Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование ферментных систем лизосом различных тканей в реализации клеточного питания

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование ферментных систем лизосом различных тканей в реализации клеточного питания"

'1 1 0 3 9'<ь

АКЛДОШ МВДЦШСКЙХ НАУК СССР ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ

уда С12.015.1:577Л52.3/05:61?.39Г

ИССЛЕДОВАНИЕ ФЕГШШШХ СИСТЕМ ЛИЗОСОМ РАЗЛИЧНЫХ ТКАКЕИ В РЕАЛИЗАЦИИ КЛЕТОЧНОГО ПИТАНИЯ

03.00.04. - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

На правах рукописи

БРЕГВШЕ Нина Сергеевна

МОГ-КРП - ТРТЮ

Раоото шполнена на кафедре биохимии Тбилисского государственного медицинского института и в лаборатории ензимологии питания Института питания АМН СССР.-

Научныо руководители: доктор медицинских, наук,

профессор Ткешелашвили Л.К.. кандидат биологически! наук Васильев А.В.

Офащальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Гашаров Ц.-Ы.Г.

Ведущее учреждение:

Задаа состоится " /2

доктор медицинских паук, Ыаянская H.H.

Научно-исследовательский институт биологической и медицинской хишш АШ СССР

О _1991 года в_часов

на заседании Специализированного ученого совета Д.001.02.01 при Институте штения АШ СССР по адресу: 109240, Уосква, Устьинский проезд, 2/14.

с диссертацией ыокно ознакомиться в библиотеке Института шггшш А1Ш СССР.

Автореферат разослан " К " 0?_199р г.

Учений секретарь' Специализированного совета, ^ кандидат медицинских наук

В.И.Еминченко

t'.

!

J

0Е1ЛЯ ХАГЛКТЕГИСТ'ЛКА ГАВОТН

Актуальность теми.В настоящее время известно дейстгато отдельных компонентов micin на различные метаболические системы, субклеточные структуры и клетки » целом, что позволило выделить на каждом из уровней организации Функциональное звено, наиболее чувствительное к изменению характера питания (А.А.Покровский, '1Гг74; В.А.Тутелькн, 1977; М.М.-Г.Гшшароп, 1970; М.М.Левачев, 1980; В.Б.Спирцчев, 1980). Одной из таких систем является лизосомалыщй аппарат клетки, обеспя-чивапцнй регуляцию интенсивности обмена практически всех необходим« для нормальной жизнедеятельности макромолекул ла стадии их катаболизма (А.А.Покровский, В.А.Тутельян, 1976; А.Барретт, М.Хит, 1980; Р.Дин, Г 901; Т.А.Короленко, 1Э90; Wicderanders В. at.al., 19341 Kirschfce Н. , Barrott <\. J., 19Q7).

Предыдущие исследования позволили сформулировать положение, что функция клеточного питания лизосом у млекопитающих при определенных алиментарных состояниях обеспечивает реализацию ряда физиологических процессов в норме и патологии (В.А.Тутольян, А.П.Васильев, 1992, 1987, 19ЭО). Однако изучение особенностей Функционирования специализированных Ферментных систем лизосом, определяющих реакцию этих субклеточных структур на качественный и количественный состав пищи в различных органах и типах клеток, носит весьма ограниченный характер, тогда как расшифровка этих механизмов является необходим™ этапом на пути детального познания закономерностей биохимической адаптации организма, в том число и к характеру питания (В.А.Тутельяп, 1980; Л.Е.Панин, Н.Н.Маянская, 1987). Среди ферментных систем лизосом наибольший интерес с точки зрегая функциональной значимости,.

- г -

особенностей специфичности, распределения в клетках и тканях представляют протеолитическио ферменты, внимание к которым на ослабевает на протяжении МНОГИХ ЛЙТ (Mayer R.J., Вег G. , Laszlo L., 1990). Вместе с тем, хотя и сформулированы определенные представления о биогенезе, нроцессинге и-регуляции активности протеолитических ферментов лизосом (Л-.А.Локшша, 1979; В.В.Мосолов, 1983; Л.А.Локшина, . Э.А.Дилакян, 1985; Л.А.Локшина, В.С.Билинкина, 1990; Turk v., i9B6« pi»i<er v., 1990) вопрос об особенностях регуляции лизосомальных протеиназ различна групп (аспартатшх, тиоловых) и их физиологической роли остается открытым.

Цель и задачи исследования. Цодыо работы явилась попытка расшифровать механизмы регуляции лшосомалишх протеиназ различных групп -аспартатных (катепсина о) и -толовых (катепсшюв В, Н, l) в норме и при активации процессов клеточного • питания. Задачи исследования включали :

- сравнительное изучение активности лизосомальных иротоиназ и других лизосомальных гидролаз в печени, почках и селезенке крыс в условиях полного парентерального питания;

- сравнительное изучение активности лизосомальных иротоиназ и других лизасомалыых гидролиз в различных органах крыс (паче-нь, почки, селезенка, тимус, скелетные мьшщы, сердце, мозг) при белковом голодании;

- изучение отдельных особенностей биогенеза лизосомалышх протьи-. наз при различном . уровне шгибировашш биосинтеза белка (транскрипции, трансляции)!

- изучение взаимосвязи между активность») тиолсьих прошшаз лизосом и содержанием их ендогенных ингибитора в норма и пои белковом

голодании.

Научная новизна. Впервые установлено, что при активации процессов клеточного питания, индуцированных условиями полного парентерального питания или белкового голодания активируется система катепсин d-зависимого протеолиза и в случае белкового голодания подавляется активность систем тиоловых протеиназ независимо от уровня потребления серусодержащих аминокислот. Впервые получены доказательства существования различных типов регуляции активности тиоловых протеиназ ли-зосом - срочный тип регуляции эндогенными ингибиторами и регуляция активности ферментов этой группы на уровне транскрипции. Получошша данные имеют существенное значение для понимания процессов биогенеза, посттрансляционлого процессинга и регуляции активности тканевих протеиназ.

Научно-практическая значимость. Предложен простой способ выделения суммарной фракции термо-, кислотостабильных ингибиторов тиоловых протеиназ из печени крыс, что в сочетании, с разработанным методом оценки специфпеской ингибиторной активности по патаину, катепсинам В,и l позволяет разработать принципиально новые критерии оценки функционального состояния лизосомального аппарата при патологических состояниях алиментарной этиологии.

Апробация работы проведена на расширенной конференции отдела биохимии и физиологии питания Института питания АМН СССР (1990 г.). Основные положения работы долокрны на М, XiX научной конференции молодых медиков Грузии(Тбилиси, Х98Э, 1990) и на симпозиуме "и«сн«~

-ilem and Regulation of 1ntracel1ul«г.protein cataboli em" (Будапешт,

1990). Основные полояения работы отражены в 5 публикациях.

Структура диссертации. Работа состоит из введения; обзора литературы, представленного в 3-х разделах; экспериментальной части, вклю-

чающий ошитиыь материалов и ютодов исследовании, а так«» розульта-юв ооостьмшых исследиьаний (4 раздела); ааклгниния, выводов и списка цитированной лт-иргпури, ыслма»««го ^ раоот тич^сгвешшх и ¡0/ янругкшшх. авторов. Работа изложена на !i> страницах текста, содержит таблиц и // иллюстраций.

МАТЕРИМЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили на hpuoux-самцах лилии Вистар. Всего в работе Сало использований свыше 500 »цветных.

Модель полного.парентерального питания (ПП) била создана Порядковым Л.Ф. с сотрудниками (лаборатория парентерального питания Института питания АМН СССР, Порядков Л.Ф. и др., 1Э83; Порядков Л.Ф., 1986). Животным одной группы клишировали хелудок, крнсам другой канюли вводила в заднюю полую вену, красам обеих групп круглосуточно в точение 10 дней вводили одинаковую смесь пищевых веществ (БСмл/сут), содержащую дроюкевой белковый гидролизат "Аутолизин" и глюкозу, а также водорастворимые витамины; жирорастворимые витамины вводлли под KOiyr. Б следующей серии вкслеришнтов животные в течение 10 дней получали рацион с I8X содержанием белка (контроль); изокалорийный без-болкоъый рацион и безбелковый рацион, обогащенный l-ыэтиоюшом (1 г на 100 г сухой массы рациона).

При исследовании эндогенных ингибиторов тиоловых щютеилаз животных содержали на полусиятетическом безбелковом рационе в течение & дней и 15 дней. Половило животных в каждой группе вводили ежедневно £шугрш:олудочно с помощью зонда 100 мг аминокислоты (l- цистоин или l-штионин) на животное. Контрольные животные содержались на иэока-лорийном полусинтетическом рационе, содержащем 1Ы болка.

АКТИНОМИВДН D ВВОДИЛИ внутрибрншпшо 2-Х ИЛИ 4-Х кратно В ДО39 0,02 да на 100 г массы тела с интервалом в 12 часов и забивали через' 12 часов после последнего Введения препарата. Кивотшм всех групп за 4 часа до забоя вводили внутрибргшшшо 3Н-урлдин в физиологическом растворе в дозе 50 мхКи на 100 г массы твла и за 30 мин. - 14С-гиду ролизат белка внутрибршинно в физиологическом растворе в дозе 10 мкКи на 100 г массы тела. Кусочки исследуемой ткапн (печень, селезенка) весом 20-50 мг переносили во флаконы, содержащие I мл тканевого СОЛГОбИЛИЗвра (NCS tussuBsalubill.zer "flm«reh»m") ОСТЭВЛЯЛИ ДО полного растворения, после чего заливали 10 мл толуольного сшштиля-тора. Параллельно 0,5 мл гомогената осаждали I мл 20% ТХУ, цонтрйфу-гировали, отбирали по 0,5 мл падосадка и переносили во флаконы для радиоактивного счета с 10 ил диоксанового сщштилятора (400 мл диок-сан, 90 мл метанола, 10 - этиленгляколя, 30 г сублимированного нафталина "Sigma", США, 2 Г РРО, 0,2. Г РОРОР "aloma", США). 0СЭДОК рО-суспендировали в 3 мл 5% ТХУ и переносили на мембранный фильтр "Сынпор Я 2" (ЧСФР), дваада промывали Б мл 5$ раствором ТХУ, мембранный фильтр просушивали и переносили во флаконы для сцинтиляцион-ного счета с диоксановнм сцинтилятором.

Циклогексимид вводили внутрйбршинно 2-х или 4-х кратно в дозе 0,1 мг на 100 г массы тела с интервалом 12 часов и забивали через IS часов после последнего введения препарата. Кивотнкм всех групп за 4 часа до забоя внутрибрппшно вводили 14С-уридии в физиологическом растворе в дозе 5 мкКи на 100 г массы тела и за 30 минут" - "'н-лййцин внутрибрпжнно в физиологическом растворе в дозе 40 мтЖл па 100 г' могссн тела. Определение оОщрй, ГХУ-осяадаемой и ТХУ-рчстворпмой радиоактивности проводились как описало вше.

В исследуемом материале (пвчэпь, почки, селезенка,'сердце, cito-

JtóTiÜJu МШЦ11, мозг, тнмус) определяли активность G лизосомалышх протеиназ - катеисиноь А (КФ 3.4 Л2А Л ), В (КФ3.4.22.Т), С (КФ 3.4.14.1), и (К* 3.4.23.5), |[ (КФ 3:4.22.16), l (КФ 3.4.22.15) с использованием сшжтрофотометрических и спектрофлюориметрических методой (Яаррмт А.Дж., Хит М., i960; Васильев A.D. и др., 1983; югвг.м;в н., ivas), а тйкжй других лизосомалышх гидролаэ - арилсульфатази А и Ь (КФ 3.1.6.1), р-галактоэидази (КФ 3.2.1.23), р-глюкозидазы (КФ 3.2.1.21) р-глшурошдаш (КФ 3.2.1,31), p-w-ацатилглюкозаминидази (КФ 3.2.1.«')(')) микроштодами на основа ультрамикросистемы биохимичас-кого анализа (Покровский A.A., лрчаков А.И., 1958; Покровский A.A., Тутольян В.А., Кравченко Л.В., 1975). Активность папаина (КФ 3.4.Я2.2) определяли епектрсфлшриметрически с использованном в качеств суосграта м-бензоил-ои-арпшин-р-нафпшмина ("serva", ФРГ) при pH 6,0 в I М фосфатном буфере, содержащем 1,33 м,М ЭДТА и 0,18 мМ L-цистоина (Мосолов В.Б.,1583).

Полученные данные были подвергнуты статистической обработке и выражались как Mim. Степень достоверности выявленных различий мевд показателями оценивалась с использованием t-критерия Стыоденто.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. Исследование активности лизосомалышх гидролаз в печени, почках и селезенке крыс в условиях полного парентерального штакия

Зкспериметальная модель полного парентерального питания (ГШ) яв- ' ляется адекватной для изучения ¡юли лизосом в процессах клеточного штания, поскольку обеспечивает физиологические потребности организма в основных лицевых воинствах и вноргии и в то ко время продопре-

до.пяет утилизации макромолекул пуцЛшнто» ноиоеродстиоши на пяточном уровн». К концу эксперимента ма-эд! тело кинотных, находивши -ся в усдм-иях ПП'и рпутрих^лудочного питания (РКП), Сило ирокпИескн одинакова (ЖЖЗ г и ?Л7.'5 П, равно кяк приборка в кассе за гкспе -рнменталышй период, которая составила в обоих группах г. Пмост» с том, относительная масса печени и почек крыс, получивших ПП, была вкво на 24 и 36% соответственно, а относятс.инля масса сп,п«з»нки возрастала в 4,2 раза. Несмотря па различия в кассе указанных органов, концентрация белка в них была одинакова (печень - ?.0:Н5 и 202+2; почки - ?5Ь5 и ?.Б7*5; селезенка - 108*4 и 100- 2 для ПП и ВЖП, соответственно).

Результата проведенного унзимологического анализа свидительству-ют, что в печени крчо, получяпипх Ш1, существенно возрастала удельная ектигпооть катопсшюв А и о (на 68 и соотпетствэтю), тогда как активность глолешх нротеиназ и других лизосомалышх гилролпп изменялась незначительно (на ГЙ-255). В почках отмочено достоверное снижение удельной активности катепсинов В и С, а также р-гплактози-даза и р-^-ацетилглккозачитдазы. В отличие от печет!, удельная активность катепсинов А и о в почках кр.чс, получогаих ПП, не изменялась. В селезенке не выявлено значительных изменений в функциональном состоянии протеолитической системы лизосом. Исключение составлял г.а пышет В, удельная активность которого в условиях ПП возрастала на К-*. Наряду с этим октиьиэсть деяосомалытх гилролаз и арилсульфатаз А ¡1 В С!Ч'У<:'аеь на 17-35?.

Нг:-:коль"у гтнос«т.»липя касса псследуе^я органов крыс, нзхосот-"1 ус»-':.>?ЛХ Ш Ш, су^отпнно ОТ»",;!Ча.тг,!СЬ 1.*оапу ССЙСЙ, |ф4Д-сп" г.е."'согбрт!-'."! ср^мпт'-льпуп ецегау сутгарнсЛ

;;:тч .'.Н'.ос .'.'альных ГПЛКГ.ЧЗ в расчете па отюситед'ьчуо "ЗСС7

оргшш. Как видно из рис. I, в шчени крыо, получавших ПП, наиболее значимо - в 2 раза - возрастала суммарная активность катепсинов А и i;. с)то в равной марь относится и к роакции катепсинов А и о в почках, где суммарная активность данных ферментов возрастала на 45 и tai соответственно, тогда как суммарная активность тиоловых протеина'., напротив, снижалась на 13-44$. При подобной оценке влияния ПП üb a¡> тишюсть ллзосомалышх гадролаз привлекает шшмавие факт резко-.го ■ -- в 2,9 с,7 раза увеличения суммарной активности исследованных ttujwüiiioB в со Липецке. При этом, в отличие от печени и почак, наибольшее увеличении активности - в 6,7 раза - обнаружено для катеп-UÜHU Ь.

JtliH öOJk.u ПОЛНОЙ оценки CTpyiCTypHO-функционального С0СТ0Я1ШЯ ли-зосоыалыюго аппарата клеток печени и почек исследовали изменение ■уровня наседамонтируемой активности Лизосоыалышх гадролаз в отих органа* (табл. I)¿

Как видно,' при ПП в печени имеет место резкое увеличение активности всех лизосоиалышх гадролаз. Причиной этого мохзт быть как интенсивный' процесс гетерофагоцитоза, являющийся функциональным компо-buajrou клеточного шгшпш и сопровоздащийся активным образованием вторичных лизисом, так и нарушение структурной целостности мембран лизосом гешт.цитоь, поскольку гфи длительном ПП обнаруживают измэ-аьния ооада дольчатой структуры печени и жировую инфильтрацию гепа-тоцитов (|ижроыскиИ A.A., Крыстев Л.П., 1977; Порядков Л.Ф. и др., lüt¡3).

Таырм ооразом, fie ре ход организма на ЛП сопровоадается значительной 4yiL4iUu;iiaJii¿ioa перестройкой лизосомального аппарата, специфичной в üaüiinuuCTii от юшточной принадлежности. Можно полагать, что ь ре-ijyuKuaii клеточного питания при соалвнсироьшшом рационе

Гч ■. I . ■ ' ! ' • i ; f чпя як-;'лппоить j?.r;c.:c.v.í: -m:l¡,< г.тдрпл.у > г

(Л), п»> ги (Г) и по'!г..г: (В) izpijf. ncvr/'n'riix »;:pftiro р.ччмг)' 'T.'.Tr-i;;''..:. (n TÎ!'H'>.";■ /f".HIь-'j- мп-. -П т::;•: сп'ог нгг.дмиш !" и'.-.! "ч.'Лл ). 1 - 4 - :;тп'ИГ'.!!; А. - f ■. ' i :, Ü: ''i - ar^'ii-y.-iï А и Г.; f ; 7 ''-глм'.ур^пмяза;

>> !' т. !'■; '.-en .-рдич.тг - "Г;:,

:¡ •'('."• !П . {)• .'.) — ситг- TI.H-' :ги г-->г!П1Х о )'"!'.

наибольшую роль играют катепсюш А и d в печени и почках, тогда как изменение активности катепсина В в селезенке отражает особенности участия тиолових протешшз лизосом в реакциях ограниченного протео-лиза в иммунокомпетентшх органах (Локшина Л.А., Дилакян Э.А., 1985; Васильев A.B. и др., 1988, 1989).

Таблица I

Неседиментируемая активность ферментов лизосом печени и почэк при длительном парентеральном питании (в % от общей)

Исследуемые ферменты П е ч е н ь П о ч К и

Контроль j Опыт Контроль Опыт

Катепсин А 9,7*1,2 14,8*2,0 6,9*0,8 9,8*1,3

Катепсин В I0,3il,8 20,0*1,7* 12,5*1,1 24,4*7,1

Катепсин С 17,2*1,6 27,6*2,3* 3,20*0,21 2,72*0,19

Катепсин о 28,4*10,1 40,9*4,5 28,4*1,2 21,5*3,3

Арилсульфа-таза А и В I,27±0,I3 3,14*0,23* 11,5*0,7 9,0*0,5*

р-галактози-даза 11,7*0,5 I6,0tl,2* 37,5*2,1 30,9*3,4

ü-глюкурони-даза 6,07*0,5 10,4*0,6* 22,6*1,6 8,62*0,68*

p-N-ацетил- глюкозамшш- даза . 1 1,57*0,14 3,87*0,35* 12,4*1,6 9,64*1,03

Примечание Представлены средние (Iii«) данные из 8-10 определений; * - р < 0,05-0,01

- Ii -

2. Исследование активности лизоссмалыгых гидролаз в различных органах крыс при белковом голодании и введении метионина

В условиях белкового или полного голодания происходит активация процессов клеточного питания. Подобная активация лизосомелышх гидролаз рассматривается'как адаптивная реакция лизосомального аппарата, направленная на деструкцию наименее необходимых для жизнедеятельности клеток структурных макромолекул с последующей реутилизацией соответствующих мономеров на биосинтетические нужда. Известно, что в пэчени и скелетных мышцах крыс при белковой недостаточности и голодании имеют место роципрокныо отношения мекду катепсшами А, о и В, С, l, проявляющиеся активацией ферментов первой группы и снижением активности ферментов группы гаоловых протеияаз (Тутельян в.А., Васильев A.B., 1987; науазэ к. et ii,, 1?з4). Последнее может быть связано с дефицитом зн-групп, вызванным недостатком серусодермащих аминокислот, в связи с чем была предпринята попытка экспериментального подтверждения данного предположения.

Результаты ферментного анализа, представленные па рис. 2, свидетельствуют, что наиболее внракеннне изменения в активности лизосо-малъкых глптозидаз и арилсульфатаз А и В были выявлены в печени и скелета« мншцах. При чем, если в печени животных обеих экспериментальных груш оОнарукена достоверная активация арилоульфатэз А и В и р-м-ацотилглюкозачинидазы на 23-130%, то активность этих ферментов в скелетных мышцах составляла лишь 36-71$ от контрольного уровня. Напротив, активность р-глюклзндазы в скелетных мызцэх как у пшотннх, потреблявших оозбежовнй рчцион, так п безбелковый рацион, обогяфп-шй мотиошшом, резко увеличивалась по срэвнешго с контролем - 'в 2,5

Арнлсульфатаьы

тшЫ

- 12 -

галак'тозидаоа

?Ь Щ

1

¡1' >41.11

3 со 'К1:;1 шпа

1 тимус

ь ' С.'РЛПЧ

6 сколстцап

пияна

7 - ио'11' •

-гля'Позкдаза

(> -И - ЛцГ ■пиннпдаз.м

Светлые отод^шш -бсзоолконии рацион; Темные - 'езбслиосий рацион I и.:ГИОШШ.

I 7 1 4 *

Катепсин Л

Катепсин В

Катепсин С

1 » 1 * » » I

Катепсин I) ♦1

Катепсин Н

Катепсин .Ь

Гис.: 2. Активность лизосоыалышх гадролаз в разных органах крыс при 0е1пковом голодании ( в % от контроля).

и 1,9 раза, соответственно. Оценивая роакцию лизоссмалышх гидролаз данной группы, следует отметить, что поскольку изока.юрийпость бэз-бэлковых рационов обеспечивалась дополштолънын включек/ем в ого состав углеводного компонента, возрастите активности в печет арил-сульфатаз А и В я ß-N-ацотилглтозашшидйза мозшо рассматривать как адекватный ответ по увеличение интенсивности обмена гликодгагадов, в том числе и сульфоглюколппидсп (Покровский A.A., Тутальяи В.д., 1978; Барретт А.Дя., Ялт М.,1Э80). В свою очередь, ость основание расценивать изменение актизпосш р-галактозидазн в скелетных ¡,пддцах к моэго ¡сек реакцию из избатотасо и направленное в условиях белкового дефицита поступления в эти ткани глюкозы (Покровский A.A., 1974).

Особый интерес представляют данныэ исследования' функционального состояния протеолитической системы лизосом.- В втом случае можно отметить выроненные (презде всего в печэни и мышечной ткани) различия в изменении активности мояду группой тиоловых протеиназ - катопсинсв В, С, Н, l с одной стороны и катепсйнов А и d с другой. В подавляющем большинстве случаев активность тиоловых протеиназ лизосо.ч как при потреблении еивотннми безбелкового рациона, так и безбелкового рациона, обогащенного нетионином, существенно снихаэтся. Напротив, активность андопэптидазы - катепсина о и катвпсина А возрастала в среднем на 20-60$ при дефиците белка и снижалась при добавлении в безбэлховый рацион мэтионина. Мокло сказать, что в случае дефицита белка реакция протеиназ лизосом является типичной и согласуется с результатами, полученными ранее (Васильев A.B., Звягина О.П., 1973; Сото С.Х. И др., 1978; Hayase К. et al., 1984 )• ВМЭСТб С ТвМ, поскольку практически не было выявлено различий мэаду активностью тиоловых протеиназ в исследованных' органах у животных, потреблявших безбелковый рацион и рацион, обогащенный кэтиошшом, следует при-.

знать неправомерным предположение о том, что снижение активности тиоловых протеиназ лизосом при голодании и белковой недостаточности обусловлено дефицитом вн-групп (Васильев A.B., Звягина О.П., 1978; Сото С.Х., и др., 1978).

3. Исследование влияния вктиномицина d и циклогексимида на активность лизосомальных протеиназ в печени крыс

Предавствущие эксперименты позволили установить, что катепсин d-зависимый протеолиз активируется как в условиях ПП, так и белкового голоданля, тогда как изменение (угнетение) активности тиоловых протеиназ отмечено лишь в последнем случае и не зависит от концентрации вн-групп. Это дало основание предположить возможность регуляции лизосомальных протеиназ на различных этапах их биогенеза, поскольку не имеется сведений о существовании кофакторов для ферментов этой груп-ш.

Как видно из результатов, представленных в табл. 2, введение ак-пшомицина d вызывало в печени незначительное (на 25-37%) увеличение удельной активности лизосомальных протеиназ да«е при максимальной дозе препарата - 0,08 мг/100 г м.т. Учитывая токсический эффект ак-тиномицина о, приводящий к уменьшению массы тела на 2056 (р < 0,05), представлялось целесообразным проанализировать суммарную активность лизосомальных протеиназ, рассчитанную на относительную массу органа, после чего стало ясно, что ектиномицин d практически не влияет на активность протеиназ лизосом в печени. В то же время, из результатов рздкоизотопного исследования (табл. 3) следует, что .на фоне введения актиномицшш D (т.е. ингибирования Сиогаштеза MFHK), о чем ььиде-тельствует снижение степени включения ?Н-уридина в печень, отмочоно

Таблица 2

Активность лизосоыальнкх протеиназ в печени при введении . актиномицина D и циклогекеимида (шаюль/ыин/г белка)

Условия Катепсин

экспери- j------!-----,-----1-----г--------г

мента , А . } В j С j d j H j

Арилсульйатаза А и Б

Акткношщин D

Контроль 18,8*1,17 17,3-0,53 42,4*1,17 17,6*0,47 0,063±0,007 0,866*0,01 9,10*0,28

0,04 мг . ■ актиномицина

на 100 г „ . . . ' j. * *

массы тела 22,7*1,14* .18,6*0,79 38,0*1,63 14,7*0,55* 0,033*0,002* 0,784*0,041 8,63*0,30

О,CS мг актиномицина

на 100 г- , ' . 1С j. . v 1

массы тела 21,3*1,37 23,8*1,61х у 39,4*1,18 24,1*1,23* 0,052*0,004 1,12*0,04* 9,40*0,23 Циклогекейцид

Контроль 12,6*0,89 21,5*4,06 44,3*2,34 18,9*0,97 0,094*0,018 1,39*0,02 -7,25*0,210

0,2 кг ,

пиклогексиыида

массы°тела '4,52*0,38х 11,7*0,196* 16,95*0,92" 14,6*0,91х 0,025*0,002* 0,813*0,013* 6,92*0,176 0,4 кг

циклогекеимида

up TQ^ т*

касса"тела 2,03*0,14* 10,6*0,19х 12,0*0,43* 10,5*0,44* 0,013*0,001* 0,682*0,02* 5,74*0,190*

Приыечализ. Представлены средние (М*о ) данные из 8-10 определений; х - р < 0,05-0,01

Таблица 3

j;iíTnKCiis::.0CTb гк.тзчс:п:я предгеотЕзккикзЕ синтеза белка и нуклежовж кислот при ВГСДЗН!« йкт;п:ося-л:на D и цкялггоксимида (ггг ка ICO г кагсн тела)

Ус л ори я.

Контроль 0,04 кг

с,се иг

ТХУ-сса^дг9!'йл радиоактивность

^rl- у р и д и н j С-г!!дролятат белка

944±36 717±23:'4

ocs^-5

ТХУ-нзосахдаеная радиоактивность

%-у р и Д и н р^С-гидрэлиэа? белка

1У

1У

С21±23 547±22

478-20*

301-II

529-25х

544^12х

I93±II 0,63-0,02 3,40±0,19 0.3S±0,0I 2,35±0,0S 27I-I855 0,95-0,03х 4,45±0,2IK 0,57±0,02s 2,96±0,09*

29IÍI7* 0,93-0,04'" 4,о6±0,2Сх 1,07±0,07и 5,90±0,39*

14С-у

р и к и н

!"Н-л е Я ц и н !

14С-у

•У р И д я н

е Я ц и н

ЦИКЛ0ГСКСИ?!ЯД

Контроль 0,2 !!Г 0,4 мг

24,07^1,23 16,10^1,12. I6S±I0 I23±I0 0,52±0,05 2,95±0,30 I,2I±0,09 6,8I±0,4I 25,85-1,^2 18,90-0¡69 147+9 114-10 0,57±0,04 3,2S±0,22 I,84±0,09K I0,26±0,37s 27,53-0,99х 25,02-0,84х П7±Ю* 6I±8K 0,55±0,02K 3,98±0,25H 1,55*0,06* 9,0S±0,35*

Пргсстаггенн средние (1!± м) данное из 8-10 определений; I -Dpü/r белка х Ю3; П -ЗрМ/на стнзсит^яьнув ыассу органа у I0J; С -Dp',1 в С от обзегоЭрМ на г белка; I" -Dp'.í в * от sírtre d?M на г ткали; ч - р <, 0,05-0,01

П

I

достоверное увеличение 14С-аштокислот в 'ГО-нерастворимую фракции (сухарная индукция рибосомального сайта биосинтеза бежа на ршти». стадиях ингибирования элонгации и транскрипции является закономерной) (Endo у., 1934). Таким образом сопоставление данных, ен5нма-тичасксго и радиоизотошшх исследований позволяет сделрть вывод, чти регуляция активности лизосомалышх протеиназ осуществляется независимо от процессов-транскрипция.

Введение циклогексииида приводило к резкому - в 2-2,5 раза сншл нив как удельной так и суммарной активности всех исследованных про теиназ'лазосом. Существенно, что активность других лизосомалышх гидролаз - арнлсульфатаз А и В, как и в случае введения акганог.ыцииа о практически не изменялась. О степени ингибирования внутрикх.о'гочш, го протеолиза свидетельствует в дозозависикоэ снихенио урсыш тху -неосаадаемой радиоактивности. Ыожно заключить, что звено биосинтеза белка на уровне трансляции является рэгуляторным для протеолигнчискт ферментов лизосом. Аналогичные результаты бшги получены я при вчш бировашш биосинтеза белка Т-2 ТОКСИНОМ (Kr»vehBnl:o L.V. *t »1., 1<?вз). На специфичность регуляции ферментов лизосом этой группы yitu зывают данные об отсутствии изменений активности арнлсульфатаз а и В. Подобный феномен обусловлен, по-видимому, коротким периодом гюлу агзни протеиназ лизосом по сравнению с другими лизосомальшн.! tv.;u»'

лазали (Temeitor» L. »t »1., 1979| B»cchlno f. et al., 19Ш).

4. Исследование активности ендогешшх ингибиторов тш s ut протеиназ в печени крыс при белковом голодании

Анализ результатов проведанных исследований дм оснований счи тать, что при белковом голодании oyaiacTBemiyn роль в регуляции <5а-

ланоа протоолитичоской активности лизосом могут играть эндогенные ингибиторы тиоловых иротоинаэ. Для проверки этого продпологюгая из ппчени крыс на основе ранее предложенных методов (ниario и. <?t ai. i9Bi) выделяли в нашей модификации (см.схему) суммарную фракцию термо-.кислотостабилышх ингибиторов тиоловых протеиназ лизосом из печени крыс. Тестировалась разработанным нами способом по инактивации патюина, явллицагося структурным аналогом катапелша В (рис.3).

Как видно из рис. 4, содержание впвотных в течение Б дней на безболковом рационе приводило к уволичэшда ингибиторной активности в ?. раза. Введение животным на фоне безбелкового рациона мотиошша не вызывало значимых изменений в уровне ингибиторной активности, тогда как введение цистсина увеличивало активность ингибиторов на 20-25Í. При белковом голодании в течение 15 дней существенных, изменений в уровне ингибиторной активности у хзшотсшх, получавших болболкошй рацион и Сезбелковнй рацион на фопе введения мзтионкна, выявлено не было (rio сравнению с б-дневннм периодом). Вместе с тем ингибиторыая активность препарата, полученного от ¡кивотных, которым вводили цис-теин, возрастала по сравнению с контролем и б-дневнш периодом в 6-3 раз и в 3-4 раза, соответственно (рис. з).

Поскольку оценка суммарной ингибиторной активности тестировалась по панаину, что не позволяло судить о-специфичности икгабяропания отдельных тиоловых протеиназ, на гомогенате шчепп кнтзктних крыс проводили дополнительную оценку уровня ингибиторной активности отно -сителько катепсинов Bul, концентрация которых по сраппшга с друш-кл ф^рузнтачи этой груши наиболее высока в геччщ (KírecMc н. et к1., НШ). Было установлено, что взноольк»»? сродство к вих •■.".•»нчач кнпШторьу кроявля-»т k&toucrh В, причем характер ого ига-к^м-ши» qess ясс&сокягьк. групп иаогиах был аналогичен инпгпрот.гмь:." на-

tivtk »идкдитя гчщстишх птсичм и тшфя.ш-и'Иt«ix> ипг.ц-ьгогчп: дпсп-шюпых ни-тишл'1 и.ч нкчыш кии:

I. «ГЙГОТОВЛМШК 1КЛ11Ш1Х ГОЖНКПЛТО:,' ИЛ ЛиДЦСП С1ТДК IWiTfK'Wrai'OBAIMK о: ПИ П.-™ (Kiuuú ог./мин. l¿ ишцт) "i. ДОЬКЙЫШИ pH ОЛШГНАТЛИТА до 2,5 С ПОМОЩЬЮ i> N Hill

4. Hftl'PEBAlttîS РАСТВОРА IIA ВОДЯНОЙ HAHR (HO®C, (О минут)

5. ОХЛАЖДЕНИЙ СУСИКНЯИИ И ДОВЕДЕНИЕ pli ДО ь,0 г: ]li>M;i!l¡I.K)

6 M НиОН

6. ЦЕНТРИИГИРОВАНИВ РАСТВОРА (37Ь00 об/иин, Ы) минут)

7. МОШ1Ы1АЯ СУШКА СУНЕРПАТАН'ГА

D

" < " UÍ)

"1" 1.-.Í)

il)

1*110.3. Зависимость активности папаиня от количеств.-! ферненг;! и npof,¿. По оси ординат - % флуоресценции; по оси аСсцисс -количество Ф'фш.птп, ыкг/ил. I - лктнрность папин;) в отсутствие uiirnCinopj; '?. - активность папг:ина при дсОнплснлн IQ мил aiU'HOuTopt*. ■

Б

Рис. 4. Зашеимость активности намина от количество добавляемого шггибиторя. По оои ординат - % флуорссцошии, но оси абсщт.г: - количрстпо ингибитора, мл. А - продолтатвпмгооть лип ты 5 дней, Б - нродолгатрлыпоть дигти 1Г, дной. I - йозболковои диото с дплаилмшем иистпчня, Г. - ОсзАсдковая диото, 3 - ОезОалчоиля дш;та о добзытиис.м «отиошшл, 4 - контроль.

И '4 * ~

а- 5 я - * : *

1Ш ЛИ

/

¡1/ *

* V.

л X

Г ■ 'АО

"1 "" «Ь

А

л ■ и -

1ш

......* -

1

— а— и .5

N - -К----

Б

Рис.5. Зависимость активности папаика от количества фермента в пробе при добавлении ингибитора. По оси ординат - % флуоресценции• по оси абсцисс - количество фермента, икг/мл. А - продолжительность диоти - 5 дней, В - продолжительность диоти - 15 дней. I - контроль без ингибитора, 2-лсаОс.пкоиая диета с добавлением метионмна, 3 -контроль с шггипнторсм,4- брзбелковпя дизта,5 .- безбелковая диета с добши!Р)шси щютеина.

4

шина, а уровень активности катепсина В в печени находился в обратной зависимости от ингибиторной активности полученных препаратов.

Таким образом полученные результаты дают основание считать, что при белковом голодании регуляция активности катепсина В в печени обусловлена изменением увеличения содержания специфических ингибиторов и частичным переходом фермента в "депонированную" форму. Можно полагать, что введение цистеина на фоне его дефицита стимулирует биосинтез эндогенных ингибиторов, поскольку цистеин является необходимым компонентом функциональных участков ингибитора, взаимодействующих С аКТИВНЫМ Центром КаТвПСИНа В (Turk v. st «1., 1985).

В свою очередь, активации катепсинов А и о при белковом голодании следует расценивать не как результат индукции их синтеза da novo, а как следствие перехода этих ферментов в более активную форму. Для катепсина d эндогенные ингибиторы животного происхоадения в настоящее время не идентифицированы, однако полученные данные указывают на принципиальную возможность их существования.

ВЫВОДЫ

1. Впервые установлено, что при индукции процессов клеточного питания, обусловленной переводом животных на полное сбалансированное парентеральное питание, имеет место активация системы катепсин-D-зависимого лизосомального протеолиза в печени и почках, выражающаяся в увеличении в 2 раза активности катепсина о и его синергиста катепсина А.

2. При индукции процессов клеточного питания, обусловленной переходом организма на эндогенное питание в условиях белкового голодания, в печени, почках, сердце, скелетных мышцах и мозге крыс выявлена активация катепсинов А и D (на 20-60%) и снижение активности катепсинов

l, В, С, Н. Обогащению рациона метионином приводило к нормализации активности катепсинов А и d, но не влияло на активность тиоловых протеиназ.

3. Впервые установлено, что шгибированиэ биосинтеза белка на уровне трансляции приводит к резкому - в 2-2,6 раза снижению активности всех исследованных протеиназ лизосом, тогда как ингибироваяие биосинтеза белка на уровне транскрипции не вызывает изменений активности ферментов данной группы.

4. Разработана схема выделения суммарной фракции терло,- кислото-стабильных ингибиторов тиоловых протеиназ лизосом из печени крыс, характеризующейся высокой специфичностью к катепсину В.

5. Впервые установлено, что в условиях белкового голодания уровень активности тиоловых протеиназ лизосом в печени крыс регулируется их ввдогенными ингибиторами.

6. Результаты исследования свидетельствуют, что помимо посттраяс-ляционного процессинга существуют два различных механизма регуляции протзиназ лизосом: срочный механизм, регуляции эндогенными ингибиторами и регуляция активности ферментов этой группы на уровне трансля-. ции.

СПИСОК РА60Т, ОПУбЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Брегвадзе Н. с.Влияние метионииа на активность лизосомальных ферментов в различных органах крыс на фоне белкового голодания.// Тезисы докладов ХУШ Республиканской научной конференции молодых медиков Грузии. - Тбилиси, 1989, с.ПО.

2. Васильев A.B., Брегвадзе Н.С., Тутальян В.А. ДОвоаачалькмв гядролазы различных органов крыс в процессах клеточного пита-

НЛЯ./ТВопр.МЭД.хшки. - 1990. - т.36.- Ji 4. - С.45-47.

3. Васильев А.В., Е5рогвадзэ Н.С., Порядков Л.О., Тугельян В.А. Протеоллтическая активность лизосом в различных органах крыс

в условиях полного парентерального питания.//Вопр.под.химии. -1990. - Т.36. - JG 4. - С.51-63.

4. Врогг.адзэ Н.С. Голь лизосомшис протоишз в реализации клеточного питания. - Тезисы докладов XIX Республиканской научной конференции молодых медиков Грузии. - Тбилиси, 1990, с.152.

Б. Bragvadia N.D., Dankova Т.О., Vaallyov A.V. Effsct of protein •starvation and addition oi cysteine and methionine on enrioga--пзив inhibition of lysosomal thiol protaaaso.//Mrcheniurn and regulation of intracellular protein catabollum. Abstracts. -Budaper.t, Hungary, 1995?, p. 44.