Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование иммуноглобулинов в норме и при патологии с помощью моноклональных антител и спектральных методов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование иммуноглобулинов в норме и при патологии с помощью моноклональных антител и спектральных методов"

од

РГб

АКАДЕШЯ НАУК УКРАШШ ШЮТИТУТ ЕКОХИШ{ НМ. А. В. ПАЛЛАДИНА

3 УДИ

Ш. правах рузсопг-хи

ЕФЕТ08 Константен Александрович

ИССЛЕДОВАН!С5 Ю.5.{УКОГЛОБУЛИНОВ В НОРМЕ Н ПРИ ПАТОЛОГИИ С ПОЖЗЬЙ 1ЯКОЯ7ШАЛЫШХ МГПГГЕЛ И СПЕКТРАЛЬНЫХ МЕТОДОВ

03. 00. 04 - бзаэиэсся

АВТ0РЕ5ЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологически наук

Киев - 1994

Работа выполнена - Крымском государственном медицинском институте

Научный консультант - член-корреспондент АН Украины,

заслуженный деятель науки Украины, доктор биологических наук, профессор [геоЩКИЙ Г. Е^

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

ЕОЕРСйНЯК С. А.

доктор биологических наук, профессор БОРИСЕНКО С.Н.

доктор биологических наук, профессор ЗИМ В.Л.

Ведущее учреждение - Украинский государственный

медицинский университет км. А.А. Богомольца

Зашита диссертации состоится "2.С" ии)/<Л' 1954 г. е 14.СО на еаседании специализированного ученого созета Д 016.07.01 при Институте биохимии им. А.В.Палладина

АН Украины (252601, г. Киев-30, ул. Леонтовича, 9).

>

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии им. А.В.Палладина АН Украины.

Автореферат разослан "-/У" .-с-аг^С 1994 г.

Ученый секретарь специализированного ученого совета кандидат биологических наук

КИРСЕНКО. О.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Антитела-иммуноглобулины представляют собой ключевые макромолекулы иммунно^ системы, так как отвечают за распознавание чужеродных агентов и запускают иммунные реакции организма. При патологии может возникать постсинтетическая модификация белков, приводящая к нарушению нормальной функции этих молекул (Троицкий, 1991). Если такие изменения затрагивают антитела, это вдвойне опасно, так как может привести к сбою работы всей защитной системы организма. Поэтому исследование модифицированных при патологии иммуноглобулинов имеет первостепенное значение для понимания патогенеза многих болезней. С другой стороны, актуально изучение молекулярных механизмов функционирования иммуноглобулинов. Последние являются сложными образованиями, имеющими большую молекулярную массу, доменную структуру, несколько активных центров (антигенсЕязывающих и эффекторных), расположенных в разных частях молекулы. В иммуноглобулинах могут происходить разнообразные информационные переходы, они способны к взаимодействию с различными лигандами не антигенной природы (Dudich et al., 1983; Завьялов, 1984; Троицкий и др., 1991). Поэтому очевидно, что функционирование антител в иммунной системе не определяется простой агрегацией их на антигене. Еезусловно, ' важное значение для включения эффекторных функций имеют конформационные перестройки, которые обнаружены в молекулах антител при связывании антигенов и гаптенов ( Burton, 1985).

В настоящее время широчайшее распространение получила гибри-домная технология, открытая менее двух десятилетий тому назад (Köhler, Milsteln, 1975). Монокловальные антитела (МКА) к заданным антигенам, продуцируемые гибридомами, являются тонким инструментом для различных молекулярных исследований. Каждое МКА уникально по своим свойствам. Получение МКА к различным антигенным детерминантам иммуноглобулинов человека и других'белков, способных с ними взаимодействовать, является актуальной научной задачей, так как с одной стороны, такие МКА позволяют исследовать свойства (строение, модификацию, функции) иммуноглобулинов, а с другой - они могут пайти применение во многих фундаментальных и прикладных исследованиях (получение аффинных сорбентов, использование в качестве компонентов тест-систем, разработка лечебных препаратов и т. п.), что существенно расширяет рамки значимости таких исследований.

Все выпесказанное подтверждает актуальность данной работы, посвященной вопросам функционирования иммуноглобулинов человека, изучения модификации их при патологии и получения и использования моноклональных антител.

Дель и задачи исследования. Настояшдя работа является продолжением многолетних исследований, проводимых на кафедре биохимии и е ла5оратории биотехнологии Крымского медицинского института, которые были начаты под руководством члена-корреспондента АН Украины Г.Б.Троицкого и посвящены изучению физико-химических характеристик иммуноглобулинов и их. изменчивости при патологгш.

Ранее нами (Ефетов и др., 1985) был разработан способ, позволяющий выявлять изменённые при патологии иммуноглобулины, оценивая степень устойчивости их конформации к воздействию низких концентраций мочевины (12%) методом температурно-пертурбационнои дифференциальной спектрофотометра (ТПДС). При этом выраженные изменения были обнаружены при хроническом лимфолейкэзе. Было высказано предположение, что возможной причиной изменения 1ей при патологии является их неспецифическое связывание с продуктами распада опухолевой ткани. Однако оставался нерешенным ряд вопросов. Является ли 'отмеченная модификация 1еЗ характерной только для лт-фопролифератианых заболеваний или она может возникать и при других новообразованиях? Связаны ли обнаруженные изменения ¡г<3 с деструкцией клеток и тканей организма при патологии? Что является непосредственной причиной данной модификации 1^3? Сопряжены ли обнаруженные особенности конформации измененных иммуноглобулинов с нарушением их функций? Для ответа на эти вопросы был значительно расшрен круг изучаемых патологии, увеличен спектр применяемых методов,1 получены и использованы моноклинальные антитела.'

Рель данного исследования - изучить изменения конформацион-ного и функционального состояния иммуноглобулинов & при патологии к выяснить биохимические основы этих изменений.

Для достижения намеченной цели поставлены и решены следуйте задач;::

1. Получить на осноье гибридомной технологии моноклональные антитела к иммуноглобулинам человека, а также к гмфифильноыу пептиду из яда пчелы - мелиттину, с целью изучения его взаимодействия (как модельного лиганда) с человека. Использовать полученные ыоноклональные антитела для исследования иммуноглобулинов

при патологии.

2. Исследовать в сравнительном аспекте устойчивость нонфор-мацин иммуноглобулшоз В в норме, при злокачественных новообразованиях различны* локализации и другие патологических состояниях, сопровождающиеся деструктивными процесса«! в организме.

3. Изучить способность 1еб к агрегаты в норме и при патологии.

4. Изучить взаимодействие амфифильных соединении (липидов, пептидов) с 1е:Б человека и проанализировать локализацию возможных центров связывания на молекуле иммуноглобулина.

5. Определить содержание липидов з препаратах в норме и при патологии.

6. На модельной паре моноклональнов антитело - антиген исследовать влияние амфифильных соединений на антигенсвяаывзюшую функции 1еЗ.

7. Оценить комллементфзксирушуи способность 1еС, изменённых при изучаемых заболеваниях.

8. Выяснить причины модификации при патологии.

9. Исследовать возможность появления парапротеинемии при злокачественных новообразованиях нелимфоидного происхождения.

Научная новизна. Впервые обнаружена повышенная устойчивость

выделенных пз сыворотки крови людей, больных злокачественными новообразованиями желудка и других локализаций, к воздействии 127. мочевины по сравнении с 1е6 здоровых людей. Зти изменения связаны с деструктивными процессами в организме, что подтверждается увеличением "жёсткости" конформацшт 1£б при патологии, сопровождающейся разрушением клеток и тканей организма (острое отравление уксусной кислотой с выраженным гемолизом, ревматизм, ревматоидный артрит, бронхоэктатическая болезнь)..

Впервые показано, что 1§<3 при злокачественной опухоли желудка обладают повышенной склонностью к агрегации по сравнению с 1ев здорового человека.

Впервые удалось смоделировать условия, при которых выделенный из сыворотки крови здорового человека, приобретет повы-пенкуто устойчивость конформации, характерною для при патологии. Это достигалось присутствием в растворе фосфатидилхолина или мелиттина вместе с 1е6 здорового человека в молярном соотношении 5:1. С помощью моноклональных антител к мелиттину показано, что этот пептид связывается с в молярном соотношении 1:1, причём

основным местом связывания является Гс-фрагмент. Так как эффект 127. мочевины на 1е6 локализован по данным ТПДС преимущественно в ГаЬ-фрагментах, но значительно снижается при связывании лпганда рс-фрагментом, сделан вывод об увеличении устойчивости кокформа-ции РаЬ-области в результате взаимодействия Рс-фрагмента с амфи-фильнымл лигандами.

Обнаружено, что константа диссоциации комплекса для

некоторых при злокачественных новообразованиях различных локализаций выше, чем для ¡гб здоровых людей.

Показано, что взаимодействие амфифильных лигандов (фосфати-дилхолина, мелиттина) с 1еО-антнтела.ми приводит к ослаблению ан-тигенсвязывашей активности антител.

Впервые делается вывод о том, что обнаруженная модификация 1еВ при патологии (повышенная устойчивость к Бездействию мочевины, склонность к агрегации) является следствием взаимодействия Рс-фрагмента с амфифилъными продуктами распада клеток и тканей организма. Это приводит к нарушению функции иммуноглобулинов (ослабление комплементфиксирующёй и антигенсвлзывающей активности) , что может быть причиной ослабления гуморального ' иммунитета при изучаемой патологии.

Получено 12 новых штаммов гибридом, продуцирующих монокло- ■ нальные антитела к человека, их тяжелым и лёгкш цепям и

протеолитичесгаш фрагментам. Часть из этих антител обнаруживает способность к преципитации антигена, что позволяет их использовать для качественного и количественного определения иммуноглобулинов в методах иммунодиффузии. Получен также клон гибридомных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к пептиду из яда пчелы - мелиттину. ^

Создан аффинный сорбент на основе полученных мсноклональных антител к ¡£31,2,3, с помощью которого выделен парапротеин 1(?54 при физиологических значениях рН и ионной силы раствора.

Практическая ценность. Полученные данные о модификации иммуноглобулинов Э при патологии (повышенная устойчивость конформа-ции, склонность к агрегадии, ослабление ксшлементфиксирующей активности) имеют гажное значение для понимания молекулярных механизмов патогенеза заболеваний.

Полученные в работе моноклональные антитела могут быть применены для различных биохимических, иммунологических, клинических исследований, создания диагностических тест-систем и лечебных пре-

паратон. Продемонстрирована возможность использования USA для количественного определения уровня иммуноглобулинов, диагностики па-рапрстеинемий, изучения взаимодействия лигандсв с иммуноглобулинами.

Имеются положительные решения патентной экспертизы о выдаче 12 патентов на изобретения.

Исследования проводились в рамках ряда государственных программ:

1. Программы ГКНТ и АН СССР 0.74.05 по физико-химической би-олстии и биотехнологии, по задании 17.Н2 "Исследование межмолекулярных взаимодействии в и-шунноп системе в норме к при патологии",

2. Государственной научно-технической программы 01.Сч.00 "Исследование механизмов формирования противоопухолевой резистентности организма и разработка способов его усиления", по задан:® Государственного комитета Украины г.о вопросам науки и технологий "Выяснение механизмов постсинтетической модификации иммуноглобулинов челоЕекз при злокачественных новообразованиях"

3. Научного направления 5 "Науки с Земле: проблемы окружающей среды", з соответствии с заданием 5/221 Государственного комитета Украины по вопросам науки и технологий "Получение монокло-налькых антител и использование их как иммунодиагностикумов при патологии и а экологически неблагоприятных условиях".

Апробация работы и внедрение. Материалы диссертации были доложены на 15-й Конференции Федерации европейских биохимических обдестЕ (Москвз, 1984), 4-м симпозиуме СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей кл-тке" (Киев, 1984), 5-й, 6-й и 7-й Всесоюзных конференциях по спектроскопии биополимерез -'Харьков, 1934, 1953, 1991), Республиканской конференции "Механизмы иммуностимуляции" (Киев, 1S85), 2-м Украинском съезде гематологов и трансфузиолсгов (Киев, 1985), Международных симпозиумах "Структура, биосинтез и функции молекулярных элементов иммунной системы (Пущгао, 1987; 'Краков, 1989), 1-й Всероссийской конферен-

"Система комплемента" (Киров, 1967), Всесоюзной конференции "Бис/.учяя - медицине" (Ленинград, 1988), 5-м и 6-м Украинских биохимических съездах (Ивано-Франковск, 198?; Киев, 1S92), на заседаниях Крымского отделения Украинского биохимического общества и научных конференциях кафедры биохимии Крымского медицинского института (Симферополь).

Полученные монсклональные антитела к мелиттину были внедрены

в Институте биохимик им. А.В.Палладина АН Украины (акт внедрения от 17.03.93), где они были использованы для изучения взаимодействия этого пептида с липидами в модельных мембранах. С их помощью была установлена локализация антигенных детерминант меллттина в мембране, что позволило исследовать механизм биологшеского действия пептида (Костржевская и др., 1992).

Публикации. Основные результаты исследований были опубликованы е 39 печатных работах, включая 12 патентов.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 267 страницах машинописного текста, включая 22 таблицы и 26 рисунков. Работа состоит из введения, семи глав, заключения и выводов. Описок литературы содержит 393 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований Исследования были проведены на ста девяти препаратах двух белках Еенс-Джонса, двух препаратах и 1§А, полученных от 379 людей. (Для исключения влияния на результаты индивидуальных особенностей белка ряд препаратов 1е<3 был выделен из смесей сывороток крови нескольких людей). Изучались здоровых люден и при раке желудка, прямой кишки, желчного пузыря, легкого, щитовидной железы, кожи, ыеланоме кожи, хроническом лимфолейкозе, лимфогранулематозе, миеломной болезни, миоме матки, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, бронхоэктатической болезни, ревматизме, ревматоидном артрите, остром отравлении уксусной кислотой, а также и белки Бенс-Джонса при миеломной болезни и при болезни Вальденстрема. Диагноз во всех случаях был установлен высококвалифицированными специалистами на основании комплекса клинических и лабораторных' данных. У больных с новообразованиями диагноз был подтвержден при гистологическом исследовании опухолевой ткани, при изучении картины крови (хронический лимфолейкоз), на основании данных стернальной пункции и иммунологических исследований белков сыворотки крови и мочи (миелом-ная болезнь). Для взятия проб отбирались только такие больные, которым кровь не переливалась, чтобы исключить возможность появления в кровяном русле чужих иммуноглобулинов.

Препараты и 1&А выделялись из глобулиновой фракции сыво-

ротки крови методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-Трисакриле М и ДЭАЭ-Целлюлозе (Брок, 1987). IgM был получен трехкратным переосаждением сыворотки крови деионизированной водой с последующей гель-фильтрацией на Ультрагеле АсА 22. Белки Бенс-Джонса очищали из мочи осаждением 17,5Х (NH4)2S04 и гель-фильтрацией отдиализо-Еанного осадка на Сефадексе G-100.

Fab- и Fc-фрагменты IgG, г(аЬ')2"Фрагменты IgG и (Fcjsn-фрзг-менты IgM получали соответственно палаиновым, пепсиновым и трипси-новым гидролизом белков (Брок, 1987) с последующей гель-фильтрацией на Сефадексе G-100 или Ультрагеле АсА 22. Смесь Fab- и Fc-фгагмен-тов разделялась ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-Целлюлоге.

Контроль чистоты, идентификация и типирование выделенных белковых препаратов осуществлялись методами двойной радиальной 1э.<мунодиффугии и иммуноэлектрофореза с моноспецифическими и по-липреципитирувдими антисыворотками (Фримель,1967), тЕердофагксго иммуноферментного анализа (ЛФА) с моноклональными антителами против иммуноглобулинов человека (Егоров и др.,1991), а также диск-электрофореза и SDS-электрофореза в градиенте концентрации полиакриламидного геля (Гааль и др.,1982).

Мелиттин, выделенный из яда пчелы; препарат искусственно синтезированного мелиттина; а также фосфслипага, выделенная из яда пчелы, были нам любезно предоставлены в Институте биохимии им. А.В.Палладина АН Украины (Киев).

Определение концентрации белков осуществлялось микробиурето-еым методом (Кочетов,1980) и по значению экстинкции при длгае волны 220 нм.

Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела (МКА) к иммуноглобулинам человека и мелиттину, получали путем слияния в присутствии полизтиленгликоля 4ССО (Merck, Германия) клеток мызиной миеломы Sp 2/0 с лимфоцитами селезенки иммунизированных соответствующим антигеном мышей EALB/c (Фридлянская,1988). Для культивирования и селекции гибридомы использовалась среда RFMI-1540, содержащая 2QZ фетальную бычью сыворотку. В перЕые 3 недели после гибридизации в среду добавлялись гипоксантин, аминолтерин и тимп-дин (Фибих,1987). Клонирование гибридом проводилось методом лимитирующего разведения (Мак-Керн, 1983). Продукция и специфичность '--—.•'тел оценивались методом иммуноферментного анализа на панели лнтигеноз. Принадлежность МКА к подклассу IgG определялась при помощи преципитирующих козьих антисывороток против иммуногло-

будинов G мыши разных подклассов (Sigma, США) методом двойной радиальной иммунодиффугш. Наработка моноклональных антител проводилась In vitro в 50 - 250 мл пластиковых флаконах и In vivo -при ьнутрибрюшинном введении мышам BALE/c гибридомных клеток.

Температурко-пертурбационные дифференциальные спектры регистрировались на ДЕулучевых спектрофотометрах "Specord M4Ö" и "Specord LT» VIS" (Carl Zeiss, Германия) е интервале длин волн 250-333-нм при оптическом пути 1 см. Концентрация белка в опытах составляла 0,50-0,95 мг/'мл, интервал изменений температуры был 9*45°С. Бее исследования проводились в 0,005 М фосфатном буфере, содержащем 0,15 М НаС1, рН-7,2-7,3 (3SP). Расчет дол;- и числа пертурбируемых температурой тироэиновых и трилтофановых остатков производился на основании результатов, полученных при сопоставлении данных для белков и соответствующих модельных растворов этих аминокислот (Demchenko, Zyira,lS77; Демченко, 1931) с учетом взаимного вклада тирозинового и триптофанового максимумов при длинах волн 288 и 295 км. Общее число тирозиноЕых и трилтофановых остатков в белке определяли спектрофотометрически (Beaven, Holiday,1952).

Спектры кругового дихроизма (КД) регистрировались на дихро-графе "Mark III" (Jobin Ivon, Франция). Дисперсия оптического вращения (ДОВ) исследовалась на спектрополяршетре 241 MC (Perkln-Elmer, Швеция).

Изучение агрегации иммуноглобулинов было выполнено методом лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС) в Санкт-Петербургском институте ядерной физики РАН им. Б.П.Константинова на установке, работающей в гетеродинном режиме (Лебедев и др.,1987). Источником излучения служил гелий-неоновый лазер с длиной волны 6S2.8 нм.

Определение констант связывания IeG с первым фактором комплемента Clq производилось по методике, основанной на исследовании изменения активности Clq при конкурентном ингибированнии его эффектором (Козлов и др., 1983).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ЮС 05СУЩЕИ1Е

Свойства полученных моноклональных антител

Создание мышиных гибридом, продуцирующих мококлональные антитела (ЫКА) к человеческим иммуноглобулинам, имеет большое ана-чение для изучения последних с помощью различных иммунологических методов. Чтобы отобрать диагностически ценные ЬНА, необходимо

иметь панель гибридом-продуцентов. Иммуноглобулины.способны связывать вещества не антигенной природы, такие как пептиды ' и ди-фильные соединения (Дудич и др.,1932; Burton, 1985; НеЕеродс-кий,1993). Мелиттин - основной компонент пчелиного яда, является пептидом с ярко выраженными диф ильными свойствами (Демченко, Костржевская, 1986). Поэтому использольэование этого вещества как модельного лиганда для изучения взаимодействия с IgG представляет интерес для понимания механизмов функционирования иммуноглобулинов. Ыоноклональные антитела к этому пептиду могут оказать больную помощь в исследовании процесса взаимодействия пептид-IgG. Исходя из сказанного, мы поставили перед собой задачу получения гибрздом, синтезирующих 1£КА к антигенным детермннантзм кммуногло-булинов человека и мелиттина.

В результате исследований была получена панель гибридом, из которой отобрано 13 устойчивых стаммов, выдержавиих более 20 пассажей в культуре и на животных и продуцирующих специфические МКА к тяжелым цеп™ IgG и IgU, их протеолитическим фрагмента.1.!, к легким цепям иммуноглобулинов человека, а также к мелиттину (табл.1).-Специфичность МКА исследовали в непрямом ИФА на панели из мо-ноклональных IgGl, IgG2, IgG3, IgS4 и IgA человека, выделенных из сыворотки крови больных миеломной болезнью; поликлонадьных IgG; их папаиновых Fab- и Fc-фрагментов; моноклонального IgM из сыворотки крови больного болезньв Вальденстрёмз и (Fc)sfi- трипсиноеых фрагментов этого белка; белков Еенс-Джонса (а- и Х- лёгкие цепи) из мочи больных миеломной болезнью; искусственно синтезированного мелиттина; фосфолипааы, выделенной из яда пчелы и бычьего сывороточного альбумина (в качестве контроля) '

МКА В2, ВЗ, Е5, 1Д4 специфически взаимодействуют с IgU человека и (или) их (Fc)5(1-фрагментшл1, но не реагируют с Igu, IgA и лёгкими цепями. Это свидетельствует о том, что антигенные детерминанты, распознаваемые этими антителами, расположены на тяжёлой . д-цепи. Особенно интересны, с насей точки зрения, МКА ВЗ, реагирующие только с (Рс)5Д-фрагментами. (ко не с цельной молекулой 10А). Очевидно, что антигенная детерминанта, с которой реагируют МКА ВЗ, в интактной молекуле IgM экранирована РаЬ-фрагментами. Применение таких МКА очень перспективно для оценки качества препаратов IgU (например, при их длительном хранении), широко применяемых для медицинских я научных целей. Наличие реакции препарата с МКА ВЗ свидетельствует о распаде молекул и его непригодное-

Таблица 1. Специфичность полученных моноклональных антител

На- Под-:)

зва- КЛ ££ С«.

ние МКА :

В2 1£(32Ь

ВЗ 1ен31

В5 1861

1А4 1@\31

А5ЕЗ 1ц31

2311 1831

Л2Н2 1^31

Н1135 1§02а

2Н11 1е-31

2П1 1831

ЭК2

£5 1^31

Антигены

:паза:

а : \ :

V: Л : а

2К11 + 2РИ

+ + + т + Т + - -

+ + - + + + - - - -

+ + - - - -

+ + + + + - - - -

+ + + + + ч- - - -

+ + + -г * - -

+ - + - -

— т + 4-

* * * * л эк г ■

2Н11+ 5Н2

■?М2

М2Р5 1-2131 *

Примечание: - - способность взаимодействовать с антигеном (по данным икмуноферментного анализа), * - способность прс-ципи-тировать антиген.

ти для дальнейшего применения.

МКА А5БЗ, 2611, Л2Н2, Н1165, 2Нх1 и 2F11, взаимодействуют с рагличт?.):; антигенными детерминантами IgG человека, но не с Ig-A, IgM и легкими цепями. Это свидетельствует о том, что распознаваемые детерминанты расположены на тяжелых т-цепях. МКА А5ВЗ не реагируют с ! g'G2. .V5íA 2G11 и Л2Н2 специфичны к антигенной детерминанте, расположенной в шарнирной области (отсутствует реакция с Fai- и Fс- фрагментами), но не взаимодействуют соответственно с jg-G3 л Ig64. МКА H11S5. 2Ш1 и 2F11 реагируют со всеми подклассами Ig'3. причем H11G5 и 2Н11 взаимодействуют с антигенными детерминанта!.:!:. расположенными в шарнирной области, a 2F11 - с антигенной детермлнаятсй, повторяющейся на Fab- и Fe- фрагментах Ig-G.

!¿KA. продуцируемые пйридомкым птаммом Е5, распознают анти-neHKj-j дет- рминаяту, расположенную на \-легких цепях иммуноглобулинов человека. a SH2 - на ае-легких цепях.

МКА M2F9 епеш-фгчески'ззаимс'действуют с мелиттином, но не реагируют с другим компонентом пчелиного яда - фосфолипазой. Возможность использования этих антител для выяснения механизмов взаимодействия мелиттина с липидными мембранами была продемонстрирована в исследованиях, проведенных в Институте биохимии им. А.З.Палладина АН Украины (Костржезская и др., 1992).

Реакции иммунопреципиталии широко применяются в иммунологической практике (Сримель ,19-57). Для этих целей используются по-ликленальные антитела к исследуемому антигену. Невозможность в большинстве случаев применения в реакциях иммунопреципитации ЫКА обусловлена тем. что последние способны связывать только одну антигенную детерминанту. Однако, применение МКА в этих методиках очень перспективно, т.к. во-первых, использование МКА позволяет стандартизировать исследования (в то время как препараты поликло-нальных антител по понятным причинам значительно варьируют от партии к партии), а во-вторых, наработка МКА в больших объемах более технологична и обходится дешевле, чем получение соответствующих кол!пеств поликлональных антител.

МКА могут формировать преигаитационнув решётку с антигеном в двух случая:-:; 1 - когда антигены несут по крайней мере две одинаковые детерминанты, 2 - если в системе имеется смесь хотя бы ДЕух разных ¡¿KA, каждое из которых специфично к одной из двух разных детерминант данного антигена. Если в качестве антигенов используются иммуноглобулины, то возможны обе перечисленные ситуации.

Способность МКА к иммунопреципитации оценивали методом двойной радиальной иммунфдиффузии по Оухтерлони. Оказалось, что этим свойством обладают только четыре 1ÍKA к иммуноглобулинам челозека.

МКА В2 способны прецилитировать антиген - IgM, что можно объяснить десятикратным повторением каждой ив антигенных детерминант в пентамере IgM и его (Fe)5Д-фрагментах.

Остальные МКА приобретают способность к иммунопреципитации только в парных смесях. Как уже было отмечено, МКА 2Н11 и МКА 2F11 специфичны к г-цепям иммуноглобулинов. Так как МКА ЗН2 взаимодействуют с ж-легкими цепями иммуноглобулинов, то смеси антител ЕК11+ЗН2 и 2FÍ1+3H2 можно использовать для определения типа легкой цепи lg<3. Образование иымунопреципитатов смесями УНА 2F11+2H11 и 2Н11+ЗН2 (или 2F11+3H2) свидетельствует о том, что исследуемым антигеном является IgG, содержащий «-легкие цепи. Если же преципитат образуется только с МКА 2F11+2H11 и не формируется с 2Н11+ЗН2 (или 2F11+3H2), то это позволяет сделать вывод о том, -что паралротеив IgG содержит Х-легкие цепи.

Особый интерес приобретают полученные результаты в свете возможности их использования для создания диагностических тестов в ¡-.линической и лабораторной практике. Как известно, уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови и их качественный состав сильно варьируют при различных патологических состояниях. Наиболее показательны изменения ишукоглобулшювой фракции при паралротеинеми-ческих гемобластозах. Чаще среди последних (1,2 -1,5 случаев на 100 ООО населения) встречается миелоыная болезнь, идя'множественная миелома. Множественная миелома (генерализованная плаэыоцито-ыа, болезнь Рустицкого-Калера) - заболевание, сопровождающееся возникновением злокачественной опухоли, субстратом которой является клон зрелых плазмоцитов (Дьюри, 1937). Поэтому в крови таких больных обнаруживаются в высоких концентрациях моноклональные иммуноглобулины (так называемые парапротеины), синтезированные опухолевой тканью. Это; в свою очередь-, приводит « значительному повышению уровня иммуноглобулинов з сыворотке крови и увеличению гомогенности т-глобулиновой фракции. Последнее можно выявить, с одной стороны, изучая соотношение типов лёгких цепей в пуле сывороточных Ig (наличие моноклональной фракции неизбежно ведёт к нарастании уроЕНЯ ж- или Х-цепей, в зависимости от того, какой тип цепи присутствует в парапротеине), а.с другой - по форме дуг преципитации в иммуноэлектрофорезе (наличие интенсивной, с чёткими

границами, обычно укороченной дуги'преципитации, соответствующей моноклональной фракции иммуноглобулинов, так называемого м-градиента) (Андреева, ЧернохвостоЕа,1535).

Для определения концентрации 1еЗ в сыворотке крови и соотношения зе/Х легких цепей в фракции мы использовали полученные нами монокяснальнке антитела в методе простой радиальной иммуно-диффузга по Уанчини (Еем, 1987). Для построения калибровочного графика в качестве антигена использовался моноклональный 1§64зе Злы. Были исследованы сызоротки крови больного Тка (с предположительным диагнозом - миеломная болезнь) и здорового человека. Получены следующие результаты. В сызоротке крови здорового человека содержание суммарного - 11,1 мг/мл, ¡рйг - 8,7 мг/мл, в сыворотке крови больного Тка - соответственно 24,3 мг/мл и 3,6 мг/мл.. Нормальная концентрация 1е-3 в сыворотке крОЕИ составляет 8-16 мг/мл (Амброзиус п др., 1931). Таким образом, у больного Тка обнаружено повыгеяло-э содер>-.акие Однако, гипергаммаглобулинемия может ш.!5тъ место при очень многих заболеваниях. Поэтому для выявления парапротешгемзп! важное значение имеет анализ соотношения з суммарной фракции 1д<3. Зто соотношение з норме составляет по данным разных авторов от 0,3 до 0,7 (Тернер,1933; Андреева, Чернох50стовг,1925; Носик,1991). Концентрация 1£ОХ у Тка есстзр-ллз 20,7 .»¿т/мл (24,3 минус 3,6), а соотношение ¡гЗХЛдвз -5,8, з то Ере:« как для здорового человека эти цифра составили соответственно 2,4 мг/мл (11,1 минус 8,7) и 0,3. Таким образом, :-:з сснозанга полученных результатов моляо сделать вывод, что у больного Тка наблюдается гкпергаммаглобулинемня, обусловленная парэлротетаемией 12<ЗХ.

2ажноэ эначоине з дпгггностпкэ пзрапротеикемических гемоблас-тогоз имеет ^.¡унзэдектрсфорзз. Результаты, полученные этгал методе:.! с использованием нгдпи: прещтнифущих мояоклонзльных антител (2Р11+2Н11 - анти 1гЗ и 32 - антн 1дМ), показали наличие в крови, больных Тка и Гам Н-грздкента, обусловленного соответственно па-рапротекнами и 1£М.

Нояоклокзльные антитела Н2Г9 к мелиттину такяа обладали способностью к пммунолреципитащш (табл. 1). Зто объясняется тем, что данный пептид а солевых растворах способен к олигомэризащш, Повторен::- антигенной детерминанты и создаёт условия для возник-поеэии.ч прэп'.шнтационнон репЭтка при реакции 1НА-мелзггткн.

Тати образом, была создана панель гибридом, продущфуззпшх

МХА к иммуноглобулина.4,; человека и амфифильному пептиду мелиттину. Полученные МКА были использованы в дальнейших исследованиях для изучения изменений свойств иммуноглобулинов при патологии и выяснения причин, которые лежат в основе этих изменений.

Исследование устойчивости конформации сывороточных IgG в норме и при патологий в сравнительном аспекте

Для выяснения механизмов выполнения иммуноглобулинами их биологических функций важное значение имеет исследование происходящих в них конформационных изменений. Причем больший интерес представляют не денатурацнонные процессы, а тонкие конформацион-ные переходы, не сопровождающиеся нарушением вторичной структуры, заключающиеся в изменении междоменных взаимодействий в молекуле IgG. Для регистрации таких изменений может быть применен только достаточно чувствительный метод. Именно таким методом является температурно-пертурбациоаная дифференциальная спектрофотометрия (ТВДС), позволяющая оценивать микроокру»?ние хромофорных аминокислот в белке (Демченко,1931).

С помощью метода ТПДС ш изучали конформационные переходы, возникающие в IgQ под действием мочевины. Оказалось, что это вещество е концентрации 12% ещё не приводит к денатурационкым изменениям •' (по данным кругового дихроизма и -дисперсии оптического вращения). Однако при такой концентрации в IgQ здоровых людей наступает конформационноэ изменение, регистрируемое в ТЦЦС уменьшением тирозинсгаого (288 ны) и триптофзнового (2S5 нм) максимумов. Описываемый конформационный переход полностью обратим: после перевода IgG иэ раствора 12S мочевины в 9ФР диализом восстанавливается исходный |температурно-пертурбационньш дифференциальный спектр. В таблице ? приведены данные ТЦДС для пятнадцати препаратов IgQ, полученных иэ сыворотки крови здоровых ладей. Во всех случаях е 12Z мочевине наблюдается уменьшение числа пертурбируе-ыых температурой тирозинов в среднем на 17,2±0,9, что составляет примерно-половину от общего числа остатков, пертурбируемых в IgG, находящихся в ЗФР (36,1+1,5). Уменьшение числа пертурбируемых триптофанов значительно меньше (на 2,0±0,3).

Таким образом, основным параметром, характеризующие устойчивость конформации Ig6 при данных условиях эксперимента, является число пертурбируемых температурой тирозиновых остатков. Поэтому для оценки глубины воздействия 12Z мочевины на конформации IgQ по

с

- 15 -

Таблица 2. Результаты температурка-пертурбационной дифференциальной спектрофотометрии 1е6 здоровых людей в ЗФР и 12% мочевине

Препа-:Коли-раты гчестзо ¡26 :доноров

доля : кол-во(х) : доля : кол-во (у)

Л 1 1 , 0,574 32,1 0,280 15,7 16,4 2,04

л 2 1 0,570 31,9 0,116 6,5 25,4 4,91

д 3 1 0,449 25,2 0,222 12,5 12,7 2,02

д л 1 0,612 34,3 0,316 17,7 16,6 1,94

д •5 1 0,686 42,9 0,381 23,8 19,1 1,80

д 6 18 0,527 31,1 0,241 14,2 16,9 2,19

д 7 1 0,528 35,3 0,301 20,1 15,2 1,76

Д 8 0,560 37,0 0,326 21,5 15,5 1,72

Л 9 1 0,523 33,4 0,358 22,9 10,5 1,46

д 10 1 0,541 35,3 0,250 16,4 18,9 . 2,15

д 11 21 0,556 42,5 0,405 26,2 16,3 1,62

л 12 15 0,695 40,4 0,362 21,1 19,3 1,91

д 13 1 0,617 34,8 0,284 16,1 18,7 2,15

л 14 2 0,896 48,9 0,505 27,6 21,3 1,77

д 15 5 0,637 35,8 0,373 20,9 14,9 1,71

Ц- 36,1 18,9 . 17,2 2,08

б-± 5,7 5,6 3,5 0,81

ш-± .1,5 1,4 . 0,9 0,21

дачным ТВДС мы введи коэффициенты х-у и х/у, которые являются- соответственно разностью и отношением расчетного числа пертурбируе-мых температурой тирозиновых остатков (х) и этого же показателя для белка, находящегося в 12% мочевине (у). Коэффициент х/у может принимать значения от 1 для еысоко устойчивых к мочевине белков (когда ТЩС практически не меняется в присутствии мочевины) до 2 и более в случае выраженного конформационного перехода ( когда з присутствии мочевины наблюдается значительное уменьшение максиму-

ыоз Т1ЩС при 288 и 295 нм). Для IgQ здоровых людей имеет место как раз последнее, х/у - 2,0Э ± 0,21.

Для Еыяснекия локализации изменений конформации, Еозникасщих под влзгянием мочевины е молекуле IgG, мы исследовали отдельные фрагмента и цепи иммуноглобулинов. Конформационный переход, вызванный действием 121 мочевины, не только сохраняется в Г(аЬ')2-фрагменте, но его амплитуда даже больше, чем в цельной молекуле. Так, в IgG Д 9 уменьшение числа пертурбируемых температурой гирозинов в 12Z мочевине составляет 10,5 остатков, а в Г(аЬ')г-фрагмонте - 16,5. Полученный результат свидетельствует о стабилизирующей роли Fc-фрагмента, не позволяющего цельной моле-коме IgG претерпеть полностью такое же конформационное изменение, какое имеет место в изолированной Р(аЬ')2-облаотп. В результате изучения эффекта отдельно на Fab- и Fc-фрагментах, выделенных после папаинового гидролиза IgG, показано, что уменьшение числа пертурбируемых тирозинов в присутствии 121 мочевины происходит в основном в .Fab-фрагментах IgG. Изменение жесткости мккроокружения хромофорных аминокислот в Fc-фрагменте незначительно и не превышает ошибку опыта (табл. 7).

Уменьшение числа пертурбируемых температурой тирозинов в Fab-фрагментах в 123 мочевине свидетельствует в пользу того, что данный растворитель ЕызыЕает конформационное превращение- в областях контактов между парой вариабельных и парой Сн1 и Cl-доменов, а также, возможно, в области антиген-связывающего центра, так как тленно в этих местах IgG сосредоточено большинство тирозиновых остатков. Эти данные подтверждаются результатами, полученными при, изучении белков Еенс-Джонса. Описываемый эффект регистрируется методом ТПДС не только в димерах легких цепей , но и в отдельных L-цепях.

Для выяснения причин возникновения конформационных изменений е IgG под влиянием мочевины, мы изучали её воздействие на белок, меняя рН и концентрацию солей в растворе. Изменение концентрации ионов Еодорода в растворе более, чем в 100 раз (рН 7,3 и 5,2), практически не влияет на эффект 12Z мочевины. Если при рН - 7.3 в IgG Д 6 число пертурбируемых тирозинов уменьшилось на 16,9 остатков, то при рН - 5,2 - на 16,0 остатков. Полученные результаты позволяют говорить о том, что описанный конформационный переход скорее всего определяется не изменением электростатических взаимодействий в белке.

- 17 -

Таблица 3. Результаты тешературно-пертурбацкояной дифференциальной спектрофотоыетрии 1^3 больных хроническим ллмфодейкоэом (развернутая стадия заболевания) в ЗФР и 12% мочезине

Препа- ТирозиноЕые остатки

раты пертурбируемые температурой

х-у V

X/ )

ЗФР 12% мочевина

доля : кол-во(х) доля : кол-во (у)

1 .0,457 25,6 0,448 25,1 0,5 1,02

2 0,319 17,9 0,315 17,6 0,3 1,02

3 0,495 30,2 0,497 30,3 ■0,1 1,00

4 0,419 23,4 0,419 23,5 -0,1 1,00

5 0,385 23,9 0,387 24,0 -од 1,00

6 0,320 19,2 0,317 19,0 0,2 1,01

7 0,339 24,5 0,368 23,1 1,4 1,06

8 0,355 23,1 0,357 23,2 -од 1,00

9 0,467 29,9 0,432 27,6 2,3 1,08

10 0,689 41,4 0,648 38,9 2,5 1,06

11 0,391 25,1 0,381 24,5 0,6 1,02

12 0,407 26,9 0,339 25,7 1,2 . 1,05

13 0,364 23,7 0,409 26,6 -2,9 0,89

14 0,331 22,2 0,345 23,2 :1,0 0,96

15 0,388 24,9 0,412 ' 26,4 -1,5 0,94

. 16 0,618 35,2 0,549 32,2 4,0 1,12

17 0,478 27,9 .- 0,526 30,7 -2,8 0,91

Ы~ 26,2 £б;о 0,3 1,01

б- 5,8 5,0 1,8 0,06

и-± ' 1,4 1,2 0,4 0>01

Как известно, небольшие концентрации солей улучшают' растворимость большинства глобулинов сыворотки крови, вдсорбнруясь на поверхности белковой глобулы и увеличивая её гидратацию. Увеличение концэнтрацш КаС1 в растворе существенно ослабляло действие

мочевины на IgG. Уменьшение числа пертурбируемых температурой ти-розшов в IgG Д 3 под .влиянием 127. мочевины в 0,005 U фосфатном буфере составило 16,8 остатков, в том же буфере с 0.9S (0,15 II) WaCi -, 12,7, а при концентрации NaGl 2,92 (0,5 М) - только 8,3 остатка. Сам же NaCl в указанных концентрациях не изменяет число пертурбируемых тирозинов и, следовательно, не влияет на четвертичную структуру IgG. Уменьшение эффекта 12Х мочевины на белок при увеличении концентрации ИгС1 можно объяснить стабшиэируюцш действием этой соли на структуру IgG.

Высокие концентрации солей,' наоборот, вызывают дегидратации белковой глобулы. . Хорошо известно дегидратирующее действие такой соли как сернокислый аммоний. Оказалось, что 30-; (также как

и 12 X мочевина) приводит к уменьсению числа пертурбируемых тиро-зинов в IgG Д 6: при концентрации 1DZ - на 6,5, а при 13% - уже на 16,8 остатков. Эти изменения были полностью обратима (они не- ■ чеаали при переводе IgG в 2£? диализом) и не сопрогоздалксь сколько-нибудь заметным увеличением мутности растворов, связанным с агрегацией белка. Сходство изменений по данным ТВДС, вызываемых в IgG 5тим веществом и 122 мочевиной может свидетельствовать' в пользу аналогичности механизма их действия - дегидратации отдельных областей белковой молекулы. Это же подтверждается тем, что само по себе уменьшение максимумов ТЦЦС в модельных растворах хромофоров свидетельствует об их переходе в более гидрофобное микроскружзние (Nicola, Leach,1976).

Еылвление специфически модифицированных иммуноглобулинов, которые могут возникать при патологическом процессе, является сложной задачей. Это связано с тем, что данные белки даже в здоровом организме гетерогенны. Причем эта Гетерогенность является биологически обусловленной и 1шеет важное функциональное значение. Изменение качественного и количественного состава иммуноглобулинов -задитньм физиологический ответ на заболевание. Для выявления отличий IgG при патологии мы использовали подход, основгнкый на изучении конформационноп устойчивости этих белков к действию 127. мочевины. Наиболее "жесткими" оказались IgG при хроническом лкмфо-лейкозе (табл. 3). При данной патологии число пертурбируемых температурой тирозиновых остатков при переводе белка па ЗФР в 12* мочев!шу изменяется очень незначительно: х-у - 0,3 ± 0,4; ::/у -- 1,01 ± 0,01. Эти цифры достоверно отличаются от таких же показателей, полученных для IgG здороеых людей (табл. 2): х-у -

Таблица 4. Результаты температурно-пертурбационной дифференциальной спектрофотометрш больных раком хелудка 2 35Р и 1231 мочевине

Препа- :Ста- Ткроэиновые остатки

раты : ДЛЯ пертурбируемые температурой

1га : габо- х-у к/у

:лева~ ЗФР : 127, мочевина

:ния

доля . кол-во(х) : доля : .кол-во (у)

лтр III 0,552 34,1 0,513 31,6 2,5 1,03

:-1зн IV 0,564 34,0 0,513 30,3 3,1 1,10

Здс IV 0,657 40,9 0,539 33,5 7,4 1,22

Зол III 0,491 23,2 0,467 26,8 1,4 1,05

Лггч IV 0,547 31,7 0,401 23,3 3,4 1,36

Свп IV 0,483 30,7 0,444 27,9 2,8 1,10

Арб ш 0,527 38,1 0,493 30,0 а, 1 1,27

Скл III . 0,585 37,5 0,398 25,6 11,9 1,46

2ор IV 0,541 33,8 0,427 26,7 7,1 1,27

Вес IV 0,534 35,5 0,445 29,7 5,8 Д.20

Нхт III 0 % 36,4 0,330 24,7 ".V 1,47

с IV 0,592 38,9 0,443 24,9 14,0 1,55

Кая III 0,629 25,7 ■ 0,426 24,1 11,6 1,49

:йс-: III 0,560 3215 0,369 21,4 11,1 1

Пгм III 0,575 32,4 0,399 22,5 3,9 1,44

. Ерм' III 0,567 32,7 0,433 25,0 7,7 1,31

дц21 III 0,593 33,9 0,423 24,0 9,9 1,41

дэз III 0,562 33,3 0,373 22,4 11,4 1,51

Оль III 0,625 2-4,9 ■ 0,490 27,3 7,6 1,28

Щгр III 0,542 30,7 0,435 24,6 6,1 1,25

3*1»3 26,3 8,0 1,32

б-; 3,1 0,7 3,3 0,3 3,6 0.8 0,16 0,04

- 17,2 ± 0,9 ^ - 17,2, р > 93.*!:), я/у - 2,03 ± 0,21 ^ - 5,1, р > 99X5 • Для выяснения причин обнаруженной модификации иммуноглобулинов' необходимо было на первом этапе разобраться, для како-

го круга патологических состояний отмечаются такие изменения.

В таблице 4 представлены результаты ТЦЦС, полученные по аналогичной методике для 20 IgQ, выделенных из сыворотки крови больных раком желудка III - IV стадии . Оказалось, что и при данной патологии IgQ значительно более устойчивы к воздействию 127. мочевины, чем IgG здоровых людей . Показатель х-у в среднем составил 8,0 ± 0,8, в то время как у здоровых доноров (табл. 2) эта величина была значительно больше. Отличия достоверны (t - 7,6, р>99Х). Интервал изменении х/у для злокачественных опухолей желудка был 1,05 - 1,56. Среднее значение х/у (1,32 ± 0,04). также достоверно отличалось от х/у в норме (t - 3,6, р > 99Х). Построив зависимость величины х/у от х-у, получаем очень характерную картину (рис. 1). Правее условной черты, соответствующей значению х/у --1,6, оказались точки, соответствующие IgG в норме, левее - IgG при опухолях (исключение составил .только IgG Д 9: х/у - 1,46).

С целью изучения динамики результатов ТЦЦС в процессе болезни в течение 1,5 лет наблюдался больной Зол с диагнозом рак желудка III стадии. За это время IgQ исследовался 4 раза: до операции, через 2 недели, 8 месяцев и 1,5 года после операции. До операции величина х-у составляла всего 1,4, а х/у - 1,05, однако через 2 недели после' удаления опухоли (комбинированной гастрэктошш) 12% мочевина-уже вызывала значительные изменения в ТЦЦС сывороточного IgQ (х-у - 15,2, х/у - 1,80). Больной поступил на плановое обследование через 8 месяцев после операции. При этом, наряду с отсутствием каких-либо'клинических проявлении распространения опухолевого процесса, данные ТЦЦС IgQ свидетельствовали о нарастании устойчивости белка к действию 12Z- мочевины (х-у - 12,6,- х/у -- 1,50). Через 1,5 года после операции больной снова поступил на обследование. При этом он был кахектичен, клинически были обнаружены множественные метастазы в печени, a IgQ улэ почти ке изменялся в мочевине (х-у - 6,1, х/у - 1,19). Эти данные могут свидетельствовать о корреляции мезду клиническим течением заболевания и степенью выраженности изменений в IgQ.

Моноклональная'иммуноглобулинопаткя (паралротеинамия), сопутствующая злокачественным новообразованиям нелшфовдного происхождения, при отсутствии признаков миоломной болезни встречается чрезвычайно редко. Такое сочетание от числа всех исследованных случаев парапротеинемии составляет всего 7-8% (Андреева, Чэрнох-Еостова, 1985; Дьюри, 1987). В связи с этим представляет интерес

х-у

гч

/6

<2

- / 1 1 1

1 . 1 ' * * 1 * % 1

- !•. •• ' 1 ••

- 1

- ** 1 1 1

Л 1 % ■ ' 1

'/у

Рис. 1. Соотношение показателей ТПДС х-у и х/у для 1еО здоровых людей (1) и больных ракой желудка (2).

обнаруженная нами парапротеинемия у больного Смк со злокачественной опухолью желудка IV стадии. Данные цитологического исследования пункгата костного мозга, отсутствие костных изменений (рентгенография) и белка Бенс-Джонса в моче не дают оснований говорить о диагнозе множественной шеломы. Для качественной очистки пара-протеина был применён метод аффинной хроматографии с использованием полученных на>ш моноклональных антител Л2Н2.

Особенности техники аффинной хроматографии требуют для снятия антигена с сорбента применения растворов с рН - 2,0 - 3,0 или с

высокой молярноетью соли (Дин и др.,1588,- Rumbley et al.,1993). При эхом могут происходить денатурационные изменения е белке, делающие препарат IgG непригодным для исследования в чувствительных спектральных методах. Поэтому для нашей цели не подходили иммуно-сорбенты на основе МКА, взаимодействующие только с одним подклассом IgG, хотя выделенные на таких сорбентах иммуноглобулин не теряют своих антигенных свойств и могут применяться в различных кммунохимических методах. Для получения аффинного носителя ш использовали МКА Л2Н2 против IgGl.2,3 человека. Иммуносорбент на основе Сефарозы-4В и ША приготавливался перйодатным методом (Hoffmann, O'Shannessy, 198S). Перед выделением колонка тщательно отмывалась с помощью ЗФР. Затем вносилась суммарная IgG-фракция сыворотки крови. При элюции этим же буфером на колонке сорбировались IgGl, IgG2 и IgG3. Белок, находящийся в элюате по данным диск-электрофореза не содержал примесей, а по результатам твердофазного ИФА с мышиными ЫКА против подклассов IgG человека представлял собой чистый IgG4. Методом двойной радиальной иммунодиффу-зии по Оухтерлони было обнаружено, что парапротеин IgG Смк содер-жиг в своем составе ае-лёгкие цепи.

Еыделенный белок был сконцентрирован, отдиапизован против ЗФР и использован для исследования устойчивости кокформации к воздействию 12X мочевины методом ТЦЦС. Результаты ТЦЦС поликло-нальной фракции IgG Смк и аффинно выделенного из нее IgG4 показали, что парапротеин обладает меньшей степенью устойчивости к воздействию 12% мочевины по сравнению с поликд опальным IgG (х/у -1,76). В то же время пул IgG Смк оказался более устойчив к воа-_ действию мочевины, что характерно для IgG при новообразованиях.

Таким образом,, создан аффинной сорбент.для выделения IgG4 при физиологических значениях рН и ионной силы раствора, что позволяет использовать выделенный на таком сорбенте белок для тонкого конформационного анализа. . ...

Мы исследовали также 11 препаратов IgG, выделенных из сыворотки крови больных с язвенной болезнью желудка и двенадцатипере-. тной кишки (табл. 5). Результаты Т1ЩС оказались промежуточными по отношению к IgG здоровых людей и IgG при раке желудка. Наряду с белками, претерпевающими под действием мочевины выраженный кон-формационный переход (IgG Очр, IgG Дбв, IgG Мит, IgG Baa, IgG Акр), были обнаружены IgG, более устойчивые к воздействию мочевины (IgG Гол, IgG Кра). В среднем же, тем не менее, показатели

- 23 -

Таблица 5. Результаты температурнй-пертурбационной дифференциальной спектрофотометрии IgG больных язвенной болезнью желудка (Ж) и двенадцатгаерстной кизки (ДПК) в ЗФР и 12Z мочевине

Препа- : лока-раты :лиза-IgG :ция : язвы

30? : 12Х мочевина

доля : кол-во(х) : доля : кол-во (у)

Очр Я 0,562 35,5 0,241 15,6 20,9 2,34

Дбв S 0,703 46,6 0,351 23,1 23,5 2,02

Мит H 0,723 46,1 0,411 25,0 20,1 1,7?

Гол я 0,641 35,4 0,500 27,6 7,8 1,23

Зел ж 0,692 40,5 0,482 23,2 12,4 1,44

Арг s 0,656 37,3 0,424 24,1 13,2- 1,55

Сфш S, ДПК 0,650 33,3 0,449 25,6 13,2 1,52

Еаа ДПК 0,852 46,6 _ 0,498 27,3 19,3 1,71

Акр дпк 0,717 41,2 " 0,397 22,9 18,3 1,80

Нра ДПК 0,666 37,1 0,431 26,7 10,4 1,39

Мак ДПК 0,703 41,2 0,434 25,3 15,9 1,63

М- 40,7 . 24,8 ' 15,9 1,68

б-± - 4,2 3,5\. 4,9 0,30

' 1,3 1,1 1,5 0,09

ТПДС достоверно отличались от такзгх же показателей для больных со злокачественными опухолями желудка. Для тирозиковых остатков соответственно х-у - 15,9 ± 1,5 и 8,0 ± 0,3 (.1 - 4,6, р>99£), х/у - 1,68 ± 0,09 и 1,32 ± 0,04 (1 - -3,7, р > 997.).

Иммуноглобулины 6 были изучены также при нозообразоЕаюих некоторых других локализаций: раке прямой кишки, раке желчного пузыря, раке легкого, раке щитовидной железы, раке кожи, меланоме кожи, лимфогранулематозе, мисме матки (табл. 6). Ео всех случаях обладали повышенной устойчивостью к воздействию мочевины (х/у не превышало 1,6), причем наиболее "жёсткими" бедками оказались

при раке легкого (х/у - 0,93) и меланоме коми (х/у - 1,19). Так как при большинстве новообразований наблюдается распад опухолевой ткани, было высказано предположение, что одной из причин модификации может быть лигандирование образующимися при этом продуктами деградации клеток. Для проверки этого предположения в качестве объекта исследований был выбран 1гЗ, выделенный иэ сыворотки крови больного с острым алиментарным отравлением уксусной эссенцией (1^3 Шиш), так как при этой патологии наблюдается массированный гемолиз эритроцитов (Лыжников,Костомарова,1989), и крозь насыщена продуктам!! распада клеток. Концентрация свободного гемоглобина в плазме крови у данного больного составляла 1,15 г/л (при норме 0,01-0,07 г/л). При исследовании 1г-3 методом ТЦЦС в 35? и в 12.1 мочевине были получены следующие результаты (табл. 6). Для тирозиновых остатков коэффициенты х-у и х/у составили соответственно 7,8 и 1,31, что соизмеримо с данными, полученными для 1еЗ при новообразованиях. Таким образом, при гемолизе эритроцитов также появляются обладающие повышенной устойчи-

востью к воздействш 12Х мочевины.

Наличие аналогичной модификации иммуноглобулинов (табл. 6) при таких ваболезанпях, как ревматизм (активная фаза), ревматоидный артрит (активная фаза) и бронхозктатическзя болезнь ( х/у соответственно 1,31, 1,53 и 1,39) также может свидетельствовать о корреляции деструктивных процессов с появлением в сыворотке крови иммуноглобулинов с повышенной устойчивостью конформации.

Таким образом, при ряде патологических состояний, сопровождающихся деструктивными процессами, впервые обнаружены качественно изменённые 1ёБ, достоверно отличазщкеся от нормальных 1^3 повышенной конформащкнной ригидностью.

Анализ причин кзмзкенкя свойств иммукогдобудпюз при новообразованиях и других патологических состояниях Практически всегда при новообразованиях происходит распад опухолевой ткани. Воанккгэщкз при атом продукты деградации клеток еопздеит в кровяное русло, где могут взаимодействовать с белками сыворотки крови, б том числе с иммуноглобулинами, что мо;*ет ¡»менять свойства последних. Причем речь в данная случае идет не о реакции антиген-антитело, а о неспецифическом лигандиропашш. Зогиожносхь такого взаимодействия 1еб с различными нкзксыолэку-лярннли факторами хорошо известна (Завьялов, 1984; ОшЛсЬ с-1 а1.,

Таблица 6. Результаты температурно-пертурбационной дифференциальной с-лектрофотометрии 1еС больных с различной патологией в ЗФР и 12Х мочевине

Пре- Ста- Тирозиновые остатки,

па- дия пертурбируемые температурой

ра- Патология за- х-у х/у

ты бо- ЗФР : 123 мочевина

IffG ле-'

ва- доля ; ко- доля : ко-

ния : ли- : : ли-

: чест-: : чест-

: во : : во

: 00 : : (У)

йчг рак прямой II 0,657 41,0 0,478 29,8 11,2 1,38

кзазжи

Бгч рая прямой IV 0,541 33,2 0,387 23,8 9,4 1,39

кишки

Прч рак прямой III 0,672 45,2 0,471 31,6 13,6 1,43

кишки

Кзм рак желчного IV 0,507 29,1 0,334 19,3 9,8 1,51

пузыря

Кон рак легкого III 0,554 28,9 0,567 29,6 -0,7 0,98

Трц рак щитовид- ■III 0,729 46,2 0,512 32,4 13,8 . 1,43

ной железы

Хрс рак кожи II 0,729 47,0 0,475 30,6 16,4 1,54

Бал меланома III 0,511 24,7 0,431 20,8 3,9 1,19

ката

Ток лимфогрануле- II 0,564 31,6 0,412 23,1 8,5 1,37

матоз

Фир лимфогрануле- II 0,529 29,6 0,343 19,2 10,4 . 1,54

матоз

Лен мисма матки - 0,648 40,9 0,449 28,3 12,6 1,45

Крз бронхоэктати- .0,716 44,1 0,517 31,8 12,3 1,39

ческая болезнь

Кош ревматизм, - 0,585 32,6 0,444 24,8 7,8 1,31

активная фаза,

П степень

активности

Бек ревматоидный - 0,630 36,6 0,413 24,0 12,6 1,53

артрит.

активная фаза,

II степень

активности

Шиш острое отрав- - 0,574 32,7 0,437 24,9 7,8 1,31

ление уксусной

кислотой *

1591; Троицкий и др. 1991?. Одним иэ основных компонентов меточных мембран является .фосфатидилхолин, или лецитин. Это вещество высвобождается в больших количествах при гемолизе эритроцитов. Наличие гидрофобных сайтов на поверхности IgG (Eurton, 1555) делает возможным взаимодействие этого белка с амфифильныыи соединениями. Еще в 1S67 году Г.Е. Троицкий писал: "Поскольку камлая белковая молекула имеет гидрофобные гоны, почти Еее белки имеют свойства липопротеинов, хотя бы они и были чип шли протеинами. Известно, что огромнее большинство белков именно по причине оушеетвованил гидрофобных зон легко комплектируется с липидами". Возможность взаимодействия IgG с амфифильными лигандами былэ однгеначно продемонстрирована б работах (Троицкий и др.,1991: Кегеродсклй,1995).

Исходя из Есех этих Фактов, мы решили исследовать сЕСнотва IgG здорового человека в присутствии лецитина '.табл. 7}. Оказалось, что при молярном соотношении в растворе лецитин:IgG -5:1, белок приобретал значительную устойчивость к воздействию IS', мо-чеЕины, Х'у-1,34 (в то время как в отсутствии лецитина эта величина составляла 1,77). Напомним, что при злокачественных опухс-дях лелудка х/у - 1,32 ± 0,04. а при отравлении уксусной кислотой и гемолизе эритроцитов - 1,31. (Увеличение х-у при дальнейшем повышении концентрации лецитина может свидетельетЕОвать о начале де-натурааионных изменении в IgG при воздействии высоких концентраций гидрофобного .агента).

Установив этот факт, мы исследовали содержание обеих лиг.идов в препаратах IgG здорового человека и больных раком желуде с помощью метода, основанного на восстановлении липидами хромовой кислоты (Маркова,1959}. Оказалось, что при данной патологии содержание липидое в IgG было более,' чем в два раза выше ( б 5 мг препарата IgG здорового человека обнаруживается SO мкг, а в 5 иг IgG больных раком - 170 - ISO мкг липидое).

Известно, что с IgG могут взаимодействовать пептиды не антигенной природы. Так, в частности, обнаружено, что с Сн2-доменами IgG связан полипептид с молекулярной массой оксло 2000 (Дудич и др., 1932, Dudlch et al.,19S3, 1991). Отмечена возможность комплекс ирования IgG и с другими веществами пептидной природы (Завьялов, 1934). Бее это натолкнуло нас на мысль исследовать взаимодействие IgG не только с липидами, но и с амфифильными пептидами. Б качестве такого модельного вешества прекрасно подходит мелиттин из яда пчелы, имеющий молекулярную массу около 2700. состоящий из

- 2/ -

Таблица 7. Результаты температусно-пертурбационнсй дифференциальной спектрсфотометрии IjO, РаЬ- и Рс-£рагментсв !гЗ здоровых лпдей

:Наличие в системе: Тирозины. : Тирсэины. : Белек. : амфпфильнсго ее- :пертурбируемые:пертурбируемые:

:единения ¡.коли- : в ЗФР :в 12* мочевине: х-у

:чествс молей на :------'--------:--------------:

: один моль белка) : Деля: доличест-: Доля: Количест-: : : : во (х) : : во (у: :

IgG кет 0 ,622 34 О 0.315 17," 15, с 1 54

rat нет 0 ,639 15 1 0.445 9,3 5.3 1 54

Fc нет 0 .215 2 6 0,155 2.3 0.3 1 1 2

Ig-3 ДН кет и ¿95 43 9 0.506 о Г* 6 п л .-*. el,-. 1 ""

лецитин С \ 0 ,709 S3 7 0,530 23, 9 5.3 1 34

лецитин (ю и ,б"2 35 т 0,427 23, 9 12,3 1 54

лецитин (50 ) 0 ,740 40 4 0,460 25. 1 15,3 1 51

мелиттик 5 0 .695 33 г. 0,593 32, 4 5.5 1

мелиттик (после

диализа 1) о .744 40 5 0,519 23, 3 12.3 1 43

Fat' нет мелиттин (после о ,788 16 S 0,505 10, 3 б, 1 л 55

диализа 0,2) 0,632 14 6 0,423 9. - 5,5 1, 52

аминокислотных остатков, формирующих гидрофобную и гидрсфиль-:-у?з области. Мелиттин является xopecnai иммунсгенсм i King- et al. , 1934), что позволило нам получить гибридс-му, продуцирутещус МХА. специфически реагирутсщ:е с атта пептидом.

Было обнаружено, что если мелиттик и ¡?3 здорового человека присутствуют з растворе в молярном соотнесении 5:1, то IgG приоб- , ретаот высокую устойчивость к воздействию 12?; мочевины: зоу -Ч'" (без мелиттина х/у - 1,77). После диализа смеси от пептида rij- утрачивал повышенную "десткость" (х/у - 1.42}. С ясмошьв ЙКА в количественном ИФА определено, что на каждой молекуле 'g-3 при зтем сорбировалось по 1 молекуле мелиттина (табл. "}.

Суммируя эти данные, можно сделать вывод, что взаимодействие амфифильных соединении с IgS здоровых людей моделирует пс-вшенну» устойчивость кэнформации белка, характерную для 1^3 при патологии.

В дальнейшей была исследована локализация места лигандирова-ния IgG. Для этого эксперименты ставились на изолированных фрагментах иммуноглобулинов. Выяснено, что конформационный переход, вызванный 12% мочевиной, локализован в Fab-фрагментах. В то же время оказалось (данные количественного ИФА с использованием МКА к мелиттину), что мелиттин связывается с Fc-фрагментами. Эти данные хорошо коррелируют с результатами работ (Троицкий и др.,1991, Неверодский, 1993), в которых показано, что другое амфифильное ' соединение - катионогенный детергент ДТ-2, также связывается с Fc-фрагментом IgG (данные получены с помощью детергента, меченного радиоактивным тритием).

Полученный нами результат может иметь важное значение не только для понимания причин модификации IgG при патологии, но и для выяснения механизмов функционирования иммуноглобулинов. Ведь если связывание лиганда с Fc-фрагментом приводит к значительному увеличению устойчивости Fab-фрагментов к воздействию мочевины, это может свидетельствовать о наличии конформационного перехода в Fab-области IgG, индуцированного лигандированием Fc-фрагмента.

. Один из важных вопросов, который предстояло выяснить - отражается ли увеличений устойчивости конформации IgG, характерное для патологии, на функциональных особенностях этих белков. Поэтому с помощью метода, основанного на ингибировании активности первого фактора комплемента (Clq) эффектором, исследовалось взаи- •' модействие Clq с IgG в норме и при патологии. Оказалось, что некоторые IgG, выделенные из сыворотки крови больных с новообразованиями различных локализаций .обладают аномально низким сродством к Clq. Константа диссоциации комплекса IgG-Clq для IgG из сыворотки крови больных (хронический лиыфолейкоз, меланома кожи, рак легкого, рак желудка) в среднем равна (5,95 ± 1,93) х 10"6 Ы, что достоверно превышает константу для IgG здоровых людей, раЕную (1,65 ± 0,30) х Ю-6 М (t - 2,2; р > 95%). Особенно слабое взаимодействие Clq с IgG наблюдалось а случае хронического лимфолей-коза : Кд - (8,91 ± 2,95) х 10~б Ы. Причиной наблюдаемого феномена может быть экранирование комплементсвязываацего участка IgG. С другой стороны, так как известно, что сайт СЕягтания Clq расположен на Сн2-домене, мояшо предположить, что именно здесь происходит взаимодействие IgG и с емфифильными лигандаш.

На модельной паре ыоноклональное антитело - антиген методом ИФА было исследовано влияние фосфатидилхолнна и мелиттина на ан-

. - 29 -

Таблица 8. Исследование взаимодействия моноклоналъных IgG-антител H11G5 с антигеном (IgG Д18) методом ИФА (результаты даны з значениях зкстинкции при длине волны 4С5 нм)

Образец антител

Разведение антител (в неразведанном образце 600 мкг/мл LHA)

1/400 г 1/800 : 1/1600 : 1/3200: 1/6400

1. ¡штактные МКА

2. МКА в присутствии мелиттина в молярном соотношении 1:5

3. образец 2 после диализа

4. МКА в присутствии лецитина в молярном соотноаении 1:5

5. образец 4 после диализа

0,273 0,227 0,195 0,167 0,150 0,207 0,190 0,146 0,102 0,079

0,223 0,195 0,157 0,125 0,091 0,177 0,151 0,131 0,119 0,084

0,228 0,151 0,143 0,106 0,110

тигенсвязывающую функцию антител. На планшет, сенсибилизированный антигеном (IgG Д18) в концентрации 5 мкг/мл, вносились в различных разведениях препараты моноклоналъных IgG-антител H11G5 (МХА в присутствии мелиттина или лецитина, эти же образцы после диализа, а также интактные МКА). Проявление связавшихся ЫКА осуществлялось конгюгатсм бараньих антител против IgG мьш с пероксидазсй хрена, субстратом служила смесь ABTS с НгОг- Выяснилось (тзбл. 8), что присутствие в растворе мелиттина или лецитина в соотношении 5 молей на 1 моль IgG-антител вызывает ослабление взаимодействия МКА с антигеном (меньшие значения зкстинкции в ИФА по сравнению с тагами же результатами для интактных ЫКА). Важно отметить, что МКА, отдиализованные от избытка лиганда, также обладали меньшей анти-генс'вязывающей активностью по сравнению с МКА, не контактировавшими с дифильными соединениями. Причиной наблюдаемого эффекта может быть изменение конформационного состояния Fab-фрагментов IgG при взаимодействии IgG с дигандсми.

Методом лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС) было по-

казано, что гидродинамический радиус мономеров больного раком желудка оказался меньше по сравнению с 1е<3 здорового человека (соответственно 6,30 ± 0,36 ям и 7,30 ± 0,45 нм). Этот факт можно объяснить уменьшением гидратной ободочки 1^3 при патологии, что вероятно связано с увеличением гидрофобности поверхности белка при связывании с лигандами. Ыетод ЛКС показал совершенно различное распределение частиц по размерам в растворах Если 1^3 здорового человека находились только в мономерном состоянии (размер частиц 6,8-7,6 нм), то 1е<3 больного раком желудка присутствовали в растворе как в виде мономеров (5,8-6,7 нм), так и в виде агрегатов (19,"9-23,7 нм). Причем массовая доля олигомеров была минимальна (всего 0,3 - 0,41), но достоверно регистрировалась таким чувствительным методом , как ЛКС, так как соответствовала вкладу по рассеивающей способности 15 - 251. Увеличение гидрофобности поверхности молекулы является фактором, определяющая появление полимеров глобулярных белков (Троицкий, 1567). Поэтому наличие агрегатов 1еО при патологии также может свидетельствовать в пользу лигандирования 1гв гидрофобными метаболитами.

Резюмируя все сказанное, необходимо отметить, что наиболее вероятной причиной повышения устойчивости информации является взаимодействие их с продуктами деструкции тканей и клеток организма, возникающих при патологическом процессе. Это отражается и на функциональных особенностях (снижение комплеменгфиксирую-щей и антигенсвязывающей активности), что может играть роль в ослаблении иммунитета и быть важным звеном патогенеза'заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Иммуноглобулины Б Пев), выделенные из сыворотки крови людей, больных злокачественными новообразованиями желудка и других локализаций, достоверно отличаются от 1еО здоровых людей. Эти отличия заключаются в большей устойчивости кокформации 1г<3 при патологии к воздействию 127. мочевины. Выявленные изменения связаны с деструктивными процессами в организме, что подтверждается наличием повышения »информационной ригидности ¡¿3 при другой патологии, сопровождающейся разрушением клеток и тканей организма (острое отравление уксусной кислотой с выраженным гемолизом, ревматизм, ревматоидный артрит, бронхоэктатическая болезнь). Проявлением обнаруженного гффекта является значительно менее Еыражен-

- -

нее ослабление интенсивности тирозинового и триптофанового максимумов в температурно-пертурбационных дифференциальных спектрах иммуноглобулинов Q при патологии при помещении последних з раствор мочевины. Изменения, вызываемые в IgG здоровых людей 12* мочевиной, не приводят к нарушению вторичной структуры белков по данным кругового дихроизма и дисперсии оптического вращения и заключаются в изменении междсыенных взаимодействий в РаЬ-фраг-ментах Ig<3.

2. IgG при злокачественной опухоли желудка обладают повышенной склонностью к агрегации и уменьшением гидродинамического радиуса мономеров по сравнению с IgG здорового человека, что объясняется увеличением гидрофобности IgG при патологии.

3. Содержание общих липидов в препаратах IgG при злокачественных новообразованиях желудка возрастает более, чем в два раза по сравнению с IgG здорового человека.

4. Еысокая устойчивость к воздействию 127. мочевины, характерная для IgG при патологии, воспроизводится при инкубации IgG здоровых людей с такими амфифильными соединениями как фосфатидил-холин и модельный пептид мелиттин (при соотношении 5 молей на 1 моль IgG). С помогаю моноклональных антител к мелитткну установлено, что этот пептид связывается с IgG в молярном соотношении 1:1, причем основным местом связывания является Fc-фрагмент.'

5. Инкубация моноклональных IgG-антител с фос-фатидилхолином или мелиттином (при соотношении 5 молей на 1 моль IgG) приводит к ослаблению антигенсвязывающей функции антител, причем эффект сохраняется и после отмывания избытка лиганда диализом.

6. Для измененных при злокачественных - новообразованиях IgG характерно снижение ксотле^знтф^ксиругщей активности, что проявляется в увеличении константы диссоциации комплекса Igu-Clq.

7. Причиной изменения свойств IgG при патологии (повышенная устойчивость к воздействия мочевины, склонность к агрегации) является взаимодействие Fc-учаотка молекул IgG с амфифильными продуктами распада клеток и тканей организма. Это приводит к нарушению функции иммуноглобулинов (снижение антигенсвязывающей и комп-лементфиксярующей активности), что может быть причиной ослабления гуморального иммунитета при изучаемой патологии.

8. В связи с тем, что эффект 127. мочевины на IgG локализован по данным ТПДС преимущественно в Fab-фрагментах, но значительно снижается при связывании лиганда Fc-фрагментом, делается вывод об

увеличении устойчивости конформации ГаЬ-области в результате взаимодействия Гс-области с амфифильными соединениями.

9. Создано 12 гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к 103, 1£?М человека, их тяжелым и легким цепям и протеолити-ческим фрагментам. Некоторые из этих антител могут преципитиро-вать антиген (сами или в парных смесях друг с другом), что позволяет их использовать в иммунопреципитационных методах для типиро-вания иммуноглобулинов, определен!« их концентрации, соотношения легких цепей разных типов в диагностики парапротеинемических гемобластозов. Получен также клон гибридомных клеток, продуцирующий моноклональные антитела к пептиду из яда пчелы - мелиттину.

10. В одном случае при злокачественной опухоли желудка обнаружена парапротеинемия 12<34. Создан аффинный сорбент на основе полученных моноклональных антител к 1^1,2,3, с помощью которого выделен паралротеин 1е64 при физиологических значениях рК и ионной силы раствора. Это позволило получить белок в нативном состоянии и использовать его для конформационных исследований. Полигональная фракция 1еС из сыворотки крови данного больного более устойчива к воздействию 127. мочевины, чем моноклональный 1^64.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ефетов К. А. Изучение конформации иммуноглобулинов методом темп&ратурно-пертурбационной дифференциальной спектрофотометр»«! // Внедрение в'практику здравоохранения результатов научных исследований." Симферополь, 1932.- С. 4.

2. Ефетов К.А., Семенец П.Ф. Метод выделения белков иг геля после препаративного электрофореза // Статья деп. ео ВНКИИ. Рефе-' рат опубликован в журнале "Лай. дело".- 1963.- N 6.- С.60.

3. Троицкий Г.Е., Тэтин С.Ю., Бфетов К.А. Исследование конформации 1вЗ при частичной дегидратации. Данные температурно-пертурбационной дифференциальной спектрофотометрии // Докл. АН УССР, сер. Б.- 1934.- К 2.- С.83-86.

4. Троицкий Г.В., Тэтин С.Ю., Ефетов К.А. Влияние дегидратации на междоменные взаимодействия в иммуноглобулине 5 и его фрагментах // Биофизика.- 1984.- Т.29, вып.4.- С. 578-582.

5. Тэтин С.Ю., Троицкий Г.Е., Ефетов К.'А., Семенец П.Ф. Кон-формационные переходы в 1е6, вызванные недекатурирушдап факторами // 16-я Конференция Федерации европейских биохимических обществ

- 33 -

(Москвз, июнь 1934): Теэ. докл.- М.', 1984.- С.377.

6. Троицкий Г.В., Тэтин С.Ю., Ефетов К.А. Конформадионный переход в иммуноглобулине G, приводящий к фиксации им комплемента // 4-й двусторонний симпозиум СССР - Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Киев, июль 1984 г.): Тез. докл.- Киев: Наук, думка, 1984.- С.125.

7. Троицкий Г.В., Тэтин С.Ю., Ефетов К.А. Различия конформа-ции иммуноглобулинов G, выделенных из сыворотки крови у Сольных хроническим лимфолейкозом и у здоровых людей // 5-я Всесоюзная конференция по спектроскопии биополимеров (Харьков, октябрь 1984): Тез. докл.- Харьков, 1984.- С.233-234.

8. Тэтин С.Ю.. Ефетов К.А., Троицкий Г.В. Спектральные исследования конфирмационного состояния иммуноглобулина G при связывании им комплемента // 5-я Всесоюзная конференция по спектроскопии биополимеров ( Харьков, октябрь 1984): Тез. докл.- Харьков, 1984.-С.237-238.

9. Тэтин С.Ю., Атамась С.П., Ефетов К.А. Уточненный метод расчета температурноепертурбационных дифференциальных спектров белков /7 5-я Всесоюзная конференция по спектроскопии биополимеров (Харьков, октябрь 1984): Теэ. докл.- Харьков, 1984.- С.238-240.

10. Ефетов К.А., Тэтин С.Ю., Троицкий Г.В., Шидей В.З. Устойчивость конформации иммуноглобулинов G при хроническом лимфолей-козе // Докл. АН УССР, сер. Б.--1985.- N 8.- С.68-71.

11. Тэтин С.Ю., Ефетов К.А., Троицкий Г.В., Козлов Л.В., Зин-ченко A.A. Комплементфиксирующая активность иммуноглобулина G в растворах этиленгликодя // Еиоорган. химия.--1985.- Т.11, N 8.-' С. 1068-1073.

12. Троицкий Г.В., Тэтин С.Ю., Ефетов К. А., Семенец П.<3., • Атамась С. П. Конформационные переходы в иммуноглобулинах G в норме и при патологии // Республиканская конференция "Механизмы им-муностимуляции" (Киев, октябрь 1985): Тез. докл.- Киев, 1985.-

С. 228-229.

13. Тэтин С.Ю., Ефетов К.А., Шидей В.З., Троицкий Г.В. Иммуноглобулины G при хроническом лимфолейкозе // 2-й Украинский съезд гематологов и трансфузиологоз. (Киев, май 1986): Тез", докл.-Кнев, 1986.- T.I.- С.133-134.

14. Тэтин С.Ю,,- Атамась С.П. , Ефетов К.А., Семенец П.Ф., Ее-веродский П.Э., Косик О.Г., Троицкий Г.В. Конформационные пере-

ходы в иммуноглобулинах G и способность IgG фиксировать комплемент в норме и при лю$опролиферативных заболеваниях // Симпозиум "Структура, биосинтез и функции молекулярных элементов иммунной системы" (Пуцино, июнь 1937): Тоз. докя.- Пущине, 1987.- С. 60.

15. Тет1н С.В., Атамась С.П., ефетов К.О., Семенець П.Ф., Не-Ееродський П.Е., Тро1цький Г.В. Характеристика конформац!I 1мунс-глобул!н1в у норм! та при л1ифопрод1феративних захворюваннях // 5-ii Укра1нський 61ох1м1чний а' 1зд (1Еано-Франк1вськ, вересекь 1987): Тези доп.- Ки1в, 1987.- ч. 2.- С. 257-253.

16. Ефетов^К.А., Троицкий Г.В., Ефетов С.В. Температурно-пер-турбационная дифференциальная спектрофотометрия иммуноглобулинов при злокачественных новообразованиях // 6-я Всесоюзная конференция по спектроскопии биополимеров (Харьков, октябрь 153S): Tea. докл.- Харьков, 1988.- С. 124-125.

17. Тэтин С.Ю., Атаыась С.П., Ефетов К.А., Неверодсюш П.Э., Шидей В.З., Троицкий Г.В. Иммуноглобулины гри лимфопролифератта-ных заболеваниях // Всесоюзная конференция "Биохимия - медицине (Ленинград, ноябрь-декабрь 1988): Тез. докл.- Ленинград, 1988.-С. 192-193.

18. Тэтин С.Ю., Ефетов К.А., Троицкий Г.В. Комплементфикси-рующая активность, иммуноглобулинов G в норме и при димфопролифе-ративных заболеваниях // Система комплемента, М., 1988.- С. 71-72.

19. Tetln S.Yu., Efetov К.А., Atatias S.P., N&verodsky P.E., Knjazeva O.A., Troltsky G.V. The primary steps of denaturation and complement binding activity of IgG at norm and pathology // 10-th Workshop and Symposium "Structure, biosynthesis and functions of the molecular elements of the Immune system" (Cracow, June 1989): Abstr.- Cracow, Poland,' 1989.- P. 22.

20. Ефетов К.А., Троицкий Г.В. Исследование иммуноглобулинов G при новообразованиях методом температурно-пертурбацконной дифференциальной спектрофотометрии // Докл. АН УССР, сер. В.- 1S9Q.-

N 2.- С. 55-58.

21. Ефетов К.А. Спектральное исследование паралрохеина при злокачественной опухоли желудка // 7-я Конференция по спектроскопии биополимеров (Харьков, октябрь 1991): Тез. докл.- Харьков, 1991.- С. 99-100.

22. Ефетов К.А., Троицкий Г.В. Дифференциальная спектрофотометрия иммуноглобулинов при заболеваниях желудка и двенадцатиперстной кишки // 7-я Конференция по спектроскоп™ биополимеров

(Харьков, октябрь 1991): Тез. докл.4 Харьдав, 1991.- С. 101-102.

23. Ефетов К.Д., Троицкий Г.В., Ефетов C.B. Устойчивость кон-ф-срмзщги сывороточных тдлунсглобулиЕоз. при некоторых опухолях // Еспр. ыед. химии.- 1S91.- Т. 37, вып. 4.- С. 18-20.

24. Ефетоз К.А., Князева O.A. Моноклонзльные антитела к мелит-тину - пептиду из яда пчелы // Вопросы теоретической и практической медицины.- Уфа, 1992.- С. 29-20.

25. ефетов К.О,, Князева О.С., Тет1н С.Ю. Одер.-»ання та влас.ти-eoctI мкшачнх моноклональних антит1л до 1муноглобул1н1з лзодини // 8-й УкраКнськин б1о:-:1м1чний з'1эд (Ки!в, траэень 1992): Тези доп.-Kiîïb: Еидазкицтво УСТА, 1992.- ч. III.- С. 99.

26. Ефетоз К.А., Троицкий Г.В. Кокформацпонкый переход в иммуноглобулине при Езазыодействии с змфифильными соединениями // Докл. АН Украины. Математика, естествознание, технические науки.-1993.- 1J 1.- С. 39-93.

27. Ефетоз Е.А., Tsr.ni С.Ю., Князева O.A. Штамм гибридкнх культизкруеюх клеток хивотных î.'.us Musculus L., используемый для получения мококлокзльных антител к IgGl,3,4 человека / Патент F3 H.2002503, ШШ5 Cl2 И 5/00, С12 Р 21/08 // Еюл. "Изобретения".-1953.- H 41-42.

28. Ефетоз К.А., Тзтин С.Ю., Князева O.A., Троицкий Г.В. Штамм гибридных культивируемых клеток Mus nuscùlus L., используемый для получения мококдснальных антител к IgGl,2,3 человека / Патент РФ N 2002579, ШЯ5 С12 H 5/00, С12 Р 21/03 // Вол. "Изобретения"." 1993.- N 43-44.

29. Ефетоз К.А., Тэтин С.Ю., Князева O.A., Троицкий Г.2. Птемм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L., исподьзу-si.mii для получения прегститирухнцпх моноклональных антител к IgM человека / Патент ТС ÎI 2033580, МКИ5 С12 N 5/00, С12 Р 21/03 // Вал. "Изобретения".- 1093.- N 43-44.

30. Князева O.A., Ефетов К.А., Тзтин С.Ю.. Троицкий Г.З. Штамм гибридных культивируемых клеток'Mus musculus L., используемый для получения монсклснзльных антител к х-цепям Ig человека / Патент РФ И 2003681, НКИ5 С12 N 5/00, С12 Р 21/03 //Бил. "Изобретения".- 1993.- H 43-44.

31. Ефетов H.A., Князева O.A., Тэтин С.Ю., Троицкий Г1в. Ета!-:м гибридных культивируемых клеток Mus musculus L.- продуцент моноклональкых антител к Х-легким цепям иммуноглобулинов человека / Патент PS N 2003682, Ш15 С12 H 5/00 // Бзол. "Изобретения".-

« ..

1993.- N 43-44.

32. Князева O.A., .Ефетов К.А., Тэтин С.Ю. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L.- продуцент моноклональных антител к мелиттину из яда пчелы (Apis me11liera L.) / Патент РФ N 2003683, ЫКИ5 С12 N 5/00, Cl2 F 21/08 //Еюл. "Изобретения".- 1993.- N 43-44.

33. Ефетов К.А., Тэтин С.Ю., Князева O.A. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L.- продуцент моноклональных антител к (Рс)5Д-фрагменту IgM человека / Патент РФ N 2003684, ЫКИ5 С12 N 5/00 // Еюл. "Изобретения".- 1993.- N 4344.

34. Ефетов К.А., Тэтин С.Ю., Князева O.A., Троицкий Г.Б. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. -продуцент моноклональных антител к IgM человека / Патент РФ

N 2003685, ЫКИ6 С12 N 5/00, С12 Р 21/03 //Еюл. "Изобретения". -1993.- N 43-44.

35. Князева O.A., Ефетов К.А., Тэтин С.Ю., Троицкий Г.В. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L.-продуцент моноклональных антител к IgG человека / Патент РФ

N 2003686, ЫКИ5 С12 N 5/00, С12 N 5/16 //Бюл. "Изобретения".-1993.- N 43-44.

36. Ефетов К.А., Тэтин С.Ю., Князева O.A. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., используемый для получения моноклональных антител к IgM человека / Патент РФ

N 2003687, ЫКИ5 Cl2 К 5/00, С12 Р 21/00 // Еюл."Изобретения".-

1993,- N 43-44.

37. Ефетов К.А., Тэтин С.Ю., . Князева O.A. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus'musculus L., используемый для получения моноклональных антител к IgG человека / Патент РФ

N 2008350, ЫКИ5 Cl2 N 5/00, С12 Р 21/08 // Еюл."Изобретения".-

1994.- N 4.

38. Князева O.A., Ефетов К.А., Тэтин С.Ю., Троицкий Г.В. -Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L., используемый для получения преципитируювдх моноклональных антител к IgG человека / Патент РФ N 2010856, ЫКИ5 С12 N 5/00, С12 Р 21/08 // Еюл. "Изобретения".- 1994.- N7.

39. Ефетов К.А., Арутюнян A.B. Агрегация иммуноглобулинов человека в норме и при злокачественной опухоли желудка У/ Биофизика. -1994.- Т.39, вып.1.- С. 106-111.