Исследование методами СЗМ иммобилизации молекул ДНК и оценка их проводимости

Шарипов, Талгат Ишмухамедович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование методами СЗМ иммобилизации молекул ДНК и оценка их проводимости
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование методами СЗМ иммобилизации молекул ДНК и оценка их проводимости"

ШАРИПОВ ТАЛГАТ ИШМУХАМЕДОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДАМИ СЗМ ИММОБИЛИЗАЦИИ МОЛЕКУЛ ДНК И ОЦЕНКА ИХ ПРОВОДИМОСТИ

03.01.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

О з [,1АР 2011

Саратов - 2011

4856564

Работа выполнена на кафедре физической электроники и нанофизики физико-технического института ГОУ ВПО «Башкирский государственный

университет»

Научный руководитель: доктор физико-математических наук,

профессор Бахтизин Рауф Загндович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор Скрипаль Анатолий Владимирович

Ведущая организация: Московский государственный университет

им. М.В. Ломоносова (МГУ)

Защита диссертаций состоится «15» марта 2011 г. в 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д212.243.05 при Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского (410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83).

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке им. В.А.Артисевич Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (г. Саратов, ул. Университетская д.

доктор физико-математических наук, профессор Байбурин Вил Бариевич

42)

Автореферат разослан « Л » февраля 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета д.ф.-м.н., профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Биосенсоры играют важную роль в развитии многих разделов биологии, химии, физике. Разновидностью биосенсоров являются ДНК-чипы - миниатюрные устройства для параллельного анализа специфических взаимодействий молекул ДНК. Они находят все более широкое применение в исследованиях в области молекулярной биологии, генетики и в ДНК-диагностике [Guschin et al., 1997; Мирзабеков и др., 2002]. В современных ДНК-чинах взаимодействие между ДНК-мишенью (исследуемой ДНК) и иммобилизованным ДНК-зондом обнаруживают по величине флуоресцентного сигнала, генерируемого соответствующей репортерной группой. Современные способы изготовления чипов позволяют наносить ДНК-зонды на поверхность подложки с субмикронной точностью, однако контроль качества нанесения оказывается недостаточным.

Разработка эффективных ДНК-чипов возможна с использованием методов атомно-силовой микроскопии (АСМ), являющейся одной из представительниц семейства сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ) которая привлекает внимание биофизиков тем, что позволяет реализовать комплексный подход к изучению структурно-функциональных связей биологических объектов, сочетая высокое разрешение нанометрового порядка по нормали с неразрушающим характером исследования, обусловленным невысокой интенсивностью взаимодействия зонд-образец, и возможностью проведения исследований в различных средах, в том числе в жидкостях и газовых смесях. Применение методов АСМ позволяет непосредственно визуализировать результаты нанесения и иммобилизации ДНК-зондов на поверхности подложки и, тем самым, содействовать повышению плотности и однородности иммобилизованных олигонуклеотидов, а также наблюдать присутствие чужеродных объектов, образование агрегатов и др.

Вместе с тем, необходимо указать и на некоторые ограничения применимости методики АСМ: 1) при интерпретации результатов следует учитывать, что латеральное разрешение зависит от исследуемого образца, размера и формы иглы-зонда; 2) недостаточное понимание характера взаимодействия зонда с образцом и . 3) существует необходимость разработки специфических методов приготовления образцов [Muller et al., 1997; Wagner, 1998; Hansma, 1996; Галлямов иЯминский, 1999].

образом, необходимым условием успешности исследований биомолекул методом АСМ является их иммобилизация на атомарно гладкой поверхности, что невозможно без разработки соответствующей методики приготовления образцов. Субмолекулярное разрешение исследуемых молекул может быть достигнуто только в том случае, если они стабильно прикреплены к поверхности подложки отдельно друг от друга.

Цель исследования: разработка методик приготовления образцов для исследования особенностей иммобилизации различных молекул ДНК на поверхности слюды и золота, а также изучение электропроводности олигонуклеотидов методами сканирующей зондовой микроскопии.

Были поставлены следующие задачи:

разработать методики приготовления образцов для визуализации с высоким разрешением молекул ДНК различного происхождения с помощью атомно-силовой микроскопии;

определить физические параметры агрегатов, образующихся при иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности слюды; исследовать зависимость плотности одиночно иммобилизованных олигонуклеотидов от концентрации компонентов раствора-образца;

провести экспериментальные исследования электрической проводимости олигонуклеотидов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Наилучшими иммобилизующими свойствами для закрепления на поверхности слюды как длинных молекул ДНК, выделенных из бактериофага X, так и коротких химически синтезированных молекул ДНК обладают катионы Мп2+.

2. Зависимость площади поверхности иммобилизованного агрегата от количества 20-звенных молекул олигонуклеотидов в нем имеет линейный характер при количестве олигонуклеотидов в агрегате от 1 до 3 шт. Когда в агрегате содержится 4 или 5 олигонуклеотидов, площадь поверхности агрегата для таких двух случаев примерно одинакова.

3. Плотность одиночно иммобилизованных олигонуклеотидов резко возрастает при увеличении концентрации этих молекул в растворе от 0 до 2 нг/мкл. При дальнейшем увеличении концентрации от 2 до 10 нг/мкл наблюдается плавное уменьшение плотности одиночно иммобилизованных олигонуклеотидов с постепенным установлением определенной неизменной величины.

4. Увеличение концентрации катионов Мп2+ в иммобилизационном растворе от 25 до 50 мкМ приводит к возрастанию плотности одиночно иммобилизованных олигонуклеотидов. При

концентрации катионов в растворе свыше 50 мкМ происходит снижение плотности одиночно иммобилизованных олигонуклеотидов.

5. Исследование электрической проводимости 20-звенных олигонуклеотидов с помощью сканирующей туннельной спектроскопии показало, что их вольтамперная характеристика нелинейна.

Научная новизна работы и практическое значение. Описанные в литературе методики иммобилизации нуклеиновых кислот оптимизированы применительно к молекулам олигонуклеотидов, имеющих относительно малый размер и, как следствие, меньшую способность к физи- и хемосорбции на поверхности. Подобраны условия среды, при которых наблюдается наименьшая агрегация олигонуклеотидов. Впервые получены АСМ-изображения олигонуклеотидов разной длины, образующих комплексные агрегаты при связывании с двухвалентными катионами. Произведена оценка качественных и количественных параметров иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности слюды. Расчет этих параметров имеет ключевое значение для разработки эффективных ДНК-чипов.

Определено удельное сопротивление олигонуклеотидов длиной 20 звеньев, которое оказалось равным 3.25 Омсм. Изучение степени электропроводности биомолекул чрезвычайно важно и может внести вклад в развитие амперометрических биосенсоров.

Изучение биомолекул является одним из направлений нанотехнологий, часто называемым нанобиотехнологиями, является передним краем развития науки и имеет большие перспективы практического применения в наноэлектронике (нанопровода, молекулярные транзисторы), в медицине (адресная доставка лекарственных средств, ДНК-чипы для генетического анализа, биосенсоры) и др.

Полученные результаты исследования особенностей иммобилизации молекул ДНК используются в учебном процессе кафедры физической электроники и нанофизики Башкирского государственного университета.

Достоверность результатов обеспечена использованием апробированных методов измерений, соответствием экспериментального оборудования целям и задачам исследований. Результаты исследований апробированы на всероссийских и международных научных конференциях, семинарах, симпозиумах.

химии «Фундаментальная математика и ее приложения в естествознании» (Уфа, октябрь 2009, 2010 гг.), Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, декабрь 2008 г.), Ежегодных Всероссийских научных школах-семинарах «Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине» (Саратов, 2007, 2008, 2010 гг.), I и II открытой школе-конференции стран СНГ «Ультрамелкозернистые и наноструктурные материалы» (Уфа, 2008, 2010 гг.), II и IV Международных конференциях «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, июнь 2008, 2010 гг.), Школе молодых ученых «СОВРЕМЕННЫЕ НАНОТЕХНОЛОГИИ» (Екатеринбург, март 2008 г.), Четырнадцатой Всероссийской Научной Конференции Студентов-Физиков и молодых ученых (Уфа, март 2008 г.), Всероссийской школе-конференции для студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальная математика и ее приложения в естествознании» (Уфа, октябрь 2007 г.), Первой Всероссийской Школе-семинаре «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, июнь 2007 г.), Санкт-Петербургской Международной конференции по нанобиотехнологиям (Санкт-Петербург, ноябрь 2006 г.), Второй всероссийской конференции молодых ученых «Физика и химия высокоэнергетических систем» (Томск, май 2006 г.), на Школе-семинаре «КоМУ-2005»-«Нанотехнологии и наноматериалы» (Ижевск, декабрь 2005 г.), V, VI и VIII региональных школах-конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых по математике и физике (Уфа, октябрь 2005, 2006 и 2008 гг.).

