Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизма модулирующего действия серотонина на кальциевые и калиевые каналы в нейронах улитки Helix pomatia

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизма модулирующего действия серотонина на кальциевые и калиевые каналы в нейронах улитки Helix pomatia"

Національна Академія Наук України Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця

^ IV

На правах рукопису

СОТКІС Ганна Валеріївна

ДОСЛІДЖЕННЯ МОДУЛЮЮЧОЇ Дії СЕРОТОНІНУ НА КАЛЬЦІЄВІ ТА КАЛІЄВІ КАНАЛИ У НЕЙРОНАХ СЛИМАКА НЕІЛХ

РОМАТІА

03.00.05- Биофизика АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеню кандидата біологічних наук

Київ - 1997

Роботу виконано у відділі загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України.

Науковий керівник: академік

Платон Григорович Коспок кандидат біологічних наух Олена Олександрівна Лук’янець

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Маргарита Кістянтинівна Малишева кандидат біологічних наук Світлана Анатоліївна Федулова

Провідна установа: кафедра біофізики Національного Університету ім. Т. Г. Шевченка

Захист відбудеться

на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д-01. 13. 01 при Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою м. Київ вул. Богомольця 4.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України.

Автореферат розісланий '_______199^р.

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради Інституту фізіологи ім. О. О. Богомольця

доктор біологічних наук 3. О. Сорокіна- Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. З'ясування молекулярних механізмів функціонування електрохерованих іонних каналів збуджених мембран є одним з важливих завдань сучасної мембраиології. Особливу увагу представляє отримання нових відомостей про структуру кальцієвих каналів, які поряд з їх широким поширенням у мембрані багатьох збудливих утворень, грають велику роль у спряженні різноманітних внутрішньоклітинних та мембранних процесів. У цьому разі, кальцієвий струм, який тече крізь ці канали, може помітно змінювати концентрацію іонів кальцію всередині клітини та активувати процеси м’язевого скорочення та секреції нейромедіаторів, а також крізь ланцюг біохімічних реакцій робити обернений вплив на іонні канали мембрани. Самі кальцієві канали також дуже чутливі до зміни внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію.

Наявність розвинутої системи кальцієвих каналів є, зокрема, важливою особливістю соматичної мембрани нервових клітин як хребетних, так і безхребетних тварин. Утворення методу внутрішньоклітинного діалізу (перфузії) (Kostyuk, Krishtal, 1977а) сприяло значному просуненню наших знань про механізми, які забезпечують електричну збудливість соматичної мембрани, та, зокрема, дало можливість докладно досліджувати властивості кальцієвих каналів.

ПотенцІалзалежні калієві канали також грають важливу роль у різноманітних проявах електричної активності клітин: їх активація задає реполяризацію мембрани під час потенціала дії та розвиток гіперполяризації; вони приймають участь у ритмічній активності ряду збудливих клітин.

Існує декілька видів потенціалзалежних калієвих каналів, які відрізняються один від одного потенціал залежні спо, здатністю інактивуватися, кинетикою активації та інактивації, фармакологічними характеристиками.

Великий інтерес представляє вивчення кальцієвої та калієвої мембранних провідносте# на рівні поодиноких каналів шляхом використовування методу “patch- clamp” у конфігурації “cell- attached” .

Також велику увагу привертає досліджування дй на кальцієву та калієву провідності серотоніну (5-НТ) , який являє собою природний нейрюмедїатор, та який є відомий своєю міцною дією на функцінування нервових клітин.

Тому серотонін і був вибраний нами для оцінки функціональних та фармакологічних властивостей поодиноких кальцієвих та калієвих каналів.

Поряд з серотоніном, для ідентифікації типів кальцієвих та калієвих

функціонування різних типів поодиноких кальцієвих та калієвих каналів у нейронах виноградного слимака Helix pomatia, а також зміну активності поодиноких каналів після зовнішнього прикладання різних типів фізіологічно-активних речовин.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

1. Визначити типи кальцієвих та калієвих каналів у нейронах слимака, вивчити дію 4-АР, Cs+ , Cd2+ на активність поодиноких потенціалзалежних каналів.

2. Визначити провідність кальцієвих та калієвих каналів при контрольних умовах та після прикладання серотоніну, та встановити тип цих каналів.

3. Вивчити механізм дії серотоніну на активність поодиноких кальцієвих та калієвих каналів та визначити, як діють ці речовини на канальну молекулу-безпосередньо, чи через систему цитоплазматичних вторинних посередників.

4. Виміряти кінетику активності кальцієвих та калієвих каналів та порівняти S Захарактсрисгиками інтегральних струмів після зовнішньої дії серотоніну.

псггенціалкероваких кальцієвих та калієвих каналів мембран нервових клітин педальних гангліїв виноградного слимака Helix pomatia. Об'єднання методу внутрішньоклітинної перфузії та методу “patch- clamp” у конфігурації “cell-attached” дало можливість зареєструвати макросіруми та струми крізь поодинокі канали у однієї і тієї ж клітини. Ці данні поклали початок більш детальнішим дослідженням кальцієвих та калієвих макрострумів на рівні поодиноких каналів. У роботі при дослідженні активності каналів було встановлено, що сильним фізіологічним механізмом модуляції активності поодиноких каналів виступає серотонін, який є модулятором як кальцієвих, так і калієвих каналів.

Теоретичне та практичне значення роботи. Отримані результати є основою для більш детального дослідження поодиноких каналів, та вони можуть бути корисними для вивчення механізмів дії фармакологічних речовин різних груп.

каналів використовували відомі блокатори каналів, такі як: 4-АР, Сї+ , Сй2+ .

Мста роботи- дослідити особливості

У роботі досліджували властивості

з

АгпкіДяїгія роботи. Основні положення роботи доповідались та обговорювались: на 8 міжнародному конгресі Чеського та Словацького нсйрохімічного товариства (Martin, Slovakia, 1996) , спільному міжнародному Українсько-Німецькому семінарі (Київ, 1996) , на семінарах Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця (1996, 1997) . За матеріалами роботи опубліковано З етапі

Обсяг та структура дисептаиП. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, обговорення результатів, висновків та списку літератури з 120 найменувань. Робота викладена на 145 сторінках та ілюстрована 20 малюнками.

