Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование эффектов трансплантации фетальной мозговой ткани и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на течение экспериментальной нейродегенерации с потерей памяти

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование эффектов трансплантации фетальной мозговой ткани и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на течение экспериментальной нейродегенерации с потерей памяти"

На правах рукописи

Самохин Александр Николаевич

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТОВ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ФЕТАЛЬНОЙ МОЗГОВОЙ ТКАНИ И МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК НА ТЕЧЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ НЕЙРОДЕГЕНЕРАЦИИ С ПОТЕРЕЙ ПАМЯТИ

03.03.01. физиология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Пущино-2015

1 0 <■'?. 7П1С I - и !_ и 1 3

005558973

Работа выполнена в Лаборатории клеточных механизмов патологии памяти Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биофизики клетки Российской академии наук.

Научный руководитель: Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат биологических наук Бобкова Наталья Викторовна кандидат биологических наук Полтавцева Римма Алексеевна

доктор биологических наук

Лосева Елена Владимировна

(вне лаборатории функциональной нейроцитологии

ИВНД РАН, Москва)

кандидат биологических наук Попова Ирина Юрьевна

(снс лабораторий системной организации нейронов ИТЭБ РАН, Пущино)

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук

Защита состоится «11» марта 2015 г. в 13 часов 30 минут на заседании совета Д 002.093.01 по защите диссертаций на соискание учёной степени кандидата наук, на соискание учёной степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке ПНЦ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, и на сайте ИТЭБ РАН: http://web.iteb.psn.ru.

Автореферат разослан « января 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.ф.-м.н.

Ланина

Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы.

Одна из важнейших проблем неврологии связана с изучение факторов, вызывающих процесс нейродегенерации. Болезнь Альцгеймера (БА) является примером развития патологического процесса в мозге, приводящего к полной потере памяти и деградации личности у людей пожилого возраста. На сегодняшний день в мире наблюдается стремительное увеличение численности больных БА. Поэтому БА признана одной из главных медицинских и социально-экономических проблем в развитых странах, что связано с увеличением продолжительности жизни населения. Предполагается, что перспективной для продления активной жизни в старости и существенного облегчения протекания болезней, ассоциированных со старением, может стать заместительная клеточная терапия с использованием трансплантации стволовых клеток (СК). Однако в вопросах их использования в клинической практике и механизмах терапевтического действия остаётся много неясного. Хотя известно, что СК выделяют трофические факторы, усиливающие эндогенный нейрогенез и улучшающие выживаемость клеток реципиента, но их локализация и направленность дифференцировки в разных видах патологии может быть различной - от нейронов до астроглии и олигодендроцитов, способных ремиелинизировать аксоны нейронов. Важной проблемой трансплантации СК остаётся источник стволовых клеток. При трансплантации эмбриональных стволовых клеток, полученных методом терапевтического клонирования, и iPS (индуцированные плюрипотентные стволовые клетки) клеток возникает риск развития раковых опухолей, который резко снижается при использовании мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. (ММСК). ММСК обладают всеми свойствами СК: тропизм к повреждённым участкам, защита от распознавания иммунной системой реципиента [Uccelli et а1.,2011]. Однако имеются противоречивые данные об эффективности трансплантации ММСК в случаях нарушения памяти, вызванных ишемией или внутримозговым введением бета-амилоида [Лосева и др., 2011].

Очевидно, что не только трансплантированные клетки влияют на организм реципиента, но и их функционирование во многом зависит от микроокружения, как правило, с той или иной патологией. Поэтому исследование эффектов стволовых клеток целесообразно проводить на моделях заболеваний. Сложность разработки новых методов лечения БА заключается в отсутствии валидных моделей этого заболевания на животных. Существующие модели на трансгенных животных частично воспроизводят наследственную форму данного заболевания, которая по последним данным встречается очень редко - в 1-5% случаев. Наше исследование было выполнено с использованием ольфакторной бульбэктомии, (ОБЭ), которая характеризуется не только потерей памяти [Hozumi et al., 2003], но и воспроизводит основные биохимические и морфологические признаки , характерные для БА [Nesterova et al., 2008]. Ряд поведенческих признаков свидетельствует о поражении эмоциональной сферы и развитии у них депрессивно-подобного состояния [Song and Leonard, 2005],

3

которое, как и при БА купируется хроническим приёмом антидепрессантов, главным образом блокаторов обратного захвата серотонина. У ОБЭ животных увеличивается двигательная активность [Breuer et al., 2009], наблюдается уменьшение потребления пищи [Song et al., 2005], arpeccHBHOCTbfHsuchou et al., 2002], изменение поведения в приподнятом крестообразном лабиринте и в тесте избегания [Hozumi et al., 2003]. ОБЭ животные демонстрируют широкий спектр дисфункций нейротрансмиттерных систем мозга, включая серотонин- и ацентилхолинергическую системы мозга [Nesterova et al., 1997; Бобкова и др., 2001; Han et al., 2008] наряду с повышенным уровнем противовоспалительных цитокинов [Song et al., 2005] и гипертермией [S. Yehuda 1976]. Важными характеристиками ОБЭ животных является гибель нейронов в височной коре и полях гиппокампа - структурах мозга, ответственных за обучение и память [Nesterova et al., 2008] и поражаемых нейродегенерацией при БА, что сопровождается нарушением длительной потенциации в гиппокампе [Moriguchi et al., 2006] на фоне повышения уровня мозгового бета-амилоида [Александрова и др., 2004], интенсификации гиперфосфорилирования белка Тау [Ни et al., 2012] и ухудшения нейрогенеза в зубчатой фасции гиппокампа [Бобкова и др., 2004; Гершович и др., 2006; Shioda et al., 2010]. Кроме того большой массив клинических данных свидетельствует о важной роли поражения обонятельной системы у пациентов с БА, что служит дополнительным доказательством возможности использования ОБЭ животных для изучения закономерностей развития нейродегенеративного процесса с потерей памяти.

Таким образом, исследование эффективности использования ММСК при разных видах введения на течение нейродегенерации, сходной с наблюдаемой при болезни Альцгеймера, предпринятое в данной работе, является актуальным и востребованным практикой направлением.

Целью настоящей работы явилось исследование возможности предотвращения или торможения развития нейродегенеративного процесса в мозге животных, подвергнутых операции ольфакторной бульбэктомии, путём внутримозговой трансплантации фетальной ткани разных структур мозга, или системного введения суспензии культивированных ММСК человека. Задачи исследования:

1. Исследовать динамику изменения пролиферативной активности в мозге ольфакторно бульбэктомированных(ОБЭ) животных.

2. Поведенческое исследование отдалённого эффекта трансплантации фетальной ткани обонятельной луковицы на пространственную память у ОБЭ и ложнооперированных (J10) животных.

3. Анализ отдалённого эффекта трансплантации фетальной ткани обонятельной луковицы на состояние нейронов височной коры и гиппокампа у ОБЭ мышей.

4. Изучение локализации в мозге системно трансплантированных ММСК.

5. Исследование характера дифференцировки системно трансплантированных ММСК в мозге животных-реципиентов.

Научная новизна работы.

В работе впервые проведено сравнительное изучение эффективности пересадки в мозг фетальной ткани из различающихся по пролиферативной активности структур мозга донора на поведенческие и морфологические характеристики ольфакторно бульбэктомированных (ОБЭ) мышей, с развивающимся нейродегенеративным процессом. Установлено, что только пересадка фетальной ткани обонятельной луковицы богатой стволовыми клетками, но не ткани мозжечка, не обдающей пулом стволовых клеток, предотвращала развитие нарушения пространственной памяти и гибель нейронов в мозге ОБЭ мышей. Показана эффективность влияния системного и внутримозгового введения культивируемых ММСК человека на память ОБЭ мышей. Показана возможность проникновения в мозг мыши системно введённых ММСК человека и их способность к длительному выживанию в мозге ОБЭ реципиентов. Важными явились результаты о дифференцировке трансплантированных ММСК человека в астроциты в мозге ОБЭ мышей, что свидетельствует о значении нарушения функций астроглии в развитии патологического процесса сходного с болезнью Альцгеймера. Научно-практическое значение работы.

Идея использования клеточной терапии в лечении нейродегенеративных заболеваний, в отношении которых отсутствуют эффективные методы терапии, давно обсуждается в среде учёных и клиницистов [Barker and Rosser 2001]. Однако на пути ее внедрения в практику стоит ряд сложных проблем - какие клетки наиболее пригодны для этих целей и какие пути доставки их в поражённый мозг эффективны и наименее травматичны. Данная работа даёт ответы на оба эти насущных вопроса. Трансплантация в мозг фетальной ткани обонятельной луковицы или культивируемых клеток ММСК приводит к восстановлению пространственной памяти, улучшению клеточного состава и увеличению плотности нейронов в мозге ОБЭ животных. Важно отметить, что при системном введении, ММСК человека оказались способными направленно мигрировать и локализоваться в отделах мозга ОБЭ животных, которые поражаются нейродегенеративным процессом. Большой практический интерес представляют результаты о выживаемости и дифференцировке трансплантированных ММСК человека в астроциты. Этот результат заставляет по-новому взглянуть на роль астроглии, поскольку известно, что в условиях патологии стволовые клетки замещают клеточные элементы с нарушенными функциями. Полученные результаты имеют практическую значимость, поскольку в целом ряде работ указывается на сходство последствий удаления обонятельных луковиц с симптомо-комплексом, характерным для болезни Альцгеймера [Бобкова и др., 2001; Yehuda et al., 2014; Islam et al., 2014]. Таким образом, полученные результаты приближают нас к пониманию фундаментальных механизмов патогенеза нейродегенеративного процесса, а разработанные в ходе исследования подходы к его коррекции представляются перспективными для их внедрения в практику для профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний, включая и болезнь Альцгеймера. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III

5

Всероссийском конгрессе с международным участием студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний Новгород 2010); International symposium "Hippocampus and Memory" (Pushchino 2006); на I съезде физиологов СНГ (Дагомыс 2005) доклад занял 1 место на конкурсе молодых учёных.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 27 печатных работ, из них 6 в рецензируемых журналах, в сборниках 5, в материалах конференций 16. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 106 страницах, иллюстрирована 7 таблицами и 33 рисунками. Список литературы содержит 175 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные. Экспериментальные данные, описанные в работе, получены с использованием мышей NMRI (5-10 животных в группе), которым в возрасте; 2-х месс была проведена операция двухстороннего удаления обонятельных луковиц - бульбэтомия. Все животные содержались при 21-23°С при свободном доступе к воде и пище.

Двухстороннюю ольфакторную бульбкэтомию проводили в стерильных условиях под нембуталовым наркозом (40 мг/кг, в/б) с применением 0.5%-ного раствора новокаина для местного обезболивания при скальпировании, путём аспирации через трепанационное отверстие в черепе со стереотаксическими координатами (АР -2; L 0; Н 3). Ложнооперированные (ЛО) животные того же возраста подвергались аналогичной манипуляции, но без удаления обонятельных луковиц и являлись контролем [Бобкова и др., 2003]. Полнота и точность удаления обонятельных луковиц оценивалась визуально при забое, а также при микроскопическом исследовании срезов мозга этих животных. Животные с неполным удалением или повреждением фронтального полюса коры изымались из дальнейших исследований, а результаты их поведенческого тестирования не учитывались при статистической обработке поведенческих данных.

Тестирование пространственной памяти. Выработку пространственного навыка проводили в водном лабиринте Морриса [Morris, 1984] в течение 5 дней, после чего тестировали пространственную память, показателями которой были - достоверность превышения показателей времени пребывания и числа заходов, выраженных в %, в секторе, в котором при обучении размещалась площадка спасения, в сопоставлении с аналогичными характеристиками поведения животных в индифферентных секторах.

Оценка интенсивности пролиферативной активности в мозге проведена на животных. Исследование выполнено с использованием тимидинового аналога 5-Бромо-2'-дезоксиуридин-5'-монофосфата (BrdU), который встраивается в ДНК делящихся клеток. Использование специфических антител к BrdU позволяет идентифицировать клеточные ядра, ДНК которых включили BrdU [Takagi et al., 1993]. Через подсчёт числа иммуннопозитивных клеточных ядер определяется темп

клеточного деления в определённой временной точке после бульбэктомии. На разных сроках после удаления обонятельных луковиц (2-10 недель) животные разных групп получали инъекцию BrdU (Sigma В9285) (в\б; 50 мг\кг веса). Через 24 часа под эфирным наркозом мыши подвергались интракардиальной перфузии мозга охлажденным физиологическим раствором, После фиксации мозга, готовились срезы на микротоме толщиной 20 мкм. Срезы инкубировались с моноклональными анти-BrdU антителами (Sigma В2531), после этого инкубировали срезы с вторичными антителами (IMTEC 60227), затем срезы окрашивали в DAB (3,3'-Диаминобензидин), После этого срезы расправляли на предметных стёклах и с использованием микроскопа (Микмед 2) идентифицировали клеточные ядра, ДНК которых включили BrdU в течение суток и проводили количественный анализ.

Забор и трансплантация кусочков фетальной ткани обонятельной луковицы. Для пересадки использовали микрокусочки (0,5 мм3) фетальной ткани обонятельной луковицы или мозжечка мышей, взятые от зародышей 15-16 дня гестации. Для взятия образцов ткани мозга зародышей беременная самка анестезировалась нембуталовым наркозом (40 мг/кг, в/б) с применением 0.5%-ного раствора новокаина для местного обезболивания при вскрытии полости матки. Изъятие фетального материала производили под бинокулярной лупой. Трансплантацию проводили в день изъятия фетального материала, без его предварительной инкубации [Jensen et al., 1984]. Трансплантация кусочков фетальной ткани обонятельной луковицы и мозжечка проводилась в стерильных условиях под нембуталовым наркозом (40 мг/кг, в/б) с применением 0.5%-ного раствора новокаина для местного обезболивания при скальпировании. Двустороннее введение трансплантата животным проводили через два трепанационных отверстия в черепе по соответствующим стереотаксическим координатам (bregma 1,8mm; interaural 5,78mm)[Rosen et al., 2000] в паренхиму коры головного мозга [Nemecek et al., 1995].

Методика получения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. Человеческие мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (чММСК) были полученные из Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова министерства здравоохранения Российской Федерации. Фетальные ММСК выделяли из костного мозга трубчатых костей, центрифугировали, отбирали фракцию мононуклеарных клеток на границе раздела фаз, повторно центрифугировали, полученный осадок вновь ресуспендировали в культуральной среде и культивировали 9 дней [Полтавцева и др 2012].

Внутримозговая и системная трансплантация суспензии ММСК человека. Суспензия ММСК в объёме 0,1 мл, содержащая 1 миллион клеток, или физиологический раствор вводились в хвостовую вену мышам 4-х групп : ОБЭ(ольфакгорно бульбэктомированные)+физ. раствор, ОБЭ+ММСК, JIO (ложнооперированные)+физ. раствор, JIO+MMCK. Для введения клеток в паренхиму фронтальной коры, мышей, находящихся под нембуталовым наркозом (40 мг/кг, в/б) с применением 0.5%-ного раствора новокаина для местного обезболивания, фиксировали в стереотаксисе и после скальпирования сверлили отверстие с координатами 1,7 мм каудально от брегмы и 1 мм латерально от центрального шва. Суспензия клеток вводилась на глубину 1,5 мм с помощью микрошприца Гамильтона в объеме 10 мкл. В другой серии экспериментов для выявления возможности

преодоления ММСК гематоэнцефалического барьера у ОБЭ мышей мы произвели в/в введение GFP (green fluorescent protein - зелёный флуоресцирующий белок) позитивных ММСК, полученных из костного мозга трёхмесячных трансгенных мышей C57BL/6-Tg(ACTbEGFP)10sb/J, несущих ген GFP, находящийся под контролем активного промотора, через 7 дней после бульбэктомии. Для облегчения идентификации в мозговой ткани трансплантируемых клеток, срезы мозга ОБЭ реципиентов были окрашены по методу Хёкста для выявления клеточных ядер. Срезы выдерживали в красителе Хёкста (Hoechst 33342 (Invitrogen); концентрация 0.1-12 мкг/мл) в течение 30 минут при 37°С.

Демаскирование антигенов. Во избежание перекрестных сшивок молекул эпитопа, которые меняют уникальную структуру поверхности антигена и препятствуют специфическому связыванию первичных антител при иммуногистохимическом исследовании, мы применили метод демаскирования антигена в цитратном буфере (Heat Induced Epitope Retrieval) [Werner et al., 1996]. Срезы предварительно отмываются в растворе TBS+Triton XI00 три раза по пять минут с использованием шейкера. Далее срезы помещают в раствор цитратного буфера (10 шМ Sodium Citrate, 0,5 % Tween 20, pH 6.0), предварительно доведённого до кипения на водной бане. Срезы держаться в горячем буфере в течение 20 минут, после чего их перекладывают в холодную дистиллированную воду на 10 минут, и проводят иммуногистохимическое исследование по протоколу.

Одинарная и двойная иммуногистохимическая окраска. Флуоресцентная и конфокальная микроскопия. Первичные антитела на человеческий ядерный антиген (HNA; Chemicon 1281, 1:40) были предварительно протестированы на клеточной культуре человеческих ММСК. После демаскирования антигенов, срезы мозга мышей отмывали в TBS три раза по пять минут и проводили блокирование неспецифичного связывания путём инкубирования в 10% растворе козьего сывороточного альбумина GSA (Goat Serum Albumin) в TBS в течении двух часов. В это время срезы находились на шейкере в условиях мягкого перемешивания блокирующего раствора. После блокировки срезы инкубировались в растворе первичных антител при комнатной температуре в течении 30 минут, а затем их оставляли на 12 часов при температуре +4° С. На следующий день срезы отмывали от несвязавшихся первичных антител в растворе TBS 3 раза по 5 минут и инкубировали в растворе вторичных антител, конъюгированных с флуорохромом (А1еха-488 или FITC) в течение двух часов. Инкубирование проводили в темноте для исключения выгорания флуорохрома. Далее срезы опять промывали в растворе TBS от несвязавшихся вторичных антител, накладывали на предметное стекло и заключали в SlowFade Gold (Invitrigen). Для определения характера дифференцировки ММСК проводили двойное иммуногистохимическое окрашивание срезов мозга с использованием первичных антител против человеческого ядерного антигена HNA (HNA; Human nuclear antigen; Chemicon MAB 1281, 1:40), первичных антител против глиального маркера GFAP (а-GFAP АВ-4, rabbit anti-mouse, Neomarkers, 1:100) и первичных антител против нейронального маркера - нейрон специфичной энолазы (NSE) (a-NSE, rabbit anti-mouse, Invitrogen, 1:30; a-NSE, rabbit anti-mouse, Neomarkers 1:100). В качестве вторичных применяли антитела, конъюгированные с Alexa-488 (А-21202 Alexa FluorA 488 donkey anti-mouse IgG, 1:50) или Alexa-594 (A-21207 Alexa FIuorA 594 donkey anti-rabbit IgG, 1:50). У каждого животного просматривалось 20 срезов. Для

анализа иммуногистохимической окраски использовали конфокальный инвертированный микроскоп (DMI 6000 CS, Leika). Флуорохром Alexa Fluor 488 (так же как FITC и GFP) возбуждался аргоновым лазером с длиной волны 488 nm. Alexa Fluor 594 возбуждался гелий-неоновым лазером с длиной волны 594 nm.

Окрашивание срезов мозга крезилвиолетом по методу Ниссля для оценки морфо-функциональпого состояния нейронов. Для исследования брался каждый шестой срез височной коры и гиппокампа. Предварительно отмытые от антифриза срезы мозга инкубировались в растворе красителя крезила фиолетового в ацетатном буфере (соотношение 2/8. 0,1 Моль. рН=3,5) в течение 15 - 20 минут. После этого срезы помещаются в дистиллированную воду и затем проводятся по батарее спиртов (этанол) увеличивающейся концентрации: 40%, 70%, 96%, и 100%. По одной минуте в каждом спирте (экспозиция - одна минута в каждом из спиртов). После окраски срезы расправлялись на предметном стекле и заключались в даммар-лак под покровное стекло [Nesterova et al., 2008].

Для статистической обработки результатов применяли статистический анализ One way ANOVA, а также двухсторонний критерий Стьюдента. Расчёты проводились в программе Gnumeric. Графики и гистограммы строились в программе Microsoft Office Excel и Gnumeric. Данные представлены как Х±т.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Почему паши исследования были проведены на бульбэктомировапных животных?

Повышенный уровень р-амилоида, гиперфосфолирирование белка Тау, присутствие олигомеров Р-амилоида в мозге ОБЭ животных, а также нарушение пространственной памяти, развитие депрессивно-подобного состояния, дефицит серотонинергической и ацетилхолинергической систем мозга, нарушение длительной потенциации в гиппокампе, а также гибель клеток в областях, характерных для болезни Альцгеймера (БА), делают бульбэктомированных животных привлекательным объектом для исследования механизмов генерации этого сложного симптомо-комплекса, сходного с наблюдаемым при БА, и для разработки подходов к его коррекции. Важно отметить, что как блокаторы ацетилхолинэстеразы, так и атипичные антидепрессанты, которые входят в перечень препаратов, используемых в клинике у больных с БА [Wang Jun et al., 2014], способны сдерживать поведенческие проявления нейродегенеративного процесса, развиваемого у БЭ животных [Song and Leonard, 2005]. У ОБЭ, как и у трансгенных мышей, моделирующих генетическую форму БА, позитивный эффект на память имели антитела к альфа7 ацетилхолиновому рецептору и внеклеточному домену прионного рецептора [Kamynina et al., 2010]. Все это служит достаточным основанием использовать ОБЭ животных для моделирования определенных признаков БА [Бобкова и др., 2001; Александрова и др., 2004; Yehuda et al., 2014; Islam et al., 2014]. Не все исследователи пока разделяют эту точку зрения и придерживаются традиционного использования ОБЭ животных как модели

эндогенной депрессии [Song and Leonard, 2005], при этом упуская из виду, что депрессивное состояние входит в симптомо-комплекс БА и купируется атипичными антидепрессантами, в основном блокаторами обратного захвата серотонина [Wang Jun et al., 2014]. Как любая модель, ольфакгорная бульбэктомия, конечно, имеет свои ограничения: БА у человека не вызывает оперативным удалением обонятельных луковиц, хотя общепризнано, что нарушение обоняния является одним из ранних симптомов БА [Ferreyra-Moyano and Barragan, 1989; Doty RL 2003]. Поэтому именно ОБЭ животных мы использовали в своих исследованиях по изучению возможности применения клеточной и тканевой трансплантации для предотвращения нейродегенеративного процесса, сходного по своим проявлениям с симптомо-комплексом, характерным для БА.

Пролиферация в мозге ольфакторно бульбэктомированных животных.

Ранее нами была выявлена своеобразная динамика развития нейродегенеративного процесса у ОБЭ мышей с наличием бессимптомного периода, характерного для БА, что значительно затрудняет своевременную диагностику этого заболевания [Бобкова и др.,2013]. Наблюдаемая в это время нормализация нарушенной пространственной памяти наряду с восстановлением клеточной плотности в поражённых патологическим процессом структурах позволили предположить наличие активации нейрогенеза в мозге этих животных, как одного из механизмов, сдерживающих развитие патологии. В нашем исследовании проведён анализ наличия пролиферативной активности в мозге ОБЭ мышей и изучена ее динамика. Пролиферативная активность является первым необходимым этапом нейрогенеза.

Результаты подсчёта средней плотности иммунопозитивных к BrdU ядер в разные сроки послеоперационного периода представлены на рисунке 1.

Анализу были подвергнуты три области мозга: субэпиндемальная зона боковых желудочков и зубчатая фасция гиппокампа, в которых нейрогенез идет на протяжении всей жизни, а также височная область коры - структура, для которой нейрогенез не является характерным явлением. Видно, что уже через неделю после бульбэкгомии во всех исследованных структурах достоверно повышалась плотность BrdU-иммунопозитивных ядер.

Сопоставление динамики клеточной пролиферативной активности в различных зонах у ОБЭ животных показало (Рис.1.Г.), что для субэпиндемальной зоны боковых желудочков и зубчатой фасция гиппокампа максимум пролиферации отмечается через три недели после операции, в то время как пик пролиферативной активности в височной коре отмечается позднее и наблюдается через четыре недели после бульбэкгомии. В дальнейшем происходит снижение интенсивности пролиферативной активности с последующей ее стабилизацией [Бобкова и др., 2004; Гершович и др., 2006].

А)

Б)

о 20

Q. ,40 0J

3

Е »

-БЭ -ЛО

В)

э 1 m

недели после операции

Г)

недели после операции

-свз -сгз -вк

недели после операции

недели после операции

Рис.1. Динамика изменения плотности иммунопозитивных к BrdU ядер в субвентрикулярной зоне (А), в субгранулярной зоне гиппокампа( Б), в височной коре (В) у ОБЭ и ЛО животных. Сравнение временных динамик и интенсивности изменения плотности илшунопозитивных к BrdU ядер в различных структурах мозга ОБЭ животных (Г). Достоверность отличия показателей в группе ОБЭ животных к соответствующим показателям в группе ЛО животных: *-р < 0,05; **-р<0,01; *** - р < 0,001..

Одним из недостатков использования BrdU является теоретически возможное его соединение со свободными концами разрушающейся ДНК при апоптозе. Особенно эта вероятность возрастает в условиях развития нейродегенеративного процесса. Неслучайно эта реакция лежит в основе метода TUNEL для определения клеток с апоптозом, но для удержания связывания BrdU обязательно используется terminal deoxynucleotidyl transferase. Доказательством того, что усиление иммунопозитивности к BrdU в нашем случае в основном происходило в результате интенсификации

пролиферативного процесса является постепенная нормализация нейрональной плотности в коре, гиппокампе и в структурах, синтезирующих основные нейромедиаторы - ядре Мейнерта, дорзальном ядре шва и голубоватом пятне в послеоперационном периоде у ОБЭ мышей. Данные, представленные на рисунке 2, показывают динамику этого процесса, завершающегося в среднем через 6 месяцев после операции.

Таким образом, при ольфакторной бульбэктомии у мышей наблюдается повышение пролиферации клеток в таких областях, как субгранулярная зона зубчатой фасции гиппокампа, субвентрикулярная зона и височная кора, о чем свидетельствует увеличение BrdU-иммунопозитивных ядер на срезах мозга. Данные процессы имеют характерную временную динамику с пиком на 3-4-ой неделе после операции и снижением ее интенсивности к 8 неделе после операции (Рис.1).

Nucleus magnocellularis preopticus (NMP) — гигантоклегочное приоптическое ядро

Nucleus raphe dorsalis (NRD) дорсальные ядра шва

месяцы

месяцы

120 100 80 60 40 20 О

Locus coeruleus (LC) - голубоватое пятно

3 4,5

месяцы

Рис.2. Плотность нормальных нейронов в структурах мозга в различных послеоперационных периодах у ОБЭ мышей.

Несовпадение сроков активации пролиферативной активности и восстановления памяти у ОБЭ мышей, наблюдаемое через 3-4 месяца после оперативного удаления обонятельных луковиц, по-видимому, обусловлено временем, необходимым для дифференцировки нейрональных прогениторов в зрелые функциональные нейроны. Исследования других авторов с применением Вгёи также показали снижение интенсивности гиппокампального нейрогенеза у ОБЭ крыс, но наблюдаемого в более поздние сроки после операции - на 6 и IО неделях [Гаако-Моукв а1., 2005; БЬ^а й а1., 2010]. Эти данные, как и наши результаты, показывают наличие определённой динамики в сложном процессе, запускаемом операцией удаления обонятельных луковиц. По-видимому, за

интенсивной пролиферацией следует более длительный процесс дифференцировки вновь образованных клеток в астроциты и нейроны. Ольфакториая бульбэктомия вызывает ряд взаимосвязанных патологических и компенсаторных изменений в мозге, в которых прослеживается чёткая временная динамика. Так, пролиферация достигает пика на 3 неделе после ольфакторной бульбэктомии, нарушение пространственной памяти - на 4 неделе, а выраженная гибель клеток в различных областях, достигает максимума на 5 неделе. Через 6 месяцев ОБЭ животные незначительно отличаются от ЛО контроля ни по уровню пространственной памяти. Частично восстанавливается морфология нейронов коры, гиппокампа и других структур, поражаемых после ольфакторной бульбэктомии [Бобкова и др., 2003; Бобкова и др., 2010]. По-видимому, наблюдаемые изменения связаны с активацией компенсаторных механизмов у ОБЭ животных. Однако к 8-ми месяцам после ольфакторной бульбэктомии происходит постепенное ухудшение памяти, которую ОБЭ животные утрачивают через 10-12 месяцев после операции в отличие от ложнооперированных животных того же возраста, которые демонстрируют высокий уровень пространственной памяти. Такая динамика развития нейродегенеративного процесса в мозге ОБЭ животных позволяет предположить, что определённые компенсаторные механизмы, которые активируются в результате ольфакторной бульбэктомии, в том числе нейрогенез, приводят лишь к временному восстановлению когнитивных функций. Постепеноо, с возрастом, этот процесс ослабевает, что происходит по-видимому, в результате истощения компенсаторных механизмов, а также под влиянием неизвестных пока факторов, где доминирующим, по всей видимости, является старение, сопровождаемое изменениями проксимальных свойств внеклеточного матрикса, активности патогенных (например, амилоидного или воспалительного) каскадов и других нарушений клеточного окружения. Такой взгляд позволяет рассмотреть патогенез БА в новом свете и предложить подходы к ее терапии путём экзогенного введения соединений, участвующих в механизмах компенсаторных реакций. Такой подход был успешно реализован нами при интранозальном введении рекомбинантного белка теплового шока, уровень которого резко возрастает в гиппокампе в фазу бессимптомного развития патологии у ОБЭ мышей [ВоЬкоуа й а1., 2014]. Полученные в данном разделе данные позволили предположить возможность сдерживания развития патологического процесса сходного с болезнью Альцгеймера в мозге ОБЭ мышей при использовании клеточной терапии на основе внутримозговой аллогенной трансплантации ткани фетального мозга.

Трансплантация фетальных клеток обонятельной луковицы.

Нами были подготовлены три группы ОБЭ мышей и три группы ложнооперированных животных. Двум группам ОБЭ мышей и двум группам ЛО животных через 6 месяцев после ольфакторной бульбэктомии под нембуталовым наркозом стереотаксически была произведена трансплантация микрокусочков ткани обонятельной луковицы или мозжечка, выделенных из мозга 15 дневных зародышей мышей, в паренхиму фронтальной коры. Через 2

13

месяца после операции трансплантации животных обучали навигационному рефлексу в водном лабиринте Морриса. При тестировании пространственной памяти было установлено, что контрольная группа ОБЭ животных была не способна выделять сектор, в котором при обучении находилась спасательная платформа, в то время как группа ЛО мышей посещала отсек обучения достоверно чаще, чем другие индифферентные отсеки лабиринта и достоверно больше времени проводила в нем. Трансплантация фетальной ткани обонятельной луковицы в паренхиму фронтальной коры ОБЭ животным приводила к восстановлению у них способности идентифицировать отсек обучения, что свидетельствует об улучшении пространственной памяти. Однако ОБЭ мыши, которым проводили аналогичную трансплантацию кусочка фетальной ткани мозжечка, были не способны отличать отсек обучения от индифферентных отсеков лабиринта Морриса (Рис.3) [Самохин и др., 2005].

Число заходов в сектора

ЛО ЛОч-Т

БЭ+ТМ БЭ+Т

Рис.З. Позитивный эффект внутримозговой трансплантации фетальной ткани обонятельной луковицы, но не мозжечка на пространственную память ОБЭ мышей. По оси ординат время пребывания и число заходов в сектора водного лабиринта Морриса. По оси абсцисс — группы экспериментальных животных:

БЭ — контрольные бульбэктомированные животные, ЛО — контрольные ложнооперированные животные; ЛО+Т и БЭ+Т — ложнооперированные и бульбэктомированные мыши с трансплантацией фетальной ткани обонятельной луковицы во фронтальную кору; БЭ+ТМ- бульбэктомированные мыши с трансплантацией фетальной ткани мозжечка во фронтальную кору. Темным отмечены столбцы., соответствующие показателям в индифферентных отсеках лабиринта Морриса, светлым отмечены столбцы, соответствующие времени пребывания в отсеке обучения.

Достоверность отличия показателей в индифферентных отсеках от отсека обучения * -р < 0,05; **-р<0,01; *** - р < 0,001.

Гистоиммунохимический анализ мазков суспензии клеток, приготовленных из кусочков обонятельной луковицы или мозжечка фетального мозга, с использованием моноклональных антител anti-PCNA (Sigma FOI67) было установлено наличие в них пролиферирующих клеток (Рис. 4). Эти данные совпадают с результатами других авторов о том, что эмбриональные обонятельные луковицы содержат большое число нейробластов, мигрирующих из SVZ [Tamaki et al., 2002; Wang et al., 2011].

По завершению поведенческого исследования нами был проведён анализ морфо-функционального состояния нейронов в полях гиппокампа и височной коре — структурах, играющих основную роль в процессах обучения и памяти. Полученные результаты свидетельствуют о том, что мозг животных через 8 месяцев после ольфакторной бульбэктомии характеризуется выраженным нейродегенеративным процессом в височной коре и полях гиппокампа, о чем свидетельствует гибель нейронов, отражающаяся в снижении клеточной плотности, уменьшение количества нормальных нейронов и увелечение встречаемости таких видов нейрональной патологии как пикноз, цитолиз и кариолизис. В таблицах 1 и 2 представлен количественный анализ распространённости перечисленных выше патологических состояний нейронов и нейрональной плотности в мозге ОБЭ мышей, а также влияние на эти показатели внутримозговой трансплантации фетальной ткани обонятельной луковицы и мозжечка. Видно достоверное увеличение числа нормальных клеток на фоне снижения процента клеток с разными видами клеточной патологии во всех изученных структурах под влиянием внутримозговой трансплантации (Таблица 1), также как и возрастание клеточной плотности в полях гиппокампа, но не в височной коре (Таблица 2) [Самохин и др., 2005].

Из представленных данных также следует, что протекторный эффект трансплантации обонятельной луковицы на нейроны исследуемых структур мозга ОБЭ животных был выражен значимо сильнее, чем действие пересадки ткани мозжечка. Считается, что положительное влияние трансплантации фетальной ткани осуществляется благодаря миграции клеток в зоны, характеризующееся потерей клеток, а также за счёт стимуляции эндогенного нейрогенеза выделяемыми трансплантатом ростовыми факторами [Меа<1 й а!., 2013; С?т й а!., 2013]. Синтезируемые в трансплантате трофические факторы

\Puc.4. Феталъная ткань обонятельной луковицы с Anti-PCNA \(Anti-Proliferating cell Nuclear Antigen).

способствуют повышению устойчивости нейронов к действию таких нейротоксинов как бета-амилоид и гиперфосфорилированный тау-белок, Особый интерес представляет эффективность трансплантации фетальной ткани обонятельной луковицы по сравнению с действием ткани мозжечка.

Таблица 1. Влияние трансплантации на количественное соотношение нормальных клеток и нейронов с разными видами патологических реакций в структурах мозга разных групп экспериментальных животных.

ЛО— ложнооперированные мыши, ОБЭ — булъбэктомированные животные, ЛО+ТОЛ -ложнооперированные мыши с фетальным трансплантатам обонятельной луковицы, ОБЭ+ТОЛ - бульбэктамированные мыши с фетальным трансплантатам обонятельной луковицы, ЛО+ТМ- ложнооперированные мыши с фетальным трансплантатам мозжечка, ОБЕ+ТМ- бульбэктамированные мыши с фетальным трансплантатам мозжечка. Звёздочками отмечена достоверность отличия показателей различных групп от ЛО животных; большими точками - от ОБЭ мышей. Оценка достоверности * - р<0.05; ** р <0.01; ***-р<0.001.

Распределение патологических клеток, %

Структуры Группы норма ппкноз кариолизпе цитолиз вакуолиза ция

Височная кора ЛО п=8 ЛО+ТОЛ п—6 ло+тм 11=5 ОБЭ п=9 ОБЭ+ТМ п=5 ОБЭ+ТОЛ п=7 76,№±1,1 77,1±1,1 67,6±1,1*" 12,5±0,8 8,5±1,1 15,4±0,8*** " 2,9±03 2,6±0,6 4,8±0,5* 5,3±0,6 7,6±0,9 11,2±0,7*« 3,5±0,6 3,9±0,7

53,8±1,1*** 59,4±2,0 62,6±1,7*** 20,5±1,0*** 20,1±1,2 17,8±1,0"» " 4,5±0,4*** 1,9±0,6 2,3±0,4'" 17,5±0,8*** 17Д±1,4 15,4±1,1*** ' 3,6±0,5 1,5±0,5 2,3±0,3* '

Гиппокамп (поля СА1-СА2) ЛО п=8 ЛО+ТОЛ п=6 ЛО+ТМ 81,1±1,5 78,8±2,4 81,5±1,4'" 7,3±0,9 7,4±1,4 6,7±0,"" з,о±оз 2,5±0,5 1,5±0,3*" 5,9±0,6 9,0±1,1 10,1±0,7"* 2,6±0,4 1,4±0,4 4,6±1,2*

ОБЭ п=9 ОБЭ+ТМ 58,0±1,2*** 59,5±1,3 17,8±1,0*** 19,5±и 4,4±0,5" 2Д±0,9 16,3±1,1*" 15,6±1,0 3,5±0,4 1,8±0,4

ОБЭ+ТОЛ п=7 64,2±1,5*** *" 16,7±0,8*** 4,1±0,3* "* 15,6±1,0*** 1,3±0,3"

Гиппокамп (поля САЗ-СА4) ЛО п=8 ЛО+ТОЛ п=6 ЛО+ТМ 85,7±1Д 75Д±2,7 5,0±0,6 9,7±1,4 2,1±0,2 ЗД±0,8 5,8±0,5 10,9±1,5 1,3±04 0,6±0Д

66,9±1,0*** 11,9±0,7*** 2,6±0,4 17,6±0,7*** 0,9±0,2

ОБЭ п=9 ОБЭ+ТМ 55,3±1,3*** 58±1,5 18,5±0,8*** 18,4±1,6 3,6±0,4" ЗД±0,7 193±1,0*** 17Д±1,6 2,8±0,4*** 3,8±1,3

ОБЭ+ТОЛ п=7 63,9±1,5*" 14,1 ±0,8 "" 2,2±0,4" 18,1±1,0*** 1,7±0,4*

Мы предполагаем, что фетальные клетки обонятельной луковицы обладают большим потенциалом в стимуляции эндогенного нейрогенеза и благодаря миграции в зоны, характеризующееся потерей клеток при ольфакторной бульбэктомии, дифференцируются там в нейроны [Fricker et al., 1999; Hurelbrink et al., 2005; Chen et al., 2007].

Таблица 2. Количественный анализ влияния трансплантации фетальной ткани обонятельной луковицы и мозжечка на плотность нейронов в височной коре, полях СА1-СА2 и САЗ-СА4 гиппокампау различных групп животных.

Звёздочками отмечена достоверность отличия показателей: различных групп от J10 животных; большими точками - от ОБЭ мышей. Оценка достоверности * - р<0.05; ** р <0.01; ***-р<0.001.

Группы животных Плотность клеток на мм2

Височная кора Гиппокамп СА1-СА2 Гиппокамп САЗ-СА4

ЛО п=8 2388±114 2722±72 21664:61

ЛО+ТОЛ >1=6 2027±64 2500±89 2444±И9

ЛО+ТМ п=5 2184±57* 2532±47* 1757±22*

БЭ п=9 1561±52*** 2130±50*** 1797±42***

БЭ+ТМ п=5 1152±56" 2144±75 1797±67

БЭ+ТОЛ п=7 1277±42*** " 2222±53*** 2250±47**

Однако возможно и другое объяснение наблюдаемого э< )фекта. Поскольку

влияние пересадки фетальной ткани на пространственную память и морфофункциональное состояние нейронов оценивалось через два месяца после трансплантации, то большинство введенных с трансплантом нейральных прогениторных клеток уже завершило свою дифференцировку и в значительной степени снизилось количество выделяемых ими ростовых и трофических факторов. Однако отличительной особенностью обонятельной луковицы от мозжечка является интенсивный нейрогенез на протяжении всей жизни организма, который, можно предположить, продолжается и во введённом кусочке этой структуры более длительный период, что представляет большой интерес и требует дальнейшего изучения. Важно отметить, что улучшение памяти ОБЭ животных, вызванное трансплантацией фетальной ткани обонятельной луковицы, ассоциировалось с восстановлением плотности нейронов в полях гиппокампа, но не височной коры, что находится в полном соответствии с представлением о важности гиппокампа в обучении и воспроизведении пространственных навыков.

Трансплантация чММСК.

Эффективность использования фетальной ткани для купирования патологического процесса показана многими авторами, однако на пути ее

внедрения в практику стоят непреодолимые морально-этические проблемы. Более приемлемой является трансплантация культивированных клеток, проявляющих свойства стволовых. В последнее время интерес исследователей привлекают мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), которые могут быть выделены из костного мозга самого реципиента и через несколько пассажей культивирования вновь введены в организм. В нашем исследовании была изучена эффективность ксенотрансплантации культуры ММСК человека на течение нейродегенеративного процесса в мозге ОБЭ мышей. При этом введение клеточной суспензии чММСК, полученных и охарактеризованных в научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова, проводили непосредственно в мозг или в хвостовую вену.

Следует указать, что тестирование памяти у разных групп ОБЭ и ЛО животных проводилось через 1, 2 или 3 месяца после внутримозгового введения суспензии чММСК или системного в хвостовую вену животного.

Наши результаты свидетельствуют, что ММСК человека, трансплантированные ОБЭ мышам, вызывают улучшение пространственной памяти. Через 3 мес после трансплантации память ОБЭ мышей не отличалась от уровня ложнооперированных (ЛО) животных (Рис.5) [Самохин и др., 2010; Бобкова и др., 2013]. При этом было установлено, что нормализация памяти ОБЭ животных быстрее наступала при внутримозговом введении суспензии чММСК.

40 35 30 25 20 15 10 5 0

* ♦

а = 3 г Е т * * *

* с 1 1 т ! * 1 ! т *

н 11 1 I 1 — 1

1 ■ 1

12 3 4 ЛО

12 3 4

12 3 4

12 3 4 БЭ+ММСК в/в

БЭ БЭ+ММСК в/м

сектора водного лабиринта

Рис. 5. Сравнительное исследование эффективности системного (в/в) и внутримозгового (в/м) введения чММСК на пространственную память бульбэктомированных (БЭ) животных через 3 месяца после трансплантации.

По оси ординат — время пребывания в отсеках лабиринта Морриса в сек, по оси абсцисс -обозначения групп животных и отсеков лабиринта (1,2,3 и4). Звёздочками отмечен уровень достоверности отличий времени пребывания в индифферентных отсеках (серые столбцы) по сравнению с отсеком обучения (черные столбцы)* - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001.

ММСК могут опосредовать улучшение памяти у ОБЭ животных посредством нескольких механизмов. Так, было показано, что ММСК выделяют

18

ростовые факторы и цитокины, которые положительно влияют на эндогенный нейрогенез, тормозят апоптоз и осуществляют регуляцию иммунных процессов и воспаления [Torrente and Polli, 2008]. Среди ростовых факторов, которые способны выделять ММСК - фактор роста нервов (NGF), нейротрофин-3, BDNF и GDNF [Pisati et al, 2007]. Далее представляло интерес проверить возможность проникновения в мозг ОБЭ и ЛО мышей системно введённых чММСК, а также проследить возможные пути их дифференцировки в нервные клетки.

Иммуногистохимическое исследование срезов мозга ЛО и ОБЭ мышей с трансплантацией чММСК проводили с применением первичных антител против человеческого ядерного антигена HNA (Chemicon), первичных антител против глиального маркера GFAP (Neomarkers a-GFAP АВ-4) и первичных антител против нейронального маркера - нейрон специфичной энолазы NSE (Invitrogen a-NSE). В качестве вторичных применяли антитела, конъюгированные с А1еха-488 или А1еха-594. У каждого животного просматривалось 20 мозговых срезов. Для анализа иммуногистохимической окраски использовали конфокальный инвертированный микроскоп (DMI 6000 CS, Leika). При микроскопическом исследовании была отчётливо видна изумрудная флуоресценция в области выстилки желудочков головного мозга. При большом увеличении, отдельные HNA-позитивные клетки были видны в тканяи мозга около выстилки боковых желудочков, где отчётливо видны окрашенные флуорофором ядра [Самохин и др., 2013; Панченко и др., 2014]. Наши данные иммуногистохимических исследований, проведённые через 3 дня после системной трансплантации чММСК, свидетельствуют о способности этих клеток преодолевать гематоэнцефалический барьер не только у ОБЭ, но и у ЛО мышей, а также встраиваться, главным образом, в выстилку желудочков головного мозга. ММСК также были обнаружены в паренхиме коры мозга, в полях CAI и САЗ гиппокампа, зубчатой фасции и височной коре через 3 дня после системного введения (Рис.6) [Самохин и др., 2013; Панченко и др., 2014].

Рис.6. А-Б - Микрофотографии паренхимы мозга ОБЭ мышей с в/в трансплантацией ММСК человека. Вблизи боковых желудочков определяются клетки, иммунопозитивные к НИА (стрелки). Иммуногистохимическое окрагиивание с применением первичных антител против человеческого ядерного антигена (1ША) и вторичных антител, конъюгированных с флуорохромом (А1еха-488 [зелёная флуоресценция]). Масштаб - 38 мкм. Конфокальная микроскопия.

Полученные результаты о способности чММСК преодолевать гематоэнцефалический барьер у ОБЭ мышей были подтверждены и в другой экспериментальной серии с системной трансплантацией ОБЭ животным ММСК, выделенных из костного мозга трансгенных мышей линии (С57ВЬ/6-Т£(АСТЬЕСРР)10зЬЛ) СгРР положительные клетки при этом были также обнаружены в паренхиме мозга ОБЭ мышей при проведении исследования на 3-ий день после введения их в хвостовую вену (Рис.7).

*

\ к

Рис.7. Микрофотографии срезов височной коры ОБЭ мышей через три дня после системной трансплантации GFP (зеленая флуоресценция) положительных ММСК клеток мышей. Ядерный хроматин окрашен в синий цвет красителем Хёкста. Масштаб: А - 550 мкм; Б -70 мкм; С - 12 мкм. Конфокальная микроскопия.

Способность мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из костного мозга, выживать в мозге и оказывать позитивное действие на поведение реципиента при внутримозговой трансплантации ранее была отмечена в условиях инъекционной модели Б A [Wu et al., 2007]. В модели болезни Хангтинктона ММСК также были способны преодолевать гематоэнцефалический барьер после их системной трансплантации [Lee et al., 2005]. Также показана способность ММСК проходить сквозь монослой эндотелиальных клеток на модели гемато-энцефалического барьера in vitro [Matsushita et al, 2011; Lin et al., 2013].

Однако на сегодняшний момент отсутствуют данные по дифференцировке, функциональной интеграции и долговременному выживанию ММСК при системном введении в условиях нейродегенеративной патологии, сходной с болезнью Альцгеймера, на основе ольфактоной бульбэктомии.

При сравнении значений плотности (n/мм2) нейронов в поле СА-1 гиппокампа было выявлено ее повышение у ОБЭ мышей с системным введением чММСК по сравнению с ОБЭ мышами с введением физиологического раствора, однако, нейрональная плотность у ОБЭ мышей с системным введением чММСК оставалась ниже, чем у ЛО животных (Рис.8) [Самохин и др., 2013; Панченко и др., 2014].

Рис.8. Плотность нейронов в поле СА-1 гиппокампа у бульбэктомированных мышей(БЭ) без инъекции чММСК, бульбэктомированных мышей с введением чММСК (БЭ+чММСК) и ложнооперированных (ЛО)мышей.

По оси ординат — плотность нейронов, пересчитанная на мм2

Звёздочками отмечен уровень достоверности отличий ** - р < 0,01; *** -р < 0,001

Характер дифференциации трансплантированных чММСК.

При двойной иммуногистохимической окраске с использованием первичных антител против человеческого ядерного антигена и первичных антител против ШЕ (нейрон специфичная энолаза) было установлено, что введенные чММСК не способны дифференциироваться в нейроны в условиях развития нейродегенеративного процесса, сходного с наблюдаемым при болезни Альцгеймера, поскольку не было отмечено ни одного случая коллокализации нейрон специфической энолазы и человеческого ядерного антигена. Однако данные двойного иммуногистохимического окрашивания с использованием первичных антител против человеческого ядерного антигена и первичных антител против СБАР (маркер астроглии), свидетельствуют о том, что небольшая часть введенных чММСК под влиянием клеточного окружения дифференцируется в астроциты (Рис.9 и 10) [Самохин и др., 2013; Панченко и др., 2014].

Рис.9. Коллокализация иммунопозитивности к НЫА и йБАР в астроцитах (красная окраска) на срезах мозга ОБЭ мышей с системной трансплантацией чММСК. Двойная иммуногистохимическая окраска с использованием первичных антител против человеческого ядерного антигена и первичных антител против йБАР. Масштаб: 30 мкм. Конфокальная микроскопия.

/ / -т ч

\ •f- . > \ - 1 b 12.0 И"' V \ '-

Рис.10. Коллокализация иммунопозитивности к HNA и GFAP в астроцитах (красная окраска) Примеры астроцитов, ядра которых содержат белок человека (зелёная окраска) на срезах мозга ОБЭ мышей (стриатум) с системной трансплантацией чММСК. Двойная иммуногистохимическая окраска с использованием первичных антител против человеческого ядерного антигена и первичных антител против GFAP. Конфокальная микроскопия.

Важно отметить, что ММСК, как и другие стволовые клетки, обладают тропизмом по отношению к зонам развития патологии, где они дифференцируются в клетки повреждённой ткани, тем самым способствуя функциональному восстановлению [Venkataramana et al., 2010; Inden et al., 2012]. Возможно, что нарушение нормального функционирования астроглии играет существенную роль в патогенезе болезни Альцгеймера. Это предположение подтверждается и литературными данными о роли астроглии в болезни Альцгеймера [Rodri'guez et al., 2009: Kulijewicz-Nawrot et al., 2012]. По литературным источникам эндогенные ММСК также являются предшественниками 10% микроглиальных клеток, которые играют важную роль в патогенезе БА, очищая мозг от амилоидных бляшек [Malm et al., 2005].

Несмотря на то, что введённые чММСК не дифференцируются в нейроны, эти клетки все же оказывают положительный эффект на нейрогенез. Об этом свидетельствуют не только их положительный эффект на обучение ОБЭ мышей, но и тенденция к повышению в их мозге плотности нейронов в полях гиппокампа по сравнению с ОБЭ животными, не получавшими введение чММСК, и достоверно не отличается от уровня нейрональной плотности в этой структуре у JIO животных [Самохин и др., 2013; Панченко и др., 2014].

Значительная часть чММСК концентрируется в области выстилки желудочков головного мозга, где находится основной пул нейральных стволовых клеток. Известно, что ММСК в красном костном мозге способны стимулировать пролиферацию гематопоэтических стволовых клеток, секретируя особые сигнальные молекулы и цитокины. ММСК также образуют специальное микроокружение для контролирования процесса гематопоэза в красном костном мозге ["Пап й а1., 2011; МипНоп е! а1., 2011]. Можно предположить, что концентрируясь в области скопления нейрональных стволовых клеток, чММСК способны стимулировать их пролиферацию и тем самым стимулировать нейрогенез в мозге ОБЭ мышей. Этот факт чрезвычайно важен, так как свидетельствует о возможности с помощью системной трансплантации ММСК активировать эндогенный нейрогенез в мозге, поражённом нейродегенерацией, сходной с наблюдаемой при болезни Альцгеймера [Самохин и др., 2013; Панченко и др., 2014].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Болезнь Альцгеймера относится к хроническим заболеваниям, которые возникают задолго до их клинической манифестации. Характерный для них длительный бессимптомный период, как правило, обусловлен активацией компенсаторных механизмов, способных длительное время противостоять и сдерживать развитие патологического процесса. Изучение этих механизмов и использование их активации может представить перспективный путь для разработки новых подходов к лечению БА, которая остаётся тяжёлым неизлечимым заболеванием, вызывающим длительную инвалидизацию больного и смерть.

В нашем исследовании, выполненном на бульбэктомированных животных, которые демонстрируют все основные поведенческие, биохимические и морфологические признаки развития нейродегенерации, сходной с болезнью Альцгеймера, включая и длительный бессимптомный период, установлено, что активация нейрогенеза может явиться одним из таких компенсаторных механизмов, сдерживающих прогрессирование патологического процесса. Действительно, в мозге бульбэктомированных животных на 3-4ой неделях после операции отмечена выраженная активация пролиферативного процесса, которая реализуется впоследствии в восстановлении плотности нейронов в коре и гиппокампе - структурах, ответственных за обучение и память, а также в структурах, синтезирующих основные нейромедиаторы. В работе выполнена проверка предположения о том, что активация процесса нейрогенеза или восполнение погибших в результате нейродегенерации нервных клеток может существенно замедлить развитие патологии. Для этого были проведены эксперименты на бульбэктомированных животных как с внутримозговой трансплантацией микрокусочков фетальной ткани мозговых структур 15 дневных зародышей мышей, так и с системным введением мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), обладающих многими свойствами стволовых клеток. Оба подхода оказывали позитивный эффект на память и морфофункциональное состояние нейронов в

23

мозге ОБЭ мышей. Однако использование фетальной ткани для трансплантации в клинике связано с морально-этическими проблемами. Поэтому в эксперименте была исследована возможность использования системного введения ММСК человека в хвостовую вену мыши.

Внутривенная трансплантация ММСК человека выражено улучшала пространственную память бульбэктомированных животных, при этом установлено, что ММСК человека способны мигрировать в поля CAI и САЗ гиппокампа, зубчатую фасцию гиппокампа, височную и теменную кору бульбэктомированных животных, где они обнаруживаются через 3 дня после их введения и, таким образом, могут преодолевать гемато-энцефалический барьер в данной модели. Человеческие ММСК, попадая в мозг, в основном концентрируются в области эпендимального слоя боковых желудочков мозга, где находится естественный пул нейральных стволовых клеток. По всей видимости, введённые чММСК способны стимулировать эндогенный нейрогенез за счёт стимуляции пролиферации нейрональных стволовых клеток реципиента. В пользу этого предположения говорит увеличение плотности нейронов в гиппокампе у БЭ мышей с введёнными чММСК по сравнению с БЭ мышами, которым не вводились стромальные клетки.

Возможность преодоления гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и попадание ММСК в мозг при системном введении была также паказана в экспериментах с трансплантацией GFP позитивных клеток.

Важным является наблюдение, что определённая доля чММСК преодолевших ГЭБ, дифференцируется в астроциты, но не в нейроны. Этот факт представляет наибольший интерес, поскольку, учитывая особенность стволовых клеток замещать плохо функционирующие клетки, подтверждает особую роль нарушений в астроцитах при развитии БА, что, как правило, не учитывается при изучении генеза БА.

Полученные результаты не только представляют теоретический интерес для фундаментальной биологии, но и имеют практическую ценность, поскольку работа выполнена на модели нейродегенеративного процесса, который воспроизводит основные характеристики симптомо-комплекса, наблюдаемого при спорадической форме БА. Нами показана возможность использования малотравматичного системного введения ММСК для коррекции такой нейродегенерации, которое по эффективности воздействия на память не уступало внутримозговому введению этих клеток. Таким образом, полученные данные не только намечают перспективу дальнейших исследований механизмов запуска нейродегенерации, сходной с наблюдаемой при БА, с акцентом на особой роли астропши в этом процессе, но и существенны для разработки новых подходов к предотвращению развития этой патологии на основе системной трансплантации ММСК.

выводы

1. Удаление обонятельных луковиц вызывает усиление клеточной пролиферации как в зонах мозга, для которых характерен нейрогенез в условиях нормы - в субвентрикулярной зоне боковых желудочков и в субгранулярной зоне зубчатой фасции гиппокампа, так и в височной коре - структуре, для которой несвойственен нейрогенез в постнатальный период развития.

2. Трансплантация фетальной ткани обонятельной луковицы, но не мозжечка в паренхиму фронтальной коры мозга ольфакторно бульбэктомированных животных способствует восстановлению пространственной памяти. Трансплантация фетальной ткани обонятельной луковицы в паренхиму фронтальной коры мозга предохраняет мозг бульбэктомированных животных от прогрессирования нейродегенеративного процесса, что выражается в возрастании числа нормально функционирующих клеток на фоне снижения нейронов с патологическими изменениями в височной коре и полях гиппокампа.

3. Системная и внутримозговая трансплантация культивируемых мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток человека (чММСК), выделенных из костного мозга, приводит к восстановлению пространственной памяти у бульбэктомированных животных.

4. Введённые внутривенно чММСК способны проникать в мозг и встраиваться в выстилку желудочков мозга бульбэктомированных и ложнооперированных мышей. Небольшая часть клеток обнаружена непосредственно в паренхиме мозга.

5. У бульбэктомированных мышей с системным и внутримозговым введением чММСК обнаружена повышенная нейронная плотность в гиппокампе, что можно расценивать как активацию процесса нейрогенеза в мозге

6. В мозге бульбэктомированных животных, с применением двойной гистоиммунохимической окраски выявлено, что часть чММСК дифференцируется в астроциты.

7. Результаты свидетельствуют о возможной альтернативе внутримозговой

инъекции для доставки клеток путём внутривенного введения, которое гораздо менее травматично по сравнению с внутримозговым введением. 8. Учитывая, что нейродегенеративный процесс, инициируемый удалением обонятельных луковиц, по своим поведенческим, морфологическим и биохимическим признакам проявляет сходство с симптомо-комплексом, характерным для болезни Альцгеймера, полученные результаты о позитивном влиянии системного введения ММСК, важны для разработки подходов к ранней терапии этого заболевания.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ Публикации в рецензируемых журналах

1. Александрова И.Ю., Кувичкин В.В., Кашпаров И.В., Медвинская Н.И., Нестерова И.В., Лунин С.М., Самохин А.Н., Бобкова Н.В. Повышенный уровень бета-амилоида в мозге у бульбэктомированных мышей. // Биохимия. 2004. Т. 69. С. 218-224.

2. Бобкова Н.В., Полтавцева P.A., Самохин А.Н., Сухих Г.Т. Терапевтический эффект мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на память животных с нейродегенерацией альцгеймеровского типа. // Клеточный технологии в биологии и медицине. 2003. № 3. С. 123-126.

3. Бобкова Н.В., Нестерова И.В., Медвинская Н.И., Александрова И.Ю., Самохин А.Н., Гершович Ю.Г. Активация компенсаторных механизмов в мозге после бульбэкгомии // Российский физиологический журнал И.М. Сеченова. 2004. Т. 90. № 8. С. 199-200.

4. Бобкова Н.В., Нестерова И.В., Медвинская Н.И., Александрова И.Ю., Самохин А.Н., Гершович Ю.Г. Нейрогенез в мозге млекопитающих в норме и при развитии патологии. // Открытое образование. 2006. № 3. С. 294-295.

5. Нестерова И.В., Бобкова Н.В., Медвинская Н.И., Самохин А.Н., Александрова И.Ю. Морфофункциональное состояние нейронов височной коры и гиппокампа в сопоставлении с уровнем пространственной памяти у бульбэктомированных крыс. // Морфология. 2007. Т. 131. № 2. С. 32-36.

6. Панченко М.М., Полтавцева P.A., Бобкова Н.В., Вельмешев Д.В., Нестерова И.В., Самохин А.Н., Сухих Г.Т. Локализация и характер дифференцировки трансплантированных мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток человека в мозге бульбэктомированных мышей. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2014. № 3. С. 139-144.

Статьи в научных сборниках и периодических научных изданиях

7. Бобкова Н.В., Нестерова И.В, Медвинская Н.И., Александрова И.Ю. Самохин А.Н., Гершович Ю.Г. К вопросу о генезе болезни Альцгеймера. // Материалы международного симпозиума «Интегративная медицина в XXI веке». Судак, Крым, Украина. 2004. С. 73-75.

8. Бобкова Н.В., Нестерова И.В., Медвинская Н.И. , Александрова И.Ю., Самохин А.Н. Роль астроглии в компенсаторных механизмах мозга. Материалы Первого международного междисциплинарного конгресса «Достижения нейронауки для современной медицины и психологии». Судак, Украина. 2004. С. 40-42.

9. Гершович Ю.Г., Самохин А.Н., Нестерова И.В., Медвинская Н.И., Бобкова Н.В. Активация клеточной пролиферации в мозге у животных с нейродегенерацией альцгеймеровского типа. // Сборник материалов Второго международного междисциплинарного конгресса «Достижения нейронауки для современной медицины и психологии». Судак, Украина. 2006. С. 76-78.

10. Bobkova N.V., Nesterova I.V., Medvinskaya N.I., Aleksandrova I.Y., Samokhin A.N., Gershovich Y.G, Gershovich P.M., Yashin V.A. Possible role of olfactory system in Alzheimer's disease genesis. In book «Alzheimer's and Parkinson's disease - AD/PD». // Edit. L.Hanin, A.Fisher, Monduzzi. International Proceedings. Medimond. 2005. P. 91-95.

11. Nesterova I.V., Bobkova N.V., Medvinskaya N.I., Samokhin A.N., Aleksandrova I.Y. Morphofiinctional state of neurons in the temporal cortex and hippocampus in relation to the level of spatial memory in rats after ablation of the olfactory bulbs. // Neurosci. Behav. Physiol. 2008. V. 38. № 4. P. 349-353.

Публикации в материалах научных мероприятий

12. Бобкова Н.В., Медвинская Н.И., Нестерова И.В. , Александрова И.Ю. , Самохин А.Н. Компенсаторные механизмы при болезни Альцгеймера. // Труды XX Международной конференции и дискуссионного клуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Ялта-Гурзуф, Украина. 2012. 5-15 июня. С. 82-84.

13. Бобкова Н.В., Гужова И.В., Маргулис Б.А., Самохин А.Н., Медвинская Н.И., Нестерова И.В., Новоселов С.С., Гершович Ю.Г., Александрова И.Ю. Исследование нейропротекгорных механизмов на модели нейродегенеративного процесса альцгеймеровского типа. // Сборник научных трудов I съезда физиологов СНГ. Дагомыс. 2005. С. 129.

14. Бобкова Н.В., Нестерова И.В., Медвинская Н.И., Александрова И.Ю., Самохин А.Н. Изучение механизмов спонтанной регенерации в мозге у бульбэктомированных мышей. // Сборник материалов 2-го международного симпозиума «Стресс и экстремальные состояния». 2003. С. 31-32.

15. Бобкова Н.В., Нестерова И.В., Медвинская Н.И., Александрова И.Ю., Самохин А.Н. Индукция нейродегенеративного процесса альцгеймеровского типа. // В сборнике «Фундаментальные науки - медицине». Москва. 2002. С. 3941.

16. Бобкова Н.В., Нестерова И.В., Медвинская Н.И., Александрова И.Ю., Самохин А.Н. Обоняние и болезнь Альцгеймера. // Материалы 7-ой междисциплинарной конференции по биологической психиатрии «Стресс и поведение». Москва. 2003. С. 47-48.

17. Бобкова Н.В., Нестерова И.В., Медвинская Н.И., Александрова И.Ю., Самохин А.Н., Новиков В.В. Новые подходы к профилактике и лечению

27

болезни Альцгеймера на основе экспериментальной модели спорадической формы этого заболевания. // Сборник материалов отчетной конференции по Программе фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине». Москва. 2003. С. 13-15.

18. Бобкова Н.В., Нестерова И.В., Медвинская Н.И., Александрова И.Ю., Самохин А.Н., Гершович Ю.Г. Нейрогенез как проявление пластичности мозга при развитии нейродегенерации альцгеймеровского типа. // Сборник тезисов XX съезда физиологического общества имени И.П.Павлова. Москва. 2007. С.68.

19. Нестерова И.В., Бобкова Н.В., Медвинская Н.И., Самохин А.Н., Александрова И.Ю. Морфофункциональное состояние нейронов височной коры и гиппокампа у бульбэктомированных крыс с разной способностью к обучению. // Материалы V международной конференции по функциональной нейроморфологии. Морфология. 2006. №. 2. С. 65.

20. Самохин А.Н., Бобкова Н.В., Нестерова И.В., Медвинская Н.И., Александрова И.Ю. Исследование возможности купирования нейродегенеративного процесса на модели спорадической формы болезни Альцгеймера. // Материалы междисциплинарной конференции с международным участием «Новые биокибернетические и телемедицинские технологии 21 века для диагностики и лечения заболеваний человека». Петрозаводск. 2003. С. 27-28.

21. Самохин А.Н., Бобкова Н.В., Полтавцева P.A., Нестерова И.В., Медвинская Н.И., Сухих Г.Т. Сравнительный эффект внутривенного и внутримозгового введения нейральных прогениторов и мезенхимальных стволовых клеток человека на память бульбэктомированных животных. // III Всероссийский конгресс с международным участием студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010». Нижний Новгород. 2010. С. 177-178.

22. Самохин А.Н., Гершович Ю.Г., Нестерова И.В., Медвинская Н.И., Александрова И.Ю., Гершович П.М., Бобкова Н.В. Эффективность использования трансплантации фетальных клеток обонятельной луковицы для предотвращения развития нейродегенерации альцгеймеровского типа. // Сборник научных трудов I съезда физиологов СНГ. Дагомыс. 2005. С. 214.

23. Самохин А.Н., Полтавцева Р.А.,Панченко ,М.М., Нестерова И.В., Бобкова Н.В., Сухих Г.Т. Локализация в мозге и характер дифференцировки мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток человека, влияние на память животных с нейродегенерацией альцгеймеровского типа. // Международная научно-методическая конференция «Современные проблемы биофизики сложных систем. Информационно-образовательные процессы». Воронеж. 2013. С. 152-155.

24. Bobkova N.V., Medvinskaya N.I., Nesterova I.V, Aleksandrova I.Y., Samokhin A.N., Gershovich Y.G, Gershovich P.M., Yashin V.A. Possible role of olfactory system in Alzheimer's disease genesis. // Book of abstracts of 7th International Conference "Alzheimer's and Parkinson's Diseases: Insights, Progress and Perspectives AD/PD 2005". Sorrento. Italy. 2005. P. 18.

25. Bobkova N.V., Samokhin A.N., Medvinskaya N.I., Nesterova I.V., Gershovich J.G, Aleksandrova I.Yu. Neuronal repairing prevents alzheimer's type

28

neurodegeneration. // Supplement to Alzheimer's and Dementia. 2006. V. 2. No. 3. P. 473.

26. Poltavseva R.A., Nesterova I.V., Medvinskaya N.I., Samokhin A.N., Artyuhov I.V., Peregudov A.G, Sukhikh GT., N.V Bobkova. Experimental motivation for using cellular therapy for Alzheimer's disease treatment. // IV Conference "Strategies for Engineered Negligible Senescence (SENS)". 2009. No. 139.

27. Samokhin A.N., Nesterova I.V., Gershovich J.G, Medvinskaya N.I., Aleksandrova I.Yu., Gershovich P.M., Bobkova N.V. The bulbectomized animals after fetal tissues transplantation state study. // International symposium "Hippocampus and Memory". Pushchino. 2006. P. 101.

Диссертационная работа была выполнена при поддержке программы Президиума РАН ФНМ-2012.

Подписано в печать 12.01.2015г. Печать лазерная

Заказ № 4875 Тираж: 100 экз.

Типография «Р1хРпт» ИНН 503900523316 142290, Пущино, м-н «АБ», 18а (4967) 75-97-84 www.fix-print.ru