Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование ассоциации ряда генов системы гемостаза с ишемической болезнью сердца

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование ассоциации ряда генов системы гемостаза с ишемической болезнью сердца"

На правах рукописи

ЧУДАКОВА ДАРЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ АССОЦИАЦИИ РЯДА ГЕНОВ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА С ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2005

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИ генетика»).

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Валерий Вячеславович Носиков.

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор медицинских наук, профессор Алий Юрьевич Асанов

доктор биологических наук,

профессор Дмитрий Владимирович Залетаев

Институт Молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.

Защита состоится «7» июня 2005г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИ генетика».

Реферат разослан «3» мая 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук / В.И.Щербакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной инвалидности и смертности в экономически развитых странах, при этом на долю ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда приходится примерно две трети случаев смерти от сердечно-сосудистых заболеваний.

Известно, что данные сердечно-сосудистые патологии являются многофакторными заболеваниями с многочисленными звеньями патогенеза. Для таких заболеваний характерен сложный механизм формирования фенотипа, в основе которого лежит взаимодействие генетических факторов с факторами внешней среды. При этом для каждого конкретного заболевания можно выделить группу так называемых генов-кандидатов, продукты которых могут быть прямо или косвенно вовлечены в развитие данной патологии.

Так как коронарный тромбоз играет существенную роль в патогенезе острых коронарных синдромов, к генам-кандидатам, определяющим развитие ишемической болезни сердца и ее осложнений, можно отнести группу генов, кодирующих белковые факторы системы гемостаза. Современная стратегия исследования генетической составляющей многофакторных заболеваний включает в себя поиск полиморфных маркеров в генах-кандидатах и оценку их ассоциации с заболеванием.

Установление ассоциации гена с заболеванием и последующая оценка индивидуального генетического риска имеют важное значение для разработки дифференцированного подхода к профилактике и лечению данной патологии и ее осложнений в зависимости от наследственной предрасположенности конкретного пациента. Поэтому в настоящее время одним из наиболее прогрессивных подходов является разработка стратегии ранней диагностики, прогнозирования и превентивной терапии заболевания с использованием генетических маркеров.

Цель и задачи работы. Целью данной работы было изучение ассоциации полиморфных маркеров нескольких генов-кандидатов, кодирующих белковые факторы системы гемостаза, с развитием ишемической болезни сердца (ИБС) и неблагоприятным исходом у больных ИБС. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов, кодирующих фактор свертывания крови V (1^5), фактор свертывания крови VII (Е7), Р-цепь фибриногена (ГвВ), Р3-субъединицу интегрина аПЬрЗ (1ГСВЗ), а11Ъ-субъединицу интегрина аПЬрЗ (ГГСА2В), ингибитор активатора плазминогена типа 1 (РЬАЫН!),

РОС. Н Б*-"-'

л \

протеин С (PROC) и тромбомодулин (THBD) в группах больных ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда, а так же в группе здоровых индивидов среди русских г. Москвы.

2. Провести сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов полиморфных маркеров даняых генов-кандидатов в исследованных выборках больных и здоровых индивидов для выявления ассоциации изученных маркеров с развитием болезни и определения вклада данных генов в наследственную предрасположенность к патологии.

Научная новизна работы. В данной работе впервые исследована ассоциация полиморфных маркеров Arg506Gln, Arg306Thr(Gly) и С(~426)Т гена F5, Arg3S3Gln и G73A гена F7, G(—455)A гена FGB, А1/А2 гена JTGB3, НРА-За/ЗЬ гена ITGA2B, 4G(-675)5G гена PLANH1, С(-1654)Т и A(-1641)G гена PROC и Ala455Val гена THBD с ишемической болезнью сердца (ИБС) и неблагоприятным исходом у русских больных с ИБС. Обнаружена ассоциация полиморфного маркера С(-1654)Т гена PROC с развитием неблагоприятного исхода при ИБС. Установлено, что носители генотипа СС данного полиморфного маркера имеют повышенный риск неблагоприятного исхода, тогда как носители генотипа СТ имеют пониженный риск неблагоприятного исхода при ИБС. Обнаружена ассоциация полиморфного маркера G(-455)A гена FGB с развитием неблагоприятного исхода при ИБС. Установлено, что носители аллеля G или генотипа GG данного полиморфного маркера имеют пониженный риск неблагоприятного исхода при ИБС. Обнаружена ассоциация полиморфного маркера G(-455)A гена FGB с уровнем фибриногена у женщин, больных ИБС. Все вышеизложенные результаты получены впервые.

Практическая пенность работы. Показано, что исследованные полиморфные маркеры генов FGB и PROC могут использоваться для прогноза течения заболевания у больных с ИБС. Выявление ассоциации полиморфных маркеров генов FGB и PROC с неблагоприятным течением ИБС открывает новые перспективы в выделении групп больных с высоким риском развития осложнений.

Апробация работы. Диссертационная работа была представлена на заседании Секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП «ГосНИИ Генетика» 16 марта 2005 г. Результаты настоящей работы докладывались на Российском национальном конгрессе кардиологов «От исследований к стандартам лечения», г. Москва, Россия (7-9 октября 2003 г.); на Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики», г. Москва, Россия (25 - 27 ноября 2003 г.); на XVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и

биотехнологии», г. Москва, Россия (10-13 февраля 2004 г.); на международной конференции «From human genetic variations to prediction of risks and responses to drugs and environment», остров Саяторин, Греция (30 сентября - 4 октября 2004 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, включая 3 статьи, а также тезисы докладов и сообщений на конференциях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на 145 страницах машинописного текста и содержат 17 таблиц и 17 рисунков. В работе процитировано 235 зарубежных и 20 отечественных литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Исследование ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с ишемической болезнью сердца (ИБС).

Изучение ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов с ИБС проводили, используя две группы пациентов, общая характеристика которых приведена в таблице 1. В исследование включались пациенты с ИБС, поступившие в стационар Городской клинической больницы (ГКБ) № 51. Диагноз ставили на основании клинических и биохимических исследований и данных коронароангиографии (у части больных) У части больных ИБС был диагностирован инфаркт миокарда (ИМ). Контрольная группа представляла собой случайную выборку пациентов, имеющих аналогичный профиль основных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний, у которых проведенная эхо- и электрокардиография не выявила достоверных признаков ИБС.

Таблица 1.

Общая характеристика обследованных групп больных с ИБС (ИБС+), ИБС и ИМ (ИБС+, ИМ+) и с отсутствием ИБС и ИМ (ИБС-, ИМ-).