Личный вклад автора заключается в разработке методики проведения микроскопических исследований биообъектов, подборе режимов работы сканирующего зондового микроскопа, получении АСМ-, СТМ-изображений различных по природе и длине молекул ДНК, вольт-амперных характеристик олигонуклеотидов. Все химические аспекты проекта: подбор химических реагентов, модифицирующих катионов и т. д., а также анализ полученных результатов и их интерпретация проводились совместно с коллегами из института биохимии и генетики УНЦ РАН и химического факультета БашГУ. При проведении исследований по диссертационной работе была использована поисковая система и патентная база БашГУ по нанотехнологиям.

Публикации. По результатам исследований, выполненных при работе над диссертацией, опубликовано 23 печатные работы, в том числе 1 статья в журнале из списка изданий, рекомендованных ВАК РФ, 2 статьи в российских журналах, 7 публикаций в сборниках трудов всероссийских и международных конференций, тезисы 13 докладов.

Структура и объем диссертации. Общий объем диссертационной работы составляет 111 страниц машинописного текста, состоит из списка

сокращений, введения, четырех глав материала, заключения. Список литературы содержит 110 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность выполненной диссертационной работы, сформулированы цель и основные задачи исследования, выносимые на защиту, показана научная новизна и практическая значимость полученных результатов.

В первой главе приведен критический анализ имеющихся в отечественной и зарубежной литературе экспериментальных исследований последних десятилетий по изучению визуализации молекул ДНК. Дано описание строения, свойств, применения молекул ДНК. Рассмотрены наиболее общие стратегии иммобилизации биомолекул. Представлены основные понятия биочиповой технологии. Приведен подробный обзор представленных в литературе экспериментальных данных по исследованию проводимости молекул ДНК.

Вторая глава посвящена выбору материалов и описанию методов приготовления образцов для изучения особенностей иммобилизации молекул ДНК разных видов с помощью АСМ и исследования проводимости олигонуклеотидов с помощью сканирующей туннельной спектроскопии.

Рассматриваются основные виды подложек для исследования биомолекул методами СЗМ, а также способы их модификации.

В третьей главе описывается визуализация различных по длине и природе молекул ДНК.

Исследование фрагментов нашивной ДНК

АСМ-исследования проводились в полуконтактном режиме на приборе «Solver Р47» (ЗАО «NT-MDT», г. Зеленоград, Россия) на воздухе с использованием отечественных Si кантилеверов (ЗАО «NT-MDT»). В качестве подложек использовались поверхности свежего скола слюды, модифицированные благодаря обработке катионами металлов. При приготовлении всех растворов использовалась бидистиллированная деионизованная вода milli-Q. Исследуемыми образцами служили фрагменты двуцепочечной нативной ДНК и молекулы ДНК бактериофага L

С целью получения АСМ-изображений молекул ДНК высокого разрешения на слюде был опробован ряд методик иммобилизации молекул [Hansma et al.. 1996; Muller et al., 1997], в ходе которых варьировались концентрация образцов и условия среды. В первую очередь была изучена эффективность использования ионов двухвалентных металлов для закрепления молекул ДНК на поверхности. В качестве связующих выступали катионы Mn2+, Niz+, Mg2'. Обнаружено, что наилучшими иммобилизующими свойствами обладает Мп2+, лающий хорошо воспроизводимые результаты.

Образцы были приготовлены по разработанной нами методике: свежесколотую слюду выдерживали в течение 40 мин в 10 мМ растворе МпБ04, а затем подвергали сушке на воздухе и наносили на нее иммобилизационный раствор, содержащий 10 мМ МпБ04 и 10 нг/мкл ДНК (фрагменты двуцелочечной молекулы с «липкими» (т. е. отжигающимися друг на друге) концами длиной 250 и.о.). Раствор выдерживали на слюде в течение 10 мин, после чего дважды промывали водой по 100 мкл и вновь сушили. Для дополнительного осушения образец помещали в эксикатор с

На полученном изображении (рис. 1) наблюдаются кольцевые структуры. «Загрузка» поверхности (т.е. плотность иммобилизованных молекул) оказывается достаточной для наблюдения отдельных молекул. Поскольку образцы представляют собой фрагменты ДНК с «липкими» концами, то вполне объяснимым является образование этих кольцевых структур.

Исследование молекул ДНК бактериофага /

В этом случае на поверхность подложки наносилась капля иммобилизационного раствора, содержащего 2,5 мМ Мп804 и 1 нг-'мкл молекул А-ДНК, представляющих собой длинные (ок. 48000 п.о.) последовательности нуклеотидов, затем высушивалась при комнатной температуре в течение 1 часа. Подложка не промывалась водой. На полученном изображении (рис. 2) отчетливо наблюдаются нитевидные объекты и сетевидная структура, являющаяся результатом объединения отдельных нитей-молекул ДНК.

Р,05.

Рис 1. АСМ-изображение фрагментов ДНК с «липкими» концами, иммобилизованных на слюде, модифицированной катионами Мп3+. полученное в полу контактном режиме.

Рис. 2. АСМ-изображение молекул >.-ДНК, иммобилизованных на слюде, модифицированной катионами Мп2+, полученное в полуконтактном режиме.

В результате удалось надежно закрепить молекулы ДНК на поверхности подложки. Проведение подобных АСМ-исследований дает вклад в понимание различных механизмов процесса осаждения молекул ДНК на слюдяную поверхность и взаимодействия с ней. Полученные результаты могут быть применены в нанобиотехнологиях (при создании биосенсоров, ДНК-чипов), в наноэлектронике (при создании нанопроводов и т.д.).

Исследование влияния буферного компонента раствора на характер иммобилизации олигонуклеотидов

С целью снижения степени агрегации было исследовано влияние концентрации связующего катиона. Было предположено, что при соотношении количества катиона и фосфатных групп 1:1 степень агрегации наименьшая при условии сохранения достаточно высокой иммобилизующей способности соли металла. Данное предположение подтверждено экспериментально. Кроме того, согласно описанным в литературе методикам в раствор ДНК как правило добавляется буферный солевой компонент, также способствующий дезагрегации. Нами было исследовано влияние НЕРЕБ-КОН-буфера на эффективность иммобилизации олигонуклеотидов.

В данной части работы исследовались 2 образца, приготовленные разными способами. В первом случае образец был приготовлен следующим образом: на поверхность свежего скола слюды наносили 5 мкл иммобилизационного раствора, содержащего 60 мкМ МпСЬ и 2 нг/мкл олигонуклеотидов (93-нукпеотидные одноцепочечные молекулы ДНК). Раствор выдерживали на слюде в течение 1-2 мин., после чего остатки каапи удаляли фильтровальной бумагой Рйгак и затем подвергали сушке в эксикаторе при комнатной температуре в течение 17 часов, чтобы окончательно избавиться от влаги.

Рис. 3. АСМ-изображение олигонуклеотидов. иммобилизованных на слюде, модифицированной катионами Мп2" (А) и его увеличенный фрагмент (Б).

На полученных АСМ-изображениях (рис. 3) наблюдаются как отдельные молекулы олигонуклеотидов размерами около 25-30 нм, так и объединения нескольких молекул - агрегаты различных размеров (около 5070 нм). Как видно из рис. ЗА, распределение адсорбированных олигонуклеотидов относительно равномерно на большой площади сканирования.

Во втором случае на поверхность слюды наносили такой же объем иммобилизационного раствора, содержащий такие же олигонуклеотиды в концентрации 2 нг/мкл, 60 мкМ МпСЬ и 10 мМ буферный раствор HEPES-КОН. Раствор выдерживали на слюде около 5 мин., после чего каплю удаляли фильтровальной бумагой Filtrak и затем подвергали сушке в эксикаторе при комнатной температуре в течение 17 часов, чтобы окончательно избавиться от влаги.

Рис, 4. АСМ-изображение олигонуклеотидов, иммобилизованных на слюде, модифицированной катионами Мл3" и HkPE.S-K.OH буфером.

На полученном АСМ-изображении (рис. 4) наблюдаются плотно расположенные, преимущественно одиночные объекты эллипсоидной формы - олигонуклеотиды.