результатів. 1. Розроблена методика виготовлення піпеток для реєстрації струмів крізь поодинокі канали у нейронах виноградного слимака Helix pomatia.

2. Досліджена дія серотоніну на високопороговий кальцієвий струм поодиноких кальцієвих каналів у нейронах виноградного слимака Helix pomatia.

3. Досліджена дія серотоніну на поодинокі калієві канали у нейронах виноградного слимака Helix pomatia.

4. Виявлено декілька типів потенціал залежних калієвих каналів у нейронах виноградного слимака Helix pomatia.

МЕТОДИКА

Дослідження проводились на свіжоізольованих нейронах, які були виділені з педальних гангліїв виноградного слимака Helix pomatia. Виділений ганглій з Helix pomatia клали у розчин Рінгера, у якому була проназа Е 0.2%. Ферментативна обробка ганглію тривала 1 г 30 хв при температурі + 37°С. Для отримання ізольованих клітин ганглій розрізали на дрібні шматочки і за допомогою голок з останніх виділяли нейрони. Виділені нейрони інкубувались на протязі 30 хв у розчині Рінгера при температурі + 4°С.

Дослідження трансмембранних іонних струмів здійснювались за допомогою методу внутрішньоклітинної лерфузії (Kostyuk, Krishtal, 1977а) . Піпетки виготовляли з м'якого пластика. Опір піпеток складав 2- 3 МОм, коли вони були заповнені внутрішньоклітинним розчином. Контрольний

позаклітинний розчин мав такий склад (мМ/л): CaClj 20; TrisCl 25; MgCh 4; TEA Cl 80;pH 7.6 (Tris- OH). Внутрішньоклітинний розчин містив (мМ/л) : ATP 2; EGTA 10; CsCl 80; Tris ASP 40; MgCl2 2; teophyffine S;'pH 7.4 (Tris- ОЩ

Дослідження струмів поодиноких іонних каналів здійснювалось методом “patch- clamp” у конфігурації “cell- attached" . Мікропіпетки виготовляли з товстостінного скла (пірекс) . Опір піпеток складав 104- 20 МОм, коли вони були заповнені піпсгочккм розчином. Для дослідження кальцієвих каналів використовувався розчин такого складу (мМ/л): СаСІд 100; MgCl2 2; Hepes 10; pH 7. 4 (Tris- OH) .В дослідженнях калієвих каналів піпеточний розчин містив (мМ/л): СаС12 100; MgCl2 2; Hepes 10; pH 7. 4 (Tris- OH).

При дослідженні змін струмів під дією серотоніну, цей медіатор додавався у позаклітинний розчин у концентрації 10 jiM.

Для виявлення типів калієвих каналів використовували такі типи калієвих блокаторів (мМ/л): 4- АР 10; Cd 0.1; Cs 60.

Підсилення іонних струмів здійснювалось за допомогою підсилювача ЕРС- 9. Сигнал з виходу, перетворювача надходив через фільтр (частота зрізу І кГц) на аналога- цифровий перетворювач і далі в комп'ютер “Macintosh” . Дані аналізувались за допомогою програми “Igor- Pro” . Для аналізу активності поодиноких іонних каналів використовувались параметри “імовірність відкритого стану каналу (Ро ) “ : пРд — ( Zt0 ) / Т та “середній час відкритого стану каналу ( ) “ : то = ( ) / N, де п- число каналів під

мікропіпеткок), tg~ час відкритого стану каналу, Т- загальний час реєстрації активності каналів, N- число відкривань каналу.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

1. Загальні характеристики кальцієвоб провідності у нейронів слимаків.

Проведені дослідження показали, що в мембрані нейронів педальних гангліїв Helix pomatia вхідний кальцієвий струм переноситься крізь високопорогові кальцієві канали.

Фонова електрична активність ізольованих нейронів як правило була відсутня або була представлена рідкими спонтанними потенціалами дії. (мал. 1А) . Клітини, які досліджували, мали потенціал спокою -100 мВ, що було дуже близько до їх фізіологічних характеристик; значення величини та тривалості потенціала дії у позаклітинному розчині, який містив 20 мМ

кальцію, були відповідно рівними 221 ± 34 мВ (п- 4) та 0. 9 ± 0. 1с (п-4) . Потенціал дії виявляв плато, величина та тривалість якого відповідно становили 80 ± 23 мВ (п= 4) та 0. 4 ± 0. 2 с (п-4) - Плато змінювалось в залежності від змін у концентрації зовнішнього кальцію. Іонна мембранна провідність ізольованих нейронів досліджувалась за допомогою “voltage- clamp” реєстрації. Мал. 1Б дозволяє оцінити вольт- амперну характеристику інтегрального струму, який був отриманий при використовуванні RAMP протоколу (від -100 мВ до +100 мВ) у конфігурації “wholl- cell" при пітримуючому потенціалі - 80 мВ та тривалості 200 мс. Вольт- амперна характеристика вказує на те, що пік (« 500 пА) при значенні + 20 мВ відповідає максимуму кальцієвогго макроструму (Іо.) при наявнісп у позаклітинному розчині 20 мМ Са2+ .

В

Б

Мал. 1 Кальцієва провщвісті. у ізольованому нейроні:

А- кальцієвий потенціал дй; Б- запис струму крізь кальцієві канали, яга отримані у відповідь на RAMP-стимуляцію мембранного фрагменту від -100 мВ до +100 мВ у конфігурації “wholl-cell” у ізольованому нейроні,який виділений з педального ганглію слимака Helix pomatia; В- запис струму крізь кальцієві канали, які отримані у відповідь на RAMP-стимуляцію мембранного фрагменту від -100 мВ до +100 мВ у конфігурації “cell-attached” у ізольованому нейроні,який виділений з педального ганглію слимака Helix pomatia.

