Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование мембранных тубулярных структур в модельных и клеточных системах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование мембранных тубулярных структур в модельных и клеточных системах"

На правах рукописи УДК 577.3

ЛИЗУНОВ ВЛАДИМИР АНАТОЛЬЕВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕМБРАННЫХ ТУБУЛЯРНЫХ СТРУКТУР В МОДЕЛЬНЫХ И КЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМАХ

Специальность 03.00.02 - «Биофизика»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва-2005

Работа выполнена в Институте Электрохимии им. А.Н. Фрумкина Российской Академии Наук

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук,

Фролов Вадим Александрович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор

Генрих Николаевич Берестовский

доктор биологических наук, профессор Александр Владимирович Зеленин

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. М. М.

Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской Академии Наук

Защита диссертации состоится июня 2005 г. в часов на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте по адресу:

141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер., д. 9, МФТИ С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.

Автореферат разослан «221» 2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета ч^ь. . ~— Брагин В.Е.

/6507

ОБЩАЯ

iая характег

:ристика работы

Актуальность темы исследования

Мембранные тубулярные структуры (ТС) широко распространены в биологических системах. Микротрубочки, стенки которых образованы фосфолипидной мембраной, являются неотъемлемой частью таких структур, как эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, клеточные отростки, псевдоподии и др. Более того, ТС выполняют важные транспортные функции по обмену веществ между внутриклеточными компартментами, возникают в процессах деления и слияния мембран и, предположительно, играют важную роль в ходе эндоцитоза и экзоцитоза. Поэтому исследование механических и транспортных свойств мембранных тубулярных структур является одной из приоритетных задач биофизики мембран.

В последнее время все чаще возникает вопрос о роли механических и молекулярных свойств липидной мембраны в процессах формирования, стабилизации и деления клеточных ТС. Особенно это важно в применении к эндо- и экзоцитозу, так как эти процессы лежат в основе жизнедеятельности любой клетки. На уровне же многоклеточных организмов, нарушения в работе этих процессов приводят к целому ряду тяжелых заболеваний.

Так, изучаемое в данной работе слияние GSV - везикул (GLUT4 storage vesicles), содержащих белок GLUT4 (glucose transporter-4), лежит в основе инсулин-зависимой регуляции содержания глюкозы в организме и важно в связи с выяснением причин возникновения диабетов. Исследование же поглощения клетками субмикронных частиц важно для понимания процессов эндоцитоза и фагоцитоза, опосредующих иммунные функции макрофагов, а именно нейтрализацию бактерий и вирусов в организме. В основе всех перечисленных выше клеточных процессов лежат топологические перестройки мембранных ТС, изучению которых и посвящена эта работа. Цель работы

Цель настоящей работы заключалась в исследовании механических и транспортных свойств мембранных тубулярных структур. В ходе работы были поставлены следующие задачи:

1. Разработать модельную систему для изучения ТС, сформированных из бислойной липидной мембраны (БЛМ)

2. Исследовать форму, стабильность и проницаемость модельной ТС.

3. Разработать методику регистрации ощепления одиночных везикул в

процессе эндоцитоза.

М>с НАЦИОНАЛЬНАЯ ВИММОТЕКА i

4. Исследовать проницаемость ТС и кинетику их деления при эндоцитозе.

5. Разработать методику регистрации экзоцитоза одиночных вБУ везикул в адипозных (жировых) клетках.

6. Изучить кинетику слияния СБУ-везикул с плазматической мембраной и процесс латеральной диффузии белка СШТ4 через ТС.

Научная новизна

Разработана модельная система, позволяющая формировать ТС из БЛМ с заданными свойствами (длиной, радиусом и липидным составом). Система позволяла получать флуоресцентное изображение ТС, измерять ее ионную проницаемость и исследовать механическую стабильность при растяжении/сжатии.

Впервые показано, что модельная ТС проявляет бистабильное поведение, т.е. при вариациях параметров способна переключаться между двумя состояниями: микроскопической катеноидальной мембранной трубкой (МТ) и квазицилиндрической нанотрубкой (НТ) с диаметром до 10 нм.

Показано, что при переходах МТ-НТ проницаемость ТС может меняться на несколько порядков, при этом сохраняется целостность мембраны и не возникает проводящих дефектов и трансмембранной проводимости.

На клетках 1С-21 измерена проницаемость ТС, возникающих в процессе эндоцитоза (т.н. мембранных перешейков - МП). Была впервые зарегистрирована кинетика деления МП при поглощении субмикронных частиц макрофагами и показана ее независимость от размера везикулы.

Обнаружено, что в процессе эндоцитоза происходят обратимые изменения проницаемости МП, не приводящие к отделению везикулы. Показано, что обратимые переходы осуществляются гораздо быстрее, чем деление МП. Было высказано предположение, что обратимые изменения проницаемости МП аналогичны переходам МТ-НТ и обусловлены механическими свойствами мембраны.

Исследовано слияние ОБУ-везикул в адипозных клетках и показано, что возникновение долгоживущих МП в процессе экзоцитоза регулирует скорость высвобождения мембранных белков. Теоретическая и практическая ценность

Обнаруженные свойства модельных ТС, а именно их критическое поведение и возможность обратимых переходов между состояниями с различной проницаемостью, важны для понимания роли липидного бислоя в

биологических процессах формирования, трансформации и деления клеточных ТС.

Разработанная модельная система позволяет, помимо исследования механических свойств ТС, также изучать взаимодействие ТС с клеточными белками, участвующими в процессах эндо- и экзоцитоза. Так, уже начаты эксперименты с динамином (белком, опосредующим эндоцитоз) и получены предварительные результаты, свидетельствующие о том, что динамин успешно адсорбируется на модельную ТС, а при гидролизе ГТФ осуществляет ее деление.

Выяснение влияния свойств мембраны на процессы эндо- и экзоцитоза носит практическую ценность, так как это может позволить разработать методы регуляции этих процессов, а также лучше понять их молекулярные механизмы. Впервые обнаруженные долгоживущие ТС, возникающие в процессе слияния GLUT4 везикул, позволяют предложить новые способы регуляции транспорта глюкозы на клеточном уровне. Возможные нарушения в ходе этого процесса могут лежать в основе таких патологий, как диабет 2-го типа. Более того, обнаруженное поведение ТС при экзоцитозе может быть фундаментальным механизмом тонкой регуляции редиркуляции мембранных белков. Апробаиия работы

Основные результаты, изложенные в диссертации, докладывались и обсуждались на конференции «Laboratory of Cellular and Molecular Biophysics Arnual Scientific Retreat», National Institutes of Health (Бетесда, США, 2003); на международной конференции «Membrane Bioelectrochemistry: from basic principles to human health» (Москва, 2002); на 45-ом съезде американского биофизического общества (Бостон, США, 2001); на научной конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000); на XLII и XLI конференциях МФТИ (Долгопрудный, 2000; 1999) и на научных семинарах по биоэлектрохимии ИЭЛ РАН (Москва, 1999-2005). Публикаиии

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, список которых приведен в конце автореферата. Структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа состоит из 3 глав и изложена на 115 страницах, содержит 33 рисунка и 2 таблицы. Список литературы включает 127 источников.

материалы и методы исследований

Формирование ТС из БЛМ.

Бислойная липидная мембрана формировалась по методу Мюллера-Рудина на тефлоновом отверстии (R=25-100mkm) в специальной ячейке, заполненной раствором электролита (ЮОмМ КС1). Использовались следующие липиды (Avanti Polar Lipids Inc., США): дифитоноилфосфотидилхолин (ДФФХ), динервоноилфосфотидилхолин (ДНФХ), олеоил- и диолеоилфосфотидихолин (ОФХ и ДОФХ), олеоил- и диолеоилфосфотидилэтаноламин (ОФЭ и ДОФЭ). Мембраны формировались из раствора липида в сквалене 10мг/мл. В ряде опытов использовались смеси ОФЭ:ОФХ=1:1 и ДОФЭ:ДОФХ=1:1 смольными добавками холестерина от 5 до 40%. Для флуоресцентной микроскопии использовались добавки 2-5 мольных процентов родамин-ДОФЭ.

Стеклянная пипетка подводилась к БЛМ (подведение контролировалось визуально с помощью микроскопа) до формирования плотного контакта мембраны со стеклом (сопротивление утечки ~ ГОм). Фрагмент мембраны под пипеткой (пэтч) разрушался импульсом. отрицательного гидростатического давления. При отведении пипетки образуется мембранная трубка. Стадии формирования и деления МТ контролировались с помощью флуоресцентной микроскопии - содержащийся в мембране флуоресцентный зонд обеспечивал визуализацию формы МТ. При достижении критической длины МТ трансформировалась в нанотрубку (HT)- Механические манипуляции (изменение длины МТ/НТ) проводились пьезо-манипулятором (ESA-CSA, NewPort, США) так, что МТ/НТ всегда соединяла два коаксиальных кольца. На кольцах были расположены т.н. мениски, содержащие раствор липида в высокомолекулярном неполярном растворителе, мениски обеспечивали резервуар для увеличения площади мембраны и одновременно определяли натяжение.

Электрические измерения.

Электрические измерения проводили с помощью установки, состоящей из универсального генератора PAR-175 (Princeton Applied Research, США), пэтч-кламп усилителя ЕРС-7 (Warner Instruments Corp., США), фильтра F-900 (Frequency Devices, США) и осциллографа OS-1420 (GOULD, Англия). В режиме фиксации потенциала (voltage-clamp режим усилителя РС-505) к электродам по разные стороны МТ/НТ прикладывалось постоянное напряжение (20-100мВ) и измерялся ток через МТ/НТ. В отдельных опытах дополнительно

измерялся ток через мембрану, для чего снаружи МТ/НТ помещался третий электрод и использовался второй пэтч-кламп усилитель с общей землей. Данные (ток и командные потенциалы) записывались на жесткий диск-компьютера после предварительной оцифровки с помощью АЦП L-305/L-1210 (L-Card, Россия). Частота опроса менялась от 1 до 50 кГц, перед оцифровкой сигналы пропускались через фильтр низких частот (F-900); частота среза устанавливалась в 2 раза меньше частоты опроса. Для управления платами сбора данных семейства L-Card и последующей обработки данных было разработано собственное программное обеспечение.

Клетки

Клетки линии IC-21 получали из коллекции клеточных культур Института Вирусологии РАМН. Культивирование производилось во флаконах в стандартной культуральной среде DMEM (GIBCO, США) с 5% эмбриональной телячьей сывороткой (Biofluids, США), в С02-атмосфере при 37°С. Для проведения электрофизиологических экспериментов клетки из флаконов пересевали на пластиковые чашки Петри. Эксперименты проводили в буфере PBS (GibcoBRL, США) в течение 1 -3 часов после посева.

В рамках гранта CRDF RBO-1297MO-03 изолированные и трансфицированные адипозные клетки поставлялись из лаборатории экспериментальной диабетологии (N1DDK, National Institutes of Health, США). Белые адипозные клетки изолировались из жировой ткани придатков яичка (эпидидимиса) 180-250г самцов крыс (линия CD, Charles River, Inc.) и трансфицировались плазмидой HA-GLUT4-GFP (green fluorescent protein). В раствор с плавающими изолированными адипозными клетки погружались покровные стекла, покрытые поли-лизином (poly-L-lysine, Sigma, США), к которым в течение суток спонтанно прикреплялись клетки. Затем стекла с прикрепленными клетками переносились в специальные чашки для микроскопии (Delta-TPG, Bioptechs, США) и фиксировались таким образом, что клетки получались зажатыми между двумя покровными стеклами. Раствор содержал 3,5% бычьего альбумина (BSA, fraction-V, Intergen, США) и 2% фиколла для предохранения клеточной мембраны от механических повреждений при контакте со стеклом. Во время эксперимента в чашке поддерживалась температура 37'С с помощью термоконтроллера Delta-T4 (Bioptechs, США). Для стимуляции клеток в буферный раствор добавлялось 70нМ инсулина.

Измерение адмиттпнса фрагмента клеточной мембраны Для регистрации отдельных актов везикуляции in vitro был использован метод патч-кламп (patch-clamp) без разрыва клеточной мембраны под пипеткой (конфигурация cell-attached). Петч-пипетки готовили из стеклянных капилляров (WPI, США) на микрокузнице Sutter Instruments (США), кончик пипетки (диаметр 1-2мкм) покрывали силгардом для снижения емкости пипетки. Сопротивление пипетки, заполненной раствором электролита (PBS), составляло 2-6 МОм. При подведении пипетки к клетке между стеклом и клеточной мембраной формировался плотный контакт. В процессе измерений к мембранному фрагменту посредством патч-кламп усилителя ЕРС-7 (List Electronic, Германия) прикладывали постоянную разность потенциалов в 20мВ и одновременно подавали синусоидальный сигнал напряжения с частотой 58kHz и амплитудой 50мВ. Токовый ответ, преобразованный патч-кламп усилителем в сигнал напряжения, с помощью векторного вольтметра разделялся на два сигнала с разницей фаз в я/2. Точная подстройка фазы позволяла по одному каналу регистрировать изменения действительной^), а по другому мнимой(1ш) части адмиттанса, по третьему каналу регистрировалась проводимость по постоянному TOKy(Goc)-

Флуоресцентная микроскопия с использованием нарушенного полного внутреннего отражения (нПВО). Для наблюдения за динамикой и слиянием GSV-везикул в живых адипозных клетках была собрана установка для флуоресцентной видео-микроскопии с использованием метода нПВО. Установка состояла из инвертированного микроскопа Olympus IX-70 (Olympus Inc., Япония), оборудованного масляно-иммерсионным объективом 60Х 1.45NA, источника лазерного излучения (аргон 488нм, Spectra Physics, США) и интенсифицированной CCD-камеры (intensified VE1000SIT MTI, США). Лазерный луч подавался через боковой оптический вход микроскопа и фокусировался на заднюю фокальную плоскость так, что на выходе из объектива получался плоскопараллельный пучок. Использование объектива с повышенной числовой апертурой (NA>1.3) позволяло получать условия для полного внутреннего отражения на границе стекло-вода: 0>6c=sin''(n2/ni), где 0 - угол, под которым лазерного луч выходит из объектива, П| и пг - показатели преломления. При этом интенсивность проходящей световой волны (I) экспоненциально затухает с расстоянием: I~exp(-z/d), где z - расстояние от границы раздела, d - глубина проникновения. Флуоресценция эффективно возбуждается только в тонком пограничном слое ~ 2d. Глубина проникновения

определяется относительными Индексами преломления двух сред и углом падения луча на границу раздела: d = X/47t/(n12sin8 - п22)1/г. Изменяя угол падения лазерного луча, при условии выполнения полного внутреннего отражения, можно менять глубину освещения. Благодаря экспоненциальному затуханию с расстоянием проходящей волны метод флуоресценции нПВО позволяет существенно повысить соотношение сигнал/шум и делает возможным наблюдение за движением отдельных флуоресцентных GLUT4-GFP везикул в течении десятка минут.

Для регистрации быстрой динамики движения и слияния GLUT4 везикул выходное изображение с CCD-камеры записывалось в реальном времени на видеомагнитофон и одновременно оцифровывалось с частотой 30Гц с помощью видеоплаты Flashbus (Integral Technologies, США) и записывалось на диск компьютера. Для уменьшения фотоповреждения в перерывах между кадрами лазерное излучение прерывалось с помощью механического затвора UniBlitz D122 (Vincent Associates, США). Для управления видеоплатой использовалось программное обеспечение Metamorph (Universal Imaging, США).

результаты и обсуждение

Несимметричная катеноидальная мембранная трубка В данной работе была разработана оригинальная методика для формирования и изучения свойств мембранной трубки (МТ) из бислойной липидной мембраны (БЛМ). Для случая симметричных граничных условий было подтверждено, что форма МТ описывается катеноидом. Далее было показано, что в случае несимметричных граничных условий (разные радиусы колец Rt и Rj) форма МТ также описывается уравнением, аналогичным катеноиду, но только с двумя параметрами. Решением его является несимметричный катеноид, y(x)=a*cosh((x-b)/a], удовлетворяющий граничным условиям: y(xi)=R,, ; X1+X2—L. Параметры а и Ь находились численно для заданных R/, R? и L с помощью специально написанной программы в среде Maple. Полученные формы поверхности сопоставлялись с изображением МТ (Рис.1).

Во всех случаях теоретическая и экспериментальная поверхности совпадали с точностью до погрешности измерения формы (~1мкм, см. Методы). Для произвольных Rt и R2 была рассчитана критическая длина (LK), при которой МТ претерпевает коллапс. Показано, что результаты расчета совпадают с экспериментальными данными (Рис.1 в).

в

I*

4.33

3.33

1.13

1 10 20 10 40 50

Рис.1. Сопоставление формы и критических параметров МТ с катеноидом.

(а) - флуоресцентное изображение МТ, содержащей 2% родамин-ДОФЭ. Масштаб 20мкм,

(б) - поверхность вращения катеноид; (в) - зависимость критической длины МТ от граничных условий Л/ и Я}, точками показаны экспериментальные данные.

Возможность описания формы МТ несимметричным катеноидом было проверена для различных липидных составов (ДФФХ, ДОФХ:ДОФЭ, ДНФХ и др.) и для МТ с характерными размерами от 200мкм до 1мкм. Таким образом, было впервые показано, что в общем случае для произвольных граничных условий и различного липидного состава форма МТ описывается несимметричным катеноидом. При этом форма и критические параметры МТ определяются исключительно граничными условиями и не зависят от механических свойств мембраны и молекулярных особенностей составляющих ее липидов.

Для исследования проницаемости МТ в процессе удлинения и коллапса измерялся ток через МТ и определялась ее проводимость. Для этого использовалась модифицированная методика патч-кламп. Было показано, что МТ стабильна в различных растворах электролита (КаС1/КС1, от ЮмМ до 1М). Была получена зависимость проводимости МТ от длины и полученные величины проводимости сопоставлены с расчетными значениями для объема электролита, окруженного соответствующим катеноидом. При удлинении МТ проводимость менялась сначала плавно, практически обратно пропорционально длине; ближе к Ьк радиус МТ в узком месте начинал резко уменьшаться, что приводило к существенному уменьшению проводимости. В момент коллапса проводимость МТ резко (за миллисекунды) падала до чрезвычайно малых значений (КМОпСм), которые удалось зарегистрировать с использованием максимального разрешения пэтч-кламп установки. Эта остаточная проводимость и позволила обнаружить новую структуру - мембранную нанотрубку, которая формировалась в процессе коллапса МТ.

Квазицилиндрическая мембранная нанотрубка

Было показано, что при Ь >Ьк МТ переходит в исключительно тонклю тубулярную структуру с поперечным размером (диаметром) порядка десятка нанометров. Было установлено, что при этом сохраняется бислойная структура и цилиндрическая топология мембранной поверхности. Полученная структура была названа «мембранной нанотрубкой» (НТ). Исходный малый диаметр НТ не позволял визуализировать НТ даже с использованием высокочувствительной флуоресцентной микроскопии. Только эмпирически найденные модификации липидного состава (смесь холестерина с лизолипидами) позволили увеличить равновесный диаметр НТ до значений порядка 200нм и получить ее флуоресцентное изображение (Рис.2).

Рис.2. Флуоресцентное изображение нанотрубки увеличенного диаметра. Липидный состав ОФХ:ОФЭ:холестерин-30:30:40, с добавкой 2% родамин-ЦОФЭ. Стрелкой показана микропипетка Неоднородный фон обусловлен зашкаливающим сигналом флуоресценции от большой мембраны (вырезана слева) Масштаб - 5мии

Было показано, что при квазистационарном удлинении НТ остается стабильной при любой длине. При уменьшении длины менее Ьк НТ также оставалась стабильной. И лишь по достижении Ь=1К<< Ьк НТ теряла устойчивость и переходила обратно в МТ, имеющую форму катеноида.

В отличие от МТ, форма НТ не зависит от граничных условий, а определяется механическими свойствами БЛМ (натяжением и изгибной жесткостью). В отличие от мыльных пленок и других систем с поверхностным натяжением, БЛМ обладает еще и изгибной жесткостью. Именно ее наличие и лежит в основе формирования НТ в процессе коллапса МТ. При стремлении радиуса МТ к нулю резко возрастает изгибная энергия, определяемая как: ]Ур=р^{С1+Сг-2С0)Л8 , где /? - модуль изгиба, С/ и С2 - главные кривизны

поверхности, С0 - спонтанная кривизна, определяемая молекулярной геометрией липида. Поэтому при достижении определенного радиуса поверхностное натяжение, стремящееся уменьшить площадь уравновешивается изгибным моментом, стремящимся уменьшить кривизну. Для цилиндрического элемента мембранной поверхности радиуса г, суммарная энергия, связанная с натяжением и изгибом равна: Е(г)~г{а+р(1/г)2}, где а - коэффициент поверхностного натяжения. Дифференцируя выражение для энергии по г ,

находим выражение для равновесного радиуса: г*=ф/о)ш. Для БЛМ из ДФФХ с сг~10'3Н/м, и р - 10"19 Дж полумаем г*~10нм. В принципе, эту же оценку можно найти из соображений размерности: [а] =Дж/м2; [¡3]=Дж, следовательно характерный размер определяется выражением ф/о)"2

Таким образом, было теоретически предсказано, что НТ имеет форму, близкую к цилиндрической, с радиусом г-ф/а),п. Однако для сохранения целостности мембраны НТ на краях должна удовлетворять граничным условиям: у(х1)=Я]; у(х2)=Яь где и Я2»г. Для этого было предложено кусочно-непрерывное описание, в котором цилиндрическая поверхность гладко сшивалась с катеноидальными «крыльями» (Рис.3), заданными уравнением: у(х) = г*со$к(х/г)\ 11~г*агссозИ(Я.1/г); ¡¡-г*агссозИ (Я 2/г). Такая сшивка

а б в

Рис.3. Теоретическая форма НТ и результаты компьютерного моделирования в среде Surface Evolver. (а) Кусочно-непрерывное описание НТ: I/ и /j - катеноидальные крылья. I - длина цилиндрической области, меняющаяся при растяжении/сжатии. Рамкой показана область сшивки, (б) Поверхность с минимальным изгибом и площадью, полученная в среде Surface Evolver; R, =3, R}-1, L -8, a =/, /? =0 01, r =0 1 (в) Отклонение от цилиндрической формы в области сшивки

обеспечивает минимум суммарной энергии натяжения и изгиба, т.к. катеноид -минимальная поверхность с нулевой суммарной кривизной. При этом разрыв в месте сшивки испытывает только вторая производная, хотя при этом скачком меняется и средняя кривизна поверхности. Тем не менее, правомочность такого описания была подтверждена компьютерным моделированием с использованием среды Surface Evolver. Отклонение от кусочно-непрерывной формы заключалось в незначительном прогибе поверхности в точке сшивки катеноида с цилиндром. Похожая форма с прогибом была также получена численно в работе [Powers et al., 2001].

Преимуществом данного аналитического кусочно-непрерывного описания является возможность легко находить критическую длину 1К для НТ: !к = /,+/; = г *{arccosh(R,/r)+arccosh(R}/r)}. Из этой формулы видно, что 1К имеет

близкую к логарифмической зависимость от отношения (R/r) и, следовательно, даже для больших и по сравнению с г, критическая длина 1К будет порядка г. Это также объясняет, почему после коллапса МТ не возможно визуально разрешить форму мембраны в области, где цилиндрическая часть НТ сшивается с плоской мембраной, так как длина переходной области тоже ~ г.

В связи с наноскопическими размерами НТ использование микроскопии было затруднено, и большинство данных было получено из электрических измерений. Так, было подтверждено предположение о цилиндрической форме НТ. При вариадиях длины НТ проводимость менялась обратно пропорционально длине, т.е. сохранялось удельное сопротивление на единицу длины и, следовательно, радиус НТ был постоянен. Также были зарегистрированы случаи деления (разрыва) НТ, вызванные механическим воздействием (например, резким увеличением длины). При этом проводимость НТ скачком падала до нуля.

Для разных липидных составов были получены экспериментальные оценки радиуса полости НТ. Для этого строилась линейная зависимость G от 1/L и из наклона прямой (к) по формуле г=(кр/п)и: находился радиус полости. Для мембран с известными механическими параметрами, радиус полости совпадал с расчетными значениями равновесного радиуса НТ, r=(ß/a)"\ с точностью до толщины бислоя (4нм). Для мембран с неизвестным модулем изгиба данная методика поззоляла его определять.

Вистабильность ТС - бифуркационные переходы МТ-НТ С использованием катеноидального описания МТ и кусочно-непрерывного описания для НТ были построены диаграммы, объясняющие энергетическую выгоду переходов МТ-НТ (Рис.4). Так, при приближении длины МТ к критической, энергия МТ становится больше энергии НТ с той же длиной. Однако, переход не происходит, так как МТ все еще является локальным минимумом. И только при достижении критической длины LK происходит бифуркационный переход МТ в НТ. Аналогично, при уменьшении длины энергия НТ постепенно начинает превышать энергию МТ с такой же длиной, и в области L~lK переход НТ в МТ становится выгоден. Так как основным параметром, меняющимся при переходе МТ-НТ, является радиус, то его можно выбрать в качестве обобщенной координаты процесса. Для построения профилей энергии системы МТ-НТ было использовано семейство гиперболических косинусов: yi(x)=ai*cosh(x/bJ. Для выбранных длин L от 0 до LK находилась последовательность у,(х) с параметром а„ принимающим

13

значение от 0 до Л, и рассчитывалась их энергия по формуле №= |(сг+ /?(С, +С1):)а5, На рис.4б представлены найденные профили энергии,

описывающие переходы МТ-НТ при длинах от 0.21а- до Ьк-

Видно, что в системе существует два минимума, соответствующих состояниям НТ (Рис.46, а=(/3/о)1/2) и МТ (Рис.4б, а=ау). Для перехода из одного состояния в другое необходимо преодолеть барьер, определяемый энергией неустойчивого катеноида (Рис.4б, а=ан). Однако, при приближении длины к Ьк соответствующий МТ минимум становится более пологим и в точке Ьк совсем исчезает; при этом происходит безбарьерный переход в НТ. Аналогично, при уменьшении Ь барьер, препятствующий переходу НТ-МТ, постепенно уменьшается, и при значениях Ь~1К НТ переходит в МТ. Таким образом, представленное описание энергетики ТС полностью описывает наблюдаемую бистабильность и бифуркационные переходы МТ-НТ.

а б

ии а Ж

Рис.4. Энергетика ТС при переходах МТ-НТ (а) Теоретические зависимости энергии МТ и НТ от длины. 1 - энергия устойчивого катеноида (МТ); 2 - энергия неустойчивого катеноида; 3 - энергия квазицилиндрической НТ; энергия нормирована на энергию двух плоских мембран (б) Зависимость энергии ТС от радиуса (а). Параметры ТС: Я «=/; а =1; Р -10"1; а/ - положение устойчивого катеноида • минимум, соответствующий МТ, а=(р/о),/3 - минимум, соответствующий НТ; аИ - положение неустойчивого катеноида, определяет энергетический барьер перехода МТ-НТ. Стрелками показаны переходы МТ-НТ.

Изменение проводимости ТС при переходе МТ-НТ

Отдельная серия экспериментов была посвящена регистрации изменения проводимости в процессе перехода МТ-НТ. Так как поперечные размеры структур существенно отличались: МТ (Л от 1 до 100 мкм) и НТ (г = ф/о)ш, от 10 до ЮОнм), то в процессе перехода проводимость менялась на 2-4 порядка (Рис.5).

Рис.5. Изменение проницаемости ТС при переходах МТ-НТ. Для ТС. сформированной из ДФФХ, проводимость (й) менялась на 4 порядка: 400нСм в состоянии МТ; 40пСм в состоянии НТ. Л/ "!мкм: Л; -50мкм; г -Юнм; £-£*■ -5мкм.

Таким образом, мембранная тубулярная структура в окрестности критических точек (1ц и Ьк) может при незначительных вариациях длины переключаться между двумя состояниями с отличающейся на порядки проницаемостью. При этом критический переход можно вызвать не только вариацией длины, но и изменением граничных условий (Я/ и или приложением трансмембранного давления. В работе МеНкуап е1 а1., 1984 для симметричной МТ была получена следующая формула для критического давления:

В принципе, если условия на границе ТС (Д/ и не сильно отличаются от ф/а)"2, то возможен практически плавный переход из МТ в НТ без изменения проницаемости. Так при достижении Ьк дальнейшее удлинение ТС будет происходить за счет роста центральной цилиндрической части с радиусом ф/о)м, а на краях будут сохраняться катеноидапьяые крылья, совпадающие с «половинками» исходного катеноида МТ.

В процессе перехода МТ-НТ одновременно с проводимостью самой тубулярной структуры измерялась также и трансмембранная проводимость. Было показано, что при переходе МТ=>НТ и НТ=>МТ связность мембраны сохраняется и, более того, не возникает даже короткоживущих проводящих дефектов. Характерно, что в случаях индуцированной механической дестабилизации МТ или НТ, не приводящей к переходу в другое состояние, проводящие дефекты возникали, а иногда даже приводили к полному разрыву БЛМ.

ТС при эндоцитозе (мембранные перешейки)

При формировании эндоцитозной везикулы тоже возникают мембранные ТС, т.н. мембранные перешейки (МП), связывающие везикулярную мембрану с плазматической. Процесс высвобождения везикулы заканчивается делением МП. Для исследования этого процесса был адаптирован метод измерения адмиттанса, разработанный для изучения процессов экзоцитоза секреторных гранул [ЬоШке е1 а1.,1995].

Смт=400нСм

Сцт=40пСм

МТ

"v.

НТ

На мембране клеточной линии макрофагов IC-21 пэтч-пипеткой выделялся фрагмент 2-5мкм2, на котором далее измерялись сверхмалые изменения адмитганса (~пСм). Эндоцитоз стимулировался добавлением в пипетку ЮОнм полистиреновых микросфер. Ранее нами совместно с лабораторией клеточной и молекулярной биофизики (LCMB, National Institutes of Health, США) с помощью электронной и конфокальной микроскопии было показано, что клетки IC-21 активно поглощают данные микросферы.

При формировании везикулы на стадии, когда возникает МП, емкость, связанная с мембраной везикулы, отделена от емкости мембранного фрагмента дополнительным сопротивлением доступа, обратным проводимости МП. Поэтому можно использовать следующую эквивалентную электрическую схему (Рис.ба), из которой следует, что при отщеплении везикулы с емкостью Св проводимость МП равна: GMn-(Re2+Im2)/Re, a CB=(Re2+lm2)/(Im*со), где Re и 1т изменения мнимой и действительной части адмитганса, со - частота синусоиды прикладываемого напряжения. В приближении, что форма везикулы близка к сферической, можно оценить диаметр отщепляемых везикул по формуле: DB=(C^KCy^l/2, где с>й=10фФ/мкм2 - удельная емкость мембраны. На Рис.6 представлена запись Re и 1т каналов, отражающая отщепление везикулы и соответствующее изменение проводимости МП.

Im

2фф 1№Ц|

Р. ^ 200пСм

2с

Рис.6. Регистрация проводимости МП в процессе отщепления везикулы методом адмиттанса (а) Эквивалентная схема; Сш - проводимость МП, Св - емкость везикулы, (б) Изменения мнимой (1т) и действительной (Яе) части адмиттанса при делении МП. (в) Соответствующее изменение проводимости МП, пересчитанное из изменений адмиттанса

Из полученных регистрации были найдены статистические распределения емкости (диаметра) везикул и времени деления МП* (Рис.7). Большинство везикул имели характерный размер (диаметр) ~100-200 нм, и соответственно емкость ~ 1-1.5№. Такие размеры являются типичными для клатрин-зависимого эндоцитоза, при котором форма и размер везикулы определяются клатриновой оболочкой. То, что макрофаги поглощают небольшие частицы клатрин-зависимым эндоцитозом, предполагалось в ряде

работ. Однако, кинетика поглощения и динамика проводимости МП в процессе отделения эндоцитозных везикул у макрофагов исследована впервые.

Было также зарегистрировано отщепление везикул и большего размера, от 200 до 500нм в диаметре, которое не может быть отнесено к клатрин-зависимому эндоцитозу, поскольку максимальный размер клатриновой везикулы 200нм. На электронных микрофотографиях, сделанных совместно с лабораторией ЬСМВ, были также обнаружены везикулы от 100 до бООнм, причем если мелкие везикулы содержали по одной микросфере, то в больших везикулах их количество достигало 10-15 микросфер. Известно, что большие везикулы (до Змкм) могут формироваться в процессах фагоцитоза и макропиноцитоза. Однако то, что частицы размером 1 ООнм могут индуцировать формирование больших везикул, показано впервые.

а б

Дпаметр везикулы, мкм 0Л 0Л 0.4 0.5

1 2 3 4 5 6

Емкость вмпкулы, фЗ>

о 2

с 2 к

5 X

<1) С

а

к 2 4>

а а

600

Дняметр везикулы, мкм 0.2 0.3 0.4

0.5

400-

200

й

и 1н

1 2 3 4 5 1 Емкость везикулы, фф

Рис.7. Статистика одиночных событий зндоцитоза. (а) Распределение везикул по размеру, диаметр пересчитывапся из изменения емкости, (б) Зависимость времени деления (х) МП от размера везикулы; каждая точка отвечает среднему значению пяти и более измерений; отрезками показано среднеквадратичное отклонение.

Удивительным является тот факт, что кинетика деления МП для больших везикул (Ов >200нм) статистически не отличается от кинетики для малых клатриновых везикул (£>я<200нм, Рис.7б). Считается, что формирование фагоцитозной везикулы является более многостадийным и сложным процессом, чем обыкновенный эндоцитоз. Однако в последнее время были получены свидетельства, что в фагоцитозе также участвует белок динамин, который опосредует деление МП в клатрин-зависимом эндоцитозе. Наши данные показывают, что финальная стадия фагоцитоза - деление МП протекает феноменологически сходно с эндоцитозом. Это позволяют предположить, что

белковые комплексы и механизм их работы при делении МП для фагоцитоза и эндоцитоза являются одинаковыми.

Впервые при стимулированном эндоцитозе были обнаружены обратимые скачки проводимости МП, не приводящие к отделению везикулы (Рис.8). Подобные спонтанные события были зарегистрированы при изучении экзоцитоза, однако связать это напрямую с эндоцитозом было невозможно. Данные скачки могут быть связаны с изменениями формы МП аналогично переходам МТ-НТ. Так небольшие вариации длины или изменения условий на границе МП могут переключать его структуру между двумя состояниями с разной проводимостью. В случае МП граничные условия могут задаваться с одной стороны белковой оболочкой (клатриновым каркасом), а с другой стороны параметрами актинового цитоскелета. Известно, что цитоскелет формирует на плазматической мембране небольшие ячейки, в пределах которых мембрана относительно свободна. То, что мембрана при эндоцитозе натянута между границами цитоскелетной ячейки и белковым каркасом везикулы определяет также возникновение локального натяжения, которое существенно выше среднего натяжения на клеточной мембране. Таким образом, форма и поведение МП может также определяться локальным натяжением и изгибом мембраны, однако с учетом возмущений, вносимых белками, опосредующими процесс.

Рис.8. Обратимые изменения проводимости МП. (а) Серия быстрых скачков проводимости МП между стабильными уровнями 1 и 2; серия заканчивается более медленным делением МП - отрывом везикулы, (б) Схема обратимого изменения проводимости МП без отрыва везикулы

имеет меньший разброс (<г>=6±2мс, N=100) по сравнению с длительностью необратимого скачка (<г>=140±100мс, N=310). Это позволяет предположить, что обратимые скачки и необратимое деление имеют разную природу. Нами было выдвинуто предположение, что обратимые скачки определяются

а

б

Характерно, что длительность г обратимого скачка гораздо меньше и

механическими свойствами мембраны (локальным натяжением и изгибной жесткостью). Скачки проводимости МП, аналогичные переходам МТ-НТ, обусловленные исключительно механикой мембраны, должны совершаться очень быстро (~мс). Полноценное деление МП, приводящее к отщеплению везикулы, является более сложным и многостадийным процессом, опосредуемым совместной работой целого комплекса белков и, соответственно, протекает медленнее и с большой вариабельностью.

в наших экспериментах частота обратимых событий увеличивалась с понижением температуры с 37 °С до 25°С. Известно, что при понижении температуры до 25°С эндоцитоз сильно ингибируется. По-видимому, это связано с нарушением работоспособности белковой машины и, в частности, динамина. Также известно, что после гидролиза ГТФ динамин быстро десорбируется с мембраны. При этом, если деления МП не произошло, то в течении некоторого времени (до сорбции нового динамина) МП может свободно менять свою форму и совершать переходы, аналогичные МТ-НТ. Все это подтверждает предположение о том, что обратимые изменения проницаемости МП обусловлены именно механическими свойствами мембраны, а не работой белков.

ТС при экзоиитозе и транспорт мембранных белков

Следующая часть работы посвящена изучению слияния GSV-везикул,

содержащих мембранный белок GLUT4 (glucose transporter-4), и выяснению

роли ТС при высвобождении и транспорте этого белка в плазматическую

мембрану.

Адипозные клетки считаются основным регулятором содержания глюкозы в организме и нарушение в их работе приводят к нарушению обмена веществ, ожирению и диабетам. Эти клетки под регуляцией инсулина могут, как запасать глюкозу, так и высвобождать ее посредством ускоренного трансмембранного транспорта, осуществляемого с помощью GLUT4. На уровне клетки транспорт глюкозы регулируется изменением концентрации GLUT4 в плазматической мембране. При стимуляции инсулином специальные везикулы, содержащие GLUT4 (GSV - "GLUT4 storage vesicles") сливаются с плазматической мембраной и количество активного GLUT4 может увеличиваться в десятки раз. В отсутствии инсулина идет обратный процесс: GLUT4 быстро удаляется из мембраны посредством эндоцитоза и после сортировки опять попадает в GSV.

В рамках совместного проекта с лабораторией экспериментальной диабетологии (NIDDK, National Institutes of Health, США) нам поставлялись адипозные клетки, экспрессирующие флуоресцентный белок GLUT4-GFP. Нами была собрана установка, позволяющая регистрировать слияние отдельных GLUT4-GFP везикул с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием метода нПВО (нарушенного полного внутреннего отражения).

Было обнаружено, что GSV-везикулы в нестимулированных клетках быстро (1-2мкм/с) циркулируют по тубулиновым микротрубочкам вблизи плазматической мембраны (200-400нм), динамически покрывая всю поверхность клетки. Это расходится с предыдущими представлениями, предполагавшими, что GSV являются статичным хранилищем GLUT4. Более того, считалось, что действие инсулина заключается именно в инициировании движения GSV к мембране для осуществления последующего слияния. Нами же было показано, что инсулин, напротив, тормозит движущиеся GSV и останавливает их в местах, где затем происходит слияние. Для объяснения такого поведения нами была разработана кинетическая модель, хорошо описывающая экспериментальные данные. В основе' модели лежало предположение, что инсулин увеличивает вероятность обратимого связывания GSV с мембраной, а само слияние носит вероятностный характер - чем дольше везикула связана с мембраной, тем выше вероятность слияния.

Далее нами было показано, что при стимуляции инсулином наблюдается своеобразная кластеризация GSV. Был проведен корреляционный анализ расстояния между отдельными GSV, и были получены количественные критерии кластеризации, а также оценен характерный размер кластера, ~ 5мкм. Места образования кластеров GSV могут определяться как особенностями тубулиновой сети микротрубочек, так и позиционированием белковых комплексов на мембране, участвующих в связывании GSV везикул (т.н. tethering).

Более того, именно в кластерах, где накапливались GSV, наблюдалось их слияние. Слияние одиночных GSV регистрировалось по изменению флуоресцентного изображения везикул (ФИВ). По мере высвобождения GLUT4 из везикулы происходит расширение профиля ФИВ. На Рис.9 показаны, кадры слияния GSV, под каждым кадром приведен радиальный профиль ФИВ и его аппроксимация функцией Гаусса. Из-за дифракции GSV с характерным размером 40нм имело ФИВ ~ 1мкм, поэтому слияние детектировалось только тогда, когда GLUT4 диффундировал за пределы 1мкм. Для каждой везикулы

строились зависимости спада сигнала флуоресценции 1В(0 в зоне ФИВ (1мкм) и ширины радиального профиля а2(0, определяемого из функции Гаусса.

б

М0 от5, мкм2

О 10 20 30 Время, с

Рис.9. Кинетика слияния одиночных GLUT4 везикул, (а) Регистрация слияния везикулы, содержащей флуоресцентно меченый белок GLUT4-GFP. Под каждым кадром приведен радиальный профиль сигнала флуоресценции и аппроксимирующая функция Гаусса (б) Зависимость ширины радиального профиля o*(t) и интенсивности флуоресценции везикулы 1в(1) от времени; а находилась из функции Гаусса; It(t) нормировалась на интенсивность до слияния 1о и аппроксимировалась экспоненциальной зависимостью exp(-lfx).

