Исследование функциональных характеристик изоформ сердечного миозина

Копылова, Галина Васильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование функциональных характеристик изоформ сердечного миозина
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование функциональных характеристик изоформ сердечного миозина"

На правах рукописи

Копылова Галина Васильевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК ИЗОФОРМ СЕРДЕЧНОГО МИОЗИНА

03.03.01 - физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 ИЮН 2011

Екатеринбург - 2011

4850554

Работа выполнена в лаборатории биологической подвижности Учреждения Российской академии наук Института иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН

Научные руководители:

Доктор биологических наук Бершицкий Сергей Юрьевич,

кандидат биологических наук, в.н.с. Никитина Лариса Валерьевна

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАН, ЗДНРФ, доктор биологических наук, профессор Мархасин Владимир Семенович,

лауреат Государственной премии РФ, доктор биологических наук Прошева Валентина Ивановна

Ведущая организация:

ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится /„¿¿^¿¿¿Р 2011 г. в -/¿^ часов на заседании

совета по защите кандидатских и докторских диссертаций Д 004.027.01 при учреждении РАН Институте иммунологии и физиологии УрО РАН по адресу: 620049, Российская Федерация, г. Екатеринбург, ул. Первомайская, 106.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке УрО РАН (620041, г. Екатеринбург, ул. С. Ковалевской, д. 22/20), с авторефератом — на сайте учреждения РАН Института иммунологии и физиологии УрО РАН -http://www.iip.uran.ru

Автореферат разослан /Л 2011 г.

Ученый секретарь совета по защите кандидатских и докторских диссертаций Д 004.027.01 при учреждении РАН

Институте иммунологии и физиологии УрО РАН, _____

доктор медицинских наук, профессор С^у И. А. Тузанкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Согласно данным ВОЗ, смертность от сердечно-сосудистых заболеваний занимает первое место в мире. Факторы, которые приводят к нарушению работы сердца, многочисленны, но все они, так или иначе, влияют на сократительную функцию кардиомиоцита. Нарушение сократительной функции кардиомиоцита может происходить из-за изменения состава белков сократительного аппарата или вследствие разобщения процессов сопряжения возбуждения с сокращением.

Как известно, генерация силы в мышце осуществляется за счет энергии гидролиза АТФ поперечными мостиками, образованными головками миозиновых молекул, прикрепленными к нитям актина. В сердце млекопитающих имеется два типа тяжелых цепей миозина (ТЦМ): аир [Hoh et al.,1977]. Изоформа миозина VI является гомодимером а-тяжелых цепей, a изоформа миозина V3 - гомодимером р-тяжелых цепей. По аминокислотной последовательности VI и V3 изомиозины идентичны на 93 % [Alpert et al., 2002]. Разница в аминокислотных последовательностях между а- и р-ТЦМ определяет различие их кинетических и механических свойств [Alpert et al., 2002; Krenz et al., 2007].

В рамках интактного сердца имеется заметное различие в экспрессии изоформ миозина VI и V3 в кардиомиоцитах из разных слоев стенки желудочка [Eisenberg et al., 1985; Litten et al., 1985; Carnes et al., 2004; Reiser et al., 2001]. Экспрессия этих изоформ миозинов зависит от вида животного, его возраста и гормонального статуса [Lompre et al., 1979]. Изменения в экспрессии изоформ происходят также при Патологиях сердца [Lompre et al., 1979; van der Velden et al., 1999; Miyata et al., 2000].

Изоформы сердечного миозина отличаются по своим гидролитическим и механическим характеристикам [Sata et al., 1993; Harris et al., 1994; VanBuren et al., 1995; Noguchi et al., 2003; Malmqvist et al., 2004]. На уровне взаимодействия одиночных молекул миозина и актина обнаружено, что изомиозины VI и V3 отличаются только длительностью единичных перемещений нитей актина [Sugiura et al., 1998; Palmiter et al., 1999].

Наличие изоформ сердечного миозина является приспособлением для оптимизации сократительной функции сердца. Левый желудочек сердца взрослого человека содержит около 7 % a-тяжелых цепей миозина [Miyata et al., 2000]. При ишемической и далагахщонной кардиомиопагаи а-изоформа не обнаруживается [Reiser et al., 2001], что снижает сократимость, но повышает экономичность сокращения [AlpertNR, 1972].

В первой половине 90-х годов были обнаружены мутантные формы ß-цепи миозина (сейчас их известно более ста), приводящие к выраженным клиническим симптомам гипертрофической либо дилатационной кардиомиопатии, которые могут приводить к внезапной смерти [Schmitt et al., 2006].

Различие в соотношениях изоформ VI и V3 в кардиомиоците, прежде всего, прямо проявляется в различных скоростных характеристиках развития напряжения. Кроме того, очень важен вклад, который разные соотношения изомиозинов вносят в механическую функцию в миокарде через кооперативное влияние прикрепленных поперечных мостиков на сродство тропонина С к кальцию (через механизм мостико-тропониновой кооперативное™). Это кооперативное взаимодействие регуляторных и сократительных белков является ключевым механизмом, объясняющим целый ряд феноменов биомеханики активного миокарда, связанных с влиянием механических условий сокращений на активацию сердечной мышцы [feakov et al., 1991].

Влияние изоформ сердечного миозина на кальциевую регуляцию сокращения сердечной мышцы изучалось в экспериментах на скинированных кардиомиоцитах и препаратах сердечной мышцы [Fitzsimons et al 1998; Metzger et al, 1999; Rundel et al. 2004, 2005; Krenz et al., 2007; Stelzer et al. 2007, 2008]. В настоящем имеется только одна работа по изучению вклада изоформ сердечного миозина в кальциевую регуляцию сокращений миокарда методом искусственной подвижной системы [Noguchi et al., 2003]. Имеющаяся на сегодня информация о вкладе изоформ сердечного миозина в кальциевую рефляцию сокращения сердечной мышцы являются неполной и противоречивой.

Использование метода искусственной подвижной системы позволяет изучать непосредственно взаимодействие регуляторных и сократительных белков на уровне

тонкого филамента, что дает возможность избежать артефактов, связанных с пассивным» механическими свойствами целой мышщ>1, либо кардиомиоцига. В рамках этого метод, можно задавать различные концентрации свободного кальция и регистрировать связ!-«рСа-скорость», «рСа-сила», «сила-скорость» на уровне взаимодействующих белков.

Цель работы

Провести систематическое исследование функциональных характеристик изоформ сердечного миозина кролика и оценить их вклад в кальциевую регуляции: сокращений сердечной мышцы.

Задачи исследования

1. Исследовать функциональные свойства изоформ сердечного миозина кролика VI и УЗ, а именно: актин-активируемую М£2+-АТФ-азную активность, силогенерирующие и кинетические характеристики.

2. В искусственной подвижной системе с регулируемым тонким филаментом исследовать зависимости «рСа-скорость», «рСа-сила» для изоформ сердечного миозина VI и УЗ.

3. Исследовать связь «сила-скорость» для изоформ сердечного миозина VI и УЗ при насыщающей и ненасыщающей концентрациях кальция в растворе методом искусственной подвижной системы с регулируемым тонким филаментом.

4. Получить и проанализировать зависимость «сила-мощность» для изоформ сердечного миозина VI и V3 при насыщающей и ненасыщающей концентрациях кальция в растворе.

5. Проанализировать вклад изоформ сердечного миозина VI и УЗ в кальциевую регуляцию сокращений сердечной мышцы.

Научная новизна

Впервые систематически исследованы функциональные характеристики изоформ VI и УЗ сердечного миозина кролика, используя метод искусственной подвижной системы. Получена и проанализирована связь «рСа-скорость» для изоформ сердечного миозина VI и УЗ. Показано, что кальциевая чувствительность и коэффициент Хилла зависимости «рСа-скоросгь» для изоформ VI и УЗ сердечного миозина не отличаются.

Впервые изучена связь «рСа-сила» для изоформ сердечного миозина VI и УЗ. Показано, что при низкой концентрации каждой из изоформ как коэффициент кооперативное™, так и кальциевая чувствительность выше для УЗ, чем для VI, что может иметь адаптивное значение при патологиях, связанных со снижением концентрации миозина.

Впервые на уровне взаимодействующих ансамблей молекул сократительных белков показано, что основные характеристики зависимостей «сила-скорость» и «сила-мощность» сокращения кардиомиоцита и сердечной мышцы в целом определяются свойствами изоформ миозина.

Научная и практическая значимость

Получены новые данные о роли изоформ сердечного миозина в кальциевой регуляции сокращения сердечной мышцы. С помощью метода искусственной подвижной системы показано, что механические свойства сокращения кардиомиоцита и сердечной мышцы в целом определяются составом тяжелых цепей изоформ сердечного миозина. Эти новые данные необходимы для понимания работы сердечной мышцы в норме и ее нарушениях при патологиях сердца, приводящих к изменению состава тяжелых цепей миозина.

Внедрение

Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре экспериментальной физики физико-технического факультета Уральского федерального университета имени первого Президента России Б.Н.Ельцина; на кафедре нормальной физиологии ГОУ ВПО «Уральской государственной медицинской академии Минздравсоцразвития России».

Положения, выносимые на защиту

1. Значения коэффициента кооперативное™ Хилла зависимости «рСа-сила» для изоформ сердечного миозина VI и УЗ в искусственной подвижной системе при высокой концентрации миозина не отличаются, кальциевая чувствительность выше для изоформы УЗ; при низкой концентрации каждой из изоформ как коэффициент кооперативное™, так и кальциевая чувствительность выше для V3, чем для VI.

2. Зависимость «сила-скорость» для изоформ VI и V3 в искусственной подвижной системе при насыщающей и ненасыщающей концентрациях кальция соответствует гиперболическому уравнению Хилла в области малых нагрузок и отклоняется от него в области больших нагрузок; зависимости «сила-скорость» для изоформ VI и V3 отличаются при насыщающей и ненасыщающей концентрациях кальция; изоформный состав миозина определяет форму связи «сила-скорость» в мышечных препаратах.

3. Максимум развиваемой мощности изоформы VI выше, чем изоформы V3 и сдвинут в сторону меньших нагрузок при насыщающей и ненасыщающей концентрациях кальция, что может имел, адагпивное значение для поддержания мощности на заданном уровне; мощность, развиваемая каждой из изоформ миозина, не зависит от концентрации свободного кальция во всем диапазоне нагрузок.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на международных конференциях «Biological motility: Basic research and practice» (г. Пущино,

2006 г.); «Biological motility: Achievements and Perspectives» (г. Пущино, 2008 г.); «Biological motility: from Fundamental Achievements to Nanotechnologies» (г. Пущино, 2010 г.); на Международном форуме по нанотехнологиям (г. Москва, 2008 г.); на XXXIV и XXXVI «European Muscle Congress» (г. Дебрецен, Венгрия, 2005 г.; Стокгольм, Швеция,

2007 г.); Joint British-Russian Young Scientists Workshop (Екатеринбург, 2007 г.).

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК - 7 публикаций.

Струюура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка цитируемой литературы (188 источников). Диссертация изложена на 151 странице, содержит 20 рисунков.

Работа была выполнена при поддержке фантов РФФИ, Программы фундаментальных исследований Президиума РАН, гранта Президента РФ для государственной поддержки ведущей школы РФ, HHMI и ИНТАС.

Автор приносит благодарности д.ф.-м. н. Кацнельсону Л.Б. за консультации при построении связей «рСа-скорость», «рСа-сила», «сила-скорость» и обсуждению полученных результатов; Щепкину Д.В. за помощь в проведении экспериментов;

к.б.н. Машанову Г.И. за любезно предоставленную программу записи и обработки видеоизображения; Бершицкому Б.Ю. за техническую поддержку экспериментов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы

В обзоре литературы рассматриваются особенности строения, свойства и функциональное значение изоформ сердечного миозина. Представлен обзор исследований вклада изоформ сердечного миозина в кальциевую регуляцию сокращения сердца, полученных в экспериментах на скинированных кардиомиоцитах и препаратах сердечной мышцы, а также методом искусственной подвижной системы. Показано, что имеющаяся на сегодня информация о влиянии изоформ сердечного миозина на кальциевую регуляцию, является неполной и противоречивой.

Материал и методы исследования

Растворы. Состав буфера AB: 25 мМ KCl, 25 мМ имидазола, 4 мМ MgCb, 1 мМ ЭГТА и 10 мМ дитиотриэтола, pH 7,5.

Получение белков. Актин выделяли из ацетонового порошка по стандартной методике [Pardee and Spudich, 1982]. Сердечные тропомиозин и тропонин выделяли из миокарда левого желудочка сердца быка методами Smille, 1982 и Potter, 1982 с небольшими модификациями.

Изоформа VI миозина была получена из миокарда левого желудочка гипертиреоидных, изоформа V3 - гипотиреоидных кроликов [Litten et al., 1985, vanBuren ei al., 1995]. Миозин выделяли из левого желудочка сердца кролика по стандартной методике [Margossian и Lowey, 1982] с небольшими модификациями. Состав тяжелых цепей сердечного миозина проверялся методом ПААГ-элекгрофореза [van der Velden et al., 1999]. Миокард левого желудочка гипертиреоидных кроликов содержал преимущественно изоформу миозина VI (~90%), гипотиреоидных - изоформу миозина V3 (-90%). В день эксперимента неработающие молекулы миозина удаляли ультрацентрифугированием с F-актином и АТФ [Gordon et al., 1997].

Получение регулируемого тонкого филамента. Регулируемый тонкий филамент, состоящий из актина, тропонина и тропомиозина реконструировали путем смешивания этих белков в следующих концентрациях: 400 нМ ТМРФ-Р-актина, 80 нМ тропонина и 100 нМ тропомиозина при 4 °С в буфере АВ. Соотношение белков в регулируемых тонких фииаменгах проверяли с помощью ПААГ-электрофореза [Laemmli, 1970].

Измерение АТФ-азной активности. Актин-активируемая М§2+-АТФазная активность миозина измерялась колориметрическим методом по свободному неорганическому фосфату [Kodama et al., 1986] при 28 °С в буфере АВ, содержащем 0,05 мкМ миозина, от 10 до 30 мкМ F-актина и 1 мМ АТФ. Основные параметры кинетики Михаэлиса-Ментен определялись с помощью графика Лайнуивера-Бэрка.

Эксперименты на искусственной подвижной системе. Дня установки был использован инвертированный флуоресцентный микроскоп (Axiovert 200 М, Carl Zeiss Microimaging GmbH), укомплектованный ртутной лампой HBO 100, набором фильтров для тетраметилродамина (ТРМФ) и масляно-имерсионным объективом Alpha Plan-Fluar 100x1,45 (Carl Zeiss Microimaging GmbH). Изображение меченого актина регистрировалось с помощью EMCCD видеокамеры (Andor Technology) и записывалось на жесткий диск компьютера с помощью программы GMimPro [Mashanov et al., 2007].

Проточная камера состояла из предметного стекла с приклеенным к нему покровным стеклом, внутренняя поверхность которого была покрыта нитроцеллюлозой. В проточную камеру загружали 50мкл сердечного миозина в высокоионном буфере АВ, содержащем 500 мМ КС1, на 2 мин, затем промывали последовательно высоко- и низкоионным буфером АВ и добавляли 50 мкл БСА в концентрации 0,5 мг/мл на 1 мин. Далее загружали 500 мкг/мл F-акгина в буфере АВ с 2 мМ АТФ на 5 мин для блокировки неработающих миозиновых головок; после чего камеру трижды промывали буфером АВ. Далее добавляли 50 мкл раствора флуоресцентно меченых F-актина или тонких регулируемых филаментов в концентрации 10 нМ в буфере АВ, содержащем 100 нМ тропонин и 100 нМ тропомиозини, и инкубировали 10 мин. Затем промывали камеру буфером АВ с 0,5 мг/мл БСА, 3,5 мг/мл лкжозы, 0,02 мг/мл каталазы, 0,15 мг/мл глюкозо-оксидазы, 20 мМ ДГТ,

2 мМ АТФ и 0,5 % метиллцеллюлозы. В случае экспериментов с регулируемым тонким филаменгом раствор с АТФ содержал дополнительно 100 нМ тропонина и 100 нМ тропомиозина для предотвращения диссоциации регуляторных белков от актина. Необходимая концентрация свободного кальция в растворе достигалась добавлением Са2+-ЭГТА. Все эксперименты были выполнены при температуре 28 °С.

Построение зависимости «рСа-скорость». Для построения зависимости «рСа-скорость» были определены скорости скольжения регулируемого тонкого филамента по изоформам сердечного миозина при концентрациях кальция в растворю проточной камеры от рСа=4 до рСа=8. Скорость скольжения филаментов определяли с помощью компьютерной программы СМтРго. Кривая зависимости «рСа-скорость» была построена согласно уравнению Хилла методом наименьших квадратов:

V = Упт(1+тфСа'рСа5о)~', где рСа - отрицательный десятичный логарифм концентрации кальция в растворе; V и У^ - скорость при данном значении рСа и максимальная скорость при насыщающей концентрации кальция, соответственно; рСаю -величина, при которой достигается половина максимальной скорости скольжения филаментов (кальциевая чувствительность), И - коэффициент кооперативное™ Хилла.

Построение зависимости «рСа-сила». Относительную силу, которая движет филамент при данной концентрации кальция, оценивали по минимальной останавливающей концентрации а-актинина, по отношению к минимальной останавливающей концентрации а-актинина при насыщающей концентрации кальция. Кривая зависимости «рСа-сила» была построена согласно уравнению Хилла методом наименьших квадратов:

F = 1/[1+10(1'(рСа}дрСо)>], где: Р"- безразмерная сила, выраженная в долях к Ртах, И - коэффициент кооперативное™ Хилла, рСа50 - величина, при которой достигается сила, равная половине максимальной силы. Эксперименты были сделаны при двух концентрациях миозина, загружаемого в проточную камеру: 200 и 300 мкг/мл.

Построение связи «сила-скорость». Для построения зависимости «сила-скорость» определяли скорость скольжения регулируемых филаментов при различных концентрациях а-актинина в проточной камере. Эксперименты были

проведены при насыщающей (рСа=6,5) и ненасыщающей (рСа=7,0) концентрациях кальция в финальном буфере, содержащем АТФ.

Механическая нагрузка была выражена как отношение концентрации а-актинина, загружаемого в камеру, к максимальному значению концентрации а-актинина (соответствующему изометрическому состоянию). Теоретическая кривая зависимости «сила-скорость» аппроксимировалось с помощью гиперболического уравнения Хилла: (F/F0+a)-V=b-(1-F/F0), где К-скорость скольжения регулируемого филамента при данной нагрузке, F и F0 -значение нагрузки и максимальное значение нагрузки соответственно, а - константа силы, b - константа скорости. Значения констант а и Ъ были определены методом линеаризации гиперболического уравнения Хилла [Altringham and Johnston, 1982, Lannergren, 1978].

Определение связи «сила-мощность». Зависимость «сила-мощность» была построена на основании данных, полученных в экспериментах по определению связи «сила-скорость». Мощность определялась по формуле: P-V-F/Fo, где V -скорость скольжения регулируемых тонких филаментов при данном уровне нагрузки, F/F0 - относительная сила, выраженная как отношение концентрации а-акгинина, загружаемого в камеру, к максимальному значению концентрации а-акгинина.

Статистическая обработка. Эксперименты по определению АТФ-азной активности миозина проводились трижды. Значения Кт и Vmax представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Для построения зависимости «рСа-скорость» была усреднена скорость не менее 100 филаментов для каждого значения рСа в растворе. При определении зависимости «сила-скорость» были усреднены скорости скольжения не менее 100 филаментов при каждом значении концентрации а-акгинина, загружаемого в камеру. Значения скоростей, силы и мощности представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Эксперименты по определению зависимостей «рСа-скорость», «рСа-сила» были проведены трижды. Значения коэффициента Хилла и рСа50 для этих зависимостей получены для каждого эксперимента и усреднены. Значения

скоростей, сил, коэффициентов Хилла и рСа50 представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью компьютерной программы «Microsoft Excel» и «Статистика 6.0», для оценки значимости различий использовался непараметрический критерий Манна-Уитни.

Результаты и их обсуждение

1. Функциональные характеристики изоформ сердечного миозина

Значения и Кт актин-активируемой Mg2+-ATi>-a3Hoii активности для

каждой изоформы сердечного миозина. Значения V^ и Кт, соответственно, были равны: 5,2 ± 0,98 с"1 и 8,09 ± 5,65 мкМ для VI; 3,06 ± 0,93 с"' и 8,13 ± 2,31 мкМ для V3. Значения Fmax для изоформы VI в 1,7 раза выше, чем для V3.

Скорость скольжения F-актина по изомиозину VI составила 1,0 ± 0,1 мкм/с, по V3 - 0,59 ± 0,11 мкм/с. При насыщающей концентрации кальция (рСа=5,0) скорость движения регулируемой тонкой нити для изомиозина VI была равна 3,69 ±0,39 мкм/с, для V3 - 2,12 ±0,21 мкм/с. Скорость скольжения и F-актина, и регулируемой тонкой нити по изоформе VI в 1,7 раза больше, чем по V3. Сила, развиваемая сердечным изомиозином V3 кролика в 2 раза больше, чем VI.

2. Сравнительная оценка кальциевой активации процессов прикрепления и открепления поперечных мостиков для изоформ сердечного миозина VI и V3

Для того чтобы оценить вклад каждой изоформы сердечного миозина в кальциевую активацию процессов прикрепления/открепления поперечных мостиков, были получены соотношения «рСа-скорость», «рСа-сила», «сила-скорость», «сила-мощность» для обеих изоформ сердечного миозина.

2.1. Связь «рСа-скорость» для изоформ сердечного миозина VI и V3

Кривые зависимости «рСа-скорость» имели вид сигмоиды (рисунок 1). Значения коэффициента кооперативное™ Хилла кривой «рСа-скорость» достоверно не отличались для обеих изоформ сердечного миозина: h =1,83 ±0,12 для изомиозина VI и 1,39 ±0,39 для изомиозина V3. Кальциевая чувствительность, определяемая величиной рСа50, не различалась для обеих изоформ: для VI значение

рСа5о равнялось 7,56 ±0,01; для УЗ - 7,57 ±0,01. Аналогичные результаты в отношении кальциевой чувствительности методом искусственной подвижной системы для VI и УЗ кролика получены 1^исЫ с соавт., 2003. Значение коэффициента кооперативное™ авторы не определяли.

рСа

Рисунок 1 - Кривые зависимости скорости движения регулируемого филамента от концентрации кальция для изомиозинов VI (сплошная линия) и V3 (пунктирная линия).

Примечание: рСа - отрицательный десятичный логарифм концентрации калы/ия. Кружками и треугольниками обозначены значения скоростей, полученных в экспериментах на искусственной подвижной системе для VI и V3, соответственно. Линия регрессии соответствует уравнению Хилла. Значения скоростей представлены как среднее значение ± стандартное отклонение по трем экспериментам. Панель А: ненормированные кривые, панель Б: кривые нормированые по скорости.

Обнаружено, что скорость скольжения регулируемого филамента при насыщающей концентрации кальция для обеих изоформ выше, чем скорость F-актина в 3,8 раза. Lu с соавт., 2006 показали, что благодаря алпостерическому влиянию тропомиозина на актин большее количество гидрофобных аминокислотных остатков на актине становится доступным для лучшего стереоспецифического соответствия между актиновой нитью и молекулами миозина, что может служить причиной увеличения скорости скольжения тонкого регулируемого филамента при насыщающей концентрации ионов кальция по отношению к скорости нерегулируемого тонкого филамента.

Согласно теории мышечного сокращения, скорость ненагруженного укорочения не зависит от количества поперечных мостиков [Huxley, 1957]. В связи с этим возникает вопрос,

в чем состоит причина зависимости скорости движения филаментов от концентрации кальция в искусственной подвижной системе? Ответ состоит в том, что движение филаментов в такой системе не является ненагруженным. Имеется, по крайней мере, два фактора, которые могут выступать в качестве неучитываемой нагрузки: нигроцеллюлозная поверхность проточной камеры и нефункционирующие белки, связанные с поверхностью камеры и акшновой нитью [Haeberle and Hemric, 1995]. По этой причине, в искусственной подвижной системе с регулируемой тонкой нитью связь «рСа-скорость», которая, фактически, представляет собой связь «рСа-сила» с неучтённой силой, должна быть.

2.2. Связь «рСа-сила» для изоформ сердечного миозина VI и V3

Было установлено, что при концентрации ЗООмкг/мл сердечного миозина, загружаемого в проточную камеру, коэффициенты кооперативное™ Хилла кривых «рСа-сила» для изоформ сердечного миозина достоверно не различаются (1,54 ±0,01 для V3 и 1,56 ±0,01 для VI); при концентрации 200 мкг/мл величина h достоверно больше для изоформы V3, чем для VI (2,00 ±0,01 для V3 и 1,76 ±0,01 для VI). Кроме того, для каждого изофермента с понижением концентрации белка коэффициент кооперативности возрастает (рисунок 2).

Кальциевая чувствительность незначительно, но достоверно различалась у обеих изоформ миозина при концентрации 300 мкг/мл и равнялась 7,32 ±0,01 и 7,42 ±0,01 для VI и V3, соответственно. Однако при концентрации 200 мкг/мл наблюдалось более значительное различие в кальциевой чувствительности: рСа50 = 7,34 ±0,01 для VI и рСа50 ~ 7,93 ± 0,01 для V3. Таким образом, кальциевая чувствительность отношения «рСа-скорость» для изоформы V3 выше, чем для VI, То есть, изоформы сердечного миозина по-разному влияют на зависимость «рСа-сила».

Сдвиг влево кривой зависимости «рСа-сила» для V3 изоформы относительно кривой для VI можно объяснить различием кинетики мостиков этих двух изоформ. Время присоединённого состояния д ля изоформы V3 больше, чем д ля VI примерно в два раза [Warshaw et al., 1995]. Как полагают Brandt с соавт., 1982 увеличение времени сильносвязанного состояния ведёт к тому, что Са2+ остается дольше связанным с тропонином С

(ТпС), что в свою очередь увеличивает кальциевую чувствительность отношения «рСа-сила», то есть, ведёт к сдвигу кривой «рСа-сила» влево.

РСа рСа

Рисунок 2 - Нормированные зависимости относительной силы, развиваемой поперечными мостиками изомиозинов VI и УЗ, от концентрации свободного кальция, полученные в экспериментах на искусственной подвижной системе.

Примечание: рСа - отрицательный десятичный логарифм концентрации кальция в растворе. (А) - кривые для VI при концентрациях миозина на поверхности проточной камеры 200 (сплошная линия) и ЗООмкг/мл (пунктирная линия). (Б) - те же кривые для изомиозина УЗ. Кружками обозначена относительная сила при концентрации изомиозинов 200 мкг/мл, ромбами - при концентрации изомиозинов ЗООмкг/мл. Относительная сила представлена как среднее значение ± стандартное отклонение по трем экспериментам. Линия регрессии соответствует уравнению Хилла.

Даже незначительное изменение кальциевой чувствительности (на 0,1 рСа при концентрации ЗООмкг/мл загружаемого в проточную камеру миозина) имеет существенное физиологическое значение [ВойшеШ еХ а1., 1998].

2.3. Связь «сила-скорость» для изоформ сердечного миозина VI и УЗ

Известно, что связь «сила-скорость» зависит от концентрации кальция [Ое С1егск е1 а1., 1977]. Уровень кальция и механические условия через механизмы кооперативное™ регуляторных и сократительных белков могут существенно модулировать зависимость «сила-скорость». Можно ожидать, что связь «сила-скорость», зарегистрированная при разных уровнях кальция, для изоформ миозина будет отличаться в случае, если кооперативное влияние этих изоформ на кинетику кальций-тропониновых комплексов различно.

Были получены кривые зависимости «сила-скорость» для изоформ сердечного миозина при насыщающей (рСа=6,5) и ненасыщающей (рСа=7,0) концентрациях кальция (рисунок 3). Кривые зависимости «сила-скорость» имели форму гиперболы в области малых нагрузок и отличались от гиперболической в области больших нагрузок. Кроме того, форма кривых для гооформы VI миозина отличалась от формы кривых для изоформы V3.

0,6 Сила

Рисунок 3 - Зависимость «сила-скорость» для изоформ сердечного миозина VI и V3 при рСа = 6,5 и рСа = 7,0.

Примечание: рСа- отрицательный десятичный логарифм концентрации кальция в растворе. Значения силы пронормированы на максимальное значение для каждой изоформы при данном значении рСа. Кружками и треугольниками обозначены экспериментальные данные, полученные при рСа - 6,5 и 7,0, соответственно, аппроксимирующая линия построена с помощью полинома третьей степени методом наименьших квадратов. Значения скоростей представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Сплошная линия представляет собой кривую, соответствующую теоретической кривой, полученной с помощью гиперболического уравнения Хилла методом наименьших квадратов.

Форма кривой зависимости «сила-скорость», получаемая как связь между постнагрузкой и максимальной скоростью укорочения мышцы под этой нагрузкой в экспериментах на папиллярных мышцах и трабекулах отличается от гиперболы.

В области больших нагрузок она имеет характерный изгиб в виде направленной вверх выпуклости [Hennekes et al., 1978, Pagani and Julian, 1984].

Наличие этого изгиба связывали с особенностями метода получения данной зависимости, а не с поведением поперечных мостиков, то есть считалось, что связь «сила-скорость» для популяции поперечных мостиков в кардиомиоците должна иметь гиперболический вид в соответствии с уравнением Хилла.

Форма кривых, полученных СИ\уа с соавт., 1990 на центрифужном микроскопе для скелетного миозина и изоформ сердечного миозина [Б^шга е1 а1., 1995], очень похожа на форму полученных нами кривых: в области малых нагрузок кривая «сила-скорость» имеет вид гиперболы. Негиперболический участок на наших кривых и кривых, полученных 81щшга с соавт. и СЙша с соавт., является более выраженным, чем в работах на мышечных волокнах, что можно объяснить особенностями применяемой методики. Можно предположить наличие в искусственной подвижной системе постоянного дополнительного сопротивления движению, независящее от скорости (то есть, типа «сухого» трения). Мы оценили его вклад и показали, что с учетом «сухого» трения форма кривой зависимости «сила-скорость» приближается к форме кривой, полученной в работах на волокне.

Кривые зависимости «сила-скорость», полученные с помощью центрифужного микроскопа для изоформ сердечного [Б^ига е1 а1., 1995] и скелетного миозина [СН\уа е1 а1., 1990] несколько отличаются по форме. Негиперболическая часть кривых для изоформ сердечного миозина выражена сильнее, чем для скелетного миозина. ВойтеШ с соавт.., 1991 показали, что для волокон, содержащих одни изоформы скелетного миозина, форма кривой зависимости «сила-скорость» отклоняется от гиперболической в области больших нагрузок (около 0,8 а содержащих другие - нет. Этот результат может свидетельствовать о том, что отклонение от гиперболичности является свойством волокна, зависящим от состава сократительных белков.

Таким образом, надичие негиперболического участка на кривой зависимости «сила-скорость», скорее всего, является функциональным свойством самих поперечных мостиков. Кроме того, степень выраженности негиперболической части, возможно, закисит от изоформ миозина.

По нашим данным, максимальная скорость скольжения тонкого филамента по изоформе VI больше максимальной скорости скольжения по изоформе УЗ как при насыщающей, так и при ненасыщающей концентрациях кальция в растворе, также как

и скорость укорочения папиллярных мышц [Pagani et al., 1984] и кардиомиоцитов с преимущественным преобладанием быстрой изоформы миозина.

Работы, выполненные на скинированных кардиомиоцитах крысы [Herrón et al., 2001, Herrón and McDonald, 2002; Korte et al., 2005;], на скинированных папиллярных мышцах трансгенных кроликов [Suzuki et al., 2009] и мышей [Krenz et al., 2003] с преобладанием той или иной изоформы сердечного миозина, показывают, что при всех нагрузках скорость укорочения выше для волокон, содержащих большее количество изоформы VI. По нашим данным, в области малых и средних нагрузок при насыщающей (рСа = 6,5) и ненасыщающей (рСа = 7,0) концентрациях свободного кальция изоформа VI перемещает регулируемый тонкий филамент быстрее, чем изоформа V3 (рисунок 4).

Рисунок 4 - Зависимость «сила-скорость» для изоформ сердечного миозина VI и УЗ при рСа = 6,5 и рСа = 7,0.

Примечание: рСа - отрицательный десятичный логарифм концентрации кальция. Значения силы пронормированы на максимальное значение для каждой изоформы при данном значении рСа. Кружками и треугольниками обозначены экспериментальные данные, полученные для VI и V3, соответственно, аппроксимирующая кривая построена с помощью полинома третьей степени методом наименьших квадратов. Значения скоростей представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Согласно нашим данным, разница в скорости скольжения тонкого филаменга по разным изоформам уменьшается с ростом нагрузки: при отсутствии нагрузки скорость для V1 и УЗ изоформы отличалась на 45%, а при 0,5 Р0 разница составила ~ 25 %, при 0,7 ^— 5%. В диапазоне от 0,8 скорости скольжения филаменюв по VI или УЗ достоверно не отличались при насыщающей и ненасыщающей концентрациях кальция.

При ненасыщающей концентрации кальция У1ТИ)1 для VI и УЗ изоформь

отличалась на 60 %, а при 0,5 составила -50 %, при 0,75 /*о--30%. Такт

образом, с уменьшением концентрации кальция при одних и тех же нагрузка? разница в скоростях быстрой и медленной изоформ миозина увеличилась. Причем этс произошло за счет того, что скорость УЗ изоформы уменьшилась в большей степени чем VI изоформы. Так, значение для VI отличалось на 30 % при насыщающей ^ ненасыщающей концентрациях кальция, а для V3 - на 45 %; при 0,1 на -22 % I 40% для VI и УЗ, соответственно; при 0,25 Р0: ~6% и 15% для VI и УЗ соответственно. Таким образом, зависимость «сила-скорость» для УЗ изоформь является более чувствительной к концентрации кальция по сравнению с VI.

Для каждой изоформы миозина в области больших нагрузок (начиная с 0,8 сг максимальной нагрузки) скорость скольжения тонкого филаменга не зависит от концешрацго свободного кальция в растворе, то есть, не зависит от количества поперечных мостков.

В работе КоПе с соавт., 2005 на скинированных кардиомиоцитах крысы былс показано, что первое - кривизна кривой зависимости «сила-скорость», оцененная пс коэффициенту а/Ро, возрастала при увеличении доли УЗ изоформы в кардиомиоците второе - при уменьшении концентрации кальция от насыщающей (рСа = 4,5) дс ненасыщающей (рСа = 9,0) кривизна кривой зависимости «сила-скорость» достовернс не изменялась. В наших исследованиях форма кривых зависимости «сила-скорость> для изомиозинов VI и УЗ отличалась как при насыщающей, так и при ненасыщающей концентрации кальция в растворе. Степень кривизны кривых для изоформы УЗ был: выше, чем для VI, что следует из значений отношения а/То. для изоформы УЗ этс значение меньше, что также свидетельствует о большей эффективности преобразования энергии гидролиза АТФ в работу изоформой УЗ.

Таким образом, результаты наших экспериментов на искусственно? подвижной системе, позволяют сделать вывод о том, что состав тяжелых цепе? миозина определяет форму кривой зависимости «сила-скорость». При изменена концентрации кальция степень кривизны связи «сила-скорость» для изоформы VI

меняется в большей степени, что свидетельствует о её большей чувствительности к изменению концентрации кальция.

2.4. Связь «сила-мощность» для изоформ сердечного миозина VI и V3

Так как уровень кальция в кардиомиоците в ходе сокращения меняется, а максимальная скорость укорочения зависит от уровня активации, то концентрация кальция должна влиять и на характеристики отношения «сила-мощность».

Была получена зависимость «сила-мощность» для изоформ VI и V3 при насыщающей (рСа=6,5) и ненасыщающей (рСа=7,0) концентрациях кальция в растворе (рисунок 5).

Максимум развиваемой мощности для изоформы VI оказался больше, чем для изоформы V3 при обеих исследованных концентрациях свободного кальция, что соответствует результатам, полученным ранее на скицированных препаратах папиллярных мышц и кардиомиоцитах кроликов [Robbins et al., 2009], мышей [Krenz et al., 2007] и крыс (Herron et al., 2001; Korte et al., 2005]. Таким образом, результаты наших экспериментов позволяют сделать вывод о том, что мощность, развиваемая кардиомиоцигами и папиллярными мышцами, определяется составом тяжелых цепей миозина.

В наших исследованиях показано, что большая мощность изоформы VI по сравнению с изоформой V3 достигается, в основном, за счет более высокой её скорости, регистрируемой по скольжению регулируемого филамента.

Согласно нашим данным максимум развиваемой мощности для изоформы V3 незначительно сдвинут в сторону больших нагрузок относительно максимума мощности для изоформы VI при насыщающей и ненасыщающей концентрациях кальция (рисунок 5). Аналогично результатам [McDonald et al., 1998] на скицированных кардиомиоцитах крысы, наши данные показывают, что с уменьшением уровня кальциевой активации возрастает уровень нагрузки, при которой достигается оптимальное значение мощности (кривая «сила-мощность» сдвигается влево). Такой сдвиг имеет значение для поддержания мощности на оптимальном уровне, несмотря на уменьшение скорости сокращения при низком уровне кальция.

По нашим данным мощность, развиваемая каждой изоформой сердечного миозина, не зависит от концентрации свободного кальция в растворе во всем диапазоне нагрузок. В

диапазоне больших нагрузок (от 0,9 до максимума) изоформы VI и V3 развивают одинаковые мощности как при насыщающей, так и при ненасыщающей концентрациях свободного кальция в растворе. McDonald с соавт., 1998 на скицированных кардиомиоцитах крысы получили такой же результат: в области больших нагрузок выход мощности не зависел от уровня кальция.

Таким образом, в результате наших исследований впервые с использованием метода искусственных подвижных систем мы подтвердили, что мощность, развиваемая кардиомиоцитами и папиллярными мышцами, определяется составом тяжелых цепей миозина. Быстроциклирующая изоформа VI сердечного миозина

О 0.2 0.4 0 6 0.8 1.0 1 2 0 0.2 0.4 06 0.8 1.0 1.2

Сил а нормированная Сила нор мироваиная

Рисунок 5 - Зависимость «сила-мощность», полученная в искусственной подвижной системе при насыщающей (рСа = 6,5) и ненасыщающей (рСа = 7,0) концентрации свободного кальция в растворе для VI (сплошная линия) и V3 (пунктирная линия) изоформ сердечного миозина.

Примечание: рСа - отрицательный десятичный логарифм концентрации кальция. Аппроксимирующая кривая построена с помощью полинсича третьей степени методом наименьших квадратов. Значения мощности представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

развивает большую мощность по сравнению с изоформой V3. Наши результаты, как и результаты на скинированных кардиомиоцитах крысы, продемонстрировали, что с уменьшением уровня кальциевой активации возрастает уровень нагрузки, при которой достигается оптимальное значение мощности, что позволяет поддерживать мощность на оптимальном уровне, несмотря на падение скорости сокращения.

Следствием сердечной недостаточности, диабета и гипертиреоцдизма является угнетение функции сердца [Eichhorn and Bristow, 1996; Tahiliani and McNeill, 1986],

но точный молекулярный механизм этого явления неизвестен. Metzger с соавт., 1999 на грызунах продемонстрировали, что с каждым из этих заболеваний связан сдвиг экспрессии изоформ тяжелых цепей сердечного миозина. Аналогичное явление описано при сердечной недостаточности у человека. Miyata с соавт., 2000 выявили, что левый желудочек здорового человека содержит ~ 7 % а-ТЦМ, но на конечных стадиях сердечной недостаточности эта изоформа сердечного миозина в желудочке отсутствует. Огличие в развиваемой мощности VI и V3 изоформами миозина, а также кардиомиоцигами, содержащими а- и ß-ТМЦ может служить основой для объяснения молекулярного механизма изменения функции сердца при этих заболеваниях. Выводы

1. Актин-активируемая Mg^-АТФ-азная активность и скорость скольжения как F-актина, так и регулируемого филамента для изоформы VI в 1,7 раза выше, чем для V3; сила, развиваемая сердечным изомиозином V3 кролика в 2 раза больше, чем изомиозином VI.

2. Коэффициент кооперативное™ Хилла зависимостей «рСа-скорость» и «рСа-сила» для изоформ сердечного миозина, а также кальциевая чувствительность связи «рСа-скорость» достоверно не отличаются; кальциевая чувствительность связи «рСа-сила» для изоформы V3 выше, чем для VI; при низкой концентрации каждой из изоформ и коэффициент кооперативное™, и кальциевая чувствительность больше для V3, чем для VI.

3. Зависимость «сила-скорость» для изомиозинов VI и V3, полученная методом искусственной подвижной системы, соответствует гиперболическому уравнению Хилла в области малых нагрузок и отклоняется от него в области больших нагрузок, что и определяет форму данной зависимое™ для мышечных препаратов.

4. Степень кривизны зависимое™ «сила-скорость», для изоформы V3 выше, чем для изоформы VI; при уменьшении концентрации кальция разница в скоростях скольжения филаментов по изоформам VI и V3 увеличивается за счет большего снижения скорости по медленной изоформе.

5. Мощность, развиваемая каждой изоформой миозина, не зависит от концентрации кальция во всем диапазоне нагрузок; максимум развиваемой мощности изоформы VI выше, чем изоформы V3, и сдвинут в сторону меньших нагрузок.

6. Данные, полученные на молекулярном уровне, свидетельствует о том, что свойства изоформ сердечного миозина определяют активные механические свойства кардиомиоцитов и вносят основной вклад в адаптационную пластичность сердечной мышцы в норме и при патологии. Практические рекомендации

При разработке исследовательских программ оценки кальциевой регуляции сокращения миокарда в норме и при патологии необходимо использовать полученные результаты по влиянию изоформного состава сердечного миозина на скорость и силу сокращения сердечной мышцы при разных уровнях кальциевой активации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Shchepkin D.V. Effects of cardiac myosin binding protein-C on the regulation of interaction of cardiac myosin with thin filament in an in vitro motility assay / D.V. Shchepkin, G.V. Kopylova, L.V. Nikitina, L.B. Katsnelson, B.Y. Bershitsky // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2010. - Vol. 401. - P. 159-163.

2. Shchepkin D.V. Assessment of the effect of cardiac myosin binding protcin-C on 'pCa-velocity' relationship obtained in an in vitro motility assay / D.V. Shchepkin, G,V. Kopylova, B.Y. Bershitsky, L.V. Nikitina // J Gen Phys. - 2009. - Vol. 134 - la-2a.

3. Никитина Jl.B. Исследование взаимодействия сократительных и регуляторпых белков миокарда кролика методом искусственных подвижных систем / Л.В. Никитина, Г.В. Копылова, Д.В. Щепкин, Л.Б Кацнельсон // Биохимия. - 2008. - Т. 73, № 2. - С. 219-227.

4. Никитина Л.В. Оценка механической активности сердечных изомиозинов VI и V3 методом искусственных подвижных систем с регулируемой тонкой нитью / Л.В. Никитина, Г.В. Копылова, Д.В. Щепкин, Л.Б Кацнельсон // Биофизика. - 2008. - Т. 53, № 6. -С. 956-962.

5. Kopylova G.V. Mechanical characteristics of different rabbit cardiac isomyosins obtained in an in vitro motility assay with regulated thin filaments / G.V. Kopylova, L.V. Nikitina, D.V. Shchepkin, L.B. Katsnelson // J Muscle Res Cell Motil. - 2007. - Vol. 28. - P. 447.

6. Копылова Г.В. Применение метода in vitro подвижных систем для исследования кальций-механической связи в скелетной и сердечной мышцах / Г.В. Копылова, Л.Б. Кацнельсон, Д.А. Овсянников, С.Ю. Бершицкий, JI.B. Никитина // Биофизика. - 2006. -Т. 51, № 5. - С. 781-785.

7. Nikitina L. Mechanical and kinetic properties of rabbit cardiac isomyosins VI and V3 compared in an in vitro motility assay and optical tweezers / L.Nikitina, G.Kopylova and J.E.Molloy // J Muscle Res Cell Motil. - 2005. - Vol. 26( 1). - P. 74.

Публикации в сборниках статей, материалах конференций:

8. Shchepkin D.V. Effects of cardiac myosin binding protein-C on myocardium contractile activity assessed in an in vitro motility assay / D.V. Shchepkin, G.V. Kopylova, L.V. Nikitina. // Biological Motility: from Fundamental Achievements to Nanotechnologies: international symposium (Pushchino, May 11-15,2010). - Pushchino, 2010. - P. 237-239.

9. Nikitina L.V. pCa-Force relationship assessed in an in vitro motility assay for rabbit cardiac muscle / L.V. Nikitina, G.V. Kopylova, D.V. Shchepkin, L.B. Katsnelson // Biological Motility: Achievements and Perspectives: international symposium (Pushchino, May 11-15, 2008). - Pushchino, 2008. - P. 44-48.

10. Никитина JI.B. Связь «рСа-сила» миокарда кролика, полученная техникой in vitro подвижной системы / J1.B. Никитина, Г.В. Копылова, Д.В. Щепкин, Л.Б. Кацнельсон// Сборник тезисов докладов участников Международного конкурса научных работ молодых ученых в области нанотехнологий. - М., 2008. - С. 512-513.

11. Копылова Г.В. Определение соотношения а - и р- тяжелых цепей сердечного миозина в миокарде различных животных методом одномерного SDS гель-электрофореза / Г.В. Копылова, Д.В. Щепкин, Л.В. Никитина // Тезисы докладов XX съезда физиологического общества им. Павлова. - М., 2007. - С. 277.

12. Comparison of kinetic characteristics of musculoskeletal and cardiac myosins using the method of regulated contractile systems / G.V. Kopylova, L.V. Nikitina, L.B. Katsnelson, S.Yu.Bershitsky // Biol, motility: basic research and practice: international symposium (Pushchino, 11-15 May, 2006). - Pushchino, 2006. - P. 25-27.

Список сокращений

АТФ - аденозинтрифосфат

БСА - бычий сывороточный альбумин

ПААГ - полиакриламидный гель

ТМРФ - тетраметилродамии-фаллоидин

ТЦМ - тяжелые цени миозина

ЭГТА - этиленгликоль тетрауксусная кислота

F-актин - филаментарный актин

ТпС - тропонин С

с >

Подписано в печать 14.05.2011 Тираж 120 экз. Заказ № 515

Отпечатано с готовых файлов заказчика в ИП Звозников А.Н. Салон оперативной печати «Копирую. 620072, г. Екатеринбург, ул. Сыромолотова, 18/1

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Копылова, Галина Васильевна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 .Сократительные и регуляторные белки сердечной мышцы.

1.2. Кальциевая регуляция сокращений сердечной мышцы.

1.3. Исследование кальциевой регуляции сокращений сердечной мышцы методом искусственной подвижной системы.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Получение мышечных белков.

2.2. Оценка чистоты полученных белков с помощью гель электрофореза.

2.3. Определение концентрации белков.

2.4. Получение регулируемого тонкого филамента.

2.5. Определение АТФ-азной активности миозина.

2.6. Метод искусственной подвижной системы.

2.7. Метод искусственной подвижной системы с регулируемым тонким филаментом.

2.8. Статистическая обработка.

Глава 3. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИЗОФОРМ

СЕРДЕЧНОГО МИОЗИНА.

Глава 4. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА КАЛЬЦИЕВОЙ АКТИВАЦИИ ПРОЦЕССОВ ПРИКРЕПЛЕНИЯ И ОТКРЕПЛЕНИЯ ПОПЕРЕЧНЫХ

МОСТИКОВ ДЛЯ ИЗОФОРМ СЕРДЕЧНОГО МИОЗИНА.

Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование функциональных характеристик изоформ сердечного миозина"

Актуальность

Согласно данным ВОЗ, смертность от сердечно-сосудистых заболеваний занимает первое место в мире. Факторы, которые приводят к нарушению работы сердца, многочисленны, но все они, так или иначе, влияют на сократительную функцию кардиомиоцита. Изменение сократительной функции кардиомиоцита может происходить из-за нарушений состава белков сократительного аппарата или вследствие изменения процессов сопряжения возбуждения с сокращением.

Генерация силы в мышце осуществляется за счет энергии гидролиза АТФ поперечными мостиками, образованными головками миозиновых молекул, прикрепленными к нитям актина. В сердце млекопитающих имеется два типа тяжелых цепей миозина: а и (3 [101, 145]. Изоформа миозина VI является гомодимером а-тяжелых цепей, а изоформа миозина ,УЗ — гомодимером Р-тяжелых цепей. В миокарде предсердий а- и (3-тяжёлые цепи миозина вместе с лёгкими цепями атриального типа (АЬС1 и АЬС2) формируют два вида изомиозинов: А1(аа) и А2 (|3|3) [40]. По аминокислотной последовательности VI и УЗ изомиозины идентичны на 93 % [134]. Разница в аминокислотных последовательностях между а- и ^-тяжёлыми цепями сердечных миозинов в каталитическом и конверторном домене, а также в области рычага определяет различие их кинетических и механических свойств [134, 161].

Известно, что и в рамках одного интактного сердца в норме имеется заметное различие в экспрессии изоформ миозина VI и УЗ в кардиомиоцитах из разных слоев стенки желудочка [39, 68, 98, 104]. Существует также трансмуральное распределение изоформ сердечного миозина [68]. Субэпикард взрослого кролика содержит преимущественно а-изоформу, а субэндокард — (3-изоформу тяжелых цепей миозина.

Экспрессия этих изоформ миозинов зависит от вида животного, его возраста и гормонального статуса [143]. В сердцах мелких взрослых млекопитающих (мышь, крыса) преобладает VI изоформа, а в сердцах крупных млекопитающих, в том числе и в сердце человека - изоформа УЗ. Изменения в экспрессии этих изоформ происходят также при патологиях сердца. Так, при тяжелой гипертрофиии, вызванной перегрузкой давлением или объемом сердца, выявляется сдвиг от VI к УЗ изоформе [143, 184].

Изоформы сердечного миозина отличаются по своим гидролитическим и механическим характеристикам: изомиозин VI всех млекопитающих обладает в 2-3 раза большей АТФ-зной активностью [22, 38, 125, 168] и передвигает актиновый филамент со скоростью в 2-3 раза большей, чем изомиозин УЗ, а изомиозин УЗ у крупных млекопитающих в два раза сильнее, чем VI [38, 59, 125, 140, 168]. На уровне взаимодействия одиночных молекул миозина и актина методом оптической ловушки было обнаружено, что изомиозины VI и УЗ отличаются длительностью единичных перемещений нитей актина [114, 173].

Физиологическое значение разных изоформ миозина в сердце и сдвига их соотношения состоит в том, что они обеспечивают оптимизацию сократительной функции сердца в различных условиях его функционирования. В сердце взрослых мелких млекопитающих (мышь, крыса) преобладает быстрая изоформа миозина, так как благодаря высокому метаболизму сердце мелких грызунов бьётся с частотой 340-360 ударов в минуту, тогда как сердце человека - 70 ударов в минуту. Поэтому, чтобы оптимизировать циркуляцию крови, им необходимо иметь быстро сокращающиеся миозины с высокой силогенерирующей способностью [125, 134].

Левый желудочек сердца взрослого человека содержит около 7 % а-тяжелых цепей миозина [142] При ишемической и дилатационной кардиомиопатии а-изоформа не обнаруживается [104], что снижает сократимость, но повышает экономичность сокращения [14, 21]. Преимущественная экспрессия миозина с низкой АТФ-азной активностью при хронической перегрузке, несмотря на уменьшение сократимости, также увеличивает сократительную функцию миокарда [14]. С другой стороны, при гипертиреоидном состоянии замещение нормального миозина миозином с высокой АТФ-азной активностью является адаптацией для сердца, работающего в условиях возросшего энергетического обмена. Возросшее содержание быстрого миозина в сердце атлета также является адаптивным, так как увеличивает скорость выброса, для того, чтобы добиться большого значения ударного объема, необходимого при интенсивных тренировках.

В первой половине 90-х годов были обнаружены мутантные формы (3-цепи миозина (сейчас их известно более ста), приводящие к выраженным клиническим симптомам гипертрофической либо дилатационной кардиомиопатии, которые могут приводить к внезапной смерти. Мутации затрагивают структуру и функциональные свойства важнейших участков молекулы миозина: актин-связывающего центра, АТФ-связывающего центра и домена связывания лёгкиих цепей миозина. Это ведет к изменению кинетических и механических характеристик молекулы миозина и, как следствие, к изменению сократительных свойств кардиомиоцита [35].

Различие в соотношениях изоформ VI и УЗ в кардиомиоците [57] прежде всего, прямо проявляется в различных скоростных характеристиках развития напряжения: при преобладании быстрой изоформы VI напряжение в клетке сердечной мышцы развивается быстрее. Кроме того, очень важен тот вклад, который разные соотношения изомиозинов вносят в механическую функцию в миокарде не напрямую (т.е. не как силогенерирующие единицы), а через кооперативное влияние прикрепленных поперечных мостиков на сродство тропонина С к кальцию (через механизм мостико-тропониновой кооперативности) [31]. Это кооперативное взаимодействие регуляторных и сократительных белков является ключевым механизмом, объясняющим целый ряд феноменов биомеханики активного миокарда, связанных с влиянием механических условий сокращений на активацию сердечной мышцы [45]. Механизмы кооперативности в поперечнополосатых мышцах изучаются, в экспериментах на скицированных препаратах мышечных волокон по связям «рСа-сила».

Исследования на растворах мышечных белков, на кардиомиоцитах, а также на многоклеточных препаратах сердечной мышцы, использование искусственной подвижной системы и оптической ловушки позволило изучить ряд механических и гидролитических свойств изоформ сердечного миозина различных животных. Влияние изоформ сердечного миозина на кальциевую регуляцию сокращениий сердечной мышцы изучалось в экспериментах на скинированных кардиомиоцитах и препаратах сердечной мышцы [66, 74, 107, 159, 161, 180] с преимущественным содержанием определенной изоформы. В настоящем имеется только одна работа по изучению влияния изоформ сердечного миозина на кальциевую активацию сокращений сердечной мышцы методом искусственной подвижной системы [140]. Имеющаяся на сегодня информация о вкладе изоформ сердечного миозина в кальциевую регуляцию сокращения сердечной мышцы являются неполной и противоречивой.

Использование метода искусственной подвижной системы позволяет изучать непосредственно взаимодействие регуляторных и сократительных белков на уровне тонкого филамента, что дает возможность избежать артефактов, связанных с пассивными механическими свойствами целой мышцы, либо кардиомиоцита. Кроме того, этот метод позволяет исследовать как чистые изоформы миозина (VI и V3) по отдельности, так и их различные смеси, а также проводить исследования с нативными и с генетически модифицированными белками. В зависимости от конкретной задачи тонкий филамент можно реконструировать из различных изоформ регуляторных белков и актина, а также их мутантов. В рамках этого метода можно задавать различные концентрации свободного кальция и регистрировать связи «рСа-скорость», «рСа-сила», «сила-скорость» на уровне взаимодействующих белков.

Цель работы

Провести систематическое исследование функциональных характеристик изоформ сердечного миозина кролика и оценить их вклад в кальциевую регуляцию сокращений сердечной мышцы.

Задачи исследования

1. Исследовать функциональные свойства изоформ сердечного миозина кролика VI и V3, а именно: актин-активируемую М^ -АТФ-азную активность, силогенерирующие и кинетические характеристики.

2. В искусственной подвижной системе с регулируемым тонким филаментом исследовать зависимости «рСа-скорость», «рСа-сила» для изоформ сердечного миозина VI и V3.

3. Исследовать связь «сила-скорость» для изоформ сердечного миозина VI и V3 при насыщающей и ненасыщающей концентрациях кальция в растворе методом искусственной подвижной системы с регулируемым тонким филаментом.

4. Получить и проанализировать зависимость «сила-мощность» для изоформ сердечного миозина VI и УЗ при насыщающей и ненасыщающей концентрациях кальция в растворе.

Научная новизна

Впервые систематически исследованы функциональные характеристики изоформ VI и УЗ сердечного миозина кролика, используя метод искусственной подвижной системы. Получена и проанализирована связь «рСа-скорость» для изоформ сердечного миозина VI и УЗ. Показано, что кальциевая чувствительность и коэффициент Хилла зависимости «рСа-скорость» для изоформ VI и УЗ сердечного миозина не отличаются.

Впервые изучена связь «рСа-сила» для изоформ сердечного миозина VI и УЗ. Показано, что при низкой концентрации каждой из изоформ как коэффициент кооперативности, так и кальциевая чувствительность выше для УЗ, чем для VI, что может иметь адаптивное значение при патологиях, связанных со снижением концентрации миозина.

Научная и практическая значимость

Внедрение

Положения, выносимые на защиту

1. Значения коэффициента кооперативности Хилла зависимости «рСа-сила» для изоформ сердечного миозина VI и V3 в искусственной подвижной системе при высокой концентрации миозина не отличаются, кальциевая чувствительность выше для изоформы V3; при низкой концентрации каждой из изоформ как коэффициент кооперативности, так и кальциевая чувствительность выше для V3, чем для VI.

3. Максимум развиваемой мощности изоформы VI выше, чем изоформы V3 и сдвинут в сторону меньших нагрузок при насыщающей и ненасыщающей концентрациях кальция, что может иметь адаптивное значение для поддержания мощности на заданном уровне; мощность, развиваемая каждой из изоформ миозина, не зависит от концентрации свободного кальция во всем диапазоне нагрузок.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на международных конференциях «Biological motility: Basic research and practice» (r. Пущино, 2006 г.); «Biological motility: Achievements and Perspectives» (г. Пущино, 2008 г.); «Biological motility: from Fundamental Achievements to Nanotechnologies» (r. Пущино, 2010 г.); на Международном форуме по нанотехнологиям (г. Москва, 2008 г.); на XXXIV и XXXVI «European Muscle Congress» (г. Дебрецен, Венгрия, 2005 г.; Стокгольм, Швеция, 2007 г.); Joint British-Russian Young Scientists Workshop (Екатеринбург, 2007 г.). г

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК - 7 публикаций.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка цитируемой литературы (188 источников). Диссертация изложена на 151 странице, содержит 20 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Копылова, Галина Васильевна

ВЫВОДЫ

1. Актин-активируемая 1У^2+-АТФ-азная активность и скорость скольжения как Б-актина, так и регулируемого филамента для изоформы VI в 1,7 раза выше, чем для V3; сила, развиваемая сердечным изомиозином V3 кролика в 2 раза больше, чем изомиозином VI.

2. Коэффициент кооперативности Хилла зависимостей «рСа-скорость» и «рСа-сила» для изоформ сердечного миозина, а также кальциевая чувствительность связи «рСа-скорость» достоверно не отличаются; кальциевая чувствительность связи «рСа-сила» для изоформы V3 выше, чем для VI; при низкой концентрации каждой из изоформ и коэффициент кооперативности, и кальциевая чувствительность больше для V3, чем для VI.

4. Степень кривизны зависимости «сила-скорость», для изоформы V? выше, чем для изоформы VI; при уменьшении концентрации кальция разница в скоростях скольжения филаментов по изоформам VI и V3 увеличивается за счет большего снижения скорости по медленной изоформе.

Практические рекомендации

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Копылова, Галина Васильевна, Екатеринбург

1. Бэгшоу К. Мышечное сокращение: пер. с англ. / К. Бэгшоу. — М.: Мир, 1985.- 128 с.

2. Изаков В.Я. Биомеханика сердечной мышцы / В.Я. Изаков, Г.П. Иткин, B.C. Мархасин. М.: Наука, 1981.-326 с.

3. Исследование взаимодействия сократительных и регуляторных белков миокарда кролика методом искусственных подвижных систем / Л.В. Никитина, Г.В. Копылова, Д.В. Щепкин, Л.Б. Кацнельсон // Биохимия. -2008. Т. 73, №2. - С. 219-227.

4. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики / Э. Корниш-Боуден. М.: Мир, 1979. - 280 с.

5. Курганов Б. И. Аллостерические ферменты / Б.И. Курганов. М.: Наука, 1978.-248 с.

6. Оценка механической активности сердечных изомиозинов VI и V3 методом искусственных подвижных систем с регулируемой тонкой нитью / Л.В. Никитина, Г.В. Копылова, Д.В. Щепкин, Л.Б. Кацнельсон // Биофизика. 2008. - Т. 53, № 6. - С. 956-962.

7. Поглазов Б.Ф., Левицкий Д.И. Миозин и биологическая подвижность / Б.Ф. Поглазов, Д. И. Левицкий. М.: Наука, 1982. - 160 с.

8. Применение метода in vitro подвижных систем для исследования кальций-механической связи в скелетной и сердечной мышцах / Г.В. Копылова, Л.Б. Кацнельсон, Д.А. Овсянников, С.Ю. Бершицкий, Л.В. Никитина//Биофизика.-2006.-Т. 51, №5.-С. 781-785.

9. A new in vitro motility assay technique to evaluate calcium sensitivity of the cardiac contractile proteins / M. Sata, H. Yamashita, S. Sugiura, H. Fujita, S.

10. Momomura, T. Serizawa. // Pflugers Arch. 1995. - Vol. 429(3). - P. 443445.

11. Ali L.F. Push and pull of tropomyosin's opposite effects on myosin attachment to actin. A chimeric tropomyosin host-guest study / L.F. Ali, J.M. Cohen, L.S. Tobacman//Biochemistry. -2010. Vol. 49(51). - P. 10873-10880.

12. Allen T.S. Ca(2+)-dependence of structural changes in troponin-C in demembranated fibers of rabbit psoas muscle /T.S. Allen, L.D. Yates, A.M. Gordon // Biophys J. 1992. - Vol. 61(2). P. - 399-409.

13. Alpert N.R. in Perspectives in cardiovascular reseach (Alpert N.R. ed.) / N.R. Alpert, L.A. Mulieri. New York: Raven press, 1983. - Vol. 7. - P. 619-630.

14. Alpert N.R. Myocardial chemo-energy transduction / N.R. Alpert, L.A. Mulieri, G. Hasenfuss // The heart and cardiovascular system, 2nd ed. New York: Raven Press. - 1991.-P. 111-128.

15. Altered myosin isozyme patterns from pressure-overloaded and thyrotoxic hypertrophied rabbit hearts / R.Z. Litten, 3rd, B.J. Martin, R.B. Low, N.R. Alpert // Circ Res. 1982. - Vol. 50(6). - P. 856-864.

16. Altringham J.D. The pCa-tension and force-velocity characteristics of skinned fibres isolated from fish fast and slow muscles / J.D. Altringham, I.A. Johnston // J Physiol. 1982. - Vol. 333. - P. 421-449.ry |

17. Analysis of force-velocity relationship in cardiac muscle by means of mathematical modeling / L.B. Katsnelson, V.S. Markhasin, L.V. Nikitina, M.V. Ryvkin // Journal of Muscle Research and Cell Motility. 1997. - V.18, -P. 228.

18. Analysis of Myosin Heavy Chain Functionality in the Heart / M. Krenz, A. Sanbe, F. Bouyer-Dalloz, J. Gulick, R. Klevitsky, T. E. Hewett, H. E. Osinska,

19. J. N. Lorenz, C. Brosseau, Federico, N. R. Alpert, D. M. Warshaw, M. B. Perryman, S. M. Helmke, and J. Robbins // J Biol Chem. 2003. - Vol. 278. -P. 17466-17474.

20. Assessment of the effect of cardiac myosin binding protein-C on 'pCa-velocity' relationship obtained in an in vitro motility assay / D.V. Shchepkin, G.V. Kopylova, B.Y. Bershitsky, L.V. Nikitina // J Gen Phys. 2009. - Vol. 134 - la-2a.

21. Awan M.Z. Energetics of the development and maintenance of isometric tension by mammalian fast and slow muscles / M.Z. Awan, G.J. Goldspink // Mechanochem Cell Motil. 1972. - Vol. 1. - P. 97-108.

22. Banerjee S.K. Enzymatic properties of the heavy meromyosin subfragment of cardiac myosin from normal and thyrotoxic rabbits / S.K. Banerjee, E.G. Kabbas, E. Morkin // J Biol Chem. 1977. - Vol. 252(19). - P. 6925-6929.

23. Bottinelli R Force-velocity relations and myosin heavy chain isoform compositions of skinned fibres from rat skeletal muscle / R. Bottinelli, S. Schiaffino, C. Reggiani // J Physiol. 1991. - Vol. 437. - P. 655-672.

24. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Anal Biochem. 1976. - V. 7, №72. - P. 248-254.

25. Brandt P.W. The thin filament of vertebrate skeletal muscle co-operatively activates as a unit / P.W. Brandt, M.S. Diamond, F.H. Schachat // J Mol Biol. -1984.- 180(2).-P. 379-384.

26. Bremel R.D. Cooperation within actin filament in vertebrate skeletal muscle / R.D. Bremel, A. Weber // Nat New Biol. 1972. - Vol. 238(82). - P. 97-101.

27. Butters C.A. Cooperative effect of calcium binding to adjacent troponin molecules on the thin filament-myosin subfragment 1 MgATPase rate / C.A. Butters, J.B. Tobacman, L.S. Tobacman // J Biol Chem. 1997. - Vol. 272(20).-P. 13196-13202.

28. Ca -regulated structural changes in troponin / M.V. Vinogradova, D.B. Stone, G.G. Malanina, C. Karatzaferi, R. Cooke, R. A. Mendelson, and RJ. Fletterick // Proc Natl Acad Sci USA. 2005. - Vol. 102. - P. 5038-5043.

29. Ca2+ regulation of rabbit skeletal muscle thin filament sliding: role of cross-bridge number / B. Liang, Y. Chen, C.K Wang., Z. Luo., M. Regnier, A.M. Gordon, P.B. Chase // Biophys J. 2003. - Vol. 85. - P. 1775-1786.

30. Calcium regulation of skeletal muscle thin filament motility in vitro / A.M. Gordon, M.A. LaMadrid, Y. Chen, Z. Luo, P.B.Chase // Biophys J. 1997. -Vol. 72,3.-P. 1295-1307.

31. Calcium regulation of thin filament movement in an in vitro motility assay / E. Homsher, B. Kim, A. Bobkova, L.S. Tobacman // Biophys J. 1996. - Vol. 70, 4.-P. 1881-1892.

32. Cantino M.E. Subsarcomeric distribution of calcium in demembranated fibers of rabbit psoas muscle / M.E. Cantino, T.S. Allen, A.M. Gordon // Biophys J. -1993. Vol. 64(1). - P. 211-222.

33. Cardiac myosin binding protein-C modulates actomyosin binding and kinetics in the in vitro motility assay / W. Saber, KJ. Begin, D.M. Warshaw, P. VanBuren//J. Mol. Cell. Cardiol. 2008. - Vol. 44. - P. 1053-1061.

34. Cardiac myosin-binding protein C modulates the tuning of the molecular motor in the heart / Y.Lecarpentier, N. Vignier, P. Oliviero, A. Guellich, L. Carrier, C. Coiraulty // J. Biophys, 2008. Vol. 77. - P. 720-728.

35. Cardiac VI and V3 myosins differ in their hydrolytic and mechanical activities in vitro / P. VanBuren, D.E. Harris, R.A. Norman, D.M. Warshaw // Circ Res. 1995. - Vol. 77. - P. 439-444.

36. Carnes C. A. Age-dependent changes in contraction and regional myocardial myosin heavy chain isoform expression in rats / C. A. Carnes, T. P. Geisbuhler, and P. J. Reiser // J Appl Physiol. 2004. - Vol. 97. - P. 446-453.

37. Chizzonite R.A. Comparison of myosin heavy chains in atria and ventricles from hyperthyroid, hypothyroid, and euthyroid rabbits / R.A. Chizzonite, A.W. Everett, G. Prior, and R. Zak // J Biol Chem. 1984. - Vol. 259. - P. 1556415571.

38. Contractile activation properties of ventricular myocardium from hypothyroid, euthyroid and juvenile rats / L.M. Gibson, I.R. Wendt, D.G. Stephenson // Pflugers Arch. 1992. - Vol. 422(1). - P. 16-23.

39. Cooke R. The effects of ADP and phosphate on the contraction of muscle fibers / R. Cooke, E. Pate // Biophys J. 1985. - Vol. 48(5). - P. 789-798.

40. Cooperative binding to the Ca2+-specific sites of troponin C in regulated actin and actomyosin / Z. Grabarek, J. Grabarek, P.C. Leavis, J. Gergely // J Biol Chem. 1983.-Vol. 258, №23.-P. 14098-14102.

41. Co-operative interactions between troponin-tropomyosin units extend the length of the thin filament in skeletal muscle / P.W. Brandt, M.S. Diamond, J.S. Rutchik, F.H. Schachat // J Mol Biol. 1987. - Vol. 195(4). - P. 885-896.

42. Cross-bridge versus thin filament contributions to the level and rate of force development in cardiac muscle / M. Regnier, H. Martin, RJ. Barsotti, AJ. Rivera, D.A. Martyn, E. Clemmens // Biophys J. 2004. - Vol. 87(3). - P. 1815-1824.

43. Danzi S. Posttranscriptional regulation of myosin heavy chain expression in the heart by triiodothyronine / S. Danzi and I. Klein // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005. - Vol. 288. - P. 455-460.

44. De Clerck N.M. Force velocity relations of single cardiac muscle cells:icalcium dependency / N.M. De Clerck, V.A. Claes, D.L. Brutsaert // J Gen > Physiol. 1977. - Vol. 69(2). -P. 221-241.ry ■

45. Dillman W.H. Cardiac hypertrophy and thyroid hormone signaling rat / W.H. Dillman // Heart Fail Rev. 2010. - Vol. 15. - P. 125-132.

46. Dillman W.H. Diabetes mellitus induces changes in cardiac myosin of the rat / W.H. Dillman // Diabetes. 1980. - Vol. 29. - P. 579-582.

47. Distribution and Structure-Function Relationship of Myosin Heavy Chain Isoforms in the Adult Mouse Heart / M. Krenz, S. Sadayappan, H.E. Osinska, J. A. Henry, S. Beck, D.M. Warshaw, and Jeffrey Robbins // J Biol Chem. -2007. Vol. 282. - P. 24057-24064.

48. Distribution of myosin isozymes within single cardiac cells. An immunohistochemical study / J.L. Samuel, L. Rappoport, J.J. Mercadier, A.M. Lompre, S. Sartore, C. Triban, S. Schiaffino, K. Schwartz // Circ Res. 1983. -Vol. 52.-P. 200-209.

49. Donaldson S.K. Characterization of the effects of Mg21 on Ca21 and Sr21-activated tension generation of skinned skeletal muscle fibers / S.K. Donaldson, W.G. Kerrick // J. Gen. Physiol. 1975. - Vol. 66. - P. 427-444.

50. Dynamic interaction between cardiac myosin isoforms modifies velocity of actomyosin sliding in vitro / M. Sata, S. Sugiura, H. Yamashita, S. Momomura, T. Serizawa // Circ Res. 1993. - Vol. 73. - P. 696-704.

51. Edman K.A. Non-hyperbolic force-velocity relationship in single muscle fibres / K.A. Edman, L.A. Mulieri, B. Scubon-Mulieri // Acta Physiol Scand. 1976. -Vol. 98(2).-P. 143-156.

52. Edman KA. The velocity of unloaded shortening and its relation to sarcomere length and isometric force in vertebrate muscle fibres / K.A. Edman // J Physiol. 1979. - Vol. 291. - P. 143-59.

53. Edman, K.A.P. Relationships between force and velocity of shortening in rabbit papillary muscle / K.A. Edman, E. Nilsson // Acta Physiol. Scand. -1972. Vol. 85. - P. 488-500.

54. Effect of cross-bridge kinetics on apparent Ca2+ sensitivity / P.W. Brandt, R.N. Cox, M. Kawai, T. Robinson // J Gen Physiol. 1982. - Vol. 79(6). - P. 997-1016.

55. Effects of myosin heavy chain isoform switching on Ca2+-activated tension development in single adult cardiac myocytes / J.M. Metzger, P.A. Wahr, D.E. Michele, F. Albayya, M.V. Westfall // Circ Res. 1999. - Vol. 11.-P. 13101317.

56. Eichhorn EJ. Medical therapy can improve the biological properties of the chronically failing heart. A new era in the treatment of heart failure / E.J. Eichhorn, M.R. Bristow // Circulation. 1996. - Vol. 94(9). - P. 2285-2296.

57. Eisenberg E. A cross-bridge model of muscle contraction / E. Eisenberg, T.L. Hill // Prog Biophys Mol Biol. 1978. - Vol. 33(1). - P.55-82.

58. Eisenberg E. The adenosine triphosphatase activity of acto-heavy meromyosin. A kinetic analysis of actin activation / E. Eisenberg, C. Moos // Biochemistry.- 1968.-Vol. 7(4).-P. 1486-1489.

59. Fiber orientation in the canine left ventricle during diastole and systole / D.D. Streeter, H.M. Spotnitz, D.P. Patel, J. Ross, E.H. Sonnenblick // Circ Res. -1969. Vol. 24(3). - P. 339-347.

60. Fitzsimons D.P. Role of myosin heavy chain composition in kinetics of force development and relaxation in rat myocardium / D.P. Fitzsimons, J. R. Patel, and R. L. Moss // J Physiol. 1998. - Vol.513. - P. 171-183.

61. Fitzsimons, D.P. Aging dependent depression in the kinetics of force development in rat skinned myocardium / D.P. Fitzsimons, J.R. Patel, R.L. Moss//Am. J. Physiol. 1999.-Vol. 276.-P. 1511-1519.

62. Force regulation by Ca2+ in skinned single cardiac myocytes of frog / P.W. Brandt, F. Colomo, N. Piroddi, C. Poggesi, C. Tesi // Biophys J. 1998. - Vol. 74(4). -P. 1994-2004.

63. Force-velocity relations of rat cardiac myosin isozymes sliding on algal cell actin cables in vitro / S. Sugiura, H. Yamashita, M. Sata, S. Momomura, T.

64. Serizawa, K. Oiwa, S. Chaen, T. Shimmen, H. Sugi // Biochim Biophys Acta. -1995.-Vol. 1231(1).-P. 69-75.

65. Foth B.J. New insights into myosin evolution and classification / B.J. Foth, M.C. Goedecke, D. Soldati // Proc Natl Acad Sci USA.- 2006. Vol. 103(10).-P. 3681-3686.

66. Fraser I.D. In vitro motility analysis of actin-tropomyosin regulation by troponin and calcium / I.D. Fraser, S.B. Marston // J Biol Chem. 1995. - Vol. 270.-P. 7836-7841.

67. Fuchs F. Force, length, and Ca(2+)-troponin C affinity in skeletal muscle / F. Fuchs, Y.P. Wang // Am J Physiol. 1991. - Vol. 261(5 Pt 1). - P. 787-792.

68. Fuchs F. The binding of calcium to glycerinated muscle fibers in rigor. The effect of filament overlap / F. Fuchs // Biochim Biophys Acta, 1977. Vol. 491(2).-P. 523-531.

69. Funatsu T. Structural and functional reconstitution of thin filaments in skeletal muscle / T. Funatsu, T. Anazawa, S. Ishiwata // J Muscle Research and Cell Motility. 1994.-Vol.15.-P. 158-171.

70. Geeves M.A. Structural mechanism of muscle contraction / M.A. Geeves and K.C. Holmes // Annu. Rev. Biochem. 1999. - Vol. 68. - P. 687-728.

71. Giulian G.G. Improved methodology for analysis and quantitation of proteins on one-dimensional silver-stained slab gels / G.G. Giulian, R.L. Moss, M.Greaser // Anal Biochem. 1983. - Vol. 129, № 2. - P. 277-287.

72. Gordon A.M. Regulation of contraction in striated muscle / A.M. Gordon, E. Homsher, M. Regnier // Physiol Rev. 2000. - Vol. 80. - P. 853-924.

73. Gordon A.M. Skeletal and cardiac muscle contractile activation: tropomyosin "rocks and rolls" / A.M. Gordon, M. Regnier, E. Homsher // News Physiol Sci. -2001.-Vol. 16.-P. 49-55.

74. Gordon A.M.The variation in isometric tension with sarcomere length in vertebrate muscle fibres / A.M. Gordon, A.F. Huxley, F.J. Julian // J Physiol. -1966.-Vol. 184(1).-P. 170-192.

75. Gorga J.A. Activation of the calcium-regulated thin filament by myosin strong binding // J.A. Gorga, D.E. Fishbaugher, P. VanBuren // Biophys J. 2003. -Vol. 85(4).-P. 2484-2491.

76. Haeberle J.R. Are actin filaments moving under unloaded conditions in the in vitro motility assay? / J.R. Haeberle, M.E. Hemric // Biophys J. 1995. - Vol. 68(4 Suppl).- P. 306-310.

77. Harris D.E. Smooth and skeletal muscle myosin both exhibit low duty cycles at zero load in vitro / D.E. Harris, D.M. Warshaw //J Biol Chem. 1993. - Vol. 268(20).-P. 14764-14768.

78. Herron T.J. Loaded shortening and power output in cardiac myocytes are dependent on myosin heavy chain isoform expression / T.J. Herron, F.S. Korte,

79. K.S. McDonald // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2001. - Vol. 281(3). - P. 1217-1222.

80. Herron T.J. Small amounts of alpha-myosin heavy chain isoform expression significantly increase power output of rat cardiac myocyte fragments / T.J. Herron, K.S. McDonald//Circ Res.-2002.-Vol. 90(11).-P. 1150-1152.

81. Heterogeneity of myosin isozyme content of rabbit heart / R.Z. Litten, B.J. Martin, R.H. Buchthal, R. Nagai, R.B. Low, N.R. Alpert // Circ Res. 1985. -Vol. 57.-P. 406-414.

82. Hill A.V. The heat of shortening and the dynamic constants of muscle / A.V. Hill //Proc. R. Soc. London. Ser. B. 1938.-V. 126.-P. 136-195.

83. Hofmann P.A. Evidence for a force-dependent component of calcium binding to cardiac troponin C / P.A. Hofmann, F. Fuchs // Am J Physiol. 1987. - Vol. 253(4 Ptl).-P. 541-546.

84. Hoh J.F.Y. Electrophoretic analysis of multiple forms of rat cardiac myosin: effect of hypophysectomy and thyroxine replacement / J.F.Y. Hoh, P.A. McGrath, P. Hale // J of Mol and Cell Cardiol. 1977. - Vol. 10. - P. 10531076.

85. Homsher E. Factors affecting movement of F-actin filaments propelled by skeletal muscle heavy meromyosin / E. Homsher, F. Wang, J.R. Sellers // Am J Physiol. 1992. - Vol. 262. - P. 714-723.

86. Honda H. Calcium-triggered movement of regulated actin in vitro. A fluorescence microscopy study / H. Honda, S. Asakura // J Mol Biol. 1989. -Vol. 205(4).-P. 677-683.

87. Human cardiac myosin heavy chain isoforms in fetal and failing adult atria and ventricles / P.J. Reiser, M.A. Portman, X.H. Ning, C. Schomisch Moravec // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2001. - Vol. 280(4). - P. 1814-1820.

88. Huxley A.F. Muscle structure and theories of contraction / A.F. Huxley // Progress in Biophysics and Biophysical Chemistry. 1957. - Vol. 7. - P. 255318.

89. Huxley A.F. Proposed mechanism of force generation in striated muscle / A.F. Huxley, R.M. Simmons //Nature. 1971. - Vol. 233(5321). - P. 533-538.

90. Impact of beta-myosin heavy chain isoform expression on cross-bridge cycling kinetics / V.L. Rundell, V. Manaves, A.F. Martin, P.P. de Tombe // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005. - Vol. 288(2). - P. 896-903.

91. Janson L.W. Actin-binding proteins regulate the work performed by myosin II motors on single actin filament / L.W. Janson, J.R. Sellers, D.L. Taylor // Cell Motil Cytoskel. 1992. - Vol. 22. - P. 274-280.

92. Josephson R.K. Contraction dynamics and power output of skeletal muscle / R.K. Josephson // Annu Rev Physiol. 1993. - Vol. 55. - P. 527-546.

93. Julian F.J. The effect of calcium on the force-velocity relation of briefly glycerinated frog muscle fibres / F.J. Julian // J Physiol. 1971. - Vol. 218(1). -P. 117-145.

94. Katz A.M. Physiology of the heart / A.M. Katz. Lippincott: Williams & Wilkins, 2001.-718 p.

95. Kinetic differences at the single molecule level account for the functional diversity of rabbit cardiac myosin isoforms / K.A. Palmiter, M.J. Tyska, D.E. Dupius, N.R. Alpert, D.M. Warshaw // J Physiol. 1999. - Vol. 519. - P. 669678.

96. Kinetics of Cardiac Thin-Filament Activation Probed by Fluorescence Polarization of Rhodamine-Labeled Troponin C in Skinned Guinea Pig

97. Trabeculae / M.G. Bell, E.B. Lankford, G.E. Gonye, G.C.R. Ellis-Davies, D.A. Martyn, M. Regnier, and RJ. Barsotti // J Biophysic. 2006. - Vol. 90. - P. 531-543.

98. Kron S J. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface / S.J. Kron, J.A. Spudich // Proc Natl Acad Sci USA. 1986. - Vol. 83. - P. 6272-6276.

99. Krueger J.W. Myocardial sarcomere dynamics during isometric contraction / J.W. Krueger, G.H. Pollack // J Physiol. 1975. - Vol. 251(3). -P.627-643.

100. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. 1970. - Vol. 227, № 5259. -P. 680-685.

101. Lannergren J.The force-velocity relation of isolated twitch and slow muscle fibres of Xenopus laevis / J. Lannergren // J Physiol. 1978. - Vol. 283. - P. 501-521.

102. Left ventricular structure and function: basic science for cardiac imaging /P.P. Sengupta, J. Korinek, M. Belohlavek, J. Narula, M.A. Vannan, A. Jahangir, B.K. Khandheria // J Am Coll Cardiol. 2006. - Vol. 48(10). - P. 1988-2001.

103. Lehrer S.S. Dual effects of tropomyosin and troponin-tropomyosin on actomyosin subfragment 1 ATPase / S.S. Lehrer, E.P. Morris // J Biol Chem. -1982. Vol. 257(14). - P. 8073-8080.

104. Lu X. Temperature-dependence of isometric tension and cross-bridge kinetics of cardiac muscle fibers reconstituted with a tropomyosin internal deletion mutant / X. Lu, L.S. Tobacman, M. Kawai // Biophys J. 2006. - Vol. 91(11). -P. 4230-4240.

105. Machackova J. Molecular defects in cardiac myofibrillr proteins due to thyroid hormone imbalance and diabetes / J. Machackova, J. Barta, and N.S. Dhalla // Canj Physiol Pharmacol.-2005.-Vol. 83.-P. 1071-1091.

106. Malmqvist Ulf.P. Cardiac myosin isoforms from different species have unique enzymatic and mechanical properties / Ulf.P. Malmqvist, A. Aronsham, S. Lowey // Biochemistry. 2004. - Vol. 43. - P. 15058-15065.

107. Margossian S.S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle / S.S. Margossian, S. Lowey // Methods Enzymol. 1982. -Vol. 85.-P. 55-71.

108. Martyn D.A. Influence of Length on Force and Activation-Dependent Changes in Troponin C Structure in Skinned Cardiac and Fast Skeletal Muscle / D.A. Martyn and A.M. Gordon // J Biophys. 2001. - Vol. 80. - P. 2798-2808.

109. Mashanov G.I. Automatic detection of single fluorophores in live cells / G.I. Mashanov, J.E. Molloy // Biophys J. 2007. - Vol. 92(6). - P. 2199-2211.

110. McDonald K.S. Force-velocity and power-load curves in rat skinned cardiac myocytes /K.S. McDonald, M.R. Wolff, R.L. Moss // J Physiol. 1998. - Vol. 511 (Pt 2).-P. 519-531.

111. McKillop, D. F. Regulation of the interaction between actin and myosin subfragment 1: evidence for three states of the thin filament / D.F. McKillop, and M. A. Geeves // J Biophys. 1993. - Vol. 65. - P. 693-701.

112. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay / Y. Harada, K. Sakurada, T. Aoki, D.D. Thomas, T. Yanagida // J Mol Biol. 1990. - Vol. 216(1). - P. 49-68.

113. Metzger J.M. Effects of troponin C isoforms on pH sensitivity of contraction in mammalian fast and slow skeletal muscle fibres / J.M. Metzger // J Physiol. — 1996. Vol. 492 ( Pt 1). - P. 163-172.

114. Molecular mechanics of mouse cardiac myosin isoforms / N. R. Alpert, C. Brosseau, A. Federico, M. Krenz, J. Robbins, and D. M. Warshaw // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2002. - Vol.283. - P. 1446-1454.

115. Morris C.A. Modulation of thin filament activation using an inactivated cardiac troponin C in skinned skeletal muscle fibers / C.A. Morris, L.S. Tobacman, E. Homsher // Biophys J. 1998. - Vol. 74. - P. 173.

116. Moss R.L. Effects on shortening velocity of rabbit skeletal muscle due to variations in the level of thin-filament activation / R.L. Moss // J Physiol. -1986. Vol. 377. - P. 487-505.

117. Moss R.L. The effects of partial extraction of TnC upon the tension-pCa relationship in rabbit skinned skeletal muscle fibers / R.L. Moss, G.G. Giulian, M.L. Greaser // J Gen Physiol. 1985. - Vol. 86(4). - P. 585-600.

118. MRI myocardial motion and fiber tracking: a confirmation of knowledge from different imaging modalities / G.D. Buckberg, A. Mahajan, B. Jung, M. Markl, J. Hennig, M. Ballester-Rodes // Eur J Cardiothorac Surg. 2006. - Vol. 29 Suppl l.-P. 165-177.

119. Myosin heavy chain composition and the economy of contraction in healthy and diseased human myocardium / N.A. Narolska, S. Eiras, R.B. van Loon,

120. N.M. Boontje, R.S. Zaremba, S.R.Berg, W. Stooker, M.A. Huybregts, F.C. Visser, J. van der Velden, GJ. Stienen // J Muscle Res Cell Motil. 2005. -Vol. 26. -P.39-48.

121. Myosin heavy chain isoform expression in the failing and nonfailing human heart / S. Miyata, W. Minobe, M.R. Bristow, L.A. Leinwand // Circ Res. -2000. Vol. 86. - P. 386-390.

122. Myosin isoenzyme redistribution in chronic heart overload / A.M. Lompre, K. Schwaetz, A. d'Albis, G. Lacombe, N. van Thiem, B. Swynghedauw // Nature. 1979. - Vol. 282. - P. 105-107.

123. Myosin isozymic distribution correlates with speed of myocardial contraction / K. Schwartz, Y. Lecarpentier, J.L. Martin, A.M. Lompre, J.J. Mercadier, B. Swynghedauw//J Mol Cell Cardiol. 1981.-Vol. 13.-P. 1071-1075.

124. Myosin types and fiber types in cardiac muscle. I. Ventricular myocardium / S. Sartore, L. Gorza, S. Pierobon Bormioli, L. Dalla Libera, S. Schiaffino // J Cell Biol.-1981.-Vol. 88.-P. 226-233.

125. Noble M.I. Force-velocity relationship of cat cardiac muscle, studied by isotonic and quick-release techniques / M.I. Noble, T.E. Bowen, L.L. Hefner // Circulat. Res. 1969. - Vol. 20. - P. 112-123.

126. Pagani E.D. Rabbit papillary muscle myosin isozymes and the velocity of muscle shortening / E.D. Pagani, F.J. Julian // Circ Res. 1984. - Vol. 54(5). -P. 586-594.

127. Pardee J.D. Purification of muscle actin / J.D. Pardee, J.A. Spudich // Methods Enzymol. 1982. - Vol. 85. - P. 164-179.

128. Perry S.V. Vertebrate tropomyosin: distribution, properties and function / S.V. Perry // J Muscle Res Cell Motil. 2001. - Vol. 22. - P.45-49.

129. Podolsky R.J. The relation between calcium and contraction kinetics in skinned muscle fibres / RJ. Podolsky, L.E. Teichholz // J Physiol. 1970. - Vol. 211(1).-P. 19-35.

130. Pope B. The ATPase activities of rat cardiac myosin isoenzymes / B. Pope, J.F.Y. Hoh, A. Weeds // FEBS Lett. 1980. - Vol. 118. - P. 205-208.

131. Potter J.D. Preparation of troponin and its subunits / J.D. Potter // Methods Enzymol. 1982. - Vol. 85. - P. 241-263.

132. Power output is linearly related to MyHC content in rat skinned myocytes and isolated working hearts / F.S. Korte, T.J. Herron, M.J. Rovetto, K.S. McDonald // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005. - Vol. 289(2). - P. 801-812.

133. Pringle J.W. The Croonian Lecture, 1977. Stretch activation of muscle: function and mechanism / J.W. Pringle // Proc R Soc Lond B Biol Sci. 1978. -Vol. 201(1143).-P. 107-130.

134. Rao V.S. Phosphorylation of tropomyosin extends cooperative binding of myosin beyond a single regulatory unit / V.S. Rao, E.N. Marongelli, and W.H. Guilford // Cell Motil Cytoskeleton, 2009. Vol. 66(1). - P 10-23.

135. Regulated crosslinked actin filaments and the decoupling between their ATPase activity and sliding motility / H. Honda, N. Tagami, K. Hatori, K. Matsuno // J Biochem. 1997. - Vol. 121(1). - P. 47-49.

136. Regulation of force and unloaded sliding speed in single thin filaments: effects of regulatory proteins and calcium / E. Homsher, D.M. Lee, C. Morris, D. Pavlov, L.S. Tobacman // J Physiol. 2000. - Vol. 524 Pt 1. - P. 233-243.

137. Role of myosin heavy chain composition in the stretch activation response of rat myocardium / J.E. Stelzer, S.L. Brickson, M.R. Locher, R.L. Moss // J Physiol. -2007. Vol. 15 (579). - P. 161-73.

138. Schoenberg M. Effect of ionic strength on skinned rabbit psoas fibers in the presence of magnesium pyrophosphate / M. Schoenberg // Biophys J. 1991. -Vol. 60(3).-P. 690-696.

139. Shifts in the myosin heavy chain isozymes in the mouse heart result in increased energy efficiency / K. Hoyer, M. Krenz, J. Robbins, J.S. Ingwall // J Mol Cell Cardiol. 2007. - Vol. 42(1). - P. 214-221.

140. Single-Molecule Mechanics of R403Q Cardiac Myosin Isolated From the Mouse Model of Familial Hypertrophic Cardiomyopathy / MJ. Tyska, E. Hayes, M. Giewat, C.E. Seidman, J.G. Seidman, D.M. Warshaw // Circ. Res. -2000. Vol. 86. - P. 737-744.

141. Single-myosin crossbridge interactions with actin filaments regulated by troponin-tropomyosin / N.M. Kad, S.Kim, D.M. Warshaw, P. VanBuren, J.E.Baker // PNAS. 2005. - Vol. 102, №47. - P. 16990-16995.

142. Skeletal muscle regulatory proteins enhance F-actin in vitro motility / A.M. Gordon, Y. Chen, B . Liang, M. LaMadrid, Z. Luo, P.B. Chase // Adv Exp Med Biol. 1998. - Vol. 453. - P. 187-196.

143. Sliding velocity of isolated rabbit cardiac myosin correlates with isozyme distribution / H. Yamashita, S. Sugiura, T. Serizawa, T. Sugimoto, M. Iizuka, E. Katayama, T. Shimmen // Am J Physiol. 1992. - Vol. 263(2 Pt 2). - P. 464-472.

144. Smillie L.B. Preparation and identification of alpha- and beta-tropomyosins / L.B. Smillie // Methods Enzymol. 1982. - Vol. 85, №2. - P. 234-241.

145. Smooth, cardiac and skeletal muscle myosin force and motion generationassessed by cross-bridge mechanical interactions in vitro / D.E. Harris, S.S. Work, R.K. Wright, N.R. Alpert, D.M. Warshaw // J Muscle Res Cell Motil. -1994.-Vol. 15(1).-P. 11-19.

146. Stiffness of skinned rabbit psoas fibers in MgATP and MgPPi solution / B. Brenner, J.M. Chalovich, L.E. Greene, E. Eisenberg, M. Schoenberg // Biophys J. 1986. - Vol. 50(4). - P. 685-691.

147. Structural and functional reconstitution of thin filaments in the contractile apparatus of cardiac muscle / H. Fujita, K. Yasuda, S. Niitsu, T. Funatsu, and S. Ishiwata // J Biophys. -1996. Vol. 71. - P. 2307- 2318.

148. Structural studies of myosin : nucleotide complexes: A revised model for the molecular basis of muscle contraction / A.J. Fisher, C.A. Smith, J. Thoden, R. Smith, K. Sutoh, H.M. Holden, I. Rayment // Biophys. J. 1995. - V. 68. - P. 19-28.

149. Sugiura S. Functional characterization of cardiac myosin isoforms / S. Sugiura H. Yamashita // J Physiol (Japanese). 1998. - Vol. 48. - P. 173-179.

150. Systolic ventricular filling / F. Torrent-Guasp, M.J. Kocica, A. Corno, M. Komeda, J. Cox, A. Flotats, M. Ballester-Rodes, F. Carreras-Costa // Eur J Cardiothorac Surg. 2004. - Vol. 25(3). - P. 376-386.

151. Tahiliani A.G. Diabetes-induced abnormalities in the myocardium / A.G. Tahiliani, J.H. McNeill // Life Sci. 1986. - Vol. 38(11). -P. 959-974.

152. Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor / I. Rayment, W.R. Rypniewski, K. Schmidt-Base, R. Smith, D.R. Tomchick, M.M. Benning, D.A. Winkelmann, G Wesenberg and H.M. Holden // Science. -1993.-Vol. 261.-P. 50-58.

153. Tobacman L.S. Mechanism of regulation of cardiac actin-myosin subfragment 1 by troponin-tropomyosin / L.S. Tobacman, R.S. Adelstein // Biochemistry. -1986. Vol. 25(4). - P. 798-802.

154. Transmural dispersion of myofiber mechanics: implications for electrical heterogeneity in vivo / H. Ashikaga, B.A. Coppola, B. Hopenfeld, E.S. Leifer,

155. E.R. McVeigh, J.H. Omens // J Am Coll Cardiol. 2007. - Vol. 49(8). - P. 909-916.

156. Transmural mechanics at left ventricular epicardial pacing site / H. Ashikaga, J.H. Omens, N.B. Ingels., J.W. Covell // Am J Physiol Heart Circ Physiol. -2004. Vol. 286(6). - P. 2401-2407.

157. Transmural variation in myosin heavy chain isoform expression modulates the timing of myocardial force generation in porcine left ventricle / J.E. Stelzer, H.S. Norman, P.P. Chen, J.R. Patel and R.L. Moss // J Physiol. 2008. - Vol. 586.-P. 5203-5214.

158. Unloaded shortening of skinned muscle fibers from rabbit activated with and without Ca2+ / D.A. Martyn, P.B. Chase, J.D. Hannon, L.L. Huntsman, M.J. Kushmerick, A.M. Gordon // Biophys J. 1994. - Vol. 67(5). - P. 1984-1993.

159. VanBuren P. Enhanced force generation by smooth muscle myosin in vitro / P. VanBuren, S.S. Work, D.M.Warshaw // Proc Natl Acad Sci USA.- 1994. -vol. 91(1).-P. 202-205.

160. Woledge R.C. Energetic aspects of muscle contraction / R.C. Woledge, N.A. Curtin, E. Homsher. London: Academic Press. - 1985. — P. 8-212.

161. Woledge R.C. The energetics of tortoise muscle / R.C. Woledge // J Physiol. — 1968. Vol. 197(3). - P. 685-707.

Информация о работе

Копылова, Галина Васильевна
кандидата биологических наук
Екатеринбург, 2011
ВАК 03.03.01

Диссертация

Исследование функциональных характеристик изоформ сердечного миозина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно