Исследование динамики формирования и механизмов регуляции сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах Drosophila melanogaster

Губанова, Наталья Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование динамики формирования и механизмов регуляции сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование динамики формирования и механизмов регуляции сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

□ ОЗОбТ'БТ'б

ГУБАНОВА НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ ФОРМИРОВАНИЯ И МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ СБОРКИ-РАЗБОРКИ ЯДЕРНЫХ И ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ ПОР В СИНЦИТИАЛЬНЫХ ЭМБРИОНАХ ШОЬОРНИА МЕЬАМОвАБТЕК

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск, 2006

003067676

Работа выполнена в лаборатории морфологии и функции клеточных структур, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Киселева Елена Владимировна, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Высоцкая Людмила Васильевна, Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск

доктор биологических наук Захаров Илья Кузьмич, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт систематики и экологии

животных СО РАН, Новосибирск

Защита диссертации состоится «■24'» января 2007 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук (Д - 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, т/ф (383)333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «13» декабря 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного ^ ^

совета, доктор биологических наук 7ГД. Груздев

Актуальность проблемы. Между ядром и цитоплазмой эукариотической клетки постоянно происходит обмен информационными молекулами (мРНК) и белками -регуляторами репликации, транскрипции и трансляции. Дефекты в механизмах этого процесса могут вести к нарушению экспрессии генов, что может иметь серьезные последствия, начиная с отклонения в развитии организма и заканчивая злокачественным перерождением тканей. С этой точки зрения исследование функциональных взаимоотношений между ядром и цитоплазмой имеет не только фундаментальное научное значение, но и является актуальным вопросом, имеющим приложение в современной медицине. Основную роль в регуляции обмена между ядром и цитоплазмой играют ядерные поровые комплексы (ЯПК) - специфические каналы в ядерной оболочке (ЯдО), через которые осуществляется активный и пассивный обмен макромолекул. ЯПК являются сложными надмолекулярными структурами, в формировании которых принимает участие около 30 различных белков, называемых нуклеопоринами. Изучение механизмов формирования ЯПК является одной из актуальных задач в исследовании регуляторных механизмов ядерно-цитоплазматического транспорта.

Одним из подходов в изучении формирования ЯПК является анализ особенностей их реорганизации в ходе митоза. Известно, что в начале митоза ЯПК разбираются на отдельные белковые компоненты, ламина деполимеризуегся, а ядерные мембраны фрагментируются. После окончания митоза образуется сплошная двухслойная оболочка, в которой de novo формируются ЯПК. Известно, что в эукариотической клетке переход к митозу и его завершение происходят в результате активации и инактивации митотических киназ, что вызывает структурные изменения в цитоплазме и ядре клетки (Arellano, Moreno, 1997). Однако, то, как эти митотические факторы регулируют процессы сборки-разборки ЯПК, остается до сих пор мало изученными.

Показано, что в цитоплазме ооцитов и митотически активных клеток, таких, как опухолевые клетки и клетки ранних эмбрионов встречаются необычные мембраны, содержащие структуры, сходные с ЯПК и называемые цитоплазматическими порами (ЦП) или пороподобными комплексами. ЯПК и ЦП сходны по морфологии, белковому составу, а также проявляют синхронность в процессе обратимой реорганизации в митозе. Мембраны, содержащий ЦП, обозначают как пористые пластинки (ПП) или окончатые мембраны. Они могут быть представлены одиночными пластинками или, чаще, стопками пластинок, расположенных в цитоплазме клетки. Существует предположение, что ПП являются запасающим компартментом нуклеопоринов для формирования ЯПК в ЯдО ооцитов амфибий. Функция ПП в соматических митотически активных клетках на сегодняшний день остается недостаточно исследованной.

Известно, что малая ГТФ-аза Ran принимает активное участие в ядерно-цитоплазматическом транспорте, а также регулирует процессы формирования митотического веретена и ЯдО (Clarke, Zhang, 2004). Недавние исследования продемонстрировали, что Ran контролирует также сборку ЯПК у дрожжей (Ryan et al., 2003) и ЦП в системе in vitro (Walter et al., 2003), однако механизмы этого процесса изучены не достаточно.

Наиболее удобным объектом для изучения регуляции митотической реорганизации ЯПК и ЦП являются эмбрионы дрозофилы на стадии синцитиалыюй бластодермы. В них ядра претерпевают 13 быстрых синхронных делений, что

позволяет получать образцы, содержащие ядра на разных стадиях клеточного цикла. В цитоплазме эмбриона присутствуют также ПП, которые синхронно собираются и разбираются в ходе митоза. В дополнение к этому, начиная с 9 цикла деления, ядра разделяются на две популяции: быстро делящиеся на периферии эмбриона бластодермалыше ядра, и находящиеся в центре эмбриона и не подверженные делению, полиплоидные желточные ядра. Это предполагает существование различий в митотической реорганизации ядер и расположенной рядом с ними цитоплазмы в центральной и периферической областях эмбриона. Синцитиальные эмбрионы дрозофилы удобны также для манипуляций и наблюдения с помощью конфокальной и электронной микроскопии. На основании этого были сформулированы следующие цель и задачи настоящего исследования.

Цель диссертационной работы - изучение регуляции митотической реорганизации ядерных и цитоплазматических пор и анализ их функционального взаимодействия в эмбрионах дрозофилы на стадии синцитиальной бластодермы. В работе решались следующие конкретные задачи:

1. Провести электронно-микроскопический анализ динамики ядерной оболочки и пористых пластинок на разных стадиях клеточного цикла.

2. Выяснить являются ли пористые пластинки запасающим компартментом нукпеопоринов в синцитиальных эмбрионах дрозофилы.

3. Определить, как активность митотических киназ и фосфатаз влияет на сборку-разборку ядерных и цитоплазматических пор.

4. Определить влияние малой ГТФ-азы Ran на процесс сборки ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах дрозофилы.

Новизна и научная ценность работы:

С использованием методов электронной микроскопии, морфометрического анализа и микроинъекций впервые показано, что основная часть нуклеопоринов находится в растворенном состоянии в цитоплазме синцития и ПП не являются основным запасающим компартментом для белков ядерных пор. Установлено, что процесс сборки-разборки ЯПК и ЦП регулируется динамическим равновесием между активностью митотической киназы cdkl и действием фосфатаз, чувствительных к окадаевой кислоте. На основании проведенных исследований предложена модель регуляции сборки/разборки ЯПК и ЦП в синцитиальных эмбрионах дрозофилы. Продемонстрировано, что малая ГТФ-аза Ran участвует в формировании ядерной оболочки и ядерных пор и не влияет на формирование цитоплазматических пор. Показано, что синцитиальные эмбрионы дрозофилы являются удобной экспериментальной моделью для изучения процессов регуляции сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор in vivo. Апробация работы

Результаты исследований были представлены на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН в 2002 и 2005 гг., XIX Российской конференции по электронной микроскопии (Москва, 2002), III Международной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы современной биологии и биотехнологии» (Казахстан, Алма-Аты, 2003.), Международном симпозиуме по проблемам мейоза (Санкт-Петербург, 2003), Международном симпозиуме «Ядерная оболочка в передаче информации и генной регуляции» (Дарем, Великобритания, 2004), III съезде ВОГИС (Москва, 2004) и Дальневосточной школе-конференции (Владивосток, 2006).

Вклад автора

Автором были зафиксированы образцы эмбрионов дрозофилы и приготовлены препараты для световой и электронной микроскопии, проведен качественный анализ электронно-микроскопических образцов, а также выполнен морфометрический анализ количества ЯПК и ЦП.

Гель электрофорез, Вестерн-блот анализ, субфракционирование, количественная оценка содержания нуклеопоринов в различных фракциях, конфокальная микроскопия и микроинъекции были проведены Е.А.Онищенко (Содерторнский университетский колледж, Стокгольм, Швеция). Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 214 ссылок. Работа изложена на 144 страницах печатного текста, содержит две таблицы и иллюстрирована 39 рисунками.

Материалы и методы

Объекты исследования

В работе использовались следующие линии Drosophila melanogaster: cdklls (А171Т), png'72 и Canton S - как дикий тип. Мухи содержались на стандартном корме при 22°С. Перед отбором эмбрионов проводилась синхронизация откладки яиц. Для получения эмбрионов 'на 7-8 циклах деления отбор производился через 1 ч. после установки корма, для 11 и 14 циклов - через 2 и 2,5 ч. соответственно, а для более поздних стадий через 4 часа. Электронная микроскопия

Эмбрионы фиксировались в растворах .глугарового альдегида и тетраоксида осмия согласно методу, описанному ранее (Onischenko, Gubanova et al., 2004, 2005). Затем эмбрионы дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации и в ацетоне, после чего заключали в эпоксидную смолу AgarlOO и полимеризовали согласно стандартному протоколу. Срезы толщиной 50-80 нм, полученные на ультрамикротоме Ultracut Reichert (Австрия), переносились на медные сеточки и контрастировались растворами уранилацетата и цитрата свинца. Препараты исследовались на электронном микроскопе JEOL 100SX (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Получение, окрашивание и исследование полутонких срезов

Перед приготовлением полутонких срезов стачивалось 60 мкм толщины эмбриона, что позволяло достичь его экваториальной области. Полутонкие срезы толщиной 0,5 мкм окрашивались 1 % раствором толлуидинового синего с добавлением 1 % раствора тетрагидробората натрия и анализировались в световом микроскопе.

Определение цикла деления сннцитиалыюго эмбриона

На полутонких срезах, проходящих через экваториальную область эмбриона подсчитывалось количество ядер, что однозначно определяло цикл деления эмбриона (Zalokar, Erk, 1976). Так, для 14 цикла, на экваториальный срез приходилось от 160 до 200 ядер, для 13 - от 80 до 100 ядер, для 11 - 20-25 ядер и для 7-8 - от 2 до 4 ядер на срез.

Морфометрический анализ

Подсчет ЯПК и ЦП проводился на экране электронного микроскопа. Количество ЯПК и ЦП в эмбрионе вычислялось согласно ранее описанному методу

(Onischenko, Gubanova et al., 2004, 2005), после чего определялось среднее значение и стандартная ошибка.

Вестерн-блот и определение количества белка

Белки разделялись при помощи SDS полиакриламидного гель электрофореза и переносились на нитроцеллюлозную мембрану. Блокирования неспецифического связывания производилось по стандартному протоколу с небольшими модификациями (Onischenko et al., 2004). Вестерн-блот проявлялся в ECL-реагенте и анализировался с использованием системы анализа люминесцентных изображений LaslOOOplus.

Для определения количества белка, эмбрионы разделялись по стадиям согласно морфологическим критериям, затем готовился гомогенат 10 эмбрионов, который лизировался в 10 мкл стандартного буфера. После электрофореза и переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану, проводилась инкубация с первичными и вторичными антителами к семи нуклеопоринам. Количество белка в каждом бэнде измерялось при помощи программы ImageGauge 3.1, и выражалось в относительных единицах.

Субклеточное фракционирование

Субклеточное фракционирование было выполнено согласно методу, описанному ранее (Melier et al., 1994) с небольшими модификациями (Onischenko,Gubanova et al., 2004).

Исследование фосфорилирования нуклеопорина р150

Для адсорбции нуклеопорина pi 50 использовалась аффинная колонка (Pierce; Рокфорд), с соответствующими антителами. Комплекс антител с белками элюировался и обрабатывался двукратным SAP-буфером, содержащем щелочную фосфатазу SAP в течение 1 часа. Реакция останавливалась добавлением эквивалентного объема исходного буфера.

Микроинъекции и конфокальная микроскопия на живых эмбрионах дрозофилы

Эмбрионы без хориона прикреплялись к предметному стеклу, подсушивались в сухой камере 5-7 мин., а затем покрывались галокарбоновым маслом. Инъекции проводились с помощью вытянутого капилляра на микроинъекторе с воздушным управлением Microinjector 5242 (Eppendorf, США). Концентрация циклогексимида в инъецируемой смеси составляла 1 мкг/мл, GST-циклина В - 7,5 мкг/мл, окадаевой кислоты 150 мкМ. При исследовании действия малой ГТФ-азы Ran производились последовательные инъекции: RanT24N (Sigma-Aldrich) (8 мкг/мл) или RCC1 (Sigma-Aldrich) (8 мкг/мл), а затем циклогексимида (1 мкг/мл). Для наблюдения ЯПК и ЦП в живых эмбрионах производилась инъекция в них WGA-Alexa594 (0,1 млг/мл). Изображение объектов было получено с использованием конфокального микроскопа Leica TCS-SP, оборудованного программой Leica Cofocal Software 2.61.

Результаты и обсуждение

Изучение ультраструктурной динамики ядерных и цитоплазматических пор в процессе синцитиального развития эмбриона дрозофилы

Из ранее проведенных работ известно, что в интерфазе ЯПК находятся в собранном состоянии и состоят из трех отделов: центрального, содержащего транспортер, и > двух ассиметричных периферических - цитоплазматического, с

цитоплазмати ч^к и м и фибриллами, и внутриядерного, содержащего б ас кет-структур у (Kiseleva et al., 1996, 1998, 2001). Наши исследования ультра структуры ядерных и цитоплазмэтических пор на стадии интерфазы продемонстрировали, что ЦП и ЯПК имеют сходный вид на гексагональных срезах (Рис. 1 в, г), но различаются на поперечных срезах. ЦП не содержат б ас кет-структур у {Рис. 1 а), при этом в них наблюдаются два сходных периферических отдела, соответствующих по строению ци то плазматическом у отделу ЯПК (Рис. 1 б).

В работах других авторов было показано, что ЦП содержат нуклеопорины, характерные для цито плаз магического и центрального отдела ЯПК, в то время как белков, входящих б состав б ас к ет-структуры, в ЦП обнаружено не было (Cordes el al.. 1995), что согласуется с нашими наблюдениями. Также известно, что наружная мембрана ЯдО проявляет сходство С мембранами ЭПР, тогда как внутренняя мембрана контактирует с ламиной и содержит специфические белки. Мембраны же ПП обе идентичны мембранам ЭПР, что, возможно, и обуславливает сборку сходных периферических отделов в ЦП, соответствующих цитоплаз магическом у отделу ЯПК.

Рис, L Ультраструктура ядерных и цитоллазматических пор в синцитиальных эмбрионах D. melanogaster линии Canton S на стадии интерфазы (Onischertko, Ou ban о va et al., 2004); a - общий вид стопки пористых пластинок на поперечном срезе; вставка - цитоп л аз магические поры на большем увеличении (пунктиром обозначены цитоплазматичеСкие фибриллы); б - фрагмент ядерной оболочки на поперечном срезе; вставка - ядерные поры на большем увеличении (пунктиром обозначена бас кет-структура); в - пористая пластинка на гексагональном срезе; вставка - гексагональный срез цито плазматических пор на большем увеличении; г -гексагональный срез ядерной оболочки; вставка - гексагональный срез ядерных пор на большем увеличении.

Наши исследования продемонстрировали синхронность сборки-разборки ЯПК (Рис. 2 а) и ЦП (Рис. 2 б) в митозе, что полностью совпадает с данными ранее

опубликованных работ (7атяерта с( а!., 1977; 51а (к тэт, 5(ае]1е1т, 1984). Дополнительнее было установлено, что, если ЯПК а течение митоза разбираются не полностью, как это имеет место в центральной области эмбриона, где расположены желточные ядра, то и расположенный около них ЦП, демонстрируют сходную динамику (Рис. 2 в).

Рис. 2, Ультра структур а ЯдО и ПП б эмбрионе на стадии метафазы бластодермал ьных ядер; а - отсутствие ЯПК в оболочке бластодермальното ядра; б - отсутствие ЦП в ПП около баастодермальиых ядер; в - компоненты ЯПК (черные стрелки) в оболочке желточного ядра и компоненты ЦП (белые стрелки) в ПП около желточного ядра.

По нашим наблюдениям, в телофазе, ЦП собираются более активно и формируют стопки ПП, при чем с той стороны ядра, где еще не сформирована ЯдО. т.е. в Экваториальной области веретена деления (Ряс. 3 а, б).

Рис, 3. Бла сто дер мальные ядра и пористые пластинки на стадии тел оф азы в йинцитиальных эмбрионах дрозофилы.

а, б - вид ядер в телофазе и расположенных вблизи них Пористых пластинок. Видно, что ядерные поры (черные стрелки) распределены в ядерной оболочке неравномерно, стопки пористых пластинок (белые стрелки) расположены преимущественно с той стороны ядра, где ядерная оболочка не сформирована. ХР - хроматин. Я -ядро.

При исследовании синцтиальных эмбрионов на стадии интерфазы бпастодермалъных. ядер мы обнаружили гетерогенность в распределении и морфологии ПП. Наши исследования показали, что на 7-8 циклах деления стопки ГШ имею! небольшие размеры и гомогенно распределены по цитоплазме эмбриона. Ни более поздних циклах деления - И, 13 и 14, распределение ПП гетерогенно, они представлены Крупными стопками в центральной области эмбриона, где располагаются полиплоидные желточные ядра, небольшими - в средней области цитоплазмы, и единичными ПП вблизи быстро делящихся бластодермальных ядер.

Эти наблюдения позволили предположить существование общего фактора, который регулирует процессы сборни-разборки ЯПК и ЦП, но имеет разную активность в различных участках цитоплазмы эмбриона. Ранее было показано, что активность митотической киназы cdkl на ¡1-14 циклах деления снижена в центральной области эмбриона и повышена на периферии (Su et al., 1998). Мы предположили, что именно этот фактор может воздействовать на сборку-разборку ЯПК и ЦП, И влиять на морфологию ПП.

Исследование функции пористых пластинок в сянцитиальных эмбрионах

дрозофилы

Известно, что в ооцитзх Xenopus laevis на VI стадии оогенеза основное количество нуклеопорйна Nup62 находится в составе ЦП ПП (Cordes et al., 1995). На основании этого, а также других исследований (Kessel et al, 1992; Sïafstrom, Stae'neJin, 19й4) предполагалось, что фундаментальной функцией ПП является сохранение и запас избыточных нуклеопоринов.

Рис. 4 Диаграмма, демонстрирующая количество ядерных н цитопл аз магических ггор на эмбрион на 7-8, 1 !, 13 и 14 циклах деления эмбриона D. melanogaster линия Canton S (Onischenko, Cuba no va et al., 2004),

Для того, чтобы проверить, могут ли ПП в ранних эмбрионах дрозофилы выполнять такую функцию, мы провели сравнительное морф о метрическое исследование количества ядерных и цитоплазмам1ческих пор на разных циклах синцитиального развития дрозофилы (Рис. 4), Наши данные показали, что количество ЦП от 7-8 до 14 цикла деления остается примерно на одном уровне и составляет 6-7 миллионов ЦП на эмбрион, тогда как количество ЯПК увеличивается в

геометрической прогрессии примерно от 0,4 до 23 млн. ЯПК/на эмбрион (Onischenko, Gubanova et al., 2004). Эти данные свидетельствовали, о том, что количество нуклеопоринов, содержащихся в ЦП, является не достаточным для сборки новых ЯПК в делящихся ядрах на стадии синцитиальной бластодермы.

Проведенный далее молекулярно-биологический анализ показал, что семь исследованных нами нуклеопоринов представлены в цитозоле, ПП и ЯдО, при чем основное их количество находится в растворенной форме в цитозоле синцития, тогда как ЦП и ЯПК содержат лишь незначительную часть этих белков. Таким образом, результаты наших исследований опровергают фундаментальность функции пористых пластинок как запасающего компартмента (Onischenko, Gubanova et al., 2004).

Отличие в распределении нуклеопоринов, обнаруженное нами в синцитиальных эмбрионах дрозофилы, по сравнению с тем, что было описано для ооцитов Xenopus laevis на VI стадии оогенеза (Cordes et al., 19956), можно объяснить различными условиями, при которых белки собираются в ЯПК. В ооцитах амфибий, на VI стадии развития, ЯдО прекращает свой рост, и, возможно, поэтому нет необходимости иметь большой запас растворенных нуклеопоринов в цитоплазме для сборки ЯПК. В синцитиальных эмбрионах дрозофилы, где ядра делятся каждые 9 минут (Foe, Alberts, 1983) требуется, вероятно, наличие большого количества резервных белков, готовых к непосредственному использованию для быстрой сборки новых ЯПК. Мы предположили, что при таком быстром обороте белков ЯПК, нуклеопорины поддерживаются в цитоплазме в растворенном виде, что, возможно, обеспечивает их эффективное использование для сборки ЯПК в ядрах синцитиальных эмбрионов дрозофилы.

Cdkl и фосфатазы, чувствительные к окадаевой кислоте, являются ключевыми регуляторами сборки/разборки ядерных и цитоплазматических пор в митозе

Известно, что в эукариотической клетке переход к митозу происходит в результате активации митотических киназ. На стадии профазы митотическая киназа cdkl фосфорилирует множество белков в цитоплазме и ядре клетки, в результате чего происходят структурные изменения цитоскелета, ЯдО и хроматина. Известно, что для активации cdkl необходимы циклины - регуляторные белки, которые синтезируются в интерфазе и, связываясь с cdkl, переводят ее в активное состояние. Особенностью циклинов является наличие специализированного сайта - бокса деструкции, обеспечивающего их быструю деградацию, что позволяет своевременно инактивировать cdkl в конце митоза (Arellano, Moreno, 1997).

Для изучения влияния активности митотической киназы cdkl на процесс сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор, мы использовали ранние эмбрионы дрозофилы на 9-13 циклах деления синцитиальной бластодермы. Для инактивации cdkl использовалось несколько подходов: 1) снижение концентрации циклинов и 2) инактивация непосредственно самой митотической киназы. Нарушение синтеза циклинов вызывалось инъекцией циклогексимида, блокирующего синтез белков на стадии трансляции. В результате проведенного воздействия в эмбрионах наблюдалась остановка клеточного цикла на стадии интерфазы. Эмбрионы характеризовались крупными ядрами неправильной формы с интактными ЯПК, ПП имели нормальные ЦП, и их количество составляло около 8 млн. (Рис. 5).

Рис. 5, Диаграмма, демонстрирующая изменение количества цитоплазматических. пор на эмбрион (D. melanogaster линии Canton S) после инъекции циклогексимида, циклогексимида и GST-циклина В или буфера (Omsclienko, Gubanova et al., 2005).

При одновременной инъекции в эмбрионы циклогексимида и недеградируемой формы циклина В (08Т-циклина В), в цитоплазме синцитиальных эмбрионов наблюдались ЯдО без ЯПК и ПП с разобранными ЦП, количество которых во всем эмбрионе было значительно снижено {Рис. 5).

При исследовании р^-мутантов, характеризующихся сниженным уровнем митотических циюшнов А и В. были зарегистрированы ядра гигантского размера с нормальными ЯПК и крупные стопки ПП в цитоплазме эмбрионов. Морфометрический анализ количества ЦП в мутантаых эмбрионах показал, что в одном эмбрионе насчитывается около 12 млн. ЦП. При введении в эти эмбрионы С^Т-ционн В наблюдалась разборка ЦП и уменьшение их количества до 0,73 млн. ЦП/эмбрион (Рис. 6 ).

Рис. 6. Диаграмма, демонстрирующая изменение количества цитоплазматических пор на эмбрион, в рп§-мутанте (р.те1апо$а$1ег линия png 172) после инъекции буфера или недеградируемой формы циклина В (С8Т-циклин В). (ОщзсЬепко, ОиЬапоуа е( а!.. 2005).

Сходная картина была обнаружена нами при ультраструктурном исследовании мугантных эмбрионов, несущих термочувствительную мутацию в гене сёк 1, которая инакгивировала киназу при повышении температуры. Эмбрионы на 9-13 циклах деления выдерживались при температуре 30|1С. а затем подвергались

ультра структур ном у анализу, показавшему, что ядра имеют более крупный размер по сравнению с нормой, а ЯдО образует инвагинации и содержит нормальные ЯПК. При этом в цитоплазме эмбрионов обнаруживались стопки ПГ1 с ЦП, характерными для стадии интерфазы, в количестве около 5 млн. {Рис. 7). Таким образом, наши исследования наглядно продемонстрировали, что активность митотической киназы сс1к1 регулирует процесс сборки-разборки ЯПК и ЦП в синцлтиальных эмбрионах дрозофилы.

Рис. 7. Диаграмма, демонстрирующая изменение количества цитоплазматических пор на эмбрион в термочувствительном мутанте 1Ь,те1апо$а$1ег линия сс1к 1ь (А 171Т) после инкубации при 30ПС; при 22 С и В,те!а>!<Ш!хгег Сап!оп 8 при 30°С (ОшзсЬепко, СгиЬапоуа е! а!., 2005).

Согласно данным, полученным Е.А.Онищенко in vitro, комплекс cdkl/циклин В. вызывает диссоциацию пяти нуклеопоринов из ЯПК, при этом один из пяти нуклеопоринов - белок р 150, находится в фосфорилированном состоянии (Onischenko, Gubanova et aL, 20051. Эти данные позволяет предположить, что митотическая к и на за напрямую или опосредовано вызывает фосфорилирование некоторых нуклеопоринов и нарушает их взаимодействие с другими белками, входящими в состав ЯПК, что инициирует разборку поровога комплекса. Недавно полученные данные показали, что до разборки ЯдО в ооцитах Xenopus laevis. комплекс - cdkl-циклин В в неактивном состоянии локализуется на ЦП пористых пластинок (Beckhelling et af., 2003). Это позволяет предполагать, что комплекс cdkl-циклин В в сикцитиальных эмбрионах дрозофилы способен непосредственно связываться с поровыми комплексами в цитоплазме и ЯдО. Вместе с тем, показано, что в гифах мицелия гриба Aspergillus nidulans, где митоз протекает по закрытому типу — без разборки ядерной оболочки, фосфорилирование нуклеопоринов производится серин-треониновой киназой NIMA. которая активируется cdkl. Хотя гиперэкспрессия N1MA в клетках млекопитающих может индуцировать разборку ЯПК (Lu. Hunter, 1995), найти гомолог этого фермента у высших эукариот так и fie удалось. Возможно, NIMA играет специфическую роль в реорганизации поровых комплексов при закрытом митозе. Эти данные свидетельствуют о том, что, кроме cdkl, в разборке поровых комплексов могут принимать участие и другие киназы.

Если для разборки ЯПК и ЦП необходимо фосфорилирование нуклеопоринов, то для их сборки требуется обратный процесс - дефосфорилование. Для исследования роли фосфагаз в процессе пост-митотической сборки пор, в синцитиалыше эмбрионы дрозофилы была инъецирована окадаевая кислота в концентрации, которая

специфически йнгибирует белковые фосфатазы РР1 и РР2А. В результате этого, в эмбрионах происходила разборка пор в профазе, но их сборка не наблюдалась. Полученные данные позволяют сделать вывод, что фосфатазы (одна или обе) необходимы для пост-митотической сборки ЯПК и ЦП. Предполагаемое участие РР1 и РР2А в сборке ЯПК согласуется с множеством данных о роли фосфатаз в активации пост-митоти чес ких изменений в клетке. Так, например, на культуре клеток показано, что избыток PPI стимулирует выход из митоза, тогда как микроинъекция антител к фосфатазе PPL блокирующих ее действие, приводит к задержке клеток в митозе (Fernandez et al., 1992). Имеются также свидетельства участия РР1 в пост-митотической сборке ламины (Thompson et al., 1997; Steen et al., 2000), тогда как PP2A играет ключевую роль в пост-митот и ческой сборке аппарата Гольджи (Lowe et al., 2000).

Таким образом, наши исследования, в совокупности с данными других авторов, показали, что фосфатазы, чувствительные к окадаевой кислоте, необходимы для пост-митотической сборки ядерных и цито плазматических поровых комплексов. На основании этого мы предложили модель, согласно которой сборка разборка ядерных и цитошшматических пор в ранних эмбрионах дрозофилы регулируется динамическим равновесием между действием митотической кииазы cdkl, с одной стороны, и действием фосфатаз, чувствительных к окадаевой кислоте, с другой стороны (Рис. 8).

Рис. 8. Схематическая модель регуляции сборки /разборки ЯПК и ЦП в синцитнальных эмбрионах дрозофилы (ОгшсЬепко, ОиЬашт е( а1., 2005)

, Известно, что до 13 цикла деления в синцитнальных эмбрионах дрозофилы

активность ейк! регулируется через концентрации? циклинов и е частности цихлина В | (Ь^аг е! а1., 1994). Поэтому можно предположить, что увеличение концентрации пи клина В активирует сдк1, в результате чего инициируется процесс I фосфори дирован ия нуклеог.оринов, и поры разбираются. Деградация цк клина В происходит локально на микротрубочках веретена деления, В этой области cdkl инактивируется, и под действием фосфатаз, чувствительных к окадаевой кислоте, происходит дефосфорипкрование белков. пор. что приводит к сборке ЯПК и ЦП

Де фосфор илировэ ни ые

Фоофорнлироеа нные нукгеолорины или их комплексы

Предложенная нами модель, позволяет объяснить динамику ЯПК и ЦП в процессе клеточного цикла и синцитиального развития эмбриона. Наши наблюдения показали, что, в телофазе ПП расположены в экваториальной зоне веретена деления бластодермальных ядер. Ранее было продемонстрировано, что инактивация митотической киназы в телофазе регистрируется в районе веретена деления бластодермальных ядер (Su et al., 1998), что, как мы предполагаем, и вызывает сборку ПП.

Мы установили также, что на 7-8 циклах деления, в интерфазе, стопки ПП имеют небольшие размеры и гомогенно распределены по цитоплазме эмбриона. Так как до 8 цикла деления ядер уровень циклина В в цитоплазме эмбриона постоянно высок, предполагают, что и активность cdkl повышена на протяжении всего клеточного цикла (Edgar et al., 1994). Эти данные согласуются с нашими наблюдениями и позволяют предположить, что малые размеры стопок ПП на этих циклах деления обусловлены повышенной активностью cdkl.

Согласно нашим наблюдениям, на 13-14 циклах деления синцитиальной бластодермы, ЯПК в желточных ядрах и ЦП около них разбираются в митозе не полностью (Рис. 2 в), и в центре эмбриона наблюдаются крупные ПП. Подобная динамика ЯПК и ЦП может быть обусловлена сниженной активностью cdkl в центральной области эмбриона. Наше предположение подтверждается литературными данными, которые показали, что в желточных ядрах не происходит фосфорилирования гистона НЗ (Su et al., 1998). Поскольку он является субстратом для cdkl, это может свидетельствовать о сниженной активности митотической киназы в центре эмбриона. Совокупность наших наблюдений и литературных данных позволяют предположить, что снижение активности cdkl приводит к укрупнению ПП и неполной разборке ЯПК и ЦП в митозе. Возможно, снижение активности cdkl обусловлено недостатком циклинов А и В. Работы проведенные на синцитиальных эмбрионах дрозофилы показали, что мутация по циклину А приводит к эндорепликации хроматина бластодермальных ядер (Sauer et al., 1995), что является характерным для желточных ядер в норме. Можно предположить, что низкая концентрация циклинов А и В, необходимых для активации cdkl, обусловлена низким уровнем их синтеза в этой области эмбриона, так как в конце синцитиального развития центр клетки в основном заполнен желтком и фосфолипидами, и содержит лишь небольшое количество шероховатого ЭПР. В то же время, нельзя исключить возможность существования другой причины снижения концентрации циклинов вблизи желточных ядер.

Влияние Ran на сборку ядерных я цитоплазматических пор

Недавние исследования, проведенные in vitro и in vivo показали, что малая ГТФ-аза Ran оказывает влияние на процесс сборки ЯдО, ЯПК и ПП (Ryan et al., 2003; Walther et al., 2003). Неактивная форма Ran - Ran-ГДФ локализуется в цитоплазме клетки, где специфический фактор RanGAP, инициирует гидролиз Ran-ГТФ до Ran-ГДФ. Неактивная форма Ran транспортируется в ядро, где затем переходит в активную форму - Ran-ГТФ - при участии белка RCC1 (Regulate Chromosom Condensation), который локализуется на хроматине и необходим для его деконденсации в телофазе. Ran-ГТФ осуществляет отщепление импортируемого комплекса от ЯПК и сборку экспортируемого комплекса, вместе с которым он затем

транспортируется в цитоплазму. Белки RCC1 и RanGAP поддерживают Компартийнтадизацию активной и неактивной формы Ran в клетки: Кап-ГТФ - в ядре, а Ran-ГДФ - в цитоплазме (Clarke, Zhang, 2004). Исследования, проведенные in vitro на грубом экстракте из ооцитов Xenopus laevis, показали, что повышение концентрации Ran-ГТФ инициирует сборку ЦП, Это позволило предположить, что для сборки ЯПК необходим Ran-ГТФ, который, возможно, освобождает нуклеопорины от транспортных факторов, что делает их доступными лля сборки пор (Harel et al„ 2003; Walther et al., 2003). Существуют также данные о том, что цикл Ran необходим для формирования ЯПК у дрожжей (Ryan et al., 2003). Для выяснения влияния Кап на процесс сборки ЯПК и ЦП в синпитиальных эмбрионах дрозофилы, нами были предприняты попытки изменить компартментализацию активной и неактивной формы Ran в синцитиальных эмбрионах дрозофилы.

Наши исследования показали. что в результате последовательных микроинъекций мугантной формы Ran (RanT24N), который блокирует функцию RCC1 и не способен связываться с ГТФ, а затем шктюгекпшида (ем. выше) блокируется сборка ЯПК (Рис, 9 б). При этом наблюдался компактный хроматин, окруженный прерывистой двухслойной оболочкой, в которой не содержались ЯПК (Рис. 9 б). В то же время, данная инъекция не влияла на сборку ПП (Рис. 9 а), которые располагались и цитоплазме эмбриона а аяде -стопок и «одержали ЦП нормального строения (Губанова и др. 2006).

Рис. 9. Влияние инъекций RanT24N и циклогексимида на сборку ядерных и цитоплазматических пор в синшггиальных эмбрионах Û.meíanogastér линии Canton S. а - вид стопки пористых пластинок и цитоплазматических пор; б- фрагменты ядерной оболочки (черная стрелка указывает па разрыв оболочки). Я - ядро.

Согласно последним данным, для инициации сборки новых ядерных пор в ингактной ЯдО необходим комплекс Nup107-160, который выявляется в участках формирования новой ЯПК в ЯдО, как с ядерной, так и с цитоплазматической стороны (D'Angelo et al.. 2006). Параллельно было показано, что для встраивания ЯПК требуется также присутствие Ran-ГТФ в ядерном и цитоплазм этическом отделе поры (D'Angelo et al., 2006). Известно, что белок Nup 107 связывается с транспортным

фактором импортином |3 и расположен во внутриядерном отделе ЯПК (Walfher el al.. 2003). Можно предположить, что Ran-ГТФ освобождает комплекс Nupl 07-160 от связывания с импортном 1Í, что делает этот комплекс доступным для инициации формирования ЯПК. В этом случае отсутствие Ran-ГТФ, вызванное инъекцией мутантной формы Ran, может нарушать процесс формирования ЯПК на стадии инициации этого процесса.

Тот факт, что инъекции RaiaT24N и циклогексимида не влияет на сборку ЦП, не является удивительным. В нормальных клетках Ran-ГДФ находится в цитоплазме клетки, а Ran-ГТФ в ядре, что не предполагает его участие в процессе сборки ЦП. Поскольку данных о присутствии белка Nupl07 в ЦП нет, это позволяет предположить, что их сборка происходит по отличному от сборки ЯПК механизму.

Рис. 10. Влияние инъекций RCC1 и циклогексимида на сборку ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах D.melcmogaster линии Canton S, а - фрагмент участка цитоплазмы с ради ал ь но расположенными пористыми пластинками (белые стрелки), б - пористая пластинка, ассоциированная с микротрубочкой (черные стрелки указывают на микротрубочку).

Согласно нашим данным, микроинъекция RCC1 с последующим введением циклогексимида вызывала формирование необычно длинных, радиально расположенных микротрубочек (Рис. 10 а), с которыми были ассоциированы ПП (Рис. 10 б) При этом основная часть ПП наблюдалась в цитоплазме эмбриона, ЯдО отсутствовала, а декомпактизованный хроматин диффузно располагался в цитоплазме синцития. В работах, проведенных ранее, показано, что Ran-ГТФ вызывает формирование длинных микрогрубочек, а присутствие Ran-ГТФ на хроматине определяет направление их роста (Gruss ei al,, 2001; Wiese et al., 200V; Nachury et al., 2001). Эти данные подтверждают, что проведенные наш инъекции увеличивают содержание Ran-ГТФ в цитоплазме эмбриона, в результате чего, возможно, нарушается формирование веретена, ЯдО и ЯПК. Присутствие же в цитоплазме ПП с нормальными ЦП, свидетельствует о том, что ни Ran-ГТФ, ии Ran-ГДФ, вероятно, не оказывают влияния на сборку ЦП (Губанова и др. 2006).

Совокупность изложенных данных позволяет сделать вывод, что, несмотря на существование общих факторов, контролирующих процессы сборки-разборки ЯПК и

ЦП в митозе, на сборку ЯПК влияют дополнительные факторы, например,

компартментализация активной и неактивной формы Ran, и сборка ЯПК представляет

более сложно регулируемый процесс по сравнению со сборкой ЦП.

Выводы

1. Установлено, что цитоплазматические поры в синцитиальных эмбрионах Drosophila melanogaster содержат лишь небольшую часть нуклеопоринов. При этом основная часть белков ядерных пор присутствует в растворенном виде в цитозоле.

2. Обнаружено, что активность митотической киназы cdkl регулирует процесс сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах Drosophila melanogaster.

3. Установлено, что для сборки ядерных и цитоплазматических пор необходима активность фосфатаз, чувствительных к окадаевой кислоте.

4. Предложена модель регуляции митотической сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах Drosophila melanogaster, согласно которой этот процесс регулируется динамическим равновесием между активностью cdkl и действием фосфатаз, чувствительных к окадаевой кислоте.

5. Получены данные, свидетельствующие о взаимосвязи между укрупнением пористых пластинок и снижением активности cdkl в синцитиальных эмбрионах Drosophila melanogaster.

6. Продемонстрировано, что малая ГТФ-аза Ran участвует в формировании ядерной оболочки и ядерных пор и не влияет на формирование цитоплазматических пор и пористых пластинок.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Динамика и функция окончатых мембран в ранних эмбрионах Drosophila melanogaster // Тезисы докладов XIX Российской конференции по электронной микроскопии. Черноголовка, РАН. 2002. С. 210.

2. Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Динамика окончатых мембран в раннем эмбриогенезе Drosophila melanogaster. Ультраструктурные исследования и морфометрический анализ. // Тезисы докладов Ш Международной научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы современной биологии и биотехнологии». Алма-Аты, Казахстан. 2003. С. 151.

3. Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Электронно-микроскопический анализ динамики окончатых мембран в раннем эмбриогенезе у Drosophila melanogaster. Ультраструктура пороподобных комплексов в процессе митоза. // Тезисы докладов Международного Симпозиума по проблемам мейоза. Санкт-Петербург, Цитология. 2003. Т.45(9). С. 252.

4. Onischenko Е.А., Gubanova N.V., Kiseleva E.V., Hallberg E. Downregulated assembly of annulate lamellae in syncytial Drosophila embryos // International Symposium: Communication and gene régulation at the nuclear envelope. The University of Durham, Great Britain. 2003. P. 26.

5. Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Сравнительный анализ структурно-функциональной организации окончатых мембран и ядерной оболочки в раннем эмбриогенезе дрозофилы // Тезисы докладов. III съезд ВОГиС. «Генетика в XXI: современное состояние и перспективы развития», Москва, Россия. 2004. Т. II С. 281.

6. Onischenko ЕА, Gubanova NV, Kieselbach Т, Kiseleva EV, Hallberg E Annulate lamellae play only a minor role in the storage of excess nucleoporins in drosophila embryos. // Traffic. 2004. V. 5. P. 152-164.

7. Onischenko E.A., Gubanova N.V., Kiseleva E.V., Hallberg E. Cdkl and okadaic acid-sensitive phosphatases control assembly of nuclear pore complexes in Drosophila embryos. // Mol. Biol. Cell. 2005. V. 16. P..5152-5162.

8. Морозова K.H., Губанова H.B., Киселева Е.В. Структурная организация и возможная функциональная роль пористых пластинок, содержащих цитоплазматические поры. // Цитология. 2005. Т. 47(8). С. 667-678.

9. Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Малая ГТФ-азы Ran влияет на сборку ядерных пор, но не участвует в сборке цитоплазматических поровых комплексов. // Тезисы докладов. X Международная молодежная Школа-конференция, Владивосток, Россия. 2006. С. 132.

10. Губанова Н.В., Морозова К.Н., Киселева Е.В. Структурная организация и функция ядерных пор. // Цитология. 2006. Т. 48(11). С. 887-899.

11. Губанова Н.В., Киселева Е.В. Структурная организация и функция ядерной оболочки // Цитология. 2007. Т. 49(3) (в печати).

Подписано к печати 4 декабря 2006 г.

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7.

Тираж 100 экз. Заказ 133.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Губанова, Наталья Владимировна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Ядерная оболочка.

1.1.1. Строение и белковый состав ядерной оболочки и ламины.

1.1.2. Особенности организации ядерной оболочки клеток дрозофилы.

1.2. Ядерные поровые комплексы.

1.2.1. Ультраструктура ядерных поровых комплексов.

1.2.2. Биохимический состав ядерных пор.

1.2.3. Механизмы транспорта молекул через ядерную пору.

1.3. Цитоплазматические поры пористых пластинок. Особенности распределения, структурная динамика и взаимосвязь с ядерными поровыми комплексами.

1.3.1. Особенности распределения пористых пластинок в различных типах клеток и тканей.

1.3.2. Биохимический состав пористых пластинок и цитоплазматических пор.

1.4. Митотическая реорганизация ядерной оболочки и пористых пластинок

1.4.1. Характеристика основных этапов клеточного цикла.

1.4.2. Механизм разборки ядерной оболочки.

1.4.3. Механизм сборки ядерной оболочки.

1.4.4. Особенности сборки-разборки ядерных пор in vitro и in vivo.

1.4.5. Сборка-разборка цитоплазматических пор в условиях in vitro и в митозе in vivo.

1.5 Ранние эмбрионы дрозофилы как удобная модель для сравнительного исследования ультраструктурной динамики ядерной оболочки и пористых пластинок in vivo.

1.5.1. Характеристика раннего эмбрионального развития дрозофилы.

1.5.2.0собенности регуляции клеточного цикла в раннем эмбриогенезе дрозофилы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование динамики формирования и механизмов регуляции сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах Drosophila melanogaster"

Актуальность проблемы. Между ядром и цитоплазмой эукариотической клетки постоянно происходит обмен информационными молекулами (мРНК) и белками -регуляторами репликации, транскрипции и трансляции. Дефекты в механизмах этого процесса могут вести к нарушению экспрессии генов, что может иметь серьезные последствия, начиная с отклонения в развитии организма и заканчивая злокачественным перерождением тканей. С этой точки зрения исследование функциональных взаимоотношений между ядром и цитоплазмой имеет не только фундаментальное научное значение, но и является актуальным вопросом, имеющим приложение в современной медицине. Основную роль в регуляции обмена между ядром и цитоплазмой играют ядерные поровые комплексы (ЯПК) -специфические каналы в ядерной оболочке (ЯдО), через которые осуществляется активный и пассивный обмен макромолекул. ЯПК являются сложными надмолекулярными структурами, в формировании которых принимает участие около 30 различных белков, называемых нуклеопоринами. Изучение механизмов > формирования ЯПК является одной из актуальных задач в исследовании регуляторных механизмов ядерно-цитоплазматического транспорта.

Одним из подходов в изучении формирования ЯПК является анализ особенностей их реорганизации в ходе митоза. Известно, что в начале митоза ЯПК разбираются на отдельные белковые компоненты, ламина деполимеризуется, а ядерные мембраны фрагментируются. После окончания митоза образуется сплошная двухслойная оболочка, в которой de novo формируются ЯПК. Известно, что в эукариотической клетке переход к митозу и его завершение происходят в результате активации и инактивации митотических киназ, что вызывает структурные изменения в цитоплазме и ядре клетки (Arellano, Moreno, 1997). Однако, то, как эти митотические факторы регулируют процессы сборки-разборки ЯПК, остается до сих пор мало изученными.

Наиболее удобным объектом для изучения регуляции митотической реорганизации ЯПК и ЦП являются эмбрионы дрозофилы на стадии синцитиальной бластодермы. В них ядра претерпевают 13 быстрых синхронных делений, что позволяет получать образцы, содержащие ядра на разных стадиях клеточного цикла. В цитоплазме эмбриона присутствуют также ПП, которые синхронно собираются и разбираются в ходе митоза. В дополнение к этому, начиная с 9 цикла деления, ядра разделяются на две популяции: быстро делящиеся на периферии эмбриона Бластодермальные ядра, и находящиеся в центре эмбриона и не подверженные делению, полиплоидные желточные ядра. Это предполагает существование различий в митотической реорганизации ядер и расположенной рядом с ними цитоплазмы в центральной и периферической областях эмбриона. Синцитиальные эмбрионы дрозофилы удобны также для манипуляций и наблюдения с помощью конфокальной и электронной микроскопии. На основании этого были сформулированы следующие цель и задачи настоящего исследования. Цель диссертационной работы - изучение регуляции митотической реорганизации ядерных и цитоплазматических пор и анализ их функционального взаимодействия в эмбрионах дрозофилы на стадии синцитиальной бластодермы. В работе решались следующие конкретные задачи:

2. Выяснить являются ли пористые пластинки запасающим компартментом нуклеопоринов в синцитиальных эмбрионах дрозофилы.

4. Определить влияние малой ГТФ-азы Ran на процесс сборки ядерных и цитоплазматических пор.

Новизна и научная ценность работы:

Вклад автора

По результатам работы опубликованы следующие работы: Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Динамика и функция окончатых мембран в ранних эмбрионах Drosophila melanogaster II Тезисы докладов XIX Российской конференции по электронной микроскопии, Черноголовка, РАН. 2002. С. 210

Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Динамика окончатых мембран в раннем эмбриогенезе Drosophila melanogaster. Ультраструктурные исследования и морфометрический анализ. // Тезисы докладов Ш Международной научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы современной биологии и биотехнологии», Алма-Аты, Казахстан. 2003. С. 151 Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Электронно-микроскопический анализ динамики окончатых мембран в раннем эмбриогенезе у Drosophila melanogaster. Ультраструктура пороподобных комплексов в процессе митоза. // Тезисы докладов Международного Симпозиума по проблемам мейоза. Санкт-Петербург, Цитология. 2003. Т.45(9). С. 252.

Onischenko Е.А., Gubanova N.V., Kiseleva E.V., Hallberg E. Downregulated assembly of annulate lamellae in syncytial Drosophila embryos // International Symposium: Communication and gene regulation at the nuclear envelope. The University of Durham. 2003. P. 26.

Губанова H.B. Онищенко E.A., Киселева Е.В. Сравнительный анализ структурно-функциональной организации окончатых мембран и ядерной оболочки в раннем эмбриогенезе дрозофилы // Тезисы докладов. III съезд ВОГиС. «Генетика в XXI: современное состояние и перспективы развития», Москва, Россия. 2004. Т. II С. 281.

Onischenko ЕА, Gubanova NV, Kieselbach Т, Kiseleva EV, Hallberg E Annulate lamellae play only a minor role in the storage of excess nucleoporins in drosophila embryos. // Traffic. 2004. V. 5. P. 152-164;

Onischenko E.A., Gubanova N.V., Kiseleva E.V., Hallberg E. Cdkl and Okadaic acid-sensitive phosphatases control assembly of nuclear pore complexes in Drosophila embryos. // Mol. Biol. Cell. 2005. V. 16. P. 5152-5162;

Морозова K.H., Губанова H.B. Киселева E.B. Структурная организация и возможная функциональная роль пористых пластинок, содержащих цитоплазматические поры. // Цитология. 2005. Т. 47(8). С. 667-678; Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Малая ГТФ-азы Ran влияет на сборку ядерных пор, но не участвует в сборке цитоплазматических поровых комплексов. // Тезисы докладов. X Международная молодежная Школа-конференция, Владивосток, Россия. 2006. С. 132.

Губанова Н.В., Морозова К.Н., Киселева Е.В. Структурная организация и функция ядерных пор. // Цитология. 2006. Т. 48(11). С. 887-899.

Губанова Н.В. Киселева Е.В, Структурная организация и функция ядерной оболочки // Цитология. 2006. Т. 49(3) (в печати).

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Губанова, Наталья Владимировна

125 Выводы

1. Установлено, что цитоплазматнческне поры в синцитиальных эмбрионах Drosophila melanogaster содержат лишь небольшую часть нуклеопоринов. При этом основная часть белков ядерных пор присутствует в растворенном виде в цитозоле.

4.5. Заключение

Большая часть работ по изучению процессов сборки ЯдО и ЯПК в настоящее время проводится в системе in vitro, с использованием цитоплазматического экстракта из ооцитов Xenopus laevis, хотя отмечаются также эксперименты, использующие экстракт из эмбрионов дрозофилы (Lohka, Masui, 1983; Ulitzur et al., 1997). Однако для более полного понимания этих процессов необходима экспериментальная проверка этих результатов в системе in vivo. Необходимо, чтобы объект был хорошо известен с генетической точки зрения, удобен для наблюдения, прост в содержании и легок для манипуляций. Ранние эмбрионы дрозофилы как нельзя лучше подходят для этой цели. Дрозофила является одним из наиболее изученных биологических объектов. Эмбрионы удобны для изучения, как на электронно-микроскопическом, так и на световом уровне, с использованием флуоресцентной конфокальной микроскопии и антител к нуклеопоринам. Главным достоинством ранних эмбрионов дрозофилы является то, что на стадии синцитиального развития в одной клетке содержится большое количество синхронно-делящихся ядер, которые можно наблюдать и исследовать на разных стадиях митоза. Это позволило в опытах in vivo впервые показать, что сборка ЯПК в бластодермальных ядрах осуществляется через формирование промежуточных структур (Kiseleva et al., 2001).

Используя метод микроинъекций в эмбрионы дрозофилы, мы исследовали влияние различных факторов на процессе деления ядер, наблюдая в одной клетке, как нормальные ядра, так и ядра, подвергшиеся действию инъецированного агента. Этот подход позволил нам оценить влияние ряда регуляторных факторов на процесс формирования ЯПК и ЦП. В данном исследовании мы изучили роль трех митотических факторов, которые влияют на процессы сборки/разборки ЯПК и ЦП - митотической киназы cdkl, циклина В и фосфатаз, чувствительных к окадаевой кислоте, а также проверили как Ran-ГТФ и Ran-ГДФ влияют на этот процесс. Впервые удалось продемонстрировать, что митотическая киназа cdkl и фосфатазы, чувствительные к окадаевой кислоте, играют ключевую роль в регуляции процессов сборки/разборки ЯПК и ЦП в синцитиальных эмбрионах дрозофилы. Дополнительно проведенный сравнительный анализ динамики ЯПК и ЦП выявил различия в регуляции сборки этих структур. Таким образом, мы показали, что использование ранних эмбрионов дрозофилы открывает большие возможности для исследования широкого круга вопросов в области изучения механизмов функционирования ЯдО и ядерно-цитоплазматического транспорта. Предложенная нами модельная система является перспективной и представляет уникальные возможности для выяснения функциональной роли различных факторов в регуляции этих процессов в живой клетке.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Губанова, Наталья Владимировна, Новосибирск

1. Альберте Б., Брейд Д., Льюис Дж., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки // М.: «Мир». 1983.

2. Груздев А.Д. Применение стереологических методов в цитологии // Сборник научных трудов, Новосибирск. 1974.

3. Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Динамика и функция окончатых мембран в ранних эмбрионах Drosophila melanogaster // Тезисы докладов XIX Российской конференции по электронной микроскопии, Черноголовка, РАН. 2002. С. 210 ;

4. Морозова К.Н., Губанова Н.В., Киселева Е.В. Структурная организация и возможная функциональная роль пористых пластинок, содержащих цитоплазматические поры // Цитология. 2005. Т. 47(8). С. 667-678.

5. Aebi U., Cohn J., Buhle L., Gerace L. The nuclear lamina is a meshwork of intermediate-type filaments // Nature. 1986. V. 323. P. 560-564.

6. Afzelius B.A. The ultrastructure of the nuclear membrane of the sea urchin oocyte as studied with the electron microscope //Exp. Cell Res. 1955. V.8 (1). P. 147-58.

7. Akey C.W. Interactions and structure of the nuclear pore complex revealed by cryo-electron microscopy//J. Cell Biol. 1989. V.109. P. 955-70.

8. Akey C.W., Radermacher M. Architecture of the Xenopus nuclear pore complex revealed by three-dimensional cryo-electron microscopy // J. Cell Biol. 1993. V. 122. P. 1-19.

9. Allen T.D., Cronshaw J.M., Bagley S., Kiseleva E., Goldberg M.W. The nuclear pore complex: mediator of translocation between nucleus and cytoplasm // J. Cell Sci. 2000. V. 113. P. 1651-1659.

10. Arellano M., Moreno S. Regulation of cdk/ceclin cjmplexes during the cell cycle // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1997. V. 29. P. 559-573.

11. Ashburner M. Drosophila: a laboratory handbook // New York: Cold Spring Harbor Laboratoty Press. 1989.

12. Ashery-Padan R., Weiss A. M., Feinstein N., Gruenbaum Y. Distinct regions specify the targeting of otefin to the nucleoplasmic side of the nuclear envelope // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 2493-2499

13. Askjaer P., Galy V., Hannak E., Mattaj J.W. Ran GTPase cycle and importins are essential for spindle formation and nuclear envelope assembly in living Caenorhabditis elegans embryos // Mol. Biol. Cell. 2002. V.13. P. 4355-4370.

14. Bastor R., Lin A., Enarson M., Burke B. Targeting and function in mRNA export of nuclear pore complex protein Nupl53 // J. Cell Biol. 1996. V.l34. P. 1141-56.

15. Beaudouin J., Gerlich D., Daigle N., Eils R., Ellenberg J. Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina // Cell. 2002. V. 108. P. 83-96.

16. Beckhelling, С., Chang, P., Chevalier, S., Ford, C., and Houliston, E. Pre-M phase-promoting factor associates with annulate lamellae in Xenopus oocytes and egg extracts // Mol. Biol. Cell. 2003. V. 14. P. 1125-1137.

17. Bellamy S.J., Kendall M.D. The ultrastructure of the epithelium of the ductuli efferentes testis in the common starling (Sturnus vulgaris) // J. Anat. 1985. V. 140. P. 189-203.

18. Bialojan, C., and Takai, A. Inhibitory effect of a marine-sponge toxin, okadaic acid, on protein phosphatases. Specificity and kinetics // Biochem. J. 1988. V. 256. P. 283-290.

19. Bischoff F.R., Klebe C., Kretschmer J., Wittinghofer A. Ponstingl H. RanGAPl induces GTPase activity of nuclear ras-related Ran // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V.91.P. 2587-2591.

20. Bischoff F.R., PostingI H. Catalysis of guanine nucleotide exchange on Ran by the mitotic regulator RCC1 //Nature. 1991. V. 354. P. 80-82.

21. Bodoor K., Shaikh S., Enarson P., Chowdhury S., Salina D., Rahaijo W.H., Burke B. Function and assembly of nuclear pore complex proteins // Biochem.Cell Biol. 1999a. V. 77. P. 321-329.

22. Bodoor K., Shaikh S., Salina D., Rahaijo H.W., Bastos R., Lohka M., Burke B. Sequential recruitment of NPC proteins to the nuclear periphery at the end of mitosis // J. Cell Sci. 19996. V. 112. P. 2253-2264.

23. Bossie C.A., Sanders M.M. C-like intermediate filament protein // J. Cell Sci. 1993. V. 104. P. 1263-1272.

24. Bridger J.M., Kill I.R., O'Farrell M., Hutchison C.J. Internal lamin structures within G1 nuclei of human dermal fibroblasts // J. Cell Sci. 1993. V.104. P. 297-306.

25. Cardoso M.C., Leonhardt H., Nadal-Ginard B. Reversal of terminal differentiation and control of DNA replication: cyclin A and Cdk2 specifically localize at subnuclear sites of DNA replication// Cell. 1993. V. 74(6). P. 979-92.

26. Carroll C.W., Altman R., Schieltz D., Yates J.R., Kellogg D. The septins are required for the mitosis-specific activation of the Gin4 kinase // J Cell Biol. 1998. V. 143(3). P. 709-17.

27. Chakraborty J.J., Sinha H.A., Jhunjhunwala J. Annulate lamellae in guinea pig Sertoli cells // Expl. Mol. Path. 1986. V. 44. P. 222-229.

28. Chen L., Lee L., Kudlow B.A., Dos Santos H.G., Sletvold 0., Shafeghati Y., Botha E.G., Garg A., Hanson N.B., Martin G.M. LMNA mutations in atypical Werner's syndrome // Lancet. 2003. V.362. P. 440-445.

29. Chu A., Rassadi R., Stochaj U. Velcro in the nuclear envelope: LBR and LAPs // FEBS Lett. 1998. V. 441(2). P. 165-169.

30. Clarke P.R., Zhang C. Ran GTPase: a master regulator of nuclear structure and function during the eukaryotic cell division cycle // Trends in Cell Biol. 2001. V. 11. P. 366-371.

31. Cordes V., Gajewski A., Stumpp S., Krohne G. Immunocytochemistry of annulate lamellae: potential cell biological markers for studies of cell differentiation and pathology//Differentiation. 1995a. V. 15. P. 307-312.

32. Cordes V.C., Riedenbach S., Franke W. High content of a nuclear pore complex protein in cytoplasmic annulate lamellae of Xenopus oocytes // Europ. J. Cell Biol. 19956. V. 68. P. 240-255.

33. Cordes V., Reidenbach S., Franke W. Cytoplasmic annulate lamellae in cultured cells: composition, distribution, and, mitotic behavior // Cell Tissue Res. 1996. V.19. P. 177-191.

34. Cordes V.C., Rackwitz H., Reidenbach S. Mediators of nuclear protein import target karyophilic proteins to pore complexes of cytoplasmic annulate lamellae // Exp. Cell Res. 1997. V. 237. P. 419-433.

35. Courvalin J.C., Segil N., Blobel G., Worman H J. The lamin В receptor of the inner nuclear membrane undergoes mitosis-specific phosphorylation and is a substrate for p34cdc2-type protein kinase // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 19035-19038.

36. Coward SJ. On the occurrence and significance of annulate lamellae in gastrodermal cells of regenerating planarians // Cell Biol. Int. Rep. 1979. V. 3. P. 101-106.

37. Cronshaw J.M., Krutchinsky A.N., Zhang W., Chait B.T., Matunis M.J. Proteomic analysis of the mammalian nuclear pore complex // J. Cell Biol. 2002. V. 158. P. 915-927.

38. Dabauvalle M.C., Loos K., Merkert H., Scheer U. Spotaneous Assembly of pore complex-containing membranes ("Annulate lamellae") in Xenopus egg extract in absence of chromotin// J. Cell Biol. 1991. V. 112. P. 1073-1082.

39. Dabauvalle M.C., Loos K., Scheer U. Identifacation of a soluble precusor complex essential for nuclear рое assembly in viro // Chromosoma. 1990. V. 100. P. 56-66.

40. Daigle N., Beaudouin J., Hartnell L., Imreh G., Hallberg E., Lippincott-Schwartz J., Ellenberg J. Nuclear pore complexes form immobile networks and have a very low turnover in live mammalian cells // J. Cell Biol. 2001. V. 154. P. 71 -84.

41. D'Angelo M.A., Anderson D.J., Richard E., Hetzer M.W. Nuclear pores form de novo from both sides of the nuclear envelope // Science. 2006. V. 312(5772). P. 440-443.

42. De Souza C. P., Osmani A. H., Hashmi S. В., Osmani S. A. Partial nuclear pore complex disassembly during closed mitosis in Aspergillus nidulans // Curr. Biol. 2004. V. 14. P. 1973-1984.

43. Edgar B.A., Sprenger F., Duronio R.J., Leopold P., O'Farrell P.H. Distinct molecular mechanism regulate cell cycle timing at successive stages of Drosophila embryogenesis // Genes Dev. 1994. V.8(4). P. 440-452.

44. Eriksson M., Brown W.T., Gordon L.B. et al. Recurrent de novo point mutations in lamin A cause Hutchinson-Gilford progeria syndrome // Nature. 2003. V. 423. P. 293-298.

45. Ewald A., Hofbauer S., Dabauvalle M.C., Lourim D. Preassembly of annulate lamellae in egg extracts inhibits nucleat pore complex formation, but not nuclear membrane assembly// Europ. L. Cell Biol. 1997. V. 73. P. 259-269.

46. Ewald A., Kossner U., Scheer U., Dabauvalle M.C. A biochemical and immunologiccal comparison of nuclear and cytoplasmic pore complexes. J. Cell Sci. 1996. V. 109. P. 1813-1824.

47. Ewald A., Zunkler C., Lourim D., Dabauvalle M.C. Microtubule-dependent assembly of nuclear envelope in Xenopus laevis egg extract // Europ. J. Cell Biol. 2001. V. 80. P. 678-691.

48. Favreau C., Worman H.J., Wozniak R.W., Frappier Т., Courvalin J.C. Cell cycle-dependent phoshporylation of nucleoporins and nuclear pore membrane protein gp210 //Biochemistry. 1996. V. 35. P. 8035-8044.

49. Fenger D.D., Carminati J.L., Burney-Sigman D.L. et al. PAN GU: a protein kinase that inhibits S phase and promotes mitosis in early Drosophila development // Development. 2000. V. 127(22). P. 4763-74.

50. Fernandez A., Brautigan D.L., Lamb N.J. Protein phosphatases type 1 in mammalian cell mitosis: chromosomal localization and involvement in mitotic exit //J. Cell. Biol. 1992. V. 116. P. 1421-1430.

51. Fields A.P., Thompson L.J. The regulation of mitotic nuclear envelope breakdown: a role for multiple lamin kinases // Prog. Cell Cycle Res. 1995. V. 1. P. 271-286.

52. Finley D.R., Newmeyer D.D., Price T.M., Forbes D.J. Inhibition of in viro nuclear transport by a lec tin that binds to nuclear pores // J. Cell. Biol. 1987. V. 104. P. 189-200.

53. Fisher DZ, Chaudhary N, Blobel G. cDNA sequencing of nuclear lamins A and С reveals primary and secondary structural homology to intermediate filament proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83(17). P. 6450-6454.

54. Foe V.E., Alberts B.M. Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis // J. Cell Sci. 1983. V.61. P. 31-70.

55. Foisner R. Inner nuclear membrane proteins and the nuclear lamina // J. Cell Sci. 2001. V. 114. P. 3791-3792.

56. Franke W.W., Scheer U., Fritsch H. Intranuclear and cytoplasmic annulate lamellae in plant cells // J. Cell Biol. 1972. V. 53. P. 823-827.

57. Franke W.W., Scheer U., Fritsch H. Intranuclear and cytoplasmic annulate lamellae in plant cells // J. Cell Biol. 1972. V.53. P. 823-827.

58. Georgatos S.D., Pyrpasopoulou A., Theodoropoulos P.A. Nuclear envelope breakdown in mammalian cells involves stepwise lamina disassembly and microtubule-drive deformation of the nuclear membrane // J. Cell Sci. 1997. V. 110. P.2129-2140.

59. Gerace L., Blobel G. The nuclear envelope lamina is reversibly depolymerized during mitosis // Cell. 1980. V. 19. P. 277-287.

60. Gerace L., Blum A., Blobel G. Immunocytochemical localization of the major polypeptides of the nuclear pore complex-lamina fraction. Interphase and mitotic distribution // J. Cell Biol. 1978. V. 79. P. 546-566.

61. Girard F., Strausfeld U., Fernandez A., Lamb N.J. Cyclin A is required for the onset of DNA replication in mammalian fibroblasts // Cell. 1991. V. 67(6). P. 1169-1179.

62. Goldberg M., Lu H., Stuurman N., Ashery-Padan R. et al. Interactions among Drosophila nuclear envelope proteins lamin, otefin, and YA // Mol. Cell Biol. 1998. V. 18. P. 4315-4323.

63. Goldberg M.W., Allen T.D. The nuclear pore complex: three-dimensional surface structure revealed by field emission, in-lens scanning electron microscopy, with underlying structure uncovered by proteolysis // J. Cell Sci. 1993. V. 106. P. 261274.

64. Goldberg M.W., Allen T.D. The nuclear pore complex and lamina: three-dimensional structures and interactions determined by field emission in-lens scanning electron microscopy//J. Mol. Biol. 1996. V. 257. P. 848-865.

65. Goldberg M.W., Weise C., Allen T.D., Wilson K. Dimples, pores, star-ring and thin rings on growing nuclear envelopes: vidence for structure intermediates in nuclear pore complex assembly//J. Cell Sci. 1997. V. 110. P. 409-420.

66. Goldman R.D., Gruenbaum Y., Moir R.D. et al. Nuclear lamins: building blocks of nuclear architecture // Genes Dev. 2002. V. 16. P. 533-547.

67. Gruenbaum Y., Goldman R.D., Meyuhas R. et al. The nuclear lamina and its functions in the nucleus // Int. Rev. Cytol. 2003. V. 226. P. 1-62.

68. Gruenbaum, Y., Landesman Y., Drees B. et al. Drosophila nuclear lamin precursor DmO is translated from either of two developmentally regulated mRNA species apparently encoded by a single gene // J. Cell Biol. 1988. V. 106. P. 585-596.

69. Gruss O.J., Carazo-Salas R.E., Schatz C.A. et al. Ran induces spindle assembly by reversing the inhibitory effect of importin alpha on TPX2 activity // Cell. 2001. V. 104. P. 83-93.

70. Harel A., Chan R.C., Lachish-Zalait A. et al. Importin P negatively regulates nuclear membrane fusion and nuclear pore complex assembly // Mol. Biol. Cell. 2003a. V. 14. P. 4387-4396.

71. Harel A., Oijalo A.V., Vincent T. et al. Removal of a single pore subcomplex results in vertebrate nuclei devoid of nuclear pores // Mol. Cell. 20036. V. 11. P. 853-864.

72. Harel A., Zlotkin E., Nainudel-Epszteyn S. et al. Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos // J. Cell Sci. 1989. V. 94. P. 463-470.

73. Hatanaka K, Okada M. Retarded nuclear migration in Drosophila embryos with aberrant F-actin reorganization caused by maternal mutations and by cytochalasin treatment // Development. 1991. V. 111(4). P. 909-920.

74. Heald R., McKeon F. Mutations of phosphorylation sites in lamin A that prevent nuclear lamina disassembly in mitosis // Cell. 1990. V. 61. P. 579-589.

75. Hertig A.T. The primary human oocyte: some observations on the fine structure of Balbiani's vitelline body and the origin of the annulate lamellae // Am. J. Anat. 1968. V. 122(1). P. 107-37.

76. Hetzer M., Bilbao-Cortes D., Walther T.C. et al. GTP hydrolysis by Ran is required for nuclear envelope assembly // Mol.Cell. 2000. V. 5. P. 1013-1024.

77. Hinkle В., Slepchenko В., Rolls M.M. et al. Chromosomal association of Ran during meiotic and mitotic divisions // J. Cell Sci. 2002. V. 115(23). P. 4685-93.

78. Hinshaw J.E., Carragher B.O., Milligan R.A. Architecture and design of nuclear pore complex//Cell. 1992. V. 69. P. 1133-1141.

79. Hirano T. Condensins: organizing and segregating the genome // Curr. Biol. 2005. V. 15. P. 265-275.

80. Hoeger Т.Н., Krohne G., Franke W.W. Amino acid sequence and molecular characterization of murine lamin В as deduced from cDNA clone // Eur. J. Cell Biol. 1988. V. 47. P. 283-290.

81. Hoeger Т.Н., Zatloukal K., Waizenegger I., Krohne G. Characterization of a second highly conserved B-type lamin present in cells previously throught to contain only a single B-type lamin // Chromosoma. 1990. V. 99. P. 379-390.

82. Holmer L., Worman H.J. Inner nuclear membrane proteins: functions and targeting // J. Cell Biol. 2001. V. 146. P. 29-44.

83. Imreh G., Hallberg E. An integral membrane protein from the nuclear pore complexe is also present in annulate lamellae: Implication for annulate lamellae formation // Exp. Cell Res. 2000. V. 259. P. 180-190.

84. Izumi M., Vaughan O.A., Hutchison C.J., Gilbert D.M. Head and/or CaaX domain deletions of lamin proteins disrupt preformed lamin A and С but not lamin В structure in mammalian cells // Mol Biol Cell. 2000. V. 11. P. 4323-4337.

85. Jacobs H.W., Knoblich J.A., Lehner C.F. Drosophila Cyclin B3 is required for female fertility and is dispensable for mitosis like Cyclin В // Genes Dev. 1998. V. 12(23). P. 3741-3751.

86. Jenkins H., Whitfield W.G., Goldberg M.W. et al. Evidence for the direct involvement of lamins in the assembly of a replication competent nucleus // Acta. Biochem. Pol. 1995. V. 42. P. 133-143.

87. Jesionek-Kupnicka D., Zakrzewski K., Polis L., Liberski P.P. The ultrastructural study of primary intracranial germ tumors // Folia Neuropathol. 1999. V. 37. P. 171174.

88. Karr T.L., Alberts B.M. Organization of the cytoskeleton in early Drosophila embryos // J. Cell Biol. 1986. V.102(4). P. 1494-1509.

89. Kessel R.G. Electron microscope studies on the origin of annulate lamellae in oocytes of Necturus // J. Cell Biol. 1963. V. 19. P. 391-413.

90. Kessel R.G. The annulate lamellae from obscurity to sportlight // Electron. Microsc. Rev. 1989. V. 2. P. 257-348.

91. Kessel R.G. Annulate lamellae: last frontier in cellular organelles // Rev. Cytol. 1992. V. 133. P. 43-122.

92. Kessel R.G., Beams H.W. Intranucleolar membranes and nuclear-cytoplasmic exchange in young crayfish oocytes // J. Cell Biol. 1968. V. 39(3). P. 735-741.

93. King R., Peters J.M., Tugendreich S. et al. A 20S complex containing CDC27 and CDC 16 catalyzes the mitosis-specific conjugation of ubiquitin to cyclin В // Cell. 1995. V.81.P. 279-288.

94. Kiseleva E., Allen T.D., Rutherford S. et al. Yeast nuclear pore complexes have a cytoplasmic ring and internal filaments // J. Struct. Biol. 2004. V. 145. P. 272-288.

95. Kiseleva E., Goldberg M.W., Allen T.D., Akey C.W. Active nuclear pore complexes in Chironomus: visualization of transporter configurations related to mRNA export // J. Cell Sci. 1998. V. 111. P. 223-236.

96. Kiseleva E., Goldberg M.W., Daneholt В., Allen T.D. RNP export is mediated by structural reorganization of the nuclear pore basket // J. Mol. Biol. 1996. V. 260. P. 304-311.

97. Kiseleva E., Rutherford S., Cotter L.M. et al. Steps of nuclear pore assembly and reassembly during mitosis in early Drosophila embryo // J. Cell Sci. 2001. V. 114. P. 3607-3618.

98. Kiseleva E., Goldberg M.W., Cronshaw J., Allen T.D. The nuclear pore complex: structure, function and dynamics // Crit. Rev. In Eucar. Gene Exp. 2000. V. 10. P. 101-112.

99. Kolonin M.G., Finley R.L. A role for Cyclin J in the rapid nuclear division cycles of early Drosophila embryogenesis // Dev. Bio. 2000. V. 227. P. 661-672.

100. Lee L.A., Elfring L.K., Bosco G., Orr-Weaver T.L. A genetic screen for suppressors and enhancers of drosophila PAN GU cell cycle kinase identifies cyclin В as a targeting // Genetics. 2001. V. 158. P. 1535-1556.

101. Lin H., Wolfner M.F. The Drosophila maternal-effect gene fs(l)Ya encodes a cell cycle-dependent nuclear envelope component required for embryonic mitosis // Cell. 1991. V. 64. P. 49-62.

102. Lippincott-Schwartz J. Ripping up the nuclear envelope // Nature. 2002. V. 416. P. 31-32.

103. Liu J., Lin H., Lopez J.M., Wolfner M.F. Formation of the male pronuclear lamina in Drosophila // Dev. Biol. 1997. V. 184. P. 187-196.

104. Liu J., Song K., Wolfner M.F. Mutational analyses of fs(l)Ya, an essential, developmentally regulated, nuclear envelope protein in Drosophila // Genetics. 1995. V. 141. P. 1473-1481.

105. Lohka M.J. Analysis of nuclear envelope assembly using extracts of Xenopus eggs // Methods Cell Biol. 1998. V. 53. P. 367-395.

106. Lohka M.J., Masui Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components // Science. 1983. V. 220. P. 719-721.

107. Lopez J.M., Wolfner M.F. The developmentally regulated Drosophila embryonic nuclear lamina protein "Young Arrest" (fs(l)Ya) is capable of associating with chromatin // J. Cell Sci. 1997. V. 110. P. 643 -651.

108. Lowe, M., Gonatas, N. K., Warren, G. The mitotic phosphorylation cycle of the cis-Golgi matrix protein GM130 // J. Cell. Biol. 2000. V. 149. P. 341-356.

109. Lu K.P., Hunter T. Evidence for a NIMA-like mitotic pathway in vertebrate cells // Cell. 1995. V. 81. P. 413-424.

110. Lund E., Dahlberg J.E. Proofreading and aminoacylation of tRNAs before export from the nucleus // Science. 1998. V. 282. P. 2082-2085.

111. Lusk C.P., Makhnevych Т., Marelli M. et al. Karyopherins in nuclear pore biogenesis: a role for Kapl21p in the assembly of Nup53p into nuclear pore complexes // J. Cell Biol. 2002. V. 159. P. 267-278.

112. Macara I.G. Transport into and out of the nucleus // Micr. Biol. Mol. Biol. Rew. 2001. V. 65. P. 570-594.

113. Mani S.S., Rajagopal R., Garfinkel A.B., et al. A hydrophilic lamin-binding domain from the Drosophila YA protein can target proteins to the nuclear envelope // J. Cell Sci. 2003. V. 116. P. 2067-2072.

114. Marshall I.C.B., Wilson K.L. Nuclear envelope assembly after mitosis // Trends Cell Biol. 1997. V. 7. P. 69-74.

115. Martins S., Eikvar S., Furukawa K., Collas P. 2003. HA95 and LAP2 beta mediate a novel chromatin-nuclear envelope interaction implicated in initiation of DNA replication J. Cell Biol. 160 : 177-188.

116. Matsuoka Y., Takagi M., Ban T. et al. Identification and characterization of nuclear pore subcomplexes in mitotic extract of human somatic cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 254. P. 417-423.

117. Maul G.G. The nuclear and cytoplasmic pore complex: structure, dynamics, distribution and evolution // Int. Rev. Cytol. Suppl. 1977. V. 6. P. 175-186.

118. Meller V.H., McConnell M., Fisher P.A. An RNase-sensitive particle containing Drosophila melanogaster DNA topoisomerase II // J. Cell Biol. 1994. V. 126(6). P. 1331-1340.

119. Miller B.R., Forbes D.J. Purification of the vertebrate nuclear pore complex by biochemical criteria // Traffic. 2000. V. 1. P. 941-951.

120. Miller B.R., Powers M., Park M. et al. Identification of a new vertebrate nucleoporin, Nupl88, with the use of a novel organelle trap assay // Mol. Biol. Cell. 2000. V. 11. P. 3381-3396.

121. Minshull J., Pines J., Golsteyn R. et al. The role of cyclin synthesis, modification and destruction in the control of cell division // J. Cell Sci. Suppl. 1989. V. 12. P. 77-97.

122. Mlake-Lye R., Kurschner M.W. Induction of early mitotic events in a cell-free system // Cell. 1985. V. 4. P. 165-175.

123. Moir R.D., Spann T.P., Goldman R.D. The dynamic properties and possible functions of nuclear lamins // Int. Rev. Cytol. 1995. V. 162. P. 141-182.

124. Moir R.D., Spann T.P., Herrmann H., Goldman R.D. Disruption of nuclear lamin organization blocks the elongation phase of DNA replication // J. Cell Biol. 2000. V. 149. P. 1179-1192.

125. Monne L. Invetigations into the structure of the cytoplasm // Ark. f. Zool. 1945. V. 36. P. 1-27.

126. Moroianu J., Blobel G., Radu A. Previously identified protein of uncertain function is karyopherin a together with karyopherin p docks import substrate at nuclear pore complexes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 2008-2011.

127. Murray A., Hunt T. The cell cycle an introduction // New York, Oxford. Oxford University Press. 1993. P. 251.

128. Nachury M.V., Maresca T.J., Salmon W.C. et al. Importin beta is a mitotic target of the small GTPase Ran in spindle assembly // Cell. 2001. V. 104. P. 95-106.

129. Nakayama I., Moriuchi A., Taira Y. et al. Fine structural study of annulate lamellae complexes in human tumors // Acta Path. Jap. 1977. V. 27. P. 25-30.

130. Nakielny S., Shaih S., Burke В., Dreyfuss G. Nupl53 is an M9-containing mobile nucleoporin with a novel Ran-binding domain // EMBO J. 1999. V. 18. P. 19821995.

131. Ohba Т., Nakamura M., Nishitani H., Nishimoto T: Self-organization of microtubule asters Induced in Xenopus egg extracts by GTP-bound Ran // Science. 1999. V. 284. P.1356-1358.

132. Ohtsubo M., Roberts J.M. Cyclin-dependent regulation of G1 in mammalian fibroblasts // Science. 1993. V. 259(5103). P. 1908-1912.

133. Onischenko E.A., Gubanova N.V., Kieselbach Т., Kiseleva E.V., Hallberg E. Annulate lamellae play only a minor role in the storage of excess nucleoporins in Drosophila embryos // Traffic. 2004. V. 5. P. 152-164.

134. Onischenko E.A., Gubanova N.V., Kiseleva E.V., Hallberg E. Cdkl and okadaic acid-sensitive phosphatases control assembly of nuclear pore complexes in Drosophila embryos // Mol. Biol. Cell. 2005. V. 16. P. 5152-5162.

135. Osada H. Development and application of bioprobes for mammalian cell cycle analyses // Curr. Med. Chem. 2003. V. 10. P. 727-732.

136. Ostlund C., Ellenberg J., Hallberg E. et al. Intracellular trafficking of emerin, the Emery-Dreifiiss muscular dystrophy protein // J. Cell Sci. 1999. V. 112 (11). P. 1709-1719.

137. Padan R., Nainudel-Epszteyn S., Goitein R. et al. Isolation and characterization of the Drosophila nuclear envelope otefin Cdna // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 7808-7813.

138. Pagano M., Pepperkok P., Verde F. et al. Cyclin A is required at two points in the human cell cycle // EMBO. 1992. V. 11. P.961-971.

139. Palade G.E. Studies on the endoplasmic reticulum. II. Simple dispositions in cells in situ // J. Biophys. Biochem. Cytol. 1955. V.l(6). P. 567-582.

140. Panigua R., Nistal M., Bravo M. The formation of annulate lamellae in human Sertoli cells. Arch. Androl. 1984. V. 13. P. 9-14.

141. Pante N., Kann M. Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm // Mol. Biol. Cell. 2002. V. 13. P. 425-34.

142. Peel M., Lucas I., Duckett J., Greenwood A. Studies of sporogenesis in the Rhodophyta // Z. Zellforsch. microsk. Anat. 1973. V. 147. P. 59-74.

143. Pereda J., Cheviakoff S., Croxatto H.B. Ultrastructure of a 4-cell human embryo developed in vivo // Hum. Reprod. 1989. V. 4. P. 680-688.

144. Powers M.A., Forbes D.J., Dahlberg J.E., Lund E. The vertebrate GLFG nucleoporin, Nup98, is essential component of multiple RNA export pathway // J. Cell Biol. 1997. V. 136. P. 241-250.

145. Rabut G., Ellenberg J. Automatic real-time three-dimensional cell tracking by fluorescence microscopy//J. Microsc. 2004. V. 216. P. 131-137.

146. Raff JW, Glover DM. Nuclear and cytoplasmic mitotic cycles continue in Drosophila embryos in which DNA synthesis is inhibited with aphidicolin // J. Cell Biol. 1988. V. 107(1). P. 2009-19.

147. Ramos I., Winik B.C., Cisint S. et al. Ultrastructural changes during nuclear maturation in Bufo arenarum oocytes // Zygote. 1999. V. 7. P. 261-269.

148. Rawe V.Y., Olmedo S.B., Nodar F.N. et al. Abnormal assembly of annulate lamellae and nuclear pore complexes coincides with fertilization arrest at thepronuclear stage of human zygotic development // Hum. Reprod. 2003. V. 18 P. 576-582.

149. Resnitzky D, Reed SI. Different roles for cyclins D1 and E in regulation of the Gl-to-S transition // Mol. Cell Biol. 1995. V.15(7). P. 3463-9

150. Riemer D., Stuurman N., Berrios M., Hunter C., Fisher P.A., Weber K. Expression of Drosophila lamin С is developmentally regulated: analogies with vertebrate A-type lamins // J. Cell Sci. 1995. V. 108. P. 3189-3198.

151. Ris H. High resolution field-emission scanning electron microscopy of nuclear pore complex // Scanning. 1997. V. 19. P. 368-375.

152. Robbins E, Gonaras N.K. The ultrastructure of a mammalian cell during the mitotic cycle // J. Cell Biol. 1964. V. 21. P. 429-463.

153. Romeo R., Castorina S., Marcello M.F. Morpho-functional considerations on the annulate lamellae of the human oocytes // Bull. Soc. Ital. Biol. Sper. 1992. V. 68. P. 513-520.

154. Ryan K.J. Wente S.R. The nuclear pore complex: a protein machine bridging the nucleus and cytoplasm // Curr. Opin. Cell Biol. 2000. V. 12. P. 361-371.

155. Ryan K.J., McCaffery J.M., Wente S.R: The Ran GTPase cycle is required for yeast nuclear pore complex assembly // J. Cell Biol. 2003. V. 160. P.1041-1053.

156. Rzepecki R., Bogachev S., Kokoza E. et al. In vivo association of lamins with nucleic acids in Drosophila melanogaster// J. Cell Sci. 1998. V. 111. P. 121-129.

157. Sauer K., Knoblich J. A., Richardson H., Lehner C. F. Distinct modes of cyclin E/cdc2c kinase regulation and S-phase control in mitotic and endoreduplication cycles of Drosophila embryogenesis // Genes Dev. 1995. V. 9. P. 1327-1339.

158. Sazer S, Dasso M: The ran decathlon: multiple roles of Ran // J. Cell Sci. 2000. V. 113. P. 1111-1118.

159. Sen S. Nuclear membrane and cytoplasmic lamellae at meiotic prophase of Lilium microsporocytes // Cytologya. 1970. V. 35. P. 368-377.

160. Shamanski F.L., Orr-Weaver T.L. The Drosophila plutonium and pan gu genes regulate entry into S phase at fertilization // Cell. 1991. V.66(6). P. 1289-300

161. Sheridan W., Barrnett R. Cytochemical studies on chromosome ultrastructure // J. Ultrastruct. Res. 1969.27 :216-229.

162. Sherr С.J., Roberts J.M. Inhibitors of mammalian G1 cyclin-dependent kinases // Genes Dev. 1995. V.9(10). P. 1149-63.

163. Sigrist S, Ried G, Lehner CF. Dmcdc2 kinase is required for both meiotic divisions during Drosophila spermatogenesis and is activated by the Twine/cdc25 phosphatase // Mech. Dev. 1995. V. 53(2). P. 247-60.

164. Smith D. E., Gruenbaum Y., Berrios M., Fisher P.A. Biosynthesis and interconversion of Drosophila nuclear lamin isoforms during normal growth and in response to heat shock// J. Cell Biol. 1987. V. 105. P. 771-790.

165. Smith D.E., Fisher P.A. Interconversion of Drosophila nuclear lamin isoforms during oogenesis, early embryogenesis, and upon entry of cultured cells into mitosis // J. Cell Biol. 1989. V. 108. P. 255-265.

166. Smith T.F., Gaitatzes C., Saxena K., Neer E.J. The WD repeat: a common architecture for diverse functions // Trends Biochem. Sci. 1999. V. 24. P. 181-185.

167. Smythe C., Jenkins H.E., Hutchison C.J. Incorporation of the nuclear pore basket protein Nupl53 into nuclear pore structures is dependent upon lamina assembly: evidence from cell-free extracts of Xenopus eggs // EMBO J. 2000. V. 19. P. 39183931.

168. Spindler M, Hemleben C. Formation and possible function of annulate lamellae in a planktic foraminifer// J. Ultrastruct Res. 1982. V. 81(3). P. 341-50.

169. Stafstrom J.P., Staehelin L.A. Are annulate lamellae in the Drosophila embryo the result of overproduction of nuclear pore components? // J. Cell Biol. 1984a. V. 98. P. 699-708.

170. Stafstrom J. P., Staehelin L. A. Dynamics of the nuclear envelope and of nuclear pore complexes during mitosis in the Drosophila embryo // Eur J. Cell. Biol. 19846. V. 34. P. 179-189.

171. Steen R. L., Martins S. В., Tasken K., Collas P. Recruitment of protein phosphatase 1 to the nuclear envelope by A-kinase anchoring protein AKAP149 is a prerequisite for nuclear lamina assembly//J. Cell. Biol. 2000. V. 150. P. 1251-1262.

172. Steinkamp M.P., Hoefert L.L. Annulate lamellae in phloem cells of virus-infected Sonchus plants // J. Cell Biol. 1977.V. 74. P. 111-118.

173. Stuurman N., Heins S., Aebi U. Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions //J. Struct. Biol. 1998. V. 122. P. 42-66.

174. Su T.T., Sprenger F, DiGregorio P. et al. Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation// Genes Develop. 1998. V. 12. P. 1495-1503.

175. Sullivan Т., Escalante-Alcalde D., Bhatt H. et al. Loss of A-type lamin expression compromises nuclear envelope integrity leading to muscular dystrophy // J. Cell Biol. 1999. V. 147. P. 913-920.

176. Swift H. The fine structure of annulate lamellae // J. Biophys. Biochem. Cytol. 1956. V. 2. P. 415-418.

177. Takai, A., Bialojan, C., Troschka, M., Ruegg, J. C. Smooth muscle myosin phosphatase inhibition and force enhancement by black sponge toxin // FEBS Lett. 1987. V. 217. P. 81-84.

178. Teixeira M.T., Fabre E., Dujon B. Self-catalyzed cleavage of the yeast nucleoporin Nupl45 precursor//J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 32439-32444.

179. Terasaki M., Campagnola P., Rolls M.M. et al. A new model for nuclear envelope breakdown // Mol. Biol. Cell. 2001. V. 12. P. 503-510

180. Thompson L. J., Bollen M., Fields A. P. Identification of protein phosphatase 1 as a mitotic lamin phosphatases // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 29693-29697.

181. Tugendreich S., Tomkiel J., Earnshaw W., Whieter P. CDC27H colocalizes with CDC16Hs to the centrosome abd mitotic spindele and is essential for for the metaphase to anaphase transition II Cell. 1995. V. 81. P. 261-268.

182. Ulitzur N, Harel A, Goldberg M, Feinstein N, Gruenbaum Y. Nuclear membrane vesicle targeting to chromatin in a Drosophila embryo cell-free system // Mol. Biol Cell. 1997. V.8(8) P. 1439-48.

183. Ullman K., Powers M., Forbes D. The nucleoporin Nupl53 plays a critical role in multiple types of nuclear export // Mol. Biol. Cell. 1999. V. 10. P. 649-664.

184. Walther T.C., Alves A., Pickersgill H. et al. The conserved Nupl07-160 complex is critical for nuclear pore complex assembly // Cell. 2003a. V. 113. P. 195-206.

185. Walther T.C., Askjaer P., Gentzel M. et al. RanGTP mediates nuclear pore complex assembly // Nature. 20036. V. 424. P. 689-694.

186. Walther T.C., Fornerod M., Pickersgill H. et al. The nucleoporin Nupl53 is required for nuclear pore basket formation, nuclear pore complex anchoring and import of a subset of nuclear proteins // EMBO J. 2001. V. 20. P. 5703-5714.

187. Whitfield WG, Gonzalez C, Maldonado-Codina G, Glover DM. The A- and B-type cyclins of Drosophila are accumulated and destroyed in temporally distinct events that define separable phases of the G2-M transition // EMBO J. 1990. V. 9. P. 256372.

188. Wiese C., Wilde A., Moore M.S., Adam S.A. et al. Role of importin-beta in coupling Ran to downstream targets in microtubule assembly // Science. 2001. V. 291. P. 653-656.

189. Wiese C., Goldberg M.W., Allen T.D., Wilson K.L. Nuclear envelope assembly in Xenopus extracts visualized by scanning EM reveals a transport-dependent "envelope smoothing" event // J. Cell Sci. 1997. V. 110. P. 1489-1502.

190. Worman H.J., Yuan J., Blobel G., Georgatos S.D. A lamin В receptor in the nuclear envelope // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 8531-8534.

191. Wu W., Lin F., Worman H.J. Intracellular trafficking of MAN1, an integral protein of the nuclear envelope inner membrane // J. Cell Sci. 2002. V. 115. P. 1361-1372.

192. Yang L., Guan Т., Gerace L. Integral membrane proteins of the nuclear envelope are dispersed throughout the endoplasmic reticulum during mitosis. J. Cell Biol. 1997. V. 137. P. 1199-1210.

193. Yang Q., Rout M.P., Akey C.W. Three-dimensional architecture of the isolated yeast nuclear pore complex: functional and evolutionary implications // Mol. Cell.1998. V. l.P. 223-34.

194. Young R.G., Kothary R. Spectrin repeat proteins in the nucleus // Bio. Essays. 2005. V. 27. P. 144-152.

195. Yu J.,Wolfner M.F. The Drosophila nuclear lamina protein YA binds to DNA and histone H2B with four domains // Mol. Biol. Cell. 2002. V. 13. P. 558 -569.

196. Zalokar M, Erk I. Division and migration of nuclei during early embryogenesis of Drosophila melanogaster // J. Microscopie Biol. Cell. 1976. V. 25. P. 97-106.

197. Zalokar M, Erk I. Phase-partition fixation and staining of Drosophila eggs // Stain Technol. 1977. V. 52(2). P. 89-95.

198. Zatsepina O.V., Polyakov V.Y., Chentsov Y.S. Some structural aspects of the fate of the nuclear envelope during mitosis // Eur. J. Cell Biol. 1977. V. 16. P. 130-144.

199. Zhang Q., Ragnauth C., Greener M.J. et al. The nesprins are giant actin-binding proteins, orthologous to Drosophila melanogaster muscle protein MSP-300 // Genomics. 2002. V. 80. P. 473-481.

200. Zhao K., Harel A., Stuurman N., et al. Binding of matrix attachment regions to nuclear lamin is mediated by the rod domain and depends on the lamin polymerization state // FEBS Lett. 1996. V. 380. P. 161-164.

201. Zindy F., Lamas E., Chenivesse X. et al. Cyclin A is required in S phase in normal epithelial cells // Biochem. Biophys Res. Commun. 1992. V. 182(3). P. 1144-1154.

Информация о работе

Губанова, Наталья Владимировна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2006
ВАК 03.00.25

Диссертация

Исследование динамики формирования и механизмов регуляции сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах Drosophila melanogaster - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы