Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОСИНТЕТИЧЕСКОЙ ?-ТРЕВОНИН-ДЕГИДРАТАЗЫ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ИССЛЕДОВАНИЕ БИОСИНТЕТИЧЕСКОЙ ?-ТРЕВОНИН-ДЕГИДРАТАЗЫ"

АЩШИ НАУК СССР Ордена Ленива Институт биохишш им* А.Н. Баха

; На правах рукошг £ '

Лосева Ленина Петровна

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОСИНТЕТИЧЕСКОЙ ¿-ТР50ВЙН-ДЕГИДРА1АЗЫ:

ССпециальность 03.00*04-бнодогичесхая химия)

А ВТ О РЕ Ф Е Р А Т

^ссертации, представленной на соискание

учёной степени кандидата биологических наук

' ' ' ^ ' г

ist

На правах рукопис«

Ш.ДВЫИЯ Н4УК СССР Ордена Ленива Институт бяохиии* им. А.Н. Баха

ЛОСЕВА Левина Петровна

ИССЛЕДОВАНИЕ Ш0СШТЕТИЧЕСК02 ¿-ТРЕОНШ-ДЕГИДРАТАБЫ (Специальность 08.00.04- - биологическая хшая)

АБЮРЕ4ЕР Д." Т.

диссертанте, представаеиной на соискание ученой степеаи кандидата биологических наук

Работа, выполнена в лаборатории энзимодогша Орлова Ленина Института биохяшм вн. А.Н. Баха

Научен! руководятель: чдвн-Еорреспондвнт АН СССР, проф. B.I. КРЕТОВИЧ

Официальные оппонента: Доктор биологических наук О.Д. ПОЛЯНОВСКИЙ Кандидат ймодогических наук Н.£. ЛИВАНОВА

На официальный отзыв работа направлена на кафедру биогхииаи растений liacsaaosoro Г осу дарстве иного Университета nit, 11.8. Ломоносова*

Автореферат разослал */1973 г.

Защита диссертации состоится * на заседания Ученого Совета Ордена Ленива Института биохимии вн. А.й- Баха АН СССР (Москва, £-71, Ленинский лроспевт.ЭЗ)

С диссертацией хозно ознакомиться г библиотеке Института.

7явный секретарь, кандидат биологических наук

(H.H. ДЬЯЧКОВ)

ВВЕДЕНИЕ

Работами АшЗаргера и Шавха ,1956; •ит^ал^с,

г®м*?л, 1956 - 1958; ОНакуиюс., 1961 - 1965) было установлено, что д-треоЕйн-дегидратаза ( и-треошш-гидро-лиаза /дезакиен- ■ рующац/ Н.Ф. 4.2.1.16) (ТД-аза), каташэирушцая реакцию дегидратирования ¿»-треонина до с*-кетоОутирата (КБ) в ННд, участвует в биосинтезе д-изолейцива. Последний способен регулировать собственный биосинтез, подавляя активность этого фермента.

Особая структурная организация ТД-аэы дозволяет ей чутко реагировать на иаиенение концентраций ¿-«золейцина и ¿-валяна.

За последние 10 лет было показано, что ТД-аза широко распространена среди ыикроорганпзиов. Изучение этого фермента у ряда организмов позволило внести существенный вклад в развитие обидах проблем энзимологии.

Бели изучение ТД-азы Е.со& составило основу теории алдо-стерической регуляции (ЪШиЖ^ 1965), то изучение ТД-азы

дало толчок к развитие двух новых идей. Это,во-первых, теория "алдостерического предсостоякия"

1970), и,во-вторых, гипотеза, предполагавшая, что "незрелая * ¡лпюаЬге*) форма ТД-азы , образующая комплекс о ацил-тРНК, мохет участвовать в репрессии ферментов биосинтеза аминокислот с разветвленной цепь»

Кинетические исследования ТД-азы выявили

новое свойство ТД-азы и других регуляторкшс ферментов ускорение или замедление реакции во времени под влиянием лигандов, которое легло в основу теории гистерезисных ферментов (с^аяйл-, 1971).

Данная работа явилась развитием исследований ТД-азы, проводимы! в лаборатории энзимологии Института биохимии им. ¿.Я. Баха АН СССР под руководством В.Л. Кретовича. Исследование свойств ТД-аз растительных объектов позволяет проследить изменение каталитических и регуянторвых функций фермента в сравнительно- биохимическом аспекте. Так беСхдорофильные паразитные и сапрофитные растения:заразиха, петров крест, подъельник и гнездовка не имеют ТД-азы. По мере того, как растения переходят к автотрофыому питанию, они начинают синтезировать ТД-азу,.а. полупаразитные хлорофильные рутения;повилика, мохжевелояднин и оме- -да содержат ее.

Однако этот фермент у каждого вида растений имеет своеобразна« кинетические свойства. Так например, фермент повилики и кожжевелоядпика имеет "кислый" оптимум рй, в то время как фермент высших растений и микроорганизмов каталитически активен только при щелочном рН*

Многообразны такие свойства ТД-аз микроорганизмов• 3 связи с вышеаэлокенйш, представлялось целесообразна исследовать свойства ТД-азы азотфиясирувдего микроорганизма ОЬя&ёь^а'с&ъ

^ Вместе с тем« данная работа явилась следствием изучения дезаиинирования аминокислот экстрактами из клеток .

3 результате этих работ было установлено, что скорость деэами-нирования ¿-треонина превосхо^гг таковую для ¿-глютаиата в. 20 раз,.и что, таким образом, ТД-аэа является основным источником накопленияакмиака в экстрактах из клеток азотобактера.

В данной работе были поставлены следующие задачи:

1. Выделить ТД-азу в возможно более чистом состоянии, сохранив нативную конфориаци» фермента.

2. Йсследоэать кинетику поведения ТД-азы по отношению к субстрату и ретроингибитору- л-изолейцину.

3. Исследовать влияние концентрации водородных ионов на скорость реакции.

■+. Изучить действие дееенсибилизирувщих агентов.

5. Выяснить роль ¿-валина в регуляции активности ТД-аэи.

материалы и ыггоды КОШДОЙДЕШ

Для выделения ТД-азы клетки азотфиксирущей бактерии гктЗ&наьи выраадвали в японском, ферментере фирмы Ыарубиша на безазотистой синтетической среде (Иерусалимский» Зайцева, ¿мель, 1362) с Интенсивной аэрацией а течение часов и яри 32°С, Влажную клеточную пасту , суспендированную в 0,1 Ы К-фосфатном буфере рН 7,4 с добавками цкстеина и ЭДТА, подвергал* разрушений в ультразвуковом дезинтеграторе Ы£Е 500 вт (20 кц) в охлажденной камере. Полученный гомогенат центрифугировали 30 иди. лриЗО 000^,, надосагочную жидкость принимали за исходный экстракт, который подвергали дальнейшему фракционирований).

В жсходдый мсетрам добавили тверд»! (ЯН^)«» 304 да кок-цвнтрацжи 50?Ь насыщения (300 г на *) при рН 7,8, на холоду.Оса-док собирали центрифугирование« (15 кия.» 30 000^) и растворяй в 0,0X5 11 ¿-фосфатной буфере рЯ 7,4, содержащей стабилизирующие вещества: ¿-иэолейция (1ж10"Лз), пиридоксальфосфат (5х10~^Ы), дШ (Ш0Г®ц), ¿-цн«вин 42x10*^) и 2-иеркадтоэтано* (ЭхКГ^М) стартовый буфер. ' )

V Обессоленный на колоши с Сефадексои (г -25 Х2Вх5,7 с*) б»-> лов нажхашгал яолонку аз да1Э-целлохози («арка 1>Е-г2, фириа Ватмая) (25x5,5 си)« ураваовешекяув стартовый буфером. Неадсор-СированныЗ бело« вшивали стартовым бугром. Элхщию балка с колонки проводили ступенчато возрастающий концевтрадиялм КСв: 0,05, 0,10, 0,15, й 0,20 II в стартовом, буфере. Наибольшей ТД^ ■ V аз поЯ активностью обладали Франции элвироваиныа при концентрации КСг 0,15 и 0,20 М ( злюаты 0,15 и 0,20 М КС«). Дед дальней-; пей очистки использовали только элват.0,15 Ы КСв. : , ,.'.; • . ."

Белок, полученный -путец хроматографии на ДЗАЭ~целлплозе,. 'коццеитрирова.ли и 'обессоливали аутва голь-фильтрации иа Ссфа-' • дексе 5 -25 и дносиди а колонку с ЭКХ20ЛА-целлялоэой"(16x3,2 си) уравнозс-цеикую стартовьа буфером. Элэци«'проводили такие-,сту-:1 • пеичато слсдумедяма.-концентрациями: КСЗ: : 0,08, 0»1'2,0,16, 0,20 / и 0,30 11 стартовой:буфере»;сосредо-. ': точена: в', эдиате;' 0,20 11 дсг^'Т' ?;

.'•"• ^.Концентрированный" и обессоленный ;растзор^бел1са:послс' ЭКТЕО-'. ; ( элаат О»£0 - Ц'' КСв^-фраедйовя^

фосфата,кал^цая - 1939)»•;Сррбцкв.бе ¿га проводили;'^

в сбьеие я на холоду. Гель/уравнове^еинаи 0,03 к Кгфосфатнци ' буфврои рН?, 4 ,с оде фзвдкм, стаб или эиру ищи а, вещества, ¿обав днла ■ из расчета 2 ыг (сухой вес. геля) па .иг белка. Бедок эявировали: с геля небольшими иорцияиа (3 ил) К-фосфатиого буфера- рН 7,4 .'•• сладакадс.концвитрациа : 0,05. , 0,08 , 0,10 , 0,20", 0,30 и 0,<Ю Ы.'Буфер содергал стабилизирующие'вещества. Наиболее актов« вые элюатн (0,10-0,30 а) бшш обьедицены, а бедок.скоацонтриро~ ван высаливание« (КН^^ЗО^.^ до бО>.насыяеня*. • '

Конечинй,препаратт очи^ойннй 'и 525 раз, хранили под серяв-евслш ашганяе* (50% ласоденяя} в присутствии стабклисзаруицях .;: добр^ох. Для кинетических опытов бедок обессоливал! в» .кодов»:: с Се^&дексом С-25 (0,5x7,5 см), ураавовеиешюй 0,05 И К-фосфаа-вш буфером рН 7,4 о гоютвиаом (ШСГ®11)« - V. ■ >

Активность ТД-азы определяли:

а) по образованно *-к«тобутирата (КБ)« содержание которого иене* ряли по поглощения ого 2,4-дивитрофенилгидразока в щелочной среде при 540 и« ; 1966); я

б) по , который определяли иикродиффуэионным нетодои Цюбииов Львов,JКиротейне* 1968).

Стандартная реакционная спесь содержала в 1,0 мл 0,15 М К-фосфатного буфера рН 9,2 20 мкыолей ¿-треонина. Реащию начинали добавление« 0,01 мл раствора фермента. Контролен служила реак ционная спесь без ¿-треонина.

За единицу активности приникали количество фермента, способ вое образовать 1,0 шшоль КБ (иди КН^) за минуту при 37°С. Удедъ нуй активность рассчитывали как-количество единиц на 1,0 кг белка. Скорость образования КБ б$ша линейна в сечение 20 минут.

Белок определяли по методу Лоури {Хеиггре^а£., 1951).

Иолеетлярнур массу ТД-азы определяли по методу Эндрвса (,1965). Колонку, уравновешенную 0,10 и К-фосфатныы буфере и рК 9,3, содержащим ¿-валив (ХхЮ^Ы) и 2-меркаптоэтанол (5х10_3М), калибровали, пропуская фикоэритрин (ФЭ)-мод. масса 300 ООО, каталазу (КАТ)- 242 ООО, лактатдегидрогеяазу (ДДГ)-140 ООО я бычий сывороточный альбумин (СА) - 69 ООО. Объел элю-ции устанавливали по пику метчика, максимум которого определяли по поглощению при 280 им доя КАТ, ЛДГ,и СА и при 540 нм - для ФЭ, объем элюции ТД-азы определяли по пику активности.

Диск-злектрофорез в полиакридамидном геле высокоочиоенаого препарата ТД-азы проводили по методу Дзвиса Х964-). Для

разделения белков использовали трис-гднциновый буфер рН 9,2 и 7% мелкопористый гель. Сила тока составляла Зт& на трубку, напряжение - 450 вольт, время разделения-3 часа. Бедок, внесенный в количестве 10-25 мкг на трубку, после диск-адектрофореэа выявляли окрашиванием 0,2^ раствором кумаеи брид^антового синего в смеси метавол-уксусаая кислота-^яода (4:1:10), избыток краски отмывали этой же смесью.

ТД-азную активность в геле выявляли тремя методами. „I) Столбаил гола разреаада на диски толщиной 2 мм, которые помещали в пробирки с,0,15 И К-фосфатныа буфером рН 9,3 и растирали стеклянной палочкой. Экртракдаю фермента вели 30 мин. при ком-

чатнок температуре в 10 мин. при 37°. Р«акции начинали добавле-лхс* ^-треоввна, а образовавиийся КБ определял! по описанной выше методике.

2) Тетразолиевый метод (^И^^.-^^ЛЭП) основал ва восстановлении солей тетразолия до формазана промежуточными продуктами реакции дегидратирования Л-треошша. На месте локализации ТД-аэы а геле образуются фиолетовые зоны формазана.

3) Выявление активности под слое* агара» Столйики геля дослв , диск-электрофореза заливали расплавленный агар-агаром (температура около 45°), содержащим К-фосфатныЙ буфер рН 9,2 и ¿-треонин (100 шшолей в 4,5 мл). Образовавшийся на месте локализации ТД-азы КБ, обнаруживали по его 2,4-динитрофеявлгидразоау, который возникал после того, как поверхность агара покрывали раствором 2,4-динитрофенилгидразина.. . ^

PES У I. £ Т 1 Т Ы И С С Л Е Д О В А Н И Я

I. Внрелеяие и очистка ТЕ-азы. ' .,v-v ■;;

Для выделения ТД-азы бесклеточный экстракт с удельной ак-; ч тиввость» 0,78, получеиный из 200 г клеточкой пасты, подвергали ' фракционировани» сульфатом' аиаония, хроматографии'га колонках ;;; •. ДЭАЭ- и ЭК1Е0ЛА-целлилозы и фракционировании с лоаоцьа геля фос-

■ фата кальция. " wУ' -

■ Таблица I. Этапы очистка 'ГД-аэы у\ У ■■■УУ'-У;'-'

ФРАКЦИЙ : объем■ (мл) кол-во белка (иг). общая л активност (единицы) УД.' ь активн ед/кг белка степень очистки вы- т

исходные . ■экстраку 500,0 5 750,0 4 500 • 0,78 У ■ -'■' 100,0

(КН4)г so4, 50^ насшцекл^ 110,0 3 410,0 4 400 1,30 1,66 90,0

ВЕ-22» 0,I5ÜKtt 5Е-22, о.гомка 1050,0 ' 18.0 480,0 198.0 2 880 990 6,00. .5.00 .7,70 64,0

2°eOft(NH4)2S04, 50% насыщения 19,0 178,0 2 147 12,00 15;40 47,0

ЭКТЕОЛА-целлюлоза. 0.20Ы кое 8,4 24,3 I 373 56,50 72,00 80,5

гель фосфата иа (0,1-0,31)1 JC-босФ. бтаеоа 1.7 2,4 977 «0,00* 525,00 21,7

В результате этих операци! удельная активность фермента возросла в 525 раз, а выгод фериента составил 21%, Результаты очистки суммированы в таблице !. Следует отиетить, что ори хроматография ■ на ДЭАЭ-целдюлоэе активность обычно обнаруживалась в элюатах 0*15 в 0,20 и нее. Для очистки и кинетического анализа исполь-зоваля только фракции 0,15 и К.С8, а эдват 0,20 М КС0 (30$ от активности первой) отбрасывали*

Выделенная вами биосинтетическая ТД-аза ицела высок?» ката-дятическув активность и сохраняла чувствительность к аллостери-ческоиу ингибитору ь-изолейцину в.той яе степени, как и фермент исходного экстракта»

2* Характеристика высокоочиценкото препарата Т^-азы.

Л* Доведение ТД-азы при диск-электрофорезе в полаакрид-аыидном геле.

Ввсокоочищенный препарат ТД-ази О* цшбимй' при электрофорезе давад несколько бедковнх.полос <рис.1^Б и В). Чтобы определить; каким из полос соответствует ТД-азная активность, использовали три вьшеупомянутнг метода.

Рис.1. Диск-эдектрофо-рез в додиакрилаыиднои геде высокоочищенного

препарата ТД-азы ОН.

Аусхеиа активных зон ТД-азы, выявленных тетразолиевыы методом Б-распре делание Селяо—

выг полос: в геле (фо— то).

В—схема распределения

белковых полос. Г-активность ТД-ази, экстрагированной из дисков геля (столбя--"■ ки). ' Л

мкмо/ш я-кб 05р. ла20ичн

'а.

«я •х.

«К

ш

О- : Т* <Г •

А Б В

Тетраэолиевый метод сохаэал наличие .двух крупных активных зон форназана в верхней и-средней части геля,* между которыми . располагается серия (до б полос) мелких зон (расЛ А). Два бистро-*;® ищущихся белковых компонента (рис.1, а и б) Сияя неактивны.

Проверка ТД-азной активности непосредственно в геле, разрезанной на диски, показала сходное распределение активности (рмсЛг)

Однако выявление активности в мягких условиях, под слоем агара, показало, что диффузные быстро-движущиеся зоны (а и б)вс^в обладали слабой ТД-азной активности. Это позволило предположить, что эти диффузные зовы представляв* собой низноыодекулярные компоненты ТД-азы уёпл&жЛ^и, . образоваваиеся вследствие диссоциации фермента.

Таким образок, можно сказать, что наибольией ТД-азной активностью обладает белок в средней части геля, активность которого в .четырв-раза выше активности белка в верхней части геля.

Наличие нескольких активных зон при электрофорезе высоко-очищенного препарата ТД-азн можно объяснить либо существованием изофермантов, либо образованием высокомолекулярных форм. Существование йзофераентов , в принципе, возможно; но если учес» все активные зоны , то-синтез 6-10 изоферментов мало вероятен. К тому же, биосинтетнческая ТД-аза ие принадлежит к числу ферментсз, амеюгих множество изозимов.

Известен только один случай обнаружения двух белковых компонентов, обладающих ТД-азной активностью у итгтазт&Ммб&анЬту-тц 1969^. штамм же дикого типа этого

микроорганизма имел только одну ТД-азу. Поэтому образование множественных активных зок при электрофорезе высокоочкще&вого препарата ТД-азы &з,.г>ёпг!!ап{й1 можно объяснить агрегацией молекул .фермента в условиях электрофореза, когда белок сильно;концентрируется » узкой зоне в геле. ' "

Некоторым подтверждением образования высокомолекулярна:' форы у ТД-азы могут служить данине по распределе-

нию активности при элюции-частично очищенного фермента с колонки с Сефадексом 0-200. Невольной пик.ТД-азной активности выходил -вместе с белками, имеющими молекулярную массу порядка 1x10°.

Ряс. 2. Определение молекулярной массы высокоочищеиного

препарата ТД-азы ¿fe. ■урш&шаИ путем г ель-фильтрация на колонке с Сефадексом 6- -150.

ФЭ-фикоэритрин (нолек. масса 800 ООО); ТД-аэа -¿-трео- : нии-дегидратаза; КАТ-каталаза (242 000); ЛДГ-лактат-дегидрогеназа (140 ООО); СА-сывороточный альбуйин(690СЮ).

Кроме того, молек. масса ТД-азы di- yvne&zndü, определен- ! нал гель-фильтрацией на колонке с Сефадексом G- -150 (высокоочи-денный препарат) оказалась равной 270 ООО (рис.2), что несколько вше значения обычно приводимого для ТД-аз микроорганизмов (160 000-200 ООО) и, по-видимому, является следствием смещения пика за счет присутствия высокомолекулярного компонента.

Интересно, что сходное поведение обнаружено у Tii-азы ЩееСсу-jp¿x¿¿¿u*n. Www- , для которой показано образование двух, форм -с молекулярной массой 200 ООО и 400

Б. Влияние концентрация Фермента на удельную активность ТД-аэы ¿25r. v¿p¿&md¿£\

Появление при электрофорезе в полнакряламидяом геле яизко-модекудярных Форм ТД-аз и свидетельствует о диссо-

циации фермента. Чтобы выяснить, принадлежит ля ТД-аза- к классу

дассоцшгрувддах регуляторних ферментов (Курганов ,1963), или образование нхзкомодекуяярнга. фори является следствием раэрувения фермента при выделении, мы исследовали изменение ХД-азаоЯ активности с увеличением концентрации фермента.

-3 , ПГ

Рис.З. Зависимость удельной активности высокоочиценвого препарата ТД-взы от концентрации фермента, выраженная в логарифмических координатах.

представленная на рис.3 зависимость удельной активности фермента от концентрации ферментного белка выражается прямой линией в пределах испытанных концентраций (0,02 маг до б,4мзг). Эта граница концентраций достаточна для того, -чтобы утверждать, что ТД-аза не принадлежит к классу диссоциирующих регуляторних ферментов. Однако этот предел концентраций совершенно недостаточен, чтобы заметить агрегацию фермента.

3. Влияние ий на скорость реакции и кинетику действия ТД-азы.

Представленная на рис.4 зависимость скорости реакции от рН ддя трех начальных концентраций ¿-треонина (4, 40 и 140 икмолей) наглядно демонстрирует , что увеличение концентрации ¿-треонина вызЕваег не только сдвиг оптимума рН с 9,0 при концентрации треонина 4 икмоля до 9,8 при концентрации 40 мкмолей, во и образование сложной двухступенчатой кривой при концентрации субстрата, близкой к насыщающей.

' Ряе.;^./3дияаде рН ш скорость реакции, катализируемой ТД-азой а&. дри различных начальных кснцевграциях

1-треонина.

.'. Начальные концентрации ¿-треонина: I - 4г10~®М; -2 -4x10"%!; Б - 1,4г10~11[.

Этот факт свидетельствует о влиянии концентрации Н+ ионов на каталитические, связывающие и аллостерическве свойства-ТД-азы.

Мы проследили кинетику насыщения фермента субстратом при нескольких значениях рН. Рис. 5 показывает, что графики зависимости начальной скорости реакции от концентрации субстрата при рН 7,6 и 9,2 являются гиперболическими. До при высоком значении рН (10,1-10,55) эта зависимость становится ¿Т-образной. Такое, изменение формы* кривит отражает изменение кинетических параметров реакции, катализируемой данным ферментом. ' .

Для определения этих параметров скорость реакции измеряли при различных значениях рН в присутствии ряда концентраций ¿-треонина. Б результате получили сери» кривых насыщении, на основе которых по методу двойных обратных величин рассчитывали значения Уи ж Кц (для 5-образных кривых определяли ), а коэффициент кооперативности Хклла вычисляли из графиков Хилла (и а£; 1965).

Рис.5. Влияние начальных концентраций субстрата на скорость реакции, катализируемой очищенным препаратом ТД-азы

при различных значению: рН. А. Зависимость V от Б. Графическое определение

коэффициента кооперативное« Хилда л н. * Кривые получены при постоянной значении рН. Использо- . валя трис-фосфатиый буфер со следующими значениями рН: I - рН 7,5; 2 - рН 9,2; 3 - ра 10,15 я - 10,35.

Подученные значения и Зд^ (ковд&нхрация долунадшения): были представлены графически с использованием метода Диксона, и Уэбба : (1Э66), а лн - с использованием метода Тикера и 1есса(Зс*Ьис-,.

,1971).

Изменение трех указанных параметров при изменения рН изображено на рис.6. ¡Аз рисунка можно видеть, что при рН ниже 9,0 сродство фермента к субстрату изменяется мало 8 удерживается на высоком уровне. Максимальная скорость реакции увеличивается, при увеличении рН от 7,0 до 9,0, а коэффициент неоперативности не изменяется и равен 1,0. При рН выае 9,0 сродство фермента к ¿-треонину резко падает , максимальная скорость реакции удерхя-. вается на высоком уровне, а л,„ растет и в пределе приближается

Рис.6. Изменение кяветнчссхях параметров реакция, катализируемой ТД-азой Скупа&шях в зависимости от рН. .

А - зависимость р^ад от рЗ, Б - зависимость от рН, В - зависимость «.„ от рН.

Из атого мсхво предположить, что фермент находнтснвдвух аонфор-мациоянвг состоящих в залисаиостм от рЕ. Ери рН ниже 9,5 состояние фермента иохво охараятеркзова ть каа активное,, т.е. состояние с высоким сродством к субстрату и нормальной кинетикой, соответствуете й уравнение Цихаалиса-Меяген. Ври рН вдае 9,5 фермент па-рехади? в неактивное состояние с вязком сродством к субстрату и ¿-образной кинетикой. Подобные же результаты, где Н* ионы выступают в роли аллостерического активатора, были получены на дрожжевой шгруваткиназе (Ьй&£«,,1971).

4. Акяастерическая регуляция активности .ТД^азы.

¿.Действие ^-иаолейцина и ¿-ваддна на кинетику насменин фермента субстратом.

В отличие от ТД-аа В.со& ,1961) и Щ. ¿р&ушищ

(ЙаЕйчхэбб), проявлэдадх Э-образную зависимость V от , ТД-аэа а^.ггт^Ьм^с' имеет нормальную кинетику в широком диапазоне

¡'44* 7. Зависимость скорости реакция, катализируемой ТД-ааой . от концентрации субстрата в присутствии различны! концентраций Л-иаолейцина:

I - о; г - Гххо-4»; а - гхю"4» я 4 - ¿ою**4».

Буфер К-фосфатный, 0,15 II, рН 9,2;

А. - данные в координатах Дайнуивера-Бврка.

Б. - графики Хялла. ; " ■

■ т- л ■ В

л

4, 'Л .1 4 * 'ш —

¡' ^^ 8. Зависимость скорости реакции, „катализируемой ТД-ааой с2# -пп*£с1*и£с , от концентрация субстраха в присутствии различных концентраций ¿,-валина: I - 0 ; г - 5х10"\; 3 - 1хХ0"% и 4 - 4х10~%. Буфер ¡С-фосфатный ,0,15 Ц, рН 9,2. А - данные в координатах Лайнуивера-Бё рка. Б - графики Хилла.

- ЛЬ -

рВ от 7,0 до 9,5. Одвако в присутствии ингибитора ¿-изолейцина кинетика реакции, катализируемой данным ферментом становится . S^-ôtfpasBÔfi в sïom интервале рВ (рис.7). Интересно отметить, что сила кооперативного взаимодействия относительно невелика (>ie=I,45), что, по-видимому, говорит о величии у фермента только двух активных центров. Более сильное влияние ¿-изрлейцин оказывает на сродство ТД-азы к ¿.-треонину, о чем можно суди» по возрастании величины Sa5 . Так в присутствии 4x10"^ ¿»-кзодейци-на величина Йод била в 8 pas ваше, чем в отсутствие последнего.

Действие L-валнна на кинетику насыщения ТД-азы vèm&tHt&j L-треоняном отличается от действия д-изолейцина (рис.8). Это отличие проявляется в том, что низкие концентрации ¿-вадина не влияет на активность фермента. Кроме того, являясь конкурентным ингибитором 1Д-взы в высоких концентрациях (выше 2x1О"3!!) л-ва-лин ве изменяет характера зависимости V от [SJ0 , которая остается гиперболической..Об этом говорит линейный характер график-нов Дайнуивера-Берка и значение h, н близкое к единице (puc.S),

Б. Влияние ¿-треонина и ¿-валяна на ингибирование ТД-азц Ля. уьчл/Ь-т <ííi ¿-изолеИтономт

В присутствии высоких концентраций ¿-треонина (2х10~^|) зависимость V от fti]e для ¿-иаолеицвна представляет собой Í?-образ** яуп кривую с ftH=2,4 (рис. 9). Уменьшение концентрации субстрата; приводит в снижению сили кооперативного взаимодействия между центрами связывания изолейцива, а /1_ падает с 2,4 до!,4 при кон-

центрации ¿-треонина Хх10"М

При втом сродство фермента к

Рис. 9. йигвбирование ТД-азы COé., VtmÊ^amdu ¿-изодейципом в присутствии различвыг концентраций Л-треоияна:

I - ШО"3«, 2 - SxIO-3»!, 3-£с10~Ч1. А - зависимость относительной скорости реакции от [3]0 . Б - графики Хилда.

г с лейцину возрастало в 7 раз. 1акиы образом, арисоедгнеиие гусетрата к Тд^азе вызывает, о одной стороны, уменьшение ее сродства к изолейцину, а с другой, - увеличение кооперативного хзакыодействия между центрами, связывающими изолейцик.-

Сходный эффект имеет место в присутствии л-валина .(рис.Ю)*

дри различных концентрации л-валива:

1-0, 2 - 5хЮ~Ч1, 3 - 2x1И и 4 - 1x10"%.

К-фоефатный буфер, 0,15 М, рН 9,2. Концентрация ¿-треонина

равна 1x1и.

А - зависимость V от [3}0 .

Б - графики Хидла.

вызванного ¿г-изолейцином.

Данные получены при различные концентрациях ¿.-из о лейцина: I - О, 2 - 2г10""%, 3 - ШО**4!! и 4 - 4х10~*В. К-фосфатный буфер,0,15 а, рН 9,3. Концентрация ¿-треонина равна 1х10~®11. А - зависимость скорости реакции от концентрации ¿-валика, -Б - те асе данные представлены в виде зависимости относи- ' тельной скорости ' от концентрации ¿-калина,

где У(8од+И1<)Л} - скорость реакции в присутствии обоих эффекторов, а Уыь -скорость реакции в присутствии ¿-валяна. В- график Хилла для кривой

одинаковое по силе кооперативное взаимодействие между-цодфами связывания 1>-кзолеЙцина. Интересно, что концентрация ¿-валика, равная 5x10**^ выявляет предельную силу взаимодействия изолей-циновыг центров, и дальнейшее увеличение концентрации ¿-валина (в 20 раз) не приводит к значительном? росту 1-в (рис.10).

В. Снятие ¿,-валиноа ингябирования ТД-азы, вызванного ¿-изолейнином.-

При исследовании влияния возрастающих концентраций &-ва-:./ лина на скорость реакции , катализируемой ТД-азоН ууги/ллъЛД: (рис.11, кривая I), можно видеть, что ¿-валин , подобно ¿-изо-: лейцину , угнетает активность фермента,-но его эффективность как ингибитора в 170 раз ниже эффективности ¿-изолейцина (К^^ равны 1,35х10-2и и 8х10~%1 для ¡,-валина и ¿-изолейцина, соответственно).

Несмотря на то, что ¿-валин ингибирует активность ТД-азы, онспособен конкурентно снимать угнетение, вызванное. ¿-изолсЙ-': цином. Как видно из рис. II А {кривые 2,8,4) снятие ннгибирояа^ : рия наиболее эффективно при низких концентрациях /.-валина. Высокие яе концентрации ¿-в а лина, хотя и снижают кигкбарование, вызванное ¿-изолейцинои, сами являются ингибцторныык. СложнцЗ : характер этих кривых затрудняет расчет.;кинетических параметров;: . ^тобы упростить фориу кривых, скорость реакции .в присутствии и- ■ изолейцина и'. ¿-ва линф т а е с лик скорости реакции в присутствии:-.-.' ¿-валика. В результате получили кривые (рис.П, Б) более лрос-трго вида. .Наиболее интересной представляется кривая Л (рис.11,. . Б), которая по форме является Э-абразноЙ. Коэффициент кооперативности, рассчитанный по Хилл? для.этой кривой, имел значение. ,' 1,7 (рис.П, В). С целью проверки коэффициент неоперативности , был рассчитано использованием' разностного~методаТ(ургано1а(1971% Применив его для восходящей части кривой Ч (рис.П,А), получали . значение Л равное 1,4, т.е. величину того же порядка*

Таким образом, эти данные могут свидетельствовать о ток, что ¿-валин может, по-видимому, связываться на двух центрах, между которыми в присутствии высоких концентраций ¿-изолейцина возможно кооперативное взаимодействие.

Г. Действие ионов двухвалентной ртути.

Активность ТД-азы 07. чрезвычайно чувствительна

к ионам с К^для Нусг2 равно 2х10~°м; рис. 12, кривая I), Это свидетельствует о той, что ТЗ-аза является бел

кон, содержащим -/¡ЗН-группы. Предполагают, что ЗН-группы ыо-гут связывать аллостерический ингибитор ¿-изолейцин (ЗииълЛсА.,

Добавление л-изолейцина в концентрации 8x10"% (54% инги-бирования) не защищает ТД-азу Ш. от угнетения ртуть»

как этого можно было бы ожидать, если бы ионы ртути и ¿-изолейцин конкурировали за одни центры на ферменте. 5 данной случае, при совместной их действии наблюдается аддитивность, и для Н5ОВ2 в присутствии ¿-изолейцина не изменяется (рис. 12 , кривые I и 2). л '

В противоположность ¿-изолейцину, л-валин (2£10-3Ы) защищает ТД-азу от ингибироваиия ртутью, вызывая увеличение в 1,7 раза (рис.12, кривая 3). Вероятно, это вызывается тем, что ионы ртути и х-валин конкурируют за одни и те же - ЗН-групаы на молекуле ТД-азы СН. . Следует отметить, что высо-

кие ингибирующие концентрации ¿-валина не усиливают защитного ^эффекта (рис.12, кривая 4). Подобное защитное действие только , низких концентраций ¿-валяна отмечено для ТД-азы иЖмодэи* (£><й£г,1966).

. Высокая чувствительность ТД-азы ууп1/а*и£й д ионам ртути указывает также на возможное участие ЭН-групп в связывании субстрата. Это подтверждается тем фактом, что ¿-треонин способен конкурировать с ионами ртути (рис.13). Интересно отметить, что низкие концентрации (2х10~%), ингибируя активность фермента,.не вызывают изменения формы кривой зависимости У от [9]0 (рис. 13,А), которая остается гиперболической. Высокие же концентрации ртути^.конкурентно ингибируя действие фериевта.из-меняют кинетику насыщения фермента субстратом, которая становит ся 7-образной (рис. 13, А и 5).

Таким, образом, данные по защите ТД-азы &И, и*ы£а>*и£и ¿-ва лином от ингибирования НдСВ^ и различие в действии высоких и низких концентраций ионов ртутя на кинетику насккенкл ^зраента субстратом свидетельствуют.по всей вероятности, о рсзлячита ¡г-ун ааиях БН-групп у ферменте.. ■. ,

. Рас.12- Завясимооть скорости реакции, катализируемой ТД-азой Оде. от концентрации

н^сг2.

Данные получены:

1 - в отсутствие эффекторов, я в присутствии эффекторов -

2 - ах10_5М Л-изодейцина,

3 - ггЮ-^И^валина и

4 - 1х10-2и ¿-валяна.

Буфер К-фосфатяый, 0,15 К, рН 9,3. Концентраций /-треонина равна ШО"^.

Ряс. ХЗ.Блинние различных кон-центрадяй Нд на зависимость V о* для ТД-азы Дх Данные получены я присутствии слодувцих концентраций И^СЙ^ 1- 0, 2 - 2х10~^М, 3- ЗхЮ^а, 4 4х1СГ6и. ■

А - данные в ноординатах1айн-... уявера-Бврка. Б-графикиХилла»

СЕСЩЕВйЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Одних из признаков регулгаорных ферментов является коолера-тивность по отношена» к субстрату иди эффектору. Классический примером может служить биосинтетическая ТД^аза Е. cofa-",' у которой кинетика насыщения субстратом является ¿¿-образной 1961). Зависимость V от /Sj0 для ТД-азн G9,vbnt6a>ncu¿ была гиперболической в широком интервале рН (7,0 - 9,5). Мы предположили, что нормальная мнетжа является следствием присутствия в исходном экстракте активатора фермента ¿-валина, так как по данным Зайцевой (1965) концентрация его в клетках О-х.-ш^л/ьсШ. достаточно высока. Однако высокоочищенный препарат ТД-азы также проявлял нормальную кинетику. Поэтому можно считать, что это свойство присуще данному ферменту, и в клетке.он находится в активном состоянии; Аналогичная кинетика показана для ТД-аз S.iypft¿-тшЫмгя. (W»,So~>wa¿. tI966iJ.jd^ 0faif¿t¿d,i¿m£a*f¿t-,1970) и для ряда других ферментов. '

В присутствии аллостерического ингибитора - ь-изолейцина гиперболический характер зависимости скорости реакции от концентрации субстрата изменялся на^-образный (рис.7), коэффициет кооперативное!* достигал значения 1,45. В присутствии яопов ртути кооперативное взаимодействие между активными центрами было вше, и <* н равнялся 1,8. (рис* 13). Эти результаты позволяют пред- . положить существование двухактивных центров на молекуле ТД-азы Cést.T/Vrufa*%rf<''.

Ыехду тем, ¿У-образнме зависимости у от fS?0 для ТД-азы • véntSamé* могут быть получени и в отсутствие эффекторов, если ■ рЦ реакционной среды будет выше 9,5 (рис.5, кривая 2 иЧ). ^-Образность.кривых насыщении фермента субстратом иокет быть связана с диссоциацией фермента при высоком рН 1968). Учитывая это обстоятельство, мы поставили опыт по кинетике инактивации фермента при различных значениях.рН.-Мы рассуждали следующим образом: если высокое значение рН вызывает диссоциаций фермента, то будет набдвдаться очень быстрая и полная инактивация фермента во времени, поскольку скорость реакции при высоком рН и низкой концентрации субстрата близка к нулю- (рис.5, кривая 4).

Однако, как можно видеть из рис, 14, быстрой и полной инактивации фермента при рН 10,3 не происходит, я период полухиааи фермента равен двух часам. Исходя из этого, 1ш пришли и выводу, что кинетические , в аллостерическав изменения ТД-азы .

происходив лри высокой рН (рис.4-6) связаны с конформационвы-ии языенеимяии олигоиерной молекулы фермента. Диссоциация протона из группы (групп) с р&»10,3 сопряжена, по-видимому, с ков-формационной перестройкой молекулы и затрагивает центры связывания субстрата, во ив влияет на скорость распада фермент-субстратного комплекса. Кохно предположить, что протон диссоциирует из йиффова основания. На такую возможность указывают Дэвис и Иетдлер (фатл, Тти&^&л,, 1962).

_ Рис* 14. Влияние рН на стабильность ТД-ааы Оа.уюи&ьпОЛ.

Белок (около 8 икг/ил) вкдерживали при комнаткой температуре в трис-фосфатрои буфере (0,15 М) при следующих значениях рН: I - 9,1, 2 - 7,6, 3 - 10,3. .

Через каждые 15иин. 0,01 мл раствора фермента вноси. ли в реакционную смесь и определяли активность ТД-азы в стандартных условиях.

ТЕря ■ яау чем» адлостержчесхих свойств ТД-ааы О*. .

больное вяяшшяе мы уделили взаимному влиянию двух эффекторов -¿-валяяа я ¿-язолейцява.

Путь бяссиятваа еткх акянокяслот яюшчает четцре обцях фер-" иеятатжвныг реакция. Каждая реакция катализируется ферментом ' обаян яак для биосинтеза ¿»валяна, так ж ¿-изолейцана. Поэтому можно ожядать, что одна аминокислота будет $лиять на биосинтез другой. " ■ *: - _ > ;■

ИсследованлеТД-азмидроорганнзмовлокаэало,что ..¿-валян, в одних случаях, является активатором. 1Д-аа '.'/■ЗуроК ^

1963),Д^йЛмюйййС 41966)

ТПадА,,1968),8. Щи^Шо,£-в других -инги-

битором подобно А-изолеЙШ1ВУ\УДЙо&^с:/е>г^^ 196ВУ в-р.23'(Еаш^^/.Я^^^ '

Аяалнзгашетическихданныг,!;^ препаратом ТД-ааыДк показал, что ¿-валка в высоких; ;.

концентрациях ицтибярует активность ТД-азы (риа,II,кривая I), но в то хе время можат снимать,икгибированиэвызванное ¡¡золей-аинс*, пря этой оссбейно аффективен в пизких концентрациях (рис. 10 я II). Аналогичные' эффекты ¿-валяна наблюдали на ТД-азе.5_^^ /пихичн • и

■ 1ЭТ0).; ■■

Вследствие близкого структурного соответствия между л-ва-дяяоя я с-жзолейцином. центры приссю динения: »тих эффектороз мо- , гут, бить ядеаткчны. ■ Действительно эффект устранения Ч-валиком "; - ■ икгжбированяя, ТД-азы выз вакйога 1-й золе йя иной'

(ряс.П) , можно трактовать так,;-что'Л^ваган*;. являясь более ела- ■ бы» иигябитором ТД-аэа, вн«сияйет из' центра ; болеа сальный ин- ; гябятор ¿-иаодевцин, Тбм сашм сни&я инггЦирозание ТД-азы.

Если ато так, то • можно предполагать • сходное вяияние> • обоях эффекторе» ва кинетику действия; ТД-азы* Однако кинетика , насыяаяяя ТД-аяы субстратен в чрйсутствии ¿-вадипа ямяется гиперболической, в то; время вак с ¿-изолейданби*- - 5-образной. Кроме того, ¿-валянзачищает ХД^зЬ от) ингвбя^^ а (.-вволейцин ие аащявает, Я\Д; Присутствии -: Нд СЧ^ ■ ка&яцдадтся ад*: : дигнвный Эффект (ряс.12). ..' .',. - л

Все это свидетельствует о том, что , невидимому, центры .

ческях данных можно предположить-, что существует два центра присоединения для с-аалиыа я четцре - для 1-*золейцина.

Локазат е льс т в ом существования у ТД-аз различных центров присоединения ингибитора и субстрата, сложат данные по десенсибилизации фермента (¿З^гл^глхж; 1961). ¡¿ы пытались получить десенсибилизированную ТД-аз у С&.уёпг£лп£Ц1. Прогревание частичне-очищенного фермента при ¿'50° и 55°С в течение 10 шин, приводящее к снижению активности, не оказывало влияния на чувствительность, фермента к ¿-изолейцику. Также, беэуспешш была опыты ас действии ионов ртути. Следует.ск^ать,- что не для всех ТЛ-аз получена десенсибилизированныЗУфЬрмента. Попытки подучить десенсибилизированную форму ТД-азы ^^«¿(мг были такай безуспешны (Яо&Лг»*. - 1968).

Зозможно, что неудачи с десенсибилизацией фермента ионами ртутя объясняются неидентичностью центров присоединения ионов ртути и ¿-изолейцина, как это можно заключить из данных по ад-итивному действию Н^СЗ^ и ¿-изолейцина на активность Тд-азы уШбьисЦс (рис. 12, кривые I и 2). Однако некоторым указанием на разграничение центров связывания ¿-треонина и ¿-изолейцина служат данные по частичной и обратимой десенсибилизации, происходящей при увеличении рН. Из рис. 15 видно, что оптимум ингибиро-эанйя (рН 3,0) отличается от оптимума.активности,(рН 9,0).

Рис.15. Влияние рН на скорость реакции, катализируемой ТД-аЗОЙ гузизёиеа^'-и степень ингибирования ТД-азы ¿-нэолейциноа-Кривая I -.относительная скорость реакции; Кривая 2 - ^ ингибироваяия активности ТД-азы ¿-изолей-цином (2хЮ~%). Буфер трис-фосфатный, 0,1511. концентрация"¿-треонина 4x1 О*"3!!.

Подводя итоги всоиу сказанному, весьма важно произвести сравнительно-биохимический анализ свойств ТД-аз различны! микроорганизмов. У ряда микроорганизмов: Б.90&♦ Р.ниШхгеиьт. В.у&-ушп, £атхма£'г зависимость скорости реакции от концентрации субстрата является1 ^-образной. У других микроорганизмов -5

Жлииш. Ш&п&тг**(• и в том числе у ТД-азы имеют гиперболическую кинетику по отношению к субстрату. Это может свидетельствовать о том, что регуляция активности этих двух типов ТД-аэ различна. Активность ТД-аз с гиперболической кинетикой насыщения фермента субстратом регулируется, по-видимому, путем угнетения конечным продуктом (¿-изолейцином), в то время как 5-образная кинетика требует активации фермента ¿-валином.

Если рассмотреть четвертичную структуру, то биосинтетическая ТД-аза бактерий характеризуется тетрамервым строением. Однако количество активных и аллостерических центров.может быть различным у разных организмов, йолекула ТД-азы Е.со& , 5, {^ркоти^т и Ъ^иШ^ имеет по два активных и два аллостерических центра, а ферменты из "В.-^шш и Р.ъиШхнпл** по четыре 'и активных и аллостерических центра. ТД-аза иимйьпдйц занимает промежуточное положение и имеет, по-видимому, два активных и четыре аллостерических центра и сходна по строению с ТД-азой дрожжей.

Неспособность ТД-азы в отличие от ТД-аз Е. соЦ

и фкч&еш к десенсибилизации под влиянием ртути и нагревания, возможно отражает особую взаимосвязь активных и аллостерических центров у ТД-азы ССя. , что позволяет более тонко регулировать активность фермента »■иг.

Все это показывает, что механизмы регуляции ТД-аз у микроорганизмов весьма существенно различаются.

ВЫВОДЫ '

1. Разработан метод выделения биосинтетической ТД-азы \ут£л«сШ , позволивший очистить фермент в 525 раз с выходом в 20%. Удельная активность высокоочищенного препарата составляла 410 мкмолеЙ КБ в мин. на I мг белка.

2. С помовья гель-фидьтрации определена молекулярная масса ТД-азы, которая_№казалась. равной^2?0ЛЮ0.

3. Установлено, что уд. активность ТД-азы не зависят от концентрации фермента в пределах концентрации'белка от 0,02мкг ДО 6,4 МКГ»

4. Установлено, что оптимум рН фермента зависит от концентрация ¿-треонина: при 4 мкмолях ¿-треонина, оптимум рЕ равен 9,0, при 40 мкмолях - 9,8, а при концентрации л-треоннна,близкой к насыщающей,,зависимость V от рН имеет сложный двухступенчатый характер. .■-■ ■

5. £ отсутствие'эффектора ¿-иэояейцина зависимость V от подчиняется уравнению Мкхяэласа-Меятен. В присутствии ¿,-азо-

лейцина и высоких концентраций ионов ртути возможны кооперативные взаимодействия активных'центров фермента.

6. Особенностью ТД-азы <3аг. угтРлч^й' является появление ¿¿-образности кривых насыщении фермента субстратом ври высоком значении рН (9,5 - 10,5), связавное с конформационным переходом фермента в неактивное состояние и сшфовождащееся потерей протона из групп с рКа!0,3. Это состояние характеризуется низаам сродством фермента в субстрату и высокой максимальной скоростью реакции. _

7. и-Изоледин специфично ингибирует активность ТД-аза =8х10-5и) и имеет, по-видимому, четыре центра присоединения

на молекуле ТД-азы, между которыми возможны кооперативные взаимодействии, На силу этих взаимодействий оказывает влияние концентрации ¿-треонина и ¿.-валина.

8. ¿-Валив, являвшийся слабым ингибитором ТД-аан, способен устранять ингибировавие , вызванное ¿-изолейцином. На молекуле ТД-азы, по-видимому, имеется два центра для связывания ¿-валина, между которыми возможно кооперативное взаимодействие в присутствии высоких концентраций ¿-изолейцина* Возможно, центры присоединения -¿,-валина отличаются от таковых для ¿-изолейцина.

9. Активность ТД-азн сильно угнетается ионами ртути (%й5= =2x10*"%). Это указывает, что Эй-группы необходимы для проявления активности ТД-азы. Они локализованы либо в активном центре, либо в непосредственной близости от него, так как ингнбпро-вание, вызванное ионами ртути, снимается возрастающий концентрациями ¿-треонина. Кроме того, ЙЬгруппы» вероятно, участвуют в связывании ¿-аалина, так как последний защипает фермент от ин-гибирования

- 2В -

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Лосева Л.П., Любимов В.И., Кагая З.С., Кретович В.Л. 1968. л-Трйпяин-дегяЕРатава Оъебобаг&л . ДЙ.Н СССР, 181. 957.

2. Лосева Ji.il. 1969. ^ -Трк п н ии- л я ги тгаа тлз я иэдйж^; IIой Всесоюзный биохимический сгезд. Ташкент 1%9. Тезисы секционных сообщений. 20 секция. Биохимия микробов и вирусов, 31. ИЗД. "ФАй", Ташкент.

Б. Кретович В.Л., Лосева Л.П. 1970-

Зыделение и свойства '-^»пяич.рвтииряч'аян уОти&ш^М,

МЛ СССР, 193, Е I, 219.

4. Кретович В.Л., Лосева Л.П. 1973.

Выделение и некоторые свойства высокоэчищенной биосинтетической а -тре онин-дегвдра тазы • Микробиология, в печати.

5, Кретович В.Л., Лосева Л.П. 197В.

Аллостерические свойства биосинтетичесвой ¿-треошк-дегидра-тазы гуги/а^си^. • щ .

Иккробиология, в печати.

Результаты исследований доложены:

I. На 20 секции 11-го Всесоюзного биохимического съезда, Ташкент, 1969.

1. На конференции молодых ученых Института бисхиши им. А.Н. Баха: май 1972.

ЗАКАЗ №1743 ПОЗШ. К ПЕЧАТИ ЗО.УЛЗг. ТИРАЖ 200 ЭКЗ. РОТАПРИНТ ИГТПЗ АМН СССР