Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электрофизиологический анализ мембранных механизмов долговременной сенситизации

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Электрофизиологический анализ мембранных механизмов долговременной сенситизации"

Г ¡5 ОД

| Ч'ХЗ О

На правах рукописи

БЕРЕГОВОЙ Николай Алексеевич

ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЛБРАКЕЫХ МЕХАНИЗМОВ ДОЛГОВРЕМЕННОЙ СЕЕСЯТИЗАЦИИ

03.00.13 - Физиология человека п животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

Новосибирск, 1996

Работа выполнена в нежахадемической лаборатории комплексных исследований нейронных систем Конструкторско-технологпческого Института вычислительной техники СО РАН и Института медицинской и биологической кибернетики СО РАКШ

Научный руководитель -

Официальные оппоненты

член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор Штарк М.Б.

I - докгор биологических наук, зав. лаб. Козырева Т.В. доктор медицинских наук, ст.н.с. Никитин В.П.

Ведущая организация - Московский Государственный Университет, Биологический факультет

Защита состоится "......"........ 1996 г. в .... час.

на заседании диссертационного совета Д 001.14.01 в Институте физиологии СО РАМН (630117, Новосибирск-117, ул. академика Тинакова, 4)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии СО РАМН

Автореферат разослан "....."....... 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Елисеева А.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение различных форм индивидуального адаптивного поведения и выяснение механизмов пластичности, лежащих в его основе, представляет собой важнейший класс задач науки о высшей нервной деятельности (Котляр, 1986). Под пластичностью понимаются относительно устойчивые функциональные изменения в системах нейронов, превышающие по длительности время обычных синаптических и импульсных процессов и определяющие эффективность и направленность межнейронных связей (Конорски, 1970; Костюк, 1972).

Внимание все большего количества исследователей привлекает долговременная сенситизация, которая является одной из наиболее интересных моделей для изучения базовых механизмов пластичности. Долговременная сенситизация (ДС) -устойчивое пластическое состояние нервной системы, которое характеризуется значительным повышением реактивности нервной системы в результате действия сильных сенситизирующих стимулов. ДС является одной из форм неассоциативного обучения и ее исследование позволяет проанализировать клеточные и молекулярные основы поведения, не прибегая к усложненным методам (Кэндел, 1980).

Исследование механизмов сенситизации у высших животных сопряжено с известными методическими трудностями, в этом отношении брюхоногие моллюски оказались очень удобными модельными объектами, дающими возможность прямого соотнесения результатов, полученных на клеточном уровне, с проявлениями реального поведения. При разработке этой проблемы наиболее эффективными оказались электрофизиологические методики, позволяющие непосредственно изучать изменения функционального состояния нейронных- структур различной сложности на определенных стадиях изменения поведения.

Долговременная сенситизация рефлекса отдергивания сифона и жабер у аплизии впервые была описана в 1973 г. (Pinsker et. al., 1973), но детальное изучение механизмов ДС началось сравнительно недавно (Frost, et.al. 1985; Dale et. al., 1987, Сафронова, 1987,

- 4 -

Walters, 1987, Балабан, 1991).

Известно, что неспецифические сенситизационные изменения сопровождают ассоциативное обучение, могут ему предшествовать (Balaban, 1983; Литвинов, Логунов, 1979; Shtark et. al., 1982) и являются важным моментом в жизни животных, так как увеличивают реактивность и тем самым повышают готовность к модификации поведения (Гайнутдинов, Штарк, 1986; Kandel, Schwartz, 1982). К настоящему времени установлена ведущая роль командных нейронов в определенных видах поведения, а также значение сенсорных клеток и мотонейронов, включенных в дуги разных рефлексов (Balaban, 1979; Davis, 1983; Kandel, 1976). Хорошо известно также, что мембранные процессы определяют пластические модификации и ассоциативное обучение (Alkon, 1982; Davis, 1983; Hawkins, 1981; Литвинов, Логунов, 1979; Walters, Byrne, 1983; West et.al., 1982; Гайнутдинов, Штарк, 1986).

Результаты, полученные на аплизии (Frost et el., 1985, Montarolo et el., 1986), указывают на возможность формирования пластических сдвигов в пресинаптическом нейроне (в данном случае сенсорном нейроне аплизии) без участия постсиналтических механизмов, причем отмечено, что происходящая при долговременной сенситизации пресинаптическая фасилитация связана с синтезом новых белков и с изменениями в генной экспрессии (Montarolo et el., 1986, Castellucci et el., 1989, Kandel et el., 1993) и эти изменения индуцируются серотонином (Clark, Kandel, 1993). Этому соответствуют и данные, полученные на виноградной улитке, где подтверждается, что по крайней мере часть процесса сенситизации связана с чисто пресинаптическим по локализации процессом (Балабан, 1987, 1992). Субклеточный механизм сенситизации по этим данным представляет собой цАМФзависимое фосфорилирование серотонинчувствительных калиевых каналов, в результате уменьшения проводимости по калию увеличивается длительность потенциала действия и количество входящего во время потенциала действия кальция, что приводит к увеличенному выбросу медиатора в терминалях, а феноменологически выражается в увеличении амплитуды и длительности ВПСП в моносинаптически связанном мотонейроне.

Таким образом, фактически принято считать, что для возникновения долговременной сенситизации достаточно пластических изменений в паре сенсорный нейрон - командный нейрон только на

пресинаптическом уровне и собственно в сенсорном нейроне. На наш взгляд, пластические изменения, происходящие на уровне командного нейрона, дают вклад в длительные эффекты сенситизации, но они пока недостаточно хорошо изучены.

Исследования пластических преобразований в командных нейронах показали наличие в них изменений мембранных параметров при сильной стимуляции (Balaban, 1983) или при стимуляции серотонинергических нейронов (Zakharov et.al., 1991), в работах, проведенных в нашей лаборатории, показаны изменения в белковых спектрах командных нейронов на ранних стадиях обучения (Гринкевич, 1980). Ранее на полуинтактном препарате Helix lucorum было показано (Балабан, 1978), что в командном нейроне закрытия дыхательного отверстия происходит усиление ответов на второй - третий стимул в серии тактильных стимулов, т. е. происходит сенситизация ответов нейронов, сопровождающаяся остаточной деполяризацией, однако подтверждения этим фактам на более длительном временном интервале и в более адекватной экспериментальной ситуации получено не было. Это и определило цель и задачи настоящей работы.

Дели и задачи исследования.

Цель настоящей работы состояла в выяснении мембранных механизмов постсинаптических изменений при формировании долговременной сенситизации на идентифицированных командных нейронах оборонительного поведения моллюска Helix Pomatla L.

На основе поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить характер формирования и сохранения ДС на интактном животном при нанесении сильных ноцицептивных электрических стимулов.

2. Проследить на полуинтактном препарате электрофизиологические корреляты ДС, полученной на интактном животном, при адекватной тактильной стимуляции.

3. Изучить мембранные механизмы ДС на идентифицированных командных нейронах оборонительного поведения.

4. Разработать математическую модель, описывающую возбудимость нейрональной мембраны, применительно к соме Helix Pomatia.

5. В экспериментах на математической модели определить характер количественных изменений ионных проводимостей,

определяющих вариации возбудимости мембраны командных нейронов

при выработке ДС.

Научная новизна полученных результатов.

Решение поставленных задач позволило получить следующие результаты:

1. Разработана экспериментальная модель долговременных изменений характеристик командных нейронов оборонительного рефлекса закрытия пневмостома виноградной улитки Helix Pomatia.

2. Показано, что формирование ДС сопровождается пластическими изменениями в постсиналтических нейронах - при этом повышается возбудимость злектрогенной мембраны командных нейронов ЛПа2,3 и ППа2,3, что выражено в облегчении генерации ДЦ при адекватной тактильной стимуляции сенситизированных животных.

3. Впервые показано, что при ДС наблюдается значительная (до 10 mV) деполяризация мембраны командных нейронов оборонительного рефлекса закрытия пневмостома.

4. Обнаружено явление накопления (аккумуляции) деполяризации в командных нейронах улиток после выработки ДС, которое заключается в том, что при последовательном нанесении тактильных стимулов происходят ступенчатые деполяризавдонные сдвиги мембранного потенциала.

5. Установлено, что изменение возбудимости мембраны командных нейронов оборонительного поведения происходит вследствие уменьшения порогового потенциала в результате гиперполяризационного сдвига критического потенциала и деполяризационного смещения потенциала покоя.

6. Создана математическая модель, описывающая генерацию потенциалов действия злектрогенной нейрональной мембраной при разделении входящего тока на натриевую и кальциевую компоненты, а выходящего - на "быстрый" и "замедленный" калиевый ток.

7. В экспериментах на математической модели показано, что наиболее вероятной причиной наблюдаемых изменений критического потенциала и потенциала покоя при ДС является уменьшение проводимости каналов "быстрого" выходящего калиевого тока.

Практическая ценность работы.

Совокупность данных, полученных в работе, расширит понимание

клеточных механизмов пластичности. Описанная модель может

- У -

применяться при исследовании действия биологически активных веществ в различных модельных ситуациях на простой клеточной модели долговременной сенситизации. Кроме того, ДС может рассматриваться в качестве модели неспецифической гипертрофированной реакции тревоги, на которой возможно изучать особенности развития хронических патологических состояний центральной нервной системы.

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации доложены на:

1. II Всесоюзной конференции "Простые нервные системы и их значение для теории и практики" (Казань, 1988).

2. Международном симпозиуме "Интегративная деятельность нейрона: молекулярные основы" (Ялта, 1988).

