Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование экспрессии генов нейротрофических факторов человека в трансгенных линиях дрозофил

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ефанов, Алексей Александрович

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

Ы.Трансгенные животные как экспериментальная модель 7 изучения генной экспрессии.

1.1.1. Использование трансгенеза в решении проблем генетики развития.

1.1.2. Трансгенные Drosophila.

1.1.3. Гены Notch и Delta.

1.2. Векторы для клонирования в клетках насекомых.

1.2.1. Использование бакуловирусов для экспрессии чужеродных генов в 13 клетках насекомых.

1.2.1.1. Посттрансляционная модификация в клетках насекомых

1.2.2.Использование Р-элементов для экспресии чужеродных генов 14 в клетках насекомых.

1.2.2.1 .Общая характеристика Р-элементов Drosophila.

1.2.2.2.Векторы Карнеги.

1.2.2.3. Вектор Карнеги 20.

1.2.2.4. Вектор CaSpeR.

1.2.2.5. Вектор рРА-I с геном Adh.

1.2.2.6. Вектор pUChsneo.

1.2.2.7. Плазмиды-помощники.

1.3. Нейротрофические факторы.

1.3.1. Общая характеристика нейротрофических факторов.

1.3.2. Нейротрофические факторы суперсемейства TGF-p.

1.3.2.1. Характеристика нейротрофических факторов суперсемейства TGF-p.

1.3.2.2. Рецепторы нейротрофических факторов суперсемейства TGF-p.

1.3.2.3. Биологические эффекты нуль-мутаций лигандов и рецепторов семейства 25 GDNF.

1.3.2.4. Сигнальный каскад Ret.

1.3.2.5. Эффект GDNF в культурах клеток и тканей. 32 1.3.2.6.3ащитные и восстановительные свойства GDNF.

1.3.3.Фактор роста нервов. 35 1.3.3.1.Характеристика фактора роста нервов.

1.3.3.2. Сигнальные каскады, вызываемые NGF

1.3.3.2.1 .Характеристика сигнальных каскадов, вызываемых NGF.

1.3.3.2.2. Ras-MAPK киназный путь. 37 1.3.3.2.2.1. Генная экспрессия: немедленно ранние гены. 39 1.3.3.2.2.2.Экспрессия задержанно-ранних генов. 40 1.3.3.2.2.3.Фосфолипазный путь.

1.3.3.2.3. Ras-независимые сигнальные пути.

1.3.3.2.4. Нейротрофиновый р75 рецептор.

1.3.4.Нейротрофический фактор мозга (BDNF). 43 1.3.4.1 .Общая характеристика нейротрофического фактора мозга.

1.3.4.2.Исследование мышей, нокаутированных по гену BDNF.

1.3.4.3. Внутриклеточные каскады, активируемые BDNF.

1.3.5. Перспективы использования нейротрофических факторов в 46 лечении болезни Паркинсона.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1.Ферменты и реактивы.

2.2. Конструкции.

2.3.Приготовление компетентных клеток.

2.4.Трансформация Е. coli.

2.5. Выделение плазмидной ДНК из Е. coli.

2.6. Метод инъекций.

2.7. Выведение линий.

2.8. Контроль наличия вставки (блот-гибридизация по Саузерну).

2.8.1. Выделение хромосомной ДНК.

2.8.2. Рестрикция хромосомной ДНК.

2.8.3. Гель-электрофорез ДНК.

2.8.4. Перенос ДНК на фильтр.

2.8.5. Приготовление меченого зонда.

2.8.6. Гибридизация.

2.9. Контроль экспрессии (Нозерн блот-гибридизация).

2.9.1. Выделение тотальной РНК.

2.9.2. Гель - электрофорез РНК.

2.9.3. Перенос.

2.9.4.Гибридизация.

2.10. Гибридизация in situ на целых эмбрионах.

2.10.1. Приготовление меченого зонда.

2.10.2. Сбор и фиксация эмбрионов.

2.10.3. Подготовка эмбрионов к гибридизации.

2.10.4. Гибридизация.

2.10.5. Предадсорбция антител.

2.10.6. Отмывка гибридизации и обработка антителами.

2.10.7. Окрашивание.

2.11. Гибридизация in situ на срезах.

2.12. Вестернблоттинг.

2.12.1. Получение белковых лизатов.

2.12.2. Фракционирование белков в полиакриламидном геле.

2.12.3. Имунноблоттинг.

2.12.4. Имуннодетекция.

2.13. Иммуногистохимическое окрашивание на тирозингидроксилазу 70 и глиальный фибрилярный кислый белок.

2.14. Окрашивание X-gal.

Глава 3. Результаты.

Глава 4. Обсуждение результатов. 84 Выводы. 89 Список литературы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование экспрессии генов нейротрофических факторов человека в трансгенных линиях дрозофил"

В последние годы все больше внимания уделяется использованию достижений фундаментальной науки в прикладных целях. Реализации этой задачи посвящены, в частности, исследования в области клеточной и генной терапии. Одним из важных аспектов работ такого рода является синтез генно-инженерных конструкций и подбор подходящих промоторов, которые обеспечили бы активное функционирование таких конструкций в мозге млекопитающих и человека. Недавно было показано, что ряд репортерных генов успешно функционируют в ксенотрансплантатах нейральных производных дрозофилы в мозге грызунов, будучи поставленными под промотор белка теплового шока дрозофилы (Корочкин, 2000; Александрова и др., 2000). Этому способствует то обстоятельство, что температура тела млекопитающих является шоковой для дрозофилы, и, естественно, что, попав в такие условия клетки дрозофилы'будут реагировать адекватным образом.

Встает вопрос - а как будут себя вести гены, кодирующие нейротрофические факторы человека, соединенные в генно-инженерном конструкте с хит-шоковым промотором дрозофилы? Если результаты будут положительными, можно будет думать об использовании этих промоторов в генной и клеточной терапии.

На первом этапе этой работы, проводимой в лаборатории нейрогенетики ИБГ РАН и в лаборатории молекулярной биологии ИБР РАН им. Н.К.Кольцова, требовалось проверить, будут ли "работать" гены человека под промотором гена теплового шока дрозофилы как в условиях развивающегося организма мухи под влиянием теплового шока, так и при помещении трансформированных клеток дрозофилы в мозг млекопитающих, т.е. в температурные условия, хит-шоковые для мухи.

Перед нами была поставлена задача осуществления именно этой проверки с целью подготовки проведения прямых генно-тералевтических экспериментов на животных. Работа облегчалась наличием хорошо разработанной экспериментальной модели, используемой нашими лабораториями совместно с лабораторией М. А.Александровой.

Прежде чем приступить к изложению материалов диссертации, считаю своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность всем, без кого эта работа была бы невозможной. Я признателен научным руководителям член-корреспонденту, д.м.н. проф. Корочкину Л.И. и к.б.н. Павловой Г.В. Особую благодарность следует выразить к.б.н. Мерцалову И.Б., к.б.н. Башкирову В.Н., Модестовой Е.А, к.б.н. Ревищину А.В. за ценные консультации и методические советы. Хочу выразить признательность сотрудникам Института белка Гиоевой Ф.К. и Дерябиной О. А. за любезно предоставленную возможность исследовать экспрессию гена ngf методом Вестерн- блоттинга в их лаборатории.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Ефанов, Алексей Александрович

Выводы.

1. Получены три линии D.melanogaster-r8, Г7 и СЗ содержащие нейротрофические гены человека ngf, bdnf и gdnf соответственно под хит-шоковым промотором.

2. Получены три гомозиготные линии содержащие соответствующий трансген, мутантный ген Delta и lac Z. Г7-1М (bdnf, Delta, lac Z), Г8-1М (ngf, Delta, lac Z), C3-1M (gdnf, Delta, lacZ).

3. В результате блот-гибридизации по Саузерну в линиях Г7иСЗ были выявлены фрагменты длиной 3500 нуклеотидов. В линии Г8 был выявлен фрагмент длиной 1300 нуклеотидов.

4. Проведен молекулярный анализ полученных линий, в результате которого было показано, что гены нейротрофических факторов человека активно транскрибируются под влиянием теплового шока. С помощью блот-гибридизации по Нозерну на разных стадиях развития выявлена индуцированная экспрессия гена gdnf на эмбриональной и личиночной стадиях, но не у взрослых мух, что позволяет предположить, что активность трансгенов под heat-шокоъъш промотором регулируется на разных этапах развития различными факторами.

5. Сигналы инициации транскрипции, по крайне мере для генов gdnf и bdnf, заключены не в кодирующей области, т.к. у дрозофилы нет аналогов генов gdnf и bdnf

6. Показано, что ген gdnf человека под //еаг-шоковым промотором D.melanogaster транскрибируется в центральной нервной системе эмбрионов в головном и торакальном ганглиях, ngf - в головном ганглии, a bdnf транскрибируется по всей поверхности эмбриона равномерно.

7. Ген gdnf человека экспрессируется в трансплантированных эмбриональных нервных клетках линии СЗ-1М в мозг крысы. Это свидетельствует о том, что несмотря на то, что эмбриональные нервные клетки дрозофилы попадают в принципиально иное микроокружение в результате трансплантации, ген gdnf способен экспрессироваться при действии heat-шоковой для дрозофилы температуры тела млекопитающих.

8. Эмбриональные нервные клетки линии СЗ-1М(gdnf) значительно усиливают васкуляризацию неокортикальных аллотрансплантатов крыс при их совместной трансплантации, а также стимулируют рост аллотрансплантата. Вероятно, GDNF может влиять на развитие сосудов и способствовать их усиленному росту. Можно предполагать, что стимуляция роста аллотрансплантата может быть отражением нейропротективной функции GDNF, в результате чего сохраняется значительная часть тех клеток, которые погибли бы в результате генетически прогамированной гибели-апоптоза.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ефанов, Алексей Александрович, Москва

1. Гилберт С., Биология развития.// Москва. Мир. 1995. т.З.

2. Гловер Д., Клонирование ДНК. Методы.// Москва. Мир. 1988.

3. Корчкин Л.И., Михайлов А.Т., Введение в нейрогенетику.// Москва. Наука. 2000.

4. Корочкин Л.И., Новые подходы в генетике развития и генотерапии: ксенотрансплантацияэмбриональных нервных клеток дрозофилы в мозг позвоночных животных.// Генетика.2000. 36(11). 1436-1442.

5. Красильников М.А., Сигнальные пути, регулируемые фосфатидилинозит-3-киназой и их значение для роста, выживаемости и злокачественной трансформации клеток.// Биохимия. 2000. 65(1). 68-78.

6. Пирротта В., Проблемы трансформации клеток млекопитающих.// Москва. Мир. 1987.

7. Потеряев Д.А., Саарма М., Семейство GDNF: от нейротрофических факторов к онкогенезу.

8. Молекулярная биология. 2001. 35(2). 309-320.

9. Сингер М., Берг П., Гены и геномы.// Москва. Мир. 1998. т.2.

10. Степанов В.М., Молекулярная биология.// Москва. Высшая школа. 1996.

11. Татосян А.Г., Мизенина О. А., Киназы семейства Srs: структура и функции.// Биохимия.2000. 65(1). 57-67.

12. Alessi DR., Saito Y., Campbell DG., Cohen P., Sithanandam G., et al., Identification of the sites in MAP kinase kinase-1 phosphorylated by p74raf-l.// EMBOJ. 1994. 13. 1610-1619.

13. Bannor M. J., Goedert M., Williamas В., The possible relationship of glutathione, melanin and l-Methyl-4-Phenyl-l,2,3,6-Tetrahydropyridine (MPTP) to Parkinson's Disease.// Biochem.

14. Pharmacol. 1984. 33. 2697-2698.

15. Bar-Sagi D., Feramisco JR., Microinjection of the ras oncogene protein into PC12 induces morphologic differentiation.// Cell .1985. 42. 841-848.

16. Beck KD„ Valverde J., Alexi Т., Poulsen K., Moffar В., Vandlen R. A., Rosenthal A., Hefti F., Mesencefalic dopaminergic neurons protected by GDNF from axotonomy-induced degeneration in the adult brain.// Nature. 1995. 373. 339-341.

17. Bonni A., Ginty D., Dudek H., Greenberg M., Serine 133-phosphorylated CREB induces transcription via a cooperative mechanism that may confer specificity to neurotrophin signals.// Mol. Cell Neurosci. 1995. 6. 168-183.

18. Boydston W.R., Sohal G. S., Grafting of additional periphery reduces embryonic loss of neurons.// Brain Research. 1979. 178. 403-410.

19. Chen RH., Sarnecki C., Blenis J., Nuclear localization and regulation of erk and rsk-encoded protein kinases.// Mol. Cell.Biol. 1992. 12. 915-927.

20. Choi-Lundberg D.L., Lin Q., Chang Y.-N., Chiang Y.L., Hay C.M., Mohajeri H., Davidson B. L., Bohn M. C., Dopaminergic neurons protected from degeneration by GDNF gene therapy.// Science. 1997. 275. 838-841.

21. Cohen G., Ren R., Baltimore D., Modular binding domains in signal transduction proteins.// Cell 1995. 80. 237-248.

22. Cohen G.,The pathobiology of Parkinson's Disease : biochemical aspects of dopamine neuron senescence.// J. Neural. Transm. Suppl. 1983. 19. 89-103.

23. Copeland N.G., Zelenetz A.D., Cooper G. M., Transformation ofNIH/ЗТЗ cells by DNA of Raus sarcoma virus.// Cell. 1979. 17. 993-1002.

24. Cowley S., Paterson H., Kemp P., Marshall C., Activation of MAP kinase kinase is necessary and sufficient for PC12 differentiation and for transformation of NIH 3T3 cells.// Cell. 1994. 77. 841852.

25. Dexter D. Т., Carter C. J., Wells F. R., Javoy-Agid P., Lees A. J., Jenner P., Marsden C.D., Basal lipid peroxidation in substantia nigra is increased in Parkinson's Disease.// J. Neurochem. 1989. 52. 381-389.

26. Dexter D. Т., Carayon A., Vidailhet M., Ruberg M., Agid P., Agid Y., Less A., Wells F. R., Marsden C. D., Decreased ferritin levels in brain in Parkinson's Disease.// J. Neurochem. 1990. 55. 16-20.

27. Diederich RJ., Matsuno K., Hing H., Artavanis-Tsakonas S., Cytosolic interaction between deltex and Notch ankyrin repeats implicates deltex in the Notch signaling pathway.// Development. 1994. 120. 473-481.

28. Ret/ptc2.// Mol Cell Biol. 1998. 18.2298-2308.

29. Ernfors P., Kucera J., Lee K., Loring J., Jaeniseh R., Studies on the physiolodical role of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 in knockout mice.// J.Dev.Biol. 1995. 39. 799807.

30. Ferrante R.J., Hantraye P., Brouillet E., Beal M. F., Increased nitrotyrosine immunoreactivity substantia nigra neurons in MPTP treated baboons is blocked by inhibition of neuronal nitric oxide synthase.// Brain Research. 1999. 823. 177-182.

31. Ginty DD., Bonni A., Greenberg ME., Nerve growth factor activates a ras-dependent protein kinase that stimulates c-fos transcription via phosphorylation of CREB.// Cell. 1994. 77. 713725.

32. Goldberg D., Posakony J., Maniatis Т., Correct developmental expression of a cloned alcoholdehydrogenase gene transducted into Drosophila germ line cells.// Cell. 1983. 34. 59-73.

33. Graham D. G., Oxidation pathways for catecholamines in the genesis of neuromelanin andcytotoxic quinones.// Mol. Pharmacol. 1978. 14. 633-643.

34. Greene L., Tischler A., PC 12 pheochromocytoma cultures in neurobiologicalresearch.// Adv. Cell. Neurobiol. 1982. 3. 373-414.

35. Hiwasa Т., Kondo K., Hishiki Т., Koshizawa S., Umezawa K., Nakagawara A., GDNF-induced neurite formation was stimulated by protein kinase inhibitors and supressed by Ras inhibitors.// Neurosci Lett. 1997. 238.115-118.

36. Hoffer В .J., Hoffman A., Bowenkamp K., Huettl P., Hudson J., Martin D., Lin L.F., Gerhardt G.A., Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo.//Neurosci Lett. 1994. 182. 107-111.

37. Jenner P., Schapira A. H. V., Marsnden C. D., New insights into the cause of Parkinson's Disease.// J. Neurochem. 1992. 42. 2241-2250.

38. Jing S., Tapley P., Barbacid M., Nerve growth factor mediates signal transduction through trk homodimer receptors.// Neuron. 1992. 9.1067-1079.

39. Johnston SH., Rauskolb C., Wilson R., Prabhakaran В., Irvine KD., Vogt TF., A family of mammalian Fringe genes implicated in boundary determination and the Notch pathway.// Development. 1997. 124. 2245-2254.

40. Kawamoto Y., Nakamura S., Kawamato Т., Akiguchi I., Kimura J., Cellular localization of brain-derived neurotrophic factor-like immunoreactivity in adult monkey brain.// Brain re seach. 1999. 381. 341-349.

41. Kearns С. M., Gash D. M., GDNF protects nigral dopamine neurons against 6- hydroxydopamine in vivo.// Brain Res. 1995. 672. 104-111.

42. Kolch W., Heidecker G., Kochs G., Hummel R., Vahidi H., Mischak H., Finkenzeller G., Marme D., Rapp U.R., Protein kinase Ca activates RAF-1 by direct phosphorylation.// Nature. 1993. 364. 249- 252.

43. Mann D. M. A., Yates P. 0., Possible role of neuromelanin in the pathogenesis of Parkinson's Disease.//Mech. Ageing Deu. 1983.21. 193-203.

44. March HN., Scholz WK., Lamballe F., Klein R., Nanduri V., et al., Signal transduction events mediated by the BDNF receptor gpl45(trkB) in primary hippocampal pyramidal cell culture.// J. Neurosci. 1993. 13. 4281-4292.

45. Maxwell G.D., Reid K., Elefanty A., Bartlett P.F., Murphy M., Glial cell line derived neurotrophic factor promotes the development of adrenergic neurons in mouse neural crest cultures.// Proc Natl Acad Sci USA. 1996. 93.13274-13279.

46. Middlemas DS., Meisenhelder J., Hunter Т., Identification of TrkB autophosphorylation sites and evidence that phospholipase C-gamma 1 is a substrate of the TrkB receptor.// J. Biol. Chem. 1994. 269. 5458-5466.

47. Panin VM., Papayannopoulos V., Wilson R., Irvine KD., Fringe modulates Notch-ligand interactions.// Nature. 1997. 387. 908-912.

48. Payne D., Rossamondo A., Martino P., Erickson A., Her J., et al., Identification of the regulatory phosphorylation sites in pp42/Mitogen-activated protein kinase (MAP Kinase).// EMBO J. 1991. 10. 885-892.

49. Perry T. L., Godin D. A., Hansen S., Parkinson's Disease: A disorder due to nigral glutathione deficiency?// Neurosci. Lett. 1982. 33. 305-310.

50. Price M.L., Hoffer В .J., Granholm A.C., Effects of GDNF on fetal septal forebrain transplants in oculo.fi Exptl Neurol. 1996. 141(2). 181-189.

51. Rabizadeh S., Oh J., Zhong LT., Yang J., Bitler СМ., et al., Induction of apoptosis by the low-affinity NGF receptor.// Science. 1993. 261. 345-348.

52. Rodgers A. D., Curzon G., Melanin formation by human brain in vitro.// J. Neurochem. 1975. 24. 1123-1129.

53. Rosengren E., Linder-Eliasson E., Carlsson A., Detection of 5-S-cysteinyldopamine in human brain.// J. Neural Transm. 1985. 63.247-261.

54. Rodriguez-Tebar A., Dechant G., Gotz R., Barde YA., Binding of neurotrophin-3 to its neuronal receptors and interactions with nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor.// EMBO J. 1992.11. 917-922.

55. Rodriguez-Tebar A., Dechant G., Barde YA., Binding of brain-derived neurotrophic factor hin-3 to nerve growth factor receptor.// Neuron. 1990. 4. 487-492.

56. Rubin G. M., Spradling A. C., Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.// Science. 1982. 218. 348-353.

57. Saveliev S., Lebedev V., Voronov K., Korochkin L., Histological analysis of autopsy after transplantation of xenogenic and fetal neural tissue.// 8th Internat. Congress of the Czech and Slovak Neurochemical Soc. Martin. 1996. 140-141.

58. Saveliev S., Evgenev M., Lebedev V., Korochkin L., Drosophila nerve cells survive and differentiate in amphibian and mammals brain // Internat. J. Development. Biol. 1997. 41. 801808.

59. Sengstock G. J., Olanow C. W., Dunn A. J., Arendash G. W., Iron induces degeneration of nigrostriatal neurons.// Brain Res. Bull. 1992. 28. 645-649.

60. Smith C., Farrah Т., Goodwin R., The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins: activation, costimulation and death.// Cell. 1994. 76. 959-962.

61. Sofic E., Riederer P., Heisen H., Bechmann H., Reynolds G.P., Habenstreit G., Youdim, M. B. H., Increased iron (Ш) and total iron content in postmortem substantia nigra in parkinsonian brains.// J. Neural Transm. 1988. 74. 199-205.

62. Stephens RD., Loeb D., Copeland Т., Pawson Т., Greene L., Kaplan D., Trk receptors use redundant signal transduction pathways involving SHC and PLC gamma 1 to mediate NGF responses. // Neuron. 1994. 12. 691-705.

63. Treisman R., The serum response element. // Trends Biochem. Sci. 1992. 17. 423-426. Treisman R., Ternary complex factors:growth regulated transcriptional activators.// Curr. Opin. GenetDev. 1994. 4. 694-701.

64. Wu JY., Wen L., Zhang W-J., Rao Y., The secreted product of Xenopus gene lunatic Fringe, a vertebrate signaling molecule.// Science. 1996. 273. 355-358.

65. Yamasoba Т., Schacht J., Shoji F., Miller J.M., Attenuation of cochlear damage from noise trauma by an iron chelator, a free radical scavenger and glial cell line-derived neurotrophic factor in vivo.// Brain Res. 1999. 815. 317-325.

66. Yan Q., Matheson C.,'Lopez O.T., In vivo neurotrophic effects of GDNF on neonatal and adult facial motor neurons. Nature. 1995. 373. 341-344.

67. Youdim M. В. H., Ben-Shachar D., Riederer P., Is Parkinson's Disease a progressive siderosis of substantia nigra resulting in iron and melanin induced neurodegeneration?// Acta Neurol. Scand. 1989. 126. 47-55.

68. Yong V.W., Perry T. L., Krisman A. A., Depletion of glutathione in brainstem of mice caused by N-methyl-4-phenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridine is prevented by antioxidant pretreatment.// Neurosci. Lett. 1986. 63. 56-60.