При сравнении АСМ-изображений на рис. 3 и 4 видно, что в первом случае (без наличия HEPES-KOH) агрегация молекул происходит в большей степени, чем во втором (в присутствии HEPES-KOH). Следовательно, можно предположить, что связь олигонуклеотид-НЕРЕ8-слюда сильнее, чем связь олигонуклеотид-олигонуклеотид и, в результате, плотность одиночных олигонуклеотидов на единицу площади во втором случае оказывается больше. Однако, в первом случае АСМ-изображения получаются отчетливее и с гораздо меньшей шероховатостью участков поверхности между иммобилизованными объектами.

Четвертая глава посвящена оценке количественных параметров иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности слюды, а также изучению электропроводности олигонуклеотидов малых размеров.

Воспроизводимость результатов, статистический анализ одиночных олигонуклеотидов

Нами были использованы ACM Solver Р47 и зондовая нанолаборатория Ntegra-Prima для исследования олигонуклеотидов, иммобилизованных отдельно друг от друга или объединенных в агрегаты. Вначале была проверена воспроизводимость получаемых АСМ-изображений, то есть был проведен их статистический анализ. Были приготовлены 10 образцов по одной методике: иммобилизационный раствор, содержащий 2 нг/мкл ДНК (ОДН длиной 93 нт) и МпС12 (концентрация 50 мкМ) прогревали при 80°С в течение 2 мин для денатурации возможных двуцепочечных структур и затем наносили на поверхность свежего скола слюды. Раствор выдерживали на слюде 4 мин, после чего подложку промывали водой (10*10 мкл). Для каждого образца получали по 10 АСМ-изображений. На полученных АСМ-изображениях наблюдались отдельные объекты различного размера, которые, вероятно, представляют собой как одиночные молекулы ОДН, так и их агрегаты. Были найдены высоты предполагаемых одиночных ОДН, а также вычислены средние арифметические значения высот. Согласно полученным данным, средняя высота объектов на поверхности слюды оказалась равной 0.58 ± 0.12 нм.

В качестве дополнительного критерия оценки воспроизводимости была взята плотность расположения одиночных ОДН. Найдено, что плотность равна 13±2 шт/мкм2, то есть воспроизводимость получаемых АСМ-изображений удовлетворительна и такой критерий может быть рекомендован для оценки воспроизводимости получаемых АСМ-изображений биомолекул.

Изучение агрегатов и построение градуировочной кривой

При иммобилизации молекул ОДН из раствора они располагаются на поверхности либо в одиночном состоянии, либо образуют агрегаты. Для оценки количества молекул в агрегате было сделано предположение, что площадь поверхности агрегата Sa должна зависеть от количества молекул в нем (от массы молекул) п. По одной и той же методике приготавливали образцы разных по длине ОДН и визуализировали с помошыо АСМ. Далее находили предположительно одиночные ОДН и вычисляли их поверхностную площадь следующим образом. На АСМ-изображении одиночные ОДН -- объекты круглой формы - моделировали правильными конусами высотой h, радиусом основания R и образующей L. Площадь боковой поверхности такого конуса S b=7iRL=rclW(h2+R2). Тогда, зная h и R, можно вычислить Sb- На АСМ-изображении высоту и радиус объектов квазикруглой формы можно вычислить, построив их профили, которые легко получаются с помощью встроенного пакета программ обработки изображений Image Analysis. Вычислив таким образом площади поверхностей конусов, моделирующих одиночные молекулы ОДН разной длины, на АСМ-изображениях. была построена градуировочная кривая (рис. 5), по которой можно определять массу агрегата, а соответственно, и количество молекул в нем.

2500 5 2000 х 1500

I 1000

500 О

0 20 40 60 80 100

п, звеньев

Рис. 5. Градуировочная кривая для определения количества молекул ОДН в агрегате.

На рисунке 6 приведены примеры определения количества молекул в агрегате.

И, нм Я, нм Б, нмг

0.9 25 1963.771

11, нм 11, нм 8, нм '

1 27 2290.629

О 20 40 60 80 100 Р1апе, пт Г

0 200 400 600 800 пт

Рис. 6. АСМ-изображения ОДН и соответствующие профили сечений.

На рисунках 6а,в приведены АСМ-изображения поверхности слюды с иммобилизованными ОДН (длиной 20 нт), а на рис. 66,г - соответствующие профили; здесь же приведены размеры и боковая площадь объектов. Зная площадь, по градуировочной кривой определяем размер агрегата. Для объекта I (рис. 66) она округленно равняется 60 нт, то есть данный агрегат

состоит из трех молекул ОДН длиной 20 нт. Для сравнения на рис. 6в приведено то же самое АСМ-изображение, но линия уже проведена по другому объекту, профиль которой показан на рис. 6г. Дня данного объекта (номер 2) находим, что он состоит их четырех 20-звенных ОДН.

Исследование зависимости плотности иммобилизованных одиночных олигонуклеотидов от концентрации компонентов раствора-образца

С целью нахождения зависимости плотности одиночных ОДН от концентрации связующего катиона были проведены две серии экспериментов. Сначала была изучена зависимость плотности одиночных молекул ОДН р от их концентрации в иммобилизационном растворе при неизменном соотношении количества фосфатных групп ОДН и катионов Мп2+ 1:1. Исследуемыми объектами служили ОДН длиной 20 нт.

Р1

10 С0дн>нгмкл

Рис. 7. Зависимость плотности одиночных молекул ОДН р от их концентрации в иммобилизационном растворе.

Обнаружено, что при увеличении концентрации молекул ОДН С0дн от 0 до 2 нг/мкл происходит резкое возрастание р. При концентрации ОДН, равной 2 нг/мкл, плотность одиночных молекул оказывается максимальной. Далее при увеличении концетрации от 2 до 10 нг/мкл наблюдается плавный спад кривой с постепенным установлением определенной неизменной величины плотности одиночно иммобилизованных молекул. Вероятно, возрастающий характер кривой объясняется тем, что при малых концентрациях молекулы ОДН не агрегируются и иммобилизуются отдельно друг от друга. Постепенное увеличение концентрации ОДН приводит к увеличению плотности одиночных молекул и агрегатов. При концентрации ОДН более 2 нг/мкл процесс агрегации начинает преобладать над процессом одиночной иммобилизации.

Была также изучена зависимость плотности одиночных молекул ОДН р от концентрации катионов МгГ' в иммобилизационном растворе СМп2~, которая может быть описана функцией р=ДС0дн/СМпС12)-

с одн

С МпП,

Рис. 8. Зависимость плотности одиночных молекул ОДН. иммобилизованных на поверхности слюды, от концентрации катионов Мп2\

При увеличении концентрации катионов Мл2+ в иммобилизационном растворе от 25 до 50 мкМ (при величине С0дн/СмпС12 от 0,013 до 0,0066) наблюдается возрастание плотности одиночных молекул ОДН, что, возможно, объясняется увеличением количества мест связывания между отрицательно заряженными молекулами ОДН и поверхностью слюды. При концентрации катионов Мп2* свыше 50 мкМ (при величине С0дн/Смпс12 меньше 0,0066) процесс агрегации ОДН в растворе усиливается настолько, что плотность одиночных молекул ОДН, иммобилизующихся на поверхности, значительно уменьшается.

Результаты исследования могут внести вклад в понимание механизмов физической адсорбции молекул ДНК и их фрагментов разной длины на поверхности слюды и использоваться при дизайне ДНК-чипов.

Измерение электрической проводимости олигопуклеотидов

Молекула ДНК считается перспективным кандидатом для молекулярной электроники благодаря высокому соотношению длина/диаметр, возможности синтеза и ее свойствам, обусловленным двунитевой структурой, которые говорят о возможности самосборки. ДНК была изучена во многих аспектах, включая электронный транспорт, АСМ- и СТМ-исследования, однако результаты измерений транспорта заряда в ДНК различных научных групп не согласуются между собой.

Объектами исследования служили 20-звенные олигонуклеотиды и 5-тиол-модифицированные олигонуклеотиды. В качестве первоначального материала подложки использовалась пластина кремния (111),

легированная фосфором с удельным сопротивлением 1,6 Ом-см (номинальная концентрация носителей тока ~ 8-1017 см°). После обезжиривания в толуоле кремниевые подложки промывались в ультразвуковой ванне с ацетоном, а затем деионизованой водой. Следующим шагом очистки подложек являлось термообработка. Отжиг

—I-1-

0.00066 0.0066 0.013

осуществляли в сушильном шкафу. Далее происходил процесс термического напыления золота на кремниевую подложку на установке ВУП-4.

