Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование генетической структуры популяций дикой сои, как элемент изучения биобезопасности генетически модифицированных растений в центрах происхождения и разнообразия вида

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Исследование генетической структуры популяций дикой сои, как элемент изучения биобезопасности генетически модифицированных растений в центрах происхождения и разнообразия вида"

На правах рукописи

НЕДОЛУЖКО Артём Валерьевич

Исследование генетической структуры популяций дикой сои, как элемент изучения биобезопасности генетически модифицированных растений в центрах происхождения и разнообразия вида

Специальность 03.00.23. Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва- 2008

003450271

Работа выполнена в лаборатории Генома растений Центра «Биоинженерия» РАН (г. Москва).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Дорохов Д. Б. Официальные ошюнситы:

Доетор биологических наук, профессор, академик РАСХН Шевелуха B.C.

Кандидат биологических наук Кокаева 3. Г.

Ведущая организация: Инсттут общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Защита состоится 2008 г. в / 2- часов на заседании

диссертационного совета Д 006.027.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, г. Москва, ув. Тимирщавсам, д. 42; чей.: (495) 976-65-44; фаю: (49$) 9ПШЛ% e-mail: iab@iab.ac.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан / 9 P&f dtfjl^ 2(Ш г

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.027.01 кандидат биологических наук //

L .(JsCt<i ¿J

Меликова С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Одним из перспективных направлений современной биотехнологии является генетическая инженерия растений. Генетически модифицированные (ГМ) растения играют важнейшую роль в современном сельском хозяйстве, и в последние годы в мире наблюдается устойчивая тенденция к увеличению посевных площадей и расширению сфер их использования. Обязательным условием для внедрения ГМ растений в сельское хозяйство является установление их статуса биобезопасности.

Одним из основных потенциальных рисков при выращивании ГМ растений является возможность переноса и распространения ГМ вставки в популяциях диких родичей. Поэтому при исследовании биобезопасности ГМ растений, особенно в центрах происхождения и разнообразия видов, основная роль отводится изучению генетической структуры популяций диких родичей культурного растения и выбору модельных популяций для дальнейших исследований вероятности перекрёстного опыления между видами.

Устойчивая к гербициду ГМ соя оказалась перспективной моделью для изучения потенциального риска интрогрессии ГМ вставки в популяции диких родичей. Дикая и культурная соя (Glycine max (L.) Merr.) являются факультативными перекрёстншсами -вероятность перекрёстного опыления варьирует от 0 до 3 % (Kiang et al., 1992; Nakayama and Yamaguchi, 2002; Dorokhov et al., 2004), что позволяет проводить эксперименты в естественных условиях. Кроме того, ГМ соя, используемая в экспериментах и обладающая устойчивостью к гербициду, в значительной мере облегчает идентификацию межвидовых гибридов.

Для проведения оценки потенциального риска передачи признака устойчивости к гербициду в популяцию дикой сои в условиях Дальневосточного региона был осуществлён поиск репрезентативной популяции G. soja Siebold et Zucc., которая могла бы быть использована для этих целей.

Анализируя генетическую структуру популяций дикой сои, учитывали тот факт, что юг российского Дальнего Востока (Амурская область, Приморский и Хабаровский край) граничит с Китайско-Японским центром происхождения культурных растений (Вавилов, 1926) и является центром генетического разнообразия G. soja.

Контрастность местных агроклиматических условий является одной из причин высокого генетического разнообразия дальневосточных форм дикой сои (Седова, 1989; Сеферова, 2006). Поэтому предстояло выявить наиболее репрезентативную популяцию, обладающую наибольшим генетическим полиморфизмом.

Учитывая генетическое родство видов, выделяемых в подроде Soja, для изучения внутривидового и межвидового полиморфизма были выбраны методы RAPD и ISSR-анализа. Для изучения генетического разнообразия дикой сои с помощью RAPD-анализа необходимо было подобрать дизайн праймеров, оптимизировать условия ПЦР, выбрать группу праймеров наиболее эффективных для изучения генетического полиморфизма в подроде Soja рода Glycine.

Без использования молекулярно-генетических методов при изучении генетического разнообразия дикой сои невозможно корректно изучить потенциальное влияние интрогрессии ГМ вставки в популяции G. soja и оценить саму возможность сосуществования ГМ растений и их дикорастущих родичей в центрах происхождения и видового разнообразия и, в конечном счете, наиболее полно и эффективно использовать достижения современной биотехнологии.

Данная работа направлена на развитие новых методических подходов и их использование в изучении биобезопасности ГМ растений - важного этапа при внедрении достижений современной биотехнологии в экономику страны. Исследования проводились в соответствии с законом «О генно-инженерной деятельности», разрабатывались научно-методические подходы и рекомендации для применения ГМ растений в открытых системах и проведения контроля их биобезопасности. Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось исследование генетической структуры популяций дикой сои на юге Дальнего Востока России в контексте изучения потенциального риска использования ГМ растений в центрах происхождения и разнообразия их дикорастущих родичей. В соответствии с данной целью поставлены следующие задачи:

1. Отработать методические подходы для генотипирования и выявления внутривидового полиморфизма растений рода Glycine подрода Soja с использованием высокоэффективных ISSR и RAPD-праймеров и оптимизированных условий проведения ПЦР.

2. Изучить генетическую структуру популяции G. soja, произрастающей на Приханкайской равнине. Оценить возможность использования её в качестве репрезентативной при проведении экспериментов по изучению переноса генов от культурной к дикой сое.

3. Охарактеризовать степень генетической дифференциации популяций G. soja в антропогенных и естественных ландшафтах, исходя из того, что популяции дикой сои, произрастающие в антропогенных ландшафтах, являются первичными потенциальными акцепторами ГМ вставки.

4. Изучить филогенетические взаимоотношения в подроде Soja рода Glycine, используя 1SSR и RAPD-анализ.

5. Выявить уникальные фрагменты ДНК, характерные для G. max, G. soja и G. gracilis, • необходимые для надёжной идентификации видов и межвидовых гибридов.

6. Отработать методологию молекулярной идентификации гибридов сои содержащих ГМ вставку, провести первичный скрининг присутствия ГМ сои (трансформационное событие GTS 40-3-2) в земледельческом районе Приханкайской равнины юга российского Дальнего Востока.

7. Разработать рекомендации по минимизации риска «выхода» ГМ вставки в естественные популяции при внедрении ГМ сортов сои на территории Дальнего Востока России и предложить меры для сохранения генофонда дикой сои.

Научная иовизна

Подобран дизайн праймеров и оптимизированы условия ПЦР для проведения популяционно-генетических и филогенетических исследований растений, относящихся к подроду Soja рода Glycine, а также поиска уникальных фрагментов.

Впервые проведен детальный анализ генетической структуры популяций G. soja юга Дальнего Востока России. Установлено высокое генетическое разнообразие естественных популяций дикой сои, сопоставимое с данными для китайских популяций, произрастающих, как считается, в центре происхождения вида. Детально охарактеризованная популяция приханкайской равнины может быть использована в качестве модельной при проведении испытаний на биобезопасность ГМ сои.

Сравнительные исследования генетического разнообразия популяций дикой сои, произрастающих в естественных и антропогенных ландшафтах, выявили пониженное генетическое разнообразие у растений G. soja, характерных для антропогенно-нарушенных фитоценозов.

По результатам молекулярно-генетического анализа филогенетических отношений в подроде Soja рода Glycine подтверждено, что виды G. soja, G. gracilis и G. max являются близкородственными.

Получены ДНК-фрагменты видов G. soja (ОРХ-О5450) и G. max (ОРО-О5750), которые могут быть использованы для выявления межвидовых гибридов, в случае, когда затруднено использование морфологических признаков.

Практическая ценность

Предложены праймерные системы и условия ПЦР для проведения популяционно-генетических исследований дикой сои, поиска уникальных фрагментов и филогенетических исследований в подроде Soja рода Glycine.

Установлено, что популяция G. soja, произрастающая на Приханкайской равнине, обладает генетическим разнообразием, сходным с таковым, полученным для других популяций дикой сои, произрастающих в центре происхождения вида, и может использоваться в дальнейших работах по изучению биобезопасности ГМ сои.

Для сохранения генофонда G. soja необходимо проводить систематические охранные мероприятия в верховьях рек, направленные на защиту природных популяций дикой сои, а также ввести запрет на хозяйственную деятельность на этих территориях. Структура и объём работы

Диссертация изложена на 104 страницах и состоит из Введения, 3-х глав, Выводов, Списка литературы (150 наименований). Работа включает 15 таблиц, 28 рисунков, 4 приложения. Благодарности

Автор глубоко признателен за внимание и поддержку руководителю к.б.н. Д.Б. Дорохову, директору Центра «Биоинженерия» РАН академику К. Г. Скрябину, д.б.н. Г. Н. Челоминой, директору Ботанического сада-института ДВО РАН д.б.н. А. В. Галанину, к.б.н. Н. А. Василенко, д.б.н. А. Н. Игнатову, к.б.н. С. В. Клицову, Д. Ш. Маллабаевой, Ю.Э. Гербеку.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Исследования проводили в 2005-2008 гг. в Центре «Биоинженерия» РАН. В работу были вовлечены образцы дикой, полудикой (G. gracilis), культурной сои, гибриды культурной с дикой и образцы многолетних видов из подрода Glycine: G. tomentella Hayata, G. tabacina (Labill.) Benth., G. canescens F. J. Herrn., G. cladestina Wendl. В исследования также включены образцы родственного вида амфикарпеи японской Amphicarpaea japónica (Oliv.) В. Fedtsch. Материал, использованный в работе, собран сотрудниками Центра «Биоинженерия» РАН во время экспедиций на юге Дальнего Востока (долина оз. Ханка, долина р. Цукановка) в 1998-2006 гг., часть материала любезно предоставлена сотрудниками Всероссийского института растениеводства им. Н.И.Вавилова РАСХН, Института цитологии и генетики СО РАН и Дальневосточного НИИ защиты растений РАСХН.

Для изучения генетической структуры популяции G. soja Приханкайской равнины использовали семена (125 образцов), собранные сотрудниками Центра «Биоинженерия» РАН в период экспедиционных работ в 2004 году. В исследование были вовлечены образцы из Кировского (с. Афанасьевка, с. Комаровка, совхоз «Кировский»), Черниговского (совхоз «Дмитриевский»), Ханкайского (с. Платоновка, пос. Камень-Рыболов, пос. Турий Рог) районов (рисунок 1).

Для изучения генетической структуры популяции G. soja в долине р. Цукановка использовали семена (130 образцов), собранные сотрудниками Центра «Биоинженерия» РАН в период экспедиционных работ в 2006 году. Долина реки находится под слабым антропогенным воздействием, особенно в её верхнем течении, в то же время ее русло в нескольких местах пересекается дорогой - ландшафтом с высокой степенью антропогенной нагрузки. Семена G. soja собраны в 13 пунктах из двух типов фитоценозов: придорожные антропогенные и слабонарушенные прирусловые. Семена собирали по следующей схеме: вдоль дороги, пересекающей реку (образцы условно относили к антропогенной субпопуляции «дорога», «Д»), вдоль берега реки (образцы условно относили к естественной субпопуляции «река», «Р») и в местах пересечения дороги с рекой (образцы условно относили к смешанной субпопуляции «мост», «М») (рисунок 1). Расстояние между точками сбора от 50 до 200 метров, расстояние между мостами 3.5 километра.

Для изучения филогенетических связей внутри подрода Soja рода Glycine было проанализировано 265 образцов, представляющих 10 дальневосточных популяций дикой сои, 17 сортов культурной сои, включая стародавние, 7 форм полудикой сои, а также 2 межвидовых гибрида: F| ($ G. max сорт Березина х SG. soja) и F4 (9 G. soja х cJG. max сорт Stine 2254RR), полученные сотрудниками ВНИИР им. Н. И. Вавилова РАСХН и Института цитологии и генетики СО РАН, соответственно. В качестве внешней группы использованы растения 30-ти генотипов из подрода Glycine: G. tomentella, G. tabacina, G. canescens, G. cladestina, а также растения 10-ти генотипов A. japónica.

Изучение возможности переноса трансгенной вставки от ГМ сои (сорт Stine RR, трансформационное событие GTS 40-3-2) к сорту Венера, проводили на специальных участках сертифицированных Межведомственной комиссией по проблемам генно-инженерной деятельности (МВКГИД). Для первичного скрининга наличия ГМ сои GTS 40-3-2 и ее гибридов на полях Приморского края, использовали листовые высечки, растений из агроценозов Приханкайской равнины. При сборе растительного материала фиксировали GPS-координаты места произрастания (таблица 1).

Методы

Применялись следующие методы: экстракция ДНК из растительной ткани, измерение концентрации ДНК, выбор дизайна праймеров и оптимизация условий ПЦР, ПЦР с ЛАРО и КЭЯ праймерами, фотодокументация, анализ полученных результатов.

Таблица 1 - Скрининг ГМ сои на территории Приморского края

Маркировка Сорт и координаты GPS

1-4 Венера

5-6 Stine RR GTS 40-3-2

7-8 Венера RR после обработки в 2006 году. F2 из делянки 1, средняя фракция

9-10 Венера RR после обработки в 2006 году, F2 из делянки 2, средняя фракция

11-12 Венера RRFi желто-зеленые семена после обработки раундапом

13-14 GPS - 23

15-16-17 GPS-25

18-19-20 GPS-26

21-22-23 GPS-27

24-25-26 GPS-28

27-28 GPS - 33

29-30 GPS-33

31-32 GPS - 34

33-34 GPS - 34

35-36 GPS-35

Рисунок 1 - Районы сбора семян дикой сои на юге Дальнего Востока России

Выделение ДНК проводили из первых настоящих листьев молодых проростков по протоколу Эдвардса с соавторами (Edwards et. al., 1991), модифицированному Д. Б. Дороховым и Э. Клоке (1996). Полимеразную цепную реакцию проводили с RAPD, 1SSR

праймерами, а также праймерами для выявления трансгенной вставки. Использовались протоколы амплификации, представленные в литературных источниках (Chen, 2002; Jin et а]., 2003, 2006) и разработанные нами. Праймеры, рекомендуемые для изучения генетического разнообразия дикой сои, представлены в таблице 2.

Таблица 2 - RAPD-праймеры, использованные для изучения генетического

разнообразия G. soja

Наименование RAPD-праймера Последовательность 5' - 3'

ОРА-08 GTGACGTAGG

OPA-09 GGGTAACGCC

ОРА-04 AATCGGGCTG

ОРН-12 ACGCGCATGT

D-6 ACGGTGCCTG

D-8 GGCCTACTCG

OPG-04 AGCGTGTCTG

ОРК-14 CCCGCTACAC

OPL-18 АССАСССАСС

OPR-12 ССАТТССССА

OPS-09 TCCTGGTCCC

OPG-11 TGCCCGTCGT

ОРН-02 TCGGACGTGA

ОРО-01 GGCACGTAAG

ОРХ-05 CCGCTACCGA

Для идентификации ГМ сои (GTS 40-3-2) и ее гибридов, использовали праймеры GL186f и GL1263r, специфичные к ГМ вставке. Кроме того применяли праймеры, RR-40-3-2f и RR-40-3-2r, разработанные в Центре «Биоинженерия» РАН, специфичные к бордерным последовательностями, фланкирующим ГМ вставку.

Измерение концентрации ДНК проводили с использованием спектрофотометра BioPhotometer (AGEppendorf, Германия). Для реакции амплификации ДНК применяли амплификатор Applied Biosystems GeneAmp PCR System 2700 (США).

Статистическую обработку данных и построение филогенетических реконструкций проводили программами: Тгеесоп 1.3b (Van de Peer and De Wächter, 1994); TFPGA 1.3 (Miller, 1997); PopGen 32 (Yeh et al., 1999); Statistica 6.0.

Для вычисления коэффициентов корреляции между полученными генетическими характеристиками популяций G. soja использовали программу Statistica 6.0.

Корреляционные плеяды для разных уровней достоверности (р<0.05, р<0.01 и pO.OOl) строили методом, предложенным П. В. Терентьевым (1959).

РЕЗУЛЬТАТЫ Генетическое разнообразие дикой сон Приморского края

Сравнительный анализ спектров фрагментов амплифицированной ДНК двух ценопопуляций G. soja (оз. Ханка и р. Цукановка), подверженных разному уровню антропогенного влияния, выявил индивидуальный и межпопуляционный полиморфизм. При изучении приханкайской популяции наибольший полиморфизм выявил праймер ОРА-08 (рисунок 2).

Величина полиморфности (Рм) для выборки генотипов дикой сои, произрастающей в долине оз. Ханка минимальна для образцов, собранных близ пограничного перехода Россия-Китай - 38.71%, и максимальна у растений, произрастающих вдоль полей Кировского совхоза - 75.80%. Генотипы дикой сои из субпопуляций с. Афанасьевна, с. Комаровка, с. Платоновка, пос. Турий Рог, совхоза «Дмитриевский» и пос. Камень-Рыболов занимают промежуточное положение: величина полиморфности варьирует здесь от 50.00% до 72.58%.

Рисунок 2 - Результаты амплификации образцов G. soja: (1-3) - Дмитриевка, (8-13) -Кировский совхоз, (14-17) - Платоновка; С. тах - (4-7), М - маркер молекулярной массы, праймер ОРА-08

В целом, число полиморфных локусов в популяции дикой сои невелико, исключение составляет субпопуляция, расположенная вблизи совхоза «Кировский», где выявлено наибольшее их число - 58. В обследованных субпопуляциях значения

ожидаемой гетерозиготноети варьируют в пределах от 0.1461 (переход Россия-Китай) до 0.2780 совхоз «Кировский» (таблица 3).

Таблица 3 - Основные показатели генетического разнообразия G. soja

Субпопуляция па Ne Не I пр1/ общее число локусов

с. Афанасьевка 1.7419 1.4153 0.2494 0.3771 70.96 46/62

и=18 (0.4411) (0.3460) (0.2623)

с. Комаровка 1.7258 1.4115 0.2424 0.3654 72.58 45/62

и=10 (0.4497) (0.3692) (0.2708)

совхоз 1.9355 1.4715 0.2780 0.4227 75.80 58/62

«Кировский» (0.2477) (0.3609) (0.2368)

п=32

совхоз 1.6774 1.3834 0.2311 0.3493 67.74 42/62

«Дмитриевский» и=8 (0.4713) (0.3474) (0.2708)

с. Платоновка 1.7742 1.4418 0.2564 0.3857 64.51 48/62

№=11 (0.4215) (0.3816) (0.2670)

п. Турий Рог 1.7097 1.4320 0.2445 0.3640 70.97 44/62

п=9 (0.4576) (0.4064) (0.2848)

п. Камень- 1.7903 1.4709 0.2729 0.4077 67.74 49/62

Рыболов (0.4104) (0.3736) (0,2644)

п=12

Переход Россия- 1.3871 1.2607 0.1461 0.2152 38.71 24/62

Китай и=5 (0.4911) (0.3872) (0.2888)

Обочина поля, 1.4839 1.2337 0.1505 0.2327 48.39 30/62

близ Камень- (0.5038) (0.2826) (0.2615)

Рыболов

л=20

Не - ожидаемая гетерозиготность, I - индекс гетерогенности выборки Шеннона, Рщ -

полиморфность, npl - число полиморфных локусов, п = число образцов.

Ожидаемая гетерозиготность для большинства субпопуляций имеет нормальные значения от 0.2311 до 0.2780, но у субпопуляций в районе перехода Россия-Китай и в субпопуляции, граничащей с агроценозом (обочина поля с культурной соей) вблизи пос. Камень-Рыболов, она явно пониженная - 0.1461.

При сравнении образцов западного и восточного побережий оз. Ханка выяснилось, что особи первых обладают сравнительно большей ожидаемой гетерозиготностью -0.2953, в то время как для субпопуляций противоположного берега эта величина составляет - 0.2712.

Генетические расстояния между субпопуляциями невелики, однако субпопуляции восточного побережья оз. Ханка генетически более близки между собой, чем субпопуляции западного побережья. UPGMA-реконструкция не выявила чёткой кластеризации по месту их произрастания. Отмечена тенденция к дифференциации между образцами, собранными на западном и восточном побережьях оз. Ханка.

Гетерозиготность тотальной подразделённой популяции дикой сои (Я) произрастающей в окрестностях оз. Ханка равна - 0.3111. Соответственно общее генное разнообразие состоит из внутрипопуляционной (Я,) и межпопуляционной (Gs/) составляющих (Москалейчик, 2003). Величина Hs для ханкайской популяции составляет -0.2302, a G¡, - 0.2602.

В характере построенных корреляционных плеяд для образцов восточного и западного побережий оз. Ханка обнаруживаются существенные различия (рисунок 3).

Данные корреляционного анализа указывают на различия в микроэволюционных процессах, происходящих в субпопуляциях, расположенных в разных частях видового ареала и находящихся под действием разных факторов естественного отбора. Вероятно, дифференциация субпопуляций G. soja шла в процессе длительного воздействия климатических факторов, характеризующихся неоднородностью для западного и восточного побережий оз. Ханка.

Вклад в генетическую структуру приханкайской популяции могла внести разная степень хозяйственного освоения этих территорий и рельеф. Вероятно, полной изоляции популяций и субпопуляций препятствует антропогенная деятельность: зачастую дикая соя распространяется вдоль обочин дорог. Это приводит к постоянному смешению популяций и субпопуляций в этом регионе.

При изучении генетической структуры популяции дикой сои в долине р. Цукановка наибольший полиморфизм выявил праймер D-8. Число амплифицированных фрагментов, полученных с использованием разных праймерных систем, варьирует в пределах от 5 до 20 для всей выборки (рисунок 4).

Полиморфность (Рк) в популяции изменяется от 52.42% (субпопуляция «Д») до 66.99% (субпопуляция «М»). Генотипы субпопуляции «Р» занимают промежуточное положение: величина полиморфности (Рк) равна 65.04%.

saja. А - восточное побережье оз. Ханка; В - западное побережье оз. Ханка; С - общая

плеяда для популяции оз. Ханка; пе, па, А, I, Не,Р- основные генетические параметры

Рисунок 4 - Результаты амплификации проб G. soja праймером OPS-C19 (образцы из точек сбора «1» - остров (1-10) и «2» - побережье реки, нижнее течение (11-17), М - маркер молекулярной массы)

Полученные данные ожидаемой гетерозиготности составляют: 0.1711 (субпопуляция «Д»), 0.2120 (субпопуляция «М») и 0.1935 (субпопуляции «Р»), Величина потока генов (Nm) для объединённой выборки - 12.9 мигранта на поколение. Величина Nm между субпопуляциями достаточно велика, и колеблется от 13.9 (субпопуляция «Р» -субпопуляция «Д») до 22.11 (субпопуляция «Р» - субпопуляция «М») мигранта на поколение (таблица 4).

Для сравнения: прирусловая популяция р. Камышовая, неподверженная антропогенному воздействию, характеризуется более высоким уровнем полиморфизма (P9s) - 86.48% и меньшим числом мигрантов на поколение - 6,0 (Дорохов и др., 2001).

Таблица 4 - Параметры внутрипопуляционной изменчивости G. soja

Субпопуляция na Ne Не I Pus, % npl / общее число локусов

«Река» 1.7670 1.3012 0.1935 0.3074 65,04 79/103

п=50 (0.4248) (0.3042) (0.1672) (0.2386)

«Дорога» 1.6796 1.2791 0.1711 0.2693 52.42 70/103

п=30 (0.4689) (0.3423) (0.1805) (0.2547)

«Мост» 1.8932 1.3347 0.2120 0.3371 66.99 92/103

п=50 (0.3104) (0.3175) (0.1673) (0.2299)

Не - ожидаемая гетерозиготность, 7 - индекс гетерогенности выборки Шеннона, Рщ -полиморфность, пр1 - число полиморфных локусов, п = число образцов

Сопоставление полученных результатов с литературными данными указывает на сниженное генетическое разнообразие и повышенное число мигрантов на поколение в

популяциях G. soja, подверженных антропогенному влиянию. Число полиморфных локусов в популяции у р. Цукановка невелико, наибольшее их число выявлено в субпопуляции «М» - 92. Дифференциация •популяций дикой сои

Установлено отсутствие чёткой дифференциации между изученными субпопуляциями («М», «Р», «Д») дикой сои, произрастающей в долине р. Цукановка. Генетические расстояния между популяциями относительно малы, но субпопуляции «Р» и «М» генетически более близки между собой, чем с «Д» (таблица 5). Величина <?„ минимальна - 0.0372. Величина внутрипопуляционного генетического разнообразия Н-0.1922.

Таблица 5 - Величины генетического сходства и генетических расстояний по Нею (N«,1972)

Субпопуляция Река, «Р» Дорога, «Д» Мост, «М»

Река, «Р» 0.9841 0.9886

Дорога, «Д» 0.0160 **** 0.9865

Мост, «М» 0.0115 0.0136 ****

Анализируя полученные данные, можно предположить,- что выделенные условные субпопуляции являются составными частями одной популяции, основной способ распространения семян в которой, так или иначе, связан с антропогенной деятельностью. По-видимому, расположенный выше по течению реки посёлок Цуканово и дорога, неоднократно пересекающая реку, оказывают существенное влияние на генетическую структуру популяции G. soja, произрастающей в долине р. Цукановка.

Согласно нашим первичным данным, между генотипами представляющими различные географические зоны, нет существенных отличий. Не было обнаружено локусов, характерных для конкретных популяций. На дендрограмме, построенной по методу Ward, собранные на юге Приморского края образцы кластеризуются вместе с образцами из центрального Приморья (рисунок 5).

Ранее, при изучении популяций дикой сои, произрастающей на юге Дальнего Востока России, Т. С. Седовой (1989) была отмечена зональная изменчивость её морфологических признаков. Она пришла к такому выводу при изучении длины листа и стебля, индекса листа, числа бобов на одном растении и массы 1000 семян (Седова, 1989). Наши результаты подтверждают исследования И. В Сеферовой (2006), также использовавшей анализ морфологических признаков и не выявившей контрастных отличий между растениями G. soja из разных районов Дальневосточного региона. Тем не менее, ею установлено, что уровень генетической изменчивости в популяциях дикой сои

Амурской области значительно меньше, чем в Приморье. Эти данные согласуются с результатами А. М. Сеитовой с коллегами (2004), применившей молекулярно-генетические маркеры.

Мы полагаем, что человеческая деятельность вместе с иными способами распространения семян позволила дикой сое расширить свой ареал с большой скоростью. G. soja, произрастающая в достаточно специфических фитоценозах, смогла захватить обширные пространства. Более того, обмен генетической информацией продолжается и в настоящее время, несмотря на низкий уровень ауткроссинга - от 0 до 2.4 - 3 % (Kiang et al., 1992; Nakayama, Yamaguchi, 2002; Dorokhov et al., 2004). Немаловажную роль в формировании современных популяций дикой сои играют автомобильные и железные дороги, которые являются важнейшими коридорами, по которым семена дикой сои распространяются между популяциями Китая, Кореи, Японии и России. Наибольший обмен мигрантами между Китаем и Приморским краем, по-видимому, происходит на территории Приханкайской равнины, в центральной части Приморья.

Этому способствуют благоприятные условия вегетационного сезона, особенности рельефа, сельскохозяйственная деятельность, открытие границ и большое число коммуникаций, связывающих Приморье и китайскую провинцию Хэйлунцзян.

Изучение популяций в естественных ландшафтах имеет свои «подводные камни». Вызывает трудности сбор растительного материала, так как граница между антропогенными и естественными ландшафтами не бывает чёткой. С этим мы столкнулись при изучении популяции дикой сои, произрастающей в долине р. Цукановка, посчитав сначала этот ландшафт полностью естественным. Гетерозиготность генотипов прирусловых популяций р. Цукановка была значительно выше гетерозиготности генотипов придорожных популяций. Образцы, собранные на отвалах мостов, обладали наибольшим генетическим полиморфизмом. По-видимому, в этих точках локализованы смешанные субпопуляции, где встречаются образцы из придорожной и приречной растительных группировок.

AfanasejevkaOI Afanasejevka02 Partisansk regional Partlsartsk reflionQ2 Amur regionOI Amur reg!crC2

Kraskino Vladivostok Tuny RogOl Tuny Rog02 Nadezdinski ragionOI Nadazdinski regmr02 Spassk DmrtnevkaOl Dmitnevka02 Russki islandO! Russki SsiaTtd02

SlneBR

-_

3 4 6 Linkage Distance

Рисунок 5 - Дендрограмма по евклидовым расстояниям для популяций G. soja юга Дальнего Востока, метод Ward

Несмотря на отсутствие чётких отличий между приречной и придорожной субпопуляциями, уровень генетического разнообразия растений, представленных в антропогенно-нарушенных ландшафтах (дорога) заметно ниже, чем в естественных. Полевые исследования, проведённые на юге российского Дальнего Востока, показали, что наибольшее число популяций, незатронутых человеческой деятельностью, локализованы в Хасанском районе (юг Приморского края). К примеру, полиморфность популяций сои, произрастающей в верховьях р. Камышовая, достигает 86.48% (Дорохов и др., 2001), в то время как в популяциях Ханкайской равнины (Nedoluzhko, Dorokhov, 2007) и китайских провинций Хейбей и Ляонин значения этой величины ниже - 75 % (Jin et al., 2006).

Рассчитанные нами показатели, характеризующие генетическое разнообразие в популяциях G. soja, сравнили с результатами, полученными китайскими авторами с использованием ДНК-маркеров на сопредельной территории. Наши данные хорошо согласуются с параметрами, полученными для популяций дикой сои Северного и Центрального Китая (Jin et al., 2006) (таблица 6).

Таблица б - Значения ожидаемой гетерозиготности для популяций G. soja России и

Китая

Регион Тип маркеров Значения ожидаемой гетерозиготности (Я,,) Авторы

Китай, провинция ISSR 0.259 Jin et al., 2006

Хэбей

Китай, провинция 1SSR 0.262 Jin et al., 2006

Ляотт

Приморский край, RAPD 0.324 Nedoluzhko, Dorokhov,

побережье оз. Ханка, 2007;

для объединенной

популяции

Приморский край, RAPD 0.256 Nedoluzhko, Dorokhov,

западное побережье 2007;

оз. Ханка, с.

Платоновка

Приморский край, RAPD 0.242 Nedoluzhko, Dorokhov,

восточное побережье 2007;

оз. Ханка, с.

Комаровка

Приморский край, RAPD 0.193 Недолужко и др., 2008

прирусловая

популяция р.

Цукановка

Молекуляпно-генетическнй анализ филогенетических связей видов рода Glycine подрода Soja

Уникальные фрагменты амплифицированной ДНК могут быть одним из инструментов для дискриминации видов и выявления межвидовых гибридов. Праймер ОРХ-05 позволил выделить фрагмент ОРХ-05450, характерный исключительно для G. soja. Данный фрагмент встречается у 58.8 % исследованных образцов.

Дополнительные исследования позволили нам выявить фрагмент ОРО-О5750, характерный для G. max и её гибридов, частота его встречаемости составила 100% (рисунок 6). У G. soja и G. gracilis данный фрагмент не встречался. Также обнаружен фрагмент (праймер ОРО-01) массой около 700 п.о., который встречался только у 52.9 % образцов дикой и у 85 % образцов полудикой сои. Результаты, полученные при использовании lSSR-праймеров, позволили выявить два ампликона, характерных для G. max и G. gracilis и трёх популяций G. soja 18

Не было выявлено уникального фрагмента у полудикой сои, который бы указывал на особые генетические отличия G. gracilis от G. max и G. soja. Таким образом, найденные уникальные фрагменты являются специфическими маркерами для дикой и культурной сои и, следовательно, индикаторами разобщенности близкородственных таксонов, ss s sss s М $ sWIsgggggggrnmmmhhM

i ni Hi sail-

Ф жФШ mmmШтW 65S

521

Рисунок 6 - Праймер OPO-05. Уникальный фрагмент (обведён), s - образцы G. soja; g -образцы G. gracilis; m - образцы G. max; h - межвидовые гибриды; M - маркер молекулярной массы

При изучении филогенетических отношений в подроде Soja в качестве внешней группы были введены в анализ генотипы некоторых видов многолетней сои (подрод Glycine). В ходе анализа выявлено 222 ампликона, 219 из них были полиморфны. Для подрода Soja выявлено 87 ампликонов, полиморфные составили 65.

Neighbor-Joining - метод (рисунок 7) позволил чётко дискриминировать G. soja и G. max; образцы G. gracilis кластеризовались вместе с сортами культурной сои. Следовательно, G. max и G. gracilis зволюционно близки между собой, это согласуется с данными других исследователей, также использовавших RAPD-маркеры (Thseng et al, 1999, 2000; Chen, 2002; Chen, Nelson, 2004). Предположение о близости полудикой сои и староместных сортов не подтвердилось. Гибриды дикой и культурной сои кластеризовались вместе с культурной, однако, не образовали одного общего кластера с G. gracilis. Это противоречит существующему представлению о гибридной природе G. gracilis.

subgenus Soja: G. max, G. gracilis, hybrids

subgenus Soja: G. soja

subgenus Glycine:

G. tomentetla, G. tabacina, G. caneicem, G.cladeitlm

Рисунок 7 - Филогенетическое древо для подрода Soja рода Glycine построенное методом Neighbor-Joining

Отработка методологии молекулярной идентификации гибридов сои содержащих ГМ вставку, скрининг присутствия ГМ сои (GTS 40-3-2') и ее гибридов в агиоценозах Приханкайской равнины юга российского Дальнего Востока

Надежная методология выявления ГМ культуры и ее гибридов с обычными сортами и/или дикими родичами является важным элементом при проведени монитринга агроцинозов и прилегающих к ним территорий. Современные молекулярные методы, позволяют не только выявлять ГМ растения, но и надежно определять конкретное трансформационное событие. Принимая решение о выпуске ГМ растения в открытые системы, необходимо быть уверенным, что существует эффективная методология контроля за возможым распространены ГМ вставки путем ауткроссинга в агроценозы и популяции диких родичей. На примере ГМ сои (GTS 40-3-2), устойчивой к гербициду Раундап мы отработали методологию молекулярной идентификации наличия гена EPSPS

в растительном геноме и целостности бордерных последовательностей при гибридизации сорта ГМ сои с обычным сортом.

Сотрудниками Дальневосточного НИИ защиты растений РАСХН, в специальных полевых экспериментах были получены гибриды между сортом ГМ сои (сорт Stine RR, трансформационное событие GTS 40-3-2) и сортом Венера. Гибриды были отобраны по признаку устойчивости к гербициду Раундап. Для молекулярной идентификации наличия ГМ вставки и бордерных последовательностей использовались исходные родительские растения и контрастные по устойчивости к гербициду генотипы сои. В результате проведенного молекулярного анализа: ПЦР с использованием специфических праймеров. по наличию ГМ вставки и бордерных последовательностей были идентифицированы генотипы исходного ГМ сорта и его гибриды. Результаты эксперимента по идентификации бордерных последовательностей трансформационного события GTS 40-32, представлены на рис. 8.

Учитывая потенциальную возможность самовольного внедрения ГМ сои (GTS 403-2) фермерами как на территории КНР, так и на сопридельной территории России, нами был проведён первичный скрининг наличия ГМ сои на территории Приханкайской равнины юга российского Дальнего Востока. Листовые высечки были собраны на свободных от сорняков полях сои. Проведенный молекулярный анализ не выявил ГМ сои - трансфомационного собыитя GTS 40-3-2, рисунок 8.

12 3 4 5 « ? 8 9 10 11 12 13 14 15 161" IS IS 20 21 22 23 31

Л-,

у* ■ -

- » »Ж , ш

5 - - »* * * ,rí - ■

14 ti » 5? П » я> згш .м as ■» ti »»и м .

90S

« ' 1 ' '' ■

Рисунок 8 - Скрининг ГМ сои на юге российского Дальнего Востока. 1-4: Венера, 5-6; Stine RR (GTS 40-3-2); 7-12: Венера RR (гибриды); 13-36: образцы сои собранные в агроценозах Приморского края. М - маркер молекулярной массы

Сохранение генофонда G. soja

Проанализировав популяционно-генетическую структуру вида на территории Приморского края, мы установили высокое генетическое разнообразие популяций G. soja

Приханкайской равнины (Не - 0.324), близкое по показателям к основной части ареала (КНР). Популяции G. soja, находящиеся на этой территории России, являются приоритетными для сохранения in situ и ex situ, представляют ценнейший генофонд, с помощью которого решались, решаются и будут решаться важные проблемы селекции. Учитывая выявленные нами сниженные значения полиморфности популяций, подверженных антропогенному влиянию, в сравнении с мало нарушенными ландшафтами, сохранение уникального разнообразия естественных популяций G. soja, в особенности приречных сообществ, является первостепенным. Верховья рек должны стать охраняемыми территориями, где представляется возможным проводить поиск выдающихся генотипов дикой сои для селекционно-генетических исследований. Полученные нами данные должны лечь в основу выделения сети генетических резерватов G. soja с учетом создания буферных зон для регулярного мониторинга присутствия ГМ сои и ее потенциальных гибридов, предотвращения нежелательных последствий (в случае их выявления) при внедрении ГМ сои в Дальневосточном регионе России. В случае принятия решения о внедрении ГМ сои на юге Дальнего Востока России, необходимо воздержаться от выращивания ее в верховьях рек.

Таким образом, использование современных молекулярно-генетических методов дает возможность не только выявлять интрогрессию ГМ вставки в природные популяции G. Soja, проводить мониторинг ГМ культур, но и привентивно оценить саму возможность сосуществования ГМ культур и их дикорастущих родичей в центрах происхождения и видового разнообразия.

ВЫВОДЫ

1. -Отработана технология генотипирования и выявления внутривидового полиморфизма

растений рода Glycine подрода Soja с использованием высокоэффективных RAPD-праймеров. Проведена оптимизация условий ПЦР. По результатам анализа 255 генотипов с использованием 60 RAPD-праймеров предложен оптимальный набор из 20 праймеров для генотипирования растений подрода Soja.

2. Применение технологии RAPD-анализа позволило установить, что популяция G. soja Приханкайской равнины обладает высоким генетическим разнообразием (Нс - 0.324), сопоставимым с генетическим разнообразием в центре происхождения вида. Это позволяет использовать её в качестве модельной популяции при проведении испытаний на биобезопасность ГМ сои.

3. Проведены сравнительные популяционно-генетические исследования антропогенных и естественных популяций дикой сои. Высокий уровень генетического разнообразия

(Pits - 86.48%) характерен для естественных популяций, в то время как полиморфность в антропогенных популяциях (субпопуляциях) понижена (Рщ -52.42%).

4. Идентифицированы уникальные RAPD-фрагменты для G. soja - ОРХ-О5450 и для G. max - ОРО-05750, которые могут быть использованы в качестве маркеров при изучении гибридизационной способности видов подрода Soja.

5. С использованием RAPD и ISSR-маркеров установлена генетическая близость образцов G. soja, G. gracilis и сортов G. max.

6. Отработана методология молекулярной идентификации гибридов сои содержащих ГМ вставку. Первичный скрининг показал отсутствие ГМ сои (трансформационное событие GTS 40-3-2) в земледельческом районе Приханкайской равнины.

7. В случае внедрения ГМ сои на территорию юга Дальнего Востока РФ, необходимо проводить мониторинг не только популяций G. soja антропогенных ландшафтов, но и зон соприкосновения популяций дикой сои, произрастающих в антропогенных и ненарушенных ландшафтах. Верховья рек должны стать охраняемыми территориями, где возможно проводить поиск выдающихся генотипов дикой сои для селекционно-генетических исследований. В случае внедрения ГМ сои в Россию, необходимо воздержаться от её выращивания в верховьях рек.

Основные публикации по теме диссертации:

1. Недолужко A.B., Тихонов A.B., Дорохов Д.Б. Молекулярно-генетический анализ структуры популяций дикой сои (Glycine soja Sieb. & Zucc.) в антропогенных и естественных ландшафтах Приморского края // Генетика. 2008. Т. 44. №8. С. 1084-1088.

2. Nedoluzhko A.V. and Dorokhov D.B. Study of the biosafety of genetically modified soybean in the center of its origin and diversity in the Far East of the Russian Federation // Cytology and Genetics. 2007. V. 3. P. 72 - 85.

3. Недолужко A.B., Тихонов A.B., Дорохов Д.Б. Изучение генетической подразделённости приханкайской популяции дикой сои (Glycine soja Sieb. & Zuce., 1845) //Вестник Мордовского университета. 2008. № 2. С. 33-37.

4. Недолужко A.B. Исследование генетической структуры популяций дикорастущей сои (G. soja Sieb. & Zucc.) Приханкайской равнины // Биотехнология - охране окружающей среды - М.: Изд-во ООО «Графикон -принт», 2005. С. 608.

Dorokhov D.B., Nedoluzhko A.V., Mallabaeva D.S. Gene flow from herbicide-resistant GM-soybean to conventional and wild soya in the centre of the origin in the Russian Far East // «Proceedings Second International Conference on Coexistence between GM and non-GM based agricultural supply chains». Montpellier, France, 2005. P. 249-251.

Nedoluzhko A.V., Dorokhov D.B. Comparative genetic structure of the population of wild soya at the Khanka lake region for biosafety programs // «Biosafety Issues in Implementation of GMOs New Research Approaches, Regulation and Public Perception» Yalta, 2006. P. 24.

Dorokhov D.B., Nedoluzhko A.V. Herbicide tolerant soybean in the center of origin and diversity. // Biosafety Issues in Implementation of GMOs New Research Approaches, Regulation and Public Perception. Yalta, 2006. P. 16. Dorokhov D.B., Nedoluzhko A .V., Morohovec V.N., Jakovec P.V. Practical experience of the herbicide resistant GM soybean monitoring in the Center of the Origin and Diversity of Russian Far East // International Workshop on Post Market Environmental Monitoring of Genetically Modified Plants: Harmonization and Standardization - a Practical Approach. Berlin, Germany, 2007. P. 17. Недолужко A.B., Клицов C.B., Дорохов Д.Б. Молекулярно-генетический анализ филогенетических связей видов рода Glycine подрода Soja II Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке: состояние, проблемы, перспективы/ Тезисы докладов II Вавиловской международной конференции. Санкт-Петербург, 26-30 ноября 2007. СПб.: ВИР, 2007. С. 112 -ИЗ.

Тихонов А.В., Недолужко А.В., Дорохов Д. Б. Сравнительный анализ генетической структуры популяций дикорастущей сои (Glycine soja Sieb. & Zucc.) естественных и антропогенных ландшафтов юга Приморского края // Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке: состояние, проблемы, перспективы/ Тезисы докладов II Вавиловской международной конференции. Санкт-Петербург, 26-30 ноября 2007. СПб.: ВИР, 2007. С. 137 -139.

Тихонов А.В., Недолужко А.В., Мороховец В.Н., Яковец В.П., Басай З.В., Дорохов Д.Б. Изучение вертикального переноса генов от ГМ сои к культурной и дикой сое в условиях Приморского края // «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» / Тезисы

докладов XX Зимней международной молодёжной научной школы. Москва, 11-15 февраля 2008. М. 2008. С. 138.

Тихонов A.B., Недолужко A.B., Мороховед В.Н., Яковец В.П., Басай З.В., Дорохов Д.Б. Изучение взаимодействия генетически-модифицированной сои с дикой соей в естественных условиях Приморского края // 8-я Молодёжная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» / Тезисы докладов. Москва, 2 апреля 2008. М. 2008. С. 35 -37.

1,5 печ. л.

Зак. 493.

Тир. 100 экз.

Издательство РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44 Тел.: 977-00-12, 977-40-64

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Недолужко, Артем Валерьевич

Список использованных сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Биология дикой сои

1.1.1. Таксономия видов рода Glycine

1.1.2. Географическое распространение G. soja

1.1.3. Морфологические особенности G. soja

1.1.4. Жизненный цикл и распространение семян G. soja

1.1.5. Происхождение G. soja и центры её генетического разнообразия

1.2. Изучение генетического полиморфизма G. soja

1.3. Филогенетические отношения в подроде Sofa и проблема происхождения культурной сои 3 О

1.4. Биобезопасность ГМ сои в центре происхождения и разнообразия G. soja

1.5.Сохранение генетических ресурсов дикой сои

2. Материал и методы

2.1 .Материал

2.2. Методы

2.2.1. Выделение ДНК из растительной ткани

2.2.2. Измерение концентрации ДНК

2.2.3. Создание эквнмолярных смесей ДНК

2.2.4. Полимеразная цепная реакции

2.2.5. Фракционирование фрагментов ДНК

2.2.6. Обработка данных генетического анализа

3. Результаты и обсуждение

3.1. Изучение генетического разнообразия G. soja на территории Приморского края

3.2. Молекулярно-генетический анализ филогенетических связей видов рода Glycine подрода Soja

3.3. Скрининг присутствия ГМ сои (GTS 40-3-2) в агроцсночах юга российского Дальних» Востока

3.4. Сохранение генофонда G. soja 84 Выводы 86 Список литературы 88 Приложение

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ГМ соя Генетически модифицированная соя

ЛЭП Линия электропередачи мРНК Матричная (информационная) РНК мтДНК Митохондриальная ДНК хлДНК Хлоропластная ДНК

AFLP-PCR (Amplification Fragment Length

Polymorphism)- Полиморфизм длин амплифицированных фрагментов

AMY (Amylase) - Амилаза

ASLP (Amplification Sequence Length

Polymorphism) - Полиморфизм длин амплифицированных последовательностей ДНК

АТФаза

Esterase) - Эстераза

Isocitrate Dehydrogenase) Изоцитрат Дегидрогеназа

International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications) - Международная служба по агробиотехнологии

Inter-Simple Sequence Repeat) Амплифицированные последовательности ДНК, фланкируемые микросателлитами

Internal Transcribed Spacer) Транскрибируемый спейсер, регионы на рДНК

ATPase EST

IDH ISAAA

ISSR-PCR

ITS1 иITS

MDH PCR

RAPD-PCR

SNPs SSR-PCR

ТВЕ-буфер ТЕ-буфер UPGMA

Neighbor-Joining) - Объединение ближайших соседей

Malic dehydrogenase) Малатдегидрогеназа

Polymerase Chain Reaction) -Полимеразная цепная реакция

Random Amplified Polymorphic

DNA) Амплнфнцированные последовательности случайной полиморфной ДНК

Restriction Fragment Length Polymorphism)- Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов или ПДРФ

Single Nucleotide Polymorphisms) -Единичные нуклеотидные полиморфизмы

Simple Sequence Repeats)- Простые повторяющихся последовательности (микросателлиты)

Трис-борат-ЭДТА

Трис-ЭДТА

Unbiased Pair Group Method Analysis) -Невзвешенный парно-групповой метод анализа метода Варда

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование генетической структуры популяций дикой сои, как элемент изучения биобезопасности генетически модифицированных растений в центрах происхождения и разнообразия вида"

Актуальность проблемы. Одним из перспективных направлений современной биотехнологии является генетическая инженерия растений. Генетически модифицированные (ГМ) растения играют важнейшую роль в современном сельском хозяйстве, и в последние годы в мире наблюдается устойчивая тенденция к увеличению посевных площадей и расширению сфер их использования. Обязательным условием для внедрения ГМ растений в сельское хозяйство является установление их статуса биобезопасности их бнобезоиасносш.

Одним из основных иетшцйалышх рисков при выращивании ГМ растений является возможность переноса и распространения ГМ вставки в популяциях диких родичей. Поэтому при исследовании биобезопасности ГМ растений, особенно в центрах происхождения и разнообразия видов, основная роль отводится изучению генетической структуры популяций диких родичей культурного растения и выбору модельных популяций для дальнейших исследований вероятности перекрёстного опыления между видами.

Устойчивая к гербициду ГМ соя оказалась перспективной моделью для изучения потенциального риска интрогрессии ГМ вставки в популяции диких родичей. Культурная соя (Glycine max (L.) Merr.) является факультативным перекрёстником — вероятность перекрёстного опыления варьирует от 0 до 3 % (Kiang et а!., 1992; Nakayama and Yamaguchi, 2002; Dorokhov et al., 2004), что позволяет проводить эксперименты в естественных условиях. Кроме того, ГМ соя, используемая в экспериментах и обладающая устойчивостью к гербициду, в значительной мере облегчает идентификацию межвидовых гибридов.

Для проведения оценки потенциального риска передачи признака устойчивости к гербициду в популяцию дикой сои в условиях Дальневосточного региона был осуществлён поиск репрезентативной популяции G. soja Siebold et Zucc., которая могла бы быть использована для этих целей.

Анализируя генетическую структуру популяций дикой сои, учитывали тот факт, что юг российского Дальнего Востока (Амурская область, Приморский и Хабаровский край) территориально входит в Китайско-Японский центр происхождения культурных растений (Вавилов, 1926) и является центром генетического разнообразия G. soja. Контрастность местных агроклиматических условий является одной из причин высокого генетического разнообразия дальневосточных форм дикой сои (Седова, 1989; Сеферова, 2006). Поэтому предстояло выявить наиболее репрезентативную популяцию, обладающую наибольшим генетическим полиморфизмом.

Учитывая генетическое родство видов, выделяемых в подроде Soja, для изучения внутривидового и межвидового полиморфизма были выбраны методы RAPD и ISSR-анализа. Для изучения генетического разнообразия дикой сои с помощью RAPD-анализа необходимо было подобрать дизайн праймеров, оптимизировать условия ПЦР, выбрать группу праймеров наиболее эффективных для изучения генетического полиморфизма в подроде Soja рода Glycine.

Данная работа направлена на развитие новых методических подходов и их использование в изучении биобезопасности ГМ растений — важного этапа при внедрении достижений современной биотехнологии в экономику страны. Исследования проводились в соответствии с законом «О генно-инженерной деятельности», разрабатывались научно-методические подходы и рекомендации для применения ГМ растений в открытых системах и проведения контроля их био безопасности. Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось исследование генетической структуры популяций дикой сои на юге Дальнего Востока России в контексте изучения потенциального риска использования ГМ растений в центрах происхождения и разнообразия их дикорастущих родичей. В соответствии с данной целью поставлены следующие задачи:

1. Отработать методические подходы для генотипирования и выявления внутривидового полиморфизма растений рода Glycine подрода Soja с использованием высокоэффективных ISSR и RAPD-праймеров и оптимизированных условий проведения ПНР.

2. Изучить генетическую структуру популяции G. soja, произрастающей на Приханкайской равнине. Оценить возможность использования её в качестве репрезентативной при проведении экспериментов по изучению переноса генов от культурной к дикой сое.

3. Охарактеризовать степень генетической дифференциации популяций G. soja в антропогенных и естественных ландшафтах, исходя из того, что популяции дикой сои, произрастающие в антропогенных ландшафтах, являются первичными потенциальными акцепторами ГМ вставки.

4. Изучить филогенетические взаимоотношения в подроде Soja рода Glycine, используя ISSR и RAPD-анализ.

5. Выявить уникальные фрагменты ДНК, характерные для G. max, G. soja и G. gracilis, необходимые для надёжной идентификации видов и межвидовых гибридов.

6. Провести первичный скрининг присутствия ГМ сои (трансформационное событие GTS 40-3-2) в земледельческом районе Приханкайской равнины юга российского Дальнего Востока.

7. Разработать рекомендации по минимизации риска «выхода» ГМ вставки в естественные популяции при внедрении ГМ сортов сои на территории Дальнего Востока России и предложить меры для сохранения генофонда дикой сои.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Биология дикой сои

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Недолужко, Артем Валерьевич

ВЫВОДЫ

1. Отработана технология генотипирования и выявления внутривидового полиморфизма растений рода Glycine подрода Soja с использованием высокоэффективных RAPD-праймеров. Проведена оптимизация условий ПЦР. По результатам анализа 255 генотипов с использованием 60 RAPD-праймеров предложен оптимальный набор из 20 праймеров для генотипирования растений подрода Soja.

2. Применение технологии RAPD-анализа позволило установить, что популяция G. soja Приханкайской равнины обладает высоким генетическим разнообразием (Не — 0.324), сопоставимым с генетическим разнообразием в центре происхождения вида. Это позволяет использовать её в качестве модельной популяции при проведении испытаний на биобезопасность ГМ сои.

3. Проведены сравнительные популяционно-генетические исследования антропогенных и естественных популяций дикой сои. Высокий уровень генетического разнообразия (Р95 - 86.48%) характерен для естественных популяций, в то время как полиморфность в антропогенных популяциях (субпопуляциях) понижена (Р95 - 52.42%).

4. Идентифицированы уникальные RAPD-фрагменты для G. soja - ОРХ-05450 и для G. max — ОРО-О5750, которые могут быть использованы в качестве маркеров при изучении гибридизационной способности видов подрода Soja.

5. С использованием RAPD и ISSR-маркеров установлена генетическая близость образцов G. soja, G. gracilis и сортов G. max.

6. Первичный скрининг показал отсутствие ГМ сои (трансформационное событие GTS 40-3-2) в земледельческом районе Приханкайской равнины.

7. В случае внедрения ГМ сои на территорию юга Дальнего Востока РФ, необходимо проводить мониторинг не только популяций G. soja антропогенных ландшафтов, но и зон соприкосновения популяций дикой сои, произрастающих в антропогенных и ненарушенных ландшафтах. Верховья рек должны стать охраняемыми территориями, где возможно проводить поиск выдающихся генотипов дикой сои для селекционно-генетических исследований. В случае внедрения ГМ сои в Россию, необходимо воздержаться от её выращивания в верховьях рек.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Недолужко, Артем Валерьевич, Москва

1. Абрамсон Н.И. Фитогеография: итоги, проблемы, перспективы // Вестник ВОГиС. 2007. Т. 11. №2. С. 307-331.

2. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика: Пер. с англ. М.: Мир, 1988, Т. 3. 335 с.

3. Ала А.Я. Дикая уссурийская соя донор генов повышенного содержания белка в семенах // Генетика и селекция сельскохозяйственных культур. Новосибирск, 1978. Т. 26. С. 16-20.

4. Ала А.Я., Ала B.C. Использование зародышевой плазмы диких форм сои в селекции. Благовещенск, 2002. 44 с.

5. Ала А.Я., Тильба В.А. Соя: генетические методы селекции G. max (L.) Men", х G. soja, Благовещенск: ПКИ «Зея», 2005. 128 с.

6. Брик А.Ф., Сиволап Ю.М. Молекулярно-генетический полиморфизм сои, детектированный ПП ПЦР, SSRP и ISSR // Цитология и генетика. 2001. Т. 35. №5. С. 3-9.

7. Вавилов Н.И. Центры происхождения культурных растений. JL: тип. им. Гутгенберг, 1926. 248 с.

8. Глазко В.И. Генетически детерминированной полиморфизм ферментов у некоторых сортов сои {Glycine max) и дикой сои (Glycine soja) // Цитология и генетика. 2000. Т. 34. №. 2. С. 77-84.

9. Ю.Дорохов Б.Д., Игнатов А.Н., Серяпин А.А., Дорохов Д.Б. Изучение генетического разнообразия дикорастущей сои {(Glycine soja Siebold et

10. П.Дорохов Д.Б., Клоке Э. Быстрая и экономичная технология RAPD анализа растительных геномов // Генетика. 1996. Т. 33. С. 358 — 365.

11. Козак М.Ф. Эволюционная экология и морфология представителей двух видов сои (Glicine L.). Автореферат доктора биологических наук. Астрахань, 2005. 50 с.

12. Комаров B.JI., Клобукова-Алисова Е.Н. Определитель растений Дальневосточного края. Л,: Изд-во АН ССС, 1932. Т. 2. 1175 с.

13. Куренцова Г.Э. Растительность Приханкайской равнины и окружающих предгорий. М.-Л.: Изд-во АН СССР, 1962. 137 с.

14. Маак Р. Путешествие по долине р. Уссури. Санкт-Петербург, 1861. Т. 2. 344 с.

15. Майр Э. Зоологический вид и эволюция. М: Мир, 1968. 398 с.

16. Майр Э. Популяции, виды и эволюция. М: Мир, 1974. 460 с.

17. Москалейчик Ф.Ф. Современные представления о генетической динамике подразделённых популяций // Успехи современной биологии. 2003. Т. 123. №5. С. 445-466.

18. Научно-прикладной справочник по климату СССР. Серия 3. Многолетние данные. Приморский край. Ч. 1-6. Вып. 26. Л.: Гидрометеоиздат, 1988. 416 с.

19. Недолужко В.А., Денисов Н.И. Флора сосудистых растений острова Русский. Залив Петра Великого в Японском // Труды ботанических садов ДВО РАН. Владивосток.: Дальнаука, 2001. 98 с.

20. Недолужко А.В., Тихонов А.В., Дорохов Д.Б. Молекулярно-генетический анализ структуры популяций дикой сои (Glycine soja Sieb. & Zucc.) в антропогенных и естественных ландшафтах Приморского края // Генетика. 2008. Т. 44. № 8. С. 1084 1088.

21. Пробатова Н.С., Селедец В.П., Недолужко В.А., Павлова Н.С. Сосудистые растения островов залива Петра Великого в Японском море (Приморский край). Владивосток: Дальнаука, 1998. 116 с.

22. Седова Т.С. К итогам изучения коллекции дикорастущей уссурийской сои // Научно-технический бюллетень ВИР. Л.: ВИР, 1989. Вып. 194. С. 8 9.

23. Сеферова И.В. Распространение дикорастущей уссурийской сои (Glycine soja) на территории России и представленность ее в коллекции ВИР // Генетические ресурсы культурных растений. Международная научно-практическая конференция. СПб, 2001. 490 с.

24. Сеферова И.В. Географическая изменчивость Glycine soja на российской части ареала // Материалы международной научной конференции,посвященной 200-летию Казанской ботанической школы. Казань, 2006. С. 121 123.

25. Скворцов Б.В. Дикая и культурная соя Восточной Азии // Вестник Маньчжурии. Харбин, 1927. №9. С. 35-43.

26. Сунь Син-Дун Соя. М.: Государственное издательство сельскохозяйственной литературы, 1958. 248 с. Перевод с китайского.

27. Тупикова Г.П. Соя JI.: Издание Всесоюзного института прикладной ботаники и новых культур, 1929. 255 с.

28. Харкевич С.С. Сосудистые растения Советского Дальнего Востока. Л.: Наука, 1989. Т. 4. 378 с.

29. Хедрик Ф. Генетика популяций: пер. с англ. М.: Техносфера, 2003. 592 с.

30. Яковлев И.А., Клейншмит Й. Генетическая дифференциация дуба черешчатого (Querqus robur L.) в европейской части России на основе RAPD-маркеров // Генетика. 2002. Т. 38. №2. С. 207-215.

31. Aagaard J.E., Krutovskii K.V., Strauss S.H. RAPDs and allozymes exibit similar levels of diversity and differentiation among populations and races of Douglas-fir // Journal of Heredity. 1998. V. 81. P. 69 78.

32. Abe J., Hasegawa A., Fukushi 11., Mikami Т., Ohara M. Shimamoto Y. Introgression between wild and cultivated soybeans of Japan revealed by RFLP analysis of cMoroplast DNAs // Economic Botany. 1999. V. 53. P. 285 291.

33. Abe J., Xu D.H., Suzuki Y., Kanazawa A., Shimamoto Y., Soybean germplasm pools in Asia revealed by nuclear SSRs // Theoretical and Applied Genetics. 2003. V. 106. P. 445-453.

34. Ahmad S., Wahid A., Rasul E., Wahid A. Comparative morphological and physiological responses of green gram genotypes to salinity applied at different growth stages //Botanical Bulletin of Academia Sinica. 2005. V. 46. P. 135 — 142.

35. Broich S.L., Palmer R. A claster analysis of wild and domesticated soybean phenotypes // Euphytica. 1980. V. 29. P. 23 32.

36. Brovvn-Guedira G.L., Thompson J.A., Nelson R.L., Warburton M.L. Evaluation of genetic diversity of soybean introductions and North American ancestors using RAPD and SSR markers // Crop Science. 2000. V. 40. P. 815 823.

37. Caldwell B.E. ed. Soybeans: improvement, production and uses. Madison, Wisconsin: American Society of Agronomy, 1973. 681 p.

38. Cao Y., Zhang X., Bai J., Gong G. Distribution on the wild germplasm resources of main food crops in China // Acta Agronomica Sinica. 1999. V. 25 №4. P. 424 432.

39. Chen Y. Evaluation of diversity in Glycine soja and genetic relationships within the subgenus Soja // Dissertation of Doctor of Philosophy in Crop Science. Urbana, Illinois. 2002.

40. Chen Y., Nelson R.L. Genetic variation and relationships among cultivated, wild, and semiwild soybean // Crop Science. 2004a V. 44. P. 316 325.

41. Chen Y., Nelson R.L. Evaluation and classification of leaflet shape and size in wild soybean // Crop Science. 2004b. V. 44. P. 671-677.

42. Chiang Y. Genetic and quantitative variation in wild soybean (Glycine soja) populations // Dissertation Abstracts International. PhD University of New Hampshire. 1985.

43. Cho M.R. Won S.Y., Ryu T.H, Sohn S.I., Kim J.K., Baek H.J. Genetic Diversity and GM soybean in Korea (unpublished).

44. Dong Y., Sun H., Zhuang В., Zhao L., He M. The genetic diversity in annual wild soybean // VI World Soybean Resource Conference. USA, Chicago, 1999. P. 147-155.

45. Dong Y.S., Zhuang B.C., Zhao L.M., Sun H., Zhang M., He M. Y. The genetic diversity centers of annual wild soybean in China // Acta Agronomica Sinica.2000. V. 26. № 5. P. 522 527.

46. Dong Y.S., Zhuang B.C., Zhao L.M., Sun H., He M.Y. The genetic diversity of annual wild soybeans grown in China // Theoretical and Applied Genetics.2001. V. 103. P. 98 -103.

47. Dong Y.S, Zhao L.M., Liu В., Wang Z.W., Jin Z.Q., Sun H. The genetic diversity of cultivated soybean grown in China // Theoretical and Applied Genetics. 2004. V. 108. № 5. P. 931 936.

48. Doyle, J.J., Beachy R.N. Ribosomal gene variation in soy classification // Theoretical and Applied Genetics. 1985. V. 70. P. 369 376.58JDoyle J.J. 5S ribosomal gene variation in soybean {Glycine) and its progenitor

49. Theoretical and Applied Genetics. 1988. V. 75. P. 621 624. 59.Edwards K., Johnstone C., Thompson C.A Simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis J J Nucleic Acids Research. 1991. V. 19. 6. P. 1349.

50. Ellstrand N.C., Prentice H.C., Hancock J.F. Gene flow and introgressiom. from domesticated plants into their wild relatives // Annual Review of Ecology Systematics. 1999. V. 30. P. 539 563.

51. Hrtl D.S., Fehr W.R. Agronomic performance of soybean genotype^ from Glycine max x Glycine soja crosses // Crop Science. 1985. V. 25. P. 589 — 592.

52. Forman R.T.T., Alexander L.E. Roads and their major ecological effects. Annual Review of Ecology and Systematics. 1998. Y. 29. P. 207 231.

53. Fujita R.y Ohara M., Okazaki K.? Shrmamoto Y. The extent of natural cross-pollination in wild soybean (Glycine soja) // Journal of Heredity. 1997. V. 38. P. 124-128.

54. Fukuda Y. Cytogenetical studies on the wild and cultivated Mancliurian soybean (Glycine L.) // Journal of Japanese Botany. 1933. V. 6. P. 489 — 506.

55. Hermann FJ. A revision of the genus Glycine and its immediate allies // US Department of Agriculture Technical Bulletin, 1962. Jfe 1268. P. 1 82.

56. Hirata Т., Abe J., Shimamoto Y. Genetic structure of the Japanese soybeanspopulation // Genetic Resources and Crop Evolution. 1999. V. 46. № 5. p. 441 -453.

57. Huang J., Rozelle S., Pray C., Wang Q. Plant Biotechnology in China // Science. 2002. V. 295. P. 674 677.

58. Hymowitz T. On the domestication of soybean // Economic Botany. 1970. V. 23. P. 408-423.

59. Hymowitz, Т., R.J. Singh. Taxonomy and speciation. In J.R. Wilcox (ed.) Soybeans: Improvement; production, and uses // American Society of Agronomy. 16. 2nd ed. ASA, Madison, WI, 1987. P. 23-48.

60. Hymowitz Т., Shurtleff W.R. Debunking soybean myths and legends in the historical and popular literature // Crop Science. 2005. V. 45. № 2. P. 473 -476.

61. Hyten D.L., Song Q., Zhu Y., Choi Ik-Y., Nelson R.L., Costa J.M., Specht J.E., Shoemaker R.C., Crcgan P.B. Impacts of genetic bottlenecks on soybean genome diversity // PNAS. 2006. V. 103. № 45. P. 16666 -16671.

62. Jin Y., He Т., Lu B.-R. Fine scale genetic structure in a wild soybean {Glycine soja) population and the implications for conservation 11 New Phytologist. 2003. V. 159. P. 513-519.

63. Jin Y., He Т., Lu B.-R. Genetic spatial clustering: significant implications for conservation of wild soybean (Glycine soja: Fabaceae) // Genetica. 2006. V. 128. P. 41-49.

64. Kanazawa A., Tozuka A., Akimoto Sh.-i., Abe J., Shimamoto Y. Phylogenetic relationships of the mitochondrial genomes in the genus Glycine subgenus Soja. Genes & Genetic Systems. 1998. Y. 73. P. 255 261.

65. Keen, N.L., Lyne ILL., Hymowitz T. Phytoalexin production as a chemosystematic parameter with Glycine ssp. // Biochemical Systematics and Ecology. 1986. V. 14. P. 481-486.

66. Keim P., Shoemaker R.C., Palmer R.G. Restriction fragment length polymorphism diversity in soybean // Theoretical and Applied Genetics. 1989. V. 77. P. 786-792.

67. SO.Kiang Y.T., Chiang Y.C., Kaizuma N. Genetic diversity in natural populations of wild soybean in Iwate Prefecture, Japan // Journal of Heredity. 1992. V. 93. P. 325-329.

68. SLKollipara, K.P., Singh R.J., Hymowitz T. PhylogeneJie and genomic relationships in the genus Glycine Willd. Based on sequences from the ITS region of nuclear rDNA // Genome. 1997. V. 40. P. 57-68.

69. Koyama M.L., Levesley A., Koebner R.M., Flowers T.J., Yeo A.R. Quantitative trait loci for component physiological traits determining salt tolerance in rice // Plant Physiology. 2001. V. 125. Аг« 1. P. 406 422.

70. Kuroda Y. Kaga A., Tomooka N., Vaughan D.A. Population genetic structure of Japanese wild soybean (Glycine soja) based on microsatellite variation // Molecular Ecology. 2006. V. 15. P. 959 974. *

71. Li J., Tao Y., Zheng S.Z., Zhou J.L. Isozymatic differentiation in local population of Glycine soja Sieb. et Zucc // Acta Botanica Sinica. 1995. Y. 37. P. 669 676 (in Chinese).

72. Li Z., Qiu L., Thompson J.A., Welsh M.M., Nelson RX. Molecular genetic analysis of U.S. and Chinese soybean ancestral lines // Crop Science. 2001. Y. 41. P. 1330-1336.

73. Li Z., Nelson R.L. Genetic diversity among soybean accessions from three countries measured by RAPDs // Сюр Science. 2001. V. 41. P. 1337 1347.

74. Lippe M. and Kowarik I. Long-distance dispersal of plants by vehicles as a driver of plant invasions // Conservation Biology. 2007. V. 21. № 4. P. 986 -996.

75. Liu В., Fujita Т., Yan Z.H., Sakamoto S„ Xu D., Abe J. QTL mapping of domestication-related traits in the soybean (Glycine max) И Annals of Botany. 2007. V. 100. № 5. p.i 12.

76. Lu B.-R. Conserving biodiversity of soybean gene pool in the biotechnology era // Plant Species Biology. 2004. V. 19. № 2. P. 115 125.

77. Manabe Т., Kashiwara Y., Yamada S., Harada J., Matsumura T. Environmental safety evaluation of transgenic soybean with glyphosate-tolerance in the environmentally isolated field // Breeding Science. 1996. V. 46. P. 261 (in Japanese).

78. Maughan P.J., Saghi Maroof М.Л., Buss G.R. Microsatellite and amplified sequence length polymorphisms in cultivated and wild soybean // Genome.1995. V. 38. P. 715 723.

79. Maughan P.J., Saghai Maroof M.A., Buss G.R., Huestis G.M. Amplified fragment length polymorphism (AFLP) in soybean: species diversity, inheritance, and near-isogenic line analysis // Theoretical and Applied Genetics.1996. V. 93. №3. P. 392-401.

80. Miller M.P. Tools for population genetic analyses (TFPGA) 1.3: A windows program for the analysis of allozyme and molecular population genetic data. Computer software distributed by author. 1997.

81. Nakavama Y., Yamaguchi H. Natural hybridization in wild soybean (Glycine max ssp. soja) by pollen flow from cultivated soybean (Glycine max ssp. max) in a designed population 11 Weed Biology and Management. 2002. V. 2. № 1. P. 189 —196.

82. Narvel J.M., Fehr W.R., Chu W.-C., Grant D., Shoemaker R.C. Simple sequence repeat diversity among soybean plant introductions and elite genotypes II Crop Science. 2000. V. 40. P. 1452 -1458.

83. Nap J.-P., Metz P. L. J., Escaler M., Conner A.J. The release of genetically modified crops environment // The Plant Journal. 2003. V. 33. P. 1-18.

84. Nedoluzhko A.V. and Dorokhov D.B. Study of the biosafety of genetically modified soybean in the center of its origin and diversity in the Far East of the Russian Federation // Cytology and Genetics. 2007. V. 3. P. 72-85.

85. Nei M. Genetic distance between populations // American Naturalist. 1972. V. 106. P. 283-92.

86. Nickrent D.L., Patrick J.A. The nuclear ribosomal DNA intergenic spacers of wild and cultivated soybean have low variation and cryptic subrepeats // Genome. 1998. V. 41. P. 183 192.

87. Nybom H. Comparison of different nuclear DNA markers for estimating intraspecific genetic diversity in plants // Molecular Ecology. 2004. V. 13. P. 1143-1155.

88. Ohara M., Shimamoto Y. Importance of genetic characterization and conservation of plant genetic resources: The breeding system and genetic diversity of wild soybean (Glycine soja) // Plant Species Biology. 2002. V. 17. P. 51-58.

89. Palmer R.G., Heer H.E. Agronomic characteristics and genetics of a chromosome interchange in soybean // Euphytica. 1984. Y. 33. P. 651 663.

90. Palmer, R.G., Newhouse K.E., Graybosch R.A., Delannay X. Chromosome structure of wild soybean (Glycine soja Sieb. & Zucc.) accessions from China and the Soviet Union // Journal of Heredity. 1987. V. 78. P. 243247.

91. Palmer R.G., Sun H., Zhao L.M. Genetics and cytology of chromosome inversions in soybean germplasm // Crop Science. 2000. V. 40. P. 683 687.

92. Powell W., Morgante M., Doyle J., McNicol J., Tingey S., Rafalski A. Genepool variation in genus Glycine subgenus Soja revealed by polymorphic nuclear and chloroplast microsatellites // Genetics. 1996a. V. 144. № 2. P. 703 -803.

93. Powell W., Morgante M., Andre C., Hanafey M., Vogel J., Tingey S., Rafalski A. The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis // Molecular Breeding. 1996b. V. 2. № 3. P. 225 -238.

94. Raybould A. F., Gray A. J. Genetically modified crops and hybridization with wild relatives: A UK perspective // The Journal of Applied Ecology. 1993. V. 30. №2. P. 199-219.

95. Singh R.J., Hymowitz T. The genomic relationship between Glycine max (L.) Merr. and G. soja Sieb. and Zucc. as revealed by pachytene chromosome analysis // Theoretical and Applied Genetics. 1988. V. 76. P. 705 711.

96. Shands H.L. Plant genetic resources conservation: The role of the gene bank in delivering useful genetic materials to the research scientist // Journal of Heredity. 1990. V. 81. № 1. P. 7-10.

97. Shimamoto Y., Fukushi H., Abe J., Kanazawa A., Gai J., Gao Z., Xu D. RFLPs of chloroplast and mitochondrial DNA in wild soybean, Glycine soja, growing in China // Genetic Resources and Crop Evolution. 1998. V. 45. P. 255-261.

98. Shoemaker, R.C., Hatfield P.M., Palmer R.G., Atherly A.A. Chloroplast DNA variation and evolution in the genus Glycine soja I I Journal of Heredity. 1986. V. 77. P. 26 — 30.

99. Singh R.J., Hymowitz T. Tlie genomic relationships between Glycine max (L.) Merr. and G. soja Sieb. and Zucc. as revealed by pachytene chromosome analysis // Theoretical and Applied Genetics. 1988. V. 76. P. 705 -711.

100. Singh R.J., Hymowitz T. The genomic relationships among Glycine soja Sieb. and Zucc., G. max (L.) Merr. and "G. gracilis" Skvortz // Plant Breeding. 1989. V. 103. P. 171-173.

101. Singh RJ., Hymowitz T. Soybean genetic resources and crop improvement//Genome. 1999. V. 42. P. 605-616.

102. Stewart C.N. Jr., Halfhill M.D., Warwick S.l. Transgene introgression from genetically modified crops to their wild relatives // Nature Reviews Genetics. 2003. V. 4. № ю. P. 806-817.

103. Tanksley S.D., McCouch S.R. Seed banks and molecular maps: Unlocking genetic potential from the wild 11 Science. 1997. V. 277. P. 1063 1066.

104. Thompson J.A., Nelson R.L., Vodkin L.O. Identification of diverse soybean gcrmplasm using RAPD markers // Crop Science. 1998. V. 38. P. 1348 1355.

105. Thompson J.A., Nelson R.L. Core set of primers to evaluate genetic diversity in soybean // Crop Science. 1998. V. 38. P. 1356-1362.

106. Thseng F.S., Tsai S.J., Abe J., Wu S.T. Glycine formosana Hosokawa in Taiwan: pod morphology, allozyme, and DNA polymorphism // Botanical Bulletin of AcademiaSinica. 1999. V. 40. P. 251 -257.

107. Thseng F.S. Lin Т.К., Wu S.T. The relations of genus Glycine subgenus Soja and Glycine formosana Hosokawa collected from Taiwan. Revealed by RAPD analysis II Journal of Japanese Botany. 2000. V. 75. № 5. P. 270 279.

108. Van de Peer Y., De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Computer applications in the Biosciences. 1994. V. 10. P. 569-570.

109. Villalta L, Bernet G.P., Carbonell E.A., Asins M.J. Comparative QTL analysis of salinity tolerance in terms of fruit yield using two solanum populations of F7 lines // Theoretical and Applied Genetics. 2007. V. 114. № 6. P. 1001 1017.

110. Volis S., Yakubov В., Shulgina I., Ward D., Zur V., Mendlinger S. Tests for adaptive RAPD variation in population genetic structure of wild barley, Hordeum spontaneum Koch // Biological Journal of the Linnean Society. 2001. V. 74. № 3. P. 289-303

111. Wang J.-B., Wang С., Shi S.-H., Zhong Y. ITS regions in diploids of Aegilops (Poaceae) and their pliylogenetic implications // Hereditas. 2000. V. 132. № 3. P. 209-213.

112. Wang K.-J., Takahata Y. A preliminary comparative evaluation of genetic diversity between Chinese and Japanese wild soybean (Glycine soja) germplasm pools using SSR markers // Genetic Resources and Crop Evolution. 2007. V. 54. № 1. P. 157-165.

113. Wei W., Zhong M., Wang H.-X.r Yun R., Hu Z.-A., Qian Y.-Q. Restriction endonuclease digestion of amplification products generated by RAPD technique in a population of Glycine soja И Acta Botanica Sinica. 1998. V. 40. № 5. P. 412 416 (in Chinese).

114. Williams L.F. Inheritance in a species cross in soybeans // Genetics. 1948. V. 33. P. 131-132.

115. Wolfenbarger LI., Phifer P.R. The ecological risks and benefits of genetically engineered plants // Science. 2000. v. 290. p. 2088 -2093.

116. Wu XL., He C.Y., Chen S. Y., Zhuang B.C., Wang K.J., Wang X.C. Pliylogenetic analysis of interspecies in genus Glycine through SSR markers // Acta Genetica Sinica. 2001. V. 28. №» 4. P. 359 366.

117. Xu B. A decade study of Chinese wild soybean (Glycine soja) // Jilin Agricultural Sciences. 1989. V. 39. № i. p. 5 12.

118. Xu D.H, Abe J., Gai J.Y., Shimamoto Y. Diversity of chloroplast DNA SSRs in wild and cultivated soybeans: evidence for multiple origins of cultivated soybean // Theoretical and Applied Genetics. 2002. V. 105. P. 645 653.

119. Xu D.H., Gai J.Y. Genetic diversity of wild and cultivated soybeans growing in China revealed by RAPD analysis // Plant Breeding. 2003. V. 122. № 6. P. 503 -506.

120. Xu H., Wang S., Xue D. Biodiversity conservation in China: Legislation, Plans and Measures // Biodiversity and Conservation. 1999. V. 8. № 6. P. 819 837.

121. Yeh F.C., Yang R.C., Boyle T. POPGENE. Microsoft Windows-based freeware for Population Genetic Analysis. Release 1.31. University of Alberta, Edmonton. 1999. Crp

122. Yu H. Genetic and morphological variation and differentiation of South Korean natural populations of wild soybean, Glycine soja Sieb. and Zucc. // Dissertation Abstracts International. University of New Hampshire, 1992

123. Yu H., Kiang Y.-T. Genetic variation in South Korean natural populations of wild soybean (Glycine soja) 11 Euphytica. 1993a. V. 68. № 3. P. 213 221.

124. Yu H., Kiang Y.-T. Inheritance and genetic linkage studies of isozymes in soybean // Journal of Heredity. 1993b. V. 84. № 6. P. 489 492.

125. Zeng Y., Wang J., Yang Z., Shen S., Wu L., Chen X., Meng J. The diversity and sustainable development of crop genetic resources in the Lancang River Valley // Genetic Resources and Crop Evolution. 2001. V. 48. № 3. P. 297 -306.

126. Zhang G.-Y., Guo Y., Chen S.-L., Chen S.-Y. RFLP tagging of a salt tolerance gene in rice // Plant Science. 1995. V. 110. № 2. P. 227 234.

127. Zhang К., Soliman K.M., Sapra V.T. Polymerase chain reaction detect polymorphisms and trait association in soybean // Biologia Plantarum. 1997. V. 40. №1. P. 43-53.

128. Zhao R., Cheng Z., Lu W., Lu B. Estimating genetic diversity and sampling strategy for a wild soybean {Glycine soja) population based on different molecular markers // Journal Chinese Science Bulletin. 2006. V. 51. № 10. P. 1219 -1227.

129. Zhu Т., Shi L. Doyle J.J. Keim P. A single nuclear locus phylogeny of soybean based on DNA sequence // Theoretical and Applied Genetics. 1995. V. 90. P. 991 -999.

130. Zhu W., Zhou Т., Zhong M., Lu B. Sampling strategy for wild soybean (Glycine soja) populations based on their genetic diversity and fine-scale spatial genetic structure // Frontiers of Biology in China. 2007. V. 2. № 4. P. 397 402.