydroxylation Text. / E. G. Funhoff, U. Bauer, I. Garcia-Rubio, B. Witholt, J. B. van Beilen // J. Bacteriol. - 2006.- V. 14. - P. 5220-5227.

72. Gerders, В. Influence of crude oil on changes of bacterial communities inArctic sea-ice Text. / B. Gerdes, R. Brinkmeyer, G. Dieckmann, E. Helmke // FEMS Microb. Ecol. - 2005. -V. 53. - P . 129-139.

73. Goebel, В. M. Cultural and phylogenetic analysis of mixed microbialpopulations found in natural and commercial bioleaching environments Text. / В. M. Goebel, E. Stackebrandt // Appl. Environ. Microbiol. - 1994. - V. 60. - № 5. - P. 1614-1621.

74. Head, I. M. Biological activity in the deep subsurface and the origin ofheavy oil Text. /1 . M. Head, D. M. Jones, S. R. barter // Nature. - 2003. - V. 426. P. 344-352.

75. Head, I. M. Marine microorganisms make a meal of oil Text. /1 . M. Head,D. M. Jones, F. M. Roling // Nature. - 2006. -V. 4. - P. 173-182.

76. Heiss-Blanguet, S. Assessing the role of alkane hydroxylase genotypes inenvironmental samples by competitive PCR Text. / S. Heiss-Blanguet, Y. Benoit, C. Marechaux, F. Monot // J. Appl. Microbiol. - 2005. - V. 99. - P. 1392-1403.

77. Hutchinson, D. R. Bottom simulating reflector in Lake Baikal Text. / D.R. Hutchinson, A. J. Golmshtok, C. A. Scholz., T. C. Moore, M. W. Lee, M. I. Kuzmin // Eos Trans. AGU: Spring Meeting. - 1991. - V. 72. - P. 307.

78. Kim, J. Microbial diversity in natural asphalts of the Rancho La Brea TarPits Jong-Shik Text. / J. Kim, D. E. Crowley // Appl. Environ. Microbiol. - 2007. V. 7 3 . - № 14.-P. 4579-4591.

79. Khlystov, O. Hydrocarbons of Lake Baikal Text. / O. Khlystov // InAbstracts of 9-th International Conference on GAS in Marine Sediments. - 2008. - P. 79-80.

80. Kloos, K. A new method for the detection of alkane-monooxygenasehomologous genes (alkB) in soils based on PCR-hybridization Text. /K. Kloos, J. C. Munch, M. Schloter // J. Microbiol. Methods. - 2006. - V. 66. - P. 486-496.

81. Kuhn, E. New alk genes detected in Antarctic marine sediments Text. / E.Kuhn, G. S. Bellicanta, V. H. Pellizari // Environ. Microbiol. - 2009. - V. 11.- P. 669-673.

82. Lanoil, B. D. Bacteria and Archaea physically associated with Gulf ofMexico gas Hydrates Text./ B. D. Lanoil, R. Sassen, M. T. La Due, S. T. Sweet; K. H. Nealson //Appl. Environ. Microbiol: - 2001. -V. 67. - № .11. P. 5143-5153.

83. Leahy, J. G. Microbial degradation of hydrocarbons in the environmentText. / J. G Leahy, R. R. Colwell7/ Microbiological Reviews. - 1990. - V. 55. - № 3. P. 305-315.

84. Liu, C. Alcanivorax dieselolei sp. nov., a novel alkane-degrading bacteriumisolated from sea water and deep-sea sediment Text. / C. Liu, Z. Shao // Internal Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. - 2005. - V. 55. - P.11811186.

85. Maeng, J. H. Isolation and characterization of a novel oxygenase thatcatalyzes the first step of n-alkane oxidation in Acinetobacter sp. Strain M-l Text. / J. H. Maeng, Y Sakai, Y. Tani, N. Kato // J. Bacteriol. - 1997. - V. 178. - P. 36953700.

86. Marin, M. M. The alkane hydroxylase gene of Burkholderia cepacia RR10is under catabolite repression control Text. / M. M. Marin, T. H. M. Smits, J. B. van Beilen, F. Rojo // J. Bacteriol. - 2001. - V.l 83. - P. 4202-4209.

87. Massana, R. A. few cosmopolitan phylotypes dominate planktonic archaealassemblages in widely different oceanic provinces Text. / R. Massana, E. F. DeLong, С Pedros-Alio //Appl. Environ. Microbiol. - 2000. - V. 66. - № 36. - P. 1777-1787.

88. Muyzer, G. Bacteria from hydrocarbon seep areas growing on short-chainalkanes Text. / G. Muyzer, G. M. van der Kraan // Trends in microbiology. - 2008. V. 16.-P. 138-141.

89. Quatrmi, P. Isolation of gram-positive n-alkane degraders from ahydrocarbon-contaminated Mediterranean shoreline.Text. /P. Quatrini, G. Scaglione, С D. Pasquale, S. Riela, A. M. Puglia // J Appl Microbiol. - 2008. - V. 104. - P. 251259.

90. Ramachandra, T. V. Milking diatoms for sustainable energy: biochemicalengineering versus gasoline-secreting diatom panels Text. / T. V. Ramachandra, D. M. Mahapatra, B. Karthick // Ind. Eng. Chem. Res. - 2009. - V. 3. - № 2. - P. 1-26.

91. Raymond- R. E. Microbial oxidation of n-paraffinic hydrocarbons. Text. /R. L. Raymond//Develop: Industry. Microbiol. - 1961. -V. 2. - № 1. - R 23-32.

92. Rehn, H. J: Mechanisms and occurrence' of microbial oxidation of longchain alkanes Text. / H. J. Rehn, I. Reiff//Adv. Biochem. Eng. - 1981. - V. 19. - R 175-215.

93. Rochelle, R A. DNA extraction for 16S rRNA gene analysis to determinegenetic diversity in deep sediment communities Text. / R A. Rochelle // FEMS Microbiol. Letters. - 1992. -V. 100. - R 59-66.

94. Roling, W. R M. Response of archaeal in beach sediments to spilled oil andbioremediation Text. / W. R M. Roling, I. R. Couto, R. R J. Swannell, I. M. Head // Appl. Environ. Microbiol. - 2004. -V. 70. - R 2614-2620.

96. Sambrook, J. Molecular cloning. A laboratory manual Text. / J.Sambrook, E. R Frisch, T. Maniatis // New York, Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. - 1989. - 350 p., ил. 27,5 см. - Библиогр.: p. 342-348. экз. - ISBN 0-87969-309-6.

97. Schwarz, J. R. Deep-sea bacteria: growth and utilization of hydrocarbons atambient and in situ pressure Text. / J. R. Schwarz, J. D. Walker, R. R. Colwell // Appl. Microbiol. - 1974a. - V. 28. - P. 982-986.

98. Schwarz, J. R. Growth of deep-sea bacteria on hydrocarbons at ambient andin situ pressure Text. / J. R. Schwarz, J. D. Walker, R. R. Colwell // Dev. Ind. Microbiol. - 1974b. - V. 15. - P. 239-249.

99. Simoneit, B. R. Hydrothermal petroleum from lacustrine sedimentaryorganic matter in the East African Rift Text. / B. R. Simoneit, T. A. Aboul-Kassim, J. J. Tiercelin //Appl. Geochem. - 2000. - V. 15. - № 3. - P. 355-368.

100. Siron, R. Environmental factors influencing the biodegradation ofpetroleum hydrocarbons in cold seawater Text. / R. Siron, E. Pelletier, С Brochu // Arch. Environ. Contam. Toxicol. - 1995. - V. 28. - P. 406-416.

101. Smits, Т. H. M. Functional analysis of alkane hydroxylases from gramnegative and gram-positive bacteria Text. / T. H. M. Smits, S. B. Balada, B. Witholt, J. B. van Beilen // J. Bacteriol. - 2002. - V. 184. - P. 1733-1742.

102. Sohngen, N. L. Benzin, petroleum, paraffin als kohlenstoff- undenergiequelle fur microben Text. / N. L. Sohngen // Zentraibl. Bacteriol. Parasitenkd. 1.fektionskr. Hyg. Abt. - 1913. - V. 37. - P. 595-609.

103. Stein, L. Y. Bacterial and archaeal populations associated with freshwaterferromanganous micronodules and sediments Text. / L. Y. Stein, M. T. La Due, T. J. Grundl, К. H. Nealson // Environ. Microbiol. - 2001. - V. 3. - № 1. - P. 10-18.

104. Sutherland, J. B. Metabolism of phenanthrene by Phanerochaetechrysosporium Text. / J. B. Sutherland, A. L. Selby, J. P. Freeman, F. E. Evans, C. E. Cerniglia//Appl. Envir. Microbiol. - 1991. -V. 57. - № 11. - P . 3310-3316.

105. Tolman, C. F. Biogenesis of hydrocarbon by diatoms Text. / C. F. Tolman// Econ. Geol. - 1927. - V. 22. - № 5. - P. 454-474.

106. Tor, J. M. Metabolism of organic compounds in anaerobic, hydrothermalsulphate-reducing marine sediments Text. / J. M. Tor, J. P. Amend, D. R. Lovley // Environ. Microbiol. - 2003. - V. 5. - P. 583-591.

107. Widdel, F. Anaerobic biodegradation of saturated and aromatichydrocarbons Text. / F. Widdel, R. Rabus // Curr. Opin. Biotechnol. - 2001. - V. 12. - P . 259-276.

108. Wolicka, D. The geomicrobiological role of sulphate-reducing bacteria inenvironments contaminated by petroleum products Text. / D. Wolicka, A. Borkowski // Geomicrobiology. - 2007. - V. 24. - P. 599-607.

109. Xu, M. Isolation and characterization of alkane hydroxylases from ametagenomic library of Pasiflc deep-sea sediment Text. / M. Xu, X. Xiao, F. Wang // Extremophiles. - 2008. - V. 12. - P. 255-262.

110. Yakimov, M. M. Obligate oil-degrading marine bacteria Text. / M. M.Yakimov, K. N. Timmis, P. N. Golyshin // Current Opinion Biotechnology. - 2007. V. 18.-P. 257-266.

Информация о работе

Ломакина, Анна Владимировна
кандидата биологических наук
Иркутск, 2010
ВАК 03.00.16

Диссертация

Исследование микробных сообществ в районах естественных выходов нефти на озере Байкал - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы