Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Cu,Zn-супероксиддисмутаза и новые системы продуцирования активных соединений кислорода

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Cu,Zn-супероксиддисмутаза и новые системы продуцирования активных соединений кислорода"

ргв оа

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК АРМЕНИИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. Г.Х.БУШГОША

На правах рукописи

СИМОНЯН МАКСИМ АРШАЛУЙСОВИЧ

УДК 577.152.1., 577.159., 577.23

Си,2п - СУПЕРОКСВДДИСМУТАЗА И НОВЫЕ СИСТЕМЫ ПРОДУЦИРОВАНИЯ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЯ КИСЛОРОДА

оз• о о & у

Специальность: Г.00.03 - БИОХИМИЯ

Диссертация на соискание ученой степе™ доктора биологических наук (в виде научного доклада)

ЕРЕВАН - 1996

л.иа1шиъ|1 «шппрзпмллзгь вдчизм шитиш 2,.I». РПМ»МЦ>Зи,01» тмиъ 1ЮМД№МГШ311 М^^ПМ

ШП 577.152.1., 577.159., 577.28

Ои,2п-ипмьго^итт-ьииппБияс ЬЧ РЭЧигг'Ы!

ипиагтэзппшггъ чпзивииъ Ы1Г ^шшшгчсгс

1Гши\1Ич1шп1.р-|т.11[1ч 1.00.09 - ^ЬЪишр^иЦрш

II и Ь 1т [( л и т р ] т. 1)

ЦЬЪОшршЪшЦшЪ ефвш|.|9,|П|.1|ЪЬр|1 |>п1^шпр[1 шивфТЗшЪ Чв^дЬ^т. ЯпиГшр

Ьгъчиъ - 1996

Работа выполнена в Институте биохимии Национальной Академии наук Республики Армения им. Г.Х.Бунятяна

Официальные опоненты: академик HAH РА, профессор

Давтян Мисак Артемович

доктор биологических наук, профессор Хачатрян Габриел Самсонович

доктор биологических наук, профессор Баджинян Сергей Ашотович

Ведущая организация: Ереванский Государственный Медицинский

Университет, кафедра общей химии и биофизики

Защита состоится 1996г в час.

на заседании Специализированного Совета 042 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте биохимии (375044, Ереван, ул. П.Севака 5/1) по специальности Г- 00.03 "Биохимия".

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии HAH Республики Армения.

Диссертация разослана " О 6_ 1996г.

Ученый секретарь Специализированного Совета,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

3 последние десятилетия надевды на успешное использование повышенного давления кислорода в целях лечения были в значительной мере разрушены универсальной токсичностью кислорода. С другой стороны из-за необходимости проведения подводных, подземных, космических- работ и строительства люди вынуждены находиться в атмосфере сжатого воздуха, в результате чего возникают такие физиологические явления, как азотный наркоз и кислородное отравление. Эти обстоятельства вызвали большой интерес к токсичности кислорода и появление большого числа соответствующих публикаций (Gottlieb S.P., 1971., Gilberfc L., 1972., Fridovich I., 1982-1985., Marklund S.L., 1986., Valentine J.D., 1982., Eenson P.M., 1987., Kettle A.J., 1993-, Tsan M.P., 1993«, Chary P.,1995).

Выяснилось, что кислород токсичен не из-за своей собственной реакционной способности, а вследствие того, что его восстановление до воды вызывает протекание ряда процессов одноэлек-тронного переноса, в ходе которых возникают чрезвычайно реакцион-носпособные интермедиаты Г'супероксидный радикал (О^-), син-глетный кислород^), гидроксильный радикал (НО'), перекись водорода (HgOg) и т.д., которые и, в основном, являются причиной токсичности кислорода. Or,"", как продукт одноэлектронного восстановления кислорода, в свою очередь способен взаимодействовать с HgOg, давая гидроксильный радикал и гидроксильный ион. В водных растворах это происходит в результате прямого взаимодействия (Ozawa Т.1978): 02~ +' HgOg -*■ НО' + НО" + Og.

Поиск и изучение систем, состоящих из указанных активных соединений кислорода,имеет важное значение. Существует большое число реакций небиологического и биологического окисления --спонтанных, каталитических (ферментативных), в ходе которых образуется Og^Fridovich 1.1974); В литературе приведены различные методы получения О.,-: катодное восстановление Og в апро-тонных растворителях (Maride D., 1965., Sawyer D.,1966 ) или в воде (Chevalet J.1972 )«восстановление кислорода гвдратиро-ванными электронами, образующимися при фотолизе (Adams G.e. et.al, 1965., UcCord ti., 1973 ). радиолизе(Czapaku G. 1963., Habani J.,

1963) или под действием ультразвука на воду (дпЪаг Ы. et.al,

1964), восстановление Og карбанионами (ьеВегге A. et .al, 1962). восстановленными красителями или флавинами (Massey V. et al., 1972. McCord J., 1970 ), катехинами (Misra H.P. et aJ¿972),

пирогаллолом (Marclund В. L., 1574- ) или гемопротеинами (Wa-wer E.et а1,1973), а также окисление HgO^ ионами четырехвалентного церия (Saito E.et all961). O2"" образуется при синтезе окиси азота в мозгу (Рои S. et а1,1992). Основными источниками продуцирования С>2~ в биоснстемах являются ФАД-содержащив, НАДН или НАДОН-завнсимые оксидоредкутазы с различной субстратной специфичностью (цитохромы Ъ^, С, P45Q, ъ55в» хиноны и др.), локализованные в мембранах эритроцитов (Kumar K.S. et al,1973), в адрах (Peekin A.V.et al, 1986), митохондриях (Eashba Г. 1989), эвдотелиальных клетках (Freeman B.A.et al, 1936), микросомах (Maano M.et al, 1985),"пероксисомах (Delrio L.A. et al, 19S9)» хлоропластах (¡¿ikhs.ylik о.ы. ,1987), в мембранах форменных элементов плазмы: лимфоцитов (Drozd M.et al., 1987). гранулоцитов (Cohen H.J. 1982). моноцитов (Scully S.P. et а1.,198б), фагоцитов (йова! i.,1986)» макрофагов (ionaan H.P.I98O), РШ-лей-коцнтбВ Ciakeyama H.et al., 1982), нейтрофилов (Dore M.et a 990)• Oo~ продуцируются не только внутри, но и во внеклеточных пространствах (Hassan Н.Ы. et al,1979) В Ksch.erich.ia coli И В МОЗГОВЫХ жидкостях, при усилении синтеза простагландина у кошек (Koatos Н.А. et al.,1985)» при воздействии Og с гистаминами Ciaraok I. at al.,1987). Однако, до сих пор в сыворотке крови, в мембранах эритроцитов еще не обнаружены субстраты цитохромно-го характера, участвуйте в процессе продуцирования В био-скстемах иногда возникает необходимость образования сразу нескольких типов активных соединений кислорода, так Og" и H^Og образуются в IMH-лейкоцитах feaawey J.A., qt а1,1979>» Jakett P.S., et al, 1981, Cadecae В. et al,1977), при взаимодействии нитрита с гемоглобином (Batenabe S.et al, 1981). В макрофагах происходи? увеличение образования внеклеточных НО" при воздействии железа (oiakanmi O.et al., 1993)- Процесс образования макрофагами и HgOg усиливается при инфекционных заболеваниях (Kiaura 5.В. et al 1У93). Метил глиоксал также является источником образования Oj>~ и НО" (iazal F.et al., 1994). Супероксвд-завися-щее обраэованке НО" катализируется транеферрином (Uotohaahi ы., et «1,1983). Моноцитами периферической крови интенсивно образуются 02~ я Hg02 при проказе (Sharp A.K.et al.,1985). При анонсам и реокснгенацвн НО* образуются в микроеомах мозга (Gram-пив Р. et al.,1993). О2", НО", HgO-, генерируются в митохондриях сердца (Doroehow J.H. et al.,1986). Супероксид-записяаее образование НО* происходит в присутствии комплексных солей колеза ¿uttarid^e J.U.C., 1990), при окислении п€'ок<глп,аз (Halliw«ll В., 1977 ). Под действием светь геыатопорфиргли продуцируют Og-

и НО* (Buettner G.R.et al, 1980 ). При спонтанном перекиснои окислении липидов сперматозоида человека образуется Н2О2 и О^-(Alvarez J.G. 1987). Факт участия железа при образования активных соединений кислорода заслуживает большого внимания. H^Og является первичным продуктом восстановления кислорода на многих оксвдазах, которые в большинстве локализованы в пероясясо-Maxf и присутствие в этих частицах больших концентраций катала-зы приводит к ее нейтрализации. Образование перекиси водорода было установлено в суспензии макросом, хлоропластов пр:« действии света, митоховдрий, срезов печени (Portwich F.1950), з последней на образование перекиси водорода идет 1,74$ от суммарного поглощения этим органом кяслорпда|и стационарная концентрация HgOg мояет мэнятвся от 10"^ до 10"^ кзоль/л (Oahlno H.,

1973). генерируется в ходе фагоцитоза (Paul B.l9s8,Bray н.О.

1974) и аэробными микроорганизмами, чтобы это препятствовало развитии других организмов.

Перекись водорода давно считали цнтотоксическкм соединенней, и все аэробные организмы для защиты от нее содержат каталазу. Н2О2 в низких концентрациях вызывает потерю способности срезов мозга крыс к потреблению 6-оксидопаикна (HeiidcUa H., et. al.,

1972), а также вызывает лизис эритроцитов (stocka J. il., et al.,

1973). Если то, что Н2О2 токсичен, является очэвядкын, то механизм токсичности не ясен. Хотя известно, что HgOg етвет вызывать окисление сульфгидряльных соединений (Little С.et als 1967) и метнонильных остатков белков (Little С.et al.,1969). Ь^О., моаэт вызывать н перекисное окисление полпненасыщенных гарных кислот, хотя содержание перекиси в условиях in vivo меньше. Возможно, что H¡¡p2 опасна не из-за возможности прямого взаимодействия с компонентами клетки, а скорее потому, что она^реагируя с Og" или + HgOg Fe+5+ НО' +■ НО"), может привести

к образования чрезвычайно реакционноспособного и сильного окислителя - гндроксильного радикала. С другой стороны., еще в 1934 г Габер и Вейс (НаЪегР.1954 ) сделали предположение, что за реакционную способность реактива Фентона (смесь солей железа с HgOg) ответственен НО; В дальнейшем возникло некоторое сомнение относительно этого предположения fczapski 0. et al,l978., Beliaski ï., 1985 )• Вообще перекись водорода способна расщепляться по механизму: HgOg -*> Hpü + I/20£, с образованием "горячего" кислорода feernofsky G.,1933). С другой стороны в ходе реакции НОс 0р~ образуется также активный (скнглетныП)кислород и НО"

ferinsfcy N.J. 1984). Считается, что процесс О^- + НО' -*■ -*■ Og + НО" является промежуточным в реакции Н02 + HgO^-»--*■ НО" + HgO + Og (Afanasev I.Б. 1984). С другой стороны ЕоЪегЬа J.L et al, (1978) показали возможность процессов:

но* + о2~ -* но~- + о2 и но- + н2о2 — НО- + 02~ в ■

присутствии пиридина. О возможности процесса НО' + 02 —»• Н20 + 02 в присутствии пиридина показал Greenstock С. L. (1986). Наконец, Srivatsa G.S. и сотр. (1985) показали, что в среде пиридина (П) происходит процесс НО" + 02 02~ + + 1/п (П(Н0')п, с образованием полимерного соединения пиридина и 02~ с малым выходом. Далее происходит процесс (02~ + + EjO Н02 + НО") и образующиеся Н02' превращаются в Н202 (2Н02* — Hg02 + 02), таким образом НО" способны восстанавливать кислород до Н202.

Приведенные механизмы хотя имеют некоторые противоречия, тем не менее включают почти все активные соединения кислорода. Выявление более простых систем, состоящих из этих соединений, возможно вносит некоторые уточнения в приведенные механизмы.

НО' образуется при радиолизе воды и этим объясняется значительная доля действия радиацви в биосистем&х. Причем константы скоростей реакции НО' с этанолом и бензойной кислотами (как скавенджеров НО" радикалов) составляют при 25° соответственно 1,8 . Ю9 (Neta P. I., 1968) и 6.I09 л/моль.сек"1 (Borggaard O.K. et а1,1972). В вышеуказанных системах не учитывается возможная роль НО" при продуцировании 02~ в водных средах, факт, имеющий большое значение. Вообще почти во всех приведенных выше системах продуцируются нестабильные 02~, что намного усложняет его изучение. С точки зрения этого необходимо выявить такие системы, в которых намного повышена стабильность 02~.

Против образующихся активных соединений кислорода (особенно при повышенных количествах, имеющих место при нарушении нормального физиологического статуса организма под действием различных физических, химических и биологических факторов) природа создала мощную систему ануиоксидантных ферментов: суперокскдциему-тазы, каталазы, глутатионперокевдазы и т.д.. Причем другие не-фврментные антиоксиданты, такие как еС-токоферол, витаминке, мочевая кислота и т.д. могут представлять вторую линию защиты, уменьшая до минимума повреждения, наносимые активными соединениями кислорода.

Впечатляющим достижением энзимологии в последние десятиле-

тия следует признать открытие в 1969 г Фридовичем ферментативной активности эритрокупреина (гепатокупреина, цереброкупреина)--дисмутацию Og", на основе чего белок был назван супероксиддис-мутазой Ссупероксид-оксидоредкутаза: КФ I.I5.I.1)-С0Д (McCord J,M., Pridovich Х.,1969) . Основная биологическая функция СОД состоит в сохранении жизнедеятельности аэробных организмов от повреждающего действия Og", по механизму: 20¿~ +■ 2Н"1" —HgOg + Og. Было установлено, что этот процесс происходит очень быстро (К = 1,9 . 10® л.моль-^csk-^) и ферментативная дисмутация имеет I порядок по концентрации Og" и истинным субстратом является скорее Og" чем НО^* (поскольку ферментативная дисмутация не зависит от рН в интервале 5-9,5). Пределы рН, при которых идет процесс дисмутации 0^", как покажут дальнейшие исследования, явно уменьшены. В природе существует 4 изофермента супероксидцисмутаз: Cu ,Zn-содержащая, Мп-содержащая, Ре -содержащая и Cu ,Zn-содержащая, но высокомолекулярная-'внеклеточная. Эти изоферменты СОД локализованы во внутриклеточных пространствах, мембранах и во внеклеточных средах животных, растений и микроорганизмов.

Cu fin -СОД к настоящему времени была выделена и4в основном, очищена из различных объектов живой природы: в.экстрацеллюлярных жидкостях, из различных органелл и форменных элементов плазмы Qíarklund S.L.1980, 1985), из растительного сырья (Sawado X. et al, 1972), дрожжей (Weser o.et al, 1972), из различных тканей животных (Marklund S.L. 1986, Asayama K.et al.,1985). Для выделения и очистки СОД используются методы ионообменной хроматографии и гель-фильтрации на различных носителях. При препаративном получении СОД используются различные органические растворители, дробные осаждения сульфатом аммония, термообработка белковых фракций и др. Однако, почти все указанные методы выделения и очистки, в основном,не носят комплексный характер получения СОД и не дают возможности одним и тем же методом одновременно получить и очистить не только СОД, но и другие антиоксиданты и проокси-данты для аналитических (диагностических) и препаративных (производственных) целей, изменяя только масштабы используемых мощностей и химикатов. Разработка универсального способа получения СОД и каталазы (независимо от характера животного сырья) для аналитических и производственных целей дала бы возможность изучить количественные (качественные) изменения этих метаболитов в условиях íxl vivo в норме и при различных патологических состоя-

ниях и иметь достаточное количество этих препаратов как экзогенных средств для профилактических и терапевтических целей.

Си,2п-С0Д (СОД) состоит их 2-х идентичных субъединиц, каждая из которых имеет внутри цепи дисульфидный мостик, одну сульф-гидрильную группу и ацетилированную концевую аминогруппу. Каково состояние этих групп при воздействии различных физических и химических факторов (температура, вакуум, рН) предстоит выяснить. В активный центр СОД входят 2Gu>2, 22п+2 , действующие автономно, причем цинк участвует не в каталитическом акте, а в поддержании стабильного строения активного центра. Переносчиком электронов является медь в активном центре фермента. Механизм ферментативного дисмутирования О^- изображается следующей схемой:

Е - Си+2+ 02~-». E-Cul+1 + 02,

E-Cu+1 + Of 2S-* Е-Са+2 + Н202

где Е - фермент ( ЫсСогс! J.et al,1969 Однако, как показал Hodgson Е.К. (197? )> возможен и обратный процесс дисмутирования Og" и этот процесс также катализируется супероксиддисмутазой. Этот факт требует детального изучения.

Одним из первых состав активного центра СОД был расшифрован нами (Симонян М.А. , 1974) и параллельно подтвержден другими авторами (Веет К., 1974). Линии сверхтонкой структуры спектров ЭПР СОД свидетельствуют о связи меди с 4-мя азотами гистидина.

Изучение роли воды в деле дисмутирования Of необходимо также проводить, заменяя воду апротонными растворителями, что дало бы возможность применить СОД для изучения свободнорадикальных окислительных процессов, происходящих в апротонных средах (мембранах ¡слеток и т.д.).

Общая структура СОД путем тонкого кристаллографического анализа подробно описана в работе rainer J. (1982). При изучении стабильности СОД с помощью метода кругового дихроизма было найдено, что 8 M мочевина и 4% ДЦС натрий не влияют на фермент, а гуанцдинхлорид может ингибировать СОД при низких концентрациях. Цианиды, аз иды, диэтиддитиокарбамат инактивируют СОД, в основном образуя комплексы сСи+% активном центре фермента ( Borders G.L.JI985 )• Способность перекиси водорода инактивировать СОД была показана нами еще в 1972г (Вгау R.C.et al., 1974 ) и подтверждена другими исследователями (Stanley J.P., et al., 1979., Sinet P.M., et al.,1981 ). Далее было показано, что супероксидные радикалы также способны ингибировать СОД ( Smith al, 1984). Однако, характер взаимодействий на молекулярной основу

СОД и Ор~, а также перекиси водорода, перекиси органических кислот и липоперекисей (в экстремальных и ближе к физиологическим условиях) еще изучен недостаточно. Немаловажно и исследование характера индукторов СОД. В свете биохимической роли, СОД должна ивдуцироваться кислородом и в случае E.coli уровень эвдогенной 00Д повышался 25-кратно (Gregory E.M.et al, 1973). Такое индуцирование СОД имеет место и в Saccharoinycea cerevisisa (Gregory E.H.,1974-) и легких крысы (Сгаро J.D.,1974). Однако вопрос секреции СОД (особенно под влиянием скавеццжеров НО* - алкоголя, сахара) еще изучен недостаточно (Dreosti I.E.1982. »Marklund S.L. 198З, Ledig M. et al., 1980), особенно при патологических coc-тоянкях с точки зрения протективного эффекта иццуцированной СОД при У-излучении, алкогольной интоксикации, гипергликемии, ЗБС и т.д. Защитные свойства СОД для предотвращения ряда воспалительных, ишемических, онкологических, желудочно-кишечных и многих других заболеваний широко исследуются в последние 15-20 лет, не только в эксперименте, но и в клиниках. Экзогенно введенная СОД (каталаза) оказывает кардиопротективный эффект (A.oki н. efe al., 1988), защищает животных от последствий ионизирующей радиации (Petkau А. ,1978) ,имеет противоопухолевое действие (Tanlguchi IT., 1992), оказывает положительный эффект при геморрагическом шоке (Ehee Р. et al^99lh Около 40-50 различного характера заболеваний лечат с помощью экзогенно введенной СОД. Почти во всех ' приведенных выше патологических состояниях изменяются требуемые физиологические количества (в основном повышаются) активных ин-термедиатов кислорода. Именно поэтому экзогенно введенная СОД (другие антиоксидантного характера ферменты и витамины) оказывают защитный эффект. Вообще активные соединения кислорода вредны только при повышении их физиологического уровня, однако они являются нормальными метаболитами аэробных биологических (и небиологических) свободнорадикальных окислительных процессов. В живой природе существуют много случаев, когда эти реакционноспо-собные вещества приносят конструктивную пользу. Например Но0о и иодитпероксидаза играют существенную роль в окислении иона J . а включении его в состав органических соединений, это происходит при биосинтезе тироксина в щитовидной, железе. и Н^О^ могут оказаться выжными компонентами при фагоцитозе. Нарушение баланса накопления и расхода 0^", HO'.-.^Og» липоперекисей всегда приводит к нежелательным последствиям. Существует гипотеза о некотором дисбалансе мевду продуцированием и расходом Og" в сы-

воротке крови и мембранах эритроцитов.

Изучение системы,включающей 0^", НО', HgOg, органические перекиси и липоперекиси даст возможность конкретизировать их эффекты на различные антиоксидантные белки-ферменты (особенно СОД) в условиях in vitro и in vivo, в норме и при различных патологических состояниях. Нахождение подходящих систем и механизмов продуцирования Og- (и НО') даст возможность на молекулярной основе изучить влияние этих соединений на различные биосистемы и метаболиты и выявить факторы, влияющие на активность СОД.

Исходя из вышеприведенного, мы поставили перед собой цель:

1. создать комплексный способ одновременного получения из животного сырья СОД и каталазы и из крови ферментных антиокси-дантов (СОД, каталаза, церулоплазмин, трансферрин) и цитохрома В^, а также новых типов ггрооксидантных белков-переносчиков электронов , как нововыявленных белковых компонентов в системе продуцирования Og- в сыворотке крови и мембранах эритроцитов, для аналитических (диагностических) и производственных целей (как сырьё для получения лекарственных препаратов).

2. Выявить новые системы и механизмы продуцирования в них активных соединений кислорода (Og-, НО* и др.) и на молекулярной основе исследовать их взаимодействие с СОД.

3. Показать характер и механизмы действия факторов денатурирования (дезактивирования) и "активирования" СОД in vitro и in vivo, а также защитную функцию СОД (каталазы) при различных патологических состояниях, с определением количественных изменений фермента.

4. Изучить свойства новых металлопротеиновых компонентов проок-сидантного характера системы продуцирования в сыворотке крови и мембранах эритроцитов. Выявить механизм продуцирования Og-, их эффекты на различные биосистемы, их уровень и защитную роль при патологических состояниях.

Научная новизна работы.

1.Разработаны два комплексных способа одновременного получения из животного сырья СОД и каталазы, из крови: цитохром Bg и четыре металлопротеина антиоксидантного характера (СОД, каталаза, церулоплазмин, трансферрин), а также 5 новых типов проокси-дантных металлопротеинов (4 типа цитохрома и супрола- су-пероксид-продуцируюцего липопротеина).

2. СОД проявляет высокую устойчивость против денатурирующих

агентов, особенно НО ионов и практически сохраняет свою активность при рН 4-13,3, проявляя высокую активность при рН 12,5.

3. Ближе к меди в активном центре СОД имеется восстановительная группа (возможно сульфгидрильная), которая способна при высоких температурах восстановить медь фермента (обратимо), с инактиви-рованием его.

