Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование белков семян некоторых представителей рода AVENA

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование белков семян некоторых представителей рода AVENA"

АКАДЕМИЯ НАУК ГРУЗИНСКОЙ ССР ИНСТИТУТ БИОХИМИИ РАСТЕНИЯ

На правах рукописи

БЕРУЛАВА Арчил Хутаевич

УДК 581.19:633.2

ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКОВ СЕМЯН НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕН РОДА AVENA

03.00.04 - биоишия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ТБИЛИСИ 1990

■Работа выполнена в Институте биохимии растений АН ГССР

Научный руководитель:

доктор биологических наук Конарев A.B.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, член корр.АН ГССР Джохадзе Д.И.

кандидат биологических наук Кикввдзе З.И.

Ведущая организация:

Грузинский сельскохозяйственный институт

Защита диссертации состоится 13 декабря 1990г в 13 часов на заседании специализированного совета К 007.04.01 при Институте биохимии растений АН ГССР (38005Э, Тбилиси, Военно-Грузинская дорога, 10-ый км).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института биохимии растений АН ГССР

Автореферат разослан 12 ноября 1Э90г

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние десятилетия белки семян злаков привлекают внимание биохимиков и генетиков в связи с перспективами их использования как маркеров для решения актуальных проблем филогении, систематики и селекции. На многих примерах продемонстрирована эффективность применения электрофоретических, серологических И других маркеров В родах Triticum, Aegilops, Seoals, Hordeum И др. (Конарев, 1983 ; Созинов, 1985). Для пшеницы выделяют два основных направления, по которым эти исследования развиваются наиболее успешно (Конарев, 1987). Это идентификация и регистрация генетических ресурсов по спектрам проламинов и решение вопросов родства видов и геномов по серологическим маркерам. Прогресс в более широком использовании данных подходов сдерживается из-за недостаточной изученности белков семян большинства злаков. Так довольно слабо изучены проламины овса, риса, просовидных и многих других злаков. В тоже время, вашую роль играет и уровень методических подходов, которые применяются для сравнительной характеристики белковых систем.

Цель и задачи исследования. Основной целью исследований является изучение белков семян овса для выяснения возможности их использования в филогенетическом анализе видов рода Avena. В связи с этим в задачу исследования входило:

- с использованием современных и высокоэффективных методов (быстрая хроматография белков - fplc, быстрый электрофорез -Phast-eleotrophorea, лазерная денситометрия и др.) дать характе-

ристику фракционного и компонентного состава спирторастворимой . (проламиновой) фракции семян видов овса;

- оценить перспективность применения кластерного анализа для сравнения видов овса по спектрам проламинов;

- изучить некоторые биохимические свойства компонентов а- и быстрых проламинов овса (молекулярная масса, изоэлектрические характеристики, аминокислотный состав);

- оценить перспективы использования высокоэффективной жидкостной хроматографии проламинов для идентификации и регистрации ресурсов рода Avena;

- провести иммунухимические исследования белков альбумино-глобулиновой фракции семян овса в связи с возможностью использования их в филогенетическом анализе.

Научная новизна и практическая ценность работы . Изучен фракционный, компонентный и антигенный состав белков семян некоторых видов овса.. Оценена эффективность применения различных современных методических подходов к фракционированию белков семян овсе. Получены данные, касающиеся состава и некоторых биохимических свойств а- и быстрых проламинов овса. Получены доказательства в пользу проламиновой природы быстрых проламинов овса, что позволяет использовать спектры этих компонентов в идентификации видов и сортов овса. Сделана попытка применить кластерный анализ спектров проламинов по методу медиан для оценки степени родства видов рода Avena. Показана целесообразность применения высокоэффективной жидкостной хроматографии для. целей идентификации и регистрации сортов и водов Avena. Оценены перспективы использования серологического подхо"а к анализу белков семян для решения актуальных воп-

росоз родства видов Avena. Среди белков семян видов Avena выявлен родоспедафячный антиген (применительно к современной системе роде) з антиген, с помощью которого можно оценивать степень родства видов, овса по белкам к остальным видам злаков.

