Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование методом ЭПР эндогенного свободного железа и белков сыворотки, контролирующих его активность

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование методом ЭПР эндогенного свободного железа и белков сыворотки, контролирующих его активность"

13 а и N 3 Й

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

НАУЧНО-ИССЛВДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ _ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ

На правах рукописи

ЕГОРОВ Дмитрий Юрьевич

УДК 577.334

Исследование методом ЭПР эндогенного свободного железа и белков сыворотки, контролирующих его активность.

Специальность 03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации ил соискание ученой степени кандидат» медицинских наук

Москва 1992

Работа выполнена в лаборатории биофизических основ патологии НИИ физика химической медицины МЗ Российской Федерации.

Научный ■руководи мель: доктор биологических наук,

профессор ОААзизова

Научны а консультант: кандидат биологических наук

А-В-Козлов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Защита диссертации состоитсл 9 сентября 1992 г. в на заседании специализированного ученого совета Д084.66.01 при НИИ физико химической медицины МЗ Российской Федерации по адресу 119828, Москва, Малая Пироговская, 2г

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ физико-химической медициш МЗ Российской Федерации

Ученый секретарь Совета,

кандидат биологических наук МА.Мурияа

ВЙСороксвой

доктор физико-математических наук, профессор Э1С.Рууге

Ведущая организация: Российский Государственный

медицинский университет

БИБЛИОТЕКА Общая характеристика работы.

Актуальность теми, В настоящее время не подвергается сомнениям значительная роль свободно-радикальных реакций в метаболических процессах, протекающих в организме как в норме, гак и в патологии. Исключительное место в этих реакциях, в том числе переписного окисления липидов (ПОЛ), принадлежит нонам железа. Для протекания процессов ПОЛ огромное значение имеют количество ионов железа, а также их степень окнслешя. Процессы Ре-ивдуцированного ПОЛ в сыворотке крови исследованы довольно подробно (например, методом хенилюминесцениии); в то же время каталитически активного железа в сыворотке обнаружить не удалось [СиЦепс^е & НаШгеП, 1985; Ког1оу е1 а!, 1991]. Этот факт, вообще говоря, ставит под сомнение возможность протекания таких процессов в организме и, соответственно, адекватность выводов об их механизмах Практически единственными источниками железа, откуда последнее может попасть в сыворотку, являются клетки эндотелия, крови и других органов, причем наибольшее количество Ге содержится в печени [во^ег е1 а!^ 1989). Учитывая это, можно предположить, что инициированное ионами железа ПОЛ может протекать на границе ткань-кровь, при выходе Ге из разрушающихся клеток. Однако, протекание таких процессов возможно только в том случае, если каталитически активное железо находится в клетках в форме Ге(П), я не менее, чем в ыикромолярных концентрациях.

Что же известно о внутриклеточном пуле каталитически активного железа? Известно, что в клетке существует так называемый транзитный пул железа, который, вероятно, является следствием процесса транспорта железа к местам синтеза железосодержащих белков. Именно составляющее этот пул железо и принимает непосредственное участие в процессах ПОЛ. Несмотря на то, что уже предпринимались попытки изучения железа, составляющего транзитный пул [Ванин, 1967; Тарасова, 1981; (Зоигег еЬ а!, 1989}, эта проблема остается малоизученной. В частности, количественный состав транзитного пула по данным разных авторов колеблется в широком диапазоне, а вопрос о валентности железа, входящего в его состав, вообще не изучался. Вместе с тем,

именно эти два показателя - количество и степень окисления - являются ключевыми дл участия железа в процессах ПОЛ, как, впрочем, и для понимания внутрихлеточног метаболизма железа.

Если в клетке содержится достаточное количество ионов Fea», то при £ разрушении, сопровождающем целый ряд патологических процессов, внутриклеточвс железо из жат попасть в кровь и активировать ПОЛ. Но здесь также возникает целы ряд невыясненных вопросов, в частности, каков вклад сывороточных балков в общу антиоксидантиую активность (АОА) крови, в том числе обусловленную инактавацкс ионов железа. Известно, что белкадерулоплазмин (ЦП) и трансферрин (ТФ) являои ведущей антиоксидантюй системой (АОС) крови; наиболее асе эффективным методе сценки АОА этой системы является метод ЭЛР (Козлов с соавт., 1990]. Однако до cía ni отсутствуют достаточно полные сведения о связи между параметрами сигналов ЭЛ ЦП и ТФ в сыворотке крови, и функциональными свойствами этих белке определяющих их АОА. Наряду с этим, антиоксидантные свойства пршшсьша! другому белку сыворотки - альбумину [Halliwell, 19881, однако конкретные неханш» его АОА ве известны.

В литературе отсутствуют какие-либо данные о формировании систему ЦП-ТО! раннем неонатальном периоде и влили ;ш на этот процесс перинатальной асфикы Кроме того, отсутствуют примеры использования измерения активности системы Ц ТФ для конкретных диагностических задач.