4. Найдены апротонные растворители, в которых СОД полностью растворяется и практически сохраняет свою активность. К таким растворителям относится ДМСО, формамад, и-метилформаивд, молекулы которых играют роль переносчика электрона, взамен воды.

5. Выявлен факт дезактивирования СОД НО* радикалами, перекисью водорода (необратимо) и перекисями органических кислот и липопе-рекисей, супероксвдными радикалами (обратимо).

6. Выявлены 4 новые системы и механизмы продуцирования активных соединений кислорода (02~, НО'), в частности:

а) СЭ^Г"02 —02".,

б) но-~Г* о2 — НО' + о2~.,

в) перекись Н0% 02 -Ж>- 02" + НО'.,

г) ЛП-НАДШ + Ре+3—Ш-НАДФН-Рв+5-н- ЛП-НДДФ^^+2^-

ЛП-НАДШ-+ 02~, (ЛП-липопротеин-супрол). В системах а, б, в СОД каталитически ускоряет процесс образования 02~ (НО*), после первоначального дисмутирования 02".

7. Обнаружены факторы стабилизации (этоКатили К*) или дестабилизации (спирты или сахара) 02~ и выявлена обратная зависимость между способностью дисмутирования 02~ (ферментативно или спонтанно) и фактором Лавде ( йм) первого компонента тонкой структуры ЭПР супероксидных радикалов (6М = 2,19>дисмутир6ванио>5|1 = 2,05).

•Показано новое выявление купрокатализа, в частности, констатировано, что гидратированная медь способна каталитически ускорять процесс восстановления феррицианица супероксвдными радикалами.

9. Выявлены факторы количественного изменения содержания и активности эндогенной СОД й протективное действие экзогенно введенной СОД (кагалазы) при алкогольной интоксикации, и УФ-лучевсм поражении, судорожных состояниях, гипо- и гипергликемии, термических ожогах, онкологических, келудочно-язвенных заболеваниях

и при воспалении слизистых оболочек.

10. Повышенным путем подачи этанола уровень эвдогекной СОД уве-

личивает радиорезистентность организма.

11. В лице нововыявленных проокседантного характера метало протеинов (4-х типов цитохромов В^^д и супрола - еупероксид-про.цу-цирующего липопротеина) показано наличие новых белковых компонентов системы продуцирования О^- в сыворотко крови и мембранах эритроцитов.

12. Показаны некоторые физико-химические характеристики этих белков (определены мол. массы, спектральные, кислотно-основные свойства и.т.д.) и механизм продуцирования 0^" супролом.

13. Впервые показано явление присоединения НО" ионов с Б'е+2 в протопорфирин IX содержащих белках (включая 4 типа цитохрома. ^553)

как возможный лигацц железа.

14. Супрол проявляет три различных эффекта: а)стимулирует лей-копоэз, б)ускоряет процесс пролиферации клеток в их культуре, в)подавляет рост лимфосаркомы Плисса и саркомы М-1.

15. Показан резкий'скачок эндогенных цитохромов ^^в111 > Ъ558 IV и супрола при шумовом стрессе, десимпатизации и периодической болезни.

16. Цитохромы и Ь^^дИ встречаются только в плацентарной крови человека (не венозной) и крови крыс.

Практическая ценность.

I. Разработаны простые способы одновременного выделения и очистки из животного сырья СОД и каталазы., из крови человека и животных: цитохрома" В^, металлопротеинов антиоксидантного характера (СОД, каталаза, церулоплазмин, трансферрин) и новых белковых компонентов прооксидантного характера системы продуцирования 0£~ в сыворотке крови (цитохромы Вп^д(П) и суп-рол) и мембран эритроцитов (цитохромы III) и 3^д(1У) . Эти способы могут быть применены при проведении различных медико-биохимических исследований прикладного характера по принципу активного регулирования их эндогенного уровня, введением экзогенных препаратов-белков, для достижения лечебного эффекта. Приведенные способы позволяют получить почти все вышеуказанные белки в электрофоретически гомогенном состоянии, как для аналитических (диагностических), так и для производственных целей. Это дает возможность использовать указанные металлопротеины (особенно антиоксидантного характера) как сырье дли получения широкоизвестных лекарственных препаратов (Орготеин, Грюненталь, Пероксинорм). С применением указинных спосоОов нам удалось по-

лучить и отправить заказчикам из 25 научно-медицинских центров бывшего Союза свыше 250 г высокоочищенных металлопротеинов, на сумму, эквивалентную около 0,5 млн. долларов США. Производство этих препаратов продолжается и внедряется.

2. Система СОД и сольватированный электрон (в апротонных средах) могут быть использованы для изучения механизмов свободноради-кальных окислительных процессов, происходящих в клеточных мембранах, з других, нерастворяющихся в воде биосистемах и в органическом синтезе.

3. Полученнпэ нами белки, особенно ыеталлопротеины антиоксидант-ного характера (в определенных дозах) используются как профилактические и терапевтические средства в экспериментальной медицине при ¿Г- и У5-лучевом поражении, воспалении слизистых оболочек (желудка, горла, глаз, половых путей и т.д.), опухолях различного характера (лимфосаркомы Плисса, саркомы М-1, гепатомы Зай-деля), аллоксановом.диабете, алкогольной интоксикации, судорожных состояниях различного происхождения (эмоционально-болевое, гипероксическое, коразоловое), термических ожогах и т.д. При ангине, желудочно-язвеннкх заболеваниях СОД (с каталазой) оказывает протективный эффект у людей (на добровольных началах).

4. Разработанный метод увеличения уровня эндогенной СОД (с использованием этанола) повышает радиорезистентность организма пострадавшего от ^ -излучения.

5. Оуп^ол не оказывает нежелательное действие на организм и можно его использовать как средство подавления.роста злокачественных опухолей, как фактор стимуляции лейкопоээа и как инициатор пролиферации клеток в культуре клеток.

6. На основании системы продуцирования стабильных в растворах перекиси водорода были разработаны: а)простой спектральный метод количественного определения гидратированной меди (2+), до Ю- М., б)кинетический спектральный метод количественного определения О^- (до Ю-"7 М) в растворах перекиси водорода при рН .7,4 и вше., в)способ использования как антисептического средства раствора глюкозы с перекисью водорода (как энергичный источник супероксидных радикалов) при рН 8,5, в соответствующих концентрациях. , г)получение средства для смягчения и обеления тканей и бумаг.

7. Предлагается спектральный метод определения протопорфирин-со-держащих гемопротеинов, без отделения гема от белковой части

молекулы.

8. Исходя из того, что НО' инактивирует СОД, предлагается фермент коньпгировать со спиртами или сахарами (полимерами), как энергичными скавенджерами гидроксильных радикалов, что намного стабилизирует фермент и сохраняет его активность.

Апробация работы

Всесоюзный симпозиум "Магнитный резонанс в биологии и медицине", Черноголовка, 1977., Всесоюзный симпозиум "Структура, биосинтез и превращение липидов в организме животного и человека", Ленинград, 1978., Совещание по проблеме "Многоядерные окислительно-восстановительные ферменты", Черноголовка, 1978., 4-ый Всесоюзный биохимический съезд, Москва, 1979., II Закавказская научная конференция по применению радиоспектроскопии в биологии и химии, Ереван, 1979., Всесоюзный научный симпозиум "Магнитный резонанс в биологии, медицине", Черноголовка, 1981., I Всесоюзный биофизический съезд, Москва, 1981., II Всесоюзный биофизический съезд, Черноголовка, 1982., III Всесоюзная научная конференция по химии и биологии порфиринов, Самарканд, 1982., III республиканская научная сессия по вопросам биофизики, Ереван, 1982., IV молодежная конференция по синтетическим и природным физиологически активным соединениям, Ереван, 1982., IX Всесоюзная научная конференция по биохимии нервной системы, Ереван, 1983., I Всесоюзная научная конференция по переносу электрона в белковых системах, Москва, 1985., II Всесоюзная научная конференция "Биоантиоксвдант", Черноголовка, 1986., МЗ АрмССР, материалы научной конференции, Ереван, 1986., Всесоюзный симпозиум по медицинской энзимологии, Махачкала, 1986., Научная конференция по ПОЛ в норме и патологии. Перспективы использования аити-оксидантов, Ереван, 1986., II Научная конференция по проблемам физико-химической биологии и биотехнологии в медицине, Ереван, 1986., III Всесоюзная научная конференция "Биоантиоксвдант", Москва, 1989.

Структура диссертации

Диссертация выполнена в форме научного доклада. Объем диссертационной работы изложен на 78 страницах машинописного текста, состоит из общей характеристики работы, результатов и их обсуждений -- 4 параграграфа, выводов и списка опубликованных работ автора. Работа включает 11 таблиц, 18 рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ На рисЛ представлена схема процедур полупения (в производственных или аналитических целях) в электрофоретически гомогенном состоянии Cu,Zn -супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы из животного сырья (мозг, сердце, печень, плацента, селезенка, легкие и др.).

Животная ткань -1

Перфузия, гомогенизация а ацетоне, сбор пороажа центрифугированием,

насыщение супернатанта сульфатом аммония (70%) и добавление ацетона

(5% от общего объема),

сбор верхнего слоя, диализ, сбор супернатанта,

ионообменная хроматография*супернатанта на ДЕ-52 ,

элтров^ние,

0,01 М К£5* =^03 М КЕБ

СОД каталаза

~Г~ —I—~

сефадекс G- 75 сефадекс G- 150

ДЭАЭ сефадекс А-50 ДЭАЭ сефадекс А-50 Рис. I.. Схема получения СОД и каталазы из животного сырья.

§ I. Исследование СОД.

Влияние денатурирующих агентов на СОД.

Форма и интенсивность сигнала ЭПР СОД не изменяются в диапазоне рН 5-11,5 (рис.2).

Рис.2. Изменение форш сигнала электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) СОД при различных значениях рН: I - 4,. 2 --5 - 11,5, 3 -I2,2, 4- 13,3. Условия

2600

Н (Гаусс), Го

3400

регистрирования ЭП? спектров такоЕы: постоянная времени - 0,3 сек., время сканирования опектра - 2 мин., микроволновая мощность - 10 мВ., микроволновая частота - 9,12 гГц., амплитуда модуляции - 6,3 Гс., температура - 77°К., чувствительность записи спектров - 5.10*\

Поскольку в спектре ЭПР белка наблюдается только один набор компонентов сверхтонкой структуры (СГГС), можно предположить, что оба атома меди белка находятся в одинаковом окружении (рис.2). При рН 12-12,5 сигнал имеет форму, типичную для комплексов меди с аксиальной симметрией, с соответствующими параметрами (таблица

I.)

Таблица I.

Параметр» спектров ЭПР СОД при различных рН.

рН А (Гс) аН1/2<Гс)

4 150 2,36 2,08 58

5-11,5 142 2,26 2,08 66

12 170 2,30 2,08 ' 72

13,3 195 2,18 - -

На спектре ЭПР СОД в районе ^обнаруживается 9 компонентов суперсверхтонкой структуры (ССТС) с константой расщепления 1-5 Гс, что свидетельствует о том, что медь в активном центре белка связана о 4 атомами азота. Изменение формы ЭПР СОД при рН 5-12,5 имеет обратимый характер. При рН 13 сигнал имеет форму и параметры, характерные для биуретовых комплексов меди. Об этом свидетельствует и появление в оптическом спектре поглощения максимума при 535 ни. Подхнсление раствора белка от рН 7 до 4 приводит к необратимо^ ксменению формы сигнала ЭПР (рис.2-1). В дальнейшем будет пока-эано, чтр пределы рН, в которых спектральные параметры и активность ООД изменяются обратимо, довольно расширены (в пределах 5-13,3).

Далее было исследовано влияние фторида, мочевины, додеци-сульфата натрия на форму сигнала ЭПР ООД. Инкубация белка 10"^М

фторида, 4,5 М мочевины, 0,2/5 додецисульфата при 20°, в течение I ч не приводило к существенному изменению формы спектра ЭПР, характерной для нейтральной и слабощелочной областей. Денатурирующее действие детергентов обычно связывают с разрушением гидрофобных связей, вносящих вклад в стабилизацию нативной структуры белка, а денатурация мочевиной - с разрушением водородных связей (Геп£ог<1 С., 1968). СОД является примером медьсодержащего белка, в котором специфическое лигаццное окружение меди не изменяется под действием разрушающих водородные связи агентов, т.е. водородные связи не принимают участия в формировании активного центра белка, тогда как электростатические взаимодейстзия могут оказаться существенными.

На следующем этапе исследования было изучено влияние температуры на свойства СОД. Как показано на рис.3, при нагревании водного раствора электрофоретически гомогенной СОД до 95-100° в течение 1-2 мин. наблюдается полное обесцвечивание раствора белка, как это показано на ЭПР и оптических спектрах поглощения СОД (рис.3).

Рис.3. ЭПР и оптические спектры поглощения СОД., при термической обработке белка. I - I1 - ЭПР и оптические спектры СОД до нагревания раствора белка.

2 - 2* - то же самое после нагревания раствора СОД при 95-100°, в течение 2 мин.

3 - 3 - это 2 и 21после аэрации раствора при 20°, в течение 15 мин.

При быстром охлаждении раствора СОД наблюдается реокисление чеди в активном центре фермента с характерннми ЭПР и оптическими спектрами (рис.3 - 3). Причем максимум поглощения при 680 нм, что характерно для нативной СОД, на 40 нм смещается налево и составляет 640 нм. Параметры сигнала ЭПР также резко меняются: А„ = 170 Гсе„ =2,22., л Н^ = ПО Гс.. После термической обработки до 75° СОД теряет всего 15% своей активности, однако после нагревания до 100 фермент полностью инактивируется. Т.о.

в активном центре СОД ближе к меди находится восстановительная группа (возможно сульфгидрильная),которая после соответственных конформационных изменений (Jabusch. J.R.efc а1,1980) активного центра в ходе термической обработки способна восстанавливать медь. Полученные результаты говорят о том, что СОД довольно стабильный фермент против деструктирующих и денатурирующих агентов. Это дает возможность исследовать СОД в сравнительно экстремальных условиях, для выявления механизмов генерации и утилизации супероксидных радикалов, включая апротонные (безводные) системы, где стабильность 02~ повышается. Свойства СОД в апротонных растворах.

Были исследованы эффекты 30 различного характера органических растворителей на оптические и ЭПР спектры, а также активность СОД. По своему влиянию на СОД исследованные органические растворители были разделены на 3 группы: I) растворители, оказывающие выраженное денатурирующее действие на СОД уже при низких концентрациях (15-20%). К ним относятся метил-этил-кетон, органические основания (диэтилаыин, моноэтаноламин, пиперидин, морфолин), 2) растворители, которые не денатурируют СОД и могут использоваться в процедуре получения и очистки белка (хлороформ, ацетон, этанол, диоксан),3) растворители, в которых СОД растворяется (ДМСО, формамид,и -метил-формамад). СОД была растворена в этих растворителях, после ее лиофилизации. Наиболее высокую активность СОД обнаруживает, в N-метил-формамиде preem M.R. et al.,1979. В этом ряду растворителей с убывающе/ величиной диэлектрической постоянной активность фермента падала, увеличивался "синий" сдвиг основной длинноволновой полосы поглощения белка и наблюдалось изменение формы сигнала ЭПР СОД. Интерпретация этих данных основана на предположении о двойственном влиянии органических растворителей на фермент: увеличение активности в средах с высокой диэлектрической постоянной, вероятно, в результате координации этих растворителей с атомами меди вместо еоды и неспецифическая инактивация фермента в результате взаимодействия органических растворителей с. полярными областя-ыа белковой молекулы. Действительно, как показали и другие исследователи, молекула воды является одним из лигандов меди в активном центре фермента(bofcilio G.,1974., Banci L. et al.,1989 ) и удаление воды или замена ее молекулой органического растворите-

ля приводит к соответственным изменениям в ЭПР и оптических спектрах фермента (рис.4).

Рис.4. Оптические и ЭПР спектры СОД,растворенной в органических растворителях.

1 - I1 - СОД в воде.,

2 - 2 - в ыетил-фор-мамиде., 3 -З1 - в фор-мамиде и 4 -41 - в ДЩ). Условия регистрирования ЭПР спектров как на рис .2^

После удаления этих растворителей, СОД приобретает перво-500 нм 700 начальные свойства.

Влияние сольватированного электрона (СЭ) на свойство СОД и про-. дуцирование в этой системе супероксидных радикалов.

Как указывалось выше СОД полностью растворяется в ДМСО, фор-мамиде и N -метил-формамцце. Это дало возможность изучить некоторые свойства СОД в апротонных (безводных) средах. В частности изучить взаимодействие сольватированного электрона и генерированного супероксидного радикала на окислительно-восстановительные свойства СОД, а также выявить роль фермента в этой системе.

Указанные растворители перед использованием очищали следующим образом. Растворители нейтрализовали щелочью и аммиак удаляли вакуум откачкой. После вакуумной перегонки растворители еще раз нейтрализовали и окончательно перегоняли под вакуумом.

О^- получали: I) электрохимическим путем по методу Morde D.L. et al(I965), используя 0,1 М тетраэтиламмониум бромид в качестве электролита в сухом органическом растворителе., 2)восстановле-нием сольватированным электроном молекулярного кислорода. СЭ получали в анаэробных условиях, растворяя металлический На в гек-саметилфосфорамиде. Темно-синий раствор СЭ стабилен в течение 8-10 ч (при вакууме). Характерные ЭПР и оптические спектры поглощения СЭ, СОД и С>2~ показаны на рис.5. Приведенные на рис.5 изменения говорят о том, что СЭ способен в апротонных растворителях восстанавливатьСи+2 до Си4^ в активном центре СОД, которая при аэрации генерирует Продолжение аэрации приводит к пол-

ному реокислению меди фермента. СЭ действует аналогичным образом на СОД, растворенную в форыаызде или H -ыетил-формамиде.

Рис. 5. Спектральные свойства СЭ, СОД и в апротонной среде. ЭЛР (а) и оптические спектры поглощения (б) СЭ (I, f), поело добавления 0,01 мл СОД в ДМСО к 2 мл СЭ (2,2'). 3 - Это ЭПР спектр СОД в даСО. 4 - Это 3,после добавления 0,5 мл СЭ. 5 - Это 4, после аэрации раствора кислородом в течение 20 мин. б- Эго 5, после аэрации 10 ч. Чувствительность записи спектров (Ч.з.) для 5 - 10°, остальных -

• 2700 Н, Гс 3300 Iq1, ДРУгие параметры

' регистрирования ЭПР

спектров - как на рис. 2..

Супероксидные радикалы, полученные электрохимическим путем в Г.'1-А (или в неводных средах - Frimer ¿.Д., 1983), также восстанавливают медь фермента, который после аэрации продуцирует 02~ и синхронно реокисляется. В. первой стадии происходит дисмутирование Og" (в апротонной среде), а во второй стадии, наоборот- продуцирование 02~. Предполагается, что дисмутирование в апротонной среде, возможно> происходит по схеме:

202" —*• 022" + 02, с образованием перекисного иона и кислорода. Т.о. в апротонной среде имеет место дисмутирование 02~ (генерированных восстановлением молекулы кислорода электрохимическим цутем или сольватиро-ванным электроном) супероксиддисцутазой, с одной стороны, и, с другой, 02~ и СЭ способны восстанавливать Си+- СОД, которая при .-л у рации способна восстанавливать 02 до 02~, по схеме:

Си+2 -СОД + СЭ (или 02~) -Сц+1 -СОД -2- Са+2 - СОД + 02~

Это механизм продуцирования 02~ в апротонных средах.

§ 2. Механизмы продуцирования Од*" и НО* и факторы инактивироваиия

СОД в водных средах.

Влияние кислорода на щелочные растворы СОД.

Впервые обнаружен эффект понижения рН растворов СОД путем продувания кислородом. Это понижение рН прямолинейно зависит от концентрации СОД. ЭПР и оптические спектры поглощения (последние не приводятся) претерпевают соответственные изменения в зависимости от рН в данный момент, как это показано на рис.б.

Ркс.б. Изменение рН растворов, ЭПР спектров СОД при продувании кислородом и при вакууме. аЖинетпческне кривые понижения рН растворов СОД при продувании кислородом., б)зависимость понижения рН от концентрации СОД., в)влияние вакуума на ЭПР спектры- СОД: I - СОД при рН 12,7., 2 - то же самое, при рН 13,3., 3 - это I или 2, после инкубирования при 20° под вакуумом в течение 4 ч., 4 - это 3,

после аэрации раствора кислородом в течение 5 ч (в результате этого рН понижается до 9,3). Условия регистрирования ЭПР спектров как на рис.2.

При рН 12,5 ЭПР сигнал супероксвдцисмутазы имеет аксиальную форму (максимум оптического спектра поглощения делает "синий" сдвиг)'.

Продувание кислородом приводят к увеличению супер СТС меди в активном центре фермента и понижение рН на 3,5 единицы. При этом Э!.Р и оптические спектры приобретают первоначальный (как у интактног~

2700

3300 Н, Гс

фермента) вид, хотя наблюдается некоторое понижение их интегральной интенсивности. При вццерживании этих растворов СОД в условиях вакуума в течение 4 ч, медь в активном центре фермента полностью восстанавливается (сигнал ЭПР СОД фактически исчезает). Однако аэ-радая кислородом в течение 5 ч приводит к появлению характерного для нативного белка ЭПР спектра (рН понизился с 13,3 до 9,3), всего 60 - 70 % первоначальной интенсивности. Эффект возвращения формы сигнала ЭПР СОД (характерной для биуретовых комплексов меди при рН 13.3) формы нативного белка после вакуума и последующей аэрации, говорят о том, что пределы обратимости сигнала ЭПР СОД надо расширять с рН 12,5 СйоЫНо 0.1971) до 13,3. Этот путь понижения рН раствора СОД вццида полностью не приводит к необратимым ияменениям, в отличие от реакции нейтрализации кислотой. Известно, что при щелочных рН в активном центре СОД ионы НО" замещают молекулы воды (как лигавд меди), как показаноТетег! Ы. (1974), это выражается переходом к аксиальной симметрии формы спектра ЭПР СОД. В отсутствии кислорода скорее всего происходит процесс:

Си*2 -СОД + НО" ^ НО' +• Си+- СОД (I), приводящий к восстановлению меди в активном центре. По всей вероятности, этот процесс носит обратимый характер, т.к. рН при вакууме растдоровСОД фактически не понижается. Однако, при аэрации этих растроров, а. также щелочных растворов СОД без нахождения в вакууме происходит падение рН (3,5 ед и выше), с одновременным появлением эффекта рвокисления меди (60-70 %). Этот процесс может быть

объясним по схеме: __

Си*1 + 02 —. си+2 * 02" (2).

После суммирования уровнений I и 2 получается:

но~Т*о2 но- +■ о2~.

Таким образом СОД в щелочных средах способна катализировать этот процесс, в результате чего расходуется НО- ионы с одной стороны, и, с другой, путем присоединения НО* радикалов образуется Н202, которая является слабокислым соединением.

Это один из механизмов продуцирования 02~ в водных средах.

Восстановление некоторых органических и неорганических окислителей супероксиддисмутазой и скавеццжерами НО' - радикалов в щелочных средах.

Как было показано выше, СОД способна катализировать процесс НО" + 02 -»- НО- + 027

Однако, делая такой выводив основном,ш исходили из расхода исходных соединений этой реакции. Для подтверждения правомерности этсй схемы необходимо было выявить также наличие НО' и С>2~, как продуктов этой реакции. Для этой цели были испробованы различные красители (25 наименований), из них только метилен синий или метилен зележй и кумасси бриллиант синий, а также из окислителей КМпО^ и феррипиа-нид практически не изменяются в щелочных средах и вполне подходят для достижения поставленной цели. Было показано, что в щелочных средах СОД способна обесцвечивать (восстанавливать) вышеуказанные вещества. На основании кинетических кривых восстановления были построены зависимости Лайнунвера-Берка для указанных веществ (рис.7), а также было показано восстановления этих веществ в присутствии ска-

Рис. 7. Зависимости ЛаЯнуивера-Барка,полученные при обесцвечивании КМпО^, при 526 нм и рН 12,8 (а)., феррициандда, при 420 нм и рН 13,6 (б)., кумасси бриллианта синего (КБС), прл 557 нм к рН 13 (в). Влияние СОД на процессы обесцвечивания при рН 13 метилен зеленого (г)., КБС (д) и КМп04 (е).

Кинетические кривые обесцвечивания КМпО^ супероксиддисиутазой (ж) в присутствии скавецджеров НО' - радикалов, I - для ?'2.5г;04 пр-т рН 12,8., I в присутствии: 2.10~^М маннитола (2)., гл>о-

козы (3)., ЗЛО"3« ДМСО (4)., 8.10~7М СОД (5) и 2.1." " млнниггла и 8.10~7М СОД (6).

Исходя кх того, что указанные вещества обесцвечиваются только супероксидньа!:: радикалами (га не НО" -конами или перекисью водорода, кроме перыанганата) и скавеццзперы гидрокскльных радикалов усиливают это обесцвечивание (путем перемещения процесса (I) вправо), мз&но констатировать реальность приведенного механизма образования 02~ и НО" в щелочных растворах СОД.

Генерирование супероксипных радикалов при расщеплении перекиси водорода. Роль супероксщщисмутазы в этой системе.

Очищенная перекись водорода бурно расщепляется щелочью (КОН, НаОН.нн^он ), особенно при нагревании. Этот процесс экзотерми-чен и усиливается при повышении концентрации Н202 и ПР°~

дукт этой реакции генерируются супероксидные радикалы. Нам удавалось регистрировать сигналы ЭПР 02~ в этой системе при различных значениях начальных рН: 8,2 - 13,3 и выше. Эти сигналы совпадают с сигналами О^-, полученными другими методами. Полученные Ог," фермантативно дксыутируются суперокскдцисмутазой. Процесс продуцирования 02~ сопровозццается повышение!! значений рН раствора из-за расходования перекиси водорода. Одновременно происходит повышение температуры реакционной смеси. Наблюдается корреляция мелду рН, температурой реакционной смеси, концентрацией 02~ и параметров сигнала ЭПР этих радикалов.(рис. 8).

2,00

12

<1 %

Ю „ 12 14

рн

- 1<ги - 3 -В

О - 40 ,2 ^ -7-1 - см А-*' - <Д-._# - о'/ 0 в О-о в 1 1

3100 Н.Гс 3400

10 мин 30

30 мин 60

Рис.8. Изменения интенсивностей и параметров сигнала ЭПР 02", генерированные в растворах Н^О^ (30%) при различных рН и температурах.

а- Спектры ЭПР 02~ при рН 8,2 (I)., 9,5 (2)., 11,5 (3)., 13,3 (4). б - Значения Б„(Л) и дН^ ) супероксидных радикалов при различных рН реакционной смеси., в - изменение рН (л), температуры (О) и концентрации 02~ (©) при начальных рН 10. г- Влияние СОД (2.10~9М (л) и 2.10 ~8 М (а)) на концентрацию 02"* (о ), генерированных в растворах Н202 при рН 12,6.

Стабильность полученных 02~ выше при повышенных рН реакционной смеси (выше рН II). Добавление СОД к этой системе сперва приводит к исчезновению или уменьшению интенсивности сигналов ЭПР 02~ (быстрый процесс), затем, наоборот, к увеличению концентрации 02~ (медленный процесс). СОД проявляет наибольшую активность в данной системе при рН 11,5-12,5 (таблица 2). Таблица 2.

Влияние рН на активность СОД в вышеуказанной системе Н202<

рН 8,5 10,5 11,5 12,5 13 13,7

Концентра- 2 ция дискутированных 0 р~ (М) 2.I0"3 U" супероксвд-дисмутазой. 3,5 4,5 5,6 4,1 2,5

При нагревании раствора Н202 снн^он , вместо КОН или Na ОН, все равно происходит разложение перекиси с образованием 02~. Полученные 02~ способны обесцвечивать КБС. Н202 или щелечь практически

не обесцвечивают КБС в отдельности.

Ионы железа не приводят к увеличению концентрации супероксидных радикалов в приведенных системах. Иноы На+или К1" играют. стабилизирующую роль для 02", однако для получения 02~ необходимы ионы НО".

Далее была выявлена связь между gM (üHj/2) суперокспдкого радикала, его стабильностью и способностью дискутироваться. С увеличением содержания ца+или К* (путем добавления к система На202илн К^О^

или К°) увеличивается стабильность 02~ и значения s,( и дHj/2 и, соответственно, уменьшается га способность к спонтанной или ферментативной дисмутации. Наоборот, с укеньшениеи содержания Ка+ или

К* (путем их связывания со спиртами или сахаралш), происходит уменьшение величин д(|, д ^1/2 н стабильности С2"\ с соответственном увеличением способности дисцутирования этих радикалов (рис.9). Предполагается, что эти явления связаны с изменением взашгодейст-вия мзвду неспареиным елзктроиоы О«,"* и полоаителькыш конами Яа+шш К4", которые тем сакын является стабилизаторами 02~. В присутствии спиртов ели Сахаров, наряду с уменьшением и и стабильности

02~, резко (в 100-150 раз) увеличивается содерзаниэ этих радикалов в р

Рис.9. Изменение форма и интенсивности сигнала ЭПР 02~ в зависимости от характера их окружения: К*", спирты, сахара, а - I - Спектр ЭПР 02~ при {Л 13 (или после насыщения раствора перекиси водорода (0,2 11) щелочью ( вп = 2,13, аН1/2 = 100 Гаусс}., 2 - это I, после добавления в избытке На°или К0 ( в„= 2,19, л ^1/2 = Гс).Приведена низкополевая часть спектра суперок-сидкого радикала ( Бтнв изменяется)., 3 - это I или 2 после добав-ленкя 80'Х спирта (метанол, этанол, глицерин, ПЭГ-300) или 0,5 М сахара (д-глюкоза, сахароза, гликоген), б(|= 2,05 и д ^1/2 = 20 Гс.

После добавления к 2 воды, получается спектр типа I. Ч. з. спектров для (I) - 4.101, для (2) - 2.10*, для (3) - 2.10°, остальные параметры как на рис.2, б - Увеличение или уменьшение коа-цет рации супероксидных радикалов, генерированных при расщеп-лену и 0,2 М перекиси водорода при рН 12,0 : I - в присутствии ПЕГ - 300 (или ПЭГ—400, ПЭГ-600)., 2 - метанола., 3 - этанола (ия>: пропанола, бутанола, этилен гликоля). Реакционную смесь ннку$и-

J—I-1_I_I_и I I_I I ^ _1_1_I I

3000 Н,Гс 3300 5 мин10 4 12 глюкоза

х 0,01М

ровали при 50°, в течение 2 мин. в - Кинетические кривые генерации и утилизации Og" в аналогичных условиях в присутствии 60% ПЭГ-300 (I)., метанола (2) и этанола (3). г - Генерация и расщепление С>2~ в зависимости от концентрации глюкозы, при рН 11,2. д - Понижение рН раствора глюкозы различной концентрации под влиянием супероксидных радикалов.

Резкое увеличение концентрации супероксвдных радикалов в присутствии спиртов или Сахаров объясняется тем, что с одной стороны в этих системах H^Og расщепляется интенсивнее, с другой, спирты или сахара являются энергичными акцепторами НО* радикалов. Хотя в присутствии указанных скавенджеров НО* происходит увеличение содержания Og-, однако, рН раствора не повышается в присутствии этих скавенджеров. Это говорит о том, что изменение величин gn (или Д Hj/g) супероксидных радикалов есть результат воздействия ионов К4" или ка+, а не ионов НО". Действительно, положительные ионы К* или ка+ окружают неспаренный электрон Og" и затрудняют их дисмутирование. Спирты или сахара, присоединив к себе эти положительные ионы, как бы "освобозвдают" и как результат этого уменьшается величина g(l супероксидных радикалов и последние легко дисмутируются. Обнаружено, что под влиянием образующихся Og" рН раствора глюкозы (других моно- и дисахаридов) понижается, вероятно из-за окисления сахара супероксидными радикалами (рис.9).

Ниже рН 8,2 нам не удалось обнаружить сигнал ЭПР супёроксиц-ных радикалов, что,по всей вероятности,не является пределом рН, ниже которого 0g~ не генерируются. Необходимо было разработать методику определения и при рН ниже 8,2 (7,4 и ниже). Для этой цели были использованы способности обесцвечивать синие растворы КБС (в овдельности HgOg или щелочь не обесцвечивают КБС). Процесс образования 0g~ в системе Н.^ + щелочь при низких значениях рН (рН 5-6) протекает медленнее, так как Н0~меньше, чем при высоких рН. В растворах перекиси водорода при рН 7,4 имеются достаточные количества НО" ионов для одноэлектронного восстановления "горячего" кислорода, образованного при расщеплении HgOg. Это доказывается тем, что после добавления каталазы к этим системам, рН растворов повышается. С другой стороны повышение температуры также приводит к увеличению концентрации в этих.системах. Наконец,екавевджеры НО* несравненно увеличивают выход продукта - супероксидных радикалов.(рис. 10). Путем сравнения скоростей обесцвечивания КБС супероксидными радикалами был разрабо-

тан спектрофотометрический метод количественного определения 02~ $ растворах перекиси водорода при рН 7,4 (и ниже).

Рис.10. Кинетическое определение количеств 02~ в растворах перекиси водорода при рН 7,4. а - Кинетические кривые обесцвечивания КБС в присутствии 0,2 М КОН или 0,2 М НоО^ (I) и с участием 5.КГ8 И (2)., 1,5.Ю-7 М (3)., 2,5.10 М (4).,' 5.10"7М (5) су-перокоидных радикалов, б - Скорости обесцвечивания КБС угла наклона) в зависимости от концентрации 02~. в - Кинетические кривые обесцвечивания КБС в присутствии 0,2 М Н202 при рН 4,5 (I)., в присутствии 0,2 М (2)., 0,5 М (3)., I М (4), 1,8 М (5) перекиси водорода при рН 7,4. г- Кривая зависимости скорости обесцвечивания КБС от концентрации Н202. д - Калибровочная кривая зависимости концентрации перекиси от содержания 02~ (М), при рН 7,4.

Исходя из того, что ионы К1" или Иа+ являются стабилизаторами (дезактиваторами)02~, возможно, эти ионы способствуют транспорту 02~ через соответствующие каналы (это предположение так или ина-,че подтвердил Со1Ьоп С.А. et а!, 1994). Из полученных результатов можно также предполагать, что существует возможность регуляции уровня 02~ глюкозой (другими сахарами)., не исключается возможность генерирования 02~ вышеприведенным неферментативным путем, особенно при патологических состояниях (алкогольное отравление, сахарный диабет и др.), при которых концентрация липоперекисей и перекиси водорода нарастает (тиггепв ,7.Р. еь а1.,198б), ибо происходит инактивирование каталазы, глутатионпероксидазы, СОД активными соединениями кислорода.

Активность СОД "увеличивается" в присутствии спиртов или са-

харов (в дальнейшем этот феномен был использован путем иммобилизации СОД полиэтиленгликолями (cosenza С.at al.,1993) и полисахаридами (Торчилин В.П. и др., 1982), для стабилизации фермента и его активности. Разумеется, что повышение способности СОД дискутировать 02~ не связано с действительной активацией фермента, а скорее всего, с тем, что с одной стороны 02~ становится более "свободным" от ионов царили К4" и делается более доступным для фермента, с другой, из системы связываются НО* - радикалы, которые способны связываться с медью в активном центре СОД и тем самым инактивировать фермент. Это в дальнейшем бкло подтверждено Pielden E.M.efc al (1980).

Выявление наибольшей активности СОД при рН 11,5-12,5 связано с тем, что: I) 02~ находится в "чистом" состоянии (при втих значениях рН имеетместодепротонизацгся НО2*:

но2- SC. н* + о2~),

2)при этих рН содержание Н202 низкое (как известно Н202 является фактором инактивирования СОД (synonyan м.А. eb al,1972»Bray B.C. et al,197^ч Bernofsky C.et а1,1983., Stanley J.P., 1979., Sinet P.M. et а1,1981., Bannister J.V. ,1973

Активность СОД продуцировать 02~ после их дисмутирования в щелочных растворах перекиси водорода может быть связана c-2-мя факторами: I)восстановлением меди ионами НО" или 02~ или Н202-, 2)реокислением меди и передачей электрона кислороду, с образованием 02~. Об эффекте восстановления меди СОД в щелочных средах в вакууме и реокисления с подачей кислорода (с синхронным понижением рН) и способности СОД каталитически обесцвечивать красители (путем генерирования 02~) уже говорилось. Можно констатировать, что образующийся при расщеплении перекиси водорода "горячий" кислород (Bernofsky С., 1983) способен восстанавливаться гидроксильными ионами, превращаясь в 02~, а по ходу этого процесса, как продукт реакции,' образуются также НО* радикалы. СОД каталитически ускоряет этот процесс. Обобщив вышесказанное, механизм продуцирования 02~ и НО* в растворах HgOg (ца202, K^Og) можно представить по следующей схеме;.:

Н202 Н0~, скавенджеры НО' э Q - вд. _

Приведенная схема полностью объясняет действие всех факторов, влияющих на ход этого процесса. Разумеется, этот процесс идет и при рН 7,4. Не исключается, что такой путь возможен и в биосистемах, особенно при патологических состояниях, связанных с увели-

чением содержания Н2О2 (хотя бы на мембранах форменных элементов плазмы при фагоцитозе и т.д.).

Предложенная система генерации нашла свое практическое применение : 1)выявлено свойство гликопептвда йейрогормона "С" как скавенджера НО' - радикалов., 2)обнаружено каталитическое свойство гидратированной меди воссташвливать феррицианвд:

геССИ)^5 + О-" »- геССИ)^ + о2, на основании чего был разработай очень чувствительный кинетический спектральный метод обнаружения меди., 3) Система Н^О^ + 02~ и глюкоза проявляет антисептические свойства и дает удовлетворительные аффекты у крыс. или глюкоэа применяются в клинике, как антисептические средства для обработки ран, с другой стороны раствор 10% глюкозы и Ъ% Н202 при рН 8-9 является стабильным источником супероксвдных радикалов, бактерицвдные свойства которых общеизвестны (эазайа ы., 1988). 1 4)данная система продуцирования 02" является отбеливающим и смягчающим шерсть (другие ткани) и бумагу средством (Ри31\»гага Т. а1.,1995).

Взаимодействие СОД с перекисями органических кислот и липоперекисями и генерированными из них супероксидными радикалами.

Как и в случае перекиси водорода, при разложении перекисей органических кислот или липоперекисей при рН 11,7 или выше, образуются супероксидные радикалы. Этот процесс намного ускоряется при нагревании (90-100°) и при повышении рН реакционной смеси

II, 4 ^ А ¿ии

Рис. II. ЭПР спектры и кинетические кривые их образования и утилизации (спонтанно или ферментативно) из органических (липид-ных)перекисей в различных условиях, а - Спектры ЭПР 0о~ получен-

ше при разложении: I - перекиси бензоила, при рН 12,5 (реакционная смесь содержит 90 мг перекиси,.15$ этанола, КОН и воду), общий объем реакционной смеси - 4 мл (смесь нагревали при 100° в течение 3 мин, ч.з. ЭПР спектров - 8.10°)., 2 - из перекиси янтарной кислоты (в аналогичных условиях), ч.з. - 2.10*., 3 - из перекиси малоновой кислоты, ч.з. - 5.10*., 4 - из перекиси фосфатидилхоли-на (40 мг), при рН 13 (смесь инкубировали при 25° в течение 6-8 мин), ч.з. - 5.10 ., 5 - кз перекиси кардиоляпина (50 мг), условия как в п. 4, ч.з. 8.10**., б - из гидроперекиси бензоила (70 мг) в 20% этаноле, при рН 13,4 (время инкубирования смеси - 4 юга, при 100°^, ч.з. 8.10*\, 7 - из перекиси олеиновой кислоты в 1Ъ% этаноле, ч.з. 8.10*4 В случае перекиси липидов, когда кх концентрация выэе, при рН 13 происходит полимеризация реагирующей смеси. б - Кинетические кривые образования (утилизации) из органических перекисей при инкубации реакционной смеси 100° и при трех-шшутноы инкубировании при различных температурах: зависимости при образовании 0£- из перекиси малоновой кислоты (I)., янтарной кислоты (2)., перекиси бензоила (3) и гвдроперекиси бензоила (4). в - То же саков при 3-х минутном инкубировании смеси в различных температурах.

СОД проявляет в этих условиях оптимальную активность при рН 12,4-12,6. 10~®М СОД дисмутнрует при рН 12,4 Ю"5 Ы 02~. В случае О2"", образованных из перекисей олеиновой кислоты и гидроперекиси изопропил бензоила, дисмутация практически не происходит. Стационарная концентрация О^" сравнительно высока в растворах перекиси бензоила и перекиси янтарной кислоты. После добавления полученных в этих условиях 0£~ к раствору СОД, рН смеси равен 9,5. Липиды, не содержащие перекиси, не влияют на свойства СОД, однако их перекиси восстанавливают медь фермента, тем самым инактивируя СОД. Синтетические органические перекиси при рН 7,4 восстанавливают медь СОД медленнее, чем липвдные перекиси. Как супероксидные радикалы, так и органические (липидные) перекиси способны в определенных концентрациях обратимо восстанавливать (инактивйровать) ООД (рис. 12), причем после аэрации происходит реокисленне меди фермента, с воз-•вращением активности. После удаления перекисей (диализом, гель-фильтрацией на а -10, на ДЕ-52 целлюлозе) СОД имеет ЭПР спектр нативной формы фермента.

Для выявления восстановительных свойств О2- было изучено влияние 0<>" на перманганат калия. Сама перекись бензоила не способна восстанавливать перманганат калия (в отличие от Н2О2), что быстро осуществляют супероксвдные радикалы, полученные при расщеплении са-

мой перекиси бензоила.

Рис. 12. Изменения интенсивностей ЭПР сигналов и оптических спектров СОД и кинетика этих изменений под влиянием органических перекисей или генерированных из них супероксидных радикалов, а -ЭПР сигналы: I - нативной СОД (5.10"^М)., 2 - это I, после добавления 0,05 мл 0^" (из перекиси бензоила), объем реакционной смеси - 2,5 мл (время инкубирования 30 мин при 25°, а рН раствора после добавления 02~ равен 9,4)., 3 - это 2, после аэрации 10 ч. б - Изменение интенсивностей оптических спектров поглощения СОД (I1) под влиянием 0,05 мл 2.10"^ М 02~ (¿) и после аэрации как в пункте (а) - (З1). Оптические и ЭПР спектры регистрировали одновременно. в - Кинетические кривые восстановления и реокисления меди фермента (2 мл), после добавления 0,05 мл

2.10-3М 02~ (I)

(приведены оптические и ЭПР данные) или 0,1 мл 2. КГ3 К 0о" при рН 10,3 (2). г - Кинетические кривые восстановления меди СОД под влиянием органических перекисей при рН 7,4, к раствору СОД добавлены: I - 10/5 перекиси бензоила., 2 - 10% перекиси янтарной кислоты. , 3 - 10% перекиси малеиновой кислоты. ,4-5% гидроперекиси иэопропил бензоила., 5 - перекиси фосфатвдилхолина в 10% этаноле., 6-5% перекиси кардиолипина в 10 % этаноле. Таким образом,как супероксидные радикалы, так и органические перекиси в определенных количествах обратимо восстанавливают (инактивируют фермент) медъ в активном центре фермента. При аэрации происходит реокис-ление меди (реактивация фермента).

Время полураспада в вышеприведенных условиях у органических перекисей намного больше, чем в случае перекиси водорода (перекиси кардиолипина, ацетил холина расщепляются даже без нагревания).

Количество образующихся зависит от температуры, pH реакционной смеси и концентрации перекисей. Образованные из органических перекисей также стабилизируются ионами Na+ или К1".

После дисмутирования Og" СОД продуцирует их сравнительно медленным' процессом. Супероксидные радикалы, полученные из органических перекисей,ферментативно дисмутируются в»3 рада меньше, чем Og-, полученные из перекиси водорода. Это может быть связано с тем, что pH реакционной среды довольно высока, среда вязкая и фермент в основном восстановлен перекисями. Как показано на рис. 12, 0£~, образованные из перекиси бензоила, янтарной кислоты восстанавливают медь фермента при pH 9,5. После аэрации медь фермента окисляется и СОД,в основном,сохраняет свои первоначальные (на-тивные) свойстза. Таким образом из органических перекисей и при сравнительно низких величинах pH образуются супероксвдные радикалы.

По аналогии с f^Og и органическими перекисями, не являются ли липоперекиси митохондриальных мембран источником генерации 0g~ и как они действуют на активность СОД в нейтральных средах in vitro? Для ответа на этот вопрос сперва было определено количество продуктов ПОЛ (МДА) мембран митохощрий. Эти мембраны промывали 1% WaCl и после диализа против воды собирали центрифугированием. Количество МДА в этих мембранах составляло около 5.10 моль/г мембраны при 20° (время инкубирования мембран в аэробных условиях составляло 30 мин). Количество МДА увеличивается при повышении pH, температуры и времени инкубирования мембран. В присутствии 20-25 мг мембран резко увеличивается скорость образования форма-зана при восстановлении нитросинего тетразолия супероксидными радикалами, особенно в присутствии этанола или глюкозы. Добавлением к этой смеси СОД (10-%, инкубированной с мембранами (0,5 г/мл) в течение 10-15 мин, образование формазана подавляется всего на 25-30%. После удаления мембран и аэрации раствора СОД в течение 45-50 мин фермент в количестве 10"% полностью ингибирует образование формазана. В результате инкубирования СОД с мембранами медь в активном центре фермента почти полностью восстанавливается и этот процесс ускоряется при 35-40°, параллельно содержание МДА повышается в 2-3 раза. Это говорит о том, что существует обратная зависимость между СОД-активностью фермента и содержанием липопе-рекисей митохощриальных мембран. Удалением из этого раствора фермента мембран и добавлением феррицианида к супернатанту, медь ре-

окисляется (фермент реактивируется) (рис.13).