Рис. 9. а) АСМ-изображение кремниевой подложки. Заметно, что структура кремния состоит из борозд, расположенных, примерно, на одинаковом расстоянии друг от друга. Средняя шероховатость составляет 34 нм.; б) АСМ-изображение пленки золота. АСМ-контроль показал, что золото напыли лось достаточно ровно, повторив структуру кремния. Средняя шероховатость поверхности уменьшилась до 17 нм.

Следующим этапом эксперимента является модификация поверхности золота для связывания с исследуемыми олигонуклеотидами. Химическая модификация включала создание ковалентной связи химически поляризуемых групп тиолов с чистой поверхностью металла. Адсорбция ДНК осуществлялась за счет кулоновского взаимодействия молекулы с плотно упакованной мономолекулярной пленкой тиола, ориентированной положительными функциональными группами к молекуле ДНК.

Модифицированные 5-тиол олигонуклеотиды были растворены в воде. Затем 5 этого раствора было нанесено (каплей Змм) на золотую подложку, которая затем была помещена в чашку Петри с увлажненной атмосферой, созданной при помощи кюветы с водой. Она была выдержана ¡6 часов при температуре 50°С. Потом подложка дважды промывалась в воде и в растворе 2-меркаптоэтанола. Данный раствор был использован для увеличения доступности иммобилизируемых образцов к комплементарным последовательностям. Тиольные группы быстро смещали более слабые контакты между ДНК нуклеотидами и подложкой. Затем подложка помещалась обратно в чашк\ Петри и 2 часа хранилась при температуре 40-°С, после чего подложка промывалась в воде.

Олигонуклеотиды в концентрации 1(хМ были выдержаны в течение 10 минут в растворе для гибридизации при 80 °С. Сразу после этого 5 данного раствора было нанесено на подложку, которая затем выдерживалась в течение 1 часа в атмосфере воздуха с температурой 40 °С, после чего промывалась в буфере для промывки, и затем - в чистой воде. В заключение приготовленные полложки сушились при комнатных условиях.

АСМ-исследования показали, что на поверхности исследуемого образца наблюдаются новые объекты овальной формы (Рис. 10а). которые и являются молекулами ДНК. Их расположение на подложке достаточно разряжено. Чтобы измерить вольтамперные характеристики, необходимо получить СТМ-изображение для идентификации молекул ДНК на поверхности подложки. Известно, что на СТМ-изображении молекулы ДНК представляются темными овальными объектами, поскольку они имеют меньшую элек'фическую проводимость по сравнению с золотом.

Рис. 10. АСМ-изображение (а) и СТМ-изображение (б) молекул ДНК на поверхности золота.

СТМ-исследование поверхности золота с иммобилизованными молекулами ДНК проводилось в режиме постоянного туннельного тока. На СТМ-изображении (Рис. 106) наблюдаются темные области малого диаметра - молекулы ДНК. Их латеральные размеры сходятся с размерами ДНК на АСМ-изображениях.

После получения ряда СТМ-изображений и идентификации молекул ДНК на них мы приступили к снятию вольтамперных характеристик (ВАХ), которые представляли собой зависимости силы туннельного тока через молекулы ДНК от величины приложенного напряжения между подложкой и острием СТМ (Рис. II). Вольтамперные характеристики снимались в темных точках, где предположительно и располагаются молекулы ДНК. Интервал измерений напряжения и -между подложкой образца ДНК и острием СТМ составлял от -1.5 В до 1.5 В.

<1 .

-1.5 -1,9 -0,5 о « Ц> 1,5

ив

Рис. 11. Вольт-амперные характеристики молекул ДНК.

Кривая ВАХ имеет симметричный вид относительно нулевых значений как тока, так и напряжения. Вид кривой зависимости тока от напряжения нелинейный. Особенно заметно нелинейный характер ВАХ проявляется при напряжениях больше 1 В. Интересно отметить, что на участках ВАХ с выраженным проявлением нелинейности ((/ больше 1В) заметен рост мощности или дисперсии флуктуаций а мгновенных значений туннельного тока.

Полученная ВАХ оказалась подобна ВАХ типичного полупроводника; с ее помощью определялось сопротивление молекулы (Я = 0.05 * 109 Ом). Если представить молекулу ДНК в виде нанопровода, то ее удельное сопротивление с учетом диаметра молекулы (с1 = 2 нм), площади (Б = яс12 = 6.28 нм") и длины молекулы (Ь = 10 нм) можно представить как:

р = БЯ/Ь = 6.28-10"18 0.05 109/10 10"9 = 0.0325 Ом-м = 3.25 Ом-см.

В заключении сформулированы основные результаты и выводы, полученные в ходе выполнения диссертационной работы.

Основные выводы и результаты:

1. Разработаны методики приготовления образцов для визуализации с высоким разрешением молекул ДНК различного происхождения с помощью атомно-силовой микроскопии. Наилучшими иммобилизующими свойствами для закрепления на поверхности слюды как длинных молекул ДНК, выделенных из бактериофага X, так и коротких химически синтезированных молекул ДНК, обладают катионы Мп2+.

2. Разработан метод определения количества молекул олигонуклеотидов в иммобилизованном агрегате. Установлено, что зависимость площади поверхности иммобилизованного агрегата от количества 20-звенных молекул олигонуклеотидов в нем имеет линейный характер при количестве олигонуклеотидов в агрегате от 1 до 3 шт. При количестве

олигонуклеотидов в агрегате 4-5 шт. площадь поверхности агрегата примерно одинакова.

3. Установлена зависимость плотности одиночно иммобилизованных ОДН на слюде от их концентрации в иммобилизационном растворе. Плотность одиночно иммобилизованных олигонуклеотидов резко возрастает при увеличении концентрации этих молекул в растворе от О до 2 нг/мкл. При дальнейшем увеличении концетрации от 2 до 10 нг/мкл наблюдается плавное уменьшение плотности одиночно иммобилизованных олигонуклеотидов с постепенным установлением определенной неизменной величины.

4. Установлена зависимость плотности одиночно иммобилизованных ОДН от концентрации катионов Мп2+ в иммобилизационном растворе. Обнаружено, что увеличение концентрации катионов Мп2+ в растворе от 25 до 50 мкМ приводит к возрастанию плотности одиночно иммобилизованных ОДН. При концентрации катионов в растворе свыше 50 мкМ происходит снижение плотности одиночно иммобилизованных олигонуклеотидов.

Достижение наиболее высокой плотности одиночно иммобилизованных ОДН имеет решающее значение для разработки эффективных ДНК-чипов.

5. Разработана методика измерения электропроводности молекул ДНК с помощью сканирующей туннельной спектроскопии и определено удельное сопротивление олигонуклеотидов, которое оказалось равным 3.25 Ом-см. Определение степени электропроводности чрезвычайно важно и может внести вклад в развитие амперометрических биосенсоров.

Список основных опубликованных работ по теме диссертации

* - публикации в изданиях, рекомендуемых перечнем ВАК РФ

1. *Т.И. Шарипов, Р.Ф. Талипов, P.P. Гарафутдинов, Р.З. Бахтизин. Оценка количественных параметров иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности слюды. // Вестник Башкирского университета. 2010. Том 15. №4. Сс. 860-864.

2. Т.П. Шарипов, P.P. Гарафутдинов, Р.З. Бахтизин. Особенности АСМ-исследования молекул ДНК на слюде. П Вестник Башкирского университета. 2007. Том 12. №3. Сс. 18-19.

3. Шарипов Т.Н., Гарафутдинов P.P., Талипов Р.Ф., Бахтизин Р.З. Особенности приготовления образцов при изучении иммобилизации молекул олигонуклеотидов на слюде с помощью атомно-силовой микроскопии. // Перспективные материалы. Специальный выпуск (7), июнь, 2009, сс. 368-371.

4. Т.Н. Шарипов, С.С. Гоц, Р.З. Бахтизин. Исследование проводимости молекул ДНК. // Сборник тезисов четвертой международной конференции "Современные достижения бионаноскопии". 15-18 июня 2010 года, Москва, физический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова - с. 84.

5. Шарипов Т.И., Бахтизин Р.З. Исследование одиночных олигонуклеотидов и агрегатов на их основе. // Образование, наука, инновации - вклад молодых исследователей: материалы V (XXXVII) Международной научно-практической конференции / Кемеровский госуниверситет. - Кемерово: ООО «ИНТ», 2010. - Вып. 11. - Т. 2. -сс. 651-654.

6. Шарипов Т.И., Талипов Р.Ф., Гарафутдинов P.P., Бахтизин Р.З. Изучение процессов агрегации олигонуклеотидов на поверхности слюды. // «Фундаментальная математика и ее приложения в естествознании»: Сборник тезисов Международной школы-конференции для студентов, аспирантов и молодых ученых по математике, физике и химии / отв. ред. P.M. Вахитов. - Уфа: РИЦ БагаГУ, 2009.-е. 122.

7. Т.И. Шарипов. АСМ-исследование материалов, основанных на ДНК. // Физика и химия высокоэнергетических систем: Сборник материалов II Всероссийской конференции молодых ученых (4-6 мая 2006 г., г. Томск). - Томск: Томский государственный университет, 2006. — сс. 139-140.

8. Т.И. Шарипов. АСМ-исследование молекул ДНК на слюде. // Студент и наука: Материалы студенческих научных конференций. -Уфа: РИО БашГУ, 2005. - сс. 17-18.

9. Шарипов Т.И. Методики приготовления образцов для исследования олигонуклеотидов с помощью атомно-силовой микроскопии. // Всероссийская школа-конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальная математика и ее приложения в естествознании»: Сборник трудов. Том III. Физика. - Уфа: РИЦ БашГУ, 2008.-сс. 330-333.

10. Т.И. Шарипов, Р.З. Бахтизин. Исследование одиночных олигонуклеотидо и агрегатов на их основе. // Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине-2010: Материалы ежегодной Всероссийской научной школы-семинара / Под ред. проф. Д.А. Усанова. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2010. - сс. 55 - 59.

11. Шарипов Т.И., Гарафутдинов P.P. Методики приготовления образцов для исследования адсорбции олигонуклеотидов на слюду с помощью атомно-силовой микроскопии. // Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине-2008: Материалы ежегодной Всероссийской

научной школы-семинара // Под ред. проф. Д.А. Усанова. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2008.-сс. 139-141.

12. Т.И. Шарипов, Р.З. Бахтизин, P.P. Гарафутдинов. Исследование процесса иммобилизации молекул ДНК на слюде с помощью атомно-силовой микроскопии. // Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине-2007: Материалы ежегодной Всероссийской научной школы-семинара - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2007. - сс. 127- 129.

13. T.I.Sharipov, R.Z.Bakhtizin, R.R.Garafutdinov, A.V.Chemeris. immobilization of DNA molecules on the mica surface studied by atomic force microscopy. // International workshop on nanobiotechnologies: Abstracts of international workshop, 27-29 November 2006. SPb.: Publishing House of Politechnical University, 2006. - p. 102.

14. Шарипов Т.И., Гарафутдинов P.P., Бахтизин Р.З. Исследование процесса иммобилизации молекул ДНК на слюде с помощью атомно-силовой микроскопии. // Сборник тезисов Всероссийской школы-семинара для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы». - Белгород: ИПЦ "ПОЛИТЕРРА", 2008. - сс. 174 - 177.

15. Шарипов Т.И., Гарафутдинов P.P., Бахтизин Р.З. Модификация поверхности твердотельных подложек для осаждения на них модифицированных олигонуклеотидов. // VIII Региональная школа-конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых по математике, физике и химии: Тезисы докладов. - Уфа: РИЦ БашГУ, 2008.-с. 15.

16. Т.И. Шарипов, P.P. Гарафутдинов, Р.Ф. Талинов, Р.З. Бахтизин. Особенности приготовления образцов при изучении иммобилизации молекул олигонуклеотидов на слюде с помощью атомно-силовой микроскопии. // Ультрамелкозернистые и наноструктурные материалы-2008: тезисы докладов Открытой школы-конференции стран СНГ (Уфа, 4-9 августа 2008). - Уфа, Башкирский государственный университет, 2008, с. 302.

17. Шарипов Т.И., Гарафутдинов P.P., Талипов Р.Ф., Бахтизин Р.З. Особенности приготовления образцов при исследовании олигонуклеотидов методами атомно-силовой микроскопии. // Сборник тезисов, материалы Четырнадцатой Всероссийской научной конференции студентов-физиков и молодых учёных (ВНКСФ-14, Уфа): материалы конференции, тезисы докладов: В 1 т.Т.1 -Екатеринбург - Уфа: издательство АСФ России, 2008. - сс. 417-418.

18. Т.И. Шарипов, Р.З. Бахтизин, P.P. Гарафутдинов. Исследование процесса иммобилизации молекул ДНК на слюде с помощью атомно-силовой микроскопии. // Современные достижения бионаноскопии:

Сборник тезисов Первой Всероссийской Школы-семинара 11-17 июня 2007 г. - Москва: Московский государственный университет, 2007. -сс. 61-62.

19. Т.И. Шарипов, P.P. Гарафутдинов, Р.З. Бахтизии. Особенности приготовления образцов при изучении иммобилизации молекул олигонуклеотидов на слюде с помощью атомно-силовой микроскопии. // Современные достижения бионаноскопии: Сборник тезисов второй международной конференции 17-19 июня 2008 г. -Москва: Московский государственный университет, 2008 - с. 55.

20. Т.И. Шарипов. АСМ исследование молекул ДНК на слюде. // Сборник тезисов докладов. Школа-семинар КоМУ-2005 "НАНОТЕХНОЛОГИИ И НАНОМАТЕРИАЛЫ". - Ижевск: ФТИ УрО РАН & УдГУ, 2005. - с. 65.

ШАРИПОВ Талгат Ишмухамедович

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДАМИ СЗМ ИММОБИЛИЗАЦИИ МОЛЕКУЛ ДНК И ОЦЕНКА ИХ ПРОВОДИМОСТИ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Лицензия на издательскую деятельность ЛР № 021319 от 05.01.99 г.

Подписано в печать 02.02.2011 г. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,38 Уч.-изд. л. 1,44. Тираж 100 экз. Заказ 50.

Редакционно-издательский центр Башкирского государственного университета 450074, РБ, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.

Отпечатано на множительном участке Башкирского государственного университета 450074, РБ, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Шарипов, Талгат Ишмухамедович

Введение.

Глава I. Молекула ДНК:ение, свойства, наблюдение.

1.1. Строение молекулы ДНК.

1.2. Визуализация молекул ДНК.

1.3. Иммобилизация молекул ДНК.

1.4. Биочипы.

1.5. Проводимость молекул ДНК.

Глава И. Применение методов СЗМ к исследованию молекул ДНК.

2.1. Принцип работы АСМ и различные режимы.

2.2. Выбор подложки, ее модификация.

2.3. Выбор кантилеверов.

2.4. Выбор, подготовка, синтез ДНК.

2.5. Методика приготовления образцов для изучения иммобилизации.

2.6. Методика приготовления образцов для изучения проводимости ДНК.

Глава III. АСМ-визуализация ДНК различного происхождения.

3.1. Исследование нативных ДНК.

3.2. Исследование влияния буферного компонента раствора на характер иммобилизации олигонуклеотидов.

Выводы по главе III.

Глава IV. Исследование одиночных олигонуклеотидов и агрегатов на их основе.

4.1. Воспроизводимость результатов, статистический анализ одиночных олигонуклеотидов.

4.2. Изучение агрегатов и построение градуировочной кривой.

4.3. Исследование зависимости плотности иммобилизованных одиночных олигонуклеотидов от концентрации компонентов раствора-образца.

4.4. Измерение электрической проводимости олигонуклеотидов

Выводы по главе IV.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование методами СЗМ иммобилизации молекул ДНК и оценка их проводимости"

Актуальность работы. Биосенсоры играют важную роль в развитии многих разделов биологии, химии, физике. Частным случаем биосенсоров являются ДНК-чипы - миниатюрные устройства для параллельного анализа специфических взаимодействий молекул ДНК. Они находят все более широкое применение в исследованиях в области молекулярной биологии, генетики и в ДНК-диагностике [1, 2]. В современных ДНК-чипах взаимодействие между ДНК-мишеныо (исследуемой ДНК) и иммобилизованным ДНК-зондом обнаруживают по величине флуоресцентного сигнала, генерируемого соответствующей репортерной группой. Современные способы изготовления чипов позволяют наносить ДНК-зонды на поверхность подложки с субмикронной точностью, однако контроль качества нанесения оказывается недостаточным.

Разработка эффективных ДНК-чипов возможна с использованием методов атомно-силовой микроскопии (АСМ), являющейся одной из представительниц семейства сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ), которая привлекает внимание биофизиков тем, что позволяет реализовать комплексный подход к изучению структурно-функциональных связей биологических объектов, сочетая высокое разрешение нанометрового порядка по нормали с неразрушающим характером исследования, обусловленным невысокой интенсивностью взаимодействия зонд-образец, и возможностью проведения исследований в различных средах, в том числе в жидкостях и газовых смесях. Применение методов АСМ позволяет непосредственно визуализировать результаты нанесения и иммобилизации ДНК-зондов на поверхности подложки и, тем самым, содействовать повышению плотности и однородности иммобилизованных олигонуклеотидов, а также наблюдать присутствие чужеродных объектов, образование агрегатов и др.

Вместе с тем, необходимо указать и на некоторые ограничения применимости методики ACM: 1) при интерпретации результатов следует учитывать, что латеральное разрешение зависит от исследуемого образца, размера и формы иглы-зонда; 2) недостаточное понимание характера взаимодействия зонда с образцом и 3) существует необходимость разработки специфических методов приготовления образцов [3,4].

АСМ как метод исследования требует химически подходящих и атомарно гладких подложек, для того чтобы различить топографию адсорбированных макромолекул, особенно одиночных молекул, от топографии подложки [5]. Количество подложек, отвечающих данным требованиям, ограничено. В настоящее время наиболее применима слюда; имеются работы, в которых иммобилизацию осуществляли на поверхности пирографита [6]. Таким образом, АСМ является мощным инструментом для изучения особенностей иммобилизации молекул ДНК на подложках разных типов. Необходимым условием успешности таких исследований является иммобилизация молекул ДНК на атомарно гладкой поверхности. Субмолекулярное разрешение исследуемых молекул может быть достигнуто только в том случае, если они стабильно прикреплены к поверхности подложки отдельно друг от друга. Для этого необходимо разработать методику приготовления образцов олигонуклеотидов на слюде для атомно-силовой микроскопии.

Были поставлены следующие задачи: разработать методики приготовления образцов для визуализации с высоким разрешением молекул ДНК различного происхождения с помощью атомно-силовой микроскопии; определить физические параметры агрегатов, образующихся при иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности слюды; исследовать зависимость плотности одиночно иммобилизованных олигонуклеотидов от концентрации компонентов раствора-образца; провести экспериментальные исследования электрической проводимости олигонуклеотидов.

Определено удельное сопротивление олигонуклеотидов длиной 20 звеньев, которое оказалось равным 3.25 Ом-см. Изучение степени электропроводности биомолекул чрезвычайно важно и может внести вклад в развитие амперометрических биосенсоров.

Полученные результаты исследования особенностей иммобилизации используются в учебном процессе Башкирского государственного университета студентами кафедры физической электроники и нанофизики.

Положения, выносимые на защиту:

3. Плотность одиночно иммобилизованных олигонуклеотидов резко возрастает при увеличении концентрации этих молекул в растворе от О до 2 нг/мкл. При дальнейшем увеличении концентрации от 2 до 10 нг/мкл наблюдается плавное уменьшение плотности одиночно иммобилизованных олигонуклеотидов с постепенным установлением определенной неизменной величины.

4. Увеличение концентрации катионов Мп2+ в иммобилизационном растворе от 25 до 50 мкМ приводит к возрастанию плотности одиночно иммобилизованных олигонуклеотидов. При концентрации катионов в растворе свыше 50 мкМ происходит снижение плотности одиночно иммобилизованных олигонуклеотидов.

Апробация работы. Основные результаты исследования были доложены на V (XXXVII) Международной научно-практической конференции «Образование, наука, инновации - вклад молодых исследователей» (Кемерово, 2010), Международных школахконференциях для студентов, аспирантов и молодых ученых по математике, физике и химии «Фундаментальная математика и ее приложения в естествознании» (Уфа, октябрь 2009, 2010 гг.), Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, декабрь 2008 г.), Ежегодных Всероссийских научных школах-семинарах «Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине» (Саратов, 2007, 2008, 2010 гг.), I и II открытой школе-конференции стран СНГ «Ультрамелкозернистые и наноструктурные материалы» (Уфа, 2008, 2010 гг.), II и IV Международных конференциях «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, июнь 2008, 2010 гг.), Школе молодых ученых «СОВРЕМЕННЫЕ НАНОТЕХНОЛОГИИ» (Екатеринбург, март 2008 г.), Четырнадцатой Всероссийской Научной Конференции Студентов-Физиков и молодых ученых (Уфа, март 2008 г.), Всероссийской школе-конференции для студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальная математика и ее приложения в естествознании» (Уфа, октябрь 2007 г.), Первой Всероссийской Школе-семинаре «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, июнь 2007 г.), Санкт-Петербургской Международной конференции по нанобиотехнологиям (Санкт-Петербург, ноябрь 2006 г.), Второй всероссийской конференции молодых ученых «Физика и химия высокоэнергетических систем» (Томск, май 2006 г.), на Школе-семинаре «КоМУ-2005»-«Нанотехнологии и наноматериалы» (Ижевск, декабрь 2005 г.), V, VI и VIII региональных школах-конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых по математике и физике (Уфа, октябрь 2005, 2006 и 2008 гг.).

Личный вклад автора заключается в разработке методики проведения микроскопических исследований подобных объектов, подборе режимов работы сканирующего зондового микроскопа, получении АСМ-, СТМ-изображений различных по природе и длине молекул ДНК, вольт-амперных характеристик олигонуклеотидов. Все химические аспекты проекта: подбор химических реагентов, модифицирующих катионов, расчет состава рабочих растворов и т.д., а также анализ полученных результатов и их интерпретация проводились совместно с коллегами из института биохимии и генетики УНЦ РАН и химического факультета БашГУ. При проведении исследований по диссертационной работе была использована поисковая система и патентная база БашГУ по нанотехнологиям.

Публикации. По результатам исследований, выполненных при работе над диссертацией, опубликовано 23 печатные работы, в том числе 1 статья в журнале из списка изданий, рекомендованных ВАК РФ, 2 статьи в российских журналах, 7 публикаций в сборниках" трудов всероссийских и международных конференций, тезисы 13 докладов.

Структура и объем диссертации. Общий объем диссертационной работы составляет 111 страниц машинописного текста, состоит из списка сокращений, введения, четырех глав материала, заключения. Список литературы содержит 110 единиц наименований.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Шарипов, Талгат Ишмухамедович

основные выводы:

4. Установлена зависимость плотности одиночно иммобилизованных ОДН от концентрации катионов Мп в иммобилизационном растворе. Обнаружено, что увеличение концентрации катионов Мп2+ в растворе от 25 до 50 мкМ приводит к возрастанию плотности одиночно иммобилизованных ОДН. При концентрации катионов в растворе свыше 50 мкМ происходит снижение плотности одиночно иммобилизованных олигонуклеотидов.

Заключение

Из полученных в работе данных можно сделать следующие

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Шарипов, Талгат Ишмухамедович, Саратов

1. Guschin D., Yershov G., Zaslavsky A., Gemmell A., Shick V., Proudnikov D., Arenkov P., Mirzabekov A. Manual manufacturing of oligonucleotide, DNA and protein microchips. Anal. Biochem., 1997, v.250, p.203-211.

2. D. J. Muller, A. Engel and М. Amrein. Preparation techniques for the observation of native biological systems with the atomic force microscope. Biosensors & Bioelectronics, 1997, v. 12, №8, p. 867-877.

3. P. Wagner. Immobilization strategies for biological scanning probe microscopy. FEBS Letters, 1998, v.430, p. 112-115.

4. K. el Kirat, I. Burton, V. Dupres & Y. F. Dufrene. Sample preparation procedures for biological atomic force microscopy. Journal of Microscopy, 2005, v.218, p. 199-207.

5. Klinov D.V., Dubrovin E.V., Yaminsky I.V. Scanning probe microscopy of DNA on mica and graphite. Physics of Low-Dimensional Structures, 2003, v.3, №4, p. 119-124.

6. H.Tanaka, T.Kawai, Scanning tunneling microscopy imaging of the DNA base molecules on reduced SrTi03 (100) surfaces, Materials Science and Engineering C, 3 (1995) 143 148;

7. M.Kasaya, H.Tabata, T.Kawai, Scanning tunneling microscopy observation and theoretical calculation of the adsorption of adenine on Si(100)2xl surfaces, Surface Science 342 (1995) 215-223

8. Kasumov A Y, Kociak M, Gueron S, Reulet B, Volkov V T, Klinov D V, and Bouchiat H 2001 Science 291 280

9. G. Binnig, C.F. Quate, C. Gerber, Phys. Rev. Lett. 56 (1986) 930.

10. A. Ikai, Surf. Sei. Rep. 26 (1997) 261,

11. N.C. Santos, M.A.R.B. Castanho, Biophys. Chem. 107 (2004) 133,

12. D. Anselmetti, M. Dreier, R. Lu'thi, T. Richmond, E. Meyer, J. Frommer, H.J. Guntherodt, J. Vac. Sei. Technol. B 12 (1994) 1500,

13. K.D. Jandt, Surf. Sei. 491 (2001) 303,

14. H.G. Hansma, K.J. Kim, D.E. Laney, R.A. Garcia, M. Argaman, M.J. Allen, S.M. Parsons, J. Struct. Biol. 119 (1997) 99.

15. C. Rivetti, M. Guthold, C. Bustamante, J. Mol. Biol. 264 (1996) 919,

16. S.J. Li, C. Bai, C.Wang, C. Zhu, Z. Lin, Q. Li, E. Cao, Nucleic Acids Res. 26 (1998) 4785,

17. C. Bustamante, J. Vesenka, C.L. Tang,W. Rees, M. Guthold, R. Keller, Biochemistry 31 (1992) 22,

18. J. Vesenka, M. Guthold, C.L. Tang, D. Keller, E. Delaine, C. Bustamante, Ultramicroscopy 42-44 (2) (1992) 1243,

19. Y.L. Lyubchenko, L. Shlyakhtenko, R. Harrington, P. Oden, S. Lindsay, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90 (1993) 2137,

20. H.G. Hansma, M. Bezanilla, D.E. Laney, R.L. Sinsheimer, P.K. Hansma, Biophys. J. 68 (1995) 1672

21. H. Tanaka and T. Kawai. Visualization of Detailed Structures within DNA, Scanning Probe Microscopy in Life Sciences 2nd Int. Workshop -18 Sept 2003 in Berlin

22. Xiaochun Zhang, Ioanna H. Antonopoulos, Sandip Kumar, Junghuei Chen, Andrew V. Teplyakov, Tuning the geometry of shape-restricted DNA molecules on the functionalized Si(lll). Applied Surface Science, v.256, №3, pp. 815-818.

23. M. Tijima, T. Kato, S. Nakanishi, H. Watanabe, K. Kimura, K. Suzuki and Y. Maruyama. STM/STS Study of Electron Density of States at the Bases Sites in the DNA Alternating Copolymers. Chemistry Letters Vol.34, No.8 (2005), Pp. 1084-1085

24. Y. L. Lyubchenko, L. S. Shlyakhtenko, M. Binus, C. Gaillard and F. Strauss. Visualization of hemiknot DNA structure with an atomic force microscope, Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 22, Pp. 49024909

25. Klinov D.V., Dubrovin E.V., Yaminsky I.V. Scanning probe microscopy of DNA on mica and graphite. Physics of Low-Dimensional Structures, 2003, v.3, №4, p. 119-124.

26. H. G. Hansma, I. Revenko, K. Kim and D. E. Laney. // Nucleic Acids Research, 1996. V. 24. №4. Pp. 713-720.

27. I. Barbulovic-Nad, M. Lucente, Y. Sun, M. Zhang, A.R. Wheeler, Critical Reviews in Biotechnology 26 (4) (2006) 237,

28. W. Senaratne, L. Andruzzi, C.K. Ober, Biomacromolecules 6 (2005) 2427,

29. R. Jelinek, S. Kolusheva, Chemical Reviews 104 (2004) 5987,

30. P. Tengvall, I. Lundstrom, Biomaterials 19 (4-5) (1998) 407

31. Bertrand Lemieux, Asaph Aharoni, Mark Schena. Overview of DNA chip technology//Molecular Breeding. 1998. 4: 277-289, 1998;

32. Magdalena Gabig, Grzegorz Wegrzyn. An introduction to DNA chips: principles, technology, applications and analysis // Acta Biochimica Polonica. 2001. Vol. 48 No. 3. 615-622

33. P. Wagner. Immobilization strategies for biological scanning probe microscopy. FEBS Letters, 1998, v.430, p. 112-115

34. J. Hu, M. Wang, H.-U. G. Weier, P. Frantz, W. Kolbe, D. F. Ogletree and M. Salmeron. // Langmuir, 1996. V. 12. № 7. Pp. 1697-1700.

35. Lyubchenko, Y.L., Gall, A.A., Shlyakhtenko, L.S., Harrington, R.E., Oden, P.I., Jacobs, B.L. & Lindsay, S.M. (1992) Atomic force microscopy imaging of double stranded DNA and RNA. J. Biomol. Struct. Dyn. 9, 589-606.

36. Hansma, H.G. & Laney, D.E. (1996) DNA binding to mica correlates with cationic radius: assay by atomic force microscopy. Biophys. J. 70, 1933-1939.

37. Engel, A., Schoenenberger, C.-A. and Mueller, D.J. (1997) Curr. Opin. Struct. Biol. 7, 279A284.

38. Thalhammer, S., Stark, R.W., Mueller, S., Wienberg, J. and Heckl, W.M. (1997) J. Struct. Biol. 119, 232A237.

39. Preparation techniques for the observation of native biological systems with the atomic force microscope. D.J. Müller, A. Engel, M. Amrein // Biosensors&Bioelectronics. 1997. - V. 12. - № 8. p. 867-877;

40. Atomic force microscopy of supercoiled DNA structure on mica. M. Tanigawa, T. Okada // Analytica Chimica Acta. 1998. - V. 365. - P. 19-25;

41. Visualization of supercoiled DNA with atomic force microscopy in situ. U.L. Lyubchenko, L.S. Shlyakhtenko // Proc. Natl. Acad. Sei. 1997. -V. 94.-P. 496-501

42. Butt, H.-J. (1991) Biophys. J. 60, 777-785.

43. Butt, H.-J. (1992) Biophys. J. 63, 578-582.

44. Mueller, D.J., Amrein, M. and Engel, A. (1997) J. Struct. Biol. 119, 172188.

45. Shao, Z., Mou, J., Czajkowsky, D.M., Yang, J. and Yuan, J.-Y. (1996) Adv. Phys.45, 1-86.

46. Bustamante, C. and Rivetti, C. (1996) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 395-429.

47. Guthold, M., Bezanilla, M., Erie, D.A., Jenkins, B., Hansma, H.G. and Bustamante, C. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 12927-12931.

48. Yang, J, Tamm, L.K., Tillack, T.W. and Shao, Z. (1993) J. Mol. Biol. 229, 286-290.

49. Yang, J, Mou, J. and Shao, Z. (1994) FEBS Lett. 338, 89-92.

50. Bustamante, C., Vesenka, J., Tang, C.L., Rees, W., Guthold, M. and Keller, R. (1992) Biochemistry 31, 22-26.

51. Bezanilla, M., Manne, S., Laney, D.E., Lyubchenko, Y.L. and Hansma, H.G. (1995) Langmuir 11, 655-659.

52. Hansma, H.G. and Laney, D.E. (1996) Biophys. J. 70, 1933-1939.

53. Hansma, H.G., Kim, K.J., Laney, D.E., Garcia, R.A., Argaman, M., Allen, M.J. and Parsons, S.M. (1997) J. Struct. Biol. 119, 99-108.

54. Fritz, J., Anselmetti, A., Jarchow, J. and Fernandez-Busquets, X. (1997) J. Struct. Biol. 119, 165-171.

55. K. el Kirat, I. Burton, V. Dupres & Y. F. Dufrene. Sample preparation procedures for biological atomic force microscopy. Journal of Microscopy, 2005, v.218, p. 199-207.

56. R.F. Service, Science 282 (1998) 396.

57. S.P.A. Fodor. Massively parallel genomics. Science 277 (1997) P. 393395.

58. T.M. Heme, M.J. Tarlov, J. Am. Chem. Soc. 119 (1997) 8916.

59. Fodor, S.P.A., J.L. Read, M.C. Pirrung, L. Stryer, A. Tsai Lu, and D. Solas. Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science 251 (1991) P. 767-773.

60. J. C. O'Brien, J. T. Stickney, and M. D. Porter. Preparation and Characterization of Self-Assembled Double-Stranded DNA (dsDNA) Microarrays for Protein:dsDNA Screening Using Atomic Force Microscopy, Langmuir 16 (2000), P. 9559-9567.

61. L.T. Mazzola, C.W. Frank, S.P.A. Fodor, C. Mosher, R. Lartius, E. Henderson, Biophys. J. 76 (1999) 2922.

62. J. Wang, A.J. Bard, Anal. Chem. 73 (2001) 2207.

63. T. Ta'tte, K. Saal, I. Kink, A. Kurg, R. Lo~hmus, U. Maeorg, M. Rahi, A. Rinken, A. Lo~hmus, Surf. Sci. 532-535 (2003) 1085.

64. R. Lenigk, M. Carles, N.Y. Ip, N.J. Sucher, Langmuir 17 (8) (2001) 2497.

65. E. Casero, M. Darder, D.J. Diaz, F. Pariente, J.A. Martin-Gago, H. Abrurfa, A. Lorenzo, Langmuir 19 (2003) 6230.

66. M. H. Rouillât, V. Dugas, J. R. Martin, M. Phaner-Goutorbe. Characterization of DNA chips on the molecular scale before and after hybridization with an atomic force microscope, Applied Surface Science 252 (2005) 1765-1771.

67. Turro NJ, Barton JK (1998) J Biol Inorg Chem. 3, 201.

68. Braun E, Eichen Y, Sivan U, Ben-Yoseph G (1998) Nature 391, pp. 775 -777.

69. H.W. Fink and C. Schonenberger, Nature 398, 407 (1999).

70. Porath D, Bezryadin A, Vries S De and Dekker C 2000 Nature London. 403 635.

71. Storm A J, Noort J van, Vries S de, and Dekker C , 2001 Appl. Phys. Lett. 79 3881

72. J.S. Hwang, S.W. Hwanga, D. Ahn, Electrical conduction measurement of thiol-modified DNA molecules, Superlattices and Microstructures, Vol. 76, pp. 433-438.

73. H. Cohen, C. Nogues, R. Naaman, D. Porath, Direct measurement of electrical transport through single DNA molecules of complex sequence, PNAS, 2005,-v. 102, №33,-pp. 11589-11593.

74. G. Binnig, H. Rohrer, Ch. Gerber, E. Weibel, Surface studies by scanning tunneling microscopy, Phys. Rev. Lett. 49 (1982) 57-61.

75. Миронов В. JI. Основы сканирующей зондовой микроскопии. / Учеб. пособие. Нижний Новгород: 2004. 110 с.

76. Q. Zhong, D. Inniss, К. Kjoller, V.B. Elings, Fractured polymer/silica .ber surface studied by tapping mode atomic force microscopy, Surf. Sci. 290(1993) L688-L692.

77. J. Tamayo, R. Garcafa, Deformation, contact time, and phase contrast in tapping mode scanning force microscopy, Langmuir 12 (1996) 44304435.

78. J.P. Cleveland, B. Anczykowski, A.E. Schmid, V.B. Elings, Energy dissipation in tapping-mode atomic force microscopy, Appl. Phys. Lett. 72 (1998) 2613-2615.

79. T.R. Albrecht, P. GruE tter, D. Home, D. Rugar, Frequency modulation detection using high-Q cantilevers for enhanced force microscope sensitivity, J. Appl. Phys. 69 (1991) 668-673.

80. F.J. Giessibl, Atomic resolution of the silicon (lll)-(7 7) surface by atomic force microscopy, Science 267 (1995) 68-71.

81. P.3. Бахтизин, P.P. Галлямов. Физические основы сканирующей зондовой микроскопии. Уфа: изд - во БашГУ, 2003 - 84с.

82. Bailey, S.W. (1984) Micas. Mineralogical Society of America, Washington, DC.

83. Lyubchenko, Y.L., Gall, A.A., Shlyakhtenko, L.S., Harrington, R.E., Oden, P.I., Jacobs, B.L. & Lindsay, S.M. (1992) Atomic force microscopy imaging of double stranded DNA and RNA. J. Biomol. Struct. Dyn. 9, 589-606.

84. Pashley R.M. Hydration forces between mica surfaces in aqueous solutions. // J. Colloid Interface Sei. 1981.- V.80.- №1. - P. 153-162.

85. Karrasch, S, Dolder, M., Schabert, F., Ramsden, J. & Engel, A. (1993) Covalent binding of biological samples to solid supports for scanning probe microscopy in buffer solution. Biophys. J. 65, 2437-2446.

86. Cullen, D.C. & Lowe, C.R. (1994) AFM studies of protein adsorption. 1. Time-resolved protein adsorption to highly oriented pyrolytic-graphite. J. ColloidInterf. Sei. 166, 102-108.

87. Yang, J., Takeyasu, K. & Shao, Z. (1992) Atomic force microscopy of DNA molecules. FEBS Lett. 301, 173-176.

88. Dupont-Gillain, C.C., Nysten, B. & Rouxhet, P.G. (1999) Collagen adsorption on poly (methyl methacrylate): net-like structure formation upon drying. Polymer Int. 48, 271-276.

89. Wagner, P., Hegner, M., Guntherodt, H.-J. & Semenza, G. (1995) Formation and in situ modification of monolayers chemisorbed on ultraflat template-stripped gold surfaces. Langnmir, 11, 3867-3875.

90. В.А. Быков, Микромеханика для сканирующей зондовой микроскопии и нанотехнологии, Нано- и микросистемная техника, 2008.95. http://popnano.ru/

91. Гиваргизов Е.И. Патент № 2074444 от 27.02.97. International Application Number PCT/Ru95/00154 от 18.07.95г., ЕР0726589 Al.

92. Гиваргизов Е.И. Патент № 2099808 от 20.12.97. International Application Number PCT/Ru97/00078 от 24.03.97 г., WO 97/37064 Al.

93. Vesenka J., Guthod M., Tang C.L., Keller R., Delaine E. and Bustamante C. Substrate preparation for reliable imaging of DNA molecules with the scanning force microscope. Ultramicroscopy, 1992, v.42-44, p. 12431249.

94. H. G. Hansma, I. Revenko, K. Kim and D. E. Laney. Atomic force microscopy of long and short double-stranded, single-stranded and triple-stranded nucleic acids. Nucleic Acids Research, 1996, v.24, №4, p. 713720.

95. Галлямов M.O. Сканирующая зондовая микроскопия нуклеиновых кислот и тонких органических пленок. Автореф. дис. . канд. физ.-мат. наук. М.: МГУ, 1999. - 23 с.

96. J. Ни, М. Wang, H.-U. G. Weier, P. Frantz, W. Kolbe, D. F. Ogletree and M. Salmeron. Imaging of single extended DNA molecules on flat (aminopropyl)triethoxysilane-mica by atomic force microscopy // Langmuir. 1996. V.12. №7. P. 1697 1700.

97. A.F. Morpurgo, C.M. Marcus, and D.B. Robinson, Controlled fabrication of metallic electrodes with atomic separation, Appl. Phys. Lett. 74, 2084(1999).

98. P. J. de Pablo, F. Moreno-Herrero, E. Artacho, Absence of DC-conductivity in A,-DNA molecules between nanoelectrodes at the 100 nm length scale, Appl. Phys. Lett. 79, 3881 (2001).

99. P. J. de Pablo, F. Moreno-Herrero, J. Colchero, J. Gomez Herrero, P. Herrero, A. M. Baro, P. Ordejon, J. M. Soler, and E. Artacho, Absence of DC-conductivity in X-DNA, Phys. Rev. Lett. 85, 4992-4995 (2000).

100. J.J.W.M. Rosnik, M.A. Blauw, L.J. Geerlings, E. van der Drift, S. Radelaar, Tunneling spectroscopy and modeling of electron transport in small conjugated azomethine molecules, Phys. Rev. B 62 (2000) 1045910466.

101. H. Cohen, С. Nogues, Е. Shapir, N. Borovka et al. SPM and charge transport measurements of various DNA and DNA-based molecules. International Simposium: DNA-based molecular electronics, 2004.05.1315; Jena, Germany.

102. Гоц С.С. Основы описания и компьютерных расчетов характеристик случайных процессов в статистической радиофизике. Учебное пособие. - Уфа: РИО БашГУ, 2005, 166 с.

Информация о работе

Шарипов, Талгат Ишмухамедович
кандидата физико-математических наук
Саратов, 2011
ВАК 03.01.02

Диссертация

Исследование методами СЗМ иммобилизации молекул ДНК и оценка их проводимости - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы