Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование кинетики превращений ДНК под действием ДНК-топоизомераз и ДНК-абзимов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование кинетики превращений ДНК под действием ДНК-топоизомераз и ДНК-абзимов"

На правах рукописи

РГБ ОД

ФАВОРОВ Петр Владимирович 1 О Я Н В 2000

Исследование кинетики превращений ДНК под действием ДНК-топоизомераз и ДНК-абзимоз

(03.00.04 - биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1999

Работа выполнена в лаборатории химических основ биокатализа

о

Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Научный руководитель: ■

доктор химических наук, профессор А.Г. Габибов Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, чл.-корр. РАН. С.В. Разин доктор биологических наук А.И. Глухов

Ведущая организация:

Химический факультет МГУ им. Ломоносова

Защита состоится "_" _2000 г. в "__" ' часов на

заседании диссертационного совета Д.171.02.01. при Центре медико-биологических и экологических проблем по адресу: 113149, Москва, Симферопольский б-р., 8.

С диссертацией монсно ознакомиться в библиотеке Центра медико-биологических и экологических проблем.

Автореферат разослан "_"_ 1999 г.

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА кандидат биологических наук В.В. Отраднова

Актуальность темы и направленность исследования.

Различные превращения ДНК являются важнейшими процессами, обеспечивающими жизнедеятельность организма. Всестороннее исследование таких процессов не только проливает свет на нормальное функционирование клеточного аппарата, но и способно объяснить возникновение и механизм многих заболеваний.

Одним из относительно недавних открытий в этой области стало обнаружение антител, способных катализировать гидролиз ДНК. Изучение ДНК-гидролизующих антител является одной из интересных областей современной биохимии и иммунологии. Исследование каталитических свойств антител интересно как с точки зрения решения фундаментальных проблем биокатализа расшифровки механизмов катализа физиологически важных реакций, так и для прикладных разработок, направленных на создание новых устойчивых биокатализаторов, способных включать и выключать различные процессы метаболизма. Однако, роль природных каталитических антител в аутоиммунном процессе и механизмы, вызывающие продукцию этих антител, не определены. Одним из возможных путей возникновения таких антител может быть аутоиммунная реакция организма на ДНК-белковые комплексы, в которых ДНК находится в напряженной конформации, напоминающей конформацию переходного состояния реакции гидролиза фосфодиэфирной связи. Такие комплексы могут находиться, например, в составе ядерного матрикса - наиболее прочного ДНК-белкового ансамбля эукариотической клетки.

Огромное значение для развития биохимии и широкие перспективы в биомедицине имеет и изучение механизма действия ферментов топоизомеризации ДНК и их эффекторов. Так как эти ферменты обеспечивают в живой клетке упорядоченное хранение и нормальную передачу генетической информации следующим поколениям, понимание их функционирования очень важно для фундаментальной науки. Кроме того, уже сейчас селективное регулирование активности этих ферментов с помощью ингибиторов различного действия является одним из основных способов терапии раковых заболеваний. Разработка новых терапевтических препаратов этого рода идет по пути увеличения их лекарственного действия при снижении побочных эффектов. В настоящее время, подобные исследования в значительной степени задерживаются из-за отсутствия надежных количественных кинетических методов изучения катализируемых этими ферментами реакций.

Предложенная диссертация посвящена качественному и количественному изучению функциональных свойств поликлональных аутоантител к белковым компонентам ядерного матрикса и исследованию кинетических закономерностей действия топоизомераз I и II человека. Эти исследования проведены с применением нового метода исследования ферментативных превращений ДНК - анализа изменения сигнала линейного дихроизма (ЛД) ориентированной в

потоке ДНК. Диссертация затрагивает актуальную проблему путей

образования природных каталитических антител к ДНК. Также

рассмотрены некоторые новые аспекты механизма действия и

кинетики топоизомераз и их взаимодействия с физиологически

активными эффекторами.

Цели и задачи исследования

Целями настоящей диссертации являлись:

1. Проверка гипотезы о появлении ДНК-абзимов как аутоантител к устойчивым ДНК-белковым комплексам со стабилизированной деформированной конформацией ДНК, напоминающей конформацию переходного состояния гидролиза фосфодиэфирной связи, в частности , к комплексам ядерного матрикса.

2. Изучение кинетических аспектов механизма действия ферментов топоизомеризации ДНК человека.

Задачи исследования:

1. Исследование перекрестной специфичности ДНК-гидролизующих аутоантител к белкам ядерного матрикса и анализ цитотоксических свойств антител, связывающихся с белковыми компонентами ядерного матрикса.

2. Количественное сравнение каталитических свойств матрикс-связывающих и несвязывающих фракций поликлональных ДНК-гидролизующих аутоантител методом ЛД.

3. Отработка и применение метода ЛД для изучения механизма действия топоизомераз I и II человека.

4. Изучение взаимодействия топоизомераз I и II человека с физиологически активными эффекторами.

Научная новизна и практическая ценность работы

Впервые проведено комплексное исследование свойств фракций аутоантител, связывающихся с иммобилизованными белковыми компонентами ядерного матрикса. Обнаружена высокая ДНК-гидролизующая и цитотоксическая активность таких антител. Таким образом, получены первые экспериментальные подтверждения сформулированной нами гипотезы о механизме образования ДНК-абзимов в процессе развития аутоиммунных заболеваний как аутоантител к прочным ДНК-белковым комплексам со стабилизированной напряженной конформацией нуклеотидной цепи. С помощью метода измерения ЛД ДНК в потоке впервые выполнено количественное сравнение каталитических свойств ДНК-гидролизующих антител, связывающихся и не связывающихся с белкам ядерного матрикса. Полученные данные имеют существенное практическое значение для исследования патогенеза и терапии аутоиммунных заболеваний.

С использованием нового для этого круга задач метода ЛД впервые исследована непрерывная кинетика реакций, катализируемых ферментами топоизомеризации ДНК — топоизомеразами I и II

человека. Методом ЛД проведено исследование некоторых ранее неясных аспектов кинетики и механизма действия топоизомеразы I. Предложен новый подход к анализу взаимодействия топоизомераз I и II с ДНК в присутствии физиологически активных эффекторов. Этот подход может быть применен для целенаправленного поиска и совершенствования новых противоопухолевых препаратов.

Апробация работы

Основные положения и выводы, представленные в диссертационной работе, опубликованы и прошли апробацию в виде постерных сообщений и докладов на международных конференциях: на X Международном конгрессе иммунологов (Индия, Нью-Дели, 1998) и на II Международном конгрессе по аутоиммунности (Израиль, 1999). Результаты и обсуждение

1. Исследование функциональных свойств аутоантител, связывающихся с белковыми компонентами ядерного матрикса

Происхождение природных каталитических аутоантител пока не выяснено. Ранее в нашей лаборатории было высказано предположение, что подобные антитела могут образовываться как анти-идиотипы к ферментам, вовлеченным в метаболизм ДНК. Исходя из ' предварительных данных о перекрестной специфичности ДНК-гидролизующих антител к белкам ядерного матрикса было также выдвинуто предположение, что прочные ДНК-белковые комплексы, входящие в состав ядерного матрикса, могут служить природными аутоантигенами для ДНК-гидролизующих антител, также как и для ряда других ДНК-специфичных аутоантител. Известно, что ДНК, связанная с белками ядерного матрикса, находится в энергетически нестабильной конформации. ДНК-белковые комплексы, содержащие нуклеиновые кислоты в напряженном и энергетически нестабильном состоянии, могут быть наилучшими антигенами для образования соответствующих абзимов. Переход от связывания с подобными комплексами к гидролизу нативной ДНК может подчиняться так называемому механизму индуцированного соответствия ("induced fit"). Распространение механизма индуцированного соответствия на каталитические антитела позволило выдвинуть следующую гипотезу: связывание антитела с антигеном, в данном случае субстратом, происходит за счет конформационно доступных участков связывания антитела , однако в результате связывания происходит изменение конформации комплекса, и в этот процесс оказываются вовлечены и другие функциональные группы. Это не только повышает аффинность антитела к субстрату, но и потенциально может привести к появлению каталитических свойств. Антитела к ДНК, находящейся в энергетически дестабилизированной конформации в составе ядерного матрикса могут быть наиболее близки по структуре к "классическим" абзимам, образование которых индуцируется искусственно в ответ на аналоги переходного состояния ферментативной реакции. Очевидно, что период полураспада переходного состояния слишком краток для

индукции образования каталитических антител. Однако, антиген в энергетически невыгодной конформации . стабилизированной в составе ДНК-белкового комплекса, мо»сет существовать достаточно долго для того, чтобы спровоцировать образование каталитических антител.

1.1. Гидролиз ДНК под действием матрикс-связывающих аутоантител.

В соответствии с этой гипотезой, значительная доля ДНК-абзимов должна быть перекрестно специфична к белкам ядерного матрикса. Для проверки этого предположения освобожденные от ДНК белки ядерного матрикса. выделенные из клеток линии НЬ-60 были иммобилизованы на активированной СН-сефарозе. Для определения следовых количеств ДНК в составе сорбента, пробу сорбента инкубировали с а-[3-Р]с1АТР и остальными

дезоксинуклеозидтрифосфатами в присутствии фрагмента Кленова. Контролем служила аналогичная реакционная смесь, не содержащая фрагмента Кленова. Измерения показали, что степень включения метки составляет менее 0.011:, что свидетельствует об отсутствии связанных с аффинным сорбентом молекул ДНК. На приготовленную аффинную колонку наносили поликлональные ДНК-гидролизующие антитела, выделенные из сывороток крови больных СКВ и хроническим лпмфолейкозом. Элюция антител с колонки проводилась в стандартных условиях раствором глнцин-НС1 рН 2.6. элюат нейтрализовали до рН 7.6 раствором трис-основания. Далее, с использованием в качестве субстрата суперскрученной плазмидной ДНК, анализировали ДНК-гидролизующую активность исходного препарата ДНК-абзимов, а также фракций антител, связавшихся и не связавшихся с белками ядерного матрикса. Эксперименты проводились в условиях .линейной зависимости от времени и концентрации антител. Для четырех из пяти исследованных препаратов ДНК-абзимов было обнаружено, что ДНК-гидролизующие антитела эффективно связываются с белками ядерного матрикса. Типичные результаты эксперимента представлены на рис. 1.

Кольцевая ДНК -►

Линемная ДНК -►

Сунерекрученная ^

ДНК ^

1 2 3 4 5 Рис. 1. Электрофореграмма препарата плазмиды рВ1иеэспр1 после инкубации с антителами в течение 1 ч. Плазмиду (0.7 мкг) инкубировали с равными количествами (1 мкг) (1) антител, обладающих ДНК-гидролизующей активностью (исходный препарат); (2) антител, не связавшихся с колонкой с иммобилизованными белками ядерного матрикса; (3) антител, связавшихся с белками ядерного матрикса; (4,5) без антител, в присутствии реакционного буфера.

Видно, что фракция антител, связавшихся с сорбентом обогащена по ДНК-гидролизующей активности по сравнению с исходным препаратом. Присутствие ДНК-гидролизующих антител во фракции, не связавшейся с сорбентом, может отражать наличие ДНК-абзимов, образовывающихся по иным механизмам, чем предложенный выше, например , как анти-идиотипы к ДНК-гидролизующим ферментам. Кроме того, в эту фракцию могут попасть определенные ДНК-абзимы, связывающиеся с белками ядерного матрикса, но специфичные к конформационным эпитопам, которые разрушаются при приготовлении хроматографического сорбента (удаление ДНК, денатурация белков додецилсульфатом натрия, ковалентное связывание с сефарозой).

Полученные данные согласуются с гипотезой о формировании значительной доли ДНК-абзимов как антител к сложным и относительно стабильным комплексам, удерживающим антиген-субстрат в энергетически дестабилизированном состоянии. Поскольку подобные ДНК-гидролизующие антитела были обнаружены нами в сыворотках крови больных как системной красной волчанкой, так и хронической лимфоидной лейкемией, можно предположить сходные механизмы образования каталитических антител при этих заболеваниях. Выделение индивидуальных белков ядерного матрикса, связывающихся с ДНК-гидролизующими аутоантителами, послужит дальнейшим доказательством существования предложенного механизма образования каталитических антител при аутоиммунных нарушениях.

1.2 Цитотоксическое действие матрикс-связывающих аутоантител.

Патогенная роль аутоантител к ДНК является предметом многих исследований. Известно, что наряду с образованием иммунных комплексов, наличие которых в крови провоцирует развитие нефрита при волчанке, аутоантитела к ДНК оказываются токсичными для первичных культур лимфоцитов. С другой стороны, известно, что спонтанное появление каталитических антител в организме тесно связано с аутоиммунными нарушениями. Возможные механизмы патогенности каталитических антител на данный момент неизвестны. Очевидно, что если протеолитические антитела могут обнаруживать свой патогенный эффект вне зависимости от места их локализации, то ДНК-гидролизующие антитела , прежде чем вызвать разрушение ДНК, должны попасть в ядро. Последнее не представляется невозможным, если принять во внимание растущее количество данных о проникновении антител в живую клетку с последующей ядерной локализацией. Примечательно, что хотя в большинстве случаев антитела, способные к проникновению в живую клетку, специфичны к ДНК или малым ядерным рибонуклеопротеидам, то есть к ядерным антигенам, в процессе проникновения в клетку на первом этапе происходит связывание антител с некоторыми белками клеточной мембраны. Таким образом, можно предположить и другой механизм

патогенного воздействия антител на клетку: связывание антител к ДНК с мембранными рецепторами и индукция клеточной смерти (апоптоза) через пути сигнальной трансдукции.

В нашей лаборатории была исследована цитотоксичность ДНК-связывающих антител , полученных из сывороток крови больных различными аутоиммунными и лимфопролиферативными заболеваниями. ДНК-связывающие аутоиммунных больных

проявляли цитотоксический эффект в концентрациях до Ю~10 М, причем наблюдалась корреляция величины цитотоксического эффекта препарата антител и величины ДНК-гидролизующей активности этого препарата. В связи с выявленной корреляцией между наличием цитотоксических и ДНК-гидролизующих свойств антител было интересно исследовать цитотоксический эффект фракций антител, связывающихся с иммобилизованными белками ядерного матрикса. Была исследована цитотоксичность антител, связывающих и несвязывающих белки ядерного матрикса из сыворотки крови больного СКВ. Концентрация в культуральной среде составляла 10"8М. Для сравнения определяли цитотоксический эффект равных количеств ДНК-связывающих и несвязывающих антител из сыворотки крови того же больного, полученных фракционированием на колонке с иммобилизованной ДНК. Эксперимент проводился на клетках НЬ-60 (промиелоциты человека), количество мертвых клеток оценивалось после 48 часов инкубации с антителами по МТТ-тесту (спектроскоскопическое определение количества формазана, образовавшегося из 3(4,э-диметилтиазол-2ил)2,5-дифенилтетразолиума бромида (МТТ) ). Результаты этого опыта представлены на рис. 2.

30

%

25 20 15 10 5 0

1 2 3 4 5 6

Рис. 2. Цитотоксичность антител, связывающихся с белками ядерного матрикса. Ось ординат показывает процент мертвых клеток. Клетки HL-60 инкубировались в течение 48 часов без антител (1); в присутствии 10"8М антител пациента с СКВ , не связывающихся (2) и связывающихся (3) с белками ядерного матрикса; 10"8М антител пациента с СКВ не связывающихся (4) и связывающихся (5) с ДНК; 10"8М антитела IPO-4 (апоптоз-индуцирующее антитело к Fas рецептору) (6).

Количество мертвых клеток после инкубации с антителами, связывающимися с белками ядерного составило 25% (3), что даже несколько больше, чем у антител, связывающихся с ДНК (20% мертвых клеток, 5). В то же время, цитотоксичность несвязывающейся с ДНК (4) и несвязывающейся с белками ядерного матрикса (2) фракций антител лежала в пределах ошибки эксперимента. Таким образом, можно констатировать локализацию цитотоксической активности аутоантител во фракции, связывающейся с белковыми -компонентами ядерного матрикса. В качестве положительного контроля, позволяющего оценить значимость наблюдаемого эффекта, было использовано ионоклональное антитело IPO-4, цитотоксический эффект которого обусловлен взаимодействием с Fas рецептором. В результате инкубации с равным количеством этого антитела в тех же условиях было обнаружено 23% мертвых клеток (6). Тот факт, что цитотоксический эффект поликлонального препарата антител, связывающихся с белками ядерного матрикса, оказался сопоставим с цитотоксическим эффектом моноклонального антитела к Fas рецептору дает представление о роли таких свойств антител а патогенезе аутоиммунных заболеваний.

Дальнейшее исследование свойств поликлональных аутоантител к белкам ядерного матрикса , проведенное в этой работе, включает изучение кинетики гидролиза ДНК ДНК-абзимами, имеющими и не имеющими кросс-реактивность с компонентами ядерного матрикса. Как будет обосновано ниже, это исследование, наряду с исследованием кинетики ферментативной топоизомеризации ДНК, проводилось методом измерения ЛД в потоке. Возможность применения этого метода к указанному кругу задач и результаты исследований приводятся в следующем разделе.

2. Кинетические исследования взаимодействия ДНК-абзимов и ДНК-топоизомераз с ДНК методом измерения линейного дихроизма в потоке.

Основная проблема, встающая при исследовании таких реакций метаболизма ДНК, как неспецифический или специфический гидролиз, лигирование или топоизомеризация, заключается в неотличимости большинства физико-химических свойств продуктов реакции и исходных веществ. Это прежде всего касается традиционных спектроскопических методов, совершенно не применимых для наблюдения за ходом таких реакций. Обычно для исследования топологических переходов в ДНК, вызванных действием различных биокатализаторов, используют электрофоретический анализ проб, взятых из реакционной смеси по мере прохождения реакции. Метод этот весьма универсален, но довольно трудоемок, особенно если необходимо получить серию кинетических кривых. Основным недостатком этого метода является невозможность наблюдать непрерывную кинетику процесса, что бывает необходимо при изучении механизма реакций. Наряду с электрофорезом , для исследования этих реакций применялись и другие методы (электронная микроскопия, сопряженные реакции, использование модельных субстратов). Однако, все эти методы имеют существенные ограничения и показательно, что ни один из них широкого применения не нашел.

Единственным методом, позволяющим изучать непрерывную кинетику процесса изменений в ДНК, является предложенный нами для этих целей метод линейного дихроизма (ЛД) ДНК в потоке. Этот метод позволяет непрерывно следить за протеканием любой реакции, в ходе которой изменяется топология ДНК.

2.1 Линейный дихроизм и топология ДНК

Как известно, анизотропные макромолекулы, например молекулы ДНК, в условиях, когда они ориентированы, представляют собой ансамбль хромофоров, средний дипольный момент перехода которых с осью ориентации <<х>- оптический фактор - отличен от нуля. В этом случае свет, поляризованный параллельно и перпендикулярно оси ориентации макромолекул, будет поглощаться по-разному:

ДА = А. -А1_ Ф 0,

где А\ \ и Лх - поглощение света, поляризованного соответственно параллельно и перпендикулярно оси ориентации макромолекул. Способность вещества по-разному взаимодействовать с параллельно и перпендикулярно поляризованным светом называется линейным дихроизмом. Приведенная величина ЛД ( р) определяется соотношением:

р = ДА/А = 1,5 3<соэ2 а> - 1), где А - суммарная оптическая плотность образца, 5 - степень ориентации макромолекул, а <соз2 а> - среднее по ансамблю значение

квадрата косинуса а. Таким образом, величина р должна существенным образом зависеть от общей геометрической формы макромолекулы, непосредственно - через 51, степень ориентированности, определяемую гидродинамикой и гибкостью ДНК, и косвенно - через <соэ2 а> - величину, отражающую усредненные особенности вторичной структуры данной молекулы. Для полностью ориентированной линейной ДНК в В-форме ( а=83°), значение р составляет 1,43.

Для исследования кинетики изменений топологии нужно было выбрать такой тип молекул ДНК, который мог бы существовать в нескольких топологических формах, причем таких, которые не могли бы самопроизвольно переходить друг в друга и характеризовались бы существенно различными значениями р . Наиболее распространенным, простым и удобным субстратом такого типа является кольцевая плазмидная ДНК, не содержащая разрывов ни в одной из цепей. Важнейший параметр такой ДНК - порядок зацепления Ь Это целочисленная величина, обозначающая количество оборотов одной из полинуклеотидных цепей относительно другой, когда ДНК находится в конформации, соответствующей плоскому кольцу.

где Т„, (кручение) - число витков двойной спирали в данном конформере, а XV г ("райзинг") определяет количество витков суперспирали. Мы будем также пользоваться величиной плотности суперспирализации

о = У?г/Ък ,

которая отражает линейную плотность супервитков и не зависит от длины ДНК.

Мы провели измерения зависимости сигнала ЛД от а для нескольких препаратов различных плазмидных ДНК, которые предполагали использовать далее в качестве субстратов для интересующих нас биокатализаторов. Для раскручивания двойной спирали был использован традиционный интеркалирующий агент - бромистый этидий. Результаты измерений показаны на рис. 3. Величина линейного дихроизма представлена как относительная величина ротн , если за ротн=0 принять сигнал ЛД реакционного буфера (зависящий от многих условий, постоянных, однако, в ходе одного эксперимента), а за ротн=1 - сигнал ЛД исходного препарата данной плазмиды. При значениях с, близких по модулю к 0, наблюдалась колоколообразная зависимость Ротн(°). чт0 можно объяснить уменьшением величины Б при сверхспирализации ДНК и монотонным изменением оптического фактора <о> в этой области. С дальнейшим увеличением плотности отрицательной сверхспирализации р^д вновь повышается. Причиной обнаруженного эффекта, вероятно, является то, что при больших отрицательных значениях а ДНК претерпевает различные конформационные переходы, связанные с резкими изменениями <а> и Б.

СУ

Рис. 3. Зависимость величины сигнала ротн от плотности сверхспирализации (а) для плазмид pUC 19, pBluescript, рТМ. Плазмиды титровали 200 цМ раствором бромистого этидия и значения о рассчитывали, принимая значение угла раскрутки для бромистого этидия 26°.

Так или иначе, обнаруженная нами немонотонность зависимости значения рот с заставляет относиться к вопросу об использовании метода ЛД взвешенно. Тем не менее, мы сочли возможным взять некоторые из исследованных плазмид для нашей работы, и даже использовали факт немонотонности.

Можно выделить два крайних типа процесса релаксации суперскрученной ДНК. При первом исходный топоизомер (или семейство топоизомеров) с известным числом супервитков и, следовательно, обладающее известным начальным < р> (рнач) > переходит в другое состояние (или семейство состояний), для которых также существует фиксированное значение ркон , причем сам переход осуществляется настолько быстро, что молекулы в промежуточном состоянии находятся в слишком малой концентрации для того, чтобы внести заметный вклад в измеряемый сигнал. Тогда зависимость р от времени будет иметь простой вид:

p(t)=(l-X)pKa4+ X ркон ,

где X - степень конверсии. Тогда, нет необходимости знать весь спектр значений р. Такой случай имеет место, например, когда топоизомеризация происходит путем необратимого разрыва цепи ДНК под действием тех или иных эндонуклеаз.

Во втором случае каждая молекула ДНК проходит весь спектр значений суперспирализации от максимальной до равновесной. При этом сигнал ЛД зависит как от вида зависимости р(ст), так и от значения функции распределения ДНК по топоизомерам Sn(t), где Sn концентрация n-ного топоизомера в данный момент времени:

p(t) =Е Sn(t)p(n)

Ясно, что такая зависимость p(t) может быть весьма сложной. Вопрос о виде этой зависимости будет рассмотрен в связи с исследованием кинетики топоизомеризации ДНК.

2.2 Изучение кинетики гидролиза ДНК, катализируемого аутоантителами, связывающимися с белковыми компонентами ядерного матрикса.

Чтобы оценить применимость метода ЛД для исследования кинетических параметров ферментативного гидролиза ДНК мы выбрали два хорошо изученных фермента с различными механизмами действия, эндонуклеазу рестрикции EcoRI и ДНКазу I, и сравнили результаты, получаемые методом ЛД, с литературными данными. В качестве субстрата для этих экспериментов мы выбрали плазмиду рТМ, которая характеризуется наибольшей амплитудой изменения р в зависимости от ст, что обеспечивает относительно малую инструментальную погрешность измерений. Предварительно было измерено соотношение величин ЛД для линейной, кольцевой и суперспирализованных форм плазмиды рТМ. Оно составило 1,2:1,45:1. Полученное соотношение было использовано при интерпретации полученных данных.

Типичные кривые зависимости ротн от времени для EcoRI и ДНКазы I приведены на рис. 4. Можно видеть, как разница в механизме протекания реакции отражается на ходе временной зависимости p(t). Эндонуклеаза рестрикции вносит в субстрат единичный двухцепочечный разрыв, переводя плазмиду из суперскрученной сразу в линейную форму, что соответствует монотонному увеличению сигнала ЛД с выходом на плато по мере исчезновения негидролизованного субстрата. Напротив, ДНКаза I производит множественные одноцепочечные разрывы, переводя

сверхспирализованную плазмиду сначала в кольцевую, затем, по мере их накопления, в линейную форму, и, наконец, в смесь фрагментов ДНК уменьшающейся длины. Так как нас интересует кинетика внесения первого одноцепочечного разрыва в сверхспирализованную плазмиду, мы будем использовать лишь начальный участок этой кривой. Анализ зависимостей начальных скоростей V0 от концентрации субстрата [рТМ]0 дал следующие значения Кткаж и ккат: (3,8 ±0,3) -10"5М и (2,2+0,2)-105 min"1 для ДНКазы I, (3,9 ±0,4)-10-эМ и (10,0±0,6) min-1 для EcoRI. Полученные значения Кткаж и kKaT хорошо согласуются с литературными данными (соответственно 2,5 -10"5М и 1,0 -105 min-1 для ДНКазы I, 5,5 -10"9M и 14,0 min"1 для EcoRI).

1,5

Ротн

0,5

1.0

-ДНКаза 1

— ЕсоШ

0

60

о

20 40

время , мин

Рис. 4. Зависимость сигнала ЛД суперскрученной плазмиды рТМ от времени инкубации с рестриктазой ЕсоШ и ДНказой I при 25 °С. Реакционная смесь объемом 220 мкл содержит 5 мкг плазмиды рТМ, 50 мМ Трис-НС1 рН 8,0, 10 мМ Г^СЬ. и 30 ед. ЕсоШ или 1-Ю'2 нг ДНказы I.

Таким образом, метод ЛД дал результаты, вполне согласующиеся с результатами , полученными другими методами, что позволило использовать его для изучения кинетики реакций, катализируемых ДНК-абзимами.

Сравнительное изучение изменения сигнала ЛД при добавлении к суперскрученной ДНК каталитически активных препаратов антител и их РаЬ-фрагментов выявило существенное различие во взаимодействии этих белков с ДНК. Добавление ЕаЬ-фрагментов первого в реакционную смесь вызывало лишь незначительное изменение сигнала ЛД, тогда как добавление антитела приводило к резкому падению р вплоть до изменения знака. Этот эффект не наблюдался больше ни для одного из исследованных ферментов, и мы объясняем его присутствием в антителе двух центров связывания ДНК, что может приводить к образованию иммунных комплексов, физические свойства ДНК в которых сильно изменены. В следующих экспериментах мы использовали только ГаЬ-фрагменты. Типичные кривые зависимости р суперспирализованной плазмиды рТМ от времени инкубации с каталитическими РаЬ-фрагментами, полученными из фракций аутоантител, связывающихся и не связывающихся с иммобилизованными белками ядерного матрикса, приведены на рис. 5. Кривые имеют такой же вид, как и в случае ДНКазы I и могут быть интерпретированы сходным образом.

плазмиды рТМ с КаЬ-фрагментами, полученными из ДНК-гидролизующих антител, связавшихся (1) и не связавшихся (2) с иммобилизованными белками ядерного матрикса.. Реакционная смесь объемом 220 мкл. содержит 5 мкг плазмиды рТМ, 10 мкг ГаЬ-фрагментов , 50 мМ Трис-НС1 рН 8,0, 10 мМ МяС12.

Значения Кткаж и ккат, определенные по зависимости угла наклона начального линейного участка кривой рО:) от концентрации ДНК по методу Лайнуивера-Берка представлены в таблице 1.

Таблица 1

Fab-фрэгменты антител, связывающихся с матриксом ГаЬ-фрагменты антител, не связывающихся с матриксом

кткаж, м (4,9 +0,3)-10"8 (4,3+0,4) -Ю"8

ккат, мин"1 35,2+3,0 14,0±1,6

Низкие значения Кткаж при сравнительно невысоких к.

свидетельствуют о прочном связывании антител с антигеном и предполагают неоптимальную структуру каталитического центра абзима, возникшего в результате случайной комбинации аминокислотных остатков. В то же время значения ккат для РаЬ-фрагментов антител, связывающихся с белками ядерного матрикса достоверно выше, чем для несвязывающихся. Этот результат хорошо согласуется с данными, приведенными в разделе 1.1 (рис. 1) и количественно описывает корреляцию между ДНК-гидролизующей активностью антител и их способностью связываться с белковыми компонентами ядерного матрикса. В то же время, величина Кткаж, характеризующая сродство антител к ДНК, практически одинакова для обеих фракций. Этот факт подтверждает полное удаление ДНК из препарата ядерного матрикса, подвергнутого иммобилизации. Наблюдаемые закономерности трудно объяснить иначе, как образованием ДНК-абзимов (по крайней мере, их части) как аутоантител к устойчивым ДНК-белковым комплексам ядерного матрикса.

Необходимо отметить, что в этих экспериментах был использован поликлональный препарат антител, и оценка реальной концентрации каталитически активных антител не представляется возможной. Таким образом, величина ккат для моноклональных ДНК-абзимов может быть значительно выше, что, впрочем, никак не влияет на достоверность сделанного вывода.

2.3 Исследование кинетики топоизомеризации плазмидной ДНК эукариотическими топоизомеразами I и II.

Исходя из имеющихся сведений о механизме действия топоизомераз, включающем образование нековалентных и ковалентных фермент-субстратных комплексов, внесение в молекулу ДНК одноцепочечных (топоизизомераза I) и двухцепочечных (топоизомераза II) разрывов и др., следует ожидать, что функция распределения ДНК по различным топологическим состояниям в процессе этих реакции может иметь довольно сложный вид.

Основной вопрос , касающийся механизма действия топоизомеразы I, состоит в том, может ли ДНК после того, как фермент осуществил одноцепочечный разрыв, сделать больше одного оборота (т.е. может ли число зацеплений в молекуле ДНК измениться больше, чем на 1) до того, как произойдет обратное лигирование. Одна из теорий предполагает постадийную релаксацию по схеме "расщепление-оборот-лигирование" (механизм А). Альтернативный механизм, в соответствии с которым всякий ковалентный комплекс, релаксировав на один виток, может релаксировать и дальше, т.е. процессы топоизомеризации и лигирования протекают параллельно , а не последовательно, носит название механизма "молекулярного шарнира" (механизм Б).

Рассмотрим протекание реакции при условии , что скорость релаксации ДНК в составе ковалентного комплекса с топоизомеразой I много больше скорости лигирования одноцепочечного разрыва. Так как скорость релаксации экспоненциально зависит от степени сверхспирализации субстрата, такое соотношение скоростей имеет место при взаимодействии фермента с молекулой ДНК с высоким значением <т. При протекании реакции по механизму А скорость-определяющей стадией процесса будет лигирование. Напротив, если действует механизм Б, то ДНК в составе ковалентного фермент-субстратного комплекса с гораздо большей вероятностью может претерпевать дальнейшую топоизомеризацию, чем лигирование В результате в реакционной смеси будут присутствовать в основном лишь два семейства топоизомеров - исходная сверхспирализованная плазмида и смесь продуктов с числом зацеплений, близким к равновесному. Наблюдаемая картина будет в этом случае напоминать начальную стадию действия эндонуклеазы.

Если скорость релаксации меньше скорости лигирования, то каждый акт топоизомеризации протекает в основном через стадии разрыва-

лигирования, и оба комплекса - ковалентный и нековалентный -находятся в быстро устанавливающемся равновесии. Если диссоциация данного топоизомера от фермента протекает при этом быстрее его топоизомеризации, то реакция протекает дистрибутивно, если справедливо обратное - процессивно. При этом, вне зависимости от того, какой из двух механизмов - А (постадийной релаксации) или Б («молекулярного шарнира») имеет место, процесс будет происходить практически одинаково. Заметим, что при этом любая молекула ДНК в системе должна последовательно пройти все этапы топоизомеризации. Последнее утверждение относится и к процессу топоизомеризации под действием эукариотической топоизомеразы И. Механизм действия этого фермента, в отличии от топоизомеразы I, не вызывает дискуссий. В то же время, кинетический анализ в этом случае представляется еще более сложным. Это объясняется, прежде всего, наличием двух последовательно связываемых субстратных сегментов ДНК и сопряженной реакции гидролиза АТР.

2.3.1. Экспериментальное исследование непрерывной кинетики реакции релаксации плазмидной ДНК под действием топоизомераз I и II человека методом ЛД.

1,81

О 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Время, сек.

Рис 6. Зависимость рот,, от времени при инкубации суперскрученных плазмид: рТМ (5 мкг) (кривые 1, 3) и pUC19 (8 мкг) (кривые 2, 4) с 0,45 мкг топоизомеразы I (1, 2) и с 4 ед. топоизомеразы II (3, 4) в стандартных условиях (20 mM Tris-HCl (рН 7,5), 100 тМ NaCl, 0,5 тМ ЭДТА и 75мкг/мкл ВСА, 25°С для топоизомеразы I и 50 mM Tris-HCL (рН 8,0), 120 тМ КС1, 10 тМ MgCl2, 0,5 тМ АТР, 0,5 тМ DTT и 30 мкг/мкл БСА, 25 °С для топоизомеразы II). Во врезках показаны результаты электрофоретического разделения ДНК pUC19 из проб, отобранных при снятии кривых 2 и 4 в указанные моменты времени.

На рис. 6 приведены типичные зависимости p(t), полученные при инкубации препаратов плазмид pUC19 и рТМ с топоизомеразами I и II, а также результаты электрофоретического разделения ДНК pUC19 из проб реакционных смесей, отобранных в указанные моменты

времени. При сравнении этих данных с результатами титрования тех же плазмид раствором бромистого этидия (рис. 3) видно, что если в случае топоизомеразы II (3, 4) переход от начального к конечному распределению топоизомеров идет через многочисленные

промежуточные состояния, то для топоизомеразы I (1, 2) ни на электрофорезе, ни методом ЛД не удается зарегистрировать топоизомеры, отличные от исходного препарата и конечного равновесного набора продуктов. Так как в условиях этого эксперимента (ЮОтМ ЫаС1) диссоциация нековалентного комплекса топоизомеразы I с ДНК идет довольно быстро, а субстрат находится в значительном избытке, подобные результаты не согласуются с протеканием реакции по механизму А. Дополнительным свидетельством неприменимости механизма А является тот факт , что релаксацию плазмиды рВ1иезспр1 (см. кривую ротн(а) на рис 3.) под действием топоизомеразы I вообще не удается наблюдать методом ЛД, тогда как электрофорезом регистрируется нормальная топоизомеризация (не показ.). В соответствии с ходом кинетических кривых, для дальнейшего исследования топоизомеразы I была использована плазмида рТМ, дающая большую амплитуду изменения сигнала ЛД при переходе от суперскрученной к релаксированной форме, а для исследования топоизомеразы II - плазмида риС19, кривая титрования которой имеет более протяженный начальный участок монотонной зависимости Ротн(а)-

На рис. 7 показана зависимость вида кинетических кривых от количества фермента. Для топоизомеразы I (кривые 4-6) зависимость Ротн(') прекрасно аппроксимируется экспоненциальной функцией, что проиллюстрировано полулогарифмическими анаморфозами во врезке. Этот факт дает нам возможность использовать экспоненциальный множитель к' как эффективную константу скорости - относительную характеристику скорости протекания топоизомеризации, катализируемой этим ферментом.

Для топоизомеразы II (кривые 1-3) кинетическая кривая носит сложный нелинейный характер, зависящий и от хода топоизомеризации, и от вида зависимости р (с) для данного препарата плазмиды, выявляемого по кривой титрования бромистым этидием. Интересно отметить, что с уменьшением соотношения фермент/субстрат локальный минимум кривой ротн(1) становится все менее выраженным и что этот минимум не достигает значения рт;п(ст). Этот факт свидетельствует о несогласованном характере топоизомеризации , связанном, вероятно, с тем , что в стандартных условиях связавшаяся с первым сегментом ДНК молекула фермента продолжает снимать сверхвитки на этой же молекуле ДНК, не переходя на другие. Таким образом, это наблюдение можно считать аргументом в пользу процессивного характера действия топоизомеразы II.

Далее, так как для топоизомеразы I мы обнаружили возможность использовать величину к' для характеристики протекания реакции, мы приступили к количественному исследованию кинетики реакции топоизомеразы I методом ЛД.

Время, сек.

Рис. 7. Зависимость сигнала ЛД от времени при различных количествах фермента: 4, 2.5 и 1.5 ед. топоизомеразы II и 8 мкг. плазмиды риС19 (1-3); 0.45 ,0.3 и 0.15 мкг топоизомеразы I и 5 мкг. плазмиды рТМ (4-6). Во врезке показаны полулогарифмические анаморфозы для кривых 4,5,6.

2.3.2. Изучение механизма действия топоизомеразы I методом ЛД. а. Изучение зависимости сродства топоизомеразы I к субстрату от топологического состояния и особенностей нуклеотидной последовательности молекулы ДНК

Неизменность сигнала ЛД при релаксации плазмиды рВ1иеБспр1 под действием топоизомеразы I дало нам возможность провести прямые эксперименты по определению относительного сродства топоизомеразы I к различным плазмидам и их топологическим формам.

Мы исследовали релаксацию плазмиды рТМ в присутствии сверхспирализованной или релаксированной форм плазмиды рВ1иеэспр1;. В первом случае обе плазмиды должны топоизомеризоваться параллельно, т.е. конкурировать за фермент, причем экспериментально мы будем наблюдать лишь релаксацию рТМ. Изменение скорости нарастания сигнала ЛД плазмиды рТМ во втором случае по сравнению с первым, свидетельствовало бы о различия в способности конкурентно ингибировать реакцию топоизомеризации рТМ между двумя формами рВ1иеБспр1:, то есть о различном сродстве этих форм к ферменту.

Рис. 8. Зависимость константы скорости (среднее из 3 измерений) реакции топоизомеризации сверхспирализованной плазмиды рТМ под действием топоизомеразы I от концентрации релаксированной и сверхспирализованной плазмиды рБ1иезспр1. Соотношение плазмид дано по массе.

В обеих сериях экспериментов, когда топоизомеризация рТМ проводилась в присутствии возрастающих концентраций релаксированной или сверхспирализованной форм рВ1иезспр1;, наблюдалось понижение к' с ростом соотношения рВ1иезспр1]/рТМ (по массе) (рис. 8). Величина этого соотношения в условиях, когда к' падает в два раза по сравнению с контролем (А1/2) , в обоих случаях оказалась одинаковой и составляла 5 ±1, что свидетельствует об одинаковом сродстве топоизомеразы I к ДНК рВ1иеэспр1 различной топологии. Тот факт, что А отлично от единицы, указывает на меньшее сродство к топоизомеразе I ДНК рВ1иеБСПр1 по сравнению с рТМ. Вероятно, это связано с наличием в рТМ протяженной вставки, содержащей фрагмент генома микоплазмы, который обладает весьма специфическими свойствами и содержит участок АТ-изломов -последовательность предпочтительного связывания топоизомеразы I.

б. Зависимость скорости релаксации плазмиды под действием топоизомеразы I от соотношения количеств фермента и субстрата в реакционной смеси.

Стандартной процедурой определения константы, характеризующей стабильность фермент-субстратного комплекса, является анализ зависимости стационарной скорости ферментативной реакции от соотношения субстрат-фермент. Хотя при исследовании реакции, катализируемой топоизомеразой I, не удается найти какой-либо параметр реакционной смеси, для которого существует достаточно протяженный стационарный участок, мы провели исследование зависимости к' от соотношения фермент/субстрат (Е/Б).

Полученная зависимость приведена на рис. 9. Видно, что со снижением E/S наблюдается падение к'. Возможное объяснение этому факту состоит в том, что фермент способен одинаково прочно связываться с ДНК как в сверхспирализованном, так и в в релаксированном состоянии, и, по мере протекания процесса релаксации, он перераспределяется между субстратом и продуктом, что приводит к снижению его эффективной концентрации.

Вывод, который можно сделать из данных рис. 8 и 9, а именно, что топоизомераза I примерно одинаково связывается с ДНК любой топологии, противоречит выводам, сделанным ранее на основании определения Км. Однако, константа Михаэлиса фермента близка по значению с константой диссоциации (К □) фермент-субстратного комплекса только в том случае, когда диссоциация является основным путем его израсходования, а для топоизомераз это условие не выполняется. В случае, например, хорошо изученной топоизомеразы I из vaccinia virus константа скорости диссоциации кц=0,008 с*1, а константа скорости гидролиза фосфодиэфирной связи кс1=0,07 с-1. Это значит, что когда после разрыва одной из цепей ДНК топоизомеризация протекает быстро (сильно напряженная ДНК), основным процессом израсходования фермент-субстратного комплекса становится не диссоциация, а топоизомеризация.

0,04

0,03

к",с"1

0,02

0,01

0

0,01 0,1 1

E/S

Рис. 9. Зависимость эффективной константы скорости топоизомеризации плазмиды рТМ под действием топоизомеразы I от соотношения "фермент-субстрат".