2600

3000 Н, Гс 3400

мин 4

Рис. 13. Влияние лкпоперекисей митохондриальных мембран на свойства СОД. ЭПР спектры нативной СОД (a-I) и после добавления митохондриальных мембран (0,5 г/мя) в течение 20-часовой инкубации при 4° (а-2)., после удаления мембран и добавления к раствору фермента феррицианцда (а-3). Условия регистрирования ЭПР спектров, как на рис.2.. На 36 приведены кинетические кривые восстановления меди СОД при инкубировании фермента с мембранами при 20° (б-I) и 40° (6-2) и после удаления мембран и добавления фер-

рицианида (---). в - Это кинетические кривые образования фор-

мааана в отсутствии (в-I) и в присутствии 25 мг/мл мембран (в-2), после добавления к I 0,05 мл СОД (Ю-^), инкубированной с мембранами (0,5 г/мл), в течение часа (в-3) и после удаления мембран и аэрации растворов СОД и добавления последних (5.10~®М) к I получается 31

Таким образом, как перекись водорода и органические перекиси, так и липоперекиси митохондриальных мембран являются источниками генерации хак в щелочных, так и в нейтральных средах. Однако, поскольку концентрация Н0~ при рН 7,4 невысока и перекиси расщепляются неинтенсивно, невысока и стационарная концентрация Og", образующихся (как и в случае п0 следующей схеме:

°2

НО"

0о

но*

Как в случае перекиси водорода, так и органических (липидных) перекисей СОД действует по следующей схеме:

С0Д-си+2+ нот (перекиси) С0Д-Си+1 + НО*

СОД-си+1 + Og —»- С0Д-Си+2+ Og~, после суммирования этих уравнений получается:

Ho^T^Og m. но- + о2~

В< случае органических (липидных) перекисей источником "горячего" кислорода, способного после одноэлектронного восстановления превращаться в 0g~, являются расщепляющиеся (особенно при повышенных значениях рН и температуры) перекиси. Не, исключено, что в физиологических условиях также может иметь место образование 0g~ этим путем, при усилении процессов ПОЛ. То, что перекиси являются источником продуцирования 0g~, в дальнейшем было показано и другими исследователями ( Fe dor ova O.S. et al,1983., Yamashaji S.et al, 1979., Csanyi L.J. et al, 1981., Lókesli В'.Е. et al,1986).

В тех случаях, когда в организме происходит повышение уровня ПОЛ, медь в активном центре СОД может восстанавливаться (фермент инактивироваться) не только образующимися перекисями'(включая HgOg), но и супероксидными радикалами. В данной системе не исключено продуцирование 0g~ и ферментативным путем, с помощью соответствующих окседоредуктаз, локализованных в мембранах митохондрий (ïtohl H. 198б,1987)« однако вышеприведенные результаты говорят о доминирующей роли липоперекисей в деле образования Og" и восстановления меди С0Д< Вообще, в отличие от перекисей органических кислот, гидроперекисей и перекиси водорода, липоперекиси расщепляются легче, даже при комнатной температуре, с образованием "горячего" кислорода(02), который и способен путем одноэлектронного" восстановления превращаться в 0g~.

Не исключается, что дисмутируя избыток 0g~ и в дальнейшем генерируя их, СОД тем самым также может регулировать уровень этих радикалов s клетке.

Обобщая вышеприведенные результаты, можно констатировать, что если неорганические перекиси (HgOg) инактивируют СОД необратимо и являются источниками продуцирования Og", то органические (липид-ные) перекиси инактивируют СОД обратило и также продуцируют 0g~ аналогичным (как при HgOg) механизмом. Действительно кнеацев место такое инактивирование СОД в условиях in vivo , при различных патологических состояниях, будет показано в следующем параграфе.

§ 3. Количественные изменения и факторы инактивирования эндогенной СОД и ее защитный эффект при патологических состояниях.

Исходя из того, что, с одной стороны, в условиях in vitro СОД обратимо или необратимо кнактивируется органическими (лкпид-ными) перекисями и перекисью водорода, соответственно, и, с другой, СОД не токсична и имеет низкое антигенное свойство (это было показано Carson s.et alp973и подтверждено на вццеленном нами препарате СОД), целесообразно было определить уровень, активность эндогенной СОД и возможный протективный эффект экзогенной СОД при таких патологических состояниях, в ходе которых повышается уровни активных соединений кислорода (Og", НО", HgOg, перекисей липвдов).

Белковая терапия уже в течение нескольких десятилетий успешно применяется в экспериментальной медицине и в клинике (Ельяш-кевкч Э.С. И др., 1967., Eubino Е. et al, 1968., Steinbuch М., 1969)- С помощью if -глобулинов доказано, что введенный в организм белок проходит в цитоплазму клеток, но не в ядро" (Кузнецов O.K., 1967). Причем для повышения времени полураспада введенных в организм белков (включая СОД, для которой оно составляет 25-30 мин), их стабилизируют путем иммобилизации (коньюгировагая) с различными носителями или путем капсулирования в липосомах (Richard Ph. et al,l989.,Con£orti A.et а!Ц1986)• Введенная в организм СОД в основном связывается с внешней поверхностью мембран клеток и так или иначе компенсирует уровень экстрацеллюлярной СОД ( Karlsson К. et al., 1988 ).

Модельные эксперименты проводились на белых крысах линии "Вистар". В отдельных случаях проводились и клинические испытания на добровольной основе.

Изученные потологические состояния включают:

1. if - и УФ лучевое поражение,

2. оЬтрая и хроническая алкогольная интоксикация,

3. гипо- и гипергликемия,

4. термические ожоги,

5. экспериментальные опухоли,

6. коразолевые судороги и эпилепсия,

7. желудочно-кишечные, язвенные заболевания,

8. воспаление слизистых оболочек (горло, глаза),

9. пневмония детей раннего возраста.

I. Факторы инактивирования, уровень и защитная функция СОД при У -излучении.

Известно, что в результате.ионизирующей радиации в живых организмах из-за радиолиза воды и других процессов повышается уровень активных соединений кислорода (Гусев В.А. и др., IS80.> Greenstock C.L.,1986). Против этих соединений в клетках существуют защитные системы, внутриклеточные: СОД, каталаза, глутатион-пероксидаза, глутатионредуктаза и др. и внеклеточные: экстрацел-люлярная СОД, церулоплазмин, трансферрин, витамины Е и С и др. Изучение динамики изменений'уровня и активности этих метаболитов, в частности СОД, имеет важное научно-практическое значение.

В частности были изучены факторы инактивирования СОД в условиях in vivo, подвергая крыс tf -излучению (на установке ЛУЧ-I) с дозой 650 р. В in vitroonKTax водные растворы СОД подвергли и --облучению на приборе РУП -200/20, с мощностью облучения 2.10^ рад/мин в течение 20 мин. Далее подвергали облученио цельную кровь и очищенные эритроциты (доза облучения: 2,35, 4,7, 9,4 Гр j.мощность облучения 0,2 Гр/мин), при этом к очищенным эритроцитам взамен плазмы добавляли в равном объеме 1% HaCI содержаний цитрат-ный буфер (рН 7,4). СОД вьщеляли из печени крыс (облученных и ин-тактных) и из очищенных эритроцитов и эритроцитов цельной крови (с облучением и без облучения- контроль).

СОД, выделенная у облученных животных, не имеет характерного сигнала ЭПР и оптического спектра поглощения и активность понижена на 2 порядка. Однако, при аэрации этого препарата СОД или после добавления феррицианида, почти полностью возвращаются характерные для нативной СОД. свойства (ЭПР и оптические спектры), включая ее активность(рис. 14).

Рис. 14. Изменение свойства СОД после i - излучения.

а- Кинетика изменения величин относительных интенсивностей оптических спектров поглощения и ЭПР сигналов (они коррелируются) растворов СОД, выделенной из печени интактных (• ) и облученных (А) крыс и после аэрации или добавления феррицианида к СОД из облученных животных (о ). б - Свойства облученной СОД в растворе. СОД-активность (она выражена в процентах ингибирования образования формазана) необлученной (I) и облученной (2) СОД. . После аэрации (2) получается кривая (3). в - Кинетические кривые изменения величин относительных интенсивностей оптических спектров поглощения и ЭПР сигналов необлученной (о) и облученной (Л) СОД и после аэрации последней (А).

СОД, вьщеленную у облученных животных, каких-либо качественных изменений не претерпевает (имеются в ввду спектральные характеристики), как указывалось выше имеет место лишь восстановление меди в активном центре фермента, и это носит обратимый характер. "Однако,несколько иначе изменяются свойства СОД и ката-лазы, при облучении очищенных эритроцитов и эритроцитов цельной--крови. С повышением дозы облучения вышеприведенные спектральные характеристики (ферментативные активности) изменяются заметнее (понижаются интенсивности оптических и ЭПР спектров и активности ферментов) и это имеет необратимый (20-30$) характер, особенно у очищенных эритроцитов (при повышенных дозах облучения), где отсутствует внезритроцитарная (сывороточная) антирадикальная защитная система. Эффект обратимого восстановления меди фермента скорее всего связан с повышением в результате ионизирующей радиации (или в результате радиолиза воды организма или в растворе) уровня активных соединений кислорода, в первую очередь с ли-поперекисями мембран клеток или эритроцитов (Pederson Т.С. et al, 1973., Gutteridge J.II.C. et al.,1982), как это было показано в предыдущем разделе на примере перекисей митохоцдриальных мембран.

При Í -облучении изменения свойств СОД углубляются в зависимости от уменьшения в данной среде содержания антирадикальных защитных систем. Фактически под влиянием ионизирующей радиации механизм изменения характерных свойств СОД in Vi tro , in vivo мало отличаются.

Таким образом при облучении У -лучами происходят изменения (в основном обратимые) свойств СОД (каталазы), приводящие к нарушению баланса продуцирования и утилизации активных соединений кислорода и в результате этого нарушается физиологический статус

организма, приводящий, в зависимости от глубины происходящих процессов (доз облучения), к гибели организма. Это обстоятельство дало предпосылки использовать экзогенную СОД и каталазу, как защитные средства, для понижения губительных последствий У-ионизирующей радиации.

Так, при внутрибрюшинном введении крысам 0,03 - 0,06 мг/мл СОД в физ. растворе через час и через два дня после облучения, выживаемость животных увеличивается на 40-45% (СОД вводится всего 4 раза). Облучение крыс в дозе 800 р проводилось при помощи-установки РУМ-П (мощность дозы ЗЗр/мин, фильтры - 0,5 мм меди и I мм алюминия., кожно-фокусное расстояние - 40 см). СОД при аналогичном использовании оказывает терапевтическое действие и при радио-термическом'комбинированном поражении. Причем СОД приводит к некоторому снижению (около 20%) числа лейкоцитов в периферической крови и,'наоборот, к повышению числа эритроцитов, ближе к норме., процент увеличения выживаемости составляет 20-25%.

Экзогенная СОД ускоряет также заживление термических ожогов (СОД вводится внутримышечно после ожога кожи (15%), в дозе 0,3 мг/мл, 4 раза, через день). При этом повышается уровень эндогенной СОД в печени крыс, с соответственным понижением уровня ПОЛ (МДА).

Для косвенного доказательства защитной роли эндогенной СОД при У - излучении, экранировали левую почку крыс свинцовой пластинкой (3 мм, 15 х 22 см). Активность СОД у экранированных животных снизилась всего на 10-15%, а у неэкранированных"-- на 50 - 60 %. Количество лейкоцитов и эритроцитов у экранированных животных снизилось незначительно. В результате этого (облучение животных проводилось как прежде) выживаемость повысилась приблизительно на 25%.

Таким образом,сохранение уровня эндогенной СОД приводит к увеличению радиорезистентности организма. Это дало нам основание путем регулирования уровня эвдогенной СОД (введением экзогенной СОД или другим путем)повысить антирадикальную защиту организма. Это можно осуществлять и естественным путем, создавая подходящие условия для синтеза организмом соответственного уровня СОД. Это осуществляли следующим образом. Крысам давали вместо воды 20-22% этанол (вода дается через каждые 5 дней) в течение 12-14 дней. В результате этого уровень эвдогенной СОД в печени животных повысился почти в 2 раза. Подвергая облучению ¿Г - лучами (550 р), выживаемость животных повысилась на 42-44%. Повышение уровня эвдогенной СОД у микроорганизмов (Гусев В.А. и др., 1980) в отличие от млекопитающих не увеличивает радиорезистентность

организма. Это говорит о существенном отличии механизмов действия ii -лучей на указанные объекты. Менее эффективно, когда введение этанола проводили после облучения (выживаемость повышается всего на 20-25%). Для крыс указанные условия подачи этанола оптимальные, их изменение приводит к нежелательным последствиям. При соответственном испытании и корректировании предложенный способ, возможно, даст положительный эффект и в клинических условиях.

Радиопротекторный эффект СОД в дальнейшем был подтвержден PetkaaA., 1980,1984, 1986., Jiang J.et al,1984 ..Zalesna G. et al, 1980., May Z. et al.1985,, Tomkins P.T.et al., 1990 . Защитный эЗхЕект экзогенной СОД и каталазы при УФ-повреждениях кожи в эксперименте.

Эксперименты проведены на 80 морских свинках обоего пола^массой 300-400г. УФ-облучению в дозе 2 МЭД спектром 'от 300 до 400нм подвергался выстриженный участок кожи размером 6x3 см. Источником облучения служила установка пПсорилокс-3050", удельная плотность мощности - 1,7 Дж/см^. Внутривенное введение экзогенных СОД (I мг/кг) и каталазы (2 мг/кг веса животного) через 30 мин и через 4 часа посла облучения кожи оказывало защитный эффект от УФ-повреждения. Причем каталаза предохраняла от истощения глутатионредуктазу (у интактных животных - 0,53 + 0,03., у облученных в дозе 2 МЭД - 0,26 + 0,02., у получивших каталазу на фоне УФ-облучения - 0,46 + 0,03 ед), токоферол (соответственно 17,9 + 0,8., 14,6 + 0,4 и 17,2 + 0,7 мкмоль/л), СОД (1,46 + 0,43, 0,73 + 0,05., 1,38 + 0,2) и антиоксидантную активность (А0А) сыворотки крови (22,45 + 1,2%., 19,95 + 1,1 и 22,55 + 1,2%). Однако все же происходило повышение содержания МДА (у интактных животных - 7,2 ♦ 0,3 мкмоль/л, у облученных - 8,35 + 0,5., у получивших каталазу - 8,1 + 0,31). СОД проявляла себя как терапевтическое средство высокой эффективности, способное полностью оборвать развитие цепной свободнорадикальной реакции .«вызванной У1-- облучением кожи.

Полученные результаты указывают на важную патогенетическую роль С>2~ в инициации процессов ПОЛ при УФ-облучении, на исключительную регулирующую и защитную роль СОД и каталазы при УФ-об-лучении, а также на ее высокую терапевтическую эффективность в начальном периоде развития фотоповреждений. В дальнейшем эти результаты подтвердились со стороны Miyachi Y.,(1987) и Zelak U, et al, 1991.

2. Уровень эндогенной СОД и ПОД и защитный эффект экзогенной СОД при острой и хронической алкогольной интоксикации в эксперименте.

Исходя из того, что этанол увеличивает продуцирование Og-при расщеплении перекисей в orarraxin vitro , появляется необходимость изучить и показать возможность протекания этого процесса и в условиях in vivo, в частности при алкогольных интоксикациях.

Острую алкогольно интоксикацию (ОАИ).у белых крыс (170-180г) вызывали однократным внутрибрюшиншм введением этанола из расчета бг/кг массы животного, на фоне 16 - часового голодания. Хроническую алкогольную интоксикацию (ХАИ) вызывали ежедневной (на. протяжении 25 и 40 дней) дачей вместо воды 20-25% этанола (вода подавалась через каждые 5 дней). Количество УДА в аскорбат-и НАДФН-зависимой ПОЛ выражали в нмоль/мг белка (последнюю определяли по методу Лоури). Продукты ПОЛ определяли в гомогена-тах печеночной, мозговой тканях, в цельной крови и эритроцитах' при ОАИ и ХАИ.

На основании оптических и ЭПР данных было установлено, что при ОАИ количество СОД уменьшалось на 50 + 1/5 в печени крыс с одновременным обратимым восстановлением меди в активном центре фермента в отмеченных пределах. При реокислении меди имеет место полное превращение ее в Си+2 -СОД с соответствующим повышением активности фермента. ОАИ сопровождается увеличением коли- . чества МДА на 20-30%, в печени., в эритроцитах в 1,4 раза., в мозгу в 1,2 раза,, в цельной крови в 1,05 раз. При ХАИ количество МДА увеличивается: в печени в 1,5-1,8 раз (25 дневная ХАИ), в эритроцитах около 2 раз •в мозгу в 1,5 раза, в цельной крови в 1,3 раза. При 40-дневной ХАИ указанные величины в основном мало изменяются. При 25-дневной ХАИ наблюдается повышение содержания СОД в печени в 2,3 раза, при 40-дневной ХАИ в 1,9 раз (Р< 0,05). Известно, что при ОАИ активность СОД понижается (Груздева К.Н., 1986., Ribiere C.et al,1985.,Peher J.et ai;i987), а при ХАИ, наоборот, повышается (Marklund S., 1983). В ответ на повышение уровня ПОЛ, организм при ХАИ синтезирует соответственное количество СОД против активных интермедиатов кислорода. Этот факт подсказал нам проверить и выявить возможную протективнуто функцию экзогенно введенной СОД при ОАИ и ХАИ. При ОАИ внутримышечное введение СОД (0,8 мг/кг массы крыс) за I час до и через

каждые 4 ч (всего 3 раза) после введения этанола сопровождается повышением содержания эвдогенной СОД в печени и убылью количества МДА ближе к норме. При этом обнаруживается заметное возрастание выживаемости животных (50-60$) при ОАИ. Известно, что этанол сам инициирует процесс ПОЛ мембран клеток (shaw S. efc al., 1981), при фотолизе продуцирует 02~ (Bielski В.Н., 1982, 1984) и способствует высвобождению 02~ макрофагами (Dorio H.J. efc al., 1988). Эффективность СОД при алкогольной интоксикации ведимо связана и с тем, что этанол, улавливая НО* - радикалы, способствует "активированию" СОД.

Разработанная методика повышения уровня эвдогенной СОД (при 15 дневной ХАИ) может иметь профилактическое значение для устранения воспалительных заболеваний, сопровождающихся понижением уровня эвдогенных антиоксвдантов, в частности СОД. Как было показано выше, это дает возможность повысить выживаемость животных при У - излучении.

Таким образом^этанол является важным компонентом, играющим определенную роль в системе продуцирования 02~ (из перекисей) в условиях in vivo и in vitro.

Как было показано выше, другим, народу с этанолом, важным компонентом системы продуцирования. 02- при расщеплении перекисей в условиях in vitro являются сахара (как скавенджеры НО'- радикалов). Для выявления механизма действия Сахаров, в частности глюкозы,на ход образования 02- в условиях1п vivo , нами подобрано патологическое состояние, сопровождающееся увеличением (гипергликемия) или уменьшением (гипогликемия) содержания глюкозы в организме с определением уровня эндогенной СОД и роли экзогенно введенной СОД.

3. Влияние экзогенной СОД на уровень ПОЛ, эвдогенной СОД (ката-лазы) при гипергликемии и гипогликемии.

В условиях In vitro глюкоза ускоряет процесс продуцирования 02~ при расщеплении перекисей, а полученные 02~ (при их накоплении) реагируют с глюкозой и,как результат этого, рН раствора падает до 5 единиц (по всей вероятности образуются глюконовые кислоты). Для выяснения этого двойственного эффекта глюкозы (возможно глюкоза действует как регулятор уровня 02-) in vivo были определены уровни ПОЛ, СОД при гилер- и гипогликемии, без введения и с введением экзогенной СОД.

Экспериментальную гипергликемию (аллоксановый диабет) вызывали у крыс линии "Вистар" (150-200 г), однократным в нут ри б ршинным введением аллоксана.в дозе 15 мг на 100 г массы животного. Крыс декапитировали на 5-е сутки. На терминальных стадиях заболевания плотность оптического поглощения при 680 нм (для СОД) и 530 нм (для каталазы), а также интегральная интенсивность ЭПР спектров СОД уменьшались на 40-42% (р 4. 0,05). Медь в активном центре СОД была восстановлена всего на 8-10%, соответственно уменьшалась СОД (и каталазная) активность выделенных препаратов СОД и каталазы. Причиной понижения СОД активности при гипергликемии является уменьшение количества этого фермента. Продукты ПОЛ (ЗДА) при гипергликемии возросли в 1,8 раза. Причем, образовавшиеся активные соединения кислорода способны не только инактивировать антирадикальные защитные ферменты, ко и нарушить функцию §-кле-ток (Blech D.M. et al, 1983., Sinet P.M. et al, 1981., Kono Г. et al, 1982., Tho L.L.et al.,1987). Поэтому защитная роль эк-зогенно-введенной СОД очевидна (этот эффект СОД был показан в работах Геворкян Д.Н. и др., 1981., Grankviat К. et al,1981., Та-niguchi И., 1992).

При внутрибрюшинном введении СОД и каталазы (0,3 мг/мл и 0,6 мг/мл, соответственно) на 2-ой день после дачи аллоксана и еще 3 раза через каждые 2 дня, уровень глюкозы понизился,приближаясь к норме. Вероятно, это связано с восстановлением нарушенной функции § -клеток и с нормализацией уровня эндогенной СОД. Можт предполагать, что при аллоксановом диабете накопление глюкозы вызывает повышение уровня Of in vivo (в условиях in vitro это констатировано).

Совершенно противоположные процессы имеют место при гипогликемии, которую вызывали двукратным внутрибротинным введением инсулина в дозе 20 ме/кг массы животного. Контрольные животные вместо инсулина (или СОД) получают в равном объеме физ.раствор. СОД в указанной дозе вводили внутрибрюиинно в первый день, спустя 5 часов после введения инсулина, и на второй день, через час после введения гормона. Крыс декапитировали, спустя 3 часа после вторичного введения инсулина. Как всегда, животные были разделены на 3 группы, по 20 в каящой: I)получившие физ.р?.?твог (контроль)., 2) - получившие инсулин., 3) - инсулин + СОЛ.

Как и в случае гипергликемии, различия го межту ЭПР СОД,

выделенной из печени интактных, оттнт-'х (гигогди^гмня) и omwn«

+ СОД крыс не наблюдались. Таким образом СОД не претерпевает ка-кихлибо качественных изменений при гипогликемии. По ЭПР спектрам выяснилось, что у опытных животных восстановление Си+2 в активном центре отсутствует. Количество МДА в печеночной ткани у опытных животных уменьшалось приблизительно в 1,8 раза (табл. 3), а у получивших СОД животных - в 3 раза. Таблица 3.