2. Характеристика активності поодиноких нимоевях каналів

Недивлячись на багаточиссльні спроби використовувати різноманітні комбінації ферментативної обробки для гангліїв слимаків, було проблематичним для багатьох авторів досягти стабільного гігаомного контакту для свіжоізольованих нейронів виноградного слимака (див. Kostyuk, Shuba, Savchenko, 1988) . Ці труднощі були викликані жорсткістю мембрани виноградного слимака, причиною якої є сполучна тканина, яка залишається після обробки. Тривалий ефект “прилипання” клітин у більшості разів досягався завдяки стабільному гігаомному контакту між мембраною нейрона та кінцем реєструючої піпетки у конфігурації “cell- attached” .Було використано

при стимуляції фрагмента мембрани “RAMP- стимуляцію” для виявлення кальцієвих каналів у ділянці, яка тестувалась. Стимуляція проводилась від -100 мВ до максимальної деполяризації +100 мВ (май. 1В) .

Мал. 2 ілюструє струми поодиноких кальцієвих каналів, які отримані на ізольованих нейронах слимаків при мембранному потенціалі -30 мВ та 100 мМ концентрації внутрішньошпегочного кальцію. Как можна бачити з малюнка, канальна активність має пачечний характер, що добре узгоджується з раніш відомими результатами про активність кальцієвих каналів. Вольт- амперні характеристики дозволяють проаналізувати провідність кальцієвих каналів (мал. 3) . Для побудови вольт- амперної характеристики використовувалась стимуляція фрагмента мембрани шляхом підтримки мембранного потенціалу

КОНТРОЛЬ

5-НТ

:j—'—irvwr

Мал. 2 Активність поодинокого кальцієвого каналу у ізольованому вейроиі слимаха Helix pomatia.

А- струми поодиноких кальцієвих каналів, які зареєстровані при підтримуючому потенціалі -80 мВ при контрольних умовах у конфігурації “cell-attachcd” ; Б- струми поодиноких кальцієвих каналів, які зареєстровані при підтримуючому потенціалі -80 мВ після прикладання серотоніну (10 мкМ) у позаклітинний розчин у конфігурації “cell-attached”.

на певному рівні. Реєстрації виконувались протягом 200 стимуляцій тривалістю 300 с при частоті 0. 33 Гц. На мал. З показано, що провідність каналу, згідно нахилу вольт- амперної характеристики до вісі абсцис, становить 5 пСм. Достовірність опису вольт- амперної характеристики було перевірено при побудові амплітудної гістограми для потенціалу на мембрані - ЗО мВ (мал. 4А) . Інтервал між піками на цій гістограмі повинен співпадати зі значенням амплітуди струму поодинокого каналу для вибраного значення мембранного потенціалу. Як можна бачити з малюнків 3 та 4А, вольт- амперна характеристика та амплітудна гістограма показують однакові значення амплітуди для поодиноких каналів, рівну 0. 5 пА при підгримуючому потенціалі - ЗО мВ.

-150 -100 -50 0 50 100 150

характеристик* кальцієвого струму поодинокого иаалу мембрани нейрону слимака Helix pomatia. Піпеточиий розчин мав 100 мМ кальцію.

Пстограма також ілюструє, що у проведених експериментах був знайдений тільки один тип поодиноких кальцієвих каналів.

Для аналізу кінетики поодиноких кальцієвих каналів були побудовані часові гістограми відкритого та закритого станів. Мал. 5А представляє часову гістограму відкритого стану кальцієвого каналу при підтримуючому потенціалі - 30 мВ, яка описується однією експонентою при використовуванні методу найменьших квадратів. Часова константа (to) експоненти має значення 0. 2 мс (мал. 5А) . Як можна бачити з мал. 5, максимальний час, коли канал

знаходився у відкритому стані, відповідає 12 мс. Часова гістограма, яка описує час закритого стану канала, представлена двома експонентами- швидкою та повільною (мал. 5В) . Швидка компонента характеризує- усі закриті стани каналу у межах пачки та описується експонентою з часовою константою (іа 1) 1 мс. Повільна компонента розподілу (га 2) , яка описує стан між пачками, рівна 11. 5 мс. Невеликий вплив повільної компоненти у загальну гістограму часу знаходження каналу у закритому стані та її значна тривалість свідчать про те, що кількість зачинень каналу у межах пачки значно перевищує кількість за межами пачки. Відношення значень часів закритого та відкритого станів каналу є зразком моделі каналу, який “блимає” , та перебування якого у закритому стані перевищує на 5 хв. час перебування каналу у відкритому стані.

Б

В

•а 5-HT 1

X 46 ї

•ї •! в пА

• - сф

<-«0.

•494'

• » і 1 1 » 1 0.04 ».« 8.*» в.» в.30 9Л\ «J0

с

Мал. 4 Гістограми амплітуд поодиноких кальцієвих струми нрн мембранному потенціалі -ЗО мВ.

А- при контрольних умовах; Б- після додавання 10 мкМ у позаклітинний розчин; В-приклад реєстрації кальцієвого струму крізь поодинокий канал, який отриманий у відповідь на деполяризацію мембрани -70 мВ;

3. Чутливість до серотоншу воодашжнх кальцієвих каналів

Отримані раніше дані показали дію серотоніну по відношенню до зростання кальцієвого макроструму у педальних нейронах завдяки участі цАМФ- залежного каскаду фосфор клювання (Kostyuk, Lukyanetz, Doroshenko, 1992; Lukyanetz, Kostyuk, 1996).

Оцінка механізму дії серотоніну на особливості зміни активності поодиноких кальцієвих каналів була проведена у слідуючих експериментах.

Мал. 2 показує реєстрації активності поодиноких кальцієвих каналів у конфіїурації “cell- attached” до та після прикладання серотоніну у позаклітинний розчин. При такому прикладанні серотоніну не відбувається безпосереднього контакту між позаклітинним розчином та ділянкою мембрани, яку дослідасували. Тому дія серотоніну можна пояснити тільки участю системи внутрішньоклітинних посередників. Мал. 2Б показує, що струми поодиноких

каналів до та після прикладання агоніста у позаклітинний розчин мають однакові значення амплітуди (мал. 2Б та мал. 4В) . Значно зросла кількість подій, які відповідали таким значенням амплітуди: 67 подій проти 8 у контролі; для обох випадків використовували 200 кривих реєстрацій струму.