Была впервые зарегистрирована кинетика слияния одиночных GSV и показано, что GLUT4 высвобождается в мембрану необычно медленно (Рис. 10). Время слияния определялось из экспоненциальной аппроксимации IB(t), как время уменьшения флуоресценции в зоне ФИВ в е раз (г). На рис.106 представлена гистограмма, характеризующая распределение г. Большинство везикул высвобождают GLUT4 за времена ~20 сек. Такая кинетика высвобождения содержимого везикулы является необычно медленной для экзоцитоза. Аналогичные процессы в случае слияния секреторных гранул происходят за десятки миллисекунд. Коэффициент диффузии GLUT4 в плазматической мембране был определен в экспериментах по восстановлению флуоресценции после фотоповреждения (метод FRAP, Рис. 10а): ДрО.14 мкм2/с. Интересно, что мембранные белки с близким коэффициентом диффузии высвобождаются при слиянии гораздо быстрее. На основании этого можно предположить, что лимитирующей стадией является диффузия GLUT4 через МП.

Для одиночных GSV коэффициент диффузии D оценивался двумя способами. В случае однородной диффузии o*(t) меняется линейно со временем и наклон равен A*D. Однако o*(t) был линеен только для быстро сливающихся везикул (t~l-2 сек), чему соответствовал D~0.1mkmj/c, близкий к коэффициенту

диффузии в плазматической мембране. Однако, для большинства СБУ, сливающихся медленно (<г>=20±12сек, N=51), (?(0 вел себя нелинейно.

а

б

в

1Л0, %

80

60

40

20

с

2

4

6

8

Диффузия в мембране То(1мкм) ~1с

Время, мин х•с

Рис.10. Диффузия GLUT4 белка в плазматической мембране и через МП. (а) Кривая восстановления флуоресценции после фотоповреждения в области с радиусом R=10mkm; Измеренный коэффициент диффузии GLUT4 в мембране равен Do=0.14mkm2/c. Время диффузии на 1мкм - го~1с. (б) Гистограмма времени диффузии через МП; г получены из кривых уменьшения флуоресценции везикул h(t), см. Рис.9, (в) Двух стадийный механизм переноса GLUT4 из везикулы в мембрану. Медленная стадия • диффузия через МП (х~20с); быстрая ¿тадия - диффузия в мембране (то~1с). Блоками показан белок GLUT4.

Было предположено, что в случае медленного слияния формируется т.н. долгоживущий МП, замедляющий высвобождение GLUT4. Интересно, что ранее на электронных микрофотографиях адипозных клеток не раз наблюдались везикулы, связанные с плазматической мембраной тонкими перешейками. Однако их никогда не относили к слиянию GSV. С чем связано замедление диффузии через МП, остается не понятным. Большая кривизна МП может затруднять выход GLUT4; кроме того, стерически препятствовать переносу больших молекул через МП могут белки, опосредующие слияние. Возможно, такая особенность МП используется клеткой для тонкой регуляции процесса встраивания GLUT4 в плазматическую мембрану. Более того, такой механизм встраивания позволяет, не рассеивая GLUT4 по мембране, делать его доступным для глюкозы, т.к. глюкоза может легко проникать внутрь сливающейся везикулы через МП даже нанометрового размера. Удерживание GLUT4 в везикулярной мембране может быть выгодно с точки зрения последующего эндоцитоза. Так, при необходимости резко сократить транспорт глюкозы, не надо собирать GLUT4, рассеянный по всей мембране, а достаточно отделить не полностью слившиеся везикулы.

Работа была поддержана грантами РФФИ № 03-04-48912, № 04-04-49444 и программой «Civil Research Development Foundation» CRDF RBO-1297MO-Q3.

выводы

1. Разработана экспериментальная система, с помощью которой изучены механические и транспортные свойства тубулярных структур из бислойной липидной мембраны. Система позволяет менять характерные размеры ТС (длину и радиус) от 1 до ЮОмкм и проводить электрические измерения проводимости ТС одновременно с флуоресцентной микроскопией.

2. Показано, что при длинах меньше 1К, ТС имеет форму мембранной трубки (МТ), описываемую несимметричным катеноидом: у(х)=а%созк[(х-Ь)/а]. Установлено, что форма МТ и ее критическая длина {Ьк) не зависят от липидного состава и целиком определяются граничными условиями. Для произвольных граничных условий получены формы МТ и вычислены I*.

3. Обнаружено, что при длинах ТС больше происходит критический переход из МТ в нанотрубку (НТ) с диаметром порядка десятка нанометров. Показано, что НТ стабильна при удлинении, но теряет устойчивость при малых длинах г*агссо$к(И/г'), где Я - граничный радиус, г - радиус НТ. Показано, что радиус НТ не зависит от граничных условий и определяется механическими свойствами мембраны: г-ф/а)т, где а - натяжение, /? - изгибная жесткость. Это позволяет, меняя механические свойства мембран, получать стабильные нанотрубки с радиусом от 10 до ЮОнм. Для липидных составов с неизвестными свойствами данная методика позволяет определять их механические параметры (а, /?).

4. Впервые описана бистабильность ТС - обратимые переходы МТ-НТ. Измерена проницаемость модельной ТС и показано, что в процессе перехода МТ-НТ она меняется на 2-4 порядка. Предложено теоретическое описание, объясняющее переходы МТ-НТ и позволяющее находить критические параметры (£* и /*) для произвольных условий.

5. На клеточной линии макрофагов 1С-21 зарегистрирована кинетика деления ТС (МП) при отщеплении везикулы. Впервые показано, что кинетика и время деления МП (т~200мс) не зависят от размера везикулы в диапазоне 100-500нм. Было высказано предположение, что как при эндоцитозе (0<200нм), так и при фагоцитозе (Б>200нм) деление МП осуществляется по одному и тому же механизму (предположительно, белком динамином).

7. Обнаружены обратимые изменения проницаемости МП в процессе эндоцитоза, не приводящие к отщеплению везикулы. Показано, что обратимые переходы гораздо быстрее (т~бмс), чем деление МП (т~200мс). Было высказано предположение, что обратимые изменения проницаемости МП обусловлены бистабильностью ТС и аналогичны переходам МТ-НТ.

8. На адипозных (жировых) клетках описана кинетика инсулин-зависимого слияния ОБУ-везикул, содержащих мембранный белок-переносчик глюкозы вЬиТ4. Показано, что формирование в процессе слияния долгоживущих ТС (МП) замедляет латеральную диффузию СШГ4 в плазматическую мембрану на один-два порядка.

2006-4

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

16507

Lizunov VA, Matsumoto Н, Zimmerberg J, Cushman SW, Frolov VA. Insulin stimulates the halting, tethering, and fusion of mobile GLUT4 ves|clejJrnrat adipose cells. J Cell Biol. 2005 May 9; 169(3): ' g / 7 J

Dubois M, Lizunov V, Meister A, Gulik-Krzywicki T, Verbavatz JM, Perez E, Zimmerberg J, Zemb T. Shape control through molecular segregation in surfactant aggregates. Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Oct 19;101(42):15082-15087.

Frolov VA, Lizunov VA, Dunina-Barkovskaya AY, Samsonov AV, Zimmerberg J. Shape bistability of a membrane neck: a toggle switch to control vesicle content release. Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Jul 22;100(15):8698-8703.

A.Я. Дунина-Барковская, Д.В. Карпунин, B.A. Лизунов, B.A. Фролов. Макрофаги линии IC-21 как модель для изучения электрофизиологии эндоцитоза. Биол. мембраны, 2003, т.20, №4, с.322-332.

Lizunov V.A., Samsonov A.V., Frolov V.A. "Reversible stage of the fission of lipid neck under tension". Biophys. J. Annual Meeting Abstracts, Feb 2001, 80(1):523.

B.A. Фролов, B.A. Лизунов, A.B. Самсонов, "Исследование процесса деления мембранной трубки". Тезисы школы конференции "Горизонты физико-химической биологии", Пущино, 2000, с. 17.

В.А. Лизунов, В.А.Фролов, А.В.Самсонов "Исследование процесса деления мембранной трубки". Тезисы докладов XLII конференции МФТИ, 2000, с.50.

ЛИЗУНОВ ВЛАДИМИР АНАТОЛЬЕВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕМБРАННЫХ ТУБУЛЯРНЫХ СТРУКТУР В МОДЕЛЬНЫХ И КЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМАХ

Автореферат

Подписано в печать 21.04.05.Формат 60*90. Печать офсетная.Усл.печать.л.1.2 тираж 70 экз.

Московский физико-технический институт

(государственный университет). 141700, г.Долгопрудиый, Институтский пер.9.

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Лизунов, Владимир Анатольевич

Список используемых сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

§1.1. Квазицилиндрические поверхности

§ 1.2. Мембранные тубулярные структуры в биологических системах

§ 1.3. Эндоцитоз

§ 1.4. Экзоцитоз в адипозных (жировых) клетках

§ 1.5. Транспортные свойства тубулярных структур

§ 1.6. Модельные системы для исследования тубулярных структур

§ 1.7. Тубулярные структуры из БЛМ (мембранная трубка)

§ 1.8. Энергетика и механизмы формирования клеточных тубулярных структур

Глава 2. Материалы и методы

§ 2.1. Реактивы

§ 2.2. Формирование бислойных липидных мембран

§ 2.3. Липидный состав мембран '

§ 2.4. Формирование мембранной трубки/нанотрубки из БЛМ

§ 2.5. Флуоресцентная видеомикроскопия МТ и НТ

§ 2.6. Флуоресцентная видеомикроскопия переноса микрообъектов через НТ

§ 2.7. Измерение электрической проводимости МТ и НТ

§ 2.8. Измерение электрической проводимости мембраны МТ/НТ

§ 2.9. Численное нахождение формы, энергии и критических параметров МТ

§2.10. Сопоставление формы МТ с катеноидом

§ 2.11. Определение радиуса, энергии и критических параметров НТ

§ 2.12. Компьютерное моделирование формы МТ/НТ в среде Surface

Evolver

§ 2.13. Клетки IC-21 - мышиные макрофаги

§ 2.14. Эндоцитоз флуоресцентных микросфер из микропипетки

§ 2.15. Измерение адмитанса мембранного фрагмента

§2.16. Адипозные (жировые) клетки

§2.17. Конфокальная микроскопия адипозных клеток

§2.18. Метод нарушенного полного внутреннего отражения (нПВО)

§ 2.19. Обработка и анализ изображений

Глава 3. Результаты и обсуждение

§ 3.1. Изменение формы МТ при растяжении и коллапсе

§ 3.2. Проводимость МТ

§ 3.3. Описание МТ моделью несимметричного катеноида

§ 3.4. Квазицилиндрическая мембранная нанотрубка

§ 3.5. Проводимость НТ

§ 3.6. Кусочно-непрерывное описание формы НТ

§ 3.7. Изменение проводимости ТС при переходе МТ-НТ

§ 3.8. Бистабильность ТС - бифуркационные переходы МТ-НТ

§ 3.9. ТС при эндоцитозе (мембранные перешейки)

§ 3.10. ТС при экзоцитозе GLUT4 содержащих везикул

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование мембранных тубулярных структур в модельных и клеточных системах"

Мембранные тубулярные структуры (ТС) широко распространены в биологических системах. Микротрубочки, стенки которых образованы фосфолипидной мембраной, встречаются в строении множества внутриклеточных органелл, являются основой таких структур, как клеточные отростки, подии и др. [23,29,35,48,54]. Более того ТС выполняют важные транспортные функции по обмену веществ между внутриклеточными компартментами, участвуют в процессах деления и слияния мембран и, предположительно, играют важную роль в таких процессах как эндо- и экзоцитоз [3,12,18,35,38]. Поэтому исследование механических и транспортных свойств мембранных тубулярных структур является одной из приоритетных задач биофизики мембран. ч

В настоящее время активно изучается проблема создания искусственных сетей из тубулярных мембран (tubular membrane networks). Для создания биореакторов и моделирования клеточных биохимических процессов необходима разработка методов формирования систем взаимосвязанных компартментов [27,43]. Однако до сих пор остаются малоисследованными свойства простейших мембранных трубочек. Не исследованы их структурные перестройки, транспортные свойства, проницаемость для различных веществ, и не выяснена роль липидного бислоя во всех этих процессах [29,53].

Исследования мембранных тубулярных структур, существующих в клетках, существенно затруднены многокомпонентностью и сложностью системы, присутствием огромного количества белков и других веществ, активно взаимодействующих с мембраной. Поэтому приоритетным направлением является создание модельных систем, позволяющих исследовать мембранные ТС в отсутствии клеточных факторов.

Существующие на данный момент методики формирования мембранных трубочек обладают существенными ограничениями и недостатками. Так модельные системы, основанные на липосомах, ограничены использованием растворов с очень малой ионной силой [43,76]. Искусственные гигантские липосомы оказываются не стабильными при физиологических условиях и, следовательно, не позволяют изучать взаимодействия мембраны с клеточными белками. Мембранные тубулярные структуры, выделяемые из клеток, содержат большое количество примесей и обладают неконтролируемым липидным составом. Более того, все известные на данный момент модельные системы не позволяют напрямую исследовать их транспортные свойства, измерять проницаемость и исследовать влияние механических свойств липидного матрикса на свойства ТС.

В данной работе было проведено исследование мембранных тубулярных структур в модельных и клеточных системах. В модельной системе была разработана оригинальная методика формирования ТС из БЛМ, позволяющая воспроизводимо формировать как микроскопические мембранные трубки (МТ), так и нанотрубки (НТ) с радиусом до нескольких нанометров. Сочетание электрических измерений с флуоресцентной видеомикроскопией позволяло регистрировать форму МТ и одновременно исследовать динамику проводимости в процессе коллапса и перехода в НТ.

На клеточной системе были осуществлены исследования ТС, формируемых при эндо- и экзоцитозе (т.н. мембранных перешейков - МП). На линии перитонеальных макрофагов IC21 была исследована динамика проницаемости МП в процессе эндоцитоза, и, в частности, при фагоцитозе полистереновых микросфер. Регистрация событий эндоцитоза осуществлялась на малых участках клеточных мембран в условиях регистрации тока в режиме фиксации потенциалов (метод patch-clamp, конфигурация cell-attached) [36,75] в сочетании с техникой определения адмитганса [56,58,75]. На адипозных (жировых) клетках была исследована латеральная проницаемость МП, формируемых при слиянии специальных везикул, содержащих мембранный белок GLUT4 [9,87]. Была использована флуоресцентная микроскопия в сочетании с методикой нарушенного полного внутреннего отражения [2,100].

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Лизунов, Владимир Анатольевич

Основные результаты и выводы

1. Разработана экспериментальная модельная система, с помощью которой изучены механические и транспортные свойства тубулярных структур из бислойной липидной мембраны.

2. Исследовано критическое поведение несимметричной мембранной трубки из БЛМ различного липидного состава. Показано, что форма и критические параметры (Ьц) зависят исключительно от граничных условий и определяются из уравнения несимметричного катеноида: у(х) =а *cosh[(х -Ь)/а].

3. Показана возможность формирования квазицилиндрической мембранной нанотрубки в модельной системе. Показано, что НТ стабильна при удлинении, однако теряет устойчивость при малых критических длинах 1к-Равновесный радиус НТ определяется механическими свойствами мембраны: натяжением и изгибной жесткостью: г=ф/а)ш. Это позволяет, меняя механические свойства мембран, получать стабильные нанотрубки с заданным радиусом от 10 до ЮОнм. Для липидных составов с неизвестными свойствами данная методика позволяет определять их механические параметры (сг, /?).

4. Впервые обнаружено и описано бистабильное поведение ТС. Показано, что проницаемость модельной ТС в процессе перехода МТ-НТ может меняться на 2-4 порядка, при этом сохраняется целостность мембраны и не возникает проводящих дефектов. Предложено теоретическое описание, объясняющее бифуркационные переходы МТ-НТ и позволяющее находить критически параметры (LK и 1к) для произвольных условий. 5. Исследованы свойства мембранных перешейков (МП), возникающих в процессе эндо- и фагоцитоза, на клеточной линии макрофагов IC-21. Получена кинетика деления МП при отщеплении везикулы и показано, что время деления МП не зависит от размера везикул в диапазоне 100-500нм. Это позволяет предположить существование единого механизма деления МП для процессов эндо- и фагоцитоза.

7. Обнаружены обратимые изменения проницаемости МП в процессе эндоцитоза, не приводящие к отделению везикулы. Показано, что обратимые переходы осуществляются гораздо быстрее, чем полноценное деление МП. На основании этого было предположено, что обратимые изменения проницаемости МП, аналогичны переходам МТ-НТ и обусловлены механическими свойствами мембраны.

8. Исследована кинетика встраивания мембранного белка-переносчика глюкозы GLUT4 в мембрану адипозных клеток при инсулин-стимулированном слиянии GLUT4 везикул. Показано, что формирование долгоживущих МП в процессе слияния замедляет диффузию GLUT4 в ф плазматическую мембрану на один-два порядка.

102

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Лизунов, Владимир Анатольевич, Москва

1. Adamson A.W. Physical Chemistry of Surfaces. Wiley, New York, 1996.

2. Allersma M.W., Wang L., Axelrod D., Holz R.W. Visualization of regulated exocytosis with a granule-membrane probe using total internal reflection microscopy. MolBiol Cell, 2004, v. 15, p.4658-68.

3. Alvarez de Toledo G., Fernandez-Chacon R., Fernandez J.M. Release of secretory products during transient vesicle fusion. Nature, 1993, v.363, p.554-8.

4. Bar-Ziv R., Moses E. Instability and "pearling" states produced in tubular membranes by competition of curvature and tension. Physical Review Letters, 1994, v.73, p.1392-1395.

5. Bozic В., Svetina S., Zeks B. Theoretical analysis of the formation of membrane microtubes on axially strained vesicles. Physical Review E, 1997, v.55, p.5834-5842.

6. Braga J., Desterro J.M., Carmo-Fonseca M. Intracellular macromolecular mobility measured by fluorescence recovery after photobleaching with confocal laser scanning microscopes. Mol Biol Cell, 2004, v. 15, p.4749-60.

7. Brakke K.A. The surface evolver and the stability of liquid surfaces. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series a-Mathematical Physical and Engineering Sciences, 1996, v.354, p.2143-2157.

8. Brakke K.A., Morgan F. Instabilities of cylindrical bubble clusters. European Physical Journal E, 2002, v.9, p.453-460.

9. Bryant N.J., Go vers R., James D.E. Regulated transport of the glucose transporter GLUT4. Nat Rev Mol Cell Biol, 2002, v.3, p.267-77.

10. Chen Y.J., Steen P.H. Dynamics of inviscid capillary breakup: Collapse and pinchofF of a film bridge. Journal of Fluid Mechanics, 1997, v.341, p.245-267.

11. Chernomordik L.V. Fusion of semispherical membranes. Methods Enzymol, 1993, v.220, p. 100-11.

12. Cho S.J., Quinn A.S., Stromer M.H., Dash S., Cho J., Taatjes D.J., Jena B.P. Structure and dynamics of the fusion pore in live cells. Cell Biol Int, 2002, v.26, p.35-42.

13. Cryer S.A., Steen P.H. Collapse of the Soap-Film Bridge Quasi-Static Description. Journal of Colloid and Interface Science, 1992, v. 154, p.276-288.

14. Curran M.J., Cohen F.S., Chandler D.E., Munson P.J., Zimmerberg J. Exocytotic fusion pores exhibit semi-stable states. J Membr Biol, 1993, v.133, p.61-75.

15. Dai J., Ting-Beall H.P., Sheetz M.P. The secretion-coupled endocytosis correlates with membrane tension changes in RBL 2H3 cells. J Gen Physiol, 1997, v.110, p.1-10.

16. Dai J., Sheetz M.P. Membrane tether formation from blebbing cells. Biophys J, 1999, v.77, p.3363-70.

17. Daly C., Sugimori M., Moreira J.E., Ziff E.B., Llinas R. Synaptophysin regulates clathrin-independent endocytosis of synaptic vesicles. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, v.97, p.6120-5.

18. De Camilli P., Takei K., McPherson P.S. The function of dynamin in endocytosis. Curr Opin Neurobiol, 1995, v.5, p.559-65.

19. Debus K., Hartmann J., Kilic G., Lindau M. Influence of conductance changes on patch clamp capacitance measurements using a lock-in amplifier and limitations of the phase tracking technique. Biophys J, 1995, v.69, p.2808-22.

20. Derenyi I., Julicher F., Prost J. Formation and interaction of membrane tubes. Phys Rev Lett, 2002, v.88, p.238101.

21. Dobereiner H.G., Evans E., Kraus M., Seifert U., Wortis M. Mapping vesicle shapes into the phase diagram: A comparison of experiment and theory. Physical Review E, 1997, v.55, p.4458-4474.

22. Domokos G., Szeberenyi I., Steen P.H. Simultaneously resolved bifurcation diagrams: A novel global approach applied to liquid figures of equilibrium. Journal of Computational Physics, 2000, v. 159, p.38-57.

23. Duman J.G., Pathak N.J., Ladinsky M.S., McDonald K.L., Forte J.G. Three-dimensional reconstruction of cytoplasmic membrane networks in parietal cells. J Cell Sci, 2002, v.115, p.1251-8.

24. Eggert J. Nonlinear dynamics and breakup of free-surface flows. Rev. Mod. Phys, 1997, v.69, p.865-929.

25. Elazar Z., Mayer Т., Rothman J.E. Removal of Rab GTP-binding proteins from Golgi membranes by GDP dissociation inhibitor inhibits inter-cisternal transport in the Golgi stacks. J Biol Chem, 1994, v.269, p.794-7.

26. Evans E., Bowman H., Leung A., Needham D., Tirrell D. Biomembrane templates for nanoscale conduits and networks. Science, 1996, v.273, p.933-5.

27. Farge E., Ojcius D.M., Subtil A., Dautry-Varsat A. Enhancement of endocytosis due to aminophospholipid transport across the plasma membrane of living cells. Am J Physiol, 1999, v.276, p.C725-33.

28. Farsad K., Ringstad N., Takei K., Floyd S.R., Rose K., De Camilli P. Generation of high curvature membranes mediated by direct endophilin bilayer interactions. J Cell Biol, 2001, v.155, p.193-200.

29. Farsad K., De Camilli P. Mechanisms of membrane deformation. Curr Opin Cell Biol, 2003, v.15, p.372-81.

30. Fourcade В., Miao L., Rao M., Wortis M., Zia R.K. Scaling analysis of narrow necks in curvature models of fluid lipid-bilayer vesicles. Physical Review. E.

31. Statistical Physics, Plasmas, Fluids, and Related Interdisciplinary Topics, 1994, v.49, p.5276-5286.

32. Frenkel E.J., Kuypers F.A., Op den Kamp J.A., Roelofsen В., Ott P. Effect of membrane cholesterol on dimyristoylphosphatidylcholine-induced vesiculation of human red blood cells. Biochim Biophys Acta, 1986, v.855, p.293-301.

33. Frolov V.A., Cho M.S., Bronk P., Reese T.S., Zimmerberg J. Multiple local contact sites are induced by GPI-linked influenza hemagglutinin during hemifiision and flickering pore formation. Traffic, 2000, v.l, p.622-30.

34. Gandhi S.P., Stevens C.F. Three modes of synaptic vesicular recycling revealed by single-vesicle imaging. Nature, 2003, v.423, p.607-13.

35. Gruenberg J. Lipids in endocytic membrane transport and sorting. Curr Opin Cell Biol, 2003, v. 15, p.382-8.

36. Hamill O.P., Marty A., Neher E., Sakmann В., Sigworth F.J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch, 1981, v.391, p.85-100.

37. Heinrich V., Bozic В., Svetina S., Zeks B. Vesicle deformation by an axial load: from elongated shapes to tethered vesicles. Biophys J, 1999, v.76, p.2056-71.

38. Henkel A.W., Meiri H., Horstmann H., Lindau M., Aimers W. Rhythmic opening and closing of vesicles during constitutive exo- and endocytosis in chromaffin cells. Embo J, 2000, v. 19, p.84-93.

39. Hinshaw J.E. Dynamin and its role in membrane fission. Annu Rev Cell Dev Biol, 2000, v.l6, p.483-519.

40. Hwang W.C., Waugh R.E. Energy of dissociation of lipid bilayer from the membrane skeleton of red blood cells. Biophys J, 1997, v.72, p.2669-78.

41. Ince C., Coremans J.M., Ypey D.L., Leijh P.C., Verveen A.A., van Furth R. Phagocytosis by human macrophages is accompanied by changes in ionic channel currents. J Cell Biol, 1988, v. 106, p. 1873-8.

42. Karlsson M., Sott K., Davidson M., Cans A.S., Linderholm P., Chiu D., Orwar O. Formation of geometrically complex lipid nanotube-vesicle networks of higher-order topologies. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, v.99, p. 11573-8.

43. Kiser P.F., Wilson G., Needham D. A synthetic mimic of the secretory granule for drug delivery. Nature, 1998, v.394, p.459-62.

44. Klein C., Pillot Т., Chambaz J., Drouet B. Determination of plasma membrane fluidity with a fluorescent analogue of sphingomyelin by FRAP measurement using a standard confocal microscope. Brain Res Brain Res Protoc, 2003, v.l 1, p.46-51.

45. Kozlov M.M. Fission of biological membranes: interplay between dynamin and lipids. Traffic, 2001, v.2, p.51-65.

46. Kozlovsky Y., Chernomordik L.V., Kozlov M.M. Lipid intermediates in membrane fusion: formation, structure, and decay of hemifusion diaphragm. Biophys J, 2002, v.83 p.2634-51.

47. Ladinsky M.S., Mastronarde D.N., Mcintosh J.R., Howell K.E., Staehelin L.A. Golgi structure in three dimensions: functional insights from the normal rat kidney cell. J Cell Biol, 1999, v. 144, p. 1135-49.

48. Lamaze C., Fujimoto L.M., Yin H.L., Schmid S.L. The actin cytoskeleton is required for receptor-mediated endocytosis in mammalian cells. J Biol Chem, 1997, v.272, p.20332-5.

49. Lang Т., Wacker I., Wunderlich I., Rohrbach A., Giese G., Soldati Т., Aimers W. Role of actin cortex in the subplasmalemmal transport of secretory granules in PC-12 cells. Biophys J, 2000, v.78, p.2863-77.

50. Либерман Е.А., Ненашев В.А. Изучение взаимодействия искусственных фосфолипидных мембран. Биофизика, 1968 т. 13 №1, с. 193-196.

51. Либерман Е.А., Ненашев В.А. Моделирование взаимодействия клеточных мембран на искусственных фосфолипидных мембранах. Биофизика, 1970 т. 15 №6, с.1014-1020.

52. Lipowsky R. The morphology of lipid membranes. Curr Opin Struct Biol, 1995, v.5, p.531-40.

53. Lipsker D., Ziylan U., McDermott R., Spehner D., Proamer F., Cazenave J.P., Goud В., de la Salle H., Salamero J., Hanau D. Cored tubules are present in human epidermal Langerhans cells. J Invest Dermatol, 2003, v.120, p.407-10.

54. Loerke D., Stuhmer W., Oheim M. Quantifying axial secretory-granule motion with variable-angle evanescent-field excitation. J Neurosci Methods, 2002, v.119, p.65-73.

55. Lollike K., Borregaard N., Lindau M. The exocytotic fusion pore of small granules has a conductance similar to an ion channel. J Cell Biol, 1995, v. 129, p.99-104.

56. Lollike K., Borregaard N., Lindau M. Capacitance flickers and pseudoflickers of small granules, measured in the cell-attached configuration. Biophys J, 1998, v.75, p.53-9.

57. Lollike K., Lindau M. Membrane capacitance techniques to monitor granule exocytosis in neutrophils. J Immunol Methods, 1999, v.232, p.l 11-20.

58. Lowry B.J., Steen P.H. Capillary Surfaces Stability from Families of Equilibria with Application to the Liquid Bridge. Proceedings of the Royal Society of London Series a-Mathematical and Physical Sciences, 1995, v.449, p.411-439.

59. Malide D., Ramm G., Cushman S.W., Slot J.W. Immunoelectron microscopic evidence that GLUT4 translocation explains the stimulation of glucosetransport in isolated rat white adipose cells. J Cell Sci, 2000, v.113 Pt 23, p.4203-10.

60. Marszalek P., Tsong T.Y. Cell fission and formation of mini cell bodies by high frequency alternating electric field. BiophysJ, 1995, v.68, p. 1218-21.

61. Mashl R.J., Bruinsma R.F. Spontaneous-curvature theory of clathrin-coated membranes. BiophysJ, 1998, v.74, p.2862-75.

62. Mauel J., Defendi V. Infection and transformation of mouse peritoneal macrophages by simian virus 40. J Exp Med, 1971, v.134, p.335-50.

63. McMahon H.T., Wigge P., Smith C. Clathrin interacts specifically with amphiphysin and is displaced by dynamin. FEBS Lett, 1997, v.413, p.319-22.

64. Меликян Г.Б., Козлов M.M., Черномордик JI.B., Маркин B.C. Деление бислойной липидной трубки. Доклады Академии Наук СССР, 1984, т.274, с.948-51.

65. Melikov К.С., Frolov V.A., Shcherbakov A., Samsonov A.V., Chizmadzhev Y.A., Chernomordik L.V. Voltage-induced nonconductive pre-pores and metastable single pores in unmodified planar lipid bilayer. Biophys J, 2001, v.80, p. 1829-36.

66. Melikyan G.B., Chernomordik L.V., Kozlov M.M., Markin V.S. Fission of the bilayer lipid tube. Biochim Biophys Acta, 1984, v.776, p. 169-175.

67. Merrifield C.J., Feldman M.E., Wan L., Aimers W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol, 2002, v.4, p.691-8.

68. Michalet X., Bensimon D., Fourcade B. Fluctuating vesicles of nonspherical topology. Physical Review Letters, 1994, v.72, p.168-171.

69. Mironov A.A., Weidman P., Luini A. Variations on the intracellular transport theme: maturing cisternae and trafficking tubules. J Cell Biol, 1997, v. 138, p.481-4.

70. Moody М.Р., Attard P. Curvature-dependent surface tension of a growing droplet. Phys Rev Lett, 2003, v.91, p.056104.

71. Mueller P., Rudin D.O. Action potential phenomena in experimental bimolecular lipid membranes. Nature, 1967, v.213, p.603-4.

72. Naito H., Okuda M., Zhong-can O.Y. New solutions to the Helfrich variation problem for the shapes of lipid bilayer vesicles: Beyond Delaunay's surfaces. Physical Review Letters, 1995, v.74, p.4345-4348.

73. Nanavati C., Markin V.S., Oberhauser A.F., Fernandez J.M. The exocytotic fusion pore modeled as a lipidic pore. Biophys J, 1992, v.63, p.l 118-32.

74. Neher E., Marty A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proc Natl AcadSci USA, 1982, v.79, p.6712-6.

75. Noguchi H., Takasu M. Structural changes of pulled vesicles: a Brownian dynamics simulation. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys, 2002, v.65, p.051907.

76. Orci L., Perrelet A., Ravazzola M., Amherdt M., Rothman J.E., Schekman R. Coatomer-rich endoplasmic reticulum. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, v.91, p. 11924-8.

77. Patki V., Buxton J., Chawla A., Lifshitz L., Fogarty K., Carrington W., Tuft R., Corvera S. Insulin action on GLUT4 traffic visualized in single 3T3-11 adipocytes by using ultra-fast microscopy. Mol Biol Cell, 2001, v. 12, p. 129-41.

78. Plateau J.A. Experimental and theoretical reaserches on the figures of a liquid mass withdrawn from the action of gravity. Annu.Rep. Board Reg. Smithson. Inst, 1863, p.207-285.

79. Plateau J. Statique Experimentale et Theoretique des Liquides Soumis aux Seules Forces Moleculaires. Gauthier Villars, Paris, 1873.

80. Polishchuk E.V., Di Pentima A., Luini A., Polishchuk R.S. Mechanism of constitutive export from the golgi: bulk flow via the formation, protrusion, anden bloc cleavage of large trans-golgi network tubular domains. Mol Biol Cell, 2003, v.l4, p.4470-85.

81. Powers T.R., Huber G., Goldstein R.E. Fluid-membrane tethers: minimal surfaces and elastic boundary layers. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys, 2002, v.65, p.041901.

82. Racz L.M., Szekely J., Brakke K.A. A General Statement of the Problem and Description of a Proposed Method of Calculation for Some Meniscus Problems in Materials Processing. Isij International, 1993, v.33, p.328-335.

83. Raphael R.M., Waugh R.E. Accelerated interleaflet transport of phosphatidylcholine molecules in membranes under deformation. Biophys J, 1996, v.71, p.1374-88.

84. Ratinov V., Plonsky I., Zimmerberg J. Fusion pore conductance: experimental approaches and theoretical algorithms. Biophys J, 1998, v.74, p.2374-87.

85. Rauch C., Farge E. Endocytosis switch controlled by transmembrane osmotic pressure and phospholipid number asymmetry. Biophys J, 2000, v.78, p.3036-47.

86. Rea S., James D.E. Moving GLUT4: the biogenesis and trafficking of GLUT4 storage vesicles. Diabetes, 1997, v.46, p. 1667-77.

87. Reits E.A., Neefjes J.J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nat Cell Biol, 2001, v.3, p.E145-7.

88. Robinson M.S. The role of clathrin, adaptors and dynamin in endocytosis. Curr Opin Cell Biol, 1994, v.6, p.538-44.

89. Robinson N.D., Steen P.H. Observations of singularity formation during the capillary collapse and bubble pinch-off of a soap film bridge. Journal of Colloid and Interface Science, 2001, v.241, p.448-458.

90. Rohrbach A. Observing secretory granules with a multiangle evanescent wave microscope. Biophys J, 2000, v.78, p.2641-54.

91. Rosenboom H., Lindau M. Exo-endocytosis and closing of the fission pore during endocytosis in single pituitary nerve terminals internally perfused with high calcium concentrations. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, v.91, p.5267-71.

92. Rothman J.E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature, 1994, v.372, p.55-63.

93. Rothman J.E. Intracellular membrane fusion. Adv Second Messenger Phosphoprotein Res, 1994, v.29, p.81-96.

94. Roux A., Cappello G., Cartaud J., Prost J., Goud В., Bassereau P. A minimal system allowing tubulation with molecular motors pulling on giant liposomes. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, v.99, p.5394-9.

95. Rustom A., Saffrich R., Markovic I., Walther P., Gerdes H.H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science, 2004, v.303, p. 1007-10.

96. Sakmann B. N.E. Single Channel Recording. 2nd ed. Plenum Press, New York, 1995, p.700pp.

97. Sannerud R., Saraste J., Goud B. Retrograde traffic in the biosynthetic-secretory route: pathways and machinery. Curr Opin Cell Biol, 2003, v. 15, p.438-45.

98. Schmid S.L. Clathrin-coated vesicle formation and protein sorting: an integrated process. Annu Rev Biochem, 1997, v.66, p.511-48.

99. Schmoranzer J., Goulian M., Axelrod D., Simon S.M. Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy. J Cell Biol, 2000, v.149, p.23-32.

100. Schmoranzer J., Simon S.M. Role of microtubules in fusion of post-Golgi vesicles to the plasma membrane. MolBiol Cell, 2003, v. 14, p. 1558-69.

101. Sciaky N., Presley J., Smith C., Zaal K.J., Cole N., Moreira J.E., Terasaki M., Siggia E., Lippincott-Schwartz J. Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells. J Cell Biol, 1997, v. 139, p.l 137-55.

102. Semiz S., Park J.G., Nicoloro S.M., Furcinitti P., Zhang C., Chawla A., Leszyk J., Czech M.P. Conventional kinesin KIF5B mediates insulin-stimulated GLUT4 movements on microtubules. EmboJ, 2003, v.22, p.2387-99.

103. Shemesh Т., Luini A., Malhotra V., Burger K.N., Kozlov M.M. Prefission constriction of Golgi tubular carriers driven by local lipid metabolism: a theoretical model. BiophysJ, 2003, v.85, p.3813-27.

104. Short В., Barr F.A. Membrane traffic: a glitch in the Golgi matrix. Curr Biol, 2003, v. 13, p.R311-3.

105. Shurety W., Stewart N.L., Stow J.L. Fluid-phase markers in the basolateral endocytic pathway accumulate in response to the actin assembly-promoting drug Jasplakinolide. Mol Biol Cell, 1998, v.9, p.957-75.

106. Silverstein S.C. Endocytic uptake of particles by mononuclear phagocytes and the penetration of obligate intracellular parasites. Am J Trop Med Hyg, 1977, v.26, p. 161-9.

107. Slot J.W., Geuze H.J., Gigengack S., Lienhard G.E., James D.E. Immuno-localization of the insulin regulatable glucose transporter in brown adipose tissue of the rat .J Cell Biol, 1991, v.l 13, p.123-35.

108. Smith C., Neher E. Multiple forms of endocytosis in bovine adrenal chromaffin cells. J Cell Biol, 1997, v. 139, p.885-94.

109. Spruce A.E., Breckenridge L.J., Lee A.K., Aimers W. Properties of the fusion pore that forms during exocytosis of a mast cell secretory vesicle. Neuron, 1990, v.4, p.643-54.

110. Stock K., Sailer R., Strauss W.S., Lyttek M., Steiner R., Schneckenburger H. Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device. J Microsc, 2003, v.211, p. 19-29.

111. Stowell M.H., Marks В., Wigge P., McMahon H.T. Nucleotide-dependent conformational changes in dynamin: evidence for a mechanochemical molecular spring. Nat Cell Biol, 1999, v.l, p.27-32.

112. Subtil A., Gaidarov L; Kobylarz K., Lampson M.A., Keen J.H., McGraw Т.Е. Acute cholesterol depletion inhibits clathrin-coated pit budding. Proc Natl AcadSci USA, 1999, v.96, p.6775-80.

113. Suss-Toby E., Zimmerberg J., Ward G.E. Toxoplasma invasion: the parasitophorous vacuole is formed from host cell plasma membrane and pinches off via a fission pore. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, v.93, p.8413-8.

114. Suzuki К., Kono T. Evidence that insulin causes translocation of glucose transport activity to the plasma membrane from an intracellular storage site. Proc Natl Acad Sci USA, 1980, v.77, p.2542-5.

115. Takei K., McPherson P.S., Schmid S.L., De Camilli P. Tubular membrane invaginations coated by dynamin rings are induced by GTP-gamma S in nerve terminals. Nature, 1995, v.374, p.l86-90.

116. Takei K., Slepnev V.I., Haucke V., De Camilli P. Functional partnership between amphiphysin and dynamin in clathrin-mediated endocytosis. Nat Cell Biol, 1999, v.l, p.33-9.

117. Unanue E.R., Ungewickell E., Branton D. The binding of clathrin triskelions to membranes from coated vesicles. Cell, 1981, v.26, p.439-46.

118. Ungewickell E., Branton D. Assembly units of clathrin coats. Nature, 1981, v.289, p.420-2.

119. Upadhyaya A., Sheetz M.P. Tension in tubulovesicular networks of Golgi and endoplasmic reticulum membranes. Biophys J, 2004, v.86, p.2923-8.

120. Upadhyaya A., van Oudenaarden A. Actin polymerization: forcing flat faces forward. CurrBiol, 2004, v. 14, p.R467-9.

121. Vogel S.S., Leikina E.A., Chernomordik L.V. Lysophosphatidylcholine reversibly arrests exocytosis and viral fusion at a stage between triggering and membrane merger. J Biol Chem, 1993, v.268, p.25764-8.

122. Waugh R.E. Surface viscosity measurements from large bilayer vesicle tether formation. II. Experiments. BiophysJ, 1982, v.38, p.29-37.

123. Waugh R.E., Hochmuth R.M. Mechanical equilibrium of thick, hollow, liquid membrane cylinders. Biophys J, 1987, v.52, p.391-400.

124. Weiss M. Challenges and artifacts in quantitative photobleaching experiments. Traffic, 2004, v.5, p.662-671.

125. Zhong-can O.Y., Helfrich W. Bending energy of vesicle membranes: General expressions for the first, second, and third variation of the shape energy and applications to spheres and cylinders. Physical Review. A, 1989, v.39, p.5280-5288.

126. Zimmerberg J., Blumenthal R., Sarkar D.P., Curran M., Morris S.J. Restricted movement of lipid ?.nd aqueous dyes through pores formed by influenza hemagglutinin during cell fusion .J Cell Biol, 1994, v. 127, p.1885-94.