Фактически это означает, что, как мы уже указывали, топоизомераза I, связавшись с сильно сверхспирализованной ДНК, практически не диссоциирует, пока не снимет большую часть сверхвитков, т.е. это связывание практически необратимо. Однако, при этом сродство фермента к сверхспирализованной и релаксированной ДНК может быть неизменным, что и доказывают наши результаты.

5

в. Влияние йодной силы на процесс релаксации ДНК под действием топоизомеразы I.

Результаты серии экспериментов, описывающих влияние ионной силы на кинетику реакции, катализируемой топоизомеразой I, приведены на рис. 10.

Рис. 10. Зависимость сигнала ЛД от времени при релаксации 5 мкг плазмиды рТМ под действием 0.45 мкг топоизомеразы I от концентрации NaCl. Кривые сверху вниз соответствуют 225, 200, 150, 100, 75, 50, 40, 30, 20 мМ NaCl в реакционной среде. Во врезке показаны полулогарифмические анаморфозы кривых для проб с содержанием 20 (светлые прямоугольники), 100 (темные точки), 225 (светлые точки) мМ NaCl.

Видно, что при высокой концентрации NaCl равновесное значение сигнала ЛД рравн . соответствующее выходу кинетической кривой на плато, близко к сигналу ЛД релаксированной формы плазмиды рТМ, а при низкой ионной силе рравн много ниже, что можно объяснить неспособностью топоизомеразы I диссоциировать от первоначально связанной молекулы субстрата в этих условиях. Из врезки на рис. 10 видно также, что при понижении ионной силы полулогарифмические анаморфозы этих кривых разбиваются на два линейных участка, характеризующихся значениями kj' (начальный участок) и к2' (второй участок). При концентрации NaCl более 100 мМ полулогарифмическая анаморфоза кривой линейна и может быть описана лишь одной эффективной константой скорости кг'-

0,25

0,2

0,15

к', с1

0,1

0,05

0

О 50 Ю0 150 200 250

№С1, тМ

Рис. 11. Зависимость констант скоростей релаксации плазмиды рТМ под действием топоизомеразы I к'] (светлые точки) и к'г (темные прямоугольники) от концентрации ИаС1.

Зависимость к'1 и к'2 от концентрации ИаС1 показывает, что по мере понижения ионной силы к'] стремится к значению 0,04 ± 0,02, в то время как к'2 стремится к нулю (рис. 11). При концентрации ИаС1 больше 200мМ значение к'2 выходит на плато, высота которого примерно соответствует 0,05 ± 0,02.

Таким образом, при исследовании непрерывной кинетики релаксации плазмидной ДНК под действием топоизомеразы I человека методом ЛД нами выявлены следующие закономерности для изменения констант скорости топоизомеризации:

• При увеличении соотношения "фермент-субстрат" и концентрации ИаС1 100 мМ эффективная константа скорости топоизомеризации возрастает, стремясь к величине 0,04+0,01 сек-1 по мере приближения соотношения "фермент-субстрат" к единице (см. рис. 9).

• Реакция топоизомеризации плазмиды замедляется при понижении ионной силы. При этом к'[ стремится к ненулевому значению (0,04 ± 0,02 сек*1), соответствующему ионной силе ц, равной 0

• к'2 понижается до нуля при понижении ионной силы и выходит на плато (к'= 0,05 ± 0,02 сек*1) при концентрации ШС1 200 гпМ (см. рис. 11).

Легко видеть, что предельные значения этих эффективных констант скорости весьма близки. Мы предлагаем этому следующее объяснение.

Очевидно, что наблюдаемая скорость реакции определяется скорость-лимитрующей стадией. В среде с высокой ионной силой такой стадией будет реакция гидролиза фосфодиэфирной связи, поскольку и топоизомеризация ДНК, и диссоциация комплекса фермент-ДНК в этих условиях протекают много быстрее. Диссоциация не лимитирует скорость реакции и в условиях умеренных значениях ионной силы и примерно эквимолярного количества ДНК и фермента. При низкой ионной силе в начальный момент времени реакция идет с той же лимитирующей стадией гидролиза фосфодиэфирной связи, но, по мере релаксации первичных ДНК-ферментных комплексов, кинетика изменения сигнала ЛД начинает отражать лишь кинетику диссоциации нековалентного комплекса.

2.3.3. Кинетика взаимодействия топоизомераз I и II с ДНК в присутствии физиологически активных эффекторов.

ЭТОПОЗИД

СН3СН2" ^ 'о он

камгттотецин (^дз^Н) МСРТ-10,11 (К^Н, Р3.4= 0СН20 )

БN-38 (Я2,4=Н ^СНгСНз, В3=ОН)

О" 1 О" | 0" 1

■Р-Ш- и -р—О II 1 -р-1 II

II о II о II 0

ОСН

ОН ОН

аденозин-5'-фосфат-р,7-иминодифосфат (АМРРЫР)

Рис. 11 Ингибиторы топоизомераз I и II человека, использованные в работе.

Топоизомеразы являются ключевыми компонентами ядерного аппарата эукариот, обеспечивая беспрепятственное расхождение хромосом при делении. Нарушения в их функционировании приводят к драматическим сбоям в ядерных процессах, ведущим, в конечном

итоге, к апоптозу . В связи с этим, особый интерес исследователей привлекают специфические ингибиторы топоизомераз, которые являются мощными цитотоксическими агентами. Так как ферментативная активность топоизомераз исключительно важна для клеток, находящихся в стадии деления, их ингибиторы нашли широкое применение как препараты для химиотерапии раковых заболеваний. В то же время, сильные побочные эффекты затрудняют успешное терапевтическое использование этих веществ. Таким образом, возникает необходимость адекватного анализа активности ингибиторов топоизомераз, как в целях фундаментальных исследований механизма действия фермента, так и для скрининга новых эффективных лекарственных препаратов.

В связи с этим мы провели исследование методом ЛД влияния некоторых ингибиторов топоизомераз , в том числе и применяемых для терапии рака, на кинетику этих ферментов.

Время, сек.

Рис.12. Временная зависимость сигнала ЛД при релаксации 5 мкг плазмиды рТМ под действием 0.45 мкг топоизомеразы I при различных концентрациях ингибиторов (сверху вниз): а. 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.25, 12.5 цМ СРТ; б. 0, 0.05, 0.075, 0.125, 0.25 цМ МСРТ-10,11; в. 0, 0.075, 0.15, 0.2, 0.25 цМ 5К-38.

Для исследований кинетики ингибирования топоизомеразы I было выбрано несколько соединений камптотецинового ряда: сам СРТ, 10,11-метилендиоксикамптотецин (МСРТ-10,11) и SN-38 (рис. 11). При повышении концентрации двух первых агентов сохранялся экспоненциальный характер зависимости p(t), но уменьшалась эффективная константа скорости к' (рис. 12 а,б), поэтому I 50 (концентрация ингибитора, при которой реакция протекает в два раза медленнее, чем в его отсутствие), можно использовать для оценки их ингибирующей активности. Значение 150 составило 1 цМ для СРТ и 0,1 цМ для МСРТ-10,11. Третий ингибитор, SN-38, проявлял активность иного рода (рис. 12 в). Его присутствие никак не сказывалось на скорости реакции на начальном участке, сильно подавляя реакцию ее позднее (150 для второго участка 0,2 цМ). Эти данные, на наш взгляд, свидетельствуют о некотором различии механизмов действия исследованных ингибиторов: все они, как и описано в литературе, стабилизируют ковалентные ДНК-ферментные комплексы, останавливая процесс топоизомеризации на стадии религирования одноцепочечного разрыва в молекуле субстрата, но СРТ и МСРТ-10,11 , в отличие от SN-38, еще и препятствуют связыванию фермента с ДНК, что согласуется с данными о способности камтотецина и некоторых его аналогов связываться с малой бороздкой молекулы ДНК.

Для изучения воздействия специфических эффекторов на кинетику топоизомеразы II нами были выбраны два хорошо изученных вещества, действующих по двум различным механизмам: этопозид и негидролизуемый аналог АТФ, аденозин-5'-фосфат- р,у-иминодифосфат (AMPPNP) (рис. 11). Этопозид обратимо связывается с ДНК-связывающимся участком каждой субъединицы и одновременно с одноцепочечным участком ДНК, находящимся непосредственно рядом с ковалентно связанным с ДНК тирозином. При этом равновесие обратимого религирования гидролизованного сегмента ДНК, устанавливающееся после диссоциации транспортируемого сегмента ДНК, смещается в сторону ковалентного нуклеопротеидного комплекса, что замедляет вступление фермента в следующий каталитический цикл. AMPPNP связывается с N-концевым АТРазным доменом одной или обеих из двух субъединиц топоизомеразы II, причем реакция протекает нормальным образом вплоть до диссоциации транспортируемого сегмента ДНК от фермент-субстратного комплекса и останавливается на стадии гидролиза фосфодиэфирной связи нуклеозидтрифосфата. В связи с тем, что гидролиз AMPPNP невозможен, фермент остается топологически связанным с молекулой ДНК, необратимо переходя при этом в инактивированную форму. Кинетические кривые топоизомеризации плазмиды pUC19 под действием топоизомеразы И, полученные в присутствии различных концентраций этопозида методом ЛД, приведены на рис 13 а. Видно, что при повышении концентрации ингибитора реакция топоизомеризации замедляется, причем общий вид кривой остается

неизменным. Постепенное уменьшение выраженности минимума кривой p(t) свидетельствует о том, что согласованность процесса топоизомеризашш всего ансамбля плазмид уменьшается с увеличением концентрации этопозида. Если принять начальный угол наклона кривой p(t) как приближенную характеристику протекания реакции, для этого ингибитора можно оценить I-l(| как 10 иМ. Так как топоизомераза II не способна снять более двух сверхвнтков за один цикл гидролиза-лигирования ДНК. мы не можем-уверенно наблюдать методом ЛД начального участка кривой, скорость топоизомеризации на котором не зависит от концентрации этопозида.

1

Р

100

200

300

400

500

600

Время, сек.

Рис. 13. Временная .-зависимость сигнала ЛД при релаксации 8 мкг плазмиды рСС1Я под действие:.: 4 ед. топоизомеразы II при различных концентрациях эффекторов : а. 0 иМ (кривая 1), 5 цМ (2), 10 цМ (3). 25 цМ (4), 50 цМ (о) этопозида; б. соотношение [АМРРХР)/([АТР]-[АМРР\Р))=0 (кривая 1). 0.005 (2), 0.01 (3), 0.02 (4). Во врезке на панели б. показаны результаты электрофоретического разделения ДНК риС19 в пробах, отобранных из реакционной смес:: через 400 сек. после добавления фермента.

Рассмотрим теперь протекание реакции, катализируемой топоизомеразой II, если в реакционной смеси присутствуют одновременно АТР и AMPPNP. Приравняем соотношение [AMPPNP]/([ATP]+[AMPPNP], характеризующее долю

негидролизуемого аналога в суммарной концентрации нуклеозидтрифосфагов, к значению 1 /п, где п - целое число. Для инактивации молекулы топоизомеразы II достаточно, что бы лишь один из двух связавшихся нуклеозидтрифосфатов являлся AMPPNP, и события связывания AMPPNP субъединицами независимы. Поэтому, при равенстве констант связывания АТР и AMPPNP с ферментом, в соответствии с теорией вероятности, при каждом прохождении каталитического цикла необратимо инактивируются две из каждых п молекул фермента. Тогда, при экспериментальном соотношении фермент/субстрат по молям, равном 1/20, и учитывая, что топоизомераза II снимает по 2 витка за цикл, количество сверхвитков, снятых в среднем по всем молекулам ДНК после прекращения реакции, будет равно сумме сходящейся бесконечной геометрической прогрессии с первым членом 0.05 и множителем (п-1)/п. Тогда при п, равных 200, 100 и 50, Да для плазмиды pUC19 должно составить соответственно 0.027, 0.018 и. 0.009. На рис. 13 б. представлены зависимости p(t), полученные при инкубации плазмиды pUC19 с топоизомеразой II в присутствии АТР и AMPPNP при п, равном бесконечности (контрольный опыт, кривая 1), 200 (2), 100 (3) и 50 (4). Во врезке показаны результаты электрофоретического разделения ДНК pUC19 в пробах, отобранных из реакционной смеси в момент времени, когда при всех исследованных значениях п методом ЛД уже не удается зафиксировать дальнейшую топоизомеризацию. Из этих экспериментальных данных видно, что реакция в присутствии AMPPNP не идет до равновесного распределения продуктов, и кривые p(t) выходят на плато при значениях р, соответствующих а<0. При сравнении значений р для плато кинетических кривых при различных п (рис. 13 б) и кривой титрования pUC19 бромистым этидием (рис. 3) можно констатировать разумное совпадение результатов эксперимента с теоретическим расчетом, сделанным при допущении о при равенстве констант связывания АТР и AMPPNP с топоизомеразой И. Следует учесть, однако, неизбежность высокой погрешности при таком приближенном расчете, что связанно с несинхронностью топоизомеризации ДНК.

Выводы

1. Показана высокая ДНК-гидролизующая и цитотоксическая активность аутоантител, связывающихся с иммобилизованными белковыми компонентами ядерного матрикса. На основании этих данных предложена гипотеза об образовании при аутоиммунных заболеваниях ДНК-абзимов как аутоантител к прочным ДНК-белковым комплексам, в которых стабилизированы деформации нуклеотидной цепи, например, к ядерному матриксу.

2. С помощью метода измерения линейного дихроизма (ЛД) ДНК в потоке определены кинетические константы для ДНК-гидролизующих антител, связывающихся и не связывающихся с белками ядерного матрикса. Полученные данные подтверждают высказанное предположение о механизме образования ДНК-абзимов.

3. С использованием метода ЛД исследована непрерывная кинетика реакции топоизомеризации ДНК под действием топоизомераз I и II человека. Показана применимость метода ЛД для исследования их механизма действия.

4. Методом ЛД проведено исследование некоторых аспектов кинетики и механизма реакции, катализируемой топоизомеразой I. Показана независимость величины сродства фермента к субстрату от топологического состояния молекулы ДНК. Исследована кинетика стадий релаксации ДНК и диссоциации комплекса ДНК-топоизомераза I в различных условиях.

5. Предложен метод исследования непрерывной кинетики взаимодействия топоизомераз I и II с ДНК в присутствии их физиологически активных эффекторов. Сделаны количественные оценки эффективности ингибиторов и уточнены некоторые особенности механизма их взаимодействия с фермент-субстратным комплексом.

Публикации автора.

Основные положения диссертационной работы представлены в следующих публикациях:

1. A.V. Kozyr, A.V. Kolesnikov, E.S. Alexandrova, L.P. Sashchenko, N.V. Gnuchev, P.V. Favorov, M.A. Kotelnikov, E.I. Iakhnina, I.A. Astsaturov, T.B. Prokaeva, Z.S. Alekberova, S.V. Suchkov, and A.G.

- Gabibov. Novel functional activities of anti-DNA autoantibodies from sera of patients with lymphoproliferative and autoimmune diseases. -Applied Biochem. and Biotechnol., V.75, P. 45-61, 1998.

2. A.V. Kozyr, A.V. Kolesnikov, N.A. Zelenova, L.P. Sashchenko, S.V. Mikhalap, M.E. Bulina, A.N. Ignatova, P.V. Favorov, A.G. Gabibov Autoantibodies to nuclear antigenes: Correalation between cytotoxicity and DNA-hydrolyzing activity. Applied Biochem. and Biotechnol., в печати , 1999.

3. П.В. Фаворов, Е.А. Якубовская, A.B. Решетняк, А.Г. Габибов. Кинетика взаимодействия топоизомеразы II с ДНК в присутствии физиологически активных эффекторов. Докл. РАН, Т. 370, вып. 6, 2000.

4. A.V. Kozyr, A.V. Kolesnikov, L.P. Sashchenko, P.V. Favorov, A.G. Gabibov. Cytotoxic activity of chronic lymphocytic leukemia (CLL) and lupus anti-DNA antibodies. - 10th International Congress of Immunology, Satellite Meeting on Catalytic and Superantibodies, 1998, New Delhi, India.

5. A.V. Kozyr, A.V. Kolesnikov, N.A. Zelenova, P.V. Favorov, A.N. Ignatova, M.E. Bulina, A.G. Gabibov Cytotoxic activity of CLL and SLE anti-DNA autoantibodies - II International Congress on Autoimmunity, 1999, Tel Aviv, Israel.

Отдельные аспекты диссертационной работы отражены в других публикациях автора:

1. А.В Демин., A.B. Колесников, М.А. Олферьев, П.В. Фаворов, К.В. Фегединг, А.Г. Габибов, Н.В. Гнучев Дизайн конструкций для экспрессии протеолитической легкой цепи. Генетика, Т. 34. С. 13331337, 1998.

2. А.В Демин., A.B. Колесников, М.А. Олферьев, П.В. Фаворов, К.В. Фегединг, А.Г. Габибов, Н.В. Гнучев Экспрессия каталитически активной легкой цепи антитела против вазоактивного интестинального пептида. Докл. РАН, Т.360, С. 547-549, 1998.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фаворов, Петр Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Природные каталитические антитела.

2. ДНК-топоизомеразы: Структура, механизм и эффекторы.

2.1. Классификация топоизомераз.

2.2. Топоизомеразы 1-5'.

2.3. Топоизомеразы 1-3'.

2.4. Топоизомеразы II.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Материалы.

2. Методы.

2.1. Выделение и очистка фракции иммуноглобулинов G.

2.2. Выделение ядерного матрикса и приготовление аффинного сорбента на основе белков ядерного матрикса.

2.3. Реакция релаксации суперскрученной плазмидной ДНК.

2.4. Выделение плазмидной ДНК.

2.5. Электрофорез в агарозном геле.i.

2.6. Культура эукариотических клеток и анализ цитотоксического эффекта антител

2.7. Метод линейного дихроизма.

2.8. Разделение Fab и Fc фрагментов иммуноглобулинов G.

2.9. Изучение кинетики реакции ДНК-абзимов методом Л Д.

2.10. Исследование кинетики топоизомеразной реакции методом ЛД.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Исследование функциональных свойств аутоантител, связывающихся с белковыми компонентами ядерного матрикса.

1.1. Гидролиз ДНК под действием матрикс-связывающих аутоантител.

1.2 Цитотоксическое действие матрикс-связывающих аутоантител.

2. Кинетические исследования взаимодействия ДНК-абзимов и ДНК-топоизомераз с ДНК методом измерения линейного дихроизма в потоке.

2.1 Линейный дихроизм и топология ДНК.

2.2 Изучение кинетики гидролиза ДНК, катализируемого аутоантителами, связывающимися с белковыми компонентами ядерного матрикса.

2.3 Исследование кинетики топоизомеризации плазмидной ДНК эукариотическими топоизомеразами lull.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование кинетики превращений ДНК под действием ДНК-топоизомераз и ДНК-абзимов"

Различные превращения ДНК являются важнейшими процессами, обеспечивающими жизнедеятельность организма. Всестороннее исследование таких процессов не только проливает свет на нормальное функционирование клеточного аппарата, но и способно объяснить возникновение и механизм многих заболеваний.

Одним из относительно недавних открытий в этой области стало обнаружение антител, способных катализировать гидролиз ДНК. Изучение ДНК-гидролизующих антител является одной из интересных областей современной биохимии и иммунологии. Исследование каталитических свойств антител интересно как с точки зрения решения фундаментальных проблем биокатализа расшифровки механизмов катализа физиологически важных реакций, так и для прикладных разработок, направленных на создание новых устойчивых биокатализаторов, способных включать и выключать различные процессы метаболизма. Однако, роль природных каталитических антител в аутоиммунном процессе и механизмы, вызывающие продукцию этих антител, не определены. Одним из возможных путей возникновения таких антител может быть аутоиммунная реакция организма на ДНК-белковые комплексы, в которых ДНК находится в напряженной конформации, напоминающей конформацию переходного состояния реакции гидролиза фосфодиэфирной связи. Такие комплексы могут находиться, например, в составе ядерного матрикса - наиболее прочного ДНК-белкового ансамбля эукариотической клетки.

Огромное значение для развития биохимии и широкие перспективы в биомедицине имеет и изучение механизма действия ферментов топоизомеризации ДНК и их эффекторов. Так как эти ферменты обеспечивают в живой клетке упорядоченное хранение и нормальную передачу генетической информации следующим поколениям, понимание их функционирования очень важно для фундаментальной науки. Кроме того, уже сейчас селективное 5 регулирование активности этих ферментов с помощью ингибиторов различного действия является одним из основных способов терапии раковых заболеваний. Разработка новых терапевтических препаратов этого рода идет по пути увеличения их лекарственного действия при снижении побочных эффектов. В настоящее время, подобные исследования в значительной степени задерживаются из-за отсутствия надежных количественных кинетических методов изучения катализируемых этими ферментами реакций.

Предложенная диссертация посвящена качественному и количественному изучению функциональных свойств поликлональных аутоантител к белковым компонентам ядерного матрикса и исследованию кинетических закономерностей действия топоизомераз I и II человека. Эти исследования проведены с применением нового метода исследования ферментативных превращений ДНК - анализа изменения сигнала линейного дихроизма (ЛД) ориентированной в потоке ДНК. Диссертация затрагивает актуальную проблему путей образования природных каталитических антител к ДНК. Также рассмотрены некоторые новые аспекты механизма действия и кинетики топоизомераз и их взаимодействия с физиологически активными эффекторами.

Обзор литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Фаворов, Петр Владимирович

Выводы

1. Показана высокая ДНК-гидролизующая и цитотоксическая активность аутоантител, связывающихся с иммобилизованными белковыми компонентами ядерного матрикса. На основании этих данных предложена гипотеза об образовании при аутоиммунных заболеваниях ДНК-абзимов как аутоантител к прочным ДНК-белковым комплексам, в которых стабилизированы деформации нуклеотидной цепи, например, к ядерному матриксу.

2. С помощью метода измерения линейного дихроизма (ЛД) ДНК в потоке определены кинетические константы для ДНК-гидролизующих антител, связывающихся и не связывающихся с белками ядерного матрикса. Полученные данные подтверждают высказанное предположение о механизме образования ДНК-абзимов.

3. С использованием метода ЛД исследована непрерывная кинетика реакции топоизомеризации ДНК под действием топоизомераз I и II человека. Показана применимость метода ЛД для исследования их механизма действия.

4. Методом ЛД проведено исследование некоторых аспектов кинетики и механизма реакции, катализируемой топоизомеразой I. Показана независимость величины сродства фермента к субстрату от топологического состояния молекулы ДНК Исследована кинетика стадий релаксации ДНК и диссоциации комплекса ДНК-топоизомераза I в различных условиях.

5. Предложен метод исследования непрерывной кинетики взаимодействия топоизомераз I и II с ДНК в присутствии их физиологически активных эффекторов. Сделаны количественные оценки эффективности ингибиторов и уточнены некоторые особенности механизма их взаимодействия с фермент-субстратным комплексом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фаворов, Петр Владимирович, Москва

1. Tramontane» A., Janda K.D., Lerner RA. Catalytic antibodies. Science V. 234: P.1566-1570. 1986.

2. Wirsching P., Ashley J.A., Benkovic S.J., Janda K.D., Lerner R.A. An unexpectedly efficient catalytic antibody operating by ping-pong and induced fit mechanisms. Science V.252: P.680-685. 1991.

3. Gouverner V.E., Houk K.N., de Pascual-Teresa B., Beno B., Janda K.D., Lerne R.A. Control of the exo and endo pathways of the Diels-Alder reaction by antibody catalysis. Science V. 262: P.204-208. 1993.

4. Johnson G., Moore S.W. Anti-acetylcholinesterase antibodies display cholinesterase-like activity. Eur. J. Immunol. V.25: P.25-29. 1995.

5. Crespeau H., Laouar A., Rochu D. Polyclonal DNase abzyme produced by anti-idiotypic internal image method. C. R. Acad. Sci. Ill V.317: P.819-823. 1994.

6. Janda K.D., Lo C.H., Li T., Barbas C.F., Wirsching P., Lerner R.A. Direct selection for catalytic mechanism from combinatorial antibody libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. USA V.91: P.2532-2536. 1994.

7. Paul S., Heinz-Arian P., Said S.I. Autoantibody to VIP in human circulation. Biochem. Biophys. Res. Com. V.130: P.479-485. 1985.

8. Paul S., Said S.I., Thompson A. Characterization of autoantibodies to VIP in astma. J. Neuroimmunol. V.23: P.133-142. 1989.

9. Paul S., Voile D.J., Beach C.M., Johnson D.R., Powell M.J., Massey R.J. Catalytic hydrolysis of vasoactive intestinal peptide by human autoantibody. Science V.244: P.1158-1162. 1989.

10. Paul S., Voile D.J., Mei S. Affinity chromatography of catalytic autoantibody to vasoactive intestinal peptide. J. Immunol. V.145: P.1196-1199. 1990.

11. Paul S., Mei S., Mody B., Eklund S.H., Beach C.M., Massey R.J., Hamel F. Cleavage of vasoactive intestinal peptide at multiple sites by autoantibodies. J. Biol. Chem. V.266: P.16128-16134. 1991.

12. Paul S., Voile D.J., Powell M.J., Massey R.J. Site-specificity of a catalytic VIP antibody. J. Biol. Chem. V.265: P.11910-11913. 1990.

13. Mei S., Mody B., Eklund S.H., Paul S. VIP hydrolisis by antibody light chains. J. Biol. Chem. V.266: P.15571-15574. 1991.

14. Paul S., Sun M., Mody R., Tewary H.K., Smemmer P., Massey R.J., Gianferrara T., Mehrota S., Dreyer T., Meldal M., Tramontano A. Peptidolytic monoclonal antibodies elicited by neuropeptide. J. Biol. Chem. V.267: P.13142-13245. 1992.

15. Gao Q.S., Sun M., Tyutyulkova S., Webster D., Rees A., Tramontano A., Massey R.J., Paul S. Molecular cloning of a proteolytic antibody light chain. J. Biol. Chem V.269: P.32389-32393. 1994.

16. Sun M., Gao Q.S., Li L., Paul S. Proteolytic activity of an antibody light chain. J. Immunol. V.153: P.5121-5126. 1994.

17. Gao Q.S., Sun M., Rees A.R., Paul S. Site-directed mutagenesis of proteolytic antibody light chain. J. Mol. Biol. V.253: P.658-664. 1995.

18. Paul S., Li L., Kalaga R., Wilkins-Stevens P., Stevens F.J., Solomon A. Natural catalytic antibodies: peptide-hydrolyzing activities of Bence Jones protein and VL fragment. J. Biol. Chem. V.270. P.15257-15261. 1995.

19. Klinman DM, Steinberg AD. Idiotype-antiidiotype equilibrium. Arthrites and Rheumatism V.29. P.697-705. 1986.

20. Шустер A.M., Гололобов Г.В., Квашук O.A., Габибов А.Г. Анти-идиотипические и природные каталитические антитела. Молекуляр. Биология. Т.25. С.593-602. 1991.

21. Shuster А.М., Gololobov G.V., Kvashuk О.А., Bogomolova A.E., Smirnov I.V., Gabibov A.G. DNA hydrolyzing autoantibodies. Science V.256: P.665-667. 1992

22. Щуров Д.В., Макаревич О.И., Лопаева O.A., Бунева В.Н., Невинский Г.А., Габибов А.Г. Взаимодействие ДНК-гидролизующих аутоантител с низкомолекулярными субстратами. Докл. Акад. Наук РАН Т.337(3): С.407-410. 1994.

23. Бунева В.Н. Андриевская О.А. Романникова И.В., Гололобов Г.В., Ядав Р.П., Ямковой В.И., Невинский Г.А. Взаимодействие каталитически активных антител с рибоолигонуклеотидами. Молек. Биология Т.28(4). С.738-743. 1994.

24. Gololobov G.V., Rumbley К., Rumbley J., Schourov D.V., Makarevich O.I., Gabibov A.G., Voss E., Rodkey S. DNA hydrolysis by monoclonal anti-ssDNA autoantibody BV 04-01: origins of catalytic activity Mol. Immunol, V.34 (5), P.1083-1093 1997.

25. Li L., Paul S., Tyutyulkova S., Kazatchkine M.D., Kavery S. Catalytic activity of anti-thyroglobulin antibodies. J. Immunol. V.154. P.3328-3332. 1995.

26. Wang J. DNA topisomerases. AnnuHev.Biochem. V.65,P.635-692,1996

27. Berger J.M7. Type II DNA topoisomerases. Curr.Opin.Struct.Biol. V.8, P.26-31,1998

28. Burden A., Osheroff N., Mechanism of action of eucariotic topoisomerase II and drugs tergeted to the enzyme. Biochem.Biophys.Acta, V.1400, P.139-154,1998

29. Lynn R., Giaver G., Swanberg S.L., Wang J.C. Tandem regions of yeast topoisomerase II share homology with different subunits of bacterial gyrase. Science V.233, P.647-649, 1986

30. Crenshaw D.G., Hsieh T. Function of hydrophylic carboxyl terminus of type II topoisomerase from Drosophila Melanogaster ILIn vivo studies. J.Biol.Chem. V.268, P.21335-21343, 1993

31. Cardenas M.E., Dang Q., Glover C.V., Gasser S.M. Casein kinase II phosphorylates the. eucaryote-specific C-terminal domain of topoisomerase II in vivo. EMBO J. V.ll, P.1785-1796, 1992

32. Caron P.R., Watt P., Wang J.C. The C-terminal domain of Saccharomyces Cerevisiae DNA topoisomerase II. Mol.Cell.Biol V.269, P.29746-29751,1994

33. Cabral J.H.M., Jackson A.P., Smith C.V., Shikotra N., Maxwell A., Liddington R.C. Crystal structure of breakage-reunion domain of DNA-gyrase. Nature V.388, P.903-906, 1997

34. Berger J.M., Gamblin S.J., Harrison S.C., Wang J.C. Structure at 2.7 E of a 92K yeast topoisomerase II fragment. Nature V.379, P.225-232, 1996

35. Drake F.H, Hoffmann G.A., Bartus H.F., Mattern M.R., Crooke S.T., Mirabelli C.K. Biochemical and pharmacological properties of pi70 and pl80 forms of topoisomerase II. Biochemistry V.28, P.8154-8160, 1989

36. Austin C.A., Sing J.H., Patel S., Fisher L.M., Novel HeLa topoisomerase II is the II beta isoform:complete coding sequence and homology with other type II topoisomerases. Biochim.Biophys.Acta VI172, P.283-291, 1993

37. Jensen s., Redwood C.S., Jenkins J.R., Andersen A.H., Hickson I.D. Human topoisomerase II alpha and II beta can functionally substitute for yeast TOP2 in chromosome segregation and recombination. Mol.Gen.Genet. V.252, P.79-86, 1996

38. Hsiang Y.H., Wu H.Y., Liu L.F. Proliferation-dependent regulation of DNA topoisomerase II in cultured human cells. Cancer Res. V.48, P.3230-3235, 1988

39. Biersack H., Jensen S., Gromova I., Nielsen I., Westergaard O., Andersen A. Active heterodimers are formed from human DNA topoisomerase Ilalpha and Ilbeta isoforms. PNAS V.93, P.8288-8293, 1996

40. Watt P.M., Hickinson I.D. Structure and function of type II DNA topoisomerases. Biochem J. V. 303, P.681-685, 1994

41. Berger J.M., Gamblin S.J., Harrison S.C., Wang J.C. Structure and mechanism of DNA topoisomerase II. Nature V.379, P.225-232, 1996

42. Berger J.M., Wang J.C. Recent developments in DNA topoisomerase II mechanism and structure. Curr.Opin.Struct.Biol. V.6, P.84-90, 1996

43. Osheroff N. Role of the divalent cation in topoisomerase II mediated reactions. Bichemistry V.26, P.6402-6406, 1987

44. Sander M., Hsieh T., Udvardy A., Schedl P. Sequence dependence of Drosophila topoisomerase II in plasmid relaxation and DNA binding. J.Mol.Biol. V.194, P. 219-229, 1987

45. Zechiedrich E.L., Osheroff N. Eucariotyc topoisomerases recognize nucleic acid topology by preferentially binding to DNA crossovers. EMBO J. V.9, P.4555-4562, 1990

46. Bonven B.J., Gocke E., Westergaard O. Cell V.41, P.541-551, 1985

47. Capranico G., Kohn G.W., Pommier Y. NAR, V.18, P.6611-6619, 1990

48. Pommier Y., Capranico G., Orr A., Kohn K.W. NAR V.19, P.5973-5980, 1991

49. Cornarotti M., Tinelli S., Willmore E. et al. Mol.Pharmacol. V.50, P.1463-1471, 1996

50. Spitzner J.R., Muller M.T. NAR V.16, P.5533-5556, 1988

51. Spitzner J.R., Chung I.K., Muller M.T Eucariotic topoisomerase II preferentially cleaves alternating purine-pyrimidine repeats. NAR V.18, P.l-11, 1990

52. Burden D.A., Osheroff N. In vitro evolution of preferred topoisomerase II DNA cleavage sites. J Biol Chem V.274, P.5227-35, 1999

53. Bechert T., Diekmann S., Arndt-Jovin D.J. Human 170kDa and 180 kDa topoisomerases II bind preferentially to curved and left-handed linear DNA. J.Biomol.Struct.Dynam V.12, P.605-623, 1994

54. Arndt-Jovin D.J., Udvardy A., Garner M.M., Ritter S., Jovin T.M. Z-DNA binding and inhibition by GTP of Drophila topisomerase II. Biochemistry V.32, P.4862-4872, 1993

55. Dang Q., Alghishi G.C., Gasser S.M. Phosphorylation of the C-terminal domain of yeast topoisomerase II affects DNA-protein interaction. J.Mol.Biol. V.243, P. 10-24, 1994

56. Lee M.P., Sauder M., Hsieh T. J.Biol.Chem. V.264, P.4412-4416, 1989

57. Spitzner J.R., Chung I.K., Muller M. Determination of 5' and 3' DNA triplex interface boundaries reveals the core DNA binding sequence for topoisomerase II. J.Biol.Chem. V.270, P.5932-5943, 1995

58. Li w.,Wang J. Footprinting of yeast topoisomerase II lysyl side chains involved in substrate binding and interdomainal interactions. J.Biol.Chem. V.272, P.31190-31195, 1997

59. Sander M., Hsieh T. Double strand DNA cleavage by type II topisomerase from S.Cerevisiae. J.Biol.Chem. V.258, P.8421-8428, 1983

60. Andersen A.H., Christiansen K., Zachiedrich E.L. et al. Strand specificity of the topoisomerase II-mediated double-stranded cleavage reaction. Biochemistry V.28, P.6237-6244, 1989

61. Osheroff N., Zachierlich E., Gale K. Catalytic function of DNA topoisomerase II. BioEssays V.13, P.269-273, 1991

62. Morris S.K., Harkins T.T., Tennyson R.B., Lindsley J.E. Kinetic and thermodynamic analysis of mutant type II DNA topoisomerases that cannot covalently cleave DNA. J.Biol.Chem. V.274, P.3446-3452, 1999

63. Roca J., Wang J.C. DNA transport by a type II DNA topoisomerase: evidence in favor of a two-gate mechanism. Cell V.77, P.609-616, 1994

64. Roca J., Berger J.M., Harrison S.C., Wang J.C. DNA transport by a type II DNA topoisomerase: direct evidence for a two-gate mechanism. PNAS, V.93, P.4057-4062, 1996

65. Osheroff N. Eucariotyc topoisomerase Il.Characteristic of enzyme turnover. J.Biol.Chem. V.261, P.9944-9950, 1986

66. Robinson M.J., Osheroff N. Effects of antineoplastic drugs on the poststrand-passage DNA cleavage/religation equilibrium of topoisomerase II. Biochemistry V.30, P.1807-1813, 1991

67. Rybenkov, V.V., Ullsperger C., Vologodskii A.V., Cozarelli N.R. Science, V.277, P.690-693, 1997

68. Hammonds T.R., Maxwell A. J.BioLChem. V.272, P.32696-32703, 1997

69. Gardiner L.P., Roper D.I., Hammonds T.R., Maxwell A. The N-terminal domain of human topoisomerase II is a DNA-dependant ATPase. Biochemistry V.37, P.16997-17004, 1998

70. Harkins T.T., Lewis T.J., Lindsley J.E. Pre-steady-state analysis of ATP hydrolysis by S.Cerivisiae DNA topoisomerase II. 2.kinetic mechanism for the sequential hydrolysis of two ATP. Biochemistry V.37, P.7299-7312, 1998

71. Andoh T., Ishida R. Catalytic inhibitors of DNA topoisomerase II. Biochim.Biophys.Acta V.1400, P.155-171, 1998

72. Vassetzky Y.S., Alghici G.-C., Gasser S.M. DNA topoisomerase II mutations and resistance to anti-tumor drugs. BioEssays V.17, P.767-774, 1995

73. Corbett A.H., Hong D., Osheroff N. Exploiting mechanistic differences between drug classes to define functional drug interactio domains on topoisomerase II. J.Biol.Chem. V.268, P.14394-14398, 1993

74. Freudenreich C.H., Kreuzer K.N. Localization of an aminoacridine antitumour agent in a type II topoisomerase-DNA complex. PNAS V.91, P.11007-11011, 1994

75. Morris S.K., Lindsley J.E. Yeast topoisomerase II is inhibited by etoposide after hydrolyzing thi first ATP and before releasing the second ADP. J.Biol.Chem. V.274, P.30690-30696, 1999

76. Capranico G.,Binaschi M., Borgnetto M.E., Zunino F., Palumbo M. A protein-media ted mechanism for the sequence-specific action of topoisomerase II poisons. TiPS V.18, P.323-329, 1997

77. Solary E., Bertrand R., pommier Y. Apoptosis induced by topoisomerase I and II inhibitors in humam leukemic HL-60 cells. Leuk.Lymph. V.15, P.21-32, 1994

78. Capranico G.,Binaschi M. DNA sequence selectivity of topoisomerases and topoisomerase poisons. Biochim.Biophys.Acta V.1400, P.185-194, 1998

79. Jensen P.B., Sorenson B.S., Demant E.J.F. et al. Antagonistic effect of aclarubicin on the cytotoxicity of etoposide and on topoisomerase II-mediated cleavage. Cancer Res. V.50, P.3311-3316, 1990

80. Utsumi H., Shibuya M.L., Kosaka T. Abrogation by novobiocin of cytotoxicity due to topoisomerase II inhibitor amsacrine , Cancer Res. V.50, P.2577-2581, 1990

81. Roca J., Ishida R., Berger J.M., Andoh Т., Wang J.C. Anti-tumor bisdioxypiperazines inhibit yeast DNA topoisomerase Ilby trapping the enzyme in the form of closed protein clamp. PNAS V.91, P.1781-1785, 1994

82. Ishida R.,Iwai M., Hara A., Andoh T. The combination" of different types of antitumor topoisomerase II inhibitors. Anticancer Res. V.16, P.2735-2740, 1996

83. Макаров B.JL, Димитров С.И. изучение структурных изменений в хроматине в присутствии моно- и дивалентных катионов методом линейного дихроизма в потоке. Молекулярная биология. Т. 16, С.1086-1096, 1982.

84. Шустер А.М., Гололобов Г.В., Квашук О.А., Габибов А.Г. Анти-идиотипические и природные каталитические антитела. Молекуляр. Биология. Т. 25: С. 593-602, 1991.

85. Kohwi-Shigematsu, Т., deBelle, I., Dickinson, L.A., Galande, S., Kohwi, Y. Identification of base-unpairing region-binding proteins and characterization of their in vivo binding sequences. Methods Cell Biol V.53. P.323-354. 1998.

86. Raz E., Brezis E., Rosenmann E., Eilat D. Anti-DNA antibodies bind directly to renal antigens and induce kidney dysfunction in the isolated perfused rat kidney. J. Immunol. V.142: P.3076-3082. 1989.

87. Shoenfeld Y., Zamir R., Joshua H., Lavie G., Pinkhas J. Human monoclonal anti-DNA antibodies react as lymphocytotoxic antibodies. Eur. J. Immunol. V.15(10): P.1024-1028. 1985114

88. Paul S., Voile D.J., Beach C.M., Johnson D.R., Powell M.J., Massey R.J. Catalytic hydrolysis of vasoactive intestinal peptide by human autoantibody. Science V.244: P.1158-1162. 1989.

89. Alarcon-Segovia D., Ruiz-Arguelles A., Llorente L. broken dogma: penetration of autoantibodies into living cells. ImmunoLToday V.17(4): P.163-164. 1996.

90. Yanase, K., Smith, R.M., Puccetti, A., Jarett, L., Madaio, M.P. Receptor-mediated cellular entry of nuclear localizing anti-DNA antibodies via myosin 1. J Clin Invest V.100(l) P. 25-31. 1997.

91. Raz E., Ben-Bassat H., Davidi T., Shlomai Z., Eilat D. Cross-reaction of anti-DNA autoantibodies with cell surface proteins. Eur. J. Immunol. V.23: P.383-390. 1993

92. Norden B., Kubista M., Kurucsev T. Linear dichroism spectroscopy of nucleic acids.- Quar. Rev. Bioph. V. 25 P. 51-170, 1992.

93. Crothers D.M., Dattagupta N., Hogan M., Klevan L., Lee K.S. Transient electric dichroism studies of nucleosomal particles. Biochemistry. V. 17, P. 4525-4533, 1978.

94. Basu S. Theory of linear dichroism of DNA and DNA-containing structures.-J. Theor. Biol. V. 42, P. 419-441, 1973.

95. Wang J.C., Peck L.J., Becherer K. DNA supercoiling and its effects on DNA structure and function.- Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., V. 47, P. 85-91, 1983.