Амплітудна гістограма говорить, по- перше про тс, що кількість каналів, які працюють, змінилась пря дії серотоніну. Це можна бачити, коли декілька активованих каналів потрапляли у одну і ту ж саму patch- ділянку, яку досиджували. У цьому разі після прикладання 5-НТ спостерігається зростання кількості активованих каналів удвічі (мал. 4 та 6) .

А Б

В Г

Мал. 5 Вплив 10 мкМ серотовіау на кальцієві канали у відкритому співі (А, В) та закритому стані (Б, Г).

А, Б- гістограми, які отримані при контрольних умовах; В, Г- гістограми, які отримані після додавання 10 мкМ серотоніну у позаклітинний розчин.

По- друге, 5-НТ ке індукує з'явлення інших типів кальцієвих каналів (мал. 4В) . Амплітудна гистограма вказує на те, що після прикладання 5-НТ місцезнаходження піка, який відповідає значенню амплітуди поодинокого каналу 0. 5 пА, не змінилося (мал. 4А, В) .

Для характеристики кінетичних властивостей кальцієвих каналів після прикладання 5-НТ, було побудовано гістограми відкритого та закритого станів, каналу (мал. 5) . Порівнюючи з контролем, після прикладання 5-НТ часова константа то зросла у 1. 5 разів, її значення складало то = 0. З мс (кал. 5Б) . Що до часових констант для закритого стану, то їх значення по відношенню до контролю зменшилось та склало тір = 0. 4 мс, тгсі = 5. 96 мс (мал. 5Г) .

Кількість клітин, яка досліджувалась, дорівнювала 33.

А

*- КОНТРОЛЬ •4- «4-

® ІО 20 Э9 С 40 »0 «0

Б

"ІІііV‘| |1Н ‘»і;і «jf»1' j ■” 5-НТ ц- .*■ -— ..... --

Р щ ^ І ------ —^ | | «

« *0 30 »0 «0 «о *9

Мал. 6 Викликане серотовівом зростання частоти знаходження кальцієвого каналу у відкритому стані.

А- 200 послідовних кривих реєстрації кальцієвих струмів поодиноких каналів тривалістю 300 мс кожна, які отримані при деполяризації мембрани до -ЗО мВ при контрольних умовах; Б- 200 послідовних кривих реєстрації кальцієвих струмів поодиноких каналів тривалістю 300 мс кожна, які отримані при деполяризації мембраии до -30 мВ після додавання 10 мкМ серотоніну у позаклітинний розчин.

4. Характеристика поодиноких калієвих каналів у нейронах Helix pomatia

Вимірювання вихідних струмів у ідентифікованих нейронах виноградного слимака Helix pomatia за допомогою методу “patch- clamp” у конфігурації “cell- attached” показують наявність декількох типів калієвих каналів. Було досліджено три тнпа калієвих каналів с великою (75 пСм, ВК.К) , середньою (22 пСм, СКК) та малою (6. 2 пСм, МКК) поодинокими провідносгями.

и

ВКК та СКК типи каналів активувались при значеннях мембранного потенціалу - ЗО мВ, тоді як МКК тип калієвих каналів активувався при більш негативних значеннях потенціалу, та імовірність знаходження цих каналів у відкритому стані зменшувалась при значеннях мембранного потенціалу більш позитивних, ніж - ЗО мВ.

Фармакологічні властивості показали, що активність ВКК та МКК зникає через 8- 10 хв після початку реєстрації при наявності у піпеточному розчині 60 мМ Cs+ , а активність СКК залишається без змін. ВКК та СКК більш чутливі до прикладання TEA (20 мМ) , МКК- селективно чутливі до прикладання 4- АР (10 мМ) . При наявнісгі у піпеточному розчині 100 мкМ Cd2+ поодинока провідність ВКК та СКК зменшилась на 55% та 31% відповідно. Протилежно цим двом типам калієвих каналів, поодинока провідність МКК не змінилась після дії цього блокатора.

Позаклітинне прикладання 10 мкМ серотоніну показало,що ВКК пригнічуються, а СКК та МКК залишаються нечутливими до дії цього медіатора.

Припускається, що ВКК можна віднести до групи кальцій- залежних калієвих каналів з великим значенням поодинокої провідності, або до серотонін- залежних калієвим каналам (S- каналів) , СКК- до трупи кальцій-залежних калієвих каналів з середнім значенням поодинокої провідності. Струми, які були зареєстровані крізь МКК, добре узгоджуються з характеристиками калієвих струмів, які визначаються як А- струми.

5. Поодниоки потснциліалежні калієві канали

Експерименти, які виконані за допомогою методу “patch- clamp” у конфігурації “cell- attached” , демонструють родину поодиноких потенціалзалежних вихідних калієвих струмів, отримані на ізольованих нейронах слимака Helix pomatia. Мал. 7 ілюструє експеримент, у якому потенціал мембранного фрагменту підтримувався на рівні - 80 мВ, а позаклітинний розчин містив калій у концентрації 140 мМ. У patch- ділянці, яку досліджували, більше 90% з усіх апробованих фрагментів мембрани містили ВКК тип калієвих каналів. Величини амплітуд струмів були отримані за допомогою побудованої амплітудної гістограми (мал. 7) . Значення амплітуди струму поодинокого каналу знаходилось у межах 0. 4- 9 пА, в залежності від значення мембранного потенціалу. Величини амплітуд МКК та

СКК складали 43.4% та 18.8% відповідно від значень амплітуд ВКК при значенні мембранного потенціалу 0 мВ. ВКК та СКК мали схожі потенціал о-залсжності; вони активувались При значеннях мембранного потенціалу більш позитивних, ніж - ЗО мВ (иал. 7А) . Якщо співставити ці два типа калієвих каналів, то канали з малим значенням амплітуди струму при невеликій деполяризації мали більш високу ступінь імовірності знаходитися у відкритому стані. Імовірність знаходження їх у відкритому стані значно зменшувалась при значеннях мембранного потенціалу більш позитивних, ніж - 40 мВ (мал. 7В) . Ці флуктуації струму були відмічені у декількох експериментах; вони продемонстрували пачечний характер активності, який ідентичний активності ВКК

Мал. 7 Потенціальна залежність знаходження калієвих каналів у викритому стааі.

А- амплітудна гістограма, яка отримана з одної досліджуваної ділянки мембрани при різних значеннях мембранного потенціалу, Б- інша ділянка мембрани, приклад реєстрацій активності калієвих каналів у конфігурації “сеІІ-аИасЬесі” у відповідь на деполяризацію мембрани до -60 мВ (ліворуч) та амплітудна гістограма (праворуч) ; В-залежність відкритого стану ВКК та МКК він значення мембранного потенціалу.

Як можна бачити з мал. 8, усі три типа каналів можна було спостерігати на одній ділянці мембрани, яку досліджували, при одному і тому ж значенні мембранного потенціалу.

Мав. 8 Різні типи калієм» каяалів у іїояьо&анкк нейронах слимак* Helix poraatia.

Реєстрації сітумі*, яй отримані у конфіїурацй “сеИ-аИасЬмГ . . . .

А- великі калієві канали (ВКК) та середні калієві канали (СКК) ; Б- малі калієві канали (МКК) .

6. Поодинока провідність калієвих каналів

Для встановлення електричних характеристик ВКК, СКК та МКК тихіш калієвих каналів, їх було розділено відносно значень поодиноких провідносте*. Щоб детально вивчити вольт- амперні характеристики струмів поодиноких каналів, мембранний потенціал зміщували від рівня підтримуючого потенціалу ( - 80мВ) до тестуючого рівня ( від - 70 мВ до + ПО мВ) та реєстрували струми при високому рівні фільтрації (10 кГц) . Мал. 9 демонструє водьт-

амперні характеристики. .

Значення поодинокої провідності ВКК добре узгоджується з, значеннями поодинокої провідності для кальцій- активованих калшшх каналів, котрі були раніше описані у нейронах слимаків (РоВоск, Сашапіо, 1987; СгеЯ, Ооіа, 1993) . Стрілкою на мал. 9В показани події, які відповідають СКК, провідність котрих 22 пСм. Канали, у яких спостерігалась дуже мала величина амплітуди струму, мали дуже високу імовірність знаходження у відкритому стані; імовірність знаходження каналів у відкритому стані

знижувалась при більш позитивних значеннях тестуючого потенціалу. Цей тип калієвих каналів мав значення поодинокої провідності 6. 2 пСм.

Мал. 9 Вплив внутрішкьотпеточиого прикладавші Cs+ ва два типи калієвих каналів у нейронах слимака Helix pomatia.

А- реєстрації калієвих струмів поодиноких каналів при мембранних потенціалах +100 мВ та +110 мВ, які отримані з одної ділянки мембрани у конфігурації “cell-attached” при наявності Cs+ у пілеточному розчині на початку експерименту, Б-реестрацн калієвих струмів поодиноких каналів при мембранних потенціалах +100 мВ та +110 мВ, які отримані з одної ділянки мембрани у конфігурації “cell-attached” при наявності Cs+ у пілеточному розчині через 10 хв. після початку експерименту; В-вольт-амперна характеристика ВКК та СКК; Г- вольт-амперна характеристика СКК.

7. Фармакологічні властивості калієвих каналів

Як було показано раніше, деякі фармакологічні речовини по- різному

впливають на різні типи калієвих каналів (Christie, 1995; НШе, 1984; Kostyuk ct

\ ^ аі. , 1988) . У даній роботі спостерігалась чутливість поодиноких калієвих

каналів до різноманітних типів калієвих блокаторів. Виявлено, що активність

калієвих каналів, які були зареєстровані у експериментах, не однаково

залежить від внугрішньопіпеточної концентрації Cs+ (60 мМ) . Мал. 9Б

ілюструє ВКК та СКК, які були зареєстровані при значеннях мембранного потенціалу + 100 мВ та + 110 мВ та при наявності у піпетці іонів Cs+ . Активність ВКК припинялась через 8- 10 хв. після початку реєстрації та більш не відновлювалась (мал. 9Г) . На відміну від ВКК та МКК, поодинока провідність СКК не змінювалась при наявності у ліпеточному розчині іонів Cs+ (мал. 9Г) .

Аналогічні результати були отримані і на інших досаджуваних фрагментах мембрани. Приймаючи до уваги те, що іони Cs+ блокують калієві канали з внутрішньої сторони мембрани, було припущено, що затримка у дії з боку Cs+ на активність каналу зумовлена його транспортуванням з піпетки всередину клітини за допомогою Na/ К АТФази. Було показано, що

іони Cs+ можуть заміщати іони К* при активності Na/ К АТФази і таким чином проникати у клітину (Johnson et al. , 1995) .

У наступному експерименті тестувався TEA; цей блокатор широко використовується як блокатор калієвих каналів у різних типах клітин, у тому числі і у нейронах виноградного слимака (Neher, 1971) , де він переважно діє на кальцій- залежні калієві канали (Gormann, Woolum, 1978; Hermann, Gormami, 1978) , канали затриманого випрямлення (KDR) та S- тип калієвій каналів (Shuster et al. , 1987) ; при викристовуванш TEA у низьких концентраціях не змінюється активність А- типу калієвих каналів (Neher, 1971; Hermann, 1983). Мал. 10 показує, що наявність TEA у піпетці приводить до зменшення амплітуди струму у ВКК та СКК типів калієвих каналів, пооодинока провідність яких зменшується на 25. б % та 27. З % відповідно, тоді як поодинока провідність МКК не змінюється при наявності 20 мМ внутрішньопіпеточного TEA. Ці результати добре корелюють з припущенням про те, що ВКК, які мають велике значення поодинокої провідності, мають властивості кальцій- залежних калієвих каналів, СКК можуть належати до типу калієвих каналів затриманого випрямлення (KDR) , а МКК, які мають мале значення поодинокої провідності та які не проявляють чутливості до прикладання такого блокатора як TEA, можна віднести до А- типу калієвих каналів.

Аналогічні експерименти виконувались при дослідженні блокуючого ефекту 4- АР при його позаклітинному прикладанні. 4- АР (10 мМ), який добре блокує транзієнтеий калієвий струм у різних типах клітин (Hille, 1984) , включаючи нейрони слимаків (Hermann, Gormann, 1978) , зменшував провідність МКК на 54% та був меньш ефективний у своїй дії на ВКК та СКК (мал. 11 А).

вкк

скк

ТИП КАНАЛУ

н contr

tl f ТІ ПШІП CD

ls===i tea

ІЯЇЇЇ1 АР

СИЗ Cs

Мал. 10 Кількісна оцінка вплину блокзгорів калієвих каналів на значеная поодинокої провідності ВКК, СКК, МКК.

Іони Сд2+ вихори стопували для характеристики калієвих каналів; ці іони перешкоджають входу іонів Са2+ у клітину крізь кальцієві канали, і таким чином непрямим шляхом блокують кальцій- залежні калієві канали. Мал. 10 показує, що додавання С42+ у пілеточний розчин ефективно діє на ВКК, амплітуда яких зменшується на 55 %. Внуїришньопіпсточне прикладання С<і2+ також впливає на амплітуду струмів СКК та МКК- вона зменшується при використовуванні блокатора у концентрації 100 мкМ. Усі ці фармакологічні властивості подані на мал. 11 Б.

А

Б

Мал. 11 Ефект внутрішиьоаіпегочиого прикладання 4-АР та Сй1* на три типи калієвих каналів у нейронах слимака Helix pomatia.

А- водьт-амлєрна характеристика ВКК, СКК, МКК при наявності 10 мкМ 4-АР; Б-вольт-амперна характеристика ВКК, СКК, МКК при наявності 0.1 мМ Cd1+ .

( VU \ 14 I

8. Чутливість поодиноких калієвих каналів до серотоиіиу.

Приймаючи до уваги те, що у мембрані нейронів виноградного слимака були знайдені калієві канали, струми яких чутливі до прикладання серотоніну, Ней нейромеяіатор додавався у позаклітинний розчин у концентрації 10 мкМ для тестування чутливості різних типів калієвих каналів, які були описані у експериментах. Попередні дослідження вхазують на тс, шо пригнічення каналів затриманого випрямлення у нейронах слимаків відбувається за рахунок участі цАМФ (Baxter, Byrne, 1990) ; серотонін додавався у позаклітинний розчин та досліджувана ділянка мембрани, яка знаходилась під patch-піпеткою, не контактувала з позаклітинним розчином.

Після позаклітинного прикладання 5- НТ значно зменшилась кількість відкривань каналу (мал. 12) . Мал. 20А, В ілюструє один з експериментів, де більш ніж три типи калієвих каналів мали місце на ділянці мембрани, яку досліджували (з поодинокими амплітудами струма 1. 2 пА, 0. 86 пА, 0. 76 пА,

0. 64 пА, 0. 34 пА, 0. 22 пА) при значенні мембранного потенціалу 0 мВ. Як можна бачити з реєстрацій, які представлені з одної ділянки мембрани, усі ці струми являють собою родину поодиноких каналів, но не є результатом накладання амплітуд струмів декількох працюючих каналів (днв. мал. 13В) .

А

Мал. 12 Зменшення частоти відкривань калієвих каналів, яке індуковане серотоніном.

А- 200 кривих реєстрацій струму тривалістю 300 мс кожна, які отримані у відповідь на деполяризацію мембрани до -60 мВ при контрольних умовах; Б- 200 кривих реєстрацій струму тривалістю 300 мс кожна, які отримані у відповідь на деполяризацію мембрани до -60 мВ після додавання серотоніну у позаклітинний розчин.

Амплітудна гістограма (мал. 13Г), яка відображає сукупність подій, змінювала свою форму після додавання у позаклітинний розчин 5- НТ; з гістограми можна бачити, що 5- НТ діє не однаково на різні типи калієвих каналів. Імовірність знаходження каналів у відкритому стані з амплітудами струмів

поодиноких каналів 0. 22 пА та 0. 86 пА не змінилась, імовірність знаходжене каналу у відкритому стані з амплітудами струмів поодинокого каналу 0. 34 пА та 0. 64 пА зменшилась на 52. 9 % та 51. 6 % відповідно, а канали, які мали амплітуду струму 1.2 пА- зникли. У цей хе самий час імовірність знаходження каналів з амплітудою струму поодинокого каналу 0. 76 пА у закритому стані, значно зросла (понад 36. 8 96).

Як було відзначено раніше, канали, які мають амплітуди струмів поодиноких каналів 0. 22 пА, 0. 64 яА та 0. 86 пА, належать до МКК, СКК, ВКК типам калієвих каналів відповідно. Це значить, що СКК пригні"даються 5- НТ, а МКК та ВКК нечутливі до дії цього медіатора. .

Кількість клітин, які досліджувались у експериментах, складала 26.

КОНТРОЛЬ 5- нт

0.00 Q.1Q Є-W ІЯС 6.00 СЛ0 *4в в J0

с с

їН, /“ у*

«л \ —г~*'~ • 1 \

в .00 0.10 0.20 в.30 ЇМ С.ІО OJ9 одо

Мал. 13 Ефект впливу серотоніну ва різні тшш калієвих каналів у вєйроиах слимака Helix ponutia.

А- реєстрації струмів, які отримані при мембранному потенціалі 0 мВ у конфігурації “cell-attached” при контрольних умовах;; Б- реєстрації струмів, які отримані при мембранному потенціалі 0 мВ у конфігурації “cell-attached” після додавання 10 мкМ серотоніну у позаклітинний розчин; В- амплітудні гістограми для контрольних умов; Г- амплітудні гістограми після додавання 10 мкМ серотоніну у позаклітинний розчин.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

1. Д ія серотоніну т поодинокі кальцієві канали.

В поданій роботі були проведені дослідження дії серотоніну на поодинокі кальцієві канали мембрани нейронів, виділених з педальних гангліїв Helix pomatia.

Було показано, що у данному об'єкті при використовуванні 100 мМ Са2+ як носія заряду, мала місце тільки активність одного типу Са2+ каналів з поодинокою провідністю 5 пСм. Це значення добре узгоджується зі значеннями, які були отримані на нейронах слимака Люксом та співавторами (Lux, Neher et al. , 1981) . Це значення близько за величиною до провідності низькопорогових потенціалкерованих каналів та набагато меньше значення провідності високопорогових потенціалкерованих каналів у нейронах ссавців. У цей же час кінетичні характеристики активності каналів схожі з характеристиками високопорогових Са2+ каналів у нейронах ссавців.

Отримані на нейронах слимаків дані про механізм модулювання їх активності серотоніном можуть мати значення для розуміння цього механізму у нервовій системі ссавців. Як було зазначено раніше, ідентифікація молекулярного механізму, який опосередковує зростання кальцієвой провідності нейрональної мембрани протягом процесу 5- НТ- індукованого фосфорилювання Са2+ каналів, заслуговує особливої уваги. Можливі варіанти цього механізму такі:

1. 5- НТ індукує зростання кількості активних каналів;

2. 5- НТ підвищує імовірність знаходження каналу у відкритому стані;

3. 5- НТ змінює кінетичні властивості активних каналів;

4. 5- НТ активує інші канали з близькою провідністю.

Отримані нами результати вказують, що 5-НТ діє на активність поодиноких Са2+ каналів непрямим шляхом, тобто не безпосередньо на ділянку, яка досліджується та яка знаходиться під patch- піпеткою, з позаклітинного розчину, в який додавався S- НТ.

Ці дані виключають імовірність прямої дії 5- НТ на канальну молекулу та вказують, що ефект реально може існувати за рахунок участі цитоплазматичних посередників- більш імовірно за рахунок цАМФ- залежного фосфорилювання, участь якого у модуляції кальцієвої провідності вивчалась

детально раніше на рівні ткрострумів (Edwards, Weston, 1995; Neher, 1971; Hermann et aL , 1983).

Наші результата свідчать про сладне сполучення механізмів, sod забезпечхиоть цАМФ- залежну регуляцію Саї+ каналів у нейронах слимаків, які можна визначити як “імовірність" , “кінетика” , “кількість” .

2. Фармакологічні властивості калієвих каналів

Аналіз поодиноких каналів показав наявність 6 типів К+ каналів. Відмінність між амплітудами струмів поодиноких каналів цих типів склали

0. 1 пА.

У наших експериментах можна було виділити три типи К+ каналів: з великою (75 пСм, ВКК) , середньою (22пСм, СКК) та малою (6. 2 пСм, МКК) поодинокими провідностями. Це розношення добре корелює з данними, які були отримані раніше при використанні методу “wholI-celT у конфігурації “ceil-attached” (Thompson, 1977; Shuster, 1987).

Враховуючи це, ми можемо припустити, що ВКК, які були зареєстровані у наших експериментах, відповідають КСа каналам. ВКК активуються у широкому діапазоні вимірювань мембранного потенціалу та мають велике значення поодинокої провідності, що добре корелює з параметрами КСа каналів для нейронів слимаків (Lux ct. al. , 1981) .Наші фармакологічні дослідження свідчать про те, що ВКК належать до групи КСа каналів: вони є більш чутливими до TEA та Cdi-t та меньш чутливими до 4- АР. Разом з тим, ВКК у частині своїх властивостей схожі з S- типом К+ каналів; S- канали та КСа канали ідентичні у своїй чутливості до блокування внутрішньоклітинними іонами TEA та у значеннях величин поодинокої провідності. Наші результати добре узгоджуються з результатами, які отримані Шустером та співавторами (Shuster ct. al. , 1987) , які показали, що ці обидва типи К+ каналів мають схожі значення поодинокої провідності. Ми припускаємо, що поодинокі канали, струми яких мають амплітуди 1. 2 пА та

0. 86 пА, належать до S- та КСа типам каналів відповідно; S- тип каналів чутливих до прикладання 5- НТ, після аплікації якого на ділянку мембрани, яку досліджували, кількість працюючих каналів значно зменшилась (Poliock, 1987).

Аналізуючи СКК канали, можна припустити, що з одного боку за значенням величини поодинокої провідності та своїм фармакологічними властивостям вони можуть належати до типу К+ каналів затриманого випрямлення (KDR). Але ці канали нечутливі до позаклітинного прикладання такого блокатора як Cs+ . Деякі автори (Hermann ct. aL , 1983; Lux et al. , 19S1) описують КСа канали нейронів виноградного слимака, які мають поодиноку провідність 20 пСм. Дані цих авторів добре узгоджуються з результатами наших експериметів. Таким чином, ми можемо припустити, що у об'єкті, який ми досліджували, мало місце два типи кальцій- залежних калієвих каналів з великим та середнім значеннями поодинокої провідності; це припущення не протирічить даним про наявність декількох типів кальцій- залежних калієвих каналів (Cook, 1988; Castle et. al., 1989) .

Струми, які були зареєстровані крізь МКК у наших експериментах, належать до класу А- струмів, тому що вони активуються при зміщенні мембранного потенціалу до - 60 мВ та імовірність знаходження цих каналів у відкритому стані зменшується при значеннях мембранних потенціалів більш позитивних, ніж - 30 мВ. Фармакологічні властивості цих каналів свідчать про те, що вони характеризуються вибірковою чутливістю до 4- АР.

3. Дія серотоніну на поодинокі калієві капали

Було показано, що деякі типи К+ каналів можуть бути чутливі до 5- НТ. У експериментах, які були виконані на нейронах Aplysia caJifomica, Бакстер та співавтори показали, що 5- НТ модулює три типи калієвих струмів: S- струм (Ік, s), повільну компоненту кальцій- активованого калієвого струму (Ік, са) та калієвий струм затриманого випрямлення (Ік, v) -

Модулювання Ik,s струму та повільної компоненти кальцій-активованото калієвого струму (Ік, са) серотоніном відбувається за участю вторинного посередника- пАМФ. Аналогічно відбувається модулювання калієвого струму затриманого випрямлення.

У наших експериментах ми встановили такі типи калієвих каналів; ВКК- канали, які можна віднести до класу Са2+ - залежних калієвих каналів з великим значенням провідності (75 пСм) , або до 5- НТ -чутливих калієвих каналам (S- канали) , СКК- до Са2+ - залежних калієвих каналів з середнім

значенням провідності (22 пСм) та МКК- до каналів, струми яких добре узгоджуються з характеристиками А- сірумів (6. 2 пСм).

Після прикладання 5- НТ струми поодиноких калієвих каналів, які мали амплітуду струму у контролі 1. 2 пА, заблокувались; звідси можна зробити припущення, що струми крізь ці канали належать до S- типу калієвих каналів.

Канали, які мали амплітуду струму поодинокого каналу 0. 86 пА, зменшились у кількості після прикладання 5- НТ. Аналогічні зміни відбулись з амплітудами інших калієвих каналів, І тільки калієві канали, які мали значення амплітуди струму поодинокого каналу 0. 22 пА, не зазнали ніяких змін.

Аналізуючи дані, які були отримані після позаклітинного прикладання серотоніну, можна сказати, ідо цей медіатор діє не прямим шляхом на молекулу калієвого каналу, а крізь систему вторинних посередників. Стверджувати, яка з відомих систем вторинних посередників приймає участь у ньому процессі, на основі лише електрофізіологічних характеристик неможна.

ВИСНОВКИ

1. На нейронах виноградного слимака Helix pomatia досліджені молекулярні механізми дії серотоніну на збуджливість цих клітин.

2. Показано, що дія серотоніну на інтегральний кальцієвий струм відбувається не безпосередньо на іонні канали, а крізь систему вторинних посередників.

3. Зміна амплітуди інтегрального кальцієвого струму у ідентифікованих нейронах була розглянута на рівні поодиноких каналів за допомогою методу *Svholl- cell” у конфігурації “cell- attached” . Був знайдений тільки один тип кальцієвих каналів, провідність яких склала 5 пСм.

4. Зростаня струму відбувається за рахунок зростання імовірності відкритого стану каналів, зростання часу знаходження каналу у відкритому стані та зменшення часу закритого стану.

5. При дослідженні поодиноких калієвих каналів виявлені канали з високою (75 пСм, ВКК) , середньою (22 пСм, СКК) та малою (6. 2 пСм, МКК) провідностями.

6. В результаті зовнішнього прикладання 60 мМ Cs+ активність каналів з високим та малим значеннями провідності пригнічувалась, а канали, які мали середнє значення провідності, були нечутливі до прикладання цього блокатора.

ВКК та СКК чутливі до позаклітинного прикладання 20 мМ TEA, а МКК . селективно чутливі до зовнішнього прикладання 10 мМ 4- АР.

7.3роблено висновок, що ВКК можна віднести до кальцій- залежних калієвих каналів з великою првідністю та до серотонін- чутливих калієвим каналам (S-каналам), СКК- до кальцій - залежних калієвих каналів з середнім значенням провідності, а властивості МКК добре корелюють з характеристиками калієвого А- струму. Аплікація 5-НТ показала, що ВКК пригнічуються, а СКК та МКК є нечутливими до дії цього медіатора.

8. Дія 5- ЇГГ на калієві канали також відбувається крізь систему вторинних посередників.

9. Отримані результати вивчення активності кальцієвих та калієвих поодиноких каналів надають більш повне уявлення про молекулярний механізм нейромодуляпгорної дії серотоніну- одного з важливих нейромедіаторів у нервовій системі як хребетних та безхребетних тварин.

Перелік робіт, опублікованих за матеріалами дисертації

1. Е. A. Lukyanetz, А. V. Sotkis “Serotonin- induced changes in the activity of single Ca2+ channels in Helix pomatia neurons” , Нейрофизиология/Neurophysiology, t. 28, N> 2/3, 132- 140 (1996).

2. E. A. Lukyanetz, A. V. Sotkis “ Characterization of single K+ channels in Helix pomatia neurons” , Нейрофизи ология/Neurophysiology, t. 28, № 6, 250- 259, (1996).

3. О. О. Лук'янец, Г. В. Соткіс “Дослідження модулюючої дії серотоніну на поодинокі кальцієві канали у нейронах виноградного слимака Helix pomatia” , Фізіологічний журнал, № 5/ 6 , (1997).

Сотки с А. В. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА МОДУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ СЕРОТОНИНА НА КАЛЬЦИЕВЫЕ И КАЛИЕВЫЕ КАНАЛЫ В НЕЙРОНАХ УЛИТКИ HELIX POMATIA. Диссертация (рукопись) на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03. 00. 05- Биофизика, Институт физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины, Киев, 1997.

Исследовалось влияние серотонина (5- гидрокситриптамина, 5- НТ) на активность одиночных кальциевых и калиевых каналов в идентифицированных нейронах Helix pomatia. Изучение действия 5- НТ на активность одиночных кальциевых и калиевых каналов показало, что поскольку данный медиатор был эффективным при его добавлении во внеклеточный раствор, который не контактировал с исследуемым участком мембраны под кончиком микропипетки, влияние 5- НТ на канальную молекулу обусловлено цитоплазматическими посредниками. Проведенные исследования указывают также на то, что существует только один тип высокопороговых кальциевых каналов и три типа калиевых каналов у исследованых нейронов виноградной улитки, активность которых эффективно" модулируется 5-НТ.

Sotkis А. V. THE INVESTIGATION OF MODULATION MECHANISM OF CALCIUM AND POTASSIUM CHANNELS BY SEROTONINE IN HELIX POMATIA NEURONS. The dissertation (manuscript) is presented in accordance with requirement for the degree of candidate of biologycal sciences in speciality

03.00.05- Biophysics, A. A. Bogomolctz Institute of Biology/ National Academy of Science of Ukraine, Kiev, 1997.

The influence of a ncurotransmitter serotonin (5- hydroxytriptamine, 5- HT) on single Ca2+ and К* channel activity was studied on «identified neurons of the snail Helix pomatia. Our findings showed that 5- HT influences the channel molecule in indirect manner, as it appeared effective at its application by adding to the bath solution, that had no contact with the tested membrane fragment. This finding excludes the possibility of direct binding of 5- HT to the channel molecule and shows that the effect is really mediated through a cytoplasmic messenger. Also our investigations shows, that only one type of Ca2+ and three types of KT channels was indentified in this kind of neurons.

Ключові слова: метод фіксаціїї потенціалу (patch-c!amp), конфігурація “cell-attached)” , ідентифіковані нейрони виноградного слимака, серотонін, потенціал-керовані кальцієві та калієві канали.