Алтзобвцкя работы. Материалы диссертации были доложены на Все-С0Е320Й конференции молодых ученных и специалистов посвященной 70-лэтет Великого Октября (Махрадзе, Анасеули, 1987), на-14-ом между-народном конгроссэ биохимиков (Брага, 1988), на II съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990).

Публика:^., Основные положения диссертационной работы изложены в дзух статьях и в тезксах трех конференций. ■

Объем-работы Дяссертацгонная работа состоит из введения, сбзора литературы, касглдвгсся вопросов изучения белков семян злаковых, эксяэршентЕлькой частл, включающей описания методов 'исследования,, рэзультатов исслэдсвения и их обсуждения, еыводов и списка литерованной литературы (130 наименований). Работа изложена на .9.5 страницах машинописного текста, включает 16 рисунка и 4 таб-•лицы.

Объект и основные методы исследований

Объект исследования. Материалом для исследования послужили семена диплоидных, тетраплоидаых и гексаплоидных видов рода Avena (11 видов, 31 разновидность) из коллекции ВИР им. Н.И. Вавилова.

Семена очищали от кожуры и'далее размельчали до порошкообразного состояния. Полученную муку использовали для анализа.

Выделение белковых фракций проводили по принципу фракционного экстрагирования различными растворителями (Osborn, 1935).

i Электрофоретическое разделение проламинов овса проводили по методу разработанному в лаборатории белка и нуклеиновых кислот ВИР им. I Н.Н. Вавилова (Гаврилюк и др., 1973) с некоторыми модификациями.

Проламины экстрагировали 60%-шт этанолом из размолотых семян в течение двух часов в соотношении 1:3 (вес/объем). Электрофорез в пластине полиакриламидного геля (ПААГ) проводили в приборе для вертикального электрофореза производства экспериментальной лаборатории Хийу Калур (Таллин), а также производства фирмы "ЬКВ" (Швеция). Использовали процедуру электрофореза рекомендованную в работах Н.В.Гайденковой (Гайденкова, 1989) для глиадина пшеницы и И.О.Введенской для проламинов злаков триб пшениц9вых, овсовых и мятликовых (Введенская, 1986).

Величину сходства-различия электрофоретических спектров проламинов овса определяли с помощью кластерного анализа по методу медиан (Соломон, 1980). В качестве исходной матрицы использовали значения индекса подобия К (Saperstein, Bushuk, 1995), который рассчитывали по формуле, приведенной вместе с соответствующими пояснениями в работе (Гайденкова, 1989).

Гель-фильтрацию белков спирторастворимой фракции проводили на колонке "Тойеперл HW 50". Для дальнейшей очистки белковых фракций использовали вариант высокоэффективной (быстрой) хроматографа! белков на ионообменнике Mono-S на приборе FPLC ( фирма "Pharmacia", Швеция).

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили' на хроматографе фирмы "Waters" (США). Колонка "Protein РАК 125", с размерами 2x30x0,39 см. Скорость протока растворителя (70%-ного этанола) -0,7 ни/мин. Время разделения анализируемой белковой смеси 30 кии. •

Определение аминокислотного состава белков проводили после кислотного гидролиза 6 и hoi на автоматическом аминокислотам анализаторе Т 339 (фирма "Kikrotechna", ЧССР).

Изоэлектрическое разделение проламинов овса проводили на аппарате мультифор IX (фирма "LKB", Швеция) по предложенной методике (Ригетти, 1986), а также на приборе Phast System (фирма **Pharmaoia", ПЬеция) по .методике фирмы снашими модификациями. Перед процедурой изофокусирования Phast-Gel вымачивали в растворе 6 М мочевины с амфолиндаи (355) в течение 2-3 часов с целью предотвращения аггрегации проламинов. В качестве стандартов применяли PI-etandarts этой фирмы. ,

Иммуяохймический. анализ осуществляли в постановках двойной иммунодиффузии на стекляных пластинках в слое геля о,8Я5 агарозы, приготовленной на мединал-цитратном буфере (рН 8,6) по методике используемой в ВИРе. Иммунные сыворотки получали та схеме предложенной для растительных белков (Гаврилюк и др., 1973).

Молекулярную массу компонентов проламинов определяли на приборе "Phast System" по методике фирмы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Компонентный состав проламиновой фракции белков семян овса' Для изучения компонентного состава спирторастворимых белков овса (авенинов) был применен электрофорез в пластинах геля (Введенская, 1987). Идентификацию позиций компонентов проводили по эталонному спектру, разработанному для проламинов злаков триб Tritioeae (пшеницевые), Aveneae (овсовые) и Роеае (мятликовые) (Конарев, Введенская, 1984). Анализ компонентного состава спектров

цролзминов 11 видов овса (культурных и дикорастущих) подтвердил их принципиальное отличие от таковых пшениц (Конарев, 1983). Электрофора тический анализ в кислом буфере показал, что авениновыый спектр изученных нами видов представлен компонентами а- и р-проламинов, а также быстрых проламинов - БП (Конарэв, Введенская, 1384; Губарева и др., 1988). Ранее (Конарэв и др., 1983; 1384) быстрыми проламипами были обозначены компоненты спирторастворимой фракции с подвижностью в электрофорезе в кислом буфере несколько большей а-проламинов. Компоненты 7- и ш-проламинов в спектрах проламинов изученных нами .видов овса отсутствуют (рис.1).

Для спектров проламинов всех изученных нами видов были составлены белковые формулы (табл. 1). Составление белковых формул осуществляли как это было описано ранее (Конарев, 1983; Введенская,

Таблица 1

■ Белковые формулы некоторых видов овса составленные по электрофоретическим спектрам авенинов

Белковые формулы

N каталога ВИР

4581

110

55

4742

129

11259

4953

1973

Название вида

A.ablBsinioa A.ludoviciana A.fatua A.byzantina A.sterilis A.sativa таг. aurea ¿.sativa var. montana A.sativa Chinland 64 A.sativa

БП

1 2 3

a

5 6 7

5 5-6 5 6

6

6 7 5 6 7 5

3-4 6

3 4 2 3 4-5 2 3-4

1 3=4 3=4 й

2 3 4 5 3 4 5

13 4 5 2 3 4

1

A.pilosa k-198 II I lili

A.pilosa k-207 II II 1

A-wleetii k-95 111 1110

A.wiestii K-208 i lililí 2n=14

A.strigoza k-1979 II 1 1 IIQI

A.strigoza k-1980 1 II IID •

A.barbata k-230 i II 1 II Q -i

A.barbata k-75 II II II 2n=28

A.magna k-144 1 1 III ID _

A.eterilis k-283 1! Ii lili -i

A.lUdovioiana k-110 mu ai

A.fatua k-130 Mllll

A. fatua k-286 U lililí 2n=42

A.byzantina k-4742 III! lili

A.byzantina k-111-5 inai

A.sativa v.aurea ■ 11 i ni -

ЭС - ( iiiiiiiiiiiiiiiiiiii «5-1 i , i-7 |,1- S, , 1 lili 11111111 i-5i i 1 -ÍO

БП a p 7 Ш

Рис.1. Электрофоретические спектры.спирторастворимых белков видов Avena. Электрофорез в 7.5Я5 ПААГ, рН 3,2. ЗС -эталонный спектр для триб Tritioeae,Aveneae,Poeae.

1987). Из рисунка 1 и таблицы 1 видно, что каждый из представленных видов (в том ..числе и образцы одного вида) имеет индивидуальный электрофорвтический спектр и, соответственно, белковую фор-иулу лролаюшов и быстрых проламинов.

■ При использовании спектров для решения вопросов родства видов, сортов и т.п. вопрос о филогенетической специфичности (значимости) компонентов белков и целых элекетрофоретических спектров имеет принципиальное значение. При атом, более или менее достоверные результаты можно получить анализируя взаимосвязи на уровне видов или внутри одного вида (Конарев,.1983; Созинов, 1985). В этом случае появление в электрофоретических спектрах компонентов сходных по электрофоретической подвижности, но не гомологичных менее вероятно (Аронштам и др., 1977).

Для определения степени подобия электрофоретических спектров существует множество приемов и методов. В последнее время для этих целей все чаще используется денситометрия спектров с последующей матеметической обработкой полученных результатов.

В данной работе представленные на рисунке 1 электрофореграммы денситометрировали на лазерном денситометре UltroBkan XL (фирма"LKB," Швеция). Относительную интенсивность кавдого компоненте в % вычисляли на компьютере Olivetti 290 с использованием программы GelScan XL. Для упрощения дальнейших операций интенсивность отдельных электрофоретических компонентов корректировали в соответствии с 4-х бальной шкалой, предложенной в работе (Гайденкова, 1989). Матрицей для кластерного анализа служили значения индекса подобия К. Последний позволяет учитывать как различия в компонентном составе спектров, так и оценивать каждую электрофоре тиче скую зову в зависимости от ее интенсивности. В результате проведенного, анализа выяснилось, что электрофоретические варианты Есех изученных наш видов рода Avena образуют три группы подобия. Одна из таких групп представлена на рисунке 2. Виды, вошед-

шие в группу, расположены на девдрограмме в соответствии с индексом подобия и степени близости по спектрам проламинов к кластеру. А.weistii-A.strigosa с К равным 0,9. Можно констатировать, что -расположение видов на представленной дендрограмме не противоречит существующим представлениям о взаимоотношениях и. родстве видов и геномов в роде Avena.

A.weistii A.strigoBa

A.magna A.fatua

A.ludoviciana

A.eterilia

0.9

0.8

0.7 0.6 0.5 0.4 Индекс подобия К

Рис.2. Дендрограмма некоторых видов рода Avena по электрофоретичаским спектрам проламинов.

Фракционирование спирторастворимых белков вида А.ваЛуа методами хроматографии, элек'грофореза и изоэлектрического фокусирования.

Ранее с использованием электрофореза в кислом буфере было установлено, что в составе белков спирторастворимой фракции семян злаков представителей триб овсовых, мятликовых-и ряда других, помимо компонентов «-»-проламинов и белков типа альбуминов и глобулинов (быстрые компонента спиртовой фракции - БК), обнаруживаются компонента с подвижностью несколько большей чем а-проламины. Эти компоненты были названы быстрыми проламинада, сокращенно - БП

(Конарев и др., 1983; 1984; Конарев, Примак, 1984). Яроламшовая природа этих, компонентов была установлена для некоторых представителей трибы мятликовых - Daotylis glomerata, Festuca pratensis, Poa prateaeis (Примак, 1985; Введенская, 1987). Для подтверадения дрояамйнрвой врюрода компонентов БЦ овса (рис.1) в данной работе ЙСЙрип>з©в&яи семена культурного вида овса ¿.sativa. Для втого не-схйкдажо Шло получить очищенные препараты компонентов проламинов И БП овсе.

Две установления природы быстрых проламинов (БП) был выбран Культурный сорт Avena sativa. Методом гель-фильтрации на колонке с "Тойеяеря ВЗУ-50" белки спиртовой фракции A.sativa были разделены ЯЗ 6 (РЛС.З).

Полученные фракции были проанализированы. электрофорезом в кислом буфере, В результате компоненты а- и 0-проламинов были найдены во йршии 2. Фракция 3 содержала компоненты а и БП. В условиях электрофореза проламинов в кислом буфере в электрофорог-раымах фракций 1, 4-6 компонентов белков обнаружено. не было (рис.3). Можно предположить, что фракция 1 содержит компоненты, глютелина, а 4-6 - компоненты непроламиновой природы (Конарев, ,1983; Конарев И др. , 1983; 1984s Kasarda et al. , 1976).

Использование хроматографии на колонке с "Тойеперлом" не позволило получить требуемой степени очистки компонентов проламинов. Однако, данный метод имеет ряд преимуществ ло сравнению с традиционными сорбентами типа сефадекса, поскольку деление можно проводить в более короткий срок и непосредственно а экстрагенте (бОя этанол), а также без использования мочевины. Для дальнейших исследований использовали объединенную фракцию 2 и 3 (рис. 3, заштрихованная область), представляющую из себя проламиновую фрак-

А

80 да

1 3 5 7 9 час

Рис. 3. Гель-фильтрация спирторастворимых белков семян A.sativa на колонке "Тойеперл HW-50". 1-7 номера фракций.

ию свободную от примесей других белков. Получение чис-

ых компонентов проламинов и быстрых проламинов проводили с ис-зльзованием системы РРЬС с колонкой Мопо-Б (рис. 4). Компонен-

; тный состав восьми полученных фракций выявляли электрофорезом в кислом буфере (рис. 4). Процентное содержание каждого компонента в объединенной фракции определяли после декситометрии суммарного электрофоретического спектра этой фракции (рис.4е). Так содержание компонента ЕП1 составляет 5,3% от проламиновой фракции (рис.4д, фракция * 7), компонентов а! и а2 - 4,8 и 14,3% соответственно (рис.4г, фракция Х6) и т.д.

г 3 4 5 6 7

е а о в г Я

Рис.4. Электрофоретическиэ спектры проламинов к ВШ А.ваНуа полученных РРЪС-хроматографией (а-д). 1-8 номера пиков. е - спектр проламиновой фракции (пики 2+3, рис.3).

Практический интерес для дальнейшей работы представляет со-деткание "основных" компонентов в препаратах собранных после

РРЬС-хроматографип фракций й» 6 и 7 с а- и БП1 проламингми (рис.4). Из денситограммы электрофоретического спектра и приведенных результатов вычислений (рис. 5) видно, что содержание компонента БП1 в собранной фракции 7 (рис. 4д) составляет практически 100%. Во фракции, содержащей преимущественно компоненты а-проламкнов (рис.4г, фракции 5+в на этом кэ рисунке) содержание собственно компонентов а! и а2 составляет примерно 90$. Полученные таким образом препараты компонентов а1, ой и БП1 были использованы в дальнейшей работе. А

0.5 1

45 80 ММ

Рис.Б. Денситограмма электрофорэтического спектра фракции Л 7 (рис.4д) и содержание в ней компонента БП1.

Биохимическая характеристика а- и быстрых проламинов овса А.ва1;1уа. Были определены изоэлэктрические точки и молекулярные массы компонентов а!, а2 и БП1. Для компонентов а-проламинов р! быта

определены в пределах 5-7, а для БП1 - в пределах 8.2 значений рН.

■ Молекулярные массы были определены: для а-проламинов порядка 27 кЦ и для БШ - 22 нД. Полученные значения ' в целом соответствуют таковым определенным ранее для соответствующих белков представителей трибы мятликовых (Примак, 1985; Введенская, 1987). Так для компонента БП4 И.О.Введенская получила значения молекулярной массы около 17 кД, а для al компонента ежи (D.glomerata) около 27 кД. В работе А.Хансена и И.Алтозаара (Hansen, Altosaar, 1988) нижний предел значений молекулярной массы для т.н. высокомолекулярных проламинов овса определен 22 кД (т.е. соответствует полученному нами значению для БП1). Для группы т.н. низкомолекулярннх проламинов овса эти исследователи приводят значения молекулярной массы от 12 до 18 кД. В упомянутой работе, однако, не приведены данные в пользу проламиновой природы "низкомолекулярных проламинов".

Нами был изучен аминокислотный состав компонентов а- и БП овса. В таблице 2 для наглядности приведены данные аминокислотного состава, полученные ранее другими исследователями для а- и р-проламинов пшеница и мятлика.

Анализ представленных в таблице г данных позволяет- сделать вывод о проламиновой природе компонента БП1. В пользу такого предположения свидетельствует низкое содержание в БП1 остатков основных аминокислот - лизина, гистидика и аргинина и высокое - остатков глютаминовой кислоты и пролина. По этим локазателям БШ. овса близок к БП P.pratensis (табл. 2)- и Festuoa pratensiB (Примак, 1985). Тем не менее следует отметить, что по сравнению с а- и р-гливдинзми пшеницы и а-пролвминами овса БШ. A.eativa имеет сравнительно высокое содержание основных аминокислот и более низ-

ксе - остатков глютаминовой кислоты и пролина (табл.2). Однако, как было отмечено ранее, именно эти особенности аминокислотного состава, а также необычайно высокое содержание остатков фенилзланина, характерны для быстрых проламинов в отличие от а-т-прелгмкнов (Конарев и др.,.138в).

Таблица 2

Аминокислотный состав компонентов проламина зерна ¿.sativa

Аминокислота в % к белку T.aestivum * а-р P.pratensis * а БП А.ва а tiva БП-1

лизин 0,6 0.85 1.3 1 .0 1.6

гистидин 2,9 1.1 1.3 1.2 2.0

аргинин 2,9 3.4 3.3 3.2 4.3

аспарагиновая кисота • 2,6 1.9 2.30 1.9 3.0

треонин серин 3.5 4.6 4.0 4.5 3.5

глютаминовая кислота 45,3 41.65 42.7 42.1 36.1

пролин 12,1 9.4 6.1 9.3 6.9

глицин 2,7 . 3.1 5.1 3.1 4.0

аланин 1,8 2.3 2.6 2.2 2.8

цистин СЛ. СЛ. СЛ. 0.1 СЛ.

валин 4,0 3.6 3.8 4.1 4.3

метионин 0,7 СЛ. СЛ. СЛ. СЛ.

изолейцин 2,5 3.6 3-8 3.7 3-3

лейцин 9,0 6.15 9-4 9.2 9.3

тирозин' 1 ,7 2.1 1.1 2.0 1.2

фенилалишгн 6,4 9.3 11 .0 11.0 10.1

* - С.П.Примак,1985

Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) ' для фракционирования спирторастворимых белков видов Avena. Ряд преимуществ - быстрота деления, хорошая воспроизводимость результатов, полная автоматизация процесса вместе с возможностью

объективной оценки качественного и количественного состава белковых смесей делает перспективным использование HPLC в частности для целей идентификации сортов и видов пшениц (Bietz, 1985. 1986).

При хроматографии с помощью HPLC как и в случае с электрофорезом выявлена видовая специфичность хроматограмм спиртораствори-мой фракции. В таблице, 3 приведены характеристики полученные в ходе анализа денситограмм - время выхода каждого компонента (ВУ) и его содержание в %. Эти важнейшие характеристики каждой фракции могут служить основой для разработки объективного подхода к идентификации ВИДОВ И сортов Avena.

Как видно из таблицы з максимальное количество фракций - 11 обнаружено у A.wteiSÍü, 10 у A.fatua и A.eativa. Соответствующие или гомологичные компоненты различаются также в количественном

Таблица 3

Данные ВЭЯХ спирторастворимых белков семян видов Avena

Виды Номер а пиков

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

A.barba ву 13.3 14.3 16.9. 19.8 22.7 23.4 25.3 27.6

ta % 1.1 6.9 3.6 13.2 14.6 16.1 24.6 16.8

A.steri ву 13.2 14.3 16.2 18.1 18.5 20.2 22.6 23.9 25.2 27.5

lis % 4.3 22.7 1.1 7.7 4.8 0.1 14.5 5.9 24.0 14.7

A.wieie ву 13.2 14.1 16.2 17-9 18.1 18.5 20.1 22.5 23.9 25.2 27-5

til % 16.5 26.0 2.3 7.2 3.0 10.5 0.5 11.5 6.0 8.2 7.«

A.fatua ву 13-2 14.5 15.7 16.5 18.9 20.6 22.5 23.6 24.6 27.3

% 3.7 4.8 1.3 2.2 5.2 0.6 13.0 20.6 26.9 21.1

A.sati ву 13.2 14.4 15.1 16.5 18.3 19.8 22.5 23.3 24.5 27.3

va * 28.3 7.9 4-7 0.9 2.9 0.1 ai 9.2 12.4 10.4

*ВУ - время удерживания

отношении. Диапазона вариабельности такого показателя как ВУ может устанавливаться опытным путем для гомологичных компонентов (или пиков на хроматогрямме), например, в пределах минуты, как видно из таблицы. Позиции компонентов в пределах такого диапазона могут быть пронумерованы как в табл. з. Для такого показателя как интенсивность (или содержание в %) возможно применение шкалы интенсивности аналогично упомянутой уже выше (Гайдвнкова, 1989). В таком случае ВУ и содержание в я могут служить характеристиками фракции у данного вида. Информация о виде или сорте записанная таким образом может быть легко введена в компьютер и обработана соответствующим образом. В рассматриваемом варианте идентификации и регист- . рации ресурсов вида или рода все этапы могут быть полностью автоматизированы. Недостатком такого подхода является высокая стоимость необходимого оборудования и, соответственно, одного анализа. Этим, главным образом, й объясняется■преимущественное использование в идентификации и регистрации генетических ресурсов метода электрофореза (Draper, Keef, 1988; Cooke, 1988).

О некоторых перспективах серологического подхода к анализу белков - семян видов Avena в связи с вопросами филогении и систематики рода.

Специальные исследования, проведенные с привлечением большого числа представителей всех основных триб злаков позволили выяснить вопрос о ценности разных групп белков семян для решения проблем филогении разного уровня. Было, в частности, показано, что белки спирторастворимой фракции наиболее пригодны при решении вопросов родства видов и родов злаков (Конарев и др., 1983; 1984). В данной работе мы попытались ответить на вопрос о перспективах иммунохими-ческого метода применительно к роду Avena, поскольку представляют

' ценность любые ноше данные как о взаимоотношениях видов внутри

>

рода, так и с видами других близких к Avena родов, таких как Trisetum, Arrhenatherum, Helictotriohon, Avenoohloa, Agrostis и др.

В ходе проведения нашей работы все попытки получения иммуных сывороток на белки спирторастворимой фракции видов Avena оказались неудачными. Аналогичная ситуация имела место с некоторыми родами трибы мятликовых, где также не удалось получить удовлетворительных результатов по анализу родства видов и геномов с использованием иммунной сыворотки на белки спирторастворимой фракции семян (Конарев и др., 1Э84). Тем не менее, нам удалось,получить иммунные сыворотки на белки альбумино-глобулиновой (АГФ) фракции некоторых видов овса, обладающие антигенной специфичностью на уровне родов и даже, возможно, видов злаков.

На рисунке б представлении спектры преципитации белков семян видов Avena и других видов злаков, проявленные сыворотками на АГФ тетраплоидного вида A.abiesinioa и гексаплоида A.íatua. Спектры преципитации белков видов овса практически одинаковы и состоят в случае с сывороткой A.abissinica из одного компонента, а с A.íatua из двух- Важным свойством иммунной сыворотки на АГФ A.abissinica является то, что она дает в спектре преципитации интенсивный компонент характерный только для белков видов рода Avena (в современных границах рода. Ивелев, 1975).

В отличие от сыворотки A.abisainica сыворотка A.íatua дает с белками некоторых видов злаков ( и, в первую очередь, с белками Представителей близких к Avena родов Trieetum, Arrhenatherum, Koeieria. Agi-ostite и др.) слабый антиген, частично идентичный одному кз вктигенов гомологичной реакции (рис.60).

Tritioum boeotioun Hordeum vulgare Avena sativa A.eterilis A.abissinioa A.fatua

Trisetum pratense , Agrostis alba Sorghum durra

a . ' . 6

Рис.6. Схема реакции преципитации белков семян видов Avena и других злаков. Спектры проявлены сывороткамина АГФ A.abissinioa (а), и A.fatua' (Ö). Стрелкой обозначен специфичный для спектров видов Avena антиген.. .

Следовательно, виды рода Avena могут быть довольно четко отличены по антигенным свойствам их белков АГФ (рис.6, родоспеци-фичный антиген указан стрелкой) как от видов близких к Avena родов, так и от остальных злаков. С помощью иммунной сыворотки на АГФ гексаплоидного вида A.fatua можно в какой-то мере судить о степени родства по белкам между видами рода Avena и некоторых других родов злаков.

ВЫВОДЫ

1. Современные высокоэффективные методы злектрсфорзеза, хро-матографиии и иммунохимии применены для изучения фракционного, компонентного и антигенного состава белков семян диплоидных, тет-

0 "Ч

о

раплоидных и гексаолоиных видов овса. Возможности данных методических подходов оценены в.связи с перспективами использоавания белков семян овса как маркеров в решении вопросов филогении и регистрации генетических ресурсов рода Avena.

2. Методом электрофореза изучен компонентный состав пролами-новой фракции белков семян видов овса. Показана целесообразность применения кластерного анализа спектров проламинов по методу медиан для оценки степени родства видов рода Avena по белкам.

3. Получен чистый препарат компонента БП1 - представителя фракции быстрых проламинов, изучены его биохимические свойства, доказала проламиновая природа, что делает возможным использование электрофоретических спектров быстрых проламинов в идентификации, и регистрации видов и сортов Avena.

4. Продемонстрирована перспективы применения высокоэффективной жидкостной хроматографии для целей идентификации и регистрации генетических ресурсов Avena. Предложен один из возможных вариантов автоматизированного процесса идентификации видов и сортов овса.

5. Оценены перспективы использования серологического подхода для решения спорных вопросов родства видов Avena. Среди белков альбумино-глобулиновой фракции выявлены антигены, обладающие в реакциях двойной иммунодиффузии родовой специфичностью (в соответствии с современной системой рода Avena), а также антигены, позволяющие оценивать степень родства цо белкам видов овса с остальными видами злаков.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Берулава А.Х., Конарев А.В. Серологические исследования белков семян овса в связи вопросами филогении, родства и происхождения геномов. - Всесоюзная конференция молодых ученных и специалистов посвященная 70-летию Великого Октября, Махарадзе Анасеули, 1987, с.188.

2. Berulava A., Khachidze 0. Quanlitative content of alcoholsolu-Ые protsins of Avena seeds. -14th Inter, congress of Biochemistry, Prague, 1988, vol. V, p.213-

3. Берулава А.Х. Исследование проламинов зерна'некоторых представителей рода Avena при помощи ВЭЯХ-- Сообщ. АН ГССР, 1990, т. 139,

ст. 401-404.

4-Чигвинидзе Т.Д., Модебадзе Е.Н., Берулава А.Х. Фракционный состав белков и электрофоретические спектры фракции проламинов зерна овса. II съезд всесоюзного общества физиологов растений, Минск, 1990.

5. Шенгелия Н.И., Берулава А.Х. Электрофоретические спектры проламинов зерна некоторых представителей рода Avena и кластерный анализ. - Сообщения АН ГССР, 1990, т.140 , ст. 138-143.