Содержание по ЭПР спектрам СОД (М) и МДА (нмоль/мг белка) в печеночной ткани (Р^: 0,05).

Определяемое У контрольных У опытных У опытных,

вещество животных животных получивших

(гипогли- 2 мг/кг СОД

кемия)

СОД 2.КГ5* 0,1 г.б.ю-5* 0,1 2,7. КГ5;»; 0,2

ВДА 4,5+ 0,3 2,4+ 0,2 1,5+ 0,12

Количество СОД" при гипогликемии увеличивалось на 15-20%, с введением фермента - на 25%. Введение СОД заметно понижает уровень ВДА при гипогликемии. При гипергликемии активность эндогенной СОД в печени крыс уменьшалась, так как образующиеся перекиси и 0g~ обратимо или необратимо инактивировали СОД. Наоборот, при понижении содержания активных интермедиатов кислорода уменьшается процесс деградации СОД, что в действительности имеет место при гипогликемии и является причиной некоторого прироста содержания эндогенного фермента и гибели животных. Это сввдетельтсву-ет о том, что для нормального функционирования организма необходим соответствующий уровень активных соединений кислорода (перекисей), они необходимы для синтеза простагландинов, прогестерона, для регуляции функции лизосомальных мембран, для фагоцитоза и т.д.(Журавлев А.И., 1975). 0 том, что для нормального функционирования клетки необходим определенный физиологический уровень 0g~ и перекисей, говорит и тот факт, что экзогенно введенная СОД приводит к гибели животных при гипогликемии, спустя около 50 часов и, наоборот,имеет протективный эффект при гипергликемии. Таким образом4как повышение, так и понижение уровня 0¿~ (перекисей) в

равной степени нежелательные процессы для организма. Необходимо иметь в виду и тот факт, что образующиеся Og- способны и расходоваться путем реагирования с глюкозой, возможно глюкоза играет регулирующую роль в отношении уровня супероксидных радикалов. •

4. Содержание и активность эндогенной СОД и влияние экзогенной СОД на ход развития экспериментальных опухолей (лкмфосаркомы Плисса. саркомы-45, гепатомы Зайделя).

Активность СОД понижена в тканях опухоленосителя или непосредственно в опухоли (Пескин A.B. и др., 1976., Bize X.B. et al/ l980.-,Galeotti т.,1983). В то же время при развитии опухоли понижается и активность каталазы (Bartekowiak А. 1981., Bozai А., 1979). В основном понижается активность Са,2пС0Д, а активность Мп-СОД практически не изменяется (Loven D.P. et а1,1980., Takaga Y. et al.,1982). Однако в литературе имеются разноречивые данные об активности СОД в опухоленосителях. В некоторых случаях активность СОД увеличивается, особенно на начальных этапах роста опухолей (Ланкин В.З. и др., 1976, Fernantez-Pol J.A. et al., 1982), а активность Мп-СОД уменьшается или вовсе отсутствует (Dionosí; D.et al,1975). Возможно, что это связано не только с характером опухоли, но и с различием методов определения актив-ности-'СОД.

Уровень активных соединений кислорода в опухолевых клетках намного выше (по сравнению с нормальными клетками) и они счита-.готся стимуляторами роста опухолевых клеток (shinkai К.et al, 1986, Cunningham M.L., 1985., Kensler T.W., 1984). Наоборот, антимутагенное и цитотоксическое свойства описываются в работах Okayama s.(I98I), Drath D.B.(1986).Gloves D. (1986). Таким образом однозначно трудно идентифицировать и обобщать механизмы воздействия антиоксидантных ферментов и активных форм кислорода при различных видах опухолевого роста. Тем не менее, изучение количесивенных изменений (по оптическим спектрам поглощения и по ЭПР сигналам) СОД даст механизмы выявления факторов инактивиро-вания этого фермента. Это создаст возможность более эффективного использования экзогенной СОД как возможного средства, подавляющего рост опухолей.

В качестве моделей экспериментальных опухолей использовали: лимфосаркому Плисса., саркому-45 и гепатомы Зайделя.

Кивотные были подразделены на 3 группы, по 20 в кадцой: I) интактные, 2)опухоленосители, 3)опухоленосители, получившие вну-

тримышечно СОД. Были подобраны крысы-самцы, с массой 100-120 г. После прививки соответственного опухолевого штамма продолжительность жизни животных составляла 12-14 дней. СОД выделяли и очищали из 50 г печени, по разработанному нами методу. Активность СОД определяли по методу н±яЫ и1 М. еЬ а1, 1972.

На 4, 8 и 12 день роста лимфосаркомы Плисса животных забивали декапитацией и извлекали печень. Параллельно брали печень и у ин-тактных и получивших СОД опухоленосителей. Всего проведено 4 выделения при данной опухоли.

Понижение плотностей оптических поглощений СОД в первые 4-5 дней роста опухоли (по данным изменения при 265 нм) незначительное. Наоборот, по данным изменения при 680 нм и интенсивностей ЭПР спектров СОД ( г) наблюдается их резкое понижение в эти сроки и в дальнейшем - на 8-12 день заболевания (рис.15).

Рис.15. Кинетические кривые изменения величин плотностей оптического поглощения и интен-сивностей ЭПР спектров СОД в различные сроки развития лим-фосаркомы Плисса.

I - Зависимость изменения при 266 нм., 2 - з1висимость изменения величин плотностей оптического поглощения при 680 нм или зависимость изменения величин интегральных ин-тенсивностей ЭПР спектров СОД (ч.з. 5.10^, другие параметры регистрирования ЭПР сигналов, как на рис.:2).

Исходя из этих данных, можно условно выделить 2 стадии развития лимфосаркомы Плисса. Если в первой стадии (до 4-5 дней после прививки штамма) преобладает процесс изменения хромофорной группы СОД (преобладает процесс обратимого восстановления меди СОД), то во 2-ой стадии (с 8 до 12 дней) преобладает процесс понижения содержания СОД. В 1-ой стадии происходит обратимое восстановление си+2 в активном центре фермента до 30% и медь почти полностью реокисляется (продуванием кислорода). Однако, Си -СОД, ввделенная из печени крыс-опухоленосителей во 2-ой стадии развития опухоли, после продувания кислородом окисляется всего на 6-8%

8 дни 12

(Р< 0,05). Если в I стадии потеря активности СОД носит обратимый характер, то во 2-ой стадии роста опухоли понижение интенсивнос-тей оптических и ЭПР спектров и ее активности (до 40%), в основном связано с уменьшением содержания СОД (видимо преобладает процесс деградации СОД).

В отличие от лимфосаркомы Плисса, при саркоме-45 в период кульминации роста опухоли наблюдалось некоторое увеличение (20%) содержания (активности) эндогенной СОД в печени крыс, по сравнению с интактными крысами. Вероятно, при развитии саркомы-45 происходит увеличение уровня активных интермедиатов кислорода в заметных масштабах и, в ответ на ото, организм успевает вырабатывать соответствующий уровень СОД". Фактически увеличение уровня эндогенной СОД способствует росту данной опухоли. Если при лим-фосаркоме Плисса экзогенно введенная СОД (I мг/кг веса животного, всего 3 раза, через каждые 3 дня, начало подачи СОД через 2 дня после прививки опухолевого штамма) подавляет рост опухоли на 30%, то при саркоме-45 экзогенно введенная СОД, наоборот, стимулирует рост опухоли в 1,6+ 0,1 раза. Причем, под влиянием экзогенной СОД уровень эндогенной СОД в печени крыс повышается в 1,2-1,4 раза.

В качестве другой модели экспериментальной опухоли исследовали гепатомы Зайделя под действием туляремийной вакцины и СОД. Иммунизация крыс туляремийной живой вакциной (ТВ), тормозит рост некоторых экспериментальных опухолевых штаммов. Возрастание противоопухолевой резистентности организма под влиянием ТВ сопро-вовдается увеличением активности СОД (30%). В данном исследовании изучалось влияние экзогенной СОД, полученной из печени быка и сочетающегося действия ТВ и СОД на среднюю продолжительность жизни крыс с асцитной гепатомой Зайделя. Если в контрольной группе крыс асцит вызван у всех животных, то у животных с гепатомой Зайделя, получивших СОД (внутримышечно - 0,3 мг/мл - 3 раза, через каздые 2 дня) асцит вызван в 70% случаев: У иммунизированных, с последующей прививкой гепатомы и подачей СОД, асцит вызван у 50+ 2% животных. По сравнению с соответствующим контролем продолжительность жизни животных увеличивалась также на 50%. Таким образом^под влиянием вакцины уровень эндогенной СОД увеличивается, а введенная экзогенная СОД способствует некоторому подавлению роста гепатомы Зайделя.

Интенсивное образование 02~ у животных-опухоленосителей в

ядерных, микросомальных мембранах, в ПМН-лейкоцитах и т.д. повышает процессы ПОЛ, особенно фосфолипидов и содержание перекисей повышается в первые 4-5 дней после трансплантации опухолевого штамма (Бурлакова Е.Б., 1983). В то se время, как было показано выше, образующиеся 0¿~ и перекиси восстанавливают медь супероксщдисыу-тазы и несколько инактнвируют фермент. В этих случаях (лимфосар-кома Плисса и гепатома Зайделя), особенно в начальные этапы роста опухоли, основными восстановителями меди фермента являются липопе-рекиси, которые, в отличие от HgOg, обратимо восстанавливают или инактивируит фермент. Вероятно HgOg также влияет на этот процесс, так как медь супероксиддисмутазы не полностью реокисляется после аэрации. Фактически действие активных форм кислорода на СОД в условиях in vivo не отличается от их действия in vitro и при этих опухолях. Интересен и тот факт, что на терминальных стадиях развития лиыфосаркоыы преобладает процесс торможения образования СОД, а также каталазы (для каталаэы составляет 15+1%). Это вероятно связано с тем, что образовавшиеся (другие активные соединения кислорода), усиливая выход РНК из ядер (Пескин А.В., 1976) и вызывая деградацию ДНК (Rowley D.A. et al, 1983), тем самым нарушают их нормальное функционирование. Уменьшение каталазной активности у опухоленосителей тесно связано с .инактивирующим действием (kono Y.et al., 1982). Вообще.вещества, реагирующие с нуклеиновым;: кислотамл, являются потенциальными канцерогенами (Halliwell В. et al.,1984). Тем самым 0?" такае mrW быть таковыьо!- Не исключено и действие НСР радикалов? которые всегда присутствуют в системе пере-кись-супероксвд (Pridovich I.,et all975). Однако 02~оказывают 2, фактически противоположных действия на рост опухолевых ю еток: 0о~ имеют антимутагенное (цнтотоксическое) свойство (Воробьеьа Л.И. и др., 1993., Amare Т. et а1,1993),(ЧТОочевидно при саркоме -45, наоборот, 02~вызывают рост опухоли (в случае лшфэсаркомы Плисса и гепа-томы Зайделя), что показано и у других опухолей (Shinkai к. et al, 1986•, Nakamura Г., et al., 1985 ) и протективная роль экзогенной СОД очевидна (Oberly L.W. et al, 1982, 1984).

Вероятнее всего двойственный эффект супероксидных радикалов связан с различием концентрации этого активного соединения и при соответственных изменениях этой концентрации можно подавлять или стимулировать рост клеток, в частности, опухолевых.

Надо иметь введу, что в опухолевых клетках уровень суперокск-дов по сравнению с нормальными клетками повышен и любое отклонение

от этого уровня приводит к нарушению нормального физиологического состояния клеток. Действие на рост лгафзсаркоиы Шгисса и более расширенное их обсуждение будут приведены в следующей параграфе.

5. Уровень и защитный эффект супероясиддисыутазы пр.ч судорожных припадках и эпилепсии.

Уеханизи развития судорожных припадков у болышх эпилепсией н экспериментально вызванных судорожных состояний у гшотных связывается с повышением уровня возбудимости нозг<ч в результате нарушения синаптической передачи (Громов I.A., 1573», Чзряенко А.П., IS82). Вместе с зтга установлена важная роль свободнорадн-кальных окислительных процессов с участием аютг ых кнтермедиа-тов кислорода в регуляции трансмембранного ионного тока, который во многом определяет возбудимость нейрона (Неделина 0,С. и др., 1981). В очагах эпилептической активности в коре головного мозга резко активируется ПОЛ ('Крыжановский Г.Н., 1974).

Предварительное введение животным антиоксидантов: еС-токоферола, инола, фенозина, пэгинола предотвращало эффект активации ПОЛ в очаге и значительно подавляло эпилептическую ахтшзность.

Необходимо было выяснить: I)регулирующую роль -токоферола на уровень СОД при эпилепсии., 2)защитную роль_„экзо1епш взо-денной СОД (при коразолевых судорожных состояниях).

Клинико-биохимическому и ЭЭГ обследованию подвергались 12 больных эпилепсией (мужчины) в возрасте 17-60 лет, с длительностью заболевания 10 лег и более. Контрольную группу составили 10 доноров в возрасте 20-55 лет. У всех больных отмечались редкие с средней частотой большие, малые и абортивные припадки. Витамин Е (100 мг в сутки в виде инъекции) назначался в течение 2 недель, в комбинации с противосудорожными средствами. ЗЭГ производилось на 8-канальной установке типа BT-I до и после введения витамина Е. СОД активность определяли в гемолизате эритроцитов, после удаления гемоглобина.

ЭЭГ больных до назначения витамина Е на фоне противосудорож-ных средств характеризовались наличием пароксизмальных нарушений. После 2-недельного введения витамина этот показатель снижался до 8%. При этом активность СОД в эритроцитах у больных эпилепсией была понижена на 14-16$ (Р < 0,05). Посла введения витамина наб-

лвдалась тенденция к повышению активности с приближением к-норме. Таким образом,витамин Е, понижая уровень активных соединений кислорода, предотвращает дезактивацию (деградацию) эндогенной СОД.

Судорожные состояния у крыс (170-200 г) вызывали введением .коразола в дозах 50 и 70 мг/кг массы животного внутримышечно. Контрольные животные получали 1%NaCI + 0,01 М калий фосфорно-кислий буфер (рН 7,2). У 60 опытных (им вводился коразол в дозе 50 или 70 мг/кг) и 30 контрольных животных было определено количество СОД в печени (50 г), по ЭПР и оптическим спектрам и СОД активность в крови и мозгу. Экзогенную СОД вводили внутримышечно в дозах 0,5-1,6 мг/кг массы животного в разные сроки введения коразола. Коразол вызывал типичную картину судорожных состояний. В большинстве случаев непрекращающиеся судорожные припадки приводили к развитию коматозного состояния и гибели животных через 25-30 мин после введения коразола, причем при дозе 50 мг/кг погибло 50% животных, а при 70 мг/кг - 100%. В развитии коразоле-вых судорог наблвдались 2 четко разграниченных периода: предсу-дорожный, характеризующийся различными миоклониями и гиперкине-зами и период генерализованных судорог, переходящих в эпилептический статус (Авакян P.M., 1977). Поэтому изменения СОД изучались в оба периода. В первый период существенных изменений активности СОД не наблюдалось. • Во втором периоде эта активность понижена на 35+ 2%. Инактивирование СОД связано с обратимым восстановлением меди СОД также на 35%. При припадке эффект коразола не был связан с его непосредственным влиянием на СОД, что было показано в опытах in vitro..Учитывая то, что коразол сочетает в себе свойства антилептика и судорожного яда, можно предположить, что он, сттаулируя дыхательный центр продолговатого мозга и активируя внешнее дыхание, приводит к накоплению кислорода в организме и к образованию 0g- и перекисей в количествах, превышающих оптимальные соотношения фермент-субстрата, а значительное повышение уровня этих соединений само по себе угнетает активность СОД, путем восстановления меди в активном центре фермента. Одновременно было показано, что количество МДА в гомогенатах мозга, печени и в плазме крови при судорожных состояниях, вызываемых коразолом, повышалось в 2-3 раза, по сравнению с контролем.

При предварительном внутримышечном введении животным СОД за час до инъекции коразола (50 мг/кг) уровень ТБК-активных соеди-

нений почти не возрастал. В другой серии опытов было проверено злияние экзогенной СОД на протекание судорожного процесса. Результаты исследований показали, что предварительное (25-30 мин) введение СОД полностью предотвращало гибель животных при действии коразола в дозе 50 мг/нг и на 55-60% - при дозе 70 мг/кг; При этом у животных не развивалась кома и они не принимали боковое положение. Ни в одном случае не было зарегистрировано развитие эпилептического статуса, судороги носили стертый характер.

Как известно, ингибирование СОД (каталазы) приводит к избыточному накоплении активных соединений кислорода, тем самым нарушая функцию клеточных мембран (21лшегиап Е.,. "1973 ). Не исключено, что эффект коразола связан с нарушением нейрональных, и в частности синаптосомальных мембран. В действительности, экзогенно введенная СОД,регулируя уровень оказывает не только противосудорожное влияние, но и способствует выживаемости животных. В дальнейшем этот эффект СОД был подтвержден Крижановским Г.Н., в 1987 г.

' Таким образом,СОД можно рекомендовать в качестве антагониста токсического (судорожного) действия коразола. Вообще СОД предотвращает судорожные*процессы независимо от характера инициаторов судорог. Как при коразолевых судорогах, так и при судорогах, вызванных гипербарической охснгенацивй (об этом будет сказано позже), экзогенно-введенная СОД оказывает протективный эффект.

6. Некоторые биохимические показатели и защитная функций экзогенно введенной СОД при желудочно-кишечных заболеваниях.

а)Антиоксидантная недостаточность у больных с гастрсдуоденальными язвами. ^

При язвах желудка в периульцерозной зоне увеличивается содержание восстановленных форм цитохромов, нарушается доставка и потребление кислорода клетками слизистой оболочки желудка (Щедру-нов В.В.. и др., 1983), возникает активация свободнорадикальных процессов. Образовавшиеся свободные радикалы вступают в реакции с ненасыщенными жирно-кислотными остатками фосфолигоедов мембран, что при недостаточной активности антиокседантной системы приводит к активации перекисного окисления липидов (ПОЛ). ПОЛ, в свою очередь, потенцирует язвообразование в гастродуоденальной слизистой (Вайнштейн С.Г. и др., 1984). Причем инициация свободнорадикальных процессов приводит к снижению внутриклеточного содер-

жания цАМФ Сиоуовгайвку А. вt а1.,1982 ), играющего роль вторичного "мессенджвра" в функции главных и париентальных клеток желудка (Щубникова Е.А. и др., 1986). Поиск веществ, ограничивающих процессы свободнорадикального окисления и тем самым защищающих покровно-эпителиальный пласт слизистой оболочки гастро-дуоденальной зоны, а также нормализирующих содержание цАМФ в клетке, является перспективным направлением в контролировании секреторной функции желудка (Дорофеев Г.И. и др., 1984). В связи с этим нами проведено исследование содержания цАШ, продуктов ПОЛ, витамина Е и активности СОД в крови больных язвенной болезнью (в зависимости от локализации язвы и состояния кислотовыде-ления в желудке).

В эксперименте на крысах изучено влияние СОД как вероятного гастродуоденального цукозопротектора и препарата, модулирующего секреторную функцию желудка.

Обследованы 16 здоровых лиц и 72 больных язвенной болезнью с длительностью заболевания от 6 до 14 лет. У 33 из них была язвенная болезнь желудка (ЯЕК) и у 38 - язвенная болезнь двенадцатиперстной"' кишки (ДДК). Диагноз заболевания верифицирован при рентгенологическом и эндоскопическом исследованиях. Кислотовы-делительная функция желудка оценивалась при стимуляции секреции . максимальной дозой гистамина. Среди больных ЯБЖ сохраненное кис-лотовыделение (более 16 ммоль/ч) было у 15 больных, пониженное (менее 10 ммоль/ч) - у 18. У всех больных сохранённое или повышенное (более 25 ммоль/ч) кислотовыделение имеет место при ДДК. В крови больных определяли содержание продуктов ПОЛ: ВДА и диэ-новой конъюгации высших жирных кислот (ДК) аскорбат-и НАДФН-за-висимого ПОЛ по накоплению ДК после 30 мин инкубации лри 37°а также показатели антиоксидантной системы: витамина Е (Черняускене Р.Ч. и др., 1984) и СОД. цАМФ определяли радиоиммунологичесшм методом с использованием в качестве антикоагулянта и блокатора фос-фодиэстеразы 0,5 И ЭДТА.

Экспериментальная иасть исследований выполнена на 22 белых крысах-самцах с массой тела 180-200г. 12 животным вводили вну-трибрюшинно СОД в дозе I мг/кг массы тела. Через 30 мин.после введения СОД животным под внутрибрюшинным барбамиловым наркозом (100 мг/кг) производили лапаротомию, выделяли желудок, вскрывали его по большой кривизне и в железистой части определяли пристеночный рН (ПрЮ (Елецкий ;с.:с. и др., По5), Затем животных

умерщвляли декапитацией. Слизистую оболочку желудка сразу же помещали в фарфоровый тигель и заливали жидким азотом. Для определения цАМФ использовали 10% гомогенат слизистой оболочки желудка в забуференном физиологическом растворе. В качестве контроля.определения ПрН исследовали содержание цАМФ в слизистой оболочке желудка у 10 интактных животных.

Как следует из представленных данных (табл.4), при ЯБЖ с сохраненной кислотовцделительной функцией, как и при ДЦК, наблюдается активация ПОЛ. Эти изменения возникли на фоне снижения содержания (активности) антиоксидантов. Таблица 4.

Биохимические показатели в крови больных язвенной болезнью (х+щ)

Группа об- МДА следуемых ммоль/л дк ммоль/л Витамин Е мкмоль/л сод ед/мл эритроцитов цА1й нмоль/л

Здоровые 2,68+0,28 17,4+1,5 4,85+0,31 250+20 17,7+0,11

Больные ЯБЖ с сохранен- 4,34^3 ным кислото-вццелением 27,8+1,1 3,4+0,1 190+22 24,3+0,7

Больные ЯБЖ с пониженным кисло- 4»52+0,1 товьщеле-нием 23,13+1,7 3,45+0,2 201+15 18,3+0,7

Больные ДДК.4,65^0,3 24,04+2,0 3,8+0,2 196+10 25,8+ 1,5

Уровень цАМ.5 у этих больных выше, чем у здоровых лиц. По сравнению с больными ЯБК с сохранной секреторной функцией и ДДК активность цАМ'З у этих лиц ниже, но существенно не превышает норму.

Определение ПрН в желудке крыс, получивших СОД, показало снижение этого показателя до 3,51+0,2 (против 4,3+0,1 в контроле.,

Р^ 0,01). Введение СОД сопровождалось повышением цАМФ в слизис-. той оболочке желудка (890+76 по сравнению с интактными крысами - 662+39 нмоль/г ткани., Р<с 0,002). Таким обраэом, у больных ЯВЕ и ЭДК обнаружена выраженная активация ПОЛ, что, как уже упоминалось, может иметь значение в повреядении покровно-эпителиального пласта слизистой оболочки гастродуоденальной зоны. Результаты экспериментальных исследований, показывают стимулирующую роль СОД на секрецию кислоты (возможно, путем повышения содержания цАМФ). Предполагают, что митоховдрии париентальных клеток могут работать как в режиме генерации АТФ, так и в режиме продукции Н* (Ивашкин В.Т., I98I1. В последнем случае митоховдрии в результате реакций свободного окисления, сопряженных, в частности, с переносом Са1"**, выбрасывают в среду протон (Ивашкин В.Т. и др., 1976). При этом в париенталышх клетках желудка осуществляется рад последовательных или интегративных взаимодействий цАМФ н Са+*" в метаболическом контроле секреции кислоты (Щубникова Е.А. и др., 1986).

б)Протективноэ действие СОД на поражение слизистой оболочки желудка при эмоционально-болевом стрессе.

Известно, что эмоционально-болевой стресс (ЭБС) приводит к иницированию ПОЛ (Меерсон Ф.З., 1981) и снижению активности 00Д (liozsic G., efc al,1984. На этом основании нам представлялось целесообразным изучить некоторые биохимические показатели ПОЛ стрессорно поврежденной слизистой оболочки желудка (COS) до и после введения СОД и выяснить возможную защитную функцию этого фермента.

Исследование выполнено на 49 белых крысах-самцах, массой 180-200 г. Животные были распределены на 4 группы: 1-я - контрольная группа интактных животных (15 крыс)., 2-я- интактные живот--ныо, получившие СОД (1,5 мг/кг массы тела животного) каждые 30 мин в течение 6 ч (10 крыс). У крыс 3 -й и 4 групп (10 и 14 животных соответственно) вызывали ЭБС по методу DeBideгаto О. et al. (1974) в течение 6 ч. 3-я группа подвергалась воздействию ЭБС без фармакологической защиты, 4 - я - с одновременным вну-трижелудочным введением СОД в дозе 1,5 мг/кг каждые полчаса на протяжении всего эксперимента. Степень повреждения COS оценивали 2-мя способами, определяя язвенный ивдекс (Виноградов В.А., 1982)., а также геморрагии", эрозии и язвы. В тканях мукозной час-

ти стенки желудка определяли показатели ПОЛ и состояние антиок-седантной системы: витамина Е и СОД.

У крыс 1-й и 2-й группы поражения СОМ были представлены эрозиями, кровоизлияниями , язвами с геморрагическими краями., язвенный индекс составлял 8,5. У крыс 4-й группы по сравнении с 3-й снизилось количество всех учитываемых показателей язвенно-геморрагических поражений СОЖ., язвенный ивдекс уменьшился до 2,36. Известно, что СОД проявляет защитное действие против геморрагического шока Сш1ее Р. еЬ 81,1991).

Введение СОД интактнкм крысам (табл.5) ингибировало процесс ПОЛ, о чем свидетельствовало снижение содержание ВДА. Таблица 5.

Биохимические показатели в тканях желудка крыс при ЭБС (х + я).

Группа животных ЗДА мкмоль/г да мкмоль/г Витамин Е нмоль/г сод ед/г ткани

1-я—контроль 0,04+0,003 0,27+0,14 4,1+0,11 85+5

2 -я -СОД 0,03+0,002 0,28+0,005 3,8+0,17 88+3

3-я - ЭБС 0,09+0,005 0,37+0,01 2,17+0,09 67+ 5

4-я - ЭБС + сод 0,0440,002 0,28^0,007 2,2+ 0,12 79+4

ЭБС (3-я группа) резко иницирует ПОЛ, что проявляется значительным повышением содержания МДА и ДК. Эти изменения возникают на фоне снижения уровня витамина Е и СОД. Введение животным СОД на фоне ЭБС нивелирует некоторые показатели ПОЛ, повышает уровень эндогенной СОД. Интенсивность индуцируемого ПОЛ у животных 4-й группы была существенно ниже, чем у крыс 3-й группы.

Нарушение целостности поверхностного эпителия СОЯ, увеличение межклеточного пространства, образование перекисных кластеров и фрагментация мембран создают условия, при которых СОД, введенная в аелудок, может проникнуть в межклеточное пространство покровно-эпителиального пласта, тем более, что ЭБС существенно снижает ин-

тенсивность кислотообразования (Меерсон Ф.З., 1981) с появлением допустимого для действия СОД pH в полости желудка.

Сопоставление результатов морфологического и биохимического исследования тканей позволяет предположить, что защитный эффект экзогенной СОД на поражение СОЖ при ЭБС реализуется путем регуляции уровня свободнорадикалвных процессов и предупреждения нарушений структурно-функциональной целостности липопротеидных комплексов СОЖ. Полученные данные могут явиться основанием для клинической апробации СОД как протектора повреждений СОЖ при стрессорных ситуациях. В дальнейшем к такоцу выводу пришли и Ogino К. (1988)., Bilbao J. et al (1991)., Hiraisbi H. et al. - ' (1994).

В другой серии исследований была выявлена защитная роль эндогенной СОД у крыс при ЭБС, с 8-10 дневной алкогольной интоксикацией (22% этанол подавался вместо воды, вода подавалась на 5-е сутки). В результате этого уровень эндогенной СОД в тканях желудка возрастал на 20-25%. Это приводит к некоторой нормализации вышеприведенных биохимических и морфологических показателей желудка.

Таким образом,как при JC-излучении, так и при желудОчно-яз-венных заболеваниях алкоголизация в течение 10-15 дней приводит к некоторому улучшению сосотяния больного, что делает возможным применение этого метода в клинических условиях.

7. СОД и каталаза как средства, предупреждающие ангину.

Как было показано в предыдущем разделе, препараты СОД проявляют протективное действие на СШ при различных заболеваниях, сопровождающихся повышением уровня активных соединений кислорода. , стимулируют секрецию желудочного сока. Для повышения эффективности СОД, совместно с ней использовали и каталазу (ввделен-ную и очищенную нами из печени быка), в отношении 1:2, для устранения воспалительных процессов слизистой оболочки горла (СОГ). На группе добровольцев (30 человек, больных ангиной в начальных стадиях заболевания) исследовали действие СОД + каталазы для пре-дупреаадения ангины. Препараты заранее были стерилизованы путем прогуекания через соответствующий фильтр (или путем облучения УФ лучами в общепринятых дозах). Активности СОД и каталазы составляли 3200 ед/мг и 100000 ед/ мг белка, соответственно. Состав применяемого раствора: 4 мг СОД + 8 мг каталазы в I мл раствора.

СОД и каталаза применяются путем полосканий и течение 15-20 сек с последующим заглатыванием раствора препаратов в начальных стадиях заболевания ангины, когда только появляются болевые ощущения и начинаются воспалительные процессы СОГ. Эта процедура повторяется 4 раза, с интервалом в 30-35 мин. В результате симптомы ангины почти полностью прекращаются (краснота зева исчезает, температура не повышается, больные чувствуют себя хорошо).

Полученные результаты дают основание для применения предложенного способа в клинике лечения ангины в начальных стадиях заболевания, .особенно у молодых пациентов.

8. ПОЛ И СОД активность при пневмонии.

Выявление усиления процессов ПОЛ при пневмонии у детей, сопровождающегося функциональными нарушениями эритроцитарных и ми-тохоццриальных мембран, побудило нас детально рассмотреть причины усиления ПОЛ и развития анемии при пневмониях у детей раннего возраста. Структурная целостность и функциональная активность биомембран, в том числе и эритроцитарных, зависит с одной стороны от мощностей антиоксвдантных защитных систем (Щепотин Б.Н., 1980), а с другой, непосредственно от концентрации перекисей ли-пвдов (Козлов Ю.П., 1975). Процесс ПОЛ имеет характер цепной реакции, вот почему так важен контроль условий зарождения этого про- • цесса, начинающегося с образования супероксадного радикала, способного самостоятельно или через свои производные формы: HOg', НО', HgOg атаковать практически все органические соединения (Fridovich I. 1975)- Основной объем по обезвреживанию активных интермедиатов кислорода 90%) приходится на СОД. Исходя из этих представлений, мы поставили перед собой цель выяснить взаимозависимость между состоянием процессов ПОЛ и активностью СОД при пневмониях у детей раннего возраста.

Изучали кровь здоровых и больных острой пневмонией детей в возрасте от 2 до 12 мес.

Об интенсивности ПОЛ судили по содержанки, в эритроцитах продуктов ПОЛ (1ЛДА), спектрофотометрически, при 532 нм (Ланкин В.З., 1975), результат выражали в мкмоль на 10*^ эритроцитов. Содержание ДК определяли также спектрофотометрически, при 233 нм, результат также выражали в мкмоль/10 эритроцитов.

Активность СОД определяли адреналиновым методом ( Miara Н.Р.,1972).

СОД из эритроцитов ввделяли по методу Fridovich I. (1969). Об интенсивности гемолиза судили по содержанию в плазме крови свободного гемоглобина, определяемого спектрофотометрически при 480 нм (СговЪу W.H.et al., 1956).

Под напшм наблюдением находилось 34 ребенка, в возрасте от 2 до 12 мес. В I-о группу (контрольную) вошло 9 детей. Все дети 1-й группы родились от неосложненных беременности и родов, с массой тела при роадении от 3000 до 3800 г. Во 2-ю группу вошло 12 детей, больных острой пневмонией с умеренным токсикозом. Эти дети поступили в больницу с температурой, не превышающей 38,5°. Во всех случаях пневмония подтверждена рентгенологически и характеризовалась наличием на рентгенограммах ограниченного участка затемнения очагового или сегментарного вида в одном из легких. Гематологические сдвиги характеризовались увеличением числа лейкоцитов до 12.10^/л. Умеренная анемия (содержание гемоглобина от 100 до 115 г/л) развилась у 9 больных. Для исследования брали венозную кровь при поступлении в стационар (в разгар пневмонии), до назначения гемоплазмотрансфузий или кровезаменителей и дезинток-сикационных терапий. Суммарные данные исследования приведены в таблице 6. Таблица б.

Содержание (х +п ) ДК и МДА в эритроцитах, СОД активность в эритроцитах и плазме крови и содержание гемоглобина в плазме крови в динамике острой пневмонии у детей (Р 0,05).

Показатель 1-я группа (контроль) Разгар пневмонии Период выздоровления

2-я группа 2-я группа

ДК эритроцитов мкмоль/1012 2,46+0,18 6,83+0,51 3,22+0,36

ВДА эритроцитов мкмоль/Ю12 0,33+0,06 0,94+0,11 0,51+0,07

СОД эритроцитов ед/Ю8 177,7+21 296+28,8 184+19,6

00Д плазмы, 0,19+ 0,03 0,84+0,07 0,22+0,04

ед/мг, белка

Гемоглобин 0,086+0,01 0,Ш*р,02 0,64+0,01

плазмы, 1</л

Согласно предстазленным данным, содержание продкутов ПОЛ повы.-* иено в разгар пневмонии, а в период выздорсвлош!я эти показатели сняжавтся, что свидетельствует об уменьшения интенсивности ПОЛ. Отмеченное повышение интенсивности ПОЛ происходит на фоне увеличения активности СОД. Разгар пневмонии сопровождается развитием анемизации больных, протекающей на фоне повшешхя содержания свободного гемоглобина плазмы крови, что свидетельствует о наличии гемолитического процесса в сосудистом русле. Поскольку пнзвмонн-ческий процесс сопровспдается усилением проницааемостн эрнтроцн-тарной мембраны для макромолекул гемоглобина, а белковая молекула СОД заметно меньше молекулы гемоглобина, допущение об эритроци-тарном происхождении плазменной СОД весьма оправдано, хотя основные антирадикачьные защитные системы плазмы являются металлопро-теянамя антиоксипантного- характера.

Таким образом,пневмонический процесс сопровождается усилением ПОЛ, увеличением СОД активности и внутрисосудистого гемэлиза эритроцитов.

Одной из причин анемизации больных при пневмониях является повреждение мембран эритроцитов вследствие действия активных соединений кислорода. Против повышенного уровня ПОЛ, организм вырабатывает соответственно повышенный уровень СОД. Это еще одно свидетельство о том,что если при острых формах заболеваний (в течение 2-3 дней) организм не успевает синтезировать соответствующий уровень антиоксидантных защитных систем (в частности СОД), то в дальнейшем, при разгаре заболевания, это происходит (наблюдается корреляция между количеством активных соединений кислорода и СОД). В ходе выздоровления указанные показатели приближаются к норме.

9. Экспериментальное исследование иротективного действия Х.~ и к талазы при гипербарической оксигенации.

Пусковым моментом кислородной интоксикации при гипербаричес-

кой оксигенации (ГБО) является образование в организме активных соединений кислорода (Кричевская A.A., 1980), обладающих способностью реагировать с эндогенными субстратами (прежде всего фосфо-липидами биомембран) с образованием перекисей. Перекисные соединения оказывают инактивируицее действие на оксидоредуктазы, в результате чего клетка теряет способность использовать находящийся в избытке кислород (Шимкевич Л.Л., 1973). Исходя из этого, в данном исследовании предпринята попытка предупредить токсические действия гипербарического кислорода экзогенным введением СОД и каталазы.

Исследование проводили на 38 белых крысах, массой 150-200 г. Животные были распределены по 3-м группам. В 1-ю группу входили 12 интактных крыс. Животные 2-й группы (14 крыс) подвергались воздействию токсических доз гипербарического кислорода (ежедневные утренние сеансы ГБО 0,45 МПа в течение 2 ч на протяжении 4 дней). Животные 3-й группы (12 крыс) подвергались воздействию ГБО аналогичным образом, затем получали внутрибрюшинно СОД (I мг/кг) и катал азу (1,8 мг/кг) после каждого сеанса 1Б0.

В качестве критериев токсического действия гипербарического кислорода исполнеовали судорожный эффект Бера и общетоксический эффект кислородного отравления. При этом оценивали сеанс, в течение которого наступали судороги и гибель .животных в барокамере после сеанса ГБО. После каддого сеанса у животных в группах были определены активности СОД и каталазы, а также содержание МДА в го-могенатах печени животных. Содержание МДА у животных 2-й группы по сравнению с 1-й увеличивалось в 1,8-3,2 раза, а активность СОД и каталазы соответственно понизилась на 40-42% и 22-24%., у животных усиливались судороги. Выживаемость животных 2-й группы составляла всего 15-20%. У животных 3-й группы указанные показатели приближались к норме, не наблюдались судороги и гибель животных в барокамере.

Воздействие токсического режима ГБО сопровозвдается снижением активности указанных антиоксидантных ферментов, что приводит к накоплению перекисей липвдов, превышающему физиологический резерв антиокисдантной системы.

Таким образом,как при коразолевых судорогах, так и при судорогах ГЕО антиокседантные ферменты оказывают противосудорожные, защитные действия в эксперименте.

§ 4. Обнаружение, выделение, очистка и краткие характеристики новых типов прооксидантннх металлопротеинов - компонентов системы продуцирования супероксидных радикалов в сыворотка крови и мембранах эритроцитов.

Исходя из того, что с одной стороны в крови существуют такие мощные антиоксиданты, как СОД, каталаза, церулоплазмин, трансфер-рин, СОД-активный комплекс меди, мочевая кислота, витамины Е и С и т.д. (они нейтрализуют различными механизмами активные соединения кислорода)и,с другой стороны, основными источниками продуцирования 0<Г (НО', Н2О2) в крови являются локализованные в мембранах форменных элементов крови НАДФН-зависикые оксидоредуктазы с различными субстратными специфичностями (ramaguchi Т. eb al., 1989>. Dore Ы. et al,1990 ), возможен некоторый "дисбаланс" между продуцированием и расходом активных соединений кислорода, которые больше расходуются, чем продуцируются. Эта гипотеза и послужила основой для поисковых работ с целью обнаружения в сыворотке крови (в мембранах эритроцитов) новых источников (или участников) продуцирования О.,-.

Нам удалось впервые обнаружить и одним способом одновременно ввделить и очистить из сыворотки крови и мембран эритроцитов новые белковые компоненты прооксццантного характера, участники продуцирования Og", в частности 4 новых типа цитохромов ъ -558 и су-прола (СУпероксид ПРОдуцирующего Липопротеина), а также общеизвестные антиоксидантные белки (СОД, каталаза, церулоплазмин, трапс-феррин) и цитохром Ъ-5.

Способ одновременного получения и очистки новых прооксидантных металлопротеинов и известных антиоксвдантных белков из крови.

Для повышения практической и фундаментальной ценности полученных результатов и большего их приближения к клинике, необходимо было разработать комплексный способ одновременного получения из крови основных - известных антиоксвдантных белксв-ферментов и новых типов прооксидантных белков - металлопротеинов, компонентов системы продуцирования Og" в крови. Нами был разработан универсальный способ получения этих белков как из малых количеств (5-8 мл) крови, так и из больших количеств (5 л и больше), для аналитических (диагностических) и производственных целей, соот-

ветственно. Последовательность и источники ввделения этих белков (церулоплаэмин, трансферрин, СОД, каталаза, цитохром Ъ^- из растворимой части эритроцитов), а такие впервые полученных новых типов цитохромов В&58: цитохромов'Ь5581, ъ55811, Ъ558Ш, Ъ еде17 и супероксид-продуцирующего белка - супрола приведены на рис. 16.

КРОВЬ

Сыворотка

Мембраны Растворимая часть

цйтохро^

Ш, 0,2

ЗГВ=Б5Н

трщргяг

Б-558 IV 0,02 (КМ)

Рис. 16. Последовательность и источники ввделения антиоксидант-ного и проокседантного характера металлопротеинов (в скобках указаны концентрации буферов, используемых для элюации белков).

Были использованы методы ионо-обменной хроматографии на различных носителях (ДЕ-52, КМ-52, ДЭАЭ сефадекс А-50) и гель-фильтрации на биогелях Р-60, Р-100, P-I50, G-75, G-I00, • G- 150. При получении супрола всю процедуру ввделения белка осуществляли в атмосфере азота. Центрифугирование осуществляли при 6000 х g, при 2°, в течение 15-80 мин. Чистоту полученных белков проверяли путем ПААГ электрофореза (если это допустимо для данного белка) и индексами оптических чистот.

Суть способа одновременного получения из крови вышеприведенных металлопротеинов заключается в следующем. Кровь (плацентарная, животная - от 10 мл до 5 л и болеё) центрифугировали, супер-натант (раствор Н) и осевшие эритроциты (раствор №2) обрабатывали отдельно. После диа;.иза раствора №1 против 10-кратно большего объема воды и центрифугирования, супернатант пропускали через колодку с ДЕ-52 целлюлозой, уравновешенной (—0,02 М калий фосфатным буфером рН 7,4 (К5Б). Из этой колонки супрол Блшровали

0,0G8 M КФБ, трансферрин (Т5) - 0,007 М натрий ацетатным буфером, рН 5,6 (НАБ), цитохром bg^gl - 0,02 М,-цитохром 'bgggll - 0,04 М и церулоплазмин (ЦП) - 0,15 М КЕБ. В неплацентарной крови человека нам не удавалось обнаружить, ввделить и очистить цитохромы

I ,Ъ^3И. .Эти бёЛки свойственны плацентарной крови человека и крови животных (крыс, кролика). Возможно они играют специфическую роль для обеспечения нормальной жизнедеятельности плода у людей.

Эритроциты (раствор №2) собирали центрифугированием после их самоосаждения из физиологического раствора (поверхностная масса над эритроцитами удаляется). Эритроциты промываются физиологическим раствором. После гемолиза эритроцитов водою и привода рН к 5,6 гемолизат центрифугировали и супернатант (раствор КЗ) отделяли от мембран эритроцитов (раствор №4). Добавляя к раствору №3 ДЕ-52 (í?^. 0,005 М К5Б), смесь инкубировали при 10° в течение 30 мин с помешиванием. Осевшую целлюлозу помещали в колонку и промывали 0,005 М КФБ, СОД содержащую фракцию элюировали 0,01 М, ка-тал&зу - 0,04 М и цитохром ъ-5 - 0,2 М КФБ.

Мембраны эритроцитов (раствор №4) сперва промывали пятикратно большим объемем физиологического раствора (2-3 раза), затем 0,1 Ы . КФБ и очищенные мембраны собирали центрифугированием и инкубировали в течение ночи с I% неионным детергентом (нонвдет Р—40) при слабом перемешивании, при 10°. После диализа против воды и центрифугирования, супернатант пропускали через ДЕ-52 целлюлозу. После промывания этой колонки 0,04 М КФБ цитохром Ь-55811Хзлюирова-ли 0,2 М К*Б. .Неосевшую на этой колонке часть раствора пропускали через НМ-52 целлюлозу (•*-— 0,01 М КШБ) и после промывания колонку 0,01 М КФБ цитохроы'ъ^дПГ элюировали 0,02 М МБ.

Дальнейшую очистку полученных белковых фракций проводили следующим образом.

Очистка СОД. СОД содержащую фракцию отдиализовывали против воды и супернатант пропускали через колонку с ДЭАЭ сефадексом А-50. После промывания колонки С,0С5 !' КЯЗ СОД элюировали 0,01 М КФБ. После концентрирования СОД пропускали через сОфадекс G-75. Центральную сине-зелецуп фракцию СОД повторно пропускали через ДЭАЭ сефа-декс А-50 и концентрировали на ДЕ-52 целлюлозе. В результате такой очистки получали электрофоретически гомогенный препарат СОД, с виходом 67%. Препарат имеет 3100 ед/мг СОД-активность.

Очистка каталазы. Каталазу содержащую фракцию пропускали через ДЕ-52 колонку (■*-- 0,01 М ШЗ) и после промывания 0,01 М ШЗ катал азу элюировали 0,04 М ШЗ и после концентрирования пропускали через биогель P-I50. Центральную фракцию пропускали через ДЗАЭ сэфадекс А-50. После промывания этой колонки 0,01 М ШЗ катала-зу элюировали 0,04 М КФБ. В итоге получали электрофоретически гомогенную каталазу (с выходом 61%) с 100.000 ед/ыг каталазной активностью.

Очистка трансферрина. ТФ-содержащую фракцию пропускали через ДЭАЭ сефадекс А-50 0,003 М НАБ) и белок элюировали 0,007 М НАБ. После пропускания белка через сефадекс g-75, центральную фракцию повторно пропускали через ДЭАЭ сефадекс А-50. В итоге получается трансферринСс выходом ~ 65$) в электрофоретически гомогенном состоянии (голоформа белка).

Очистка церулоплазмина. ЦП-содержащую фракцию обрабатывали смесью этанола с хлороформом (1:0,5) и после центрифугирования и диализа, раствор белка пропускали через ДЕ-52 целлюлозу. ЦП элюировали 0,15 М КФБ и пропускали затем через ДЭАЭ сефадекс А-50. После промывания этой колонки 0,05 М КЭБ ЦП элюировали 0,4 М КФБ. После концентрирования белек пропускали через колонку с сефадек- . сом g-150. Центральную фракцию концентрировали на ДЕ-52. В результате такой очистки получали'электрофоретически гомогенный препарат ЦП, с выходом 65%. Оксидазная активность полученного ЦП составляла «*»100 ед/ыг белка.

Очистка цитохрома ъ-5• Цитохром ъ-5содержащую фракцию пропускали через.колошу с ДЭАЭ сефадексом А-50, после промывания содержания колонки 0,05 М К£Б, цитохром ъ-5 элюировали 0,2 М К5Б. Далее белок пропускали через биогель Р-60. Центральную фракцию повторно пропускали через ДЭАЭ сефадекс А-50. После такой очистки получали электрофоретически гомогенный цитохром ъ-5 , с выходом /V 70%.

По физико-химическим характеристикам полученные приведенным способом металлопротеины идентичны препаратам, полученным другими методами (Deutsch Н., 1966., Бакег В.et al, 1968., Burchell А.1965

.. Ход очистки цитохрома ъ-5581, Ъ-553 II,b-558III,b-558rv и , супрола поэтапно, с количественными показателя™ приведены в таблицах 7-9.

Таблица 7. Ход очистки цитохромов Ь^са1 и Ъ^^И из сыворотки крови, поэтапно, с количественными показателями.

Этап Объем Ассд(х) А4Т5,/Аооп(хх) Выход

очистки раствора 000 сои ■ (иг)

(мл)

Удаление фор- 2000 , 0,04 0,004 300

мэнных элементов крови, осаждение и удаление сывороточных белков.

Вьщеление фрак- 100 0,72 0,2 260

ции питохрсмов

ь55а1 и ъЧ58п

после хромато-графирования на ДЕ-52 целлюлозу.

Разделение I И I II I II I II

цитохромов (ххх) (хххх)

ъЩпИ 20 20 2 1,2 0,4 0^42 140 75

после хро-матографи-рования на ДЭАЭ А-50 и концентрирования.

Гель-фильтрация на биогеле P-I50. 60

70 0,6 0,3 0,55 0,68 130 68

Хроматография на ДЭАЭ А-50. 50

50 0,6 0,5 0,7 0,73 НО 50

Примечание: (х) - величина оптического поглощения цитохрома ,

после восстановления дитионитом натрия., (хх) - индекс оптической чистоты., (ххх) - цитохром I ., (хххх)-

- цитохром Ъ^дИ •, (ххххх) - коэффициенты молярного

поглощения цитохромов и Ъд5811 удваиваются при

558 нм (в восстановленной форме).

Таблица 8. Ход очистки цитохромов ъ^дШ и из мембран

эритроцитов поэтапно, с количественными показателями.

Этап очистки Объем раствора (мл) %58(х) А412/А280 (хх) Выход (мг)

Очистка мембран эритроцитов. 50 - - -

Получение 200 1,5 0,08 1500

фракции

цитохромов

Ъ558Й1,Ъ55д IV

после их со-люб илизации и удаления нерастворимых остатков.

Разделение цитохромов ЪссдШ и55 ьц.огу путем *£в-матографи-рования на дЕ-52, НМ-52, соответственно.

(ххх)

III

(хххх)

III

III

80

30

3,2

2,8 0,8 1,5 830

190

Гель-фильтра- 150 90 ция на биогеле Р-150

1,1 0,72 1,6 2,1 500

140

Хроматогра- 200 100 0,6 0,32 1,8 фирование на (ххххх)

2,4 370

80

Примечание: (х) - величина оптического поглощения цитохрома ъ^С8 » после восстановления белка дитионитом натрия., (хх) - ивдекс оптической чистоты. , (ххх) - цитохром , (хххх) - цитохромъ^8гу (ххххх) - коэффициенты молярного поглощения цитохромов ъ^дШ и

Ъ с IV удваиваются при их восстановлении (при 558 нм). 558

Таблица 9. Ход очистки из сыворотки супрола поэтапно, с количественными показателями.

Этап очистки Объем раствора (мл) А28(/А430 Выход (г)

Кислотное осавдение. 2000 - -

Отделение супрола. 55 0,4 2,3

Хроматография на Ю5-52. 35 5,6 2,1

Хроматография на ДЕ-52. 44 6,7 1,9

Хроматография на ДЗАЭ А-50 40 7,2 1,7

Гель-фильтрация Ra G -150 и биогеле P-I50 и концентрирование. 30 8,5 1,5

В результате такой очистки получаются электрофоретически гомогенные препараты цитохрома иЪ^8Х1 . Дальнейшая очистка ци-тохромовЪ^^дШ и Ь55817 'а также супрола приводит к денатурации этих белков.

Какие имеются объяснения того, чтобы считать цитохромы Ъ^дШ и супрол в основном очищенными? При электрофорезе в МАГ (при ББ Ка - электрофорезе) при рН 8,9 и 4,5, под влиянием электрического тока происходит денатурирование этих белков, сразу же, после их вхождения в гель. Продолжение электрофореза (до выхода красителя) не приводило к обнаружению каких-дибо других белковых полос на гелях, кроме денатурированных и задержанных на вершине геля белков. Элюционныэ диаграммы этих белков после гель-фильтрации имеют симметричный вид с одним максимумом. Иццекс оптических чистот этих белков имеет максимальную величину и в результате дополнительно?. очистки уменьшается.

Цитохромы и супрол хорошо растворяются в водно-буфер-

ных системах, термолабильны и хранятся в лиофилизованном состоянии

при - 10 . Полученные вышеприведенным способом металлопротеины ан-тиоксвдантного характера также хранят в лиофилизованном состоянии (-5°) и могут быть использованы как сырьё для приготовления лекарственных препаратов, употребляемых в экспериментальной медицине и клинике (после соответственного испытания), для предупрелденил воспалительных, сердечно-сосудистых, онкологических, лучевых и т.д. заболеваний ( Lefer A.M., 1988., Oda T, et al, 1992., Bravard A. et al.,1992).

Краткие характеристики цитохромов и супрола.

Максимумы на оптических спектрах поглощения цитохроиов b^gl-iv практически одинаковые: 558, 525, 420 и 280 нм в восстановленном состоянии и 560, 530, 412 и 280 нм в окисленном. Однако имеются некоторые отличия в диапазоне волн 340-360 нм.(рис. 17).

Рис. 17. Часть оптических спектров поглощения цитохромов: ъ5581 -1, Ъ55811- 2, Ъ^ИЬтЗ. Ъ IV и супрола - 5. ьелки были растворены в 0,1 М КЕБ.

По другим характеристикам они отличаются друг от друга (табл. 10).

300 км

400

500 нм

600

Таблица 10. Некоторые 'отличительные черты цитохромов b^gl-iv и супрола.

Название белков

Молекулярная масса (кДа)

А412/А280

Поглощение при 340-360 нм.

Содержание фосфо-

липидэб

в I иг

белке

(мг)

Цитохром ъ5581

Цитохром Цитохром Цитохром Ъ Супрол

ь55811

b558IIX

558

IV

НО 0,7 349 -

95 0,73 360 -

125 1,5 365 0,07

80 2,4 362 0,03

300 9,8 _ 0,5

4 «о. о 4ol!

Цитохроны ъ,

558'

III, b558iv

и супрол являются липопротеинами,

340 460 580 ны

причем супрол имеет спектр флуоресценции с длиной возбуедення 370 нм с максимумом испускания при 430 км, что характерно группе НАДФН. (рис. 18).

Рис. 18. Спектры флуоресценции супрола: до (I) и после присоединения к белку' ионов.уо+^п1)'

Таким образом супрол является НАДОН содержащим липопротеином высокой плотности нового типа. По спектральным характеристикам и по величине молекулярной массы полученные нами цитохромы близки к цитохромам из мембран,

форменных элементов плазмы (Pericos О.А.. et al, 1987.» Boatroeen D. ot al, 1990).

Не исключено, что под влиянием протоолитических ферментов происходит высвобоядпние из мембран форменных элементов крови цитохромо в и b^^gll в сыворотку, особенно в сыворотку плацентарной крови человека. Возможно, что цитохромыb^gl-IV являются субстратами для НАДФН-зависимых оксвдоредуктаз при генерировании, супероксидных радикалов в крови. (Г ubi sai Т. et al, 1986., Dore ¡i. et al, 1990, Wakeyama H., 1982). Цитохромы играют характерную роль при патологии. Так, при отсутствии 2-х субъедшшц цитохрома ь^8 в клетках миеломоноцитарной линии ЦМ384 приводит к подавлению про 7 цесса продуцирования Of этими клетками fchampelovier Р. et al,1993). При хроническом грануломатоэе у больных уменьшается способность фагоцитирующих лейкоцитов продуцировать Of из-за уменьшения у цитохрома b^cg содержания субъединицы с высокой молекулярной массой feabani м. et al.,1993). Эти сведения послужили нам основой для выяснения количественных изменений этих эндогенных цитохромов, вшга-чая супрол, при патологических состояниях. В частности было показано, что при периодической болезни, шумовом стрессе и десимпа-тизации уровень цитохромов , b^glV и супрола повышаются в 4-8 раз, факт говорящий о важной роли этих метаболитов при данных патологических состояниях.

Как и другие гем ь -содержащие гемопротаиш, так и цитохромы b5igIV при восстановлении в щелочных средах показывают аналогичной формы спектры оптического поглощения с максимумами при 560 нм (oL-полоса), 530 нм (9 ) и 410 нм (g ). Возможно этот эффект связан с тем, что НО" может бить лигандом Уе+2 этих гемопротеинов.

Это явление и служило основой для определения гем ъ -содержащих белков без отделения тема от белковой части.

Активация супрола.и механизм продуцирования с.упероксидных радикалов.

В нативном состоянии супрол проявляет только восстановительные свойства (из-за присутствия группы НДЦШ)Г но не способен продуцировать Og". Однако после присоединения (I мг супрола способен присоединять около 0,01 мг супрол приобретает способность

продуцировать 0g~. На этой основе этоцу липопротеину было дано название "супрол" - СУпероксид ПРОдуцирующий Липопротеин. Продуцирование супролом 0о" скорее всего происходит по механизму: +3 г- о

ЛП-НАДФН - ЛП-НАДОН-Ре+5 -► ЛП-НАДФ+- Ре (+2)

-- ЛП-НАДН-Ре+3 +• 02~.

В отличие от других липопротеинов сыворотки (супрол свойственен только сыворотке крови) супрол содержит НАДФН и,скорее всего,действует наподобие КАДОН-зависимых оксидоредуктаз (rossí f. 198б). с той разницей, что у него роль переносчика электрона от НАДФН к кислороду играет Если иметь ввиду то обстоятельство, что в синовиальной и цереброспинальной жидкостях всегда присутствуют "свободные" ионы (Gutteridge g., 1982), можно предположить, что процесс активации супрола ионами железа так или иначе происходит . и в условиях in vivo, что дает основание говорить о новом источнике продуцирования 02~ в сыворотке крови (в мембранах эритроцитов). Возможно, супрол, с одной стороны, является переносчиком холестерина к клеткам и, с другой - новым компонентом системы иммунной защиты организма, как источник генерирования 02~ в сыворотке крови, наряду с Og" генерирующими системами форменных элементов крови (do- .. re Ы. et al, 1990, Tristsch G.H., 1993).

Роль иона железа как участника продуцирования 02~в биосистемах известна (Balliwell В, et al, 198ф. Ионы железа,связываясь с адриа-мицином pweier J.L,,1984) и с НАДВД-зависимым цитохромом Р450 ре-дуктазой продуцируют 02~ feuntarulo S.et а11987 )• 02""генерируется также нейтрофилами, с использованием высвобожденных из трансфер-рина Fe+2 ferieland J.K.. et а1Д991).

Супрол как фактор подавления роста опухолей, повышения числа лейкоцитоз и ускорения деления клеток в их культуре.

Существует гипотеза о том, что в процессах образования опухолевых клеток и их пролиферации вовлечены активные соединения кислорода (АСК) и регулирующие их уровень антиоксидантные ферментные системы (Oberley L.W. et al,1981., Oberley D.,1935 )• Для подтверк-

дения этих соображений, как естественный и энергичный источник нами был испробован активный супрол (АС), для выявления эффектов различной концентрации на рост опухолевых клеток, лейкоцитов и на пролиферацию клеток в культуре клеток. Расчеты показывают, что АС (150 ./¿.г/мл) продуцирует около 5.10® М в I мин. Противоопухолевое действие АС было испытано на 2-х экспериментальных моделях опухолей крыс (мышей): лимфосаркомы Плисса и саркоме М-1 в лечебном режиме. По I мл при концентрации раствора АС 150_^г/мл вводили крысам внутримышечно, через 72 ч после инокуляции трансплантанта, через день, всего 4 раза. Введение крысам АС повышает число лейкоцитов, приближая их к норме, параллельно с этим наблкъ-дается понижение роста лимфосаркомы Плисса и саркомы М-1 на 52+2% и 31,4+4%, соответственно. Введенный интактныы животным АС приводит к увеличению числа лейкоцитов в периферической крови всего на 10+2% , что говорит об отсутствии лейкоцитоза. Тот факт, что АС-стимулирует лейкопоэз у здоровых неособенному больных животных использование этого препарата становится перспективным при профи- • лактическом лечении инфекционных заболеваний (АС не вызывает нежелательных явлений, не приводит к гибели животных при внутримышечном введении в организм в количествах, в 5 раз превышающих приведенные). Исследования на культуре клеток выполнены на вторичной культуре клеток куриного эмбриона. Готовили радиоавтографическиэ препараты по общепринятной методике и определяли индекс меченых клеток (т1) в процентах из расчета 1000 клеток на 4-5 препаратов на каждый вариант. Как показано в табл. 10 и II, в стационарной фазе роста под влиянием 15 ^аг/мл АС, число делящихся клеток увеличивается на 52,1+1,5%. СОД подавляет этот процесс. Одноко повы- • шение концентрации АС (50 _/1г/мл) вызывает полный лизис клеток. Таблица 10.

Влияние супрола на деление клеток в стационарной фазе роста.

Количество АС (^г/мл) 10 15 45 45 (НС) 45 7 + 1,4.10 М СОД 60 Контроль

% 58,6 65,8 47,2 31,3 28,4 полный лизис 13,7

А Е^-Ш , 45 к' 52,1 33,5 27,6 24,7 - -

Таблица II.

Влияние СОД на культуру активно пролиферирующих клеток.

ООД . Ю_7М 7 термоинактиви-рованная СОД 1,4 5 Контроль

51,1 35 32 49,3

Возможно СОД подавляет процесс деления клеток из-за утилизации 0о~, которые необходимы для деления клеток (как нормальный метаболит в свободнорадикальных окислительно-восстановительных процессах, происходящих при делении клеток). Таким образом,АС (но не неактивировак-ный супрол-НС) в определенных количествах (или в определенных количествах) способен вызывать подавление роста опухолевых клеток, стимулируя при этом лейкопоэз и деление клеток в стационарной фазе культуры клеток и роль О2"" в этих процессах существенна.

Вообще, опухолевые клетки более чувствительны к губительным действиям 02~, так как в этих клетках активность антиоксцдантных фор-ментов намного меньше, чем в нормальных клетках, наоборот, заметно повышен уровень О2-. Возможно из-за "двоякого" действия и существуют различные, порою "противоречивые" концепции о роли 0о~ (соответственно и о роли регулируемых им ферментов) в процззеах стимуляции или подавления роста клеток (опухолевых или нормальных;. Та^ряд исследователей СОД использовали как антимутагенное средстзо (цааге Т. еЬ 81,1993» 0Ъег1еу Ь. Я.1984),а °2~ считается как ст;::.гу-лгггор образования оцухолевых клеток(Кепз1егТ.Ш.еЬ а1, 1984). Наоборот, ангимут^генное и цитотоксическое действие 02~ показано в работах (ИгаЬЬ С.В. ,1986, Ь, ,1979) • О^Г деградируют ДНК (Еоиге1ву Б.А., 1983 ) и хромосомы клеток(К1псе11а А.В., 1983), разрушают структуры клеточных мембран (ГозЫ Р.С. ,1985) > разрывают дисульфидные мостики и блокируют Са каналы (БЬг1й1 Р. еЬ а1,1988). Неизвестно, являются сигнальными молекулами для начала пролиферации клеток или они стимулируют метаболические пути пролиферации клеток. Вероятнее всего, 02~ губительно действуют на опухолевые клетки, в которых заметно понижен уровень антирадикальных защитных систем. Их действие на нормальные клетки менее ощутимо, так как в них имеется достаточное количество антиоксидантшх защитных систем. Можно предполагать, что и увеличение (в нашем случае введение активного супрола) и уменьшение (подачей СОД) уровня 02~, необходимого для обеспечения жизнедеятельности клетки (опухолевых или нормальных), в равной мере приводят к ее гибели, особенно, в тех случаях, когда величина амплитуды этих изменений велика. Возможно, в этом и заключается суть "противоречивого" действия О2"".

¡ывсцы

I. Разработаны 2 способа выделения и очистки из животного сырья ЮД и каталазы, а также из крови: цитохрома ^ и 4 металлопротеина «тиоксвдантного характера (СОД, каталаза, церулоплазмин, трансфер->ин) и 5 металлопротеинов прооксидантного характера (4 новых типа (итохромаъ^сд и супрола). Эти способы являются универсальными и югут быть использованы как для аналитических (диагностический), ак и препаративных целей. Большинство этих белков может быть ис-юльзовано как сырье для производства лекарственных препаратов. !. Высокая устойчивость СОД против денатурирующих агентов и детер-'ентов говорит о том, что специфическое лигандное окружение меди не вменяется под действием агентов, разрушающих водородные связи, во-ородныо связи не принимают участия в формировании активного центра юрмента, тогда как электростатические взаимодействия могут оказаться ущественными.

. СОД растворяется в апротонных растворителях только с высокими ко-ффициентами диэлектрической пронициаемости. Существует прямая про-орциональная зависимость между величинами этих коэффициентов и СОД ктивностью фермента. Молекула воды занимает одно лигандное половине меди в активном центре СОД и может быть заменена молекулами тих растворителей (ДМСО, формамед и N -метилформамид). .Основными факторами дезактивирования СОД явялется нарушение интакт-ого строения активного центра, обратимого или необратимого восота-овления меди и связывания с ней гвдроксильных радикалов (НО'). Най- 1 ена идентичность механизмов инактивирования СОД in vivo и in vitro. . Существует восстановительная группа (возможно сульфгвдрильная) лиже активного центра СОД.

. Спирты и сахара "активируют" СОД путем улавливания НО' радикалов освобождения супероксидных радикалов от окружающихили fC*. . Во всех выявленных 3-х системах (кроме 4-ой) Og- и НО' продуци-уются восстановлением кислорода (активного) электроном НО- иона

этот процесс каталитически ускоряется супероксвддисмутазой, кото-ая после дисмутирования Og" (быстрый процесс), продуцирует 02~ сравнительно медленный процесс). В четвертой системе продуцирова-ие супролом rC¡2~ происходит переносом электрона от НАДФН к и т него к молекулярному кислороду.

. Стабильность 02~ зависит не от ионов НО", а от окружающих ионов + или К4" и те агенты (спирты, сахара-, гликопептиды), которые спо-обны уменьшить количество этих ионов (Na+ , 1С4"), являются дестабн-изаторами Og". Возможно, Na+ или К4-, стабилизируя этим путем

осуществляют переход через соответствующие каналы в биосистемах.

9. Гвдратированная медь(+2) способна восстанавливаться супероксидными .радикалами и передать электрон феррицианиду. Этот процесс яв-. ляется новым проявлением купрокатализа.

10. Почти во всех изучаемых патологических состояниях на начальных этапах заболевания изменение СОД-активности (она в подавляющем случае понижается) носит обратимый характер и связано,в основном, с обратимым восстановлением меди (+2) в активном центре фермента. По ходу углубления заболевания наблюдается необратимое инактивирование СОД. Причина потери активности - уменьшение количества фермента в результате деградации. Есть случаи, когда организм успевает выработать соответствующий уровень СОД. Экзогенно-введенные СОД, катала-за оказывают защитное действие, особенно в начальных стадиях заболевания. Так или иначе СОД,регулируя уровень активных соединений кислорода, в первую очередь Og", дает организцу возможность самому постепенно переходить к нормальному физиологическому статусу.

11. Повышение уровня эндогенной СОД путем подачи этанола в соответствующем режиме, оказывает радиозащитное действие у млекопитающих.

12. Полученные впервые 4 типа цитохрома являются гем Ъ содержащими прооксидантами и,по всей вероятности,являются субстратами соответствующих оксидоредуктаз для продуцирования Og".

13. В восстановленной форме протопорфирин IX содержащие гемопротеи-ны, включая 4 типа цитохрома b^cg , способны присоединять к себе

(в простетической группе) ионы НО", как лиганд Fe+2.

14. Продуцирование супролом Og" возможно происходит и в условиях in vivo, особенно в синовиальных и цереброспинальных жидкостях, где всегда присутствуют "свободные" ионы Fe+^.

15. Эффекты супрола (стимулирование лейкопооза, подавление роста опухолей, ускорение процесса пролиферации клеток в культуре), возможно^ связаны с воздействием определённых количеств супероксвдных радикалов, продуцируемых этим липопротеином.

16. Возможно^ при шумовом стрессе, десимпатизации и периодической болезни повышение уровня эндогенных цктохромов ь=1-0Ш> b.-.-oIV и супрола обусловлено соответственным повышением уровня активных соединений кислорода.

17. Цитохромы ъ i-iv и супрол являются новыми компонентами системы продуцирования Ug в сыворотке крови и мембранах эритроцитов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Symonyan М.А., Nalbandyan Н.М. Interaction of hydrogen peroxide

with Superoxide Dismutase from erythrocytes// FEBS Lett., 1972, V. 28, N1, pp. 22-24.

2. Symonyan M.A., Nalbandyan R.M. Optical and magnetic properties of erythrocuprein// Intern. Union for pure applied Blophys. Aba-tracts of contributed papers. Moscow, 1972, p. 95»

3. Симонян M.A., Налбандян P.M. Влияние некоторых денатурирующих агентов на параметры сигнала ЭПР медьсодержащего белка из эритроцитов// ДАН СССР, 1972, Т.204, Лб, С.И71Гц73.

4. Симонян М.А., Налбавдян P.M. Получение электрофоретически гомогенного препарата эритрокупреина и его тепловая денатурация// Биохимия, 1975, Т.40, » 4 , С.726-732.

5. Симонян М.А., Налбавдян P.M. Кислотная и щелочная денатурация супероксиддисмутазы//Биофизика, 1975, Т.20, №5 , С.783-787.

э. Symonyan М.А., Nalbandyan R.M. EES spectra of erythrocuprein in

solution// studia biophysica, 1976, V. 54, N2, рр.99-ЮЗ. 7. Some properties of erythrocuprein treated by organic solvents. Symonyan M.A., Nalbandyan R.M.// Biochim.Biophya.Acta, 1976, V.446, N11, pp. 432-444.

3. The effect of oxigen on aikaline solution of Superoxide Diamuta-se. Symonyan M.A., Nalbandyan R.M,// Biochem.Biophya.Res.Conmun., 1976, V.71.N4, pp.1131-1138.

3. Симонян M.A., Налбандян P.M. Взаимодействие супероксидных pa-цгеалов с супероксиддисмутазой в водных и неводных средах/ Всесо-зэный симпозиум "Магнитный резонанс в биологии и медицине". Тез. ;окл., Черноголовка, 1977, С.93.

[0. Григорян Н.А., Симонян М.А., Налбавдян P.M. Очистка и сравнительное изучение свойств СОД из животных тканей// Биохимия, 1977, Г.42, №8, С. 1499-1504.

[I. Симонян М.А., Мхитарян В.Г., Налбавдян P.M. Образование супе-хжсидных радикалов из органических перекисей и гидроперекисей и »заимодействие их с супероксиддисмутазой// Всесоюзный симпозиум 'Структура, биосинтез и превращение липидов в организме животного i человека", Ленинград, 1978, С.75.

.2. Симонян М.А. Роль меди и цинка в механизме супероксвддисмутаз-юй реакции/Совещание по проблеме "Многоадерные окс-ред металлофер-генты': Черноголовка, 1978, с.42.

3. Symonyan М.А., Nalbandyan R.M. Generation of superoxide radicals in alkaline solution of hydrogen peroxide and the effect of Superoxide Dismutase on this system// Biochim.Biophys.Acta, 1979, V.583, N3, pp.279-286.

4. Симонян M.A., Карапетян А.В., Налбандян P.M. Взаимодействие упероксиддисмутазы с антителом/ 4-ий Всесоюзный Биохимический ъезд. Тезисы докл., Москва, 1979, С.54.

5. Симонян М.А. Влияние диэтилдитиокарбамата на ЭПР спектры СОД/ :-ая Закавказская научная конференция по применению радиоспектро-копии в биологии и химии. Тбилиси, 1979, С.37.

16. ßymonjran М.Д., Halbandyan R.II. Che effect of X-ray a on properties of Superoxide Dismutase// Biochem.Blophys.Ees.Commun., 1979, V. 90, H4, pp.1207-l2l3.

17. Симонян M.A., Минасян Г.М. Влияние супероксиддокздаазы на выживаемость крыс, облученных рентгеновским излучением// Ж.Эксп.Клин. Мед., 1981, Т.21, »I, С.37-39.

16. Сиырнян И.Ад, Камалян Н.Г., Саркисян Л.Х., Саруханян Э. Вклад меди типа 2 в ЭПР и оптических спектрах "синих" оксидаз/ Всесоюзный научный симп."Магнитный резонанс в биологии и медицине". Тез. докл., Черноголовка, 1981, с.39.

19. Симонян Ы.А., Налбацдян P.M. О генерации супероксндных радикалов при окислении цитохрома В-5 из эритроцитов/ I-ий Всесоюзный биофизический съезд. Тез.докл., Москва, 1982, С.52.

20. Симонян U.A. Изменение ЭПР спектров 02~ и их дисмутация в присутствии Яа (+), К(+), спиртов и Сахаров/ х-ий Всесоюзный биофизический съезд. Тез.докл., Москва, 1982, с.15. .

21. Симонян U.A., Симонова Л.Я., Налбандян P.M. Спектральные свойства восстановленных щелочных растворов гемопротеинов, содержащих протопорфкрин IV III Всесоюзная научная конф. по химии и биохимии порфиринов. Самаркавд, 1982, С.171.

22. Симонян М.А., Симонова Л.Я., Налбацдян P.M. Супеооксидцисму-тазная активность некоторых синтетических порфиринов/ Там же, С.244.

23. Симонян U.A. Свойства цитохрома В-5 из эритроцитов/ III Респуб-ликанская^научная сесия по вопросам биофизики. Тез.докл., Ереван,

24. Симонян U.A., Кариыян С.С. Взаимодействие супероксидных радикалов с глюкозой/ 4-ая Молодежная коференция по синтетическим и п^и^одньгм^физиологически активным соединениям. Тез.докл., Ереван,

25. ßymonyan М.А. Beduction of some organic and inorganic oxidants in alakline media Ъу Superoxide Dismutase and scavengers of hydroayl radicals// Biochexa.Biophys.Ees.CommuB., 1982, V. 108, N4, pp.1751756,

26. Симонян M.A., Табачникова С.И., Громов Л.А. Влияние суперок-сиддисмутаэы на судорожные состояния, вызываемые коразолом/ 9-ая Всесоюзная научная конференция по биохимии нервной системы. Тез. докл., Ереван, 1983, C.3I4.

27. Симонян М.А., Мирзоян А.Т., Налбандян P.M. Взаимодействие ионов меди с амфолинамк// Биол.к. Армении, 1983, Т.35, №5, С.374-37Э.

28. Резник Б.Я., Бирюков B.C., Налбандян P.M., Симонян М.А. Пере-кисное окисление липидов и активность супероксиддисмутазы в эритроцитах п^пневмонии у детей раннего возраста// Педиатрия, 1984,

29. Симонян М.А. Вваимодействие супероксидцисмутазы с органическими перекисями и с генерированными из них супероксидами// Биохимия, 1984, Т.49, №11, С.1792—1798.

30. Симоцян М.А., Табачникова С.И., Громов Л.А. Защитный эффект ^jrnepo кс идди смут азы п^и^су^орожных^п^ипадках, вызываемых коразолом

31. Симонян М.А., Галстян Д.А., Демирчоглян И.Г. О факторах понижения СОД-актявности в печени крыс с лимфосаркомой Плисса// Бяо-

химия, 1985, Т.50, №5, С.768-773.

32. Мирзоян A.A., Симонян М.А., Гюльхаеданян М.З. Оупероксщщис-мутаза как терапевтическое средство при облучении и KPVJ/ Комбинированные радиационные поражения. Обнинск, 1985, С.221.

33. Симонян М.А. Генерация супероксидных радикалов водорастворимым гемопротевдом из мембран эритроцитов/ 1-ая Всесоюзная научная конф. по переносу электрона в белковых системах. Тез.докл., Москва, 1985, С.25.

34. Галстян Д.А., Симонян М.А. Количественные изменения супероксяд-дисмутазы, каталазы и цитохрома с в печени крыс, на различных стадиях развития лгалЬосаркомы Плисс!/ Материалы научной конференции. МЗ АрмССР, ЕреванТ 1985, С.20.

35. Симонян М.А., Амирханян Л.Т., Карагезян К.Г. Изменение уровня супероксиддисмутазы и липкдкых перекисей в печени белых крыс под влиянием экзогенной суперокснддисмутазы при острой и хронической формах алкогольной интоксикации/ 2-ая Всесоюзная научная кокр*

Биоантиоксидант". Тез.докл., Черноголовка, 1986, С.84.

36. Симонян М.А., Минасян Г.М. Влияние экранирования почек на активность супероксиддисмутазы и выживаемость эксп. животных при об-луаднии.рентгеновскими лучами// Ж.Эксп.Клин.Мед., 1986, Т.26, М,

37. Меграбян A.A., Симонян М.А., Амадян М.Г., Авакян С.Л., Минасян A.M. Влияние витамина Е на активность супероксвддисмутазы в эритроцитах больных эпилепсией// Ж.Эксп.Клин.Мед., 1986, Т.26, ш,

СГ480-483.

38. Симонян М.А. Выделение и очистка супероксиддисмутазы из селезенки// Биол.ж. Армении, 1986, Т.39, »9, Cf773-776.

39. Амирханян Л.Т., Карагезян К.Г., Симонян М.А. Экзогенная супе-роксиддисмутаза регулятор процессов перекисеобразования в головном мозге и крови белых крыс при различных формах алкогольной интоксикации/ Всесоюзный симпозиум по медицинской энзимологии. Тезисы, докл., Махачкала, 1986, С.101.

40. Геворкян Д.Н., Мхитарян Л.В., Семерджян Л., Симонян М.А., Мхитарян В.Г. Количественные сдвиги в содержании эндогенной СОД

и процессов липидной пароксидации при гипогликемии/ Там же, С.175.

41. Симонян М.А., Галстян Д.А., Петанова Э.В. О противоопухолевом действии некоторых цитоактивных соединений и супероксвддисмутазы на рост гепатомы Зайделя/ В кн. Актуальные вопросы онкологии. ОНЦ, Ереван, 1986, С.38.

42. Симонян М.А., Агаджанов М.И. Инактивация супероксиддисмутазы супероксидными анионами и липоперекисями, образованными в митохон-дриальных мембранах печени крыс/Научная -конференция по ПОЛ в норме и патологии. Перспективы использования антиоксвдантоз. Тез.докл,, Ереван, 1986, С.18.

43. Галстян Д.А., Симонян М.А. Изменение содержания и активности эндогенной супероксиддисмутазы в печени крыс с саркомой - 45 под влиянием экзогенной супероксвддисмутазы/ 2-ая Научная конференция по проблемам физико-химической биологии и биотехнологии в медицине. Тез.докл., Ереван, 1986, С.25.

44. Кукумаджян В.А., Нэрсесян А.К., Зильфян В.И., Симонян М.А. Сочетанное действие туляремийной вакцины и экзогенной СОД на опухолевой рост/ Т:>м же," С.38.

45. Мирзоян А.А., Симонян М.А., Гюльханданян М.З., Мкртчян Р.Г. Терапевтическое действие супероксидцисцутазы при облучении и КРТП// В кн. Комбинированные радиационные поражение. Обнинск, 1986, С.153.

46. Symonyan М.А., Nalbandyan R.M. Effect of Cu+2 and SOD on reduction of ferricyanide by superoxide radicals// In Superoxide Superoxide Dismutase in Chemistry, Biol., Med., ed. by Eotilio

G. Elsevier Sci.Publ. B.V. N.-X, Oxford, Amsterdam, 1986,pp 82-84

47. Сймонян M.A., Звершхановский Ф.А. Применение гипербарической оксигенации в сочетании с ферментными антиоксвдантами СОД и ката-лазой в лечении хронических ацетатных язв в желудке у крыс// Библиографическая указатель ВИНИТИ "Депонирование рукописи", 1987, №б, Б/0383.

48. Симонян М.А., Геворкян Д.Н., Мхитарян В.Г. Количественные изменения супероксиззисмутазы и каталазы, выделенных из печени крыс при аллоксановом диабете// Бюллетень Эксп.Биол.Мед., 1987, T.cIII, Ш, С.306-308.

49. Звершхановский Ф.А., Симонян М.А., Вайнштейн С.Г., Гризенко Г.П. Протективное действие супероксиддисмутазы на поражение слизистой оболочки желудка крыс при эмоционально-болевом стрессе// Вопросы Мед.Химии., 1987, Т.ЗЗ, №3,СЛ9-53.

50. Симонян М.А., Геворкян Д.Н., Мхитарян В.Г. Влияние супероксидцисцутазы на уровень эндогенной СОД и липоперекисей в печени крыс при гипогликемии// Ж.Эксп.Клин.Мац., 1987, Т.27, №3, С.224-227.

51. Звершхановский Ф.А., Вайнштейн С.Г., Симонян М.А. Способ иссле-^ования^сек^ето^ной^ф^к^ии^желудка// Открытия Изобретения (СССР),

52. Симонян М.А., Агаджанов М.И. Генерация супероксидных радикалов при расщеплении перекиси водорода и липоперекисей митохондриальных мембран при рН 7,4 и обратимая инактивация последними Си,Zn-и Мп-СОД. // В кн.Перекисное окисление липодов в норме и патогенезе различных заболеваний. Ереван, Айастан, 1988, C.I2I-I26.

53. Симонян М.А. Факторы влияющие на структуру и концентрацию генерированных при расщеплении перекиси водорода супероксидных анионов/7 В кн. Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине. Рига, РМИ, 1988, 61-69.

54. Amirchanian L.T., Karageuzyan E.G., Simonyan Ы.А. Effect of SOD on the level of lipid peroxides in brain and blood under the conditions of alcohol intoxication/ neurochemical Aspects of Phospholipid Metabolism, Guiseppe Porcellati Foundation Int. Meeting, Perugia, Italy, 1988, p.49.

55. Симонян М.А. Способ получения супероксиддисмутазы из животного сырья// Открытия Изобретения (СССР), 1988, №28, С.107. AC I4I3I39.

Бб. Звершхановский Ф.А., Симонян М.А., Дегтяр В.В. Защитное действие супероксцвдисмутазы при повреждении слизистой оболочки желудка у,крыс при ЭБСГна фоне кратковременной и длительной алкоголизации// Физиол. ж., 1988, Т.34, Н, С.81-86.

57. Звершхановский Ф.А., Симонян М.А., Пилипенко Ю.А. Экспериментальное исследование протективного действия ферментных антиокси-дантов СОД и каталазы при применении прерывистых токсических режимов гипербарической оксигенации// Космическая биология и авиокос-мическая медицина, 1988 М, С.84-86.

58. Звершхановский Ф.А., Симонян М.А., Зайнштейн С.Г. Булгаков С.А.,

Дудко Й.И. Антиохсидантная недостаточность у больных с гастродуо-денальными язвами//й. Эксп.Клин.Мед., 1988, Т.28, JM, С.333-338.

59. Агаджанов М.И., Симонян М.А., Казарян Ш. Влияние препарата СОД на^соде^ание^гидо-СОД и ПОЛ^п^и термических ожогах// Вопросы Мед.

60. Симонян М.А., Агаджанов М.И. СОД и каталаза как средство, пре-дупрездаюцее ангину/ III Всесоюзная научная конф."Биоантиоксидант"; Тез.докл., Москва, 1989, С.274.

61. Акимов В.Г., Симонян М.А., Лашманов А.П., Полянская Н.П. Защитный эффект экзогенной СОД и каталазы при УФ-повреждениях кожи в эксперименте/ III Всесоюзная конф."Биоантиоксвдант". Тезисы докл., Москва, 1989, C.I09.

62. Симонян М.А. Уровень супероксиддисмутазы и цитохромов В-5 из растворимой части и мембран эритроцитов крыс при различных дозах ¡С -излучений/ Там же, С. 129.

63. Симонян М.А., Ургавджян М.Г., Мирзоян A.A. Состояние антиок-сидантных ферментов в облученных эритроцитах и крови// Ж. Зксп.Клин. Мед., 1989, Т.29, Ар1, С. о7-60.

64. Karageuzyan E.G., Amirchanian L.T., Simonyan М.А. Effect; exo-SQD

on the level of malonic aldehide in the brain and blood on alcoholic intoxication of rats//Neurochemistry, 1992, V.8,p.727-740.

55. Симонян М.А., Мурадян М.Ш., Бабаян М.А., Едигарян А., Галоян A.A.

^ейрогормон "С" как перехватчик гидроксильных радикалов// Нейро-кимия," 1995, Т. 12, №4, С. 35-40.

36. Симонян М.А., Бабаян М.А., Симонян Г.М. Цитохромы В-558 из мембран эритроцитов// Биохимия, 1995, Т. 60,

57. Симонян М.А., Симонян Г.М., Мелконян Р.В. Способ получения ¿еталлопротеинов// признан 'как изобретение № 000610. Патентное Управление, Ереван, 1996.

58. Симонян М.А., Карапетян A.B., Бабаян М.А., Симонян P.M. !АДфН-содержащая, супероксвд-продуцирующая липопротеиновая фракция ¡з сыворотки крови. Выделение, очистка, краткая характеристика и чеханизм действия//Биохимия, 1996, T.6I, №5, С-9?2-932-

>9. Симонян М.А., Карапетян A.B., Галстян Д. А., Симонян P.M., >абаян М.А. Супероксид-продуциругащий липопротеин (супрол) как фак-•ор подавления роста опухолей, повышения числа лейкоцитов, ускоре-[ия деления клеток в культуре// Биохимия, 1996, в печати.

'0. Карагезян К.Г., Симонян М.А., Карагезян М.К., Симонян P.M.

!овытпение индукции эндогенной супероксиддисмутазы-фактор увеличе-¡ия радиорезистентности животных// ДАН РАН, 1996, в печати.

¿Z. <H1U lifclíUUCMjrtiUBh n\iusjisnns

Sbniuqpb (ipuJi|nL\ien4

iihuniisu-u irneuin; urcuinnauji

Cu.Zn - .UnMtPOfUmhUlínnSUSC W. UtiSK

imisnnesnmrtitrti inausirmi w iuiruw«¡rc

l)ti\jumpir¡\iiil{uili q|iimiLk)jnL^Aibpb qnl{№npb qhmuiljiu'ü uiuuijiCiu'uji luijgdujV uiuibuu(ununL[JJiuV ubqifujqpb uiiii¡tni¡ini.iT

ITíiulultii II \ibpqpi{bi t* 1. lib\iquiUuljuili S jniuiluibgVbpbg Cu,Zll--unnnapogu[iriri|iuiTnLinuiqb (uo1)) b. l{«imu>iiuqh> uinjm.Wig tjo'v-b, I^uiuiuj-Lulb» gbnnLl n«|.uiq>rb^h > npurtiu^bpptilih, gbinngpriiTo-5 -p , ti^ZUbu lUuU. unu;p\i uiuaiuj íw jmUupbpuib gb»njjnrnnibn b-558i —1>, 6-558 ii-p, b-558 il£b»l)-558 iv ~b II untmpn(_ti »«?ooíb\i tíuippiTmii íuutuii bp bquivuili* iu\u¡-[|iii>tii{uil|ui\i (u:tuinnnn2li /) li- uipinuiqpu]|jiu\i l*nuiuiiuí^lihpn4: li íuijui bli pbpi(utb unL«(bpogu|in rittin[il|Ui| tüp|i (b "), ibnp°eubl (HO')qnjiug-

ifuti i Xmp vtiiíiiiltispqtip l. qnjHgi(tii\i iTbhiuilibqthibpp. 1. ut{pnuin\i út[i¿ui|u i-pnLií unt4uiuuigi|!»b t lblimpnlimj p^i^uib^ifi jni bt^nl lf itbk t jb^j i|b-

pusl|ia\iq'UnLiTnil, ü. ípujbu ifh^uiijuijpnnT otqub^b 'blp0fi~

ubl bn^pih» ljjh^uiduiipnlif «(hpoguhr|ljbnp obqdnlitbg qnjuiqujb

jyiauig,, ppilujbl-b ijbpmíjui^qum. unq ^hnpopubl pn^libpni), 4. unmipn^nq,

|í\iglulíuiuiuii[nubil i/btuui^bqJ'nij: Unui¿hu bnbp "!iuiruiliuipqbpnLtf UO-n rifuiInL-

inuig\ibini| qnjaigab 0r~ - bpn, linppg qblibpiiigVnL J ^ qpui\ig <uiJBJauiupiup quiíiquiq qnpbcWtuignil^" qpui\inq buk li.mpqai4npbi ni( 0« - bpb iTsuLluj:

¿bnpogubL nuiqbkul.Tj|3pb li.Lu,M¡jt^l',PG EiViJ)* unppLl'bbp[i, 2<1-

puipiibnq qngbmu 6\i nnt^bu UO^-b , ,uiliinb4«igVnq\ibp ,, . ,Ha l|Wü K -q 2VinSpH Un - bph 2P » k"1 JnL Wglini. iT b\i i|bp£b\Aibpbu, u;ml|ui-

ubgubinij qnuiíjg rjpuunLiiuugí{b|_nL nLUiibnLpjnL\iQ: ípb ü'n|_bl{nn-Q qripbnLiT

nnaibu mqliáb ihquita) UO'r-h uiljuib'l |uupnLÍJ¡ L uij'ü l^uipnq t «{inhiuirtbMb(. putndp njit l^k^PPH. bf ínL^ jtulj qnnbuil^bg nLtbgnq opquiíaiuiu u inLbb-

¿ntj (WUO, Jinnifuiifbn, N-JbpbL í>nnifbíbl). q

npbWiLjwVnpblj ¿ifnijinfublnl[ |bpiíb\iuih uil^mtit[nLf)JnLuiinpnnnli líp^uiiluiJpntu: UO-[i uiu ^Jtaliuti qnpbn\jlibpp in Vltro Lin vivo «pujiTui\i\ibpnt.u qnnbuu¡kaluipbli linLilili b\i k kuieiijaib b\j ^bnifbVuih lul^uihij [uiípb uui<»b4 l^mnnLjgp [asibcijuiu, qq\idh qüpdbLji l^uiiT ui^jqiapdtnb » ^brlP°EubL 1 b^.*3L u&pb^

qqWp km^binL, UO-h qb'üuiouh\¿bq|i U[tuqJu^j , \ip;u ribqpuiqmgiTtaV Sbti:

qnpbctgfflgnLif pMabVh uit¡uib4 «íbugnLpjnLiiVbpb r\bpp fciuQ_ia\i t ü. rita «iüVannL t K^uipn i nqhuilitinb duiíiuUali (ua^n l nqhuIjUpb ¿uuuilülT p^quib^b uk^bH ifb1!19n'-PjnLliubpfi ifuil^ianqut^n ciOnLU t íbuw"^: flLunuTUaubp-i|ab 10 lauppbp ^(iijiuljijnugjnlli"übpfi ubqpVuljulj i[mi.|bpnLJ UO-h wbBb4u'~ qpkiTuili íhíruiiCuili a^uinQuinc \inm uk»Hi{ (uípnLiT «iqtiiSh qbpui-

l|«i\iqUlblli t: Uju ilni-inLlf XibjiiiJnlLHUíb tliq.nqb\i UO'V-p (liuiuiui|_uiqp) qnLgiu-pbpnLil t «jui2imt(aVb¿ (pnLdh¿) rjbp: Íb4lu^ilínLPjn'-^Hpb hinpuigi[ub i{inn.b-pnuí UO't-b ulimhilaiqpb¡rtuli ífqnpbnVip \inui libliuuiup^uiqb Vjuiqbi^ ni qbqptaqagnurti t: Uju i(inL|_nnX litpoplulub UO'l-n ui4b|_fi ebí uipqjnt.ua-4bn t: abanjpniTUbp b-558 I-IV bpn II unLwpr¡|_p íialiqbuul^nL" bti uipjuilj 2b0nLknnT ü. tPbPpnph»\;bp[i BaqamtbpnLiI 0¡T - bpb qnjugiTiu\) SuiiTuil^uipqb tinp% npnogubqujuouijhu fVriLjPb uu^huuknLgiujp\i piuquiqnunluiubp: Ctinp 1 f"! qnjwgpu6 unL^bpoEufiq naiqbktt,L^J^rb (npr^uikP guj\uililibpnil) unL^priLp uipqbiuilinLif (QUjOni.i]' fc ) t nLnnLgpb uiuq. , (upui\jnnf t l^jknulnt«IP• . mpui-auigViLu t knl-LunirmjnLir pf.bí^^PP «ipnLbíbnuiqilui^ qnpbp i(Jmgp: uinbníi-i[nLiT bll Uafuunpju^ibp unL«(pn| h oqiniuqnpbiTuilJ íuiiTuip, npu(bu "opquilijiq»í1 biínLlujb^i ^uiuuikiupqb [a[í}m\ib¿ «P¿n31*!