Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование флуоресценции хлорофилла высших растений IN VIVI и зондов-красителей в суспензии хлоропластов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование флуоресценции хлорофилла высших растений IN VIVI и зондов-красителей в суспензии хлоропластов"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ля имени М. В. ЛОМОНОСОВА

J i I

Физический факультет

На правах рукописи КУЗНЕЦОВА Екатерина Александровна

ИССЛЕДОВАНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ХЛОРОФИЛЛА ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ IN VIVO И ЗОНДОВ-КРАСИТЕЛЕЙ В СУСПЕНЗИИ ХЛОРОПЛАСТОВ

Специальность 03.00.02 — биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва —

1996

Работа выполнена в Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова па кафедре биофизики физического факультета.

Научные руководители: доктор химических наук,

профессор Л. А. Блюменфельд;

доктор физико-математических наук, профессор А. К. Кукушки»

Официальные оппоненты: доктор физико-математических

наук, В. А. Караваев; доктор физико-математических паук,, профессор Э. К. Рууге

Ведущая организация —Институт химической физики РАН

Защита состоится « 6» .июня.. 1996 г. в

16.00 часов на заседании диссертационного совета К 053.05.77

в МГУ им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899 ГСП, Москва,

Лешинокие горы, МГУ, физический факультет, аудитория СФА.

С диссертацией 'можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ.

Автореферат разослан «30» О-И/Э&ЛЗС . 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета К. 053.05.77 кандидат физико-математических паук О. А. Котелышкоиа

Под», к печ. 23.04.96 г. Объем 1 п. л Зак. 178 Тир. 100

Типография Московского государственного ушшерситета леса

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Выяснение механизмов фотосинтеза является одним из основных вопросов современной биофизики и имеет большое научное и практическое значение. НажнешНую роль п фотосинтезе играют фотофнзическис процессы, происходящие в мембранах хлоронластов листьев и стеблей растений при поглощении свега. Эти процессы сопровождаются флуоресценцией, изучение которой является весьма информативным для понимания световых стадии фотосинтеза, что доказано результатами известных из литературы исследований флуоресценцжл Поэтому дальнейшее изучение флуоресцентных характеристик листьев растений, в частности, кинетиче1 ских и температурных зависимостей флуоресценции и послесвечения, является весьма актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью работы является исследование кинетических и температурных зависимостей флуоресценции и послесвечения хлорофилла, высших растений in vivo и флуоресценции зйндов-крясителей в суспензии хлоронластов..

В связи с этим решались следующие задачи:

— создание установки для одновременного исследования флуоресценции и послесвечения листьев и хлоропласто-з при температуре 20-96°С, / • '

- проведение одновременного исследования кинетики флуоресценции и послесвечения листьев, '

- изучение температурных и кинетических 'зависимостей флуоресценции листьев покрыто- и голосеменных растеши! на разных стадиях развития и в различных условиях,

- исследование спектров флуоресценции и возбуждения листьев после нагрева и без него,

- сравнительное исследование листьев и стеблей растений ра-диоснекгросконическим и люминесцентными методами,

- сравнительное исследование фотоиндуцированного тушения флуоресценции зондов-красителей 9-амипоакридина. и атсбрина в суспензии хлоропластов

Работа выполнена но плану иаучно-исслеловатсльских работ кафедры биофь.'мки физического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова но теме "Выяснение механизмов биЬкагализа и "виутрикле-¡ичиых превращений энергии на молекулярном уровне" (номер государственной регистрации 72017837).

Научная новизна работы:

1. Создана высокочувствительная установка, в которой сигналы флуоресценции и послесвечения разделены в электронном канале регистрирующей системы, что позволило измерять каждый из этих сигналов и отношение их квинтовых выходов.

2. Установлено, что термограммы флуоресценции листьев разных растений при различных условиях имеют один из трех типов и постепенно переходит от одного типа термограмм к другому по мере созревания растения, смены сезона и изменения условий выращивания. .

3. Обнаружено, что при фиксированной температура п области 52-72°С кинетическая зависимость флуоресценции повторяет оставшуюся часть термограммы. * (

4. Установлено, что после нескольких измерений на одном листе кинетичес.сис зависимости флуоресценции и послесвечения не изменяются при последующих измерениях с одним и jcm же темповым промежутком, причем интенсивности переменной флуоресценции и послесвечения в этом "аабилизироилниом" состоя/гни являют-гя пропорциональными времени темповой адаптации.

5. Показано, что предварительный нагрев наиболее сильно изменяет спектры возбуждения у молодых листьев.

6. Обнаружен новый пффект, состоящий в ослаблении с течением времени фотоинлуцированного тушения флуоресценции зонда атебрнпа в суспензии хлоропластов бобов при температуре 24-34°С; этот эффект отсутствует у зонда 9-амнноагрнлнна.

7. Установлена аналогичность спектров ЭПР, кинетики фото-индуцированных изменений сигнала ЭПР1, кривых- медленной индукции флуоресценции и термолюмннсспспцни стеблей растения соответствующим зависимостям для его листьев.

Научная и практическая ценность. Получены новые экспериментальные данные по флуоресценции хлорофилла'высших расти-' пий in vivo и зондов-красителей в суспензии хлоропластов, которые имеют существенное-научное и практическое значение.для исследования биофизических процессов фотосинтеза. Полученные результаты являются полезными для сопоставления с данными математических моделей этих процессов. ,

Апробация работы. Основные результаты диссертации были доложены и обсуждены на VI Всесоюзной конференции по фотоэнергетике растений (Львов, 1980), Всесоюзном симпозиуме "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Черноголовка, 1981X Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение" (Рига, 1981), Всесоюзном семинаре "Современные проблемы биофизики. Молекулярные аспекты фотосинтеза" (Пущино, 1981), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Всесоюзной конференции "Проблемы фотоэнергетики растений и повышение урожайности" (Львов, 1984), Всесоюзной конференции "Изменчивость пигментного аппарата и направленность первичных процессов фотосинтеза в зависимости от факторов среды" (Чернигов, 1985), семинаре но фотосинтезу расте-•шш в Высшем лесотехническом институте (София, 1989), конференции по. биофизическим проблемам фотосинтеза (София, 1990), VIII Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине" .('Звенигород - Черноголовка, 1990), а также научно-технических конференциях Московского государственного университета леса (ранее Московского лесотехнического института) (19811995). "

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 научных

работ

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, нити глав, заключения, выводов и списка литературы из 290 наименований. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, из \va\99 страниц основного текста,S"/ страниц с 5'1 рисунками и 3 таблицами, страниц со списком литературы

и ^ страниц с титульным листом, оглавлением и списком сокращений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В нерпой глапе приведен обзор литературы по флуориметриче-скнм установкам и исследованию, флуоресценции и послесвечения хлорофи лла высших растений при комнатной и повышенных температурах (п. !.], 1.2), по исследованию спектров флуоресценции хлорофилла в листьях и хлороггластах (п. 1.3), а также флуоресценции зондов-красителей в суспензии хлоропластов (п. 1.4).

Во второй главе дано описание экспериментальной установки, созданной для изучения флуоресценции и послесвечения биологических объектов, а также представлены объекты и методики исследований. В п. 2.1 рассмотрены системы созданной трехлучевой флуо-риметрическон установки с фосфороскопом и секторным диском для Модуляции возбуждающего света с частотой 2,4 кГц. Импульсы действующего света (ДС) с интенсивностью 10-100 Вг/'м2 и частотой 40-80 Гц вызывают изменение состояния объекта! В промежутках между ними при слабом возбуждающем ■ свете. (ВС) с интенсивностью 0,01 Вт/м2 регистрируются сигналы флуорс.-иенцин и послесвечения. В установке предложен и реализоврн способ разделения этих сигналов в электронном канале регистрирующей системы, позволивший с помощью разностного блока при одном фотоэлектронном умножителе одновременно регистрировать фотоиндуциро-панную флуоресценцию и послесвечение, а ¡пкже измерять отношение квантовых выходов их лучей, доли составляющих люминесген-цни и- кинетику этого отношения и долей. Тер.гостлбилнзирукнЦая

о

система обеспечивала возможность измерения этих сигналов в зависимости от температуры и времени, причем температуру объекта можно было менять в пределах 20-96°С с постоянной скоростью или стабилизировать с погрешностью 0,1°С. В н. 2.1.4 получены соотношения, позволяющие находить по ординатам экспериментальных кинетических кривых отношение квантовых выходов флуоресценции и послесвечения, а также доли составляющих люминесценции.

В п. 2.2. проведен анализ параметров установки, па основании которого бы ш выполнены условия, обеспечивающие наибольшее отношение сигнала флуоресценции к шуму: В итоге были достигнуты высокая чувствительность установки, стабильность параметров и хорошая воспроизводимость результатов. Установка позволяла измерять сигнал флуоресценции зонда'атебрина (или 9-аминоакридина), введенного с концентрацией Ю-6 М в суспензию хлоропластов, при отношении сигнала к шуму, равном 30-40.

В п. 2.3 даны методики исследований, выполненных ра-диоспсктросконическим и люминесцентными методами па других установках. В п. 2.4 перечислены объекты исследования. Это были листья и стебли различных покрыто- и голосеменных растений (клена, липы, боба, сосны, ели, кедра и др.) на разных стадиях развития и в разные сезоны года. Также были исследованы изолированные хлоропласты бобов.

В третьей главе приведены результаты сравнительного'иссле-■ довании фотоиндуцированного тушения флуоресценции зондов 9-аминоакридина (9-АА) и атебрина (Ат) в суспензии хлоропластов бобов па созданной установке. В и. 3.1 представлены полученные значения относительного тушения флуоресценции этих зондов

J

ДБ/То мод влиянием сильного ДС в зависимости от рН среды инкубации хлоропластоп (рН=5,5-9,5) с добавлением субстратов фосфо-рнлиропания (АДФ и фосфата) и без них при комн.тной температуре.

В п. 3.2 даны результаты исследования влияния ионного состава среды инкубации хлорочластов (при введении солей ЛтаС1 и МяС12) и разобщителя фосфорилирования N1^0 на фотоипдуцнро-ваниое тушение флуоресценции зондов 9-АА и Ат. С увеличением концентрации №С1 до 150 мМ или МдС12 до .10 мМ относительное тушение флуоресценции обоих зондов ЛР/Т0 возрастало, а при дальнейшем увеличении концентрации соли оно практически не изменялось. При увеличении концентрации МН4С1 в среде, а также при добавлении АДФ и фосфата относительное тушение флуоресценции зондов под влиянием ДС уменьшалось.

Анализ полученных зависимостей, приведенных в п. 3.1 и 3.2, показал, что зонд 9-АА меньше связывается с тилакондной мембраной ио сравнению с Ат. Поэтому зонд 9-АА более подходит для из-мерешп ДрН в мембранах хлоропластов, а зонд Ат целесообразно применять для исследования структурного состояния мембран.

В и. 3.3 представлены результаты исследования влияния температуры на фотоиндунированное тушение флуоресценции зондов 9-АА и Ат в суспензии хлороиластов бобов в физиологической области температур Оказалось, что тушение флуоресценции этих зондов с ростом температуры слабо уменьшается в области 10-24°С и сильно снижается после 24°С до полного нзчезновения при 34°С (рис. 1). Вместе с тем были обнаружены отличия в кинетике фотоиндуцрро1 ванного тушения флуоресценции 9-АА и Ат в области 24-34°С. При

этих температурах только для Ат наблюдали уменьшение с течением времени тушения флуоресценции при включенном ДС (рис. 1). Этот аффект у Ат, отсутствующий у 9-АА, связан, возможно, с изменением состояния мембран хлоронластов с течением времени при совместном действии мощного освещения и температуры в области 24-34°С. ,

Чсчпсртая глава посвящена люминесцентным и радиоспектро-скоиическим исследованиям лнегьев, стеблей и изолированных хлороиластов. В н. 4.1.1 приведены кинетические кривые переменной флуоресценции (ФП) и одновременного послесвечения (ПС) одного и того же листа боба, полученные в серии из 28 измерений (рис. 2). Измерения 1-21 следовали через 3-минутный промежуток темповой адаптации, а в измерениях 22-28* время темповой адаптации увеличивали до 4-15 мин. .

Во всех измерениях кинетические кривые ПС были .подобны кривым ФП. В каждом последующем измерении с 1-го до 8-го кинетические кривые ФП и ПС понижались, с 8-го измерения эти кривые не менялись (с погрешностью 1-3,7%), т.е. лист достигал "стабилизированного" состоянии. При дальнейших измерениях при таком состоянии листа обнаружено, что для экстремальных точек, значения интенсивиостей ФП и ПС оказались пропорциональными времени темповой адаптации в области 3-6 мин. для ФП и 3-15 мин для ПС.. • .

По полученным кривым ФП и ПС листа были рассчитаны кинетические зависимости отношения их квантовых выходов, а также долей составляющих люминесценции. Для "стабилизированного" состояния листа в наших экспериментальных условиях отношение.

и

Рис. 1. Фотоиндуцированное тушение флуоресценции зонда Ат (Я 10 *М) в суспензии хлоропластов бобов при различных температурах: 1 - 18,5; 2- 23,3; 3 - 26,6; 4 - 28,6; 5 - 30,6; 6 - 3'!°С

Рис. 2. Кинетические кривые флуоресценции (а) и одновременного послесвечения (б) листа боба в серии последовательных измерений (с 1 по 28) со следующими промежутками темповой адаптации: 1-21 - 3 мин, 24-5 мин, 28 - 15мин

квантовых выходов ФП/ПС изменялось со временем в пределах 0,6-0,9.

В п. 4.1.2 обсуждаются причины подобия кииетпк Ф11 (медленной стадии) и ПС (миллнеекундных и более продолжительных компонент). Этим кинетическим зависимостям оказалась подобной также и кинетика разности концентрации Р700+ при свете с /.=707 им (возбуждающем Преимущественно ФС1) и при белом свете (возбуждающем обе ФС), что свидетельствует о взаимосвязи Процессов в ФС1 и ФС2.

В п. 4.2 изложены результаты сравнительных исследований биофизических характеристик листьев и стеблей различных растении методами электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), медленной индукции флуоресценции (МИФ) и термолюмпнесцепции "(ТЛ). Спектры ЭПР, кинетика .фотоиндуцированных изменений сигнала ЭГ1Р1, кривые МИФ и ТЛ стеблей были апалотчны соответствующим зависимостям для листьев, что свидетельствует об одинаковом характере'функционирования цени электронного транспорта и реакционных центров в хлоропластах листьев и стеблей.

В пятой главе приведены результаты исследования флуоресценции хлорофилла in vivo при повышенных температурах. В п.. 5.1.1 приведены термограммы флуоресценции (ТГФ, т.е. зависимости интенсивности флуоресценции листьев Ftí от температуры при нагреве с достоянной скоростью), полученные на созданной установке в области 20-96°С для листьев 12 видов растений (боб, клеи, липа, сосна, ель, кедр и др.) на разных стадиях развития. ТГФ листьев получали при слабом возбуждающем свете (0,01 Вт/м2) н скорости нагрева -2 град/мин. Часть полученных ТГФ представлена на рис.

.4 (а, 6) и 4 (кривая I). Усиление аппаратуры выбирали таким, чтобы при начальной температуре 20-25°С величина получаемого сигнала Р0 для ратных объектов была нормирована на одно и то же значение, равное 1.

Установлено, что ТГФ листьев различных растений па разных стадиях развития принадлежат одному из трех типов. Термограммы первого типа имеют один максимум интенсивности флуоресценции в области температур К0-7.5°С и "плечо" при л1-.58°С; второго - два максимума, при 51-58°С и Г>0-7.Г>°С; третьего - одни максимум при 51-58°С. Для листьев покрыто- и голосеменных растений по мерс со-, зревання ТГФ постепенно переходят от первого типа дня зачаточных листьев (например, дтя боба кривые 1, 2 па рис. За) ко второму типу для молодых листьев (кривая 3) и к третьему' типу для зрелых листьев (кривые -1, о).

Для зрелых листьев голосеменных растений, пробуждающихся после зимнего покоя, происходят такие же переходы ТГФ: от первого типа зимой (например, для сосны кривая 1 на рис. 36) ко второму типу нос пой (например, для ели кривая 2) ;г к третье.чу типу к летне-осенний период (для сосны кривая 3). У зрелых листьев сосны зимой ТГФ от 1-го типа (кривая 1 па рис. 36) переходила ко 2-му типу после выдержки ветки при комнатной температуре в течение 3(> часов (кривая 4).

У листьев разных растений с. ТГФ 1-го типа интенсивность флуоресценции при 80-9б°С превышает значение Р0 при 20-2.5°С в 1,0-5 раз. С переходом ТГФ ко второму типу и к третьему интенсивность при 80-96°С уменьшается до значения (0.3-4) Р0. У зретых

Р,

6

отн.ед.

30 50 70 90 Т. »С

Рис. 3. Термограммы флуоресценции листьев:

а/ листья боба на разных стадиях развития: 1 - зачаточный

лист длиной 5 мм; 2 - зачаточный, 6 мм; 3 - молодой, • 6 мм; 4 - зрелый, 34 мм; 5 - зрелый, 61 мм; 6 - хлоро-

пласты зрелых листьев боба, , б/ зрелые листья сосны и ели .в разные сезоны года: 1 -сосна, январь; 2 - ель, март; 3 - сосна, август; 4 -сосна после выдержки при комнатной температуре в течение 36 часов, январь; 5 - сосна из теплицы, январь

30 50 70 90 Т.®С

Рис. 4. Термограмма флу-оресценци (1) и кинетические кривые флуоресценции при фиксированных температурах (2,3,4) для зачаточных листьев липы в мае:

1 - Т=25-96°С,

2 - 52,2°С,

3 - 50°С,

4 - 58,8°С

листьск сосны, выращенной и теплице, ТГФ, снятая зимой, была 3-го тина так же, как для листьев в августе у сосны, выращенной в обычных условиях. Но значения флуоресценции листьев тепличной сосны в максимуме (при 5(>°С) и при температуре 80 96°С были ниже, че>| у обычно)) сосны и 1,5 н 4 раза соответственно (см. крины с 1, 5 па рис. 36).

В п. 5.1,2 предложено представлять ТГФ каждого типа в виде суммы трех компонент: 1 - с максимумом интенсивности при 51-58°С; комнонета На начинается при 57-60°С п резко возрастает с увеличением температуры до 65°С, приводя к высокотемпературному максимуму в ТГФ 1-го и 2-го типов; компонента Пб проявляется в области 70-96°С. С помощью светофильтров было установлено, что с возрастанием температуры, нанимая от температуры появления компоненты На, увеличивается коротковолновая доля флуоресценции листа (см. п. 5.5.3).

В п. 5.& представлены данные о влиянии различных факторов на ТГФ листьев. В п. 5.2.1 показано, что молодые листья боба, выращенного при дефиците освещения, имели ТГФ 1-го типа, но без "плеча" при температуре 47-.55°С, вместо которого была ночги НО; стояниая и низкая интенсивность. После 60°С ТГФ молодых листьев не зависели от того, каким было осш щение при выращивании. Вероятно, у молодых листьев, выращенных при очень слабом освещении, и у зачаточных листьев сначала формируется ФС1. Затем но мере созревания илч освещения растения формируется ФС2, и на ТГФ образуется максимум интенсивности при -5ГС.

В и. 5.2.2 приведены и обсуждаются результаты исследования влияния интенсивности ВС в пределах 0,01-1,5 Вт/м2 па вид ТГФ

1(1

зрелых листьев боба. В п. 5.2.3 сравниваются ТГФ молодых листьев клена н липы, прижатых но время измерения к медной подложке ячейки термостата, с ТГФ таких же листьев, изолированных от подложки тонкой, химически нейтральной ■ пленкой. Контакт листьев с медной под южкой, н отличие от инертной, приводил к резкому уменьшению интенсивности флуоресценции при температуре выше (>5°С. Эго, возможно, вызвано проникновением атомов меди в клетки листа через слой расплавленных лпнпдов и замещением магния в ниррольном ; <>л1,це молекулы хлорофилла.

И п. 5 3 представлены температурные зависимости индукции флуоресценции и послесвечения, полученные па созданной установке для листьев клена п гли. При получении ТГФ по мере роста температуры многократно включали ДС па время 3-10 с, в течение которого одновременно измеряли максимальные значения' индукции флуоресценции и послесвечения в виде пиков нптепсивностсй па ТГФ. С ростом температуры до 50°С величины .этих пиков уменьшались до 0 как'для индукции флуоресценции, так и для. послесвечения. В области 50-С>0сС при включении ДС интенсивность флуоресценции резко уменьшалась, образуя узкие впадины на ТГФ, а послесвечение отсутствовало. При температуре более 60°С ДС не оказывал влияния на вид ТГФ.

В п. 5.4 приведены полученные зависимости флуоресценции, листьев от времени (кинетика, флуоресценции) при фиксированных повышенных температурах. Сначала записывали ТГФ листа до определенной температуры в области 52-77°С, после чего эту температуру фиксировали и записывали кинетику флуоресценции при такой и-мпер.пуро (кривые 2, 3, 4 на рис. 4). Полученная кинетика

флуоресценции сравнива'лап, с ТГФ такого же листа, записанной г. области 25-964' (кривая 1 на рис. 4). Кинетические аависимости 1|>луоресценпни разных листьев при фиксированной повышенной температуре оказались подобными их ТГФ, причем время досжжении экстремальных точек для голосеменных растении было почти таким же, а для покрытосеменных шачитсльно большим, чем на ТГФ (например, для липы см. рис. 4).

И и. 5 5 рассмотрены спектры флуоресценции и сиекгры возбуждения флуоресценции лисп,ев разных растений, по.тученпге при комнатной температуре на снектрофлуориметре српрмы 1 {¡гас 1т1 с предварительным нагревом листьев до 56-96°С или без на! рева. Как показано в 5.5.1, в спектрах флуоресценции листьев покрыто- и голосеменных растений, имеющих ТГФ .'5-го типа, без предварите лы.11-го нагрева наблюдаются дна максимума интенсивное'!и (ее спектральной плотности) при >.ф,=681-687 и 733-737 им. У листьев, имеющих ТГФ 2-ю тина, наблюдается 1-й из этих, максимумов. Предварительный нагрев листьев до 56-96°С приводит к увеличению интенсивности (|у'Уоресцениии листьев с ТГФ 2-го и 3-го тпичв при <690-700 нм. При Х(|„>Г)90 им после нагрева интенсивное и> флуоресценции листьев с ТГФ 2-го типа увеличивается, а с ТГФ 3-го тина .уменьшается. Это соответствует увеличению и;.ими нвносги (интегральной величины) на ТГФ 2-го типа пли уменьшению на ТГФ 3-го тина с ростом температуры.

13 п. 5.5.2 представлены спектры возбуждения листьев клена, лины и ели, у которых без предварительного шнреиа в этих спектрах наблюдается три максимума интенсивности флуоресценции при >.„=470, 480-483 и 609-620 нм, причем у молодых листьев ннтепепв-

пость флуоресценции иыше, чем у зрелых. Предварительный нагрев молодых листьев покрыто- и голосеменных растений (с ТГФ 2-го типа) приводит к появлению в их спектрах возбуждения новых трех максимумов при >.„=414-422, 514-515 и 542-543 им и к увеличению интенсивности в большей части спектра. Например, у листа ели весной после предварительного нагрева до 96°С интенсивность флуоресценции при Хп=422 и 609 им увеличилась в 3-4 раза. У. зрелых листьев влияние предварительного нагрева'на спектры возбуждения выражено слабее и * водится к уменьшению интенсивности флуоресценции.

В 11. 5:5.3 приведены результаты исследования доли интенсивности флуоресценции листьев в трех интервалах Хфт, полученные при снятии ТГФ с использованием светофильтров на линии регистрируемою излучения. При комнатной температуре длинноволновая доля флуоресценции (при Лфл>703 им) увеличивалась с увеличением размеров листьев, а также при переходе от этиолированного листа к листьям, выращенным при нормальном освещении. Эта длинноволновая доля уменьшалась с ростом температуры.

В и. 5.5.4 показано, что спектры поглощения и флуоресценции растворов экстрагированных пигментов практически не зависят от стадии развития листа и его предварительного нагрева до 65-70°С. Это, по-видимому, свидетельствует о неразрушении молекул хлорофилла в листьях при их нагреве до этих температур.

В заключении отмечено, что в диссертационной работе получены новые экспериментальные данные но флуоресценции хлорофилла высших растений in vivo и зондов-красителей в суспензии хлоро-нл.чегон, которые имеют существенное значение для исследования

биофизических процессов фотосинтеза. Результаты работы являются достоверными, гак как были получены на высокочувствительных установках и хорошо воспроизводились при многократном повторении.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Создана высокочувствительная флуорнметрическая установка, позволяющая разделят!, и одновременно регистрировать сигналы флуоресцеици;: и послесвечения листьев и суспензий хлоропллстов при температуре 20-9б°С, а также измерять отношение квантовых выходов этих сигналов.

2. Установлено, что термограммы флуоресценции листьев различных растений на разных стадиях развития принадлежат одному из трех типов. Термограммы первого типа характеризуются одним максимумом флуоресценции при 60-75°С и "плечом" при 31-58°С; второго типа - двумя максимумами при этих же температурах; третьего типа - одним максимумом при 51-58°С. Термограммы флуоресценции постепенно переходят от. первого типа ко второму н третьему для покрыто- и голосеменных растений но мере созревания листьев от зачаточных к молодым и к зрелым; а также для прелых льпьев голосеменных растений, пробуждающихся после зимнего покоя.

3. Показано, что молодые листья боба, выращенного при дефиците освещения, имеют термограмму флуоресценции 1-го тина, но без четко выраженною "плеча". Обнаружено, что контакт молодых листьев с медной подложкой, в отличие от инертной, приводит к

•

резкому уменьшению интенсивности флуоресценции при температуре выш-' 65"С.

4. Получены зависимости флуоресценции разных листьев от времени при фиксированной температуре в области 52-77°С, которые оказались подобными их термограммам флуоресценции, причем время достижения экстремальных точек для голосеменных растений было таким же, а для покрытосеменных значительно большим, чем на термограммах.

5. Установлено, что для одного и того же листа боба в серии из 21-ю измерения через 3-минутный темповой промежуток в каждом последующем измерении до 8-го кинетические кривые флуоресценции и послесвечения понижались, а с 8-го измерения не менялись, т. е. лист достигал "стабилизированного" состояния. Для такого состояния интенсивности переменной флуоресценции и послесвечения были пропорциональны промежутку темповой адаптации в пределах 3-6 мни и 3-15 мин соответственно, а отношение их квантовых выходов с теченнс.Ч времени изменялось в пределах 0,6-0,9.

в. Получены температурные зависимости индукции флуоресценции и послесвечения листьев в виде пиков на термограммах флуоресценции при кратковременных включениях действующего спета. Эти пики исчезали при 50°С. В области 50-60°С при включении действующего спета интенсивность флуоресценции резко уменьшалась, образуя узкие впадины на термограммах, а послесвечение отсутс твовало. При температуре более 60°С действующий свет не оказывал влияния на вид термограмм.

7. Предложено представлять термограммы флуоресценции каждого типа в виде суммы трех компонент с началом 2-й комнонен-

ты при 57-60°С. Установлено, что начиная с этой температуры, увеличивается коротковолновая доля флуоресценции листа.

8. Показано, что предварительный нагрев листьев приводит к изменению спектров флуоресценции и возбуждения, причем наиболее сильно меняются спектры возбуждения у молодых листьев.

9. Показано, что фотоипдуцированное тушение флуоресценции зондов 9-аминоакридина и атсбрпна в суспензии хлоропластов бобов с ростом температуры слабо уменьшается в области 10-24°С и сильно снижается после 24°С до полного исчезновения при 34°С. В области 24-34°С обнаружен новый аффект, состоящий в уменьшении с течением времени фотопндуцирооаш/ого тушения флуоресценции агеб рина и связанный, вероятно, с изменением состояния мембран хлоропластов.

10. Сравнительное исследование кинетики фотомидуцировап-ных изменений сигнала ЭПР1, кривых медленной индукции флуоресценции и з'ермолюмннесценцнн в листьях и стеблях различных растений свидетельствует об одинаковом характере функционирования цепи электронного транспорта и реакционных центров в хлоро-пластах листьев н стеблей.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1. Кузнецова Е.Д., Кукушкин А.К. Сравнительное изучение медленной индукции флуоресценции и послесвечения листьев и хлоропластов /./ Тезисы докл. 6-й Всссоюз. коиф. по ((ютоэнергетике растений. Львов, 1980. С. 27-28. •

2. Кузнецова Е.Л., Кукушкин Л.К. Тушение флуоресценции 9-амнноакридина и агебрина в хлоропластах при различных рН'// Биофизика. 1981. Т. 26, вып. 4. С. 683-686.

. 3. Кузнецова Е.А. Исследование Зависимости флуоресценции листьев растений ог температуры // Биофизика. 1981. Т. 26, выи. 5. С. 893-894.

4. Кукушки и А.К,, Кузнецова Е.А., Тихонов А.Н. Кинетика фотоиндуцированных изменений сигнала ЭПР от реакционного центра фотосистемы I (Р700) и ее связь с медленной индукцией флуоресценции и послесвечением // Тезисы докл. Всесоюз: симйоз. "Магнитный резонанс в биологии и медицине". Черноголовка: ИХФ АН СССР. 1981. С. 174-175.

'5. Кузнецова-Е.А:, Кукушкин А.К. Флуоресценция акридиновых красителей - метод исследования переноса протонов и структурного состояния мембран при фотосинтезе / / Тезисы докл. Всесоюз. совещания "Люминесцентный анализ в медицине И биологии и его аппаратурное обеспечение". Рига, 1981. Ч. 1. С. 135-136.

6. Кузнецова Е.А. Флуоресценция листьев высших растений при повышенных температурах // Биофизика. 1982. Т. 27, вып. 5. С. 809-811.

7. Кузнецова Е.А., Кукушкиь А.К. Влияние ионного состава среды на тушение флуоресценции 9-аминоакридина и атебрина в хлоропластах // Биофизика. 1982. Т. 27, вып. 3. С. 539-540.

8. Кузнецова Е.А. Оптимизация параметров регистрирующей системы установки для исследования фотолюминесценции биологических объектов // Науч. тр. / Моск. лесотехнический ин-т. 1982. Вып. 145. С. 81-84.

9. Кузнецова Е.А., Кукушкин Л.К. Исследование состояния мембран хлоропластов высших растений флуоресцентными методами // Тезисы докл. I Всесоюз. биофизического съезда. М , 1982. Т.-4. С. 32-33.

10. Кузнецова Е.А., Кукушкин А.К. Влияние температуры на • тушение флуоресценции 9-аминоакридина и атебрина в хлоро-иластах // Биофизика. 1983. Т. 28, вып. 5. С. 776-778.

11. Кузнецова Е.А. Термонндуцироваиные изменения флуоресценции листьев растении в зависимости от состояния их пигментного аппарата //.' Тезисы докл. Вссоюз. конф. "Проблемы фотоэнергетики растений и повышение урожайности." Львов, 1984. С. 41.

12. Кукушкин А.К., Кузнецова.Е.А., Бородуля В.М. Изменения протонного переноса и состояния мембран под влиянием света и других факторов// Тезисы докл: Весоюз. конф. "Проблемы фотоэнергетики растении и повышение урожайности." Львов, 1984. С. 39-40.

13. Кузнецова Е.А: О возможности фотоэлектронной диагностики физиологического состояния листьев растений// Науч. тр. /Моск. лесотехнический ии-т. 1985. Выи. 167. С. 113-117.

14. Кузнецова Е.А., Солнцев М.К., Ташпш В., Тихонов А.Н. Сравнительное исследование парамагнитных центров и люминесцентных характеристик листьев и стеблей высших растений//^Науч. тр. /Моск. лесотехнический ин-т. 1989. Вып. 222. С. 47-56.

15. Кузнецова Е.А., Солнцев М.К., Тихонов А.Н. Изучение функционального состояния хлоропластов в листьях и стеблях высших растений радиосиектроскоиическнм и оптическими методами// Науч. тр. /Моск. лесотехнический нн-т. 1990. Выи. 225. С. 56-62.

Hi. Кузнецова E.A., Солнцев М.К., Тихонов А.Н. Сравнительное исследование' электронного транспорта в листьях и стеблях высших растений//Тезисы докл. 8-й Всесоюз. килф. "Магнитный резонанс в биологии и медицине". Звенигород-Черноголовка, 1990. С. 68.

17. Кузнецова Е.А., Кузнецова Л.Д., Солнцев М.К., Тихонов А.Н. Исследование функциональной активности хлоропластов в листьях высших раенчшн в связи с проблемой лазерной стимуляции лесных культур// Науч. тр. /Моск. лесотехнический ин-т. 1991. Выи. 242. С. 57-6.). " '

18. Кузнецова Е.А., Солнцев М.К. Влияние лазерного облучения черенков лесных культур на их люминесцентные характеристи-' кн после укоренения// Науч. тр. /Моск. лесотехнический ин-т: 1991. Вып. 242. С. 65-72 •

19. Кузнецова Е.А. Кииешка термоиндуцированной флуоресценции листьев лесных растений/./ Науч. тр. /Моск. лесотехнический ин-т. 1991. Вып. 245. С. 132-138.

20. Кузнецова Л.Д., Кузнецова Е.А. Влияние лазерного облучения на развитие черенков древесных растений// Науч. тр. /Моск. лесотехнический нн-т. 1992. Вып. 254. С. 16-22.