Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование ферриредуктазной системы дрожжей Pichia guilliermondii

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование ферриредуктазной системы дрожжей Pichia guilliermondii"

Національна Академія наук України Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна

На правах рукопису

Протченко Ольга Володимирівна

ДОСЛІДЖЕННЯ ФЕРИРЕДУКТАЗНОЇ СИСТЕМИ ДРІЖДЖІВ РІСНІА ОШШЕЮЛОКОИ

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук

О

Львів - 1997

Дисертацією є рукопис ^

\/ ‘

Робота виконана у відділі регуляції клітинного синтезу низькомолекулярних сполук Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАІІ України

Наукові керівники: доктор біологічних наук, професор

ІДІАВЛОВСЬКИЙ Г.М.І

кандидат біологічних наук ФЕДОРОВИЧ Д.В.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

ТИМОЧКО М.Ф.

кандидат біологічних наук, доцент ТРАЧ В.М.

Провідна організація - Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України (м. Київ)

Захист відбудеться АНЭ! ОРО ^57 року 0 “ ”

годині на засіданні Спеціалізованої Вченої Ради Д 04.13.01 у Відціленні регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України (290005, Львів-5, ул.Драгома-нова 14/16). З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім.

О.В.Палладіна НАН України.

Автореферат розісланий “ ^ 1997 року

Вчений секретар Спеціалізованої ради, кандидат хімічних наук

Гончар М.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ Актуальність. В останні роки активно ведуться дослідження транспорту заліза в клітину та регуляції цього процесу у різних видів мікроорганізмів. Описано два основних механізми поглинання заліза. Один з них полягає у використанні сидерофорів - низькомолекулярних хелаторів заліза, котрі переводять Fe(III) у розчинну форму і забезпечують ним клітини. В іншому випадку залізо переноситься через мембрану специфічним транспортером у формі Fe(II). В обох випадках процес поглинання та акумуляції заліза проходить за участю фериредуктаз, ферментів, що відновлюють Fe(III) до Fe(II).

Серед дріжджів процес транспорту цього металу досліджувався у Saccharomyces cerevisiae CLesuisse & Labbe, 1994], Schіzosaccharomyces pombe [Roman et al.,1993], Rhodotorula pilimanae [Carrane et аі.,1978]. Але особливий інтерес в цьому плані представляють флавіногенні види дріжджів, у яких біосинтез рибофлавіну регулюється залізом. У перспективних продуцентів вітаміну Вг - дріжджів Pichia guillienrondii регуляція транспорту заліза та біосинтезу рибофлавіну (РФ) здійснюється за участю іонів заліза та продуктів генів негативного типу дії RIB80 та RIB81 [Шавловский и соавт., 1992, 1993]. Раніше було показано (Шав-

ловський и соавт.,1988; Федорович и соавт., 1989), що залізо у

цих дріжджів може поглинатися в процесах сидерофор-та цитрат-залежного транспорту. Одним з найважливіших в транспорті цього металу е етап відновлення Fe(III) до Fe(II). Властивості, регуляція активності та синтезу фериредуктазної системи у P. guillienrandii не досліджені. ' '

Мета і завдання досліджень. Метою роботи було дослідження функціонування і регуляції фериредуктазної системи, у P.g-uilliermondii та деяких інших видів дріжджів.

- 4 -

Для виконання робот необхідно було:

- дослідити зв'язок між транспортом заліза та фериредуктаз-ною активністю клітин;

- вивчити властивості фериредуктази in vitro у P.guilliermondii та інших видів дріжджів;

- дослідити регуляцію активності та синтезу фериредуктази в клітинах дріжджів.

- селекціонувати мутанти дріжджів P.guilliermondii з порушенною регуляцією синтезу фериредуктази та провести їх генетичний аналіз;

Наукова новизна. Досліджено роль фернредуктазної системи в транспорті заліза клітинами дріжджів, її властивості, регуляцію активності та синтезу.

Вперше виявлено стимулюючий вплив іонів міді на фериредук-. тазну систему у P.guilliermondii і деяких інших видів дріжджів.

Встановлено, щр Fe(II) репресує синтез фериредуктази у P.guillienrondii. Показано, що гени негативного типу дії R1880 та RIB81, включені в контроль біосинтезу рибофлавіну, приймають участь і в регуляції синтезу фериредуктази. Виявлено новий ген негативного типу дії HIT (high iron transport), котрий приймає участь в регуляції процесу транспорту заліза в клітину та біосинтезу РФ.

Практичне значення. Запропоновано метод виділення мутантів P.guilliermondii, здатних до надсинтезу рибофлавіну, використовуючи як селективну ознаку здатність відновлювати трифеиілтеграао-лій хлорид (ТТХ). Селекціоновані hit-мутанти можуть бути застосовані для подальшого конструювання штамів-надсинтетиків вітаміну В2. Завдяки високій редуктазній активності клітин hit-мутантів, можливим є осадження відновленої форум вітаміну В2 з культурального середовища інших штамів-наролтетиків РФ.

- 5 -

На захист виносятся наступні положення:

- відновлення Ре(ІІІ) до Ре(ІІ) аа участю фериредуктаз є необхідним етапом в транспорті Б5Ге у Р.ЕїиіІПегтюпсііі та інших видів дріжджів.

- іони міді є необхідними для забезпечення функціонування фериредуктазної системи у дріжджів

- гени КІВ80, І?ІВ81 та НІТ негативного типу дії, включені в контроль біосинтезу ГО, приймають участь і в регуляції фериредуктазної активності у Р.£иі1Негаоп(ііі.

- регуляція синтезу фериредуктази у Р.^иіІПегтопсИі здійснюється за участю іонів заліза.

Апробація роботи. Апробація роботи відбулася у відділі регуляції клітинного синтезу низькомолекулярних сполук Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України. Основні положення дисертації доповідалися на 15-му Міжнародному спеціалізованому симпозіумі по дріжджах (Рига. 1991), на засіданні Львівського відділення Українського мікробіологічного товариства (Львів, 1991), на IV Українському біохімічному з'їзді (Одеса, 1993), на Всеукраїнській конференції з фізіології і біохімії тварин (Львів, 1995), на конференціях молодих вчених у Відділенні регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України.

Публікації. Основні результати досліджень викладені в 9 друкованих працях.

Об'єм і структура роботи. Робота надрукована на 139 сторінках, включаючи ілюстративний матеріал. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, 4 розділів експериментальних досліджень, висновків, списку літератури. Робота ілюстрована 29 таблицями та 19 рисунками. Бібліографічний покажчик містить 168 джерел, в тому числі 146 - іноземних авторів.

- 6 -ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Наводяться дані про основні закономірності поглинання заліза та регуляції цього процесу у різних видів мікроорганізмів. Висвітлена роль фериредуктаз, їх біохімічні властивості, особливості регуляції активності та синтезу у різних видів бактерій, дріжджів, грибів.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

.Матеріали і методи.В роботі використовували наступні штами дріжджів: Pichia guillieraondii АТСС 9058 - штам дикого тину, Pichia guilliermondii генетичної лінії L2, L4 [Сибирньж и соавт., 19772, мутанти P. g'Uilliermondii з порушеною регуляцією флавіноге-незу rib80 (rib80,metX,MAT~) [Шавловский и соавт., 1992] , гіЬ81

(rib81,hisX,MAT~) Шавловский и соавт., 1993], гіЬ83 , гіЬ84 [Шавловский и соавт.,19893; РФ-залежні мутанти RA24 (ribl,ade2,MAT~), R8104 (ribl,hisX,MAT+) [Логвиненко и со-

авт., 1972]. Використовували також дріжджі Hansenula polymorpha ML3, Debaryomyces kloeckeri rassa Fabrii BKM Y-102, Candida boidinii T2A-I, Candida crusei EL-I, Candida famata 0-3, Pichia pinus F4, Rhodotorula pilimanae BKM 4-1977, Schwann і om'/ces occidental is 1758, Saccharomyces cerevisiae S288.

Дріжджі культивували на середовищі Беркгольдера [Burkgolder, 1943]. Використовували середовища з високим 0,2 мкг/мл або низьким 0,01 мкг/мл вмістом заліза, яке додавали у формі солі Мора (NH4)2S04 х FeS04 х 6Н20. Від іонів металів середовище очищали 8-оксихіноліном. [Waiving & Warkman, 1943]. Дріжджі вирощували при 30°С на круговій качалці (200об/хв) або в бутлях (20л) з бар-ботажем.

Мутагенез дріжджів проводили за допомогою УФ-променів. Отримання гібридів та принципи гібридологічного аналізу описані в роботі [Шавловский и соавт., 19793.

- р -

Біомасу дріжджів визначали турбідиметричним методом на фото-електроколориметрі ФЕК-56М. Вміст флавінів в культуральній рідині визначали фдюориметрично на апараті ЕФ-ЗМ, [Bessy et al., 19493. Концентрацію білка в безклітинних екстрактах і препаратах ферире-дуктази визначали за методом tLowry et al., 19513. Вихід білка з колонок реєстрували спектрофотометрично за поглинанням при 280 т.

Концентрацію негемінового заліза в клітинах дріжджів визначали за методом tKurup & Brodie, 19673.

Визначення швидкості поглинання ааліза інтактними клітинами проводили за методом СШавловский и соавт., 19883, використовуючи циклотронне 55FeCl3 з питомою активністю 16 х 1011 Бк/Г в 0,5 N НСІ (Ленінградське відділення В/0 "Изотоп")

Комплекси заліза з сидерофораш отримували за методом [Wieb & Winkelmann,19753. Сидерофори виділяли з культуральної рідини залізодефіцитних культур мікроорганізмів: копроген з Neurospora

crassa [Sivarama Sastry et al., 1962], родоторулеву кислоту з Rhodotorula pilimanae [Atkin et al., 19703, залізозв'язуючий пептид з культуральної рідини P.guilliermondii (речовина X) [Федорович и соавт.19923.

Фериредуктазну активність клітин дріжджів визначали за модифікованим нами методом [Lesuisse et al.,19873, використовуючи для зв'язування Fe(II) «.«’-дипіридил, оптичну густину визначали при 522 н«. Активність фериредуктази в безклітинних екстрактах визначали за методом [Straka & Еиегу, 19783. Активність фериоксидази визначали за модифікованим нами методом [Osaki et al., 19673, використовуючи для зв’язування Fe(lll) десфериоксамін В, оптичну густину визначали при 450 км. За одиницю активності ферменту приймали його кількість, ідо забезпечує перетворення ІмкМ субстрату за 1 хв.

- а -

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ Дослідження фериредуктазної активності Інтактних клітин Р.йщІІіегтогкИі. " '

Для з'ясуванняя ролі редукції Ге(111) до Ре(ІІ) в поглинанні заліза клітинами дріжджів, визначали швидкості відновлення заліза та поглинання 55Ре з різних комплексів інтактними клітинами Р. єиШіегтогкііі АТСС 9058. Найбільша фериредуктазна активність спостерігалась у випадку використання комплексів заліза з речовиною X (залізозв'язуючим пептидом з культуральної рідини Р.ЄШІІіегтопсІіі) та родоторулевоо кислотою. Але швидкість відновлення Ре(III) до Ге(ІІ) корелювала з швидкістю поглинання 55Ре тільки при використанні природних для Р.диіШегтопсііі хелаторів заліза - цитрату та речовини X.

Таблиця 1

Швидкість відновлення Ре(ІІІ) до Ре(ІІ) і поглинання 55Ре з різких комплексів інтактними клітинами Р.гиіПіегаюпсІіі АТСС 9058

Комплекс Ре(III) Швидкість відновлення Ре(111), нмоль Ре/мг сухих клітин за хв Відносна швидкість поглинання 55Ре, X

Ре(111)-ЕШя 0,87 100

Ре(ІІІ)-цитрат 4,15 725

Ге(111)-родогорулеза к-та 8,02 255

Ге(ІІІ)-копроген 3,61 104

Ре(ІІІ)-десфериоксамін В ' . 3,91 165

Ре(ІІІ)-речовина X 5,95 473

Відновлення заліза в комплексах з цитратом, речовиною X та ЕДТА вимагало джерела енергії (глюкози) і пригнічувалось інгібіторами клітинного метаболізму, азидом натрію, ціанідом калію та 2,4-Дїшітрофенолом ( 88%, 63%, та 47% відповідно). Н.И'-дицикло-

гексилкарбодиімід та фторид натпію знижували рівень відновлення

заліза клітинами вдвічі. В присутності глюкози швидкість відновлення Fe(IIІ)-цитрату зростала в 2 рази, a Fe(IIІ)-речовини X - в З рази.

Фериредуктазна активність клітин P.guillienrondii в логарифмічній фазі росту була втричі вища, ніж в стаціонарній.

Клітини P. guilliermondii , а також інших видів дріжджів виділяють в оточуюче середовище речовину (речовини?) з редукуючими властивостями. Найбільш активно відновлювала залізо культуральна рідина видів P. guilliermondii, С. famata, S. occidentalis.

При гель-фільтрації культурадьної рідини P.guillienrondii через сефадекс G-15 (колонка 1,1 х ЗО см), фериредуктазна активність елюювалась з колонки у вигляді одного піку. Спектр поглинання найбільш активних фракцій (Ещах- 265 нм) свідчить, що це не NAD-вмісна сполука.

Відновлення заліза у P.guilliermondii так само, як у

S.cerevisiae CLesuisse et al., 1987], обумовлено дією двох факторів: фериредуктазною активністю інтактних клітин та екскрецією низькомолекулярної сполуки (сполук), що, очевидно, полегшує солю-білізацію заліза CLesuisse et al.,19921.

Дослідження активності фериредуктази в безклітинних екстрактах дріжджів P.guilliertnondii.

Активність фериредуктази в безклітиннимх екстрактах P.guilliennondii, визначена за методиками, описаними в літературі [Straka ЗтЕшегі, 1979; Lesuisse at al. ,1990; Ernst & Winkelmann, 1977 та ін.З, була низькою. При дослідженні впливу іонів двохва-лентних металів на активність фериредуктази в безклітиних екстрактах P.guilliennondii виявилось, що для прояву фериредуктазної активності у P.guillienrondii необхідні іони Mg(II) і Cu (II) (рис. 1). Як донор електронів в фериредуктааній реакції використовували NADH. Заміна його на NADPH викликала незначне (10%) зни-

ження активності. В присутності Інших відновних агентів (відновленого глутатіону, сукцинату, цистеїну) фериредуктазна активність не проявлялась.

Рис. 1 Вплив МБН, іонів Си(II) та Мд(ІІ)

І 100.

О)

Рч

X

Р<

О)

д

о

50

X

ш

х

Е-»

"■+ КАШ + Си/ II/ +І%/ІІ/

-мв/іі/

на активність фериредуктази Р.£иі11іепюпс1іі

-КАЛИ

д

—Си/ІІ/

Для отримання частково очищених препаратів фериредуктази використовували клітини дріжджів Р.диііііеппопсііі АТСС 9058, вирощені протягом 48 годин в середовищі з низьким вмістом заліза (0,01 мкг/мл) . .

При гель-фільтрації безклітинного екстракту через сефадекс (3-200 (колона 1,1 х 100 см), зрівноваженийй 0,01 М тріс-НСІ буфером, рН 7,0 а 0,05 М і&С12 та 0,1 М гліцерином , ферйредуктаза відділялась від основної маси високомолекулярних білків, але в цих умовах відбувалась значна втрата фериредуктазної активності. Виявлено два піки редукції заліза: в високомолекулярній та низькомолекулярній фракціях. '

При фракціонуванні сульфатом амонію безклітинних екстрактів ферйредуктаза висолюється при 40 - 60% насичення. На отриманих таким шляхом препаратах проводили дослідження впливу концентрації іонів Си(ІІ) на активність фериредуктази. Виявлено, що максимальна активність фериредуктази спостерігається при концентраії іонів міді 0,5х 10~4 М. Цікаво було дослідити, як впливають іони цього

металу на фериредуктазну активність інтактних клітин, а також на швидкість поглинання заліза. Іони цього металу стимулюють відновлення заліза не тільки in vitro, але і in vivo (табл. 2) . При дослідженні активності фериредуктази в бєзклітинних екстрактах деяких видів дріжджів, виявлено, що додавання іонів Cu (II) до інкубаційної рідини підвищує фериредуктазну активність. Особливо це характерно для D. kloeckeri, С. famata, C.crusei.

Таблиця 2

Вплив іонів міді на швидкість поглинання заліза з комплексу 55Fe~EflTA та фериредуктазну активність клітин P.guilliermondii 9058, вирощених при високому (0,2 мкг/мл) та низькому (0,01 мкг/мл) вмісті заліза в середовищі.

Концентрація Си(І І) і; •" " 1 Вміст Fe |в середовищі 1 вирощування, 1 мкг/мл Г ~ • ■ ■■ "Г | Фериредуктазна актив-1 Початкова Іність інтактних клі- |швидкість (тин, ямоль Ре/мг [поглинання |сухих клітин за хв |55Ге, % ■> і і

- 0,2 0,44 100

10”4 м 1,42 251

- 0,01 1,25 3631

10~4 м 4,92 6311

При дослідженні впливу інгібіторів клітинного метаболізму на активність фериредуктази Р.еиШіепгогкШ виявлено, щр помітно інгібували що ферментативу реакцію сполуки, що зв'язують БН-групи

- п-хлормеркурбензоат та оцтовокисла ртуть. Значно пригнічував активність фериредуктази інгібітор мідьзалежних ферментів - дие-тилдиті окарбамат натрію. Азид натрію, 2,4-динітрофенол, N,N’-ди-циклогексилкарбодиімід не впливали істотно на активність фериредуктази. Кисень слабо інгібував цей фермент. В анаеробних умовах фериредуктазна активність зростала на 24%.

Для дослідження субстратно? специфічності фериредуктази

- 12 -

P.guilliermondii використовували ріані комплекси заліза. Виявлено, щй найкраще процес редукції Fe(III) в Fe(II) відбувається у випадку використання комплексів Fe(UI) а цитратом, речовиною X (залівози'Я8уючий пептид з культурально! рідини P.guilliermondii) та ЕДТА. '

Недавно в літературі було висловлено припущення lAskwith et al., 19943 ,що в транспорті заліза у S.cerevisiae приймає участь мідьвмісна фериоксидаза, але активність цього ферменту не визначали. Дослідження фериогесвдазної активності у P.guilliermondii проводили в препаратах, отриманих шляхом висолювання сульфатом амонію (ЗО -70Z насичення) з безклітишшх екстрактів. Для проявлення реакції були необхідні іони міді, але не NAD. Таким чином, це не є зворотня реакція. При гель-фільтрації препарату фериокси-дази черев сефадекс G-2Q0 активність фериредуктази та фериоксида-8Й виявлено в тих самих фракціях.

Можливо.фериредуктаза та фериоксидаза у P.guilliermondii, так само як у S.cerevisiae tAskwith et аі.,1996], е компонентами єдиної окисно-відновної Fe-транспортної системи, що забезпечує спряження процесів транспорту, відновлення і окислення іонів Fe та Си.

Селекція та дослідження властивостей мутантів з підвищеною активністю фериредуктааної системи у P.guilliermondii.

Для виділення мутантів з підвищеними відновними властивостями клітин було використано трифенідтетразолій хлорид (ТТХ), який

- -при відновленні утворює речовину черюного кольору,..- трифенілфор-мазан (ТФФ). Мутанти отримували з РФ-залежних штамів P.guilliermondii RA24 та RG104.

Селекціоновані штами належали до однієї комплементаційної групи. В порівнянні з вихідним штамом RG-104, мутанти активніше відновлювали ТТХ, метиленовий синій, фериціанід та РФ (в 30-60

разів), мали вищий рівень'транспорту 55Ре (в 30-70 разів), фери-редуктазну активність клітин (10 -50 разів) та загальний вміст негемінового валіза в клітинах ( 2-3 рази). Прототрофні по рибофлавіну (РФ) мутанти синтезували на порядок більше РФ, ніж штам дикого типу 12 (табл. 3).

Таблиця З

Фенотипічні ознаки Ьїі-мутантів та вихідного штаму.

P.guilliermondii RG-104, hit

Відновлення ТТХ, мкгТФФ/

мг сухих клітин 1,1 42,4

Швидкість відновлення Ре(ІІІ),

нмоль Ре/мг сухих клітин за хв 0,42 14,35

Відносна швидкість поглинання

55Ре, % 100 6413

Вміст негемінового Ре в клі-

тинах, мкг Ре/мг сухих клітин 58,6 121,3

Продуктивність флавіногенезу,

мкг КР/мг сухих клітин 0,2 (L2) 2,2

hit мутанти нагадували мутант W4CJupl S. cerevisiae (Jungmann et al.,1993] , котрий відзначається високою редуктазною активністю та гіперчутливістю до іонів міді, При концентрації іонів міді в середовищі 5-25 мкМ ріст hit мутантів, порівняно з штамом дикого типу, частково пригнічувався, а при концентрації 50 мкМ повністю припинявфя (рис. 2). В той же час, клітини цього штаму, вирощені в середовищі з концентрацією іонів міді 5-25 мкМ, відновлювали Fe(III) з більшою швидкістю, ніж ті, котрі росли при оптимальному забезпеченні іонами міді (0,1 мкМ).

Для того, щоб дослідити природу мутації hit, було проведено три реципрокні схрещування hit-мутантів та штамів

P.guillierrnondii дикого типу. В результаті нами отримано іаоген-

Рно.2 Вплив іонів міді на ріст [ © 1 та ферире-I дуктазну активність

s с А] hit-мутанта [ОА]

=Е

а та штаму дикого типу

P.guillieraondii АТСС 9058 [©А].

12,5 25 60

КОНЦШПМІШ Си(І*) . ю"6 U

ні, або близькі до ізогенних штами. Мейотичне розщеплення серед ауксотрофних сегрегантів, отриманих а гібридів hit х L4 за ознакою " відновлення ТТХ " становило 1:1. Сегреганти, відібрані за червоним забарвленням колоній на середовищі з ТТХ, при вирощуванні на середовищі з високою концентрацією заліза (0,2 мкг/мл) синтезували більші кількості РФ, порівняно а диким типом (від 1,3 до 2,2 мкг РФ/мг сухих клітин). Фериредуктазна активність клітин та швидкість поглинання у цих штамів були в 5 - 10 разів вищі, порівняно з штамом дикого типу. Друга група сегрегантів, котрі нездатні відновлювати ТТХ, за фериредуктазною активністю клітин, швидкістю поглинання 55Fe та продуктивністю флавіногенезу не від-

- рівнялась від штаму дикого типу.

Для того, щоб одержати додаткові докази про участь гену HIT в регуляції транспорту заліза в клітину та в регуляції флавіногенезу, за допомого® нітрозогуаніднну з штамів hit-s-16 та hit-s-9 було отримано 135 штамів, котрі не виявляли високої редуктазної активності на середовщі з ТТХ. Для з’ясування генетичної природи

ревертантів, їх схрещували а вихідними hit мутантами протилежного типу спарювання. У трьох гібридів, редуктазна активність по відношенню до ТТХ, швидкості відновлення Fe(111) та поглинання 55Fe, а також продуктивність флавіногенезу буди на рівні дикого типу. Отже, повернення до фенотипу дикого типу у цих трьох штамів обумовлене мутацією в гені hit. Таким чином, наши дослідження вказують, ідо мутація hit обумовлена пошкодженням одного гену, локалі-\

аованого в ядрі.

Оскільки за фенотипічними ознаками hit-мутанти схожі на мутантів з порушеною регуляцією флавіногенезу гіЬ80 та гіЬ81 [Шав-ловский и соавт., 1S92, 1993] , котрим також притаманні надсинтез РФ та висока швидкість поглинання 55Fe, було проведено комплемен-таційний аналіз hit мутантів на наявність мутацій ПЬ80 та гіЬ81. Гібриди, отримані схрещуванням регуляторних мутантів гіЬ80 або гіЬ81 та мутантів hit, не відрізнялись від дикого типу ні за фе-риредуктазною активністю, ні за швидкістю поглинання заліза, ні за продуктивністю флавіногенезу. Тобто, мутація hit не обумовлена пошкодженням генів RIB80 або RIB81.

Таким чином, отримані нами дані свідчать, що крім RIB80 та RIB81, у P.guilliermondii ідентифіковано ще один ген негативного типу дії HIT, котрий приймає участь в регуляції біосинтезу РФ та транспорту Fe в клітину.

Дослідження регуляції_________синтезу________фериредуктази_______^

P.guilliermondii та інших видів дріжджів.

Проведено дослідження здатності відновлювати Fed 11) до Fe(lІ) в комплексах з цитратом, речовиною X таі ЕДТА клітин різних видів флавіногенних ( P.guilliermondii, С. famata-, D. kloeckeri) та нефлавіногенних дріжджів (Н. polymorpha, С. boidinii, С. cruse і, P. piniis ), вирощених при високому (0,2 мкг/мл) і низькому (0,01 мкг/мл) вмісті заліза в середовищі (табл.4).

Таблиця 4

Продуктивність флавіногенезу та швидкість відновлення Ге(III) в комплексах а цитратом [1], речовиною X [21 та ЕДТА [3] інтактних клігин різних видів дріжджів, вирощених в середовищах з

високим (0,2 мкг/мл) та низьким (0,01 мкг/мл) вмістом заліза

Вид Вміст заліза в середовищі , МКГ/МЛ Продуктивність флавіногенезу, мкг РФ/мг сухих клітин Швидкість відновлення Ре(ІІІ),нмоль Ре/мг сухих клітин за хв.

1 2 3

Р.диіПіепгопсііі 0,01 14,30 2,02 2,18 1,45

0,2 0.40 1,61 1.21 0,81

Р. ріпш 0,01 0,30 1,09 2.1 1,05

0,2 0,17 2,34 3,71 1,61

С. Ьоісііпіі 0,01 0,13 4,92 4,19 4,03

0,2 0,06 0,81 1,94 1,21

С.кгизеі 0,01 0,17 4,84 2,66 1,98

0,2 0,06 4,11 2,17 1,05

Н.роІушогрЬа 0,01 0,15 0,97 1,05 0,89

0.2 0,05 2,18 3,31 1,89

О.кіоескегі 0,01 32,80 1,25 2,83 0,81

0,2 1,00 0,75 1,92 0,65

С.ГашаЬа 0.01 17,80 2,50 4,67 1,29

0.2 2,50 0,50 0,65 0,65

Вищою фериредуктазною активністю, порівняно з іншими дослідженими видами, відзначались клітини С. Ьоісііпіі та С.сгизеі при вирощувані на обох типах середовищ.

Дефіцит валіза в середовищі вирощування приводив до зростання швидкості відновлення Ре(ПІ) у • С.ЬоісИпіі, Р.кіоескегі,

С.Гашаїа. У Р.ріпцБ та Н.роІушогрЬа в цих умовах, навпаки, спостерігалось зниження фериредуктазної активності.

Зростання активності відновлення Ре(ІІІ) до Ре(ІІ) клітинами дріжджів ва умов дефіциту заліза залежить від природи комплексу

Ре(ІІІ)-сидерофор. Для більшості досліджених видів де було характерним у випадку використання комплексу Ре(ІІІ)-речовина X (Р.гиііііегтопсііі, С.Ьоісііпіі, О.кіоескегі, С. ґатаїа).

Результати визначення фериредуктазної активності в безклі-тинних екстрактах досліджуваних видів дріжджів в основному узгоджуються з даними, отриманими на інтактних клітинах.

Для з'ясування механізму регуляції фериредуктазної активності при виникненні дефіциту заліза в клітинах Р.єиШіегпюпсііі вивчали вплив «,«'-дипіридилу, який утворює хелатні комплекси з Ре(ІІ) та циклогєксіміду, інгібітора синтезу білку, на фериредук-тазну активність інтактних клітин та в безклітинних екстрактах. Як видно з таблиці 5, дефіцит заліза, викликаний й.а'-дипіриди-лом, приводить до синтезу фернредукгази, а циклогексімід блокує цей процес.

Таблиця 5

Вплив а,а'-дипіридилу та циклогєксіміду на синтез ферире-дуктази у Р.еиШіегтогиііі

Додано до інкубаційної рідини Швидкість відновлення Ре інтактними клітинами, Активність фери-редуктази,

нмоль Ре/мг сухих клітин за хв % Е/мг білку х 10~3 %

Ре (0,4 мкг/мл) 0,8 100 36,3 100

й,«’-диліридил (100 мкг/мл) 2,5 312 99,93 256

Й.ОЕ'-ДИПІРИДИЛ (100 МКГ/МЛ) 4 циклогексімід (15 мкг/мл) 0,85 110 43,56 120

Як було зазначено вище, у Р.диШіегтопсііі деякі му «ації, які регулюють біосинтез рибофлавіну, мають плейотропну дію і впливашть також на процеси транспорту та акумуляції заліза клітиною (Шавловский и соавт., 1989, 1992,1993). Мутанти з пошкодже-

ною регуляцією біосинтезу рибофлавіну негативного типу дії гіЬ80, гіЬ81, а також hit, для яких характерна висока швидкість поглинання Fe та підвщении вміст цього металу в клітинах, відзначаються високою фериредуктааною активністю. При вирощуванні цих мутантів в умовах дефіциту заліза відбувається незначне додатково зростання фериредуктазної активності. Як і у дикого тищ

Таблиця (

Продуктивність флавіногенезу та швидкість відновленні Fe(III) в комплексах з цитратом [Ц, речовиною X [21 та ЕДТА [З інтактних клітин мутантів P.guilliermondii з пошкодженою регуляцією флавіногенезу , вирощених в середовищх З ВИСОКИМ (0,; мкг/мл) та низьким (0,01 мкг/мл) вмістом заліз;

Штам Вміст заліза в середовищі , мкг/мл Продуктивність флавіногенезу мкг РФ/мг сухих клітин Швидкість відновлення Fe (111),нмоль Fe/мг сухих клітин за хв.

1 2 3

P.guilliermondii 0,01 14,24 3,22 4,18 1,45

АТСС 9058 0,2 0,16 1,31 1.21 0,81

гіЬ80 1018-32 6,01 14,74 10,10 5,03 2,45

0,2 3,08 5,52 2,22 2,45

ГІЬ81 131-7 0,01 10,91 11,5 5,25 3,67

0,2 8,97 3,04 4,15 2,26

ГІЬ8081 - - - - -

0,2 16,21 - -

hit 1-1 0,01 14,12 15,82 30,93 5,36

0,2 1,45 9,64 27,03 3,98

,Г.;Ь83 LV 251 0,01 0,27 2,05 - -

1 г . 0,2 0,27 1,40 - -

ГІЬ84 LV 248 0,01 0,34 2,40 - -

0,2 0,09 1,30 - -

- не визначали

P.guilliermondii, ступінь зростання активності залежав від природи комплексу заліза.

Поєднання двох мутацій негативного типу дії, гіЬ80 та гіЬ81, в гаплоїдному геномі (Шавловський та спіаавт., 1994), приводило

до підвищення в декілька раз фериредуктазної активності, порівняно з вихідними штамами.

У мутантів гіЬ83 та гіЬ84 [Шавловский и соавт.,1989] з пошкодженням регуляції біосинтезу РІ> за позитивним типом дії (у яких біосинтез рибофлавіну не регулюється залізом), фериредуктазна активність клітин, вирощених в умовах оптимального для росту забезпечення залізом, була на рівні батьківського штаму.

Таким чином, висока швидкість транспорту заліза в клітину мутантів гіЬ80, гіЬ81, та hit обумовлена підвищеною фериредуктаз-ною активністю.

Участь генів негативного типу дії RIB80, RIB81, HIT та іонів Fe(II) в регуляції флавіногенезу та фериредуктазної активності вказує на існування спільних шляхів регуляції синтезу ферментів флавіногенезу та Fe-транспортної системи.

ВИСНОВКИ

1. Показано, що клітини дріждів P.gmlliermondii здатні відновлювати Fe(III) до Fe(II) в комлексах з природними та синтетичними хелаторами: цитратом, залізозв’язуючим пептидом з культу-

ральної рідини P.guilliermondii (речовина X), ЕДТА, а також родо-торулевою кислотою, копрогеном, десфериоксаміном В. Інтенсивність відновлення FedII) У P.guilliermondii залежить від енергозабез-печеності клітини, і найбільш активно відбувається в логарифмічній фазі росту. Виявлено кореляцію між швидкістю відновлення Fe(III) та поглинанням 55Fe у випадку використання природних для P.guilliermondii хелаторів заліза цитрату та залізозв’язуючого пептиду з культуральної рідини цього виду дрівджів.

2. Розроблено метод визначення активності фериредуктази in vitro з використанням «.«-дипіридилу. Показано , щ^^іроявлення активності цього ферменту у P.guilliemondii необхідні NADH, іони Mg(II), Cu(II). Вперше виявлено, що іони Си(ІІ), стимулюють відновлення заліза як in vivo так і in vitro у P. guilliermondii та деяких інших видів дріжджів.

3. Встановлено наявність фериоксидазної активності в частково очищених препаратах P.guilliermondiі. Показано, що для проявлення активності ферменту необхідні іони Си(II).

4. Виділено колекцію hit-мутантів (high iron transport) P.guilliermondiі, які активно відновлюють Fe(III) та поглинають 55Fe з різних комплексів. За допомогою комплементаційного аналізу показано, що такий фенотип обумовлений однією ядерною моногенною мутацією.

5. Регуляторні гени біосинтезу РФ негативного типу дії RIB80, RIB81 та HIT приймають участь в регуляції фериредуктазної активності у P.guilliermondii.

6. Виявлено, що в умовах дефіциту заліза зростав фериредук-тазна активність у флавіногенних дріжджів S.occidental is,

D.kloeckeri, C.famata, а також у нефлавіногенних дріжджів C.boidinii. Клітини Н. polymorpha та P. pinus проявляють вищу фе-риредуктазну активність при вирощуванні в середовищі з високим вмістом заліза.

7. У P.guilliermondii при дефіциті заліза відбувається де-репресія синтезу фериредуктази.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Стенчук Н.Н., Протченко О-В. Рибофлавинзависимые мутанты дрожжей Pichia guilliermondii с пониженной потребностью в рибофлавине. VII Съезд Украинского микробиологического общества. Тезисы докладов.- Киев-Черновцы - 1989 - 4.1.- С. 30.

2. Стенчук Н.Н., Протченко О.В., Федорович Д.В., Шавловский Г.М. Мутанты Pichia guilliermondii с повышенной способностью к восстановлению ионов железа и рибофлавина // Генетика. - 1991. -Т.27,N 3. - С.561-564.

3. Fedorovich D.V., Protchenko 0.V., Shavlovsky G.M. Iron transport and its regulation in Pichia guilliermondii // 15th International specialised symposium on yeast.- Riga.- 1991.-P.42.

4. Федорович Д.В., Шавловский Г.М., Протченко О.В. Феррире-дуктазная активность клеток Pichia guillierirandii и особенности ее регуляции // Микробиология. - 1992. - T.61.N 1. - С.11-17.

5. Протченко О.В., Стенчук М.М., Федорович Д.В., Шавловський

Г. М. Селекція та деякі властивості мутантів дріжджів Pichia guilliermondii з підвищеною активністю ферисидерофорредуктази //VII Оьезд Украинского общества генетиков и селекционеров им.Вавилова. Тезисы докладов. - Киев. - 1992. - Ч.1.- С.128-129.

5. Федорович Д.В., Протченко О.В. Шавловський Г.М. Дослід-

ження ферисидерофорредуктазної активності дріжджів та її ролі в транспорті заліза // IV Укр. біохім. з’їзд. Тези доповідей. - Київ. - 1992. - 4.1.- С.55.

6. Федорович Д.В., Протченко О.В. Властивості та регуляція

активності фериредуктази дрівджів // Мікробіол.журн. - 1994. -

Т. 56, N1. - С.108.

7. Федорович Д.В., Протченко О.В. Шавловський Г.М. Ферире-

дуктаза Pichia guilliermondii: властивості і регуляція активності та синтезу // Укр. біохім.журн.- 1995. - Т.67, N1. - С.32-38.

8. Федорович Д.В., Кітик І.В., Протченко О.В., Шавловський Г.М. Дослідження транспорту та акумуляції заліза клітинами дріжджів Pichia guilliemondii // Всеукр.конф. з фізіології та біохімії тварин. Тези доповідей.- Львів.- 1995. - С.158-159.

9. Федорович Д.В., КитыкИ.В., Джала В.И., Протченко О.В.,

Шавловский Г.М. Аккумуляция и окислитель но-восстановительные превращения железа в клетках Pichia guilliermondii и флавиноген-ных мутантов этих дрожжей // Микробиология (в печати).

Протченко О.В.

Исследование ферриредуктазной системы дрожжей Pichia guilliermondii.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специадьномсти 03.00.04 - биохимия, Отделение регуляторных систем клетки Института биохимии им.О.В.Палладина НАН Украины, Львов, 1997.

РЕЗЮМЕ

Исследовано закономерности проявления ферриредуктазной активности интактными клетками P.guilliermondii, а также в бескле-точных екстрактах фракционированных сульфатом аммония. Впервые показано, что кроме NADH и ионов Mg(II), для проявления активности ферриредуктазы in vitro необходимы ионы Си(II). Ферриредуктаза слабо угнетается кислородом и способна восстанавливать железо в комплексах с природными и синтетическими хелаторами. Селекционировано коллекцию hit-мутантов P.guilliermondii с нарушенной регуляцией синтеза ферриредуктазы и транспорта железа в клетку и проведен их генетический анализ. Показано , что гены негативного типа действия, включенные в контроль биосинтеза рибофлавина, RIB80 и RIB81, принимают участие и в регуляции ферриредуктазной активности у P.guilliermondii. Исследовано влияние железа на феррире-дуктазную активность некоторых видов дрожжей. Установлено, что ионы этого металла репрессируют синтез ферриредуктазы у P.guilliermondii. Обсуждаются возможные механизмы координированной регуляции флавиногенеза и обеспечения клетки.Fe и Си.

- S3 -

Ключові слова: дріадді, фериредуктаза, транспорт заліза, мутанти, регуляція.

Protchenko O.V.

Investigation of the ferrіreductase system of yeast Pichia guilliermondii

The Candidate Thesis for a Master's Degree, the Speciality

03.00.04 - Biochemistry - Division of regulatory cell system, 0.V. Palladin Institut of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Lviv, 1997.

SUMMARY

Properties of ferrireductase activity of whole cells, crude extracts and ammonium sulfate preparations of yeast P.guilliermondii were studied. Ferrireductase of P.guilliermondii requires not only NADH and Mg(II), but and Cu(II) ions. Oxygen acts as a slight inhibitor. Ferrireductase reduces complexes Fe(III) with natural and arteficial chelators. The collection of hit gain-of-function mutants defective in regulation of the ferrireductase activity were selected and their genetic analysis was done. R1B80, RJB81 and HIT genes involved in negative control of riboflavin biosynthesis also take part in the regulation of ferrireductase activity in P.guilliermondii. Iron regulates the synthesis of ferrireductase in P.guilliermondii by negative feed-back mechanism.

Зам.12. Нзклад 100 екз.

Друк, вид-вз "Коопосвіта" ЛКА