Цель и задачи исследования, [елью настоящей работы явилось выяснение дв вопросов: а) исследование состояния пула свободного эндогенного железа в пече крысы и б) изучение возможности протекания в сыворотке инициирован» эндогенным железом ПОЛ и механизмов его регуляции сывороточными белками в нор и патологии. Основными задачами исследования были:

1) Исследовать механизмы протекания реакций двух- и трехвалентного желез хелаторами в модельной системе при различных условиях.

а 2) Разработать способ одновременного определения Fe(n) и Fe(JII), яригодя для использования как в модельной системе, так. и в непрозрачных биологичес?

объектах, таких как гомогенаты тканей.

3) Определить количествен имя к вплентныЯ состав "трятитнпго" пула железа в печени крысы.

4) Выяснить г.озможный механизм Ре-илдуцироваиного ПОЛ в лшшдсодержащих компонентах сыворотки крови н роль альбумина в этом процесса

5) Выявить связь между параметрами сигналов ЭПР ЦП и ТФ в сыворотке крови и их антиоксидантныип свойствами.

6) Исследовать формирование системы ЦП-ТФ в раннем неонатальном периоде у здоровых новорожденных и на фоне перинатально!! асфиксии.

7) Изучить состояние системы ЦП-ТФ у больных ИБС на фоне гемосорбцнн с целью получения диагностически значимого критерия, определяющего необходимость проведения и прогноз эффективности гемосорбщюнного лечения.

Научная меняна. Показано, что при нейтральных рН аскорбиновая кислота (АК) ускоряет окисление FeCíl). При этом обнаружено формирование парамагнитных комплексов АК с трехвалентным железой. Доказано отсутствие подобных комплексов in vivo. Показано, что десферал (ДФ) резко ускоряет окисление ионов Fe(IIJ, причем необходимым участником реакции является кислород. В анаэробных условиях но наблюдалось окисления Fe(II) в присутствии ДФ.

Представлены ' экспериментальные факты, подтверждающие существование свободного железа в ткаш( печени крысы. Показано, что более 99% всего внутриклеточного свободного железа находится в восстановленном состоянии. Установлено, что в неразрушенной ткани печени крысы количество свободного эндогенного железа составляет 20 нмоль/г ткани.

Показано, что сывороточный альбумин полностью ингибирует Fe-зависимое окисление жирных кислот (ЖК), связанных с гам, и лишь частично ЖК в составе фосфолипидов липопротеинов, что свидетельствует о его второстепенной роли как антиоксиданта. Било выяснено, что сывороточный альбумин лишь частично инактивирует ионы железа; его АОА главным образом обусловлена просгран« ленной изоляциелЖКпионов железа.

Продемонстрировано наличие высокой корреляции между амплитудой сигнала ЭПР ЦГ1 и егоферроксидазной активностью в сыворотке крови.

Исследование процесса формирования системы ЦП-ТФ в раннем нвонатальнсш периоде показало, что в первые сутки жизни происходит резкое возрастание отношения ЦП/ТФ до нормальных значений (соответствующих таковым взрослых доноров) пс сравнении с плодами, у которых индекс Щ1/ТФ на порядок ниже. Это обусловлен увеличением амплитуды сигнала ЭПР ЦП и снижением амплитуды сигнала ЭПР ТФ Последнее связано с выходом железа из состава ТФ на фоне неизменного содержание апопротеина.

Установлено, что следствием перинатальной асфиксии является угнетение процесса формирования системы ЦИ-ТФ, причем этот эффект выражен тем сильнее чем продолжительнее и тяжелее протекала асфиксия.

Практическое значение работы. Впервые разработан метод одновременно!1! определения двух- н трехвалентного железа, пригодный для работы с прозрачными i непрозрачными объектами. Разработан новый метод определения ферроксидазно) активности ЦП в сыворотке крови, значительно превосходящий по свош характеристикам известные аналоги.

На основе метода ЭПР разработан критерий необходимости проведенм. гемосорбции: ее рекомендуется прово? .л ь, если исходная величина отношения ЦП/Т'< не превышает ОД

Апробация уаботи. Результаты работы были доложены на VII и VD Всесоюзных конференциях "Магнитный резонакае в биологии и медицине" (Звенигоро, 1989; 1990), IV Всесоюзном съезде патофизиологов (Кишинев, 1989), V Всемирно конгрессе патофизиологов (Москва, 1Э91).

Пубяикаиии. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 191 стр. машинописно! текста, включает 43 риг. и 15 табл. Состоит из введения, обзора литературы (б rnaî «■еодической части, экспериментальной части с обсуждением результатов (7 гла1 заключения и выводоа Библиографический указатель содержит 201 источник.

Обзор ллтерлтуры.

В обзоре рассмотрены следующие попроси: L Роль железа в процессах ПОЛ.

2. Метаболизм железа в организме,

3. Транзитный пул железа.

4. Аитиоксндаитиые компонента сыпоротки крови.

б. Уровень белков ЦП и ТФ при патологических процессах, б. Исследование системы ЦП-ТФ методом ЭПР.

Материалы и методы исследований

Для исследования содержания железа в цельной печени крысы орган перфузировали раствором десферала через воротную вену (крысу предварительно наркотизировали эфиром), затем готовили образцы для ЭПР-спектроскопии. Количество динитрозилышх комплексов в цельной печени определяли, обрабатывая ез нитритом натрия согласно Тарасовой с соавт. {1981}. Гомогенат печени готовили лябо в гомогенизаторе тефлон-стекло, либо растирали ткань в фарфоровой ступке при температуре жидкого азота.

Количество ТБК-активных продуктов а сыворотке крови, ее компонентах и растворах линоленовдй кислоты определяли по Mihara et aL {1980}. Ферроксидазную активность ЦП измеряли по Johnson et aL {1067]. Общую фракцию Л1Ш и ЛОНП выделяли из сыворотки крови согласно Burstein et al (1970!, а очищенную фракции ЛНП - ультрацентрифугированлем в градиенте плотности согласно Lindaren [1975]. Сигналы ЭПР регистрировали на радиоспектрометрах Varían Е-4 (США) я Jeol (Япония). Спектра поглощения и кинетики изменения оптической плотиогти записывали на спектрофотометре Bcckman DU-7 (США).

Клинические исследования больных ИБС и иоворояадешшх с перинатальной асфиксией проводили совместно с АсецкоО ИЛ. (НИИ физико-химической медшгшы) и Павловой ТА (2-й МОЛГМИ им. НШТирогокО.

Статистическую обра&пку, графическое и текстовое представление материала

диссертации осуществляли на мини-ЭВМ EMG-666 (Венгрия), ШС Арр1е-2е (США) и AT 386/387 (Тайвань) с использованием дигитайзера Oscon SQ-3100F (Япония) и ЛПУ Epson GQ-5000 (Япония)

Экспериментальная часть.

Глава 1, Изучение условий взаимодействия свободного железа с хелатоуами 0 мюЯельиой системе. Фенантролин (ФЕН) в трис-буфере при нейтральных рН образует окрашенный комплекс с Fea+. Этот комплекс имеет максимум поглощения 510 нм и коэффициент молярной экстикции 10931 M-icm-i. ФЕН полностью реагирует с Fe> за время, меньшее чем 10 сек. Если вместо Fe2* в систему внести ионы то образовали« окрашенного комплекса не происходит. Использование ФЕН для изучения зависимости дииамики автоокисления Fe2+ от pli реакционной среды показало, что при-защелачивашш среды скорость аатоокисления ферро-лонов увеличивается. Важно отметить, что в кислой среде, уже при рН 6,4, двухвалентное железо практически не окисляется.

При добавлении в систему, содержащую Fe> и ФЕН при нейтральных рН, аскорбиновой кислоты (АК), наблюдается постепенное повышение величины оптической плотности с длиной волны 510 нм, свидетельствующее об образовании комплексов ФЕН с Fes». Восстановление ?с-ь аскорбиновой кислотой протекает 'достаточно медленно -через 20 ит после добавления AIC восстанавливается около 20% железа. При изменении порядса введения реагентов в систем v, т.е. сначала Fe3* и АК, а затем спустя некоторое время ФЕН, наблюдается мгновенно регистрируемый скачок оптической плотности при 510 им, и далее медленное увеличение оптической плотности. Этот скачок обусловлен появлением в системе к моменту добавления ФЕН какого-то количества ферро-иопоз, восстановленных из Fe3* под действием АК.

Неожиданным оказался эффект АК на динамику авгоокнсления Fe^*. Если при кислых рН (6,1) в среде не наблюдалось окисления железа как в отсутствие, так и в присутствия АК, то при рН 7,4 в присутствии АК окисление ферро-ионов происходило ке медленнее, как следовало ожидать, исходя из восстановительных свойств аскорбата,

а наоборот быстрее, чем в ее отсутствие. Наиболее просты!! объяснением наблюдавшихся фактов является предположение, согласно которму АК способна образовывать комплексы как с двух-, так и с трехвалентным железом, причем комплекс с Fe2* в присутствии кислорода может переходить в комплекс с F«» и наоборот.

Действительно, используя мегод ЭПР, удалось обнаружить комплексы АК с железом (рис.1). Эти комплексы обладают сккглетным сигналом ЭПР с g-4,3; следовательно железо в чх составе находится в форме Проведенное сравнение этого сигнала с сигналом ЭПР гомогената нативяоП печени крксы показало их различное происхождение. Учитывая также некоторое другие обстоятельства, можно заклзочитиь, что in vivo комплексы АК с железом на существуют.

Рис. 1. Сигнал ЭПР раствора, содержащего 100 мкМ 1 мМ

аскорбиновой киглоты в 20 мМ трис-буфере ври рН 7,4 (1); то же после добавления 1 мМ ФЕН (2) или зачисления среды до рН 6,1 (3); сигнал ЭПР гомогената интактяой печени крысы, записанного при том зке усилении (4).

При добавлении трехвалентного железа к раствору десферала (ДФ) в трис-буфере при нейтральных рН наблюдается формирование окрашенного продукта. Спектр этого соединения имеет максимум поглощения 430 нм и коэффициент молярной экстинкции 2865 M-icm-i. Продолжительность образования комплекса, как и в случае с ФЕН, не превышает 10 сек. Однако, если к этой же системе добавить не Fe3+, a Fez*, то будет наблюдаться точно такая же картина. Исследование методом ЭПР образовавшихся комплексов ДФ с железом показало, что в обоих случаях регистрируется сигнал ЭПР с {р-4,3, описанный Козловым с соавт. [1989] для модельного комплекса ДФ с Fe3*. Этот факт доказывает, что в обоих случаях* в состав комплекса с ДФ входит трехвалентное железо. Вероятно, столь быстрая кинетика формирования комплекса ДФ-Fes* при добавлении Fe2* обусловлена тем, что ДФ еще более сильно смещает равновесие в реакции автоокисления железа вправо:

Fez* + 02 <—->: Fea* + 02

Так как данная реакция является кислородзависиыой, можно предположить, что анаэробные условия скажутся на скорости окисления Fe2» в присутствии ДФ. Действительно, после предварительного вакуумирования образца до 1-3*10-4 атм введение ДФ не приводило к повышению оптической плотности при 430 нм (рис.2). Лишь впуск воздуха в систему приводил к ускорению окисления ферро-ионов, а значит и к образованию окрашенного комплекса с ДФ.

ГлаваЗ. Разработка способа одновременного определения Feflf) u Fe(IIJ) в моделъша системе. Наложенные в предыдущей главе результаты свидетельствуют о том, что при введении ФЕН в систему, содержащую Fez* Тез*, в отсутствие восстановителей будет определяться только двухвалентное железо. В то же время, при введении ДФ, за счет быстрого окисления ферро-ионов, будет определяться суммарное количество железа. Концентрации этих хелаторов были подобраны таким образом, чтобы при их одновременном добавлении к системе ионы Fe*+ реапгровали только с ДФ, а иоиы Fez*, не успевая повергнуться окислению, только с ФЕН. В результате

образуется смесь комплексов ФЕН-Гег* и ДФ-Рез*. Спектр поглощения этоЯ смеси представляет собоП суперпозицию индивидуальных спектров поглощения каждого комплекса. Соответствующая математическая обработка суммарного спектра позволяет вычленить вклад каждого комплекса и, таким образом, определить концентрации ферро- и ферри-ионов. Было показано, что в диапазоне концентрации железа от 10 до 100 мкМ в трис-буфере подобныП подход позволяет достаточно точно определять концентрации как Ре2% так и Рез*.

Время (мин)

Рис. 2. Влияние анаэробных и аэробных условий на образование комплексов ДФ с железом, в образцах, содержащих Fe2"* в трис-буфере.

Однако, слектрофотометрическое определение непригодно для работы с мутными образцами, каковыми являются гомогенаты тканей. Поскольку комплекс ФЕН-Fea* непарамагнитен, был использован следующий подход. Исследуемый образец делили на две части. К одноЯ добавляли только ДФ, к другой - смесь ДФ с ФЕН. В первом случае по интенсивности сигналя ЭПР определяли суммарное количество железа, во гтором -только количество Fes-. Количество Fe2» рассчитывали по разнице этих t

экспериментально определенных величии. Используя данный подход, экспериментально установлено хорошее соответствие реальных и измеренных концентраций ферро- и ферри-ионов в ыоделышх образцах в диапазоне концентраций 10-100 мкМ.

Глава 3, Определение свободного железо, в печени куыси. Используя в качестве хелаторов ДФ и КаК02 (последний образует с двухвалентным железом и вН-группами парамагнитные дннитрозильные комплексы с g-2,03), исследовали процесс формирования комплексов железа в гоыогенате печени. Выло обнаружено, что в обоих случаях он имеет двухфазный характер (рис.3). В первую фазу происходит быстрое нарастание амплитуды сигналов ЭПР как в случае ДФ, так и КаКО^ Продолжительность этой фазы составляет 1-2 мин. Именно в это время, как мы полагаем, с хелатораыи связывается подавляющая часть свободного внутриклеточного железа. Вторая фаза - существенно медленнее, увеличение интенсивности сигналов ЭПР незначительно. Вероятно, последнее обусловлено вытягиванием железа из состава клеточных Ре-содерасащих Селков, например ферритина. Используя калибровочны« зависимости, были определены концентрации внутршслеточного железа как I гоыогенате, так и в цельной печени (к.ол.1).

Таблица 1. Количества свободного эндогенного железа (ныоль/г ткани) в гоыогенате I цельной печени крысы.

объект обработка ДФ обработка «аШг

гошгенат

печени 38 + 2 52 + 3

цельная

печень 20 + 4 33 + 5

Как следует из таблицы, в цельной печени определяется меньше железа, чем гоыогенате. Скорее всего, это обусловлено процедурой фракционирования ткани нр приготовлении гомогената, что приводит к частичному выходу железа 1

депонированного состояния. В то же время, исходя из данных, представленных в таблице, в клетке содержатся как ионы Ре2% так и Ге-"", причем приблизительно в одинаковых количествах.

200

t[ 150

ш

g 100

о

Í 50

а

О

Рве. 3. Динамика изменения иитеясивяостя сигналов ЭПР гомогевата печени крысы после добавления NaN02 или ДФ.

Однако, при добавлении к гомогенагу печени, предварительно проинкубированному с ДФ или нитритом натрия, экзогенного железа, был получен, на первыП взгляд, несколько неожиданный результат. Оказалось, что как при добавлении Fes*, так и Fe3+, наблюдается одинаковый прирост интенсивности сигналов ЭПР, притом независимо от того, какой хелзтор был предварительно добавлен Подобный результат можно объяснить только возможностью быстрого перехода в клетке ионов железа из

Время, мин

■ одной степени окисления в другую.

Для выяснения вопроса, в каком же валентном состоянии находит« внутриклеточное свободное железо, был использован метод, специально для этой цел! разработанный и описанный в главе 2. Для максимально возможного предотвращен!» окислительно-восстановительных процессов в ходе гомогенизации последам проводили при температуре жидкого азота. Полученные порошкообразные образць ткани печени делили на три части: к первой добавляли только ДФ, ко второй - смес: ДФ и ФЕН, к третьей (контрольной) - буфер. В первом случае наблюдался интенсивны! сигнал ЭПР с £=4,3 (рис.4). Во втором и третьем случаях интенсивности сигналов ЭП] практически не различались. Это означает, что практически все свободное железо печени крысы находится в форма Ее2+. Статистическая обработка данног эксперимента позволила определить концентрации Ге2» и Рез* в печени крысы соответственно 22,2+7,6 и 0,2+1,7 ниоль/г ткани. Важно отметить, что общее количеств железа, составившее 22,4+8,3 кмоль/г ткани, хорошо совпало с таковым, получении для цельной ткани (табл.1). Можно объяснить и то, почему по нитрозильиьш комплекса железа определяется больше, чем по ДФ. Мы полагаем, что при инкубации с нитрита натрия происходит резкое нарушение осмотического равновесия в клетке (конечна концентрация достигает 0,8 М), вследствие чего в свободное состояш

переходит железо, обычно жестко закрепленное в мембранных коыпартментах ш других сайтах клетки

Глаш Л. Исследование антиоксид&нтпых свопств сывороточно альбумина,. Субстратом ПОЛ в сыворотке крови могут быть ЖК в составе альбумина фосфолипиды, входящие в состав лилопротеинов. При инкубации ллноленовой кисла (ЛК) и ЛИГ в присутствии железа и АК в обоих случаях наблюдается заметн увеличение концентрации ТБК-активных продуктов (табл.2). Добавление БСА физиологической концентрации (24 г/л) к растворам ЛК и ЛИП приводило к поч полнму ингибированню процессов перекисного окисления ЛК и к существенному ( далеко не полному) ингибированню накопления ТБК-активных продуктов в Л Ш1.

^ ЯГ =

Ряс. 4. Сигналы ЭПР гомогената печени крысы, приготовленного яа буфере, содержащем ДФ (1), смесь ДФ-ФЕН (2) и не содержащем хелатори (3).

Таблица 2. Зависимость концентрации ТБК-активных продуктов (в мкМ МДА) от времени инкубации образцов в яселезо-аскорбатной система

субстрат Омин 15 мин 5 час

ЛНП 1,04+0,03 5,84+0,30 10,9+0,6

ЛК 1,33+0,05 1,85+0Д8 15,7+0,2

ЛНП + БСА 2,49+0,06 3,77+0,07 5,44+0 Д2

ЛК+БСА 2,08+0,03 ЗД4+0,04 3,20+0,05

ВСА 1,67+0,01 1,71+0,01 1,73+0,01

Полученные результаты позволили сделать предположение, что разница в скорости ПОЛ в различных случаях связана с разной доступностью ЖК для ионов железа. Для проверки этой гипотезы исследовали доступность ферро-ионов для спин-меченой ЖК (СМЖК). Степень доступности оценивали по скорости восстановления шггроксильного фрагмента СМЖК, последний определяли по уменьшению амплитуды центральной компоненты сигнала ЭПР СМЖК. В отсутствие железа восстановлен!« СМЖК не отмечалось ни в одном из образцов (рис.5) Добавление к СМЖК ферро-ионм приводило к мгновенному исчезновению сигнала, что свидетельствовало о высоко! доступности СМЖК для ионов железа В присутствии ЛИП скорость воссстановленш метки существенно замедлялась (рис.5), однако оставалась достаточно высокой. Чт< касается БСА, то в его присутствии восстановление СМЖК практически полдасты тормозилось. Полученные результаты свидетельствуют о том, что СМЖК наимене доступна ионам железа именно в составе сывороточного альбумина.

Был исследован еще один возможный механизм АОА сывороточного альбумин! Изучали возможность связывания альбумином продуктов ИОЛ, которые, таки образом, выводятся из сферы реакций разветвления цепей. Было показано, что БС. эффективно связывает продукты окисления ЛК Однако, также было установлено, 41 БСА не способен связывать продукты окисления ЖК, входящих в состав фоефолгшндс

лнп.

Таким образом, аятшксидангные свойства сывороточного альбуши обусловлены в основном пространственной изоляцией ЖК и ионов железа.

Глава 5. Связь параметров сигналов ЭПР ПП и ТФ в сыворотке куоеи с г антпиоксиданткими сеоИгтеами. Сигнал ЭПР ТФ наливной сыворотки кро отражает количество ТФ, связанного с железом При насыщении сыворотки избытк железа происходит увеличение амплитуда сигнала ТФ, которое соответству количеству общего ТФ. Таким образом, используя нативную и нагруженную яселез сыворотки, можно определить количества Ре-ТФ, общего ТФ и степень насыщения 1 жтеаом.

-1—1—1—г—1—I—I—1—|—1—I—.—[—I—1—Г—1—1—I—1—|—г

~ О 2 4 6 8 10

Время, мин

РпС-5. Кияетикп восстановления СМЗКК, находящейся в тряс-буфгре (звездочки); СМЖК, встроенной в альбумин (кружочки) и СМЗКК, зстроеяиой в ЛНП (квадратики) в отспств!,е ясяов железа (1-3) и э присутствии 1 мИ (4-6).

Основной вклад в АОА сывороточного ЦП вносит его ферроксидазная активности Вил разработан новый метод определения феррсксндазной активности ЦП. Ои заключается в прямом измерении скорости окисления нонов Ге2* под влиянием ЦП, регистрируемо!! по образованию комплекса ФЕИ с иеокислившзшся железом Предложенный метод оказался значительно чувствительнее; прэлце к удобнее по сравнению с известными аналогами. Было осуществлено еравнонш интенсивности сигнала ЭПР ЦП в сыворотке крови с его ферронсидазноЯ активностью. Показано наличие достаточно высокоП корреляции (г-0,83) кезду зтшш параметрами. Таити образом, интенсивность сигнала ЭПР ЦП хорошо отражает АОА этого белка.

В качестве параметра, оценивающего общую АОА системы ЦП-ТФ, использовалось предложенное Козловым [1985] отношение интенсивностей сигналов ЭПР ЦП/ТФ. Амплитуда сигнала ЭПР ЦП находится в числителе, так как с ее повышением растет и АОА ЦП. Как уже отмечалось выше, интенсивность сигнала ЭПР ТФ в наивной сыворотке отражает количество связанного с железом ТФ. Чем больше амплитуда этого сигнала, тем больше концентрация Ре-ТФ в сыворотке, теь соответствемо меньше количество апо-ТФ, который и проявляет антиоксидантны,-свойства. Именно поэтому интенсивность сигнала ЭПР ТФ в нагивной сыворотк; находится в знаменателе антиокеидантного индекса ЦП/ТФ.

Глава, 6. Исследование состояния системы ЦП-ТФ у здоровых и уождепиы; о асфиксии ветел в первую неделю жги ни. Методом ЭПР был исследован процес формирования системы Щ1-ТФ у 60 здоровых плодов и новорожденных. Оказалось, чт интенсивность сигнала ЭПР ЦП постепенно повышается, и на 5 сутки жизни вдвс превышает таковой показатель у плодов (составляя примерно половину от это величины у взрослых доноров). В отличие от ЦП, максимальный уровеп интенсивности сигнала ЭПР ТФ наблюдается у плодов, а уже па первые сутки жизни о резко, почти в 4 раза падает. В дальнейшем интенсивность этого сигнала растет достигая к 5 суткам 60-70 % от уровня здоровых взрослых. Проведенные в нагруженнс железом сыворотке измерения ампилтуды сигнала ЭПР ТФ показали, ч го подобнь колебания интенсивности сигнала ЭПР в вативдай сыворотке обусловлены главки образом выходом железа из состава ТФ (степень насыщения ТФ железом снижается 55% у плодов до 17% у новорождешшх первых суток жизни). Количество общего ТФ щ этом достоверно не меняется.

Что касается дшаыкки измеиеиия индекса ЦП/ТФ, то эта вешгшна очень кала плодов, однако уже на первые сутки жизни достигает значений взрослых доноров,» дальнейшем практически не меняется. Это позволяет считать, что формирован аитиоксидантной системы ЦП-ТФ происходмтвпервыедни жизни ребенка.

Перинатальная асфиксия существенным образом влияет на прощ

формирования системы Щ1-ТФ. Если величина индекса ЦП/ТФ у плодов не меняется, то у детей 1 суток жизни, перенесших асфиксию, on а более чем в 2 раза ниже, чем у здоровых новорожденных Интересно отметить, что динамика изменения отношения ДП/ТФ в перпуо недели жизни достоверно не зависит от степени тяжести перенесенной асфиксии. Однако, на фоне лечения антиоксидантами, у детей с асфиксией легкой степени уже на первые сутки жизни происходит нормализация индекса ЦП/ТФ. При асфиксии средней тяжести отношение ЦП/ТФ нормализуется на 3-5 сутки жизни. II только лишь у детей, перенесших асфиксию в тяжелой форме (2-4 балла по шеале Ангар), даже на 5 сутки величина ЦП/ТФ сохраняется достоверно нижа нормы.

Полученные данные убедительно свидетельствуют о большой значимости С0СЮЯШ1Я ангиокендантних систем организма для тя:кести протекания патологического процесса в неонатальноы периоде. Индекс ЦП/ТФ хорошо коррелирует с тяжестью состояния больных и, особенно, эффективностью проводимой терапии, и может выступать контролем последней.

Глава 7. Исследование состояния систему, ЦЛ-ТФ у вольных ИБС до и уослв гелюсорбцпи. 33 больных ИБС были разделены на три группы по величина исходного отношения ЦП/ТФ. В первую группу вошли больные с отношением 0,8 и ниже, го вторую - с отношением от 0,8 до 1,5, и в треть» - свыше 1Д Всем больным был проведен однократный сеанс гемосорбционного лечения (использовался неселективный угольный сорбент); на 7 сутки после сеанса ГС было осуществлено повторное определение показателей системы ЦП-ТФ.

Оказалось, что в целом параметры системы ЦП-ТФ после гемосорбции имеют выраже1гаую тенденщю к нормализации (табл.3). Так например, в первой группе индекс ЦП/ТФ вырос почта а 2,5 раза, а в третьей, наоборот, снизился вдпое. Во второй группе достоверных язменетшй отношения ЦП/ТФ не произошло. Важнейшим обстоятельством сказалось то, что изменение состояния системы ЦП-ТФ хорошо соответствовали динамике клинического состояния больных. Taie например, у больных

1 группы более чем в 3 раза уменьшилось число приступов стенокардии, в 4 разл сократился ежедневный прием таблеток нитроглицерина, на 70 % улучшили« показатели велозргометрли (табл.3). Во второй группе также отмечалось улучишш; клинического состояния больных, хотя и менее выраженное, чем в первой группе. I третьей группе нн по одному из клинических признаков не было отмечено улучшения,; у двух больных из этой группы даже наступило серьезное ухудшение клиническоп состояния. Интересно отметить, что если у больных 1-й и 2-й групп количество ТБК активных продуктов в сыворотке крови не менялось, то в 3-й группе отмечалоа небольшое, но достоверное повышение их количества.

Таблица 3. Влияние гемосорбции на состояние системы ЦП-ТФ и клинически показатели у больных ИБС (в % к исходному уровню).

Показатели 1 группа 2группа 3группа

Исходная величина >1,5

отношения ЦП/ТФ <0,8 0,8 -1,5

Амплитуда сигнала ЭПР ЦП 183 ,94 83

Амплитуда сигнала ЭПР ТФ

77 74 134

Индекс 50

ЦП/ТФ 235 127

Количество ТБК-актшэдых

продуктов в сыворотке 93 108 131

Число приступов 27 57 100

стенокардии

Ежедневный прием 44 117

таблеток нитроглицерина 24

Показатели 102

велоэргометрии 169 131

Полученные результаты позволили на основе метода ЭПР разработать следуют! критерий необходимости проведения гемосорбции у больных ИБС. Гемосорбцион» лечение рекомендуется больным с исходно низким отношением ЦП/ТФ (не выше 0,8), однозначно не рекомендуется больным с исходной величиной индекса ЦП/ТФ 1,5 выше.

Выводы.

1 Обнаружено, что при нейтральных рН десферал и аскорбиновая кислота ускоряют окисление ионов железа, причем и в том и другом случае образуются парамагнитные комплексы Ге(Ш). Однако, п гоыогенате печени крысы комплексы железа с аскорбатом обнаружены не были.

2. Разработан метод одновременного определения ферро- и ферри-иопов в прозрач1шх и непрозрачных биологических объектах с помощь» смеси хелаторов десферал/фенантролин.

Ч. Показано, что количество свободного железа в гоыогенате печени крысы составляет 22,4+8,3 нмоль/г ткани. Установлено, что не менее 99% свободного внутриклеточного железа находится в двухвалентной форма

4. Показано, что антЖпсеидантные свойства сывороточного альбумина обусловлены в основном пространственной изоляцией жирных кислот и ионов железа, , и лишь в меньшей степени инактивацией иолов железа.

5. Разработан способ определения феррсксидазной активности церулоплазмина. Показано наличие высокой корреляции между интенсивностью сигнала ЭПР церулоплазмгаи и ферроксидазиой активностью в сыворотке крови.

6. Показано, что антиоксидантная система сыворотки крови ЦП-ТФ формируется в первую неделю жизни ребешеа, причем у детей, перенесших перинатальную асфиксию, ее формирование замедленно.

7. Показано, что благоприятный эффект гемосорбции у больных ИБС наблюдается только й том случае, если исходная величина отношения ЦП/ТФ ре превышала 0,8. Следствием гемосорбции является увеличение этого параметра до нормальных значений.

Список публикаций по теме диссертации.

1. Динамика изменения состояния антиоксидаитпой системы церулоплазмин-трансферрин в неонатальном периоде. В сб.: Тез. VII Всес. конф. "Маги, резонанс в биол. и мед.", Звенигород, 1989, стр. 93-94 (в соавт. с Павловой ТА, Козловым A.B., Азизовой ОЛ Щалиной Р.И., Владимировым ЮЛ.).

2. Изучение методом ЭПР природы внутриклеточного свободного железа, связываемого десфералом. Там же, стр. 97-98 ( в соавт. с Козловым A.B., Азизовой OA, Владимировым ЮА).

3. Антиоксидантная система церулоплазмин-трансферрин при патологических процессах: защитная функция, способы коррекции. В сб.: Тез. докл. IV Всес. ссъезда патофизиологов, Кишинев, 1989, т.2, стр. 534 (в соавт. с Козловым A.B., Азизовой OA, Владимировым ЮА, Павловой ТА).

4. Патогенетическая роль эндогенного свободного яселеза и способы его выведения из клетки. Там же, стр. 535 (в соавт с. Козловым A.B., Владимировым ЮА).

5. Исследование методом ЭПР Состояния антиоксидаитной системы сыворотки крови церулоплазмин-трансферрин у больны: ИБС до и после геыосорбции. В сб.: Тез. VIII Всес. конф. "Маги, резонанс в биол. и мед.", Звенигород, 1980, стр. 73. (В соавт. с Асеакой И.Л., Азизовой OA, Козловым AB., Маркиным С.С.).

G. Исследование методом ЭПР пула свободпого эндогенного железа в биологических образцах. Там же, стр. 20 (в соавт. с Азизовой OA, Козловый A.B.).

7. Механизм взаимодействия десферала с ионами Fe^+ в присутствии кислорода воздуха. Журн. физ. химии, 1990, т.64, Ш, стр. 225-227 (в соавт. с Козловым АВ„ Владимировым ЮА, Азизовой OA).

8. Образование комплексов железа с аскорбиновой кислотой в физиологических условиях in vitro и в ткани in vivo. Биофизика, 1930, т.35, вып.З, стр. 513-517. (в соавт. с Козловым AB., Владимировым ЮА, AsnaoBjfl OA).

9. Структурно-функциональные свойства клеточных мембран у детей в период ранней физиологической адаптации. Вопр. охраны материнства и детства, 1990, МЗ, стр. 70-74. (в соавт. с Павловой ТА, Салмановой Л.В., Шалиной Р.И., Азизовой OA, Козловым A.B.).

10. Антиоксидантная система церулоплазния-трансферрив при атеросклерозе в эксперименте и клинике. Вестник АМН СССР, 1990, Ж2, стр. 41-45. (в соавт. с Асецкой ИЛ., Козловым AB., Наливайко Е.С., Маркиным С.С., Сергиенко В.И., Азизовой OA, Владимировым ЮА, Лопухиным Ю.М.).

11. Структурно-функциональные свойства эритроцитарных мембран у детей, родившихся i асфиксии. Акушерство к гинекология, 1991, Ш, стр. 37-40. (в соавт. с Павловой ТА, Шалино{ Р.И., Казаковой Л.Е., Азизовой OA).

12. Intracellular free iron and lipid peroxidation in rat liver during ischemia anc reoxygenation. In: Abstr. Const Congr. Intern. Soc. Pathophysiol., Moscow, 1991, p. 233. (в соавт. с Козловым A.B., Азизовой OA, Владимировым ЮА).