Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизма действия неспецифической рибонуклеазы Penicillium brevicompactum

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Моисеев, Геннадий Петрович

ВВЕЩЕНИЕ.

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ

СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ЦИКЛИЗУЩК PHKas.

1.1. Субстратная специфичность ферментов.

1.2. Механизм каталитического действия циклизующих РНКаз.

1.3. Субстратная специфичность РНКазы А в реакции с низкомолекулярными и высокомолекулярными субстратами.

1.4. Структура комплексов РНКазы А с нуклеотидами.

1.5. Механизм реализации специфичности РНКазы А.

1.6. Молекулярные аспекты субстратной специфичности гуаьщловых РНКаз.

1.7. Узнавание нуклеотидов неспецифическими

РНКазами.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование механизма действия неспецифической рибонуклеазы Penicillium brevicompactum"

Ферменты обмена нуклеиновых кислот являются традиционными объектами энзимологии. С одной стороны, они участвуют в ключевых процессах реализации генетической информации. С другой стороны, изучение факторов, определяющих их высокую специфичность, является важным для понимания механизмов реализации специфичности биокатализаторов. Среди ферментов метаболизма нуклеиновых кислот наиболее изученными являются рибонуклеазы. Они нашли широкое применение как инструменты в научных исследованиях в различных областях молекулярной биологии. Кроме того, РНКазы служат удобной моделью для изучения взаимосвязи между структурой и функцией ферментов. Проводятся исследования по возможному применению этих ферментов для лечения ряда вирусных и опухолевых заболеваний. РНКазы представляют собой обширный класс ферментов, осуществляющих деполимеризацию РНК. Подавляющее большинство физико-химических исследований выполнено на циклизующих РНКазах. Эти ферменты гидролизуют РНК в ходе двухстадийного процесса. На первой стадии осуществляется реакция трансэтерификации с образованием моно- или олигонуклеотидов с концевым 2* Д'-циклофосфатом. На второй - концевой циклофосфат гидролизуется до 3'-фосфата.

Циклизуюпше РНКазы могут проявлять высокую специфичность к природе гетероциклического основания нуклеозида на з'-конце гид-ролизуемой з'-б' фосфодиэфирной связи. По этому признаку они разделяются на пиримидин-, пурин-, гуанозинспецифичные и неспецифичные РНКазы. Многочисленные физико-химические исследования специфичных РЫКаз позволили заключить, что узнавание определенного нуклеозидного фрагмента РНК этими ферментами обусловлено образованием критических водородных связей между функциональными группами бежа и протонодонорными или протоноакцепторными группами гетероциклического основания. Что касается механизма действия РНКаз, не цроявляющих в кинетических исследованиях специфичности к природе нуклеозида на 3'-конце гидролизуемой фосфо-диэфирной связи, то эта проблема рассматривается лишь в нескольких работах, ПОСВЯЩенных РНКазе Tg из гриба Aspergillus orysae [l-в] и РНКазе М из гриба Aspergillus saitoi [4-7? . Авторы приходят к заключению, что неспецифические РНКазы проявляют высокое сродство к природным нуклеотидам, причем гетероциклическое основание нуклеотида является необходимым элементом субстрата при образовании продуктивного фермент-субстратного комплекса.

Недавно были разработаны методы крупномасштабной очистки неспецифической РНКазы ИЗ гриба Penicillium brevicompactum[Q] .впервые выделенной в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР [9,10] . Сравнение кинетических параметров гидролиза различных динуклеозидфосфатов показало, что этот фермент функционально близок к РНКазам Tg и М [II] .

Настоящая работа посвящена изучению особенностей функционирования неспецифических РНКаз на примере РНКазы Penicillium brevicompactum. При этом предполагалось ответить на следующие вопросы: осуществляется ли гидролиз пиримидин и пурине од ерзкащих субстратов одними и теш же каталитическими группами белка,связываются ли нуклеозидные фрагменты субстратов в одном и том же участке активного центра фермента, какова природа взаимодействия гетероциклических оснований субстратов с ферментом?

Для ответа на поставленные вопросы были выполнены следующие экспериментальные исследования. Проведено изучение рН-зависимос-тей кинетических параметров реакции гидролиза Urd-2?, з' ~Р и Cyd-2',3-Р И реакции транеэтерификации для Urd-P-Ado, Cyd-P-Ado и Ado-P-Cyd. Показано, что в каждой из этих реакций участвуют две ионогенные группы фермента, с рК, близкими по величине к рК гис-тидина и остатка дикарбоновой кислоты. Детальный анализ наблюдавшихся констант ионизации ионогенных групп фермента и их зависимость от кинетических параметров реакций для различных субстратов показал, что гидролиз межнуклеотидной фосфодиэфирной связи с нуклеозидами различной природы на ее концах осуществляется одними и теш же каталитическими группами фермента. Это позволило заключить, что фосфодиэфирный фрагмент субстратов, содержащих как пуриновые, так и пиримидиновые нуклеозиды, фиксируется при образовании продуктивного фермент-субстратного комплекса в одном и том же участке активного центра РНКазы P.brevicompactum.

С целью выяснения характера взаимодействия оснований субстратов с ферментом были проведены измерения кинетических параметров реакции гидролиза широкого набора нуклеозид-2'з'-циклофосфа-тов с помощью рН-стата. В качестве субстратов использовались нук-леотиды как с природными основаниями, так и специально синтезированные их аналоги, у которых по сравнению с природными селективно удалены или изостерически замещены определенные гетероато-мы оснований. Анализ сродства этих субстратов к РНКазе p.brevicompactum показал, что взаимодействие гетероциклических оснований с ферментом осуществляется как за счет образования водородных связей, так и благодаря гидрофобным взаимодействиям. Установлено, что существенный вклад в энергию образования продуктивного фермент-субстратного комплекса дают специфичные водородные связи между протонодонорными группами бежа и 2-кето-группой пиримидин ового и атомом азота в третьем положении пуринового оснований субстратов. Нуклеозиды ингибировали реакцию гидролиза цик-лофосфатов по конкурентному типу. Показано, что величина константы ингибирования нуклеозидом с пуриновым или пиримидиновым основанием не зависит от того, использовался ли в качестве субстрата пурин- или пиримидинсодержащий нуклеотид-. Это позволило заключить, что нуклеозидные фрагменты субстратов с различными по природе основаниями фиксируются в одном и том же связывающем участке активного центра РНКазы P.brevicompactum. Изостерическое расположение по отношению к фосфорибозильному фрагменту нуклеотидов атома кислорода 2-кето группы пиримидинового основания и атома азота в третьем положении пуринового основания,способных давать водородные связи с протонодопорными группами белка,позволило предположить, что они взаимодействуют с одной и той же функциональной группой фермента.

Анализ кинетических параметров реакции гщцэолиза использовавшегося набора субстратов показал,что логарифмы наблюдаемых констант скоростей и констант Михаэлиса связаны линейными соотношениями, различающимися для пиримидиновых и пуриновых нуклеозид-2'з'-циклофосфатов.Было найдено,что соотношения между кинетическими параметрами, подобные полученным эмпирически,могут быть получены в рамках схемы многостадийной ферментативной реакции,в которой образованию продукта предшествует появление промежуточного соединения, имеющего существенно большее сродство к активному центру фермента, чем исходный субстрат.Экспериментально обнаружены аналогичные отношения между кинетическими параметрами реакции гидролиза пирими-дин-г'.з'-циклофосфатов РНКазой А. Это позволяет считать, что энзи-матические реакции гидролиза и,в силу микрообратимости,реакции трансэтерификации циклизующими РНКазами протекают через стадию образования промежуточного соединения.На основании ранее известных экспериментальных данных по изучению механизмов реакций гидролиза фосфорных эфиров в растворах и под действием РНКазы А, а также рассмотрения полученных нами эмпирических параметров,характеризующих указанный выше интермедиат,мы пришли к заключению,что им является соединение с пентакоординированным атомом фосфора.На основании полученных результатов создана обобщенная модель функционирования циклизующих РНКаз.не обладающих специфичностью к какому-либо типу гетероциклического основания субстрата.

- 8

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Моисеев, Геннадий Петрович

- 108 -выводы

Исследован механизм действия неспецифичной к гетероциклическим основаниям субстратов РНКазы P.brevicompactum. В результате проведенной работы показано следующее.

1. Гидролизуемый фосфодиэфирный фрагмент различных субстратов, содержащих пиримидиновые или пуриновые нуклеозиды, фиксируется при образовании продуктивного фермент-субстратного комплекса в одном и том же участке активного центра РНКазы P.brevicompactum. В гидролизе межнуклеотидной фосфодиэфирной связи участвуют две ионогенные группы фермента, представленные остатками гис-тидина и дикарбоновой кислоты. Установлена роль этих групп на стадии трансэтерификации и гидролиза 2* ,з'-циклофосфата реакции расщепления межнуклеотидной связи.

2. Гетероциклические основания нуклеозид-З*^'-циклофосфатов в продуктивном фермент-субстратном комплексе фиксируются в одном и том же участке активного центра РНКазы P.brevicompactum независимо от их природы. Их взаимодействие с бежом осуществляется как за счет образования водородных связей, так и благодаря гидрофобным взаимодействиям. Существенный вклад в энергию образования продуктивного фермент-субстратного комплекса дают специфичные водородные связи между определенной протонодонорной группой бежа и 2-кето группой пиримидинового или атомом азота в 3-м положении пуринового основания субстрата.

3. Для реакции гидролиза мононуклеозид-2',3'-циклофосфатов РНКазой P.brevicompactum логарифмы наблюдаемых констант скоростей и констант Михаэлиса связаны линейными соотношениями, различающимися для пиримидин- и пуринсодержащих субстратов. Феноменология этих отношений находит объяснение в рамках многостадийной схемы энздматической реакции, в которой образованию продукта предшествует образование промежуточного соединения, имеющего существенно большее сродство к активному центру фермента, чем исходный субстрат. Обнаружены аналогичные отношения между кинетическими параметрами реакции гидролиза пириглидин-2' ,3'-циклофосфатов РНКазой А. Это позволяет считать, что энзиматические реакции трансэтерификации и гидролиза циклофосфатов циклизующими РНКазами протекают через стадию образования промежуточного соединения, которым, наиболее вероятно, является соединение с пентакоординирован-ным атомом фосфора.

Выражаю глубокую и искреннюю благодарность Марату Яковлевичу Карпейскому и Геннадию Ивановичу Яковлеву за предоставление интересной темы, всестороннее и квалифицированное руководство. я признателен а,л. Бочарову и с.н. Михайлову за предоставленные синтезированные ими соединения.

Сердечно благодарю всех сотрудников Лаборатории стереохимии ферментов за моральную поддержку и доброжелательное отношение.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Моисеев, Геннадий Петрович, Москва

1. Uchida Т., Egami Р. Microbial ribonucleases with, special reference to R1.ases , T2> and U2. - In; The Enzymes,v.4, 3rd ed., ITew-York-London: Acad, Press, 1971, p.205-250.

2. Kaiser P.M., Bonacker L., ,V/itzel H., Holy A. Untersuchungen zum reaktionsmechanismus der ribonuclease II aus Aspergillus orysae (ribonuclease T2) - Hoppe-Seyler's Z. Physiol.Ghem., 1975, B.35G, IT 1, s. 143-155»

3. Yasuda T., Inoue Y. Evidence for the presence of two kineti-cally distinct active forms of ribonuclease 0?2 Eur. J. Bio-chem., 1981, v. 114,' LT 1, p.229-234.

4. Imazava M., Irie M., Ukita T. Substrate specificity of ribonuclease from Aspergillus saitoi. J.Biochem., 1968, v.64, И 5, p. 595-602.

5. Irie M. pH-Profiles of the kinetic parameters of ribonuclease from Aspergillus saitoi. J.Biochem., 1969, v.65, IT 1, p. 133-140.

6. Harada M., Irie M. frlkylation of ribonuclease from Aspergillus saitoi with iodoacetate and iodoacetamide. J.Biochem., 1973, v.73, N 4, p.705-716.

7. Igarashi K., Watanabe Y., Kumagai H., Ishisaki IT., Hirose S. Studies on the restoration of the activities of ribonucleases by polyamines in the presence of various ribonuclease inhibitors. J.Biochem., 1977, v.81, II 3, Р,579-585.

8. Ежов В.A., Лузина И.Е, Непрерывное культивирование Penicii-lium brevicompactum образующего внеклеточные рибонуклеазы. ~ Микробиология, 1978, т.47, вып.5, с.906-910.

9. Безбородова С.И., Ильина Т.В., Крупянко В.И. Получение высокоочищенной РНКазы Penicillium brevicompactum Доклады АН СССР Сер.биол., 1971, т.196, № 4-6, с.1460-1462.

10. Ильина Т#В., Безбородова С.И. Очистка РНКазы Penicillium brevicompactum Прикл. биохимия и микробиология, 1972, т.8, № 2, с.226-231*

11. Безбородова С.И. Рибонуклеазы микроскопических грибов и дрожжей. В кн.: Нуклеазы микроорганизмов. М.: Наука, 1974, C.I8&-259.

12. Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов. М.: Мир, 1980, с.328-329.

13. J3e Bender M.L., Kezdy F.J., Gunter C.R. The anatomy of an'enzymatic catalysis. oC-Chymotrypsin. J. Am. Chem. Soc., 1964, v.86, N 18, p.3714-3721.

14. Карпейский М.Я. Активные центры ферментов:стереохимия и динамика. Мол. биология, 1976, т.Ю, № 6, с.1197-1210.

15. Карпейский М.Я., Яковлев Г.И., Антонов В.К. Понижает ли фермент энергию активации элементарного акта химической реакции? Биоорг. химия, 1980, т.6, № 5, с.645-654.

16. Клёсов А.А. Специфичность ферментативного катализа. В кн.: Успехи биоорганического катализа. М.: МГУ, 1979, с.7-56.

17. Клёсов А.А., Березин И.В. Ферментативный катализ. М.: МГУ, 1980, c.II.

18. Ivanov V.I., Karpeislcy M.Ya. Dynamic three-dimensional model for enzymic transamination. -Adv. Enzymol., 1969, v.32, p.21-54.

19. Knowles J.R. Enzyme specificity: oC-chymotrypsin. J.Theor. Biol., 1965, v.9, N 2, p.213-228.

20. Barnard E.A. Ribonucleases. In: Annu. Rev.Biochem. California: Palo Alto, 1969, v.38, p.677-732.-11321. Richards P.M., Wyckoff H.W. Bovine pancreatic ribonuclease. In: The Enzymes. H.Y.- London: Acad. Press, 1971, v.4, p.647-806.

21. Findley D., Herries D.G., Mathias A.P., Rabin B.R., Ross

22. С.A. The active site and mechanism of action of bovine pancreatic ribonuclease. Nature, 1961, v.190, IT 4778, p.781 -784.

23. Findley D., Herries D.G., Mathias A.P., Rabin B.R.,

24. Westheimer F.H. Pseudo-rotation in the hydrolysis of phosphate esters. Acc.Chem.Res., 1968, v.1, IT 3, p.70-78.

25. Bencovic S.J., Schray K.J. Chemical basis of biological phosphoryl transfer. In: The Enzymes. 1T.Y.- London: Acad. Press, 1973, v.8, p.201-238.

26. Bentz F.W., Roberts G.C.K. The interaction of nucleotides with bovine pancreatic ribonuclease. In: Physico-chemical properties of nucleic acids. H.Y.: Acad. Press, 1973, v.3» p.77-138.

27. Eckstein P. Uridine 2,3-0,0-cyclophosphorothioate as substrate for pancreatic ribonuclease (I). FEBS Letters, 1968, v.2, IT 2, p.85-86.

28. Usher D.A., Erenrich E.S., Eckstein P. Geometry of the first step in the action of ribonuclease A. Proc.ITat. Acad.Sci.USA, 1972, v.69, IT 1, p.115-118.

29. Eckstein P., Saenger W., Suck D. Stereochemistry of the transesterification step of pancreatic ribonuclease. -Biochem.Biophys.Res.Commun.,1972, v.46, IT 2, p.964-971.

30. Gassen H.G., Witzel II. Zum mechanismus der ribonuclease re-aktion. I.Die aufgabe der pirimidinbase bei der reaktion.- Eur. J.Biochem., 1967, v.1, p.37-45.

31. Witzel H., Barnard E.A. Mechanism and binding sites in the ribonuclease reaction. I.Kinetic studies on the second step of the reaction. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1962, v.7, И 4, p.289-294.

32. Witzel H., Barnard E.A. Mechanism and binding sites in the ribonuclease reaction. II. Kinetic studies on the first step of the reaction. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1962, v.7, N 4, p.295-299.

33. Witzel H. The function of the pyrimidine base in the ribonuclease reaction. In: Progress in nucleic acid research. H.Y.- London: Acad. Press, 1963, v.2, p.221-258.

34. Imura IT., Irie M., Ukita T. Enzymatic depolymerization of polyadenylic acid by bovine pancreatic ribonuclease A. -J.Biochem., 1965, v.58, И 3, p.264-272.

35. Richards F,M., Wyckoff H.W., Allewell N. The origin of specificity in binding: a detailed example in a protein-nucleic acid interaction. In: The ITeurosciences. H.Y.: Rock-feller University Press, 1970, p.901.

36. Richards P.M., V/yckoff H.W. I.Ribonuclease S. In: Atlas of molecular structure in biology. Oxford: Clarendon Press, 1973.

37. Pavlovsky A.6., Borisova S.H., Borisov V.Y., Antonov I.V., Karpeisky M.Ya. The structure of the complex of ribonuclease S with fluoride analogue of UpA at 2,5 ft resolution. -FEBS Letters, 1978, v.92, IT 2, p.258-262.

38. Meadows D.H., Roberts G.C.K., Jardetzky 0. Nuclear magnetic resonance studies of the structure and binding sites of enzymes. VIII.Inhibitor binding to ribonuclease. J.IvIol. Biol.,1969, v.45, К 2, p.491-511.

39. Haar W., Thomson J.C., Maurer W., Ruterjans H. Investigation of nucleotide-ribonuclease A complexes with high-reso31lution y P-nuclear-magnetic resonance spectroscopy. Eur. J.Biochem., 1973, v.40, N 1, p.259-266.

40. Haar W., Maurer \7., Ruterjans H. Proton-magnetic resonance studies of complexes of pancreatic ribonuclease A with py-rimidine and purine nucleotides. Eur.J.Biochem.,1974, v.44, IT 1 , p.201-211.

41. Sacharovsky V.G., Chervin I.I., Yakovlev G.I., Dudkin S.M., Karpeisky 1,1.Ya., Shliapnikov S.V., Bystrov V.F. Proton magnetic resonance studies of des-(121-124)-ribonuclease A. -PEBS Lett., 1973, v.33, N 3, p.323-326.

42. Дудкин G.M., Карпейский М.Я., Сахаровский В.Г., Яковлев Г.И. О конформации активного центра рибонуклеазы А в растворе. -Докл.АН СССР, 1975, т.221, № 3, с.740-743.

43. Patel D.L., Canuel L.L., Bovey P.A., Reassignment of the active site histidines in ribonuclease A by selective deu-teration studies. Biopolymers, 1975, v.14, H 5, p.987-997.

44. Markley J.L. Correlation proton magnetic resonance studies at 250 MHz of bovine pancreatic ribonuclease. I.Reinvestigation of the peak assignments. Biochemistry, 1975, v.14, N 16, p.3546-3554.

45. Mighelsen C.,Beintema I.I. Proton nuclear magnetic resonance studies of histidine residues in rat and other rodent pancreatic ribonucleases. Effect of pH and inhibitors.

46. J.Mol.Biol., 1973, v.79, IT 1, p.25-38.1

47. Gorenstein D.G., Wyrwicz A. H Nuclear magnetic resonance study on the binding of cytidine monophosphate inhibitors to ribonuclease A. Biochemistry, 1974, v.13, N 18, p.3828 -3836.

48. Griffin J.H., Shechter A.IT., Cohen J.S. Nuclear magnetic resonance studies of a ribonuclease-dinucleoside phosphate complex and their implications for the mechanism of the enzyme. Ann.New York Acad.Sci., 1973, v.222, p.693-708.

49. Antonov I.Y., Gurevitch A.Z., Dudlcin S.M., Karpeisky M.Ya., Sakharovsky V.G., Yakovlev G.I. Complexes of ribonuclease A with 2'-deoxy-2'-fluororibose substrate analogues studied by nuclear magnetic гезопапсе. Eur.J.Biochem., 1978, v.87, IT 1, p.45-54.

50. Cu'Ilis P.M., Wolfenden R. Affinities of nucleic acid bases for solvent water. Biochemistry, 1981, v.20, N 11, p.3024 -3028.

51. Липкинд Г.И., Карпейский М.Я. Теоретический анализ связывания метильных производных урацила в контактном участке активного центра рибонуклеазыs . Мол.биология, 1976, т.10, № 2, с.395-403.

52. Buchner P., Blomberg P., Ruterjans H. lTitrogen-15 nuclear15magnetic resonance spectroscopy of "IT-labeled nucleotides.- In: Huclear magnetic resona.nce spectroscopy in molecular biology. Dordrecht, Holland: Publishing company, 1978, p. 53-70.

53. Letters R., Michelson A.M. Polynucleotides. Part III. Synthesis of some polyuridilic acid analogues and a survey of anhydride reagents. J.Chem.Soc., 1962, IT 1, p.71-78.

54. Антонов И.В., Карпейский М.Я., Падюкова Н.Ш., Яковлев Г .И., Сахаровский В.Г. Взаимодействие пиримидинспецифичной РНКазы А с пуриновыми нуклеотидами. Биоорг.химия, 1979, т.5, № 2, с.280-288.

55. Takahashi К. The amino acid sequence of ribonuclease T^. -J.Biol.Chem., 1965, v.240, II 10, p.4117-4119.

56. Takahashi K., Stein W.H., Moore S. The identification of a glutamic acid residue as part of the active site of ribonuclease T^. J.Biol.Chem., 1967, v.242, 11 20, p.4682-4690.

57. Takahashi K. The structure and function of ribonuclease T^. XI.Modification of the single arginine residue in ribonuclease T.j by phenylglyoxal and glyoxal. J.Biochem., 1970, v.68, N 5, p.659-664.

58. Takahashi K. Evidence for the implication of histidine-40 and 92 in the active site of ribonuclease T^. J.Biochem.,1973, v.74, H 6, p.1279-1282.

59. Takahashi K. The structure and function of ribonuclease T^. XXI.Modification of histidine residues in ribonuclease T^with iodoacetamide. J.Biochem., 1976, v.80, N б, р.12б7-1275.

60. Zabinsky M., Walz F.G.,Jr. Subsites and catalytic mechanism of ribonuclease T^: Kinetic studies using GpC and GpU as substrates. Arch.Biochem.Biophys., 1976, v.175, N 2, p. 558-564.

61. Osterman H.L., Walz F.G.,Jr. Subsites and catalytic mechanism of ribonuclease . Kinetic studies using GpA, GpC, GpG,and GpU as substrates. Biochemistry, 1978, v.17, N 20, p.4124-4130.

62. Osterman H.L., Walz P.G.,Jr. -Subsite interactions and ribonuclease T,| catalysis: Kinetic studies with ApGpC and ApGpU. Biochemistry, 1979, v.18, IT 10, p.1984-1988.

63. Whitefeld P.R., Witzel H. On the mechanism of action of Ta-kadiastase ribonuclease . Biochirn.Biophys.Acta, 1963, v. 72, IT 2, p.338-341.

64. Sato-Asano K., Fujii Y. Studies on ribonucleases in takadi-astase. IV.Action of ribonuclease on deamino-ribonucleic acid. J.Biochem., 1960, v.47, II 5, p.608-615.

65. Uchida Т., Egami P. Ribonuclease T^ digestion of deaminated polyribonucleotides and its applicability for nucleotide sequence analysis in polyribonucleotides. J.Biochem., 1965, v. 57, IT 6, p.742-750.

66. Irie S., Uchida Т., Egami P. Synthesis and ribonuclease degradation of dinucleoside monophosphates containing a thio-nucleoside.- Biochirn.Biophys.Acta, 1970, v.209, IT 2, p.289-295.

67. Staehelin Ы. On the specificity of RITAse T^. Biochirn.Biophys.Acta, 1964, v.87, И 3, p.493-495.-12078. Ucliida Т., Arima Т., Egami P. Specificity of RITase TJ£, J. Biochem., 1970, v.67, H 1, p.91-102.

68. Chang S.H., RajBhandary U.L. Studies on polynucleotides. L2XXI.Yeast phenylalanine transfer ribonucleic acid: partial digestion with pancreatic ribonuclease. J.Biol.Chem., 1968, v.243, И 3, p.592-597.

69. Reesse C.B., Sulston J.E. The methylation of guanylyl-(3'-5*)-uridine. - Biochim.Biophys.Acta, 1967, v.149, IT 1, p.293-295.

70. Hashimoto J., Uchida Т., Egami P. Action of ribonucleases T^,T2 and Ug on dinucleoside monophosphates containing 7-deazapurine base. Biochim.Biophys.Acta, 1970, v.199, IT 2, p.535-536.

71. Azegami Ы., Iwai K. Specific modification of nucleic acids and their constituents with trinitrophenyl group. J.Biochem. , 1964, v.55, IT 3, p.346-348.

72. Levin D.H. The polymerization of 8-azaguanosine 51-diphosphate by polynucleotide phosphorylase. Biochim.Biophys. Acta, 1962, v.61, IT 1, p.75-81.

73. Egami P., Oshima Т., Uchida T. Specificic interactions of base-specific nucleases with nucleosides and nucleotides. -Hoi.Biol.Biochem.Biophys., 1980, v.32, p.251-277.

74. Oshima Т., Imahori K. Difference spectral studies on the interaction between ribonuclease T^ and its substrate analogues. J.Biochem., 1971, v.69, IT 5, p.987-990.

75. Oshima Т., Imahori K. -A change in circular dichroism due to the binding of guanosine-31-phosphate to ribonuclease T^, J.Biochem., 1971, v.70, 11 1, p. 197-199.

76. Arata Y., Kimura S., Matsuo H., Narita K. Proton and phosphorus resonance studies of ribonuclease . Biochemistry, 1979, v. 18, II 1, p.18-24.

77. Карпейский М.Я., Яковлев Г.И., Ботт В., Ежов В.А., Приходь-ко А.Г. Исследование гуанилспецифичной рибонуклеазы из гриба Penicillium brevicompactum методом ЯМР. Биоорг.химия, 1981, т.7, № 9, с.I335-1347.

78. Безбородова С.И., Маркелова Н.Ю., Гуляева В.И. Специфичность внеклеточной щелочной РНКазы Penicillium chrysogenum 152 А.~ Биохимия, 1975, т.40, № 3, с.592-597.

79. Безбородова"С.И., Суходольская Г.В., Гуляева В.И., Ильина Т.В.,Внеклеточная щелочная рибонуклеаза. Прикл.биохимия и микробиология, 1974, т.10, № 3, с.432-437.

80. Aphanasenko G.A.Dudkih S.M., Kaminir L.B., Leshchinskaya I.В., Severin E.S. Primary structure of ribonuclease from Bacillus intermedius 7P. FEBS Lett., 1979, v.97, IT 1, p. 77-80.

81. Карпейский М.Я., Ханданян А.Ж., Чепурнова Н.К., Платонов

82. А.Л., Яковлев Г.И. Изучение субстратной специфичности и механизма действия рибонуклеазы Bacillus intermedius 7Р. -Биоорг.химия, 1981, т.7, № II, с.1669-1679.

83. Heinemann U., Saenger W. -Specific protein-nucleic acid recognition in ribonuclease T^-2'-guanylic acid complex: an X-ray study. Nature, 1982, v.299, IT 5878, p.27-31.

84. Безбородова С.И., Безбородов A.M. Внеклеточные рибонуклеазыв сравнительном аспекте. В кн.: Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз. М.: Наука, 1979, с.92-130.

85. Kaiser P.M. -Kinetishe untersuchungen zum reaktionmechanis-mus der ribonuclease Tg. Dissertat.,Marburg/Lahn, 1972.

86. Ivanova G.S., Holy A., Besborodova S.I. Substrate requirements of some microbial ribonucleases non-specific to natural bases .-Collect .Czech.Chem.Commun., 1974,v.39,1T4,P.993.

87. Shugar D. Ribonucleoside cyclic phosphates. In: Methods in enzymology. London: Acad. Press, 1967, v.12, part A, p. 131-137.

88. Kazimierczuk Z., Dudycz L., Stolarsky R., Shugar D. Preparation of 1- -D-arabinofuranosyl bensimidazole and its 5,6-dichloro derivative and the direct bromination of benzimi-dazole nucleosides. Z.Naturforsch., 1980, v.35c, IT 1/2,p.30-35.

89. Uiedballa U., Vorbruggen H. A general synthesis of U-gly-cosides. IV.Synthesis of nucleosides of hydroxy and merca-pto ll-heterocycles. J.Org.Chem., 1974, v.39, IT 25, p. 3668-3674.

90. Zemlicka J. Nucleic acid components and their analogues. CXXXII.Alkylation of some nucleic acid components and their analogues with dimethylformamide acetals. Collect.Czech. Chem.Commun., 1970, v.35, H 12, p.3572-3583.

91. Anderson D.G., Harames G.G., Walz E.G.,Jr. Binding of phosphate ligands to ribonuclease A.- Biochemistry, 1968, v.7, H 5, p.1637-1645.

92. Brown D.J., Hoerger H., Mason S.F. Simple pyrimidine. Part II. 1.Dihydro-1-methylpyrimidinec and the configuration of the N-methyluraciles. J.Chem.Soc., 1955, p.211-217.

93. Machuga E., Klapper M.H. -Catalytic activity of N carbo-xymethylhistidine-12 ribonuclease: pH dependence. - Biochim. Biophys.Acta, 1977, v.481, N 2, p.526-541.

94. Wu C.-W., Hammes G.G. Relaxation spectra of aspartate trans carbamylase. Interaction of the native enzyme with an adeno-sine-5'-triphosphate analog. — Biochemistry, 1972, v.12,1. 7, p. 1400-1408.

95. Edelhock H., Coleman J. The kinetics of the enzymatic hydrolysis of ribonucleic acid. J.Biol.Chem., 1956, v.219, IT 1, p.351-363.

96. НО. Корниш-Боуден Основы ферментативной кинетики. М.: Мир, 1978, с.232-253.

97. Peller L.,' Alberty R.A. Multiple intermediates in steady state enzyme kinetics. I.The mechanism involving a single substrate and product. J.Am.Chem.Soc., 1959, v.81, IT 22, p.5907-5914.

98. Cavalieri- L;-P. Studies on the structure of nucleic acids.

99. У11. On the identification of the isomeric cytidylic and adenylic acids. J.Am.Chem.Soc., 1953, v.75, IT 21, p.5268 -5270.

100. Сleiand W.W. Steady-state kinetics. Ins The Enzymes. 1T.Y.: Acad.Press, 1970, v.2, p.1-66.

101. Fersht A.R., Requena Y. Mechanism of the -chymotrypsincatalyzed hydrolysis of amides. pH-Dependence of k and К .с* in

102. Kinetic detection of an intermediate. J.Am.Chem.Soc., 1971, v.93, IT 25, p.7079-7087.

103. Renard M., Fersht A.R. Anomalous pH-dependance of k .j./Km in enzyme reactions. Rate constants for the association of chymotripsin with substrates. Biochemistry, 1973, v.12, IT 23, p.4713-4718.

104. Женодарова C.M., Хабарова М.И. Синтез динуклеозидмонофосфатов, катализируемый неспецифической рибонуклеазой Peniciilium brevicompactum. Биохимия, 1972, т.37, № 4, с.869-873.

105. Knorre D.G. Stepwise tRITA recognition mechanism and its kinetic consequences. FEBS Lett., 1975, v.58, IT 1, p.50-52.

106. Sigal I., Westheimer F.H. Phoophoranes as intermediates in the acid hydrolysis of acyclic phosphonates esters: evidence from oxygen exchange. J.A-m* Chem.Soc., 1979, v.101,1. 3, p.752-754.

107. Eckstein P., Shulz H.H., Ruterjans IT., Haar W., Maurer V/.

108. Stereochemistry of the transesterification step of ribonuclease T^. Biochemistry, 1972, v.11, Л 19, p.3507-3512.

109. Burgers P.M.J., Eckstein P. Diastereomers of 5'-0-adenosyl З'-O-uridyl phosphorothioate: chemical synthesis and enzymatic properties. Biochemistry, 1979, v.18, II 4, p.592-596.

110. Lindquist R.1T., Lynn J.L. , Leinhard G.E. Possible transition-state analogs for ribonuclease. The complexes of uridine with oxovanadium (IY) ion and vanadium (Y) ion. J.Am. Chem.Soc., 1973, v.95, N 26, p.8762-8768.

111. Abrash H.I., Cheung C.C.S., Davis J.C. The nonenzymic hydrolysis of nucleoside 2\ 3'-phosphates. Biochemistry,1967, v.6, Ы 5, p.1298-1303.

112. Wieker H.J., \7itzel H. Zum mechanismus der ribonuclease-reaktion. 3.Zuordnung der kinetischen parameter , , und interpretation von Km. Eur.J.Biochem., 1967, v.1,1. N 2, p.251-258.

113. Павловский А.Г., Падюкова Н.Ш., Карпейский М.Я. Структура кристаллических комплексов рибонуклеазы s с 8-замещёнными пуриновыми нуклеотидами. Докл.АН СССР, 1978, т.242, № 4, с.961-964.