3. IX Всесоюзной конференции "Проблемы нейрокибернетики" (Ростов, 1989).

4. XXVIII Совещании по проблемам высшей нервной деятельности (Ленинград, 1989).

5. IV конференции по нейробиологии обучения и памяти (Irvine, California, 1990).

6. Конференции Международного общества нейробиологии беспозвоночных (Минск, 1991).

7. X Международной конференции по нейрокибернетике (Ростов, 1992).

8. II съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1995).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), главы, посвященной методике исследований (глава 2), результатов собственных исследований (глава 3), обсуждения результатов (глава 4), выводов и списка литературы. Содержание работы изложено на

страницах машинописного текста и иллюстрировано 3 таблицами и 18 рисунками. Список литературы содержит 128 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты были проведены на 172 животных. В качестве объекта была выбрана виноградная улитка Helix Pomatia, нервная

система которой достаточно хорошо описана (Schmalz, 1914; Сахаров, 1974; Максимова, Балабан, 1983; Kilias, 1985).

Опыты проводились на виноградных улитках, не менее двух недель находившихся в стеклянном террариуме во влажной атмосфере при комнатной температуре и избытке пищи (капуста, морковь, зелень). Контрольных улиток содержали в отдельных террариумах в аналогичных условиях, не подвергая экспериментальному воздействию.

Тестирование проводили стандартным образом, помещая улиток на шар и прикрепляя на их раковину напротив пневмостома фоторезистор. В дыхательное отверстие направляли луч света, который попадал на фоторезистор. Закрытие пневмостома меняло освещенность фоторезистора и как следствие - его ток, что служило для объективной регистрации сокращения мышц дыхательного отверстия. Наблюдения показывают, что большинство интактных улиток закрывают дыхательное отверстие в ответ на тестирующий тактильный стимул пневмостома, который был одной и той же силы для контрольных и опытных животных, меньше, чем на 10 сек, а при тактильном стимуле ноги сокращение дыхательного отверстия едва заметно. Животные, у которых время закрытия пневмостома превышало 10 сек, в эксперименте не использовались.

Долговременная сенситизация оборонительного рефлекса виноградной улитки Helix pomatia вырабатывалась в течение 4-х дней посредством ежедневного нанесения 4-х электрических раздражений головы с интервалом 1,5-3 часа (переменный ток 10 мА 50 гЦ продолжительностью 1 сек). В течение всего времени эксперимента вели наблюдение за поведением животных и несколько раз проводили сеанс тестирования, который включал несколько тактильных стимулов мантии. Тесты производились до начала формирования сенситизации и через 1 сутки после ее окончания. Критерием наличия ДС служило значительное увеличение времени закрытия дыхательного отверстия (до 60 сек и более) в ответ на предъявление тестирующего тактильного стимула в область мантийного валика по сравнению с контрольными животными, содержавшимися в тех же условиях. У части улиток (около 20 % ДС не вырабатывалась и в дальнейших экспериментах они не использовались. В части экспериментов тестирование проводили ежедневно в течение двух недель после окончания выработки сенситизации.

Полуинтактный препарат представлял собой центральную нервную систему, мантийную область и каудальную часть ноги улитки, соединенные с центральной нервной системой 3-4 парами задних

мускульных педальных нервов, а также анальным, интестинальным и паллиальными нервами (классификация по Schmalz, 1914). Нервное кольцо ганглиев помещалось в раствор Рингера для холоднокровных следующего состава: NaCl-100 mM, КС1-2,5тМ, CaClo-lOmM, MgCl2-4mM, Tris-7,5 тМ, рН-7,6. Перед препаровкой улиток анестезировали, помещая в смесь воды со льдом на 15-30 мин. Механическая стимуляция мантии и ноги производилась с помощью серебряного стержня (диаметр кончика около 1 мм), который приводился в движение электромагнитом, запускаемым по программе стимуляции от ЭВМ.

Регистрацию электрической активности нейронов проводили через введенный в нейрон стеклянный микроэлектрод, который заполнялся 2,5 M раствором KCl и имел сопротивление от 10 до 50 МОм. Потенциал кончика микроэлектрода контролировался до и после эксперимента. Значения мембранного потенциала, регистрируемые в эксперименте, переводились при помощи АЦП в цифровую форму и далее обрабатывались на ЭВМ. Кроме того дополнительно осуществлялась постоянная запись хода опыта на быстродействующий самописец. В произвольные моменты времени (с интервалом 2-15 мин) производилась тактильная стимуляция и данные регистрировались на ЭВМ. Для электрофизиологического эксперимента были выбраны командные нейроны оборонительного рефлекса закрытия дыхательного отверстия виноградной улитки ЛПа2,3 и ППа2,3 (Сахаров, 1974). Исследовали параметры этих нейронов у контрольных и сенситизированных животных при ответе на тактильную стимуляцию ноги (потенциал покоя, амплитуду, овершут и длительность потенциала действия, критический потенциал, амплитуду возбуждающего постсинаптического потенциала). В качестве критического потенциала было выбрано значение мембранного потенциала, при котором скорость его нарастания (первая производная по времени) достигала определенного значения (Ходоров, 1975); в нашем случае это была величина 1 В/сек. Пороговый потенциал (или порог генерации потенциала действия) определялся как разность между критическим потенциалом и потенциалом покоя (Ходоров, 1969). Результаты были статистически обработаны с применением t-критерия Стьюдента.

и

Математическая модель возбудимости соматической мембраны нейронов моллюсков.

Математическая теория нервного импульса была разработана Ходжкиным и Хаксли (Hodgkin, Huxley, 1952) применительно к мембране гигантского аксона кальмара.

- 10 v

Механизм переноса токов через мембрану сомы гигантских нейронов моллюсков существенно отличается от аналогичных механизмов в мембране аксона кальмара. Коннором и Стивенсом позднее (Connor, Stevens,1971) была предложена модификация уравнений Ходжкина-Хаксли применительно к соматической мембране гигантских нейронов моллюсков. Ими введено описание быстрого калиевого тока в соматической мембране, а активация задержанного калиевого тока описывается не одним, как у Ходжкина и Хаксли, а двумя дифференциальными уравнениями первого порядка с различными постоянными времени. Для расчетов ионных токов вместо констант скоростей активации и инактивации используются постоянные времени этих процессов. В использованной нами модифицированной системе уравнений Ходжкина и Хаксли учитывается потенциалозависимость постоянных времени активации и инактивации быстрого калиевого тока, кроме того, введено описание кальциевого входящего тока. Модель Ходжкина-Хаксли, модифицированная применительно к соме нейронов моллюсков, представляет собой систему нелинейных дифференциальных уравнений первого порядка:

4 Xi

I - C-dV/dt + L g tm (V,t)l • h (V.t)-(V-V) + g (V-V) -

i-1 i i i ILL 4

- C-dV/dt + S I + g (V-V);

i-1 i L L ( 1 )

m (V,t) + t (V) * dm (V.t)/dt - m (V,«>); 1 mi 1 1

h (V.t) + t (V) * dh (V,t)/dt - h (V,»). i hi i i

Индексы 1-1,2,3,4 обозначают, соответственно, параметры натриевого тока, задержанного калиевого тока, быстрого калиевого тока и кальциевого тока, где XI - 3, хг - 2, хз - 4, Х4 - 2; (УД) и И] (УД) - соответствующие переменные активации и инактивации, ^ - максимальные проводимости, VI - равновесные потенциалы, С - емкость мембраны, V -трансмембранное напряжение, I - полный ток через мембрану,

SL и Vl - проводимость утечки и равновесный потенциал тока утечки, соответственно, mi(V,°°) и hj(V,«>) - стационарные уровни активации и инактивации, a tmi(V) и thi(V) -постоянные времени активации и инактивации соответствующих каналов.

Параметры кальциевого входящего тока были выбраны по данным П.Г.Костюка и соавторов (Костюк, 1986), равновесный потенциал для расчетов соответствовал +170 мВ ( по экспериментальным данным он лежит в пределах 130 - 200 мВ). Ш4 СV,со) вычислялось по известной вольт-амперной характеристике. Поскольку максимальное значение кальциевого входящего тока при фиксации напряжения на уровне V, если предварительно напряжение длительно удерживалось на уровне V0, можно описать выражением Imax- £4m42(V,°°) -h4 (V0,»)-(V - V4) ( так как постоянная времени активации кальциевого тока много меньше постоянной времени инактивации (Костюк, 1986)), то

г т 1/2

m (V,») - | I / g • h (V0,»)-(V - V}|.

4 L max 4 4 4J

Таким образом из вольт-амперной характеристики для максимумов токов, измеренных при фиксации напряжения на различных уровнях V, когда кондиционирующее напряжение V0 остается неизменным, получена зависимость от напряжения стационарного уровня активации, которую остается

ТОЛЬКО Нормировать, ЧТОбЫ ВЫПОЛНЯЛОСЬ 0 < IT14(V,«0 < 1.

Максимальная проводимость кальциевых каналов g4 была подобрана так, чтобы в экспериментах на математической модели с фиксацией напряжения максимумы входящего кальциевого тока совпадали с измеренными экспериментально; 54 оказалась равной 0,15 * 10~70м_1.

Параметры натриевого тока определялись аналогично на основании экспериментальных данных. Vi выбрано равным 60 мВ, gi оказалась равной 2,55 * 10-70м-1. Емкость 1 см2 мембраны принималась за 10"бФ.

Для решения системы нелинейных дифференциальных уравнений, входящих в математическую модель, была выбрана "гибридная" схема численного интегрирования, где уравнения, описывающие mi и hi, при начальных условиях, взятых на

- 12 -

предыдущем шаге, решаются точно аналитически.

Пренебрегая аксонной проводимостью, получаем в (1) 1-0 во время развития потенциала действия, так как стимуляция прекращается в момент времени 1-0. Тогда основное расчетное уравнение имеет вид

4

£ I + Б- (V - V ) - -С * сГ//сИ.

1-1 1 Ь Ь

Начальные условия при вычислении ПД и ионных токов во время генерации потенциала действия были следующими:

V - -40 мВ, а пц(УЛ), МУЛ) (1-1,2,3,4) имеют свои установившиеся значения при - 50 мВ, в момент времени 1-0. Все расчеты проводились при неизменных начальных условиях. Порог генерации потенциала действия определялся как значение .напряжения, при котором первая производная потенциала по времени достигает значения 1 В/сек.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Наблюдение за поведением животных при формировании ДС показало, что в первые 2 дня сенситизации улитки становятся беспокойными, больше передвигаются, меньше едят. В последующие 2 дня их двигательная активность резко снижается и время, которое улитки проводят, скрывшись в раковине после очередного электрического раздражения, возрастает от 3-10 мин в 1-й день до 60-150 мин в последний. Из результатов тестирования следует, что через 1 сутки после окончания выработки ДС время, в течение которого пневмостом остается закрытым после очередного тактильного стимула, становится более продолжительным: оно увеличивалось от 5-10 сек у контрольных животных до 60 сек и более к моменту тестирования после выработки ДС (рис.1). У большинства улиток наблюдается простое увеличение времени закрытия пневмостома, однако у части животных при нанесении тестирующего тактильного раздражения мантии пневмостом сначала приоткрывается, затем закрывается и снова открывается. Заметного увеличения времени закрытия пневмостома в

ответ на тестирующий тактильный стимул ноги не наблюдается.

Нами была также проведена серия экспериментов по исследованию длительности сохранения ДС. В этом случае улиток после окончания формирования ДС тестировали каждый день. Эти эксперименты показывают сохранение сенситизации в течение 2 недель и постепенное возвращение к уровню контрольных улиток.

Типичный ответ командных нейронов ЛПа2, и ППа2,3 на тактильную стимуляцию ноги сенситизированного или контрольного животных, был представлен возбуждающим постсинаптическим потенциалом (ВПСП), который в ряде случаев переходил в потенциал действия (ЦД) (рис.2).

I

Рис. 1. Реакция дыхательного отверстия виноградной улитки (закрытие вниз) при тактильной стимуляции ноги (1) и мантии (2) контрольной (а) и сенситизированной (б) улиток. Внизу показана отметка тактильного раздражения. Калибровка 2 мин. Рис. 2. Ответ нейрона ЛПаЗ на тактильное раздражение ноги контрольной (а) и сенситизированной (б) улиток. Амплитуда потенциала действия показана не полностью. Нижние кривые - отметка раздражения. Калибровка 10 мВ и 400 мсек.

При нанесении тактильных стимулов вероятность появления в ответе ПД для нейронов сенситизированных улиток была выше, чем у контрольных (табл. 1). Изменений в форме потенциала действия при этом не отмечено.

Табл. 1.

Серия N кол-во ответов кол-во ответов

с ВПСП с ПД

Контроль 136 118 18(27)

ДС 163 73 90(139)

(В скобках указано общее количество ПД).

Оказалось также, что величина исходного потенциала покоя для командных нейронов сенситизированных животных существенно изменяется по сравнению с контролем (рис. 3, табл. 2):

Табл. 2. Значения амплитуды потенциала действия (ПД), измеренной от текущего потенциала покоя (VI), овершута ПД (Уг), потенциала покоя \г, порогового потенциала критического потенциала Укр и продолжительности ПД (10, наблюдаемые в ответах командных нейронов ЛПа2,3 и ППа2,3 контрольных и .сенситизированных (ДС) улиток (осенняя серия опытов).

Серия N

VI, МВ ч. мВ ^ мс

Контроль 43 84,3+1,4 29, 7+1, 9 3,6+0,3

ДС 44 85,7+3,6 29, 8+4, 5 3,8+0,1

Уг. МВ Ч. мВ Укв.мВ

Контроль 21 -68,2+0,9 23, ,2+0, ,6 -44,4+0,5 (П-12)

ДС 22 -57,5+1,1 12, ,2+0, ,8 -46,7+0,7 (п-12)

При этом необходимо отметить сезонные различия потенциала покоя в контроле и у сенситизированных животных - он меняется с -68,2+ 0,9 мВ (п-21) до -57,5+1,1 мВ (п-22) в осенней серии и с -63,2+ 1,7 мВ (п-22) до -55,2+1,5 (п-20) в весенней серии опытов. Также значительно уменьшается в командных нейронах оборонительного поведения сенситизированных улиток величина порогового потенциала

потенциала действия. Различие средних значений порогового потенциала и потенциала покоя у контрольных и сенситизированных улиток статистически достоверно при уровне значимости Р<0.01 ( по t-критерию Стьюдента).

CONTROL

-70 mV

tiiju'ibii

\ < »

u

LTS

-60

Рис.3. Запись мембранного потенциала нейрона ППаЗ контрольной (control) и сенситизированной (LTS) улиток во время эксперимента на полуинтактном препарате. Амплитуды потенциалов действия прописаны не полностью. Стрелками обозначены моменты тактильного раздражения ноги. Приведены значения исходного потенциала покоя в начале эксперимента. Калибровка 5 мВ и 10 мин. Запись отражает только медленные изменения мембранного потенциала.

Кроме того, при последовательном нанесении серии тактильных стимулов с произвольным интервалом от 2 до 15 мин, мембранный потенциал после деполяризационной волны, которая возникает в ответ на раздражение, не возвращается к начальному уровню и деполяризация

мембраны командных нейронов может достигнуть величины 10 мВ (рис. 3).

Полученная долговременная сенситизация оборонительного рефлекса закрытия пневмостома виноградной улитки вела к увеличению продолжительности закрытия дыхательного отверстия от 5-10 сек у контрольных животных до 60 сек и более. Возрастание продолжительности оборонительного рефлекса служило критерием выработки долговременной сенситизации. Надо отметить, что ранее у аплизии было найдено увеличение времени оборонительного рефлекса отдергивания жабер до 100 сек.

Кроме увеличения времени закрытия пневмостома менялся также характер ответа - дыхательное отверстие приоткрывалось (первое открытие) и затем снова закрывалось. Это свойство может привести к неоднозначности определения времени закрытия пневмостома в зависимости от того момента, которое принимается за открытое состояние дыхательного отверстия. Поэтому мы измеряли полное время его закрытия и в дальнейшем для анализа использовался только этот показатель.

Выработанная сенситизация хорошо сохраняется в течение 2 недель Эти результаты свидетельствуют о том, что ДС может служить моделью обучения и долговременной памяти. Аналогичный вывод был сделан Э.Кенделом с сотрудниками (Castellucci et.al., 1936).

Из результатов видно, что ДС оборонительного рефлекса сопровождается (или обусловлена) значительными изменениями мембранных характеристик командных нейронов: значительно уменьшается абсолютная величина исходного потенциала покоя клеток, регистрируемого в начале эксперимента в отсутствие какой-либо стимуляции, что характеризует фоновый уровень мембранного потенциала нейронов. Результаты показывают, что командные нейроны сенситизированных животных деполяризованы в среднем на 10 мВ по сравнению с контрольными. Надо подчеркнуть более значительное смещение исходного мембранного потенциала в наших экспериментах, чем было получено в работе на мотонейроне аплизии (Frost et.al., 1985). Видимо, это различие в результатах является следствием регистрации электрической активности в различных элементах рефлекторной дуги.

Наши данные демонстрируют повышение возбудимости мембраны нейронов закрытия пневмостома - это проявляется в увеличении числа ПД в ответах командных нейронов ЛПа2,3 и ППа2,3 сенситизированных улиток. Причиной, ведущей к повышению возбудимости мембран этих клеток,

является повышение исходного потенциала покоя клеток (деполяризация), регистрируемого в начале эксперимента, и гиперполяризационное смещение критического потенциала, что в итоге приводит к существенному уменьшению порога генерации потенциала действия. Разумеется, в увеличение частоты генерации ПД дает вклад также и возрастание амплитуды ВПСП, как было продемонстрировано в работах группы Э.Кендела: при долговременной сенситизации в 2,5 раза возрастает амплитуда моносинаптического ВПСП, вызываемого в мотонейроне L7 аплизии сенсорной клеткой. Надо подчеркнуть, что мы регистрировали сложные ВПСП, которые часто переходили в ЦЦ, что не позволило точно определить среднюю амплитуду элементарного ВПСП.

Увеличение возбудимости командных нейронов имеет близкие аналогии в ассоциативном обучении. Так, например, в ответах этих нейронов на условный стимул на начальных этапах формирования условного рефлекса наблюдается появление ПД к 25-30 сочетаниям условного и безусловного стимулов (Литвинов и др., 1979) и показана генерация большого числа ЦЦ после выработки условного рефлекса у виноградной улитки (Balaban, 1980; Максимова и др., 1983). Наоборот, повышение порога генерации ЦЦ может вести к развитию привыкания (Цитоловский и др., 1978). Об увеличении возбудимости, происшедшей при обучении, свидетельствует и модуляция нейронной (залповой) активности в командных нейронах, управляющих движением у моллюска Pleurobranchaea (Davis, 1983; Gillette et.al., 1982).

В наших экспериментах мы нашли накопление деполяризации (рис.3), что также усиливает эффект увеличения возбудимости нервных клеток. Этот результат близок к обнаруженному у моллюска Hermissenda явлению кумулятивной деполяризации (Alkon, 1982), что было одним из первых клеточных коррелятов поведенческих модификаций при ассоциативном обучении.

С целью найти вероятный мембранный механизм обнаруженных при ДС изменений потенциала покоя и порогового потенциала потенциала действия были проведены эксперименты на математической модели. Ниже представлены результаты расчетов ионных токов во время потенциала действия в нормальных условиях: критический потенциал равен -35,7мВ, потенциал покоя составляет -49,5мВ. Уменьшение на 25 Z проводимости каналов быстрого калиевого тока приводит к изменению критического потенциала (он становится равным -35,9мВ) и увеличению потенциала покоя до -48,4мВ. Уменьшение на 50 Z проводимости каналов этого тока дает дальнейшее уменьшение

критического потенциала до -Зб.ОмВ (рис. 4), при этом мембрана переходит в режим периодической активности, что делает невозможным точное определение потенциала покоя.

Рис. 4. Потенциал действия (ПД) и токи во время ПД. Проводимость каналов "быстрого" К+ тока уменьшена на 50%; 1 - мембранный потенциал, 2 - ток, 3 - "быстрый" калиевый ток; уровень критического потенциала показан стрелкой.

Увеличение на 12 7. проводимости каналов натриевого тока тоже приводит к повышению возбудимости, но только за счет уменьшения критического потенциала до -Зб,5мВ, потенциал покоя при этом остается равным -49,5мВ.

Вариации проводимости каналов кальциевого и задержанного калиевого токов не приводят к изменениям критического потенциала и потенциала покоя; интересно отметить, что вариации проводимостей натриевого и быстрого калиевого токов не приводят к значительным изменениям характера кривых соответствующих токов.

Таким образом, воздействие на параметры только одного из системы мембранных токов - быстрого калиевого тока - может привести к наблюдаемым экспериментально изменениям и потенциала покоя и

порога генерации ПД- Вариации проводимости каналов оставшихся токов либо не дают эффекта, либо вызывают модификации только одного из двух параметров, изменения которых приводят к увеличению возбудимости при долговременной сенситизации.

Вероятный механизм "ступенчатых" изменений мембранного потенциала при тактильной стимуляции на полуинтактном препарате у улиток с ДС представляется следующим. Важным элементом рефлекторной дуги являются модуляторные нейроны. В системе оборонительного рефлекса модуляторные нейроны представлены группой клеток, получающих возбуждение от ноцицептивных детекторов через непластичные синапсы (Соколов, 1992). При выработке долговременной сенситизации модуляторные нейроны активируются и начинают выделять в межклеточную среду нейропептид (Bah-y-Rita, 1993; Katz et al., 1994; Браваренко, 1994), активируя внутриклеточные механизмы командных нейронов и включая латентный пейсмекерный механизм (Пивоваров, 1992, 1994; Balaban, 1983). Кроме того, активируются ноцицептивные детекторы, которые образуют на командных нейронах оборонительного поведения непластичные синапсы (Шехтер, 1988); таким образом, при выработке ДС на мембране командного нейрона конвергируют сигналы, пришедшие по различным путям, затем, вследствие активации G-белков, в командных нейронах запускается цикл молекулярных событий, в которые вовлечен геном, в эти процессы, видимо, включено и увеличение содержания внутриклеточного кальция (Никитин и др., 1992); в конечном итоге активируется синтез белков (Штарк, 1985; Никитин и др., 1994), функции которых связаны с избирательной регуляцией проводимости каналов "быстрого" калиевого тока. Вследствие этого действие медиаторов (серотонина) или пептидов (Elekes, Nassel, 1990; Belkin, Abrams, 1993), выделяющихся при тактильной стимуляции (Katz et al., 1994; Whim, Lloyd, 1992), приводит к инактивации части каналов "быстрого" калиевого тока и, вследствие этого, к необратимому уменьшению проводимости каналов "быстрого" калиевого тока. Это дает возможность объяснить и изменение порогового потенциала и наличие "комулятивной" деполяризации при выработке долговременной сенситизации.

ВЫВОДЫ

1. Впервые обнаружено, что в командных нейронах оборонительного рефлекса закрытия пневмостома виноградной улитки Helix Pomatia

- 20 -

при выработке долговременной сенситизации происходят долговременные, длящиеся несколько дней, изменения мембранных характеристик.

2. Показано, что формирование долговременной сенситизации сопровождается повышением возбудимости мембраны командных нейронов ЛПа2,3, и ППа2,3, что выражено в увеличении вероятности генерации потенциалов действия при адекватной тактильной стимуляции сенситизированных животных.■

3. Впервые показано, что при долговременной сенситизации наблюдается значительная (до 10 мВ) деполяризация мембраны командных нейронов оборонительного рефлекса закрытия пневмостома.

4. Обнаружено явление накопления (аккумуляции) деполяризации в командных нейронах улиток после выработки долговременной сенситизации, которое заключается в том, что при последовательном нанесении тактильных стимулов происходят ступенчатые деполяризационные сдвиги мембранного потенциала.

5. Установлено, что изменения возбудимости командных нейронов оборонительного поведения происходят вследствие уменьшения порогового потенциала потенциала-действия.

6. Методами математического моделирования показано, что наиболее вероятной причиной наблюдаемых изменений порогового потенциала и потенциала покоя при долговременной сенситизации является уменьшение проводимости каналов "быстрого" выходящего калиевого тока.

список

основных публикаций по теме диссертации

1. Н.А.Береговой, Х.Л.Гайнутдинов. Деполяризационные смещения мембранного потенциала командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки при долговременной сенситизации. -ДАН СССР, 1988, Т.301, N 4, С. 989-992.

2. Н.А.Береговой, Х.Л.Гайнутдинов, О.Г.Сафронова, М.Б.Штарк. Исследование мембранных и молекулярных механизмов интегративной деятельности командных нейронов оборонительного поведения при формировании долговременной сенситизации. - В сб. "Интегративная деятельность нейрона: молекулярные основы", М.: Инст. норм, физиол. АМН СССР, 1988, с. 29-30.

3. Х.Л.Гайнутдинов, Н.А.Береговой. Моделирование механизмов некоторых проявлений стрессовых состояний на простой нервной системе. - В сб. "Простые нервные системы". Матер. Всес. конф. Л.: Наука, 1988, с. 55-59.

4. Н.А.Береговой, Х.Л.Гайнутдинов, О.Г.Сафронова. Изменение электрических характеристик командных нейронов оборонительного поведения и некоторых белковых фракций нервной системы при долговременной сенситизации у виноградной улитки. - Там же.

5. Н.А.Береговой, Х.Л.Гайнутдинов, О.Г.Сафронова, М.Б.Штарк. Электрофизиологическое и нейрохимическое исследование долговременной сенситизации у виноградной улитки. - Бюлл. экспер. биол. и мед., 1988, т. 106, с. 259-263.

6. Н.А.Береговой, Х.Л.Гайнутдинов, Б.Ю.Гумилевский. Электрические характеристики командных и моторных нейронов оборонительного поведения при долговременной сенситизации у виноградной

улитки. - В сб. "XXVIII Совещание по проблемам высшей нервной деятельности", Л.: Наука, 1989, с. 14-15.

7. Х.Л.Гайнутдинов, Н.А.Береговой. Роль мембранного и порогового потенциалов в изменении функционирования элементов нейронной сети, связанной с модификацией состояния нервной системы. - В сб. "Проблемы нейрокибернетики". Изд. Ростовского университета, 1989, с. 429-430.

8. Kh.L.Gainutdinov, N. A.Bérégovoy. Exitability changes in command neurons of snail defensive reflex at long-term sensitization and amphetamine treatment. - Proceed. Fourth

Conf. on Neurobiol. of Learning and Memory. Irvine, California, 1990, Abstr. N 77.

9. N. A.Bérégovoy, Kh.L.Sainutdinov, O.G.Safronova, A. V.Savonenko. Change in behavior with the development of long-term sensitization of a defensive reflex in the edible snail. - Neuroscience and Behavioral Physiology, 1991, v.21, N 4, p.p. 321-323.

10. H.А.Береговой. Долговременная сенситизация: математическое моделирование процессов в мембранах командных нейронов. -Нейрокомпьютер, 1992, N 2, с. 53-56.

11. N. A.Bérégovoy, Kh.L.Gainutdinov, L.N.Grinkevich, T.A.Zapara, P.D.Lisachev, A.S.Ratushniak. A study of a neuronal plastisity. -Biological membranes, 1992, v. 5, N 11, p.p. 1736-1737.

12. H.A.Береговой. Математическое моделирование ионных токов в нейрональных мембранах при выработке долговременной сенситизации. В сб. "Проблемы нейрокибернетики", Ростов-на-Дону, изд. РТУ, 1992, с. 207-209.

13. Н.А.Береговой. Роль ионных каналов'различного типа в изменениях критического потенциала и потенциала покоя при долговременной сенситизации. - Автометрия, 1993, N 2, с. 75-79.

14. Н.А.Береговой, Х.Л.Гайнутдинов. Долговременная сенситизация виноградной улитки: электрофизиологические корреляты в командных нейронах оборонительного поведения. - Журнал высшей нервной деятельности, 1994, N2, стр. 307-315.

15. Н.А.Береговой. Модель длительных изменений характеристик командных нейронов, вызванных долговременной сенситизацией. В сб. "II съезд физиологов Сибири и Дальнего Востока", Новосибирск, 1995, стр. 42.