Показатель ИБС-(п= 110) ИБС+ (п=100) ИБС+, ИМ+ (п = 55)

Возраст, лет (среднее значение ± вЛЭ*) 55,5 ± 9,0 60,2 ± 4,9 58,3 ± 4,0

Пол (мужчины / женщины) 53/57 62/38 35/20

♦S.D. - стандартное отклонение

Выборки были этнически однородны и составлены из русских (на основании паспортных данных), проживающих в г. Москве. Геномную ДНК пациентов использовали для амплификации фрагментов ДНК, содержащих полиморфные маркеры ряда генов системы гемостаза, предположительно вовлеченных в патогенез ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда.

Анализ нуклеотидных последовательностей интересующих нас регионов осуществляли с помощью системы NCBI в сети Интернет (www.ncbi.nlm.nih.gov). Использовали следующие разделы: Map View (построение генетической карты), dbSNP (информация о полиморфных маркерах). Для подбора праймеров и рестриктаз использовали пакеты программ DNAStar и VectorNTI 9.0.

Идентификация аллелей полиморфных маркеров проводилась с использованием по-лимеразной цепной реакции, расщепления фрагментов ДНК рестриктазами, и электрофоре-тического разделения фрагментов ДНК в 8%-ном полиакриламидном геле.

1.1. Исследование ассоциации полиморфного маркера 4G(-67S)5G гена PLANH1 с ИБС и ИМ.

Продукт экспрессии гена PLANH1 - это ингибитор активатора плазминогсна типа 1 (PAI-1). PAI-1 участвует в регуляции процессов тромбообразования и фибринолиза, инги-бируя активаторы плазминогена tPA и иРА. Повышение концентрации PAI-l в плазме крови является наиболее часто встречающейся причиной снижения фибринолитической активности и, как следствие, тромботических осложнений.

Известен ряд полиморфизмов в гене, кодирующем PAI-1, и фланкирующих его областях. Из них наиболее изучен однонуклеотидный полиморфизм 4G/5G в положении -675 (Henry et al, 1997). По данным, полученным разными исследователями, уровень PAI-1 примерно на 25% выше у носителей генотипа 4G/4G, по сравнению с носителями генотипа 5G/5G (Lane et al, 2000; Ossei-Gerning et al, 1997). В течение последних лет в большинстве исследований обнаружено наличие повышенного уровня PAI-1 в плазме крови у пациентов с ИБС, особенно у лиц, перенесших ИМ (Hamsten et al, 1987; Juhan-Vague et al, 1993).

В нашей работе при исследовании распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера 4G(-675)5G в группах ИБС+ и ИБС- статистически достоверных различий получено не было (табл. 2).

Таблица 2. Отсутствие ассоциации данного Распределение частот аллелей и генотипов поли- ПОЛиморфного маркера с ИМ со-морфного маркера 4С(-675)5С гена Р1ЛЫН1 в группах больных ИБС (ИБС+), ИБС и ИМ (ИБС+, ИМ+) и в контрольной группе (ИБС-).

гласуется с данными, полученными в исследованиях на группе мужчин-американцев (Ridker et al, 1997), на группе пожилых женщин европеоидов (Roest et al, 2000) и в японской популяции (Sugano et al, 1998). Работы, обнаружившие ассоциацию данного полиморфного маркера с ИМ в основном проводились на небольших группах (Ossei-Gerning et al, 1997; Mikkelsson et al, 2000) и, возможно, полученные ими результаты связаны с недостаточной величиной выборки. Также, можно предположить, что аллель 4G является фактором риска развития ИМ в молодом возрасте. Так, впервые ассоциация аллеля 4G гена PLANH1 с ИМ была выявлена на шведской популяции у молодых мужчин (35-45 лет) (Erriksson et al, 1995), и в то же время, на больших группах пожилых пациентов ассоциация не наблюдалась. Кроме того, в нескольких работах не были обнаружены не только ассоциация данного полиморфного маркера с ИМ, но и его корреляция с уровнем PAI-1 (Doggen et al, 1999).

Таким образом, полиморфный маркер 4G(-675)5G гена PLANH1 не ассоциирован с развитием ИБС и ИМ у русских г. Москвы.

Аллели и генотипы Частота Р

ИБС+ ИМ+ ИБС+ ИБС-

Аллель 4G 0,564 0,560 0,636 >0,05

Аллель 5G 0,436 0,440 0,364 >0,05

Генотип 4G/4G 0,309 0,300 0,391 >0,05

Генотип 4G/5G 0,509 0,520 0,490 >0,05

Генотип 5G/5G 0,182 0,180 0,119 >0,05

1.2. Исследование ассоциации полиморфных маркеров Аг]>$06С1п, Аг§3061Ъг(ау) и С(~426)Т теая Р5 с ИБС и ИМ.

Продукт экспрессии гена F5 - это фактор свертывания крови V. В активированной форме фактор V служит рецептором фактора Ха, связывающего протромбин. Присутствие активированного фактора V вызывает усиление активации протромбина примерно в 350 раз, благодаря повышению локальной концентрации фактора Ха. Активация фактора V происходит за счет специфичного расщепления тромбином с образованием фактора Уа. Ингибирование происходит за счет ограниченного протеолиза активированным протеином С (Маг1аг е1 а1,1982). Протеолиз фактора Уа начинается с расщепления по остатку аргинина в положении 506, затем по остаткам аргинина в положении 306 и 679. Таким образом, ка-

кие-либо изменения в области этих участков расщепления могут оказывать влияние на инактивацию фактора свертывания крови V.

В настоящее время в гене фактора свертывания крови V обнаружен ряд полиморфизмов, в том числе и расположенных в области участков расщепления. Полиморфному маркеру, получившему название "фактор V Лейден" соответствует аминокислотный полиморфизм Arg/Gin в положении 506 полипептидной цепи (Bertina et al, 1994). Около 95% пациентов с устойчивостью к действию активированного протеина С - это носители аллеля Gin "фактора V Лейден" (Tsongalis et al, 1997). Также обнаружены: однонуклеотидный полиморфизм, которому соответствует аминокислотный полиморфизм Arg306Thr (Williamson et al, 1998), и однонуклеотидный полиморфизм, которому соответствует аминокислотный полиморфизм Arg306Gfy в положении 306 полипептидной цепи (Chan et al, 1998). Известно, что аллель Gin полиморфного маркера ArgSOöGln достаточно редок. Максимальная частота встречаемости (7%) наблюдается среди греков-киприотов (Rees et al, 1995). Частота аллелей Thr и Gly полиморфных маркеров Arg306Thr и Arg306Gly так же невелика. В нашей работе редко встречающиеся аллели данпых полиморфных маркеров гена F5 ни в одной из групп

обнаружены не были. Полиморфный маркер С(~426)Т расположен в промоторной области гена F5. Предполагалось, что данный маркер может влиять на регуляцию экспрессии гена F5, и, следовательно, может быть ассоциирован с развитием сердечно-сосудистых патологий. Данные по изучению этого полиморфного маркера на других популяциях огсукггвуют, и исследование ассоциации с ИБС данного полиморфного маркера проводилось впервые в нашей работе При сравнении групп больных с контрольной группой наблюдалась тенденция к увеличению частоты генотипа СС среди больных. Это позволяет предположить, что носительство этого генотипа может быть ассоциировано с изменениями в экспрессии данного гена. Однако, различия частот аллелей и генотипов в сравниваемых группах носили статистически недостоверный характер (табл. 3).

Таблица 3.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера С(-426)Т гена .Г5 в группах больных ИБС (ИБС+), ИБС и ИМ (ИБС+ИМ+), и в контрольной группе (ИБС-).

Аллели и генотипы Частота Р

ИБС+ ИМ+ ИБС+ ИБС-

Аллель С 0,746 0,721 0,688 >0,05

Аллель Т 0,254 0,279 0,312 >0,05

Генотип СС 0,564 0,516 0,432 >0,05

Генотип СТ 0,364 0,411 0,511 >0,05

Генотип ТТ 0,072 0,073 0,057 >0.05

Таким образом, в нашей работе было обнаружено отсутствие ассоциации полиморфного маркера С(-426)Т гена Р5 с развитием ИБС и ИМ у русских г. Москвы.

1J. Исследование ассоциации полиморфного маркера А1/А2 гена ITGB3 с ИБС. Одним из ключевых этапов свертывания крози является образование так называемого первичного тромбоцитарного тромба. При этом происходит агрегация тромбоцитов за счет взаимодействия экспрессированного на их поверхности интегрина аПЬрЗ с фибриногеном. Ингегрин allbß3 является «классическим» рецептором фибриногена, хотя он связывает и ряд других лигандов, включая фактор Виллебранда (Savage et al, 1998). Достаточно много работ посвящено изучению вовлеченности интегрина allbß3 в развитие сердечнососудистых заболеваний (Вгау et al, 1999).

Интегрин аПЬрЗ представляет собой гликопротеи-новый комплекс, состоящий из двух субъединиц, некова-лентно связанных друг с другом. Субъединицы кодируются разными генами, расположенными близко друг к другу. Субъединицу ß3 кодирует ген ITGB3. В экзонах и интронах гена ITGB3 обнаружен ряд полиморфных участков, из которых для одного однонукпеотидного полиморфизма продемонстрирована ассоциация с риском развития сердечно-сосудистых патологий. Этот однонуклеотидный полиморфизм Т/С, которому соответствует аминокислотный полиморфизм Leu/Pro в положении 33 полипептидной цепи (Newman et al, 1989) (рис. 1). Аллели этого маркера исторически получили обозначения AI (Leu) и А2 (Pro).

Предполагают, что участок в районе 33-ей аминокислоты вовлечен в узнавание и связывание субстрата, несмотря на то, что он удален от непосредственного участка связывания фибриногена, представленного аминокислотными остатками 109-171 и 211-222 (Bennett et al, 1997). Получены данные, что тромбоциты, несущие на своей поверхности интегрин allbß3 с остатком пролина в положении 33 обладают повышенной способностью к агрегации (Feng et al, 2001).

При исследовании распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера А1/А2 гена TTGB3 в группе больных ИБС по сравнению с контролем в нашей работе статистически достоверных различий обнаружено не было (табл. 4). Результаты, полученные в ходе

Рис. 1. Интегрин allbß3 (по Bray et al,1999)

исследований ассоциации данного полиморфного маркера с ИБС и/или ИМ, носят противоречивый характер.

Таблица 4. Некоторые работы подтвер-Распределение частот аллелей и генотипов поли- вдают аллеля А2 с

морфиого маркера А1/А2 гена ITGB3 в группах риском развития ИБС и им больных ИБС (ИБС+), ИБС и ИМ (ИБС+, ИМ+) и в {Carter et alj 1997). Еще в одном контрольной группе (ИБС-). исследовании этот полиморф-

ный маркер был ассоциирован с развитием ИБС, но не ИМ (Gardemann et al, 1998). Отсутствие ассоциации данного полиморфного маркера с ИМ было продемонстрировано еще в нескольких работах (Durante-Mangoni et al, 1998; Mamotte et al, 1998). Прямо противоположные результаты были получены другой группой исследователей, выявившей значительное возрастание риска развития ИМ у носителей аллеля А 2 и очень слабую ассоциацию, граничащую с ее отсутствием, данного полиморфного маркера и ИБС (Anderson et al, 1999). Обнаружено также, что носители аллеля А2 более чувствительны к ингибированию агрегации тромбоцитов аспирином (Cooke et al, 1998). Можно предположить, что расхождения в полученных данных могут быть связаны с неточностями в подборе групп сравнения, в которых не проводилось разделение по полу, а так же не учитывалось, принимали ли пациенты аспирин и т.д.

Таким образом, нами установлено, что полиморфный маркер А1/А2 гена ITGB3 не ассоциирован с развитием ИБС и ИМ у русских г. Москвы.

Аллели и генотипы Частота Р

ИБС+ ИМ+ ИБС+ ИБС-

Аллель А1 0,910 0,888 0,904 >0,05

Аллель А2 0,090 0,112 0,096 >0,05

Генотип А1/А1 0,820 0,780 0,817 >0,05

Генотип А1/А2 0,170 0,220 0,173 >0,05

Генотип А2/А2 - - 0,010 >0,05

1.3. Исследование ассоциации полиморфного маркера НРА-За/ЗЬ гена ITGA2B с ИБС.

Субъединицу allb интегрина allbß3 кодирует ген JTGA2B. Из полиморфных маркеров данного гена наиболее хорошо изучен маркер НРА-3 (Bottiger et al, 2000). Это однонуклео-тидный полиморфизм T/G (Kroll et al, 2001), которому соответствует аминокислотный полиморфизм He/Ser в положении 843 тяжелой цепи a IIb субъединицы интегрина (Goldberger et al, 1991). В литературе принято обозначать этот полиморфизм как HPA-3a/3b (Peyruchaud et al, 1995), при этом аллели обозначаются ках За и ЗЬ (остатки Не и Ser, соответственно).

Несмотря на то, что гены TTGA2B и ITGB3 расположены достаточно близко, полиморфные маркеры НРА-За/НРА-ЗЬ и А1/А2 не находятся в неравновесии по сцеплению (Carter etal, 1999).

Таблица 5. Известно, что интегрин аПЪрЗ

Распределение частот аллелей и генотипов поли- СВЯЗЫвает ряд субстратов (Shatti et морфиого маркера НРА-За/ЗЬ гена ITGA2B в ^ 1999) Предполагается, что ами-группе больных ИБС (ИБС+), ИБС и ИМ (ИБС+, нокислотный полиморфизм в по-ИМ+) и в контрольной группе (ИБС-). ложении 843 может влиять на пе-

редачу сигнала в клетку, что приводит к перестройкам цитоскелета тромбоцитов и ретракции тромба (Du et al, 1997). Также, обнаружено, что аминокислотный полиморфизм Ile843Ser расположен вблизи региона (с 844 по 859 а.о.), антитела к которому блокируют взаимодействие тромбоцитов с коллагеном (Shadle et al, 1984). Поэтому ряд работ посвящен изучению ассоциации данного полиморфного маркера с сердечно-сосудистыми патологиями.

В нашей работе при сравнительном анализе распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера НРА-За/ЗЬ в группе больных ИБС и в контрольной группе статистически достоверных различий получено не было (табл. 5). Это согласуется с результатами, полученными на других популяциях.

Таким образом, было обнаружено, что полиморфный маркер НРА-За/ЗЬ гена ITGA2B не ассоциирован с развитием ИБС и ИМ у русских г. Москвы.

Аллели и генотипы Частота Р

ИБС+ ИМ+ ИБС+ ИБС-

Аллель За 0,600 0,580 0,582 >0,05

Аллель ЗЬ 0,400 0,420 0,418 >0,05

Генотип ЗаЗа 0,345 0,320 0336 >0,05

Генотип ЗаЗЬ 0,509 0,520 0,491 >0,05

Генотип ЗЬЗЬ ОД 46 0,168 0,173 >0,05

1.4. Исследование ассоциации полиморфных маркеров Arg3S3Gln и G73A гена F7 с ИБС.

Активная форма фактора VII - это сериновая протеаза, первый фермент в каскаде свертывания крови по «внутреннему пути» (Bajaj et al, 1981). Разрыв атеросклеротической бляшки и связывание тканевого фактора с циркулирующим в крови фактором свертывания VII считается главной причиной тромбоза при инфаркте миокарда (Wilcox et al, 1989). Согласно данным, полученным в ходе исследования «Northwick Park Heart Study», повышенный уровень фактора VII является независимым фактором риска развития сердечнососудистых заболеваний (Meade et al, 1986). Последующие несколько работ подтвердили

связь высокой концентрации фактора VII в плазме с повышенным риском развития ИБС (Heinnch et al, 1994; Redondo et al, 1999) и атеротромбозов (Tamaki et al, 1999). Однако, существует ряд работ, не подтверждающих эти результаты (Folsom et al, 1997; Smith et al, 1997; Friesewinkel et al, 1993).

Обнаружена ассоциация нескольких полиморфных маркеров гена F7 с уровнем фактора VII в плазме крови. Из них наиболее изучен однонуклеотидный полиморфизм G/A, которому соответствует аминокислотный полиморфизм Aig/Gln в положении 353 полипептидной цепи (Girelli et al, 2000).

Таблица 6. Показано, что наличие остатка Gin в Распределение частот аллелей и генотипов по- положении 353 коррелирует с суще-лиморфного маркера Arg353Gln гена F7 в груп- ствснн0 более низким уровнем фак-не больных ИБС (ИБС+), ИБС и ИМ (ИБС+, тора VII в плазме; при этом Количе-ИМ+) и в контрольной группе (ИБС-). ство синтезируемого фактора не

уменьшается, но уменьшается его секреция (Hunault et al, 1997). При сравнительном анализе распределения аллелей и генотипов данного полиморфного маркера в группе больных ИБС и контрольной группе в нашей работе статистически достоверных различий получено не было

Аллели и генотипы Частота Р

ИБС+ ИМ+ ИБС+ ИБС-

Аллель Л 0,264 0,205 0,300 >0,05

Аллель G 0,736 0,795 0,700 >0,05

Генотип АА 0,109 0,110 0,127 >0,05

Генотип AG 0,309 0,330 0,346 >0,05

Генотип GG 0,582 0,560 0,527 П >0,05

(табл. 6). Это согласуется с результатами, полученными на других популяциях Так, Ванг и соавторы не нашли ассоциации данного полиморфного маркера со степенью тяжести коронарного атеросклероза по данным ангиографии (Wang et al, 1997).

В Японии так же не было выявлено связи между данным полиморфизмом и развитием ИБС (Tamaki et al, 1999). В то же время, в итальянской популяции была обнаружена ассоциация данного полиморфного маркера с ИМ, при этом аллель А был ассоциирован с уменьшенным риском развития ИМ (Girelli et al, 2000). Такие же результаты были получены в работе Яковиелло и соавторов (Iacoviello et al, 1998).

В итальянской популяции была изучена ассоциация с риском развития ИМ еще одного полиморфного маркера, однонуклеотидного полиморфизма G/A в положении 73 в первом интроне гена F7. У носителей аплеля А наблюдался более низкий уровень фактора VII

Таблица 7 кРови по сравнению с носителями Распределение частот аллелей и генотипов поли- аллеяя и аллель А был ассоции-морфного маркера вШ гена F7 в группе боль- Р08^ с пониженным риском разви-ных ИБС (ИБС+), ИБС и ИМ (ИБС+, ИМ+) ив та* ИМ (РеуущкИ е1 а1,2000).

При сравнительном анализе распределения аллелей и генотипов данного полиморфного маркера в группе больных ИБС и контрольной группе статистически достоверных различий получено не было (табл. 7). В нашей работе распределение частот аллелей и генотипов было близко к полученному в исследованиях, проведенных на других популяциях (РеууагкК & а1, 2000).

Таким образом, можно сделать вывод, что полиморфный маркер О 73А гена F7 не ассоциирован с развитием ИБС и ИМ у русских г. Москвы.

1.5. Исследование ассоциации полиморфных маркеров С(-1654)Т и А(-1641)С гена РКОС с ИБС.

Активированный протеин С выполняет функции антикоагулянта, осуществляя инактивацию коагуляционных факторов РУа и РУШа на поверхности фосфолипидов, в присутствии протеина 8 в качестве кофактора (ЯоЬЬеП & а1, 2000). Он также вызывает увеличение концентрации 1РА, за счет нейтрализации его ингибитора. Таким образом, под действием активированного протеина С происходит сдвиг равновесия 1РА/РА1-1 в сторону активатора, что приводит к увеличению фибринолитической активности крови. Кроме того, протеин С участвует в регуляции воспалительного процесса, ингибируя продукцию питокинов макрофагами (Магуаша е1 а1, 1999). Таким образом, протеин С играет важную роль в регуляции гемостаза.

Отмечено, что уровни активности протеина С могут значительно различаться, даже в пределах одной семьи. Предполагается, что это может быть связано, в том числе, и с уровнем экспрессии гена. Предшествующие стартовой точке транскрипции полиморфные маркеры могут оказывать влияние на экспрессию данного гена, уровень его продукта в плазме крови и, как следствие, развитие сердечно-сосудистых патологий.

контрольной группе (ИБС-).

Аллели и генотипы Частота Р

ИБС+ ИМ+ ИБС+ ИБС-

Аллель А 0,193 0,227 0,136 >0,05

Аллель О 0,807 0,773 0,864 >0,05

Генотип АА - 0,023 0,010 >0,05

Генотип Ав 0,386 0,407 0,252 >0,05

Генотип Ов 0,614 0,570 0,738 >0,05

Таблица 8. ® промоторной области коди-Распределеиие частот аллелей и генотипов поли- ругощего протеин С гена РЯОС, морфного маркера А(-164Щ1 гена РЯОС в группе обнаружено несколько полимор-больных ИБС (ИБС+), ИБС и ИМ (ИБС+, ИМ+) и в физмов, из них наиболее изучены контрольной группе (ИБС-). однонуклеотидные полиморфиз-

мы С/Т в положении -1654 и Л/О в положении -1641.

В нашей работе аллели полиморфного маркера А(~1641)0 гена РЯОС идентифицировали с помощью амплификации фрагмента длиной 153 п.н. с последующим расщеплением рестрик-тазой Мр201. Фрагмент ДНК, содержащий аллель (3, расщепляется рестриктазой МзрХИ, образуя продукты размером 134 и 19 п.н, в то время как фрагмент ДНК, содержащий аллель А, остается нерасщепленным (рис. 2).

Аллели и генотипы Частота Р

ИБС+ ИМ+ ИБС+ ИБС-

Аллель А 0,617 0,559 0,613 >0,05

Аллель О 0,383 0,441 0,387 >0,05

Генотип АА 0,309 0,269 0,328 >0,05

Генотип АО 0,617 0,580 0,571 >0,05

Генотип 0,074 0,151 0,101 >0,05

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Рис. 2. Электрофоретичеекое разделение в 8% полиакриламндном геле продуктов расщепления рестриктазой Мхр201 амплифицированного фрагмента гена РЯОС. Генотипы по дорожкам: 1, 3, 4,12,13,14 - АА-, 2, 5, 7, 8,10,11,15,16 - Ав; 6, 9, - СС, 17 -ДНК плазмнды рТ1С19, расщепленная рестриктазой Мзр1. Изображение сканировано.

При сравнительном анализе распределения аллелей и генотипов Полиморфных маркеров А(-1641)С и С(-1б54)Т гена РЯОС в группе больных ИБС и контрольной группе статистически достоверных различий получено не было (табл. 8,9).

Таблица 9.

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера С(-1654)Т гена Р1ЮС в группе больных ИБС (ИБС+), ИБС и ИМ (ИБС+, ИМ+) и в контрольной группе (ИБС-).

Аллели и генотипы Частота Р

ИБС+ ИМ+ ИБС+ ИБС-

Аллель С 0,679 0,699 0,660 >0,05

Аллель Т 0,321 0,301 0,340 >0,05

Генотип СС 0,452 0,461 0,381 >0,05

Генотип СТ 0,452 0,476 0,557 >0,05

Генотип 7Т 0,096 0,063 0,557 >0,05

Поиску ассоциации данных полиморфных маркеров гена PROC с развитием сердечнососудистых патологий посвящено всего несколько работ, в основном, исследующих ассоциацию данного маркера с развитием тромбозов. В нашей работе было обнаружено, что полиморфные маркеры A(-1641)G и С(-1654)Т гена PROC не ассоциированы с развитием ИБС и ИМ у русских г. Москвы.

1.6. Исследование ассоциации полиморфного маркера Ala4S5Val гена THBD с ИБС.

Тромбомодулин является ключевым звеном серии реакций, регулирующих направление и скорость процессов гемостаза (Dittman et al, 1990). Тромбомодулин в основном экс-

прессирует ся на поверхности эндотелия, Mei акариоцитов, тромбоцитов и гладкомышечных клеток. Часть молекул тромбомодулина циркулирует в крови. Образовавшийся в ходе свертывания крови тромбин в присутствии ионов С а2' способен связываться с расположенным на мембране тромбомодулином, при этом тромбин теряет способность расщеплять фибриноген и активирует протеин С.

Обнаружена ассоциация нескольких полиморфных маркеров гена THBD с развитием сердечно-сосудистых заболеваний Из них наиболее изучен полиморфизм С/Т, которому соответствует аминокислотный полиморфизм Ala/Val в положении 455 полипептидной цепи. Показано, что данный полиморфный маркер не связан с уровнем тромбомодулина в крови (Norlund et al, 1997). Это может косвенно свидетельствовать о том, что данный полиморфный маркер не ассоциирован и с уровнем экспрессии тромбомодулина на поверхности клеток При сравнительном анализе распределения аллелей и генотипов этого полиморфного маркера в группах больных ИБС и в контрольной группе статистически достоверных различий получено не было (табл. 10).

Таблица 10.

Распределение частот аллелей и генотипов поли-

Полученные результаты согласуются с данными, получен-

морфного маркера AlaASSVal гена THBD в группе ными другими группами не-

вольных ИБС (ИБС+), ИБС и ИМ (ИБС+, ИМ+) и в контрольной группе (ИБС-).

следователей. Так, согласно исследованию, проведенному на американской популяции, данный полиморфный маркер ассоциирован с ИБС у негров, но не у европейцев (Wu et al, 2001). В другой этнически неоднородной выборке (в группе пациентов 19 монголоидов, один негр, остальные европейцы, всего в группу входило 104 человека, так же как и в группу контроля) данный полиморфный маркер так же не был ассоциирован с риском развития ИМ (Ireland et al, 1997).

Таким образом, полиморфный маркер Ala455Val гена THBD не ассоциирован также и с развитием ИБС и ИМ у русских г. Москвы.

Аллели и генотипы Частота Р

ИБС+ ИМ+ ИБС+ ИБС-

Аллель С 0,809 0,768 0,682 >0,05

Аллель Т 0,191 0,232 0,318 >0,05

Генотип СС 0,650 0,591 0,494 >0,05

Генотип СТ 0,320 0,354 0,376 >0,05

Генотип 7Т 0,030 0,055 0,129 >0,05

1.7. Исследование ассоциации полиморфного маркера в(-455)А гена РХ1В с ИБС.

Фибриноген представляет собой гликопротеиновый димер, субъединица которого состоит из 3-х полипептидных цепей: а, Р и у, соединенных дисульфидными связями (Патрушев Л.И., 2002). Каждая из цепей фибриногена кодируется своим геном (рис. 3). Известно, что фибриноген - это один из основных факторов, обусловливающих вязкость плазмы крови. Уровень фибриногена в крови влияет па способность тромбоцитов к агрегации еЛ а1, 1991). Низкий уровень фибриногена ассоциируется с низким коронарным риском, даже если содержание общего холестерина или холестерина в составе липопротеинов пизкой плотности при этом высокое. Регуляция синтеза фибриногена осуществляется на уровне транскрипции. Основную роль в позитивной регуляции транскрипции фибриногена играет интерлейкин-6, секретируемый макрофагами и моноцитами в ответ на фагоцитоз продуктов деградации фибриногена, кроме того, стимулировать синтез может ряд гормонов и жирных кислот (Рппсеп й а1,1985).

Thi312AI» A/G

Taql Bell

Arg448Lys

G/A -148СУГ -455C/A

(Hindlll) (Haelll)

IL 6 ★i

H§ II BBI-^T 18 В g-^figffiBBal

4

8

5

8

5

7

а—►

ß

Рис. 3. Кластер генов семейства фибриногена. Стрелками в нижней части рисунка показано направление считывания генов. Стрелками в верхней части рисунка обозначены некоторые полиморфные участки генов и участки связывания регуляторов транскрипции.

Лимитирующей стадией в синтезе фибриногена является синтез ß-цепи (Yu et al, 1984). К настоящему времени описан ряд полиморфизмов, как в самом гене FGB, так и в его фланкирующих областях. Из них наиболее хорошо изучен полиморфный маркер G(-455)A в промоторной области гена FGB, представляющий собой однонуклеотидпый полиморфизм G/A в положении -455. Получены данные, что наличие остатка аденина в положении -455 гена FGB определяет более высокий уровень его транскрипции (van't Hoof! et al, 1999). Обнаружено несколько белковых комплексов, способных специфично связываться с промоторным регионом гена FGB около позиции -455. Один из них, комплекс III, возможно, играющий роль репрессора, распознает последовательность нуклеотидов в области от -462 до -451, причем в положении -455 предпочтительно связывается с остатком G, нежели с остатком А, чем, предположительно, и объясняется влияние данного полиморфизма на уровень транскрипции (Brown et al, 1998). Так как уровень фибриногена плазмы крови -это один из основных факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний (Ма et al, 1999), большое количество работ посвящено изучению взаимосвязи полиморфного маркера G(-455)A с данными патологиями.

Результаты, полученные в ходе исследования ассоциации полиморфного маркера G(-455)A гена FGB с ИБС в разных этнических группах достаточно противоречивы Была продемонстрирована ассоциация полиморфизма G(-455)A гена FGB с развитием ИБС в европейской популяции (Moniek et al, 1998). Однако, в ряде других работ ассоциация полиморфного маркера G(—455)A гена FGB с ИБС не была обнаружена (Tybjaerg-Hansen et al, 1997; Doggen et al, 2000).

При исследовании распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера в нашей группе больных по сравнению с контролем статистически достоверных различий получено не было (табл. 11).

Таблица 11. Ряд работ посвящен определе-Распределение частот аллелей и генотипов поли- ншо взаимосвязи между гено-морфного маркера в(-455)А гена ТОВ в группах таПами полиморфного маркера больных ИБС (ИБС+), ИБС и ИМ (ИБС+, ИМ+) и в С(-455)А гена ТОЙ и уровнем контрольной группе (ИБС-). фибриногена в плазме крови. В

крупном популяционном исследовании, при обследовании 9127 жителей Копенгагена было показано, что аллель А полиморфного маркера С(-455)А гена К?В ассоциирован с повышенным уровнем фибриногена, как у мужчин, так и у

Аллели и генотипы Частота Р

ИБС+ ИМ+ ИБС+ ИБС-

Аллель G 0,746 0,735 0,745 >0,05

Аллель А 0,254 0,265 0,255 >0,05

Генотип GG 0,581 0,570 0,582 >0,05

Генотип AG 0,327 0,330 0,327 >0,05

Генотип АА 0,092 0,100 0,091 >0,05

женщин, как среди здоровых, так и среди больных ИБС (Tybjaerg-Hansen et al, 1997). В другом европейском исследовании ассоциация аллеля А данного полиморфного маркера с уровнем фибриногена у родственников пациентов перенесших инфаркт миокарда в молодом возрасте оказалась статистически достоверной, как у мужчин, так и у женщин, однако, у молодых женщин она была менее выражена (Humphries et al, 1995).

Таблица 12.

Уровень фибриногена в плазме крови у больных ИБС с различными генотипами полиморфного маркера G(-455)A гена FGB.

Показатель Пол Генотип GG Генотип GA Генотип АА Р

Фибриноген, г/л муж п = 37 л =24 п = 5

3,67 + 0,205 3,77 ± 0,292 3,85 ±0,71 >0,05

жен п = 32 п = 15 п = 7

3,91 ±0,228 4,10 ± ОД 84 5,14 + 0,311 0,044

В нашей работе так же была определена взаимосвязь между генотипами полиморфного маркера С(- 455)А гена РОВ и уровнем фибриногена в плазме крови в группе больных.

Статистически достоверной ассоциация данного аллеля с повышенным уровнем фибриногена была только у женщин, хотя среди мужчин наблюдалась тенденция к увеличению уровня фибриногена у носителей аллеля А (табл. 12). Эти результаты близки к результатам, полученным группой английских исследователей, в работе которых ассоциация аллеля А с повышенным уровнем фибриногена была также статистически достоверной только у женщин (р = 0,003) (Henry et al, 1997).

Таким образом, полученные данные позволяют говорить об отсутствии ассоциации полиморфного маркера гена G(-455)A гена FGB с развитием ИБС и ИМ среди русских города Москвы и наличии ассоциации аллеля А данного полиморфного маркера с повышенным уровнем фибриногена у женщин с ИБС.

2. Исследование ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с неблагоприятным исходом при ИБС.

К настоящему моменту накоплены данные об ассоциации полиморфных маркеров различных генов кандидатов с теми или иными сердечно-сосудистыми осложнениями, однако в анализ, как празило, не входят пациенты, умершие от данного заболевания. Выявление среди всех больных тех, у кого риск осложнений максимален, все еще остается до конца не решенной задачей. Исследований, носящих проспективный характер, которые позволили бы установить прогностическое значение тех или иных полиморфных маркеров относительно немного.

Для оценки вклада наследственной предрасположенности в особенности течения бо-лезпи, в течении двух лет осуществлялось наблюдение за больными с ИБС, обратившимися в ГКБ № 51. Диагноз ставили на основании клинических и биохимических исследований и данных коронароангиографии (у части больных). Нефатальный инфаркт миокарда, смерть от инфаркта миокарда и острой коронарной недостаточности обозначали как «неблагоприятный исход заболевания» (НИ). Причина смерш устанавливалась на основании данных патологоанатомического исследования. Клиническая характеристика групп больных представлена в таблице 13.

Нами было проведено исследование полиморфных маркеров всех использованных нами генов системы гемостаза, однако, ассоциация с НИ при ИБС была обнаружена только для двух генов: PROC и FGB.

Таблица 13.

Клиническая характеристика обследованных больных с ИБС.

Показатель Благоприятный исход заболевания (п = 79) Неблагоприятный исход заболевания (п = 43)

Возраст 65,5 ± 1,17 70,5 ±1,43

Пол, мужчины / женщины 40/39 21/22

Гипертония 72 39

2.1. Исследование ассоциации полиморфного маркера С(-1654)Т гена РЯОС с неблагоприятным неходом ИБС.

Так как носительство аллеля С полиморфного маркера С(-1654)Т гена РЯОС ассоциировано с риском развития тромбоза (А1асЬ е1 а1, 1999), можно предположить, что причиной повторного инфаркта миокарда, острой коронарной недостаточности и инсульта у больных с ИБС являются связанные с протеином С нарушения в процессах тромбообразо-вания. В одной из работ было рассмотрено влияние 3 полиморфных маркеров С(-1654)Т, А(-~1641)0 и А(-147б)Т гена РЯОС на уровень протеина С, а также риск венозных тромбозов. Оказалось, что гаплотипы СС/Ой/ТТ соответствующих полиморфных маркеров ассоциировались с более низким уровнем протеина С и более высоким риском тром-ботических осложнений (врек ег а1, 1995). В другом исследовании изучалась связь риска венозных тромбозов с двумя полиморфными маркерами С(-1654)Т и А(-1641)0 гена РЯОС. Гаплотип СО оказался связанным с более высоким риском тромбозов, в то время как носители гаплотапа ТА имели пониженный риск (А1ас11 е1 а1,1999).

При сравнительном анализе распределения генотипов полиморфного маркера С(-1654)Т гена РЯОС в группе больных с благоприятным исходом заболевания по сравнению с группой больных с неблагоприятным исходом было обнаружено статистически достоверное возрастание доли генотипа СС (р = 0,049) в группе больных с неблагоприятным исходом (табл.14).

20

Рис. 4. Выживаемость больных с различными генотипами полиморфного маркера С(-1654) Т гена РЯОС.

Таблица 14.

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера С(-1654)Т гена РЯОСу больных с благоприятным и неблагоприятным исходами ИБС.

Аллели и генотипы Благоприятный исход заболевания Неблагоприятный исход заболевания Р OR

С 0,654 0,733 >0,05 -

Т 0,346 0,267 >0,05 -

СС 0,385 0,558 0,049 2,00 [1,05-4,22]

СТ 0,538 0,349 0,034 0,47 [0,22-0,98]

TT 0,077 0,093 >0.05 -

OR - соотношение шансов, от английского odds ratio.

В то же время, носители генотипа СТ достоверно чаше встречались среди больных с благоприятным исходом заболевания (р = 0,034). Наибольшим значением относительного риска (ОЯ = 2,00) характеризовался генотип СС, а наименьшим - генотип СТ (ОЯ = 0,47). Носители генотипа СС имеют повышенный риск неблагоприятного исхода, тогда как носители генотипа СТ имеют пониженный риск неблагоприятного исхода при ИБС. Также было обнаружено, что пациенты, имеющие генотип СС полиморфною маркера С(-1654)Т гена РЯОС имели среднее время до достижения «неблагоприятного исхода» 684,1 + 68,75 дней, в то время как пациенты с генотипами СТ и ТТ - 875,4 ± 57,93 дня (р = 0,038), при этом кривые выживаемости достоверно разошлись к концу второго года наблюдения (рис. 4).

Таким образом, полиморфный маркер С(~1654)Т гена РЯОС ассоциирован с развитием повторного инфаркта миокарда, острой коронарной недостаточности и инсульта у русских пациентов г. Москвы с ИБС, при этом носители генотипа СС имеют повышенный риск неблагоприятного исхода, тогда как носители генотипа СТ имеют пониженный риск неблагоприятного исхода заболевания при ИБС.

2.2. Исследование ассоциации полиморфного маркера С(-455)А гена РСВ с неблагоприятным исходом у пациентов с ИБС.

Уровень фибриногена в крови влияет на способность тромбоцитов к агрегации (Ьап-ёоШ а], 1991). Так как носительство аллеля А полиморфного маркера 0(-455)А гена РОВ ассоциировано с повышенным уровнем фибриногена (НшпрЬпез е1 а1, 1997), а коронарный тромбоз играет существенную роль в патогенезе острых коронарных синдромов, можно

предположить, что данный полиморфный маркер может быть ассоциирован с развитием инфаркта миокарда, острой коронарной недостаточности и инсульта у больных с ИБС.

При сравнительном анализе распределения генотипов полиморфного маркера 0(-455)А гена в группе больных с благоприятным исходом заболевания по сравнению с группой больных с неблагоприятным исходом было обнаружено статистически достоверное возрастание доли аллеля в (р = 0,036) и генотипа <36 (р = 0,029) в группе больных с благоприятным исходом (табл. 15).

Таблица 15.

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера С(-455)А гена ГСД у больных с благоприятным и неблагоприятным исходами ИБС.

Аллели и генотипы Благоприятный исход заболевания Неблагоприятный исход заболевания Р ОХ

А 0,266 0,395 0,036 1,82 [1,03-3,21]

в 0,734 0,605 0,036 0,54 [0,31 -0,96]

во 0,544 0,348 0,029 0,46 [0,22 - 0,96]

вА 0,380 0,512 >0,05 -

АА 0,760 0,140 >0,05 -

лнчнымн генотипами полиморфного маркера (Ц-455)А гена

Носители аллеля А имеют повышенный риск (ОХ = 1,82), в то время как носители аллеля С? и генотипа СйЗ имеют пониженный риск развития осложнений ИБС (ОХ = 0,54 и ОХ = 0,46, соответственно).

При оценке выживаемости больных, рассчитанной методом Каплана - Майера, было выявлено, что носители аллеля А полиморфного маркера в(-455)А гена имели меньшее время до развитая неблагоприятного исхода, чем больные с генотипом вв (728,9 ± 62,17 и 852,4 ± 63,76 дней, соответственно), однако различия не были статистически достоверны (р - 0,078) (рис. 5).

Таким образом, полиморфный маркер G(-455)A гена FGB ассоциирован с развитием повторного инфаркта миокарда, острой коронарной недостаточности и инсульта у русских пациентов г. Москвы с ИБС, при этом носительство аллеля G или генотипа GG дает благополучный прогноз, а носительство аллеля А предрасполагает к развитию осложнений данной патологии.

ВЫВОДЫ.

1. Определены частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов PLANH1, F5, ITGB3, ITGA2B, F7, THBD, FGB, PROC в группах больных ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда, а также в контрольной группе русских г. Москвы.

2. Для ряда полиморфных маркеров генов PLANH1, F5, ITGB3, ITGA2B, F7, THBD, FGB, PROC показано отсутствие ассоциации с ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда у русских г. Москвы. ^

3. Обнаружена ассоциация полиморфного маркера G(-4S5)A гена FGB с уровнем фибриногена у женщин, больных ишемической болезнью сердца.

4. Обнаружена ассоциация полиморфного маркера С(-1654)Т гена PROC с развитием неблагоприятного исхода при ишемической болезнч сердца. Носители генотипа СС имеют повышенный риск неблагоприятного исхода, тогда как носители генотипа СТ имеют сниженный риск неблагоприятного исхода при ИБС.

5. Обнаружена ассоциация полиморфного маркера G(-455)A гена FGB с развитием неблагоприятного исхода при ишемической болезни сердца. Носители аллеля А имеют повышенный риск неблагоприятного исхода, в то время как носители аллеля G и генотипа GG имеют пониженный риск неблагоприятного исхода при ИБС.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чудакова, ДА., Минушкина, Л.О., Затейщиков, Д.А., Носиков В.В. (2004) Ассоциация полиморфного маркера А1/А2 гена ITGB3 с игаемической болезнью сердца и инфарктом миокарда. Генетика, 40 (10), стр. 1402-1405.

2 Чудакова, Д.А., Минушкина, JIО, Затейщиков, Д.А., Носиков В В. (2004) Изучение ассоциации полиморфного маркера G(-455)A гена FGB с ишемической болезнью сердца. Генетика, 40 (10), стр. 1406-1409.

3. Затейщиков Д.А., Чумакова О.С., Затейщикова A.A., Зотова И.В., Минушкина Л.О., Чудакова Д.А., Носиков В В., Сидоренко Б.А. (2004) Генетические предикторы неблагоприятного течения ИБС у больных ИБС высокого риска по данным двухлетнего наблюдения Кардиология, 44 (12), стр. 16-22.

4. Носиков, В.В., Затейщиков, ДА., Савостьянов, К.В., Чумакова, О.С., Воронько, O.E., Минушкина, Л С, Чудакова, Д.А., Шестаков, А.Е., Сидоренко, Б.А. Генетические основы наследственной предрасположенности к ишемической болезни сердца. Анализ ассоциации д^х групп генов-кандидатов. Тезисы Российского национального конгресса кардиологов "От исследований к стандартам лечения", стр 235, Москва, Россия (7-9 октября 2003 г).

5. Селезнева, Н.Д., Чудакова, Д.А., Минушкина, Л.О., Затейщикова, A.A., Чумакова, О.С., Затейщиков, Д.А., Носиков, В.В., Сидоренко, Б.А. Ассоциация полиморфного маркера 4G( 675)5G гена ингибитора активатора плазминогена типа 1 с ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда Тезисы Российского национального конгресса кардиологов "От исследований к стандартам лечения", стр. 285, Москва, Россия (7-9 октября 2003 г).

6 Затейщиков ДА., Чудакова Д А.. Селезнева Н.Д, Воронько O.E., Зотова И.В., Минушкина Л.О., Носиков В.В., Сидоренко Б.А. Генетические маркеры неблагоприятного течения ишемической болезни сердца Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики», стр. 415, Москва, Россия (25 - 27 ноября 2003 г).

7. Савостьянов К.В., Затейщиков ДА., Чудакова Д.А, Чумакова О.С., Воронько O.E., Минушкина Л.О., Шестаков А.Е, Сидоренко Б.А., Носиков В.В. Генетические основы наследственной предрасположенности к ишемической болезни сердца. Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики», стр. 439, Москва, Россия (25 - 27 ноября 2003 г).

8 Чудакова, Д А , Минушкина, Л О , Затейщиков, Д А , Носиков, В.В. Изучение ассоциации полиморфных маркеров генов системы гемостаза с ишемической болезнью сердца. Тезисы докладов XVI зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", стр. 55, Москва, Россия (10-13 февраля 2004 г).

9. Zateyshchikov, D.A., Chudakova, D.A., Zateyshchikova, A.A., VoronTco, O.E., Minushkina, L.O., Chumakova, O.S., Nosikov, V.V., Sidorenko, В .A. АРОВ, FGB and PROC genes implicated in the genetic predisposition to long-term bad outcomes in patients with unstable angina. Abstracts of the Second "Biologie Prospective" Santorini Conference "From Human Genetic Variations to Prediction of Risks and Responses to Drugs and Environment", Santorini, Greece (September 30 - October 4, 2004). Clinical Chemistry and Laboratoiy Medicine, 42 (81, p. A57 - A58.

í

í

\

4

4

i

3

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 26.04.2005 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л.1,75. Тираж 100 экз. Заказ 250. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

РНБ Русский фонд

2005-4 45869

О / M2005

1995

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чудакова, Дарья Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Полиморфные маркеры.

1.1.1. Типы полиморфизмов и методы их исследования.

1.1.2. Использование полиморфных маркеров в исследовании генетики многофакторных заболеваний.

1.2. Ишемическая болезнь сердца.

1.2.1. Основные аспекты этиологии и патогенеза ишемической болезни сердца.

1.2.2. Генетические факторы риска развития ишемической болезни сердца.

1.2.3. Инфаркт миокарда.

1.3. Система гемостаза.

1.4. Характеристика исследованных в работе генов и полиморфных маркеров.

1.4.1. Ингибитор активатора плазминогена типа 1. Ген PLANH1. Полиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС и ИМ.

1.4.2. Фактор свертывания крови V. Ген F5. Полиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС и ИМ.

1.4.3. Интегрин allbp3. Ген 1TGB3. Полиморфные маркеры гена, и их ассоциация с ИБС и ИМ.

1.4.4. Ген ITGA2B. Полиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС и ИМ.

1.4.5. Фактор свертывания крови VII. Ген F7. Полиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС и ИМ.

1.4.6. Протеин С. Ген PROC. Полиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС и ИМ.

1.4.7. Тромбомодулин. Ген THBD. Полиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС и ИМ.

1.4.8. Фибриноген. Ген РОВ. Полиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС и ИМ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Реактивы и ферменты.

2.2. Буферные растворы.

2.3. Формирование групп больных и здоровых индивидов.

2.4. Выделение геномной ДНК.

2.5. Амплификация ДНК.

2.6. Расщепление продуктов амплификации рестриктазами.

2.7. Электрофоретическое разделение ДНК.

2.8. Определение уровня фибриногена в крови.

2.9. Статистическая обработка результатов.

2.9.1. Сравнение выборок по частотам аллелей и генотипов.

Точный критерий Фишера.

2.9.2. Оценка отношения шансов. Доверительный интервал.

2.9.3. Построение кривых Каплана-Мейера.

2.9.4. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1.1. Исследование ассоциации полиморфного маркера 4С(-675)5С гена РЬАЫН1 с ИБС и ИМ.

3.1.2. Исследование ассоциации полиморфных маркеров Агё506С1п, Агё3061Ъг и С(-426)Тгена Р5 с ИБС и ИМ.

3.1.3. Исследование ассоциации полиморфного маркера А1А2 гена 1ТвВЗ с ИБС и ИМ.

3.1.4. Исследование ассоциации полиморфного маркера НРА-За/ЗЬ гена 1ТвА2В с ИБС и ИМ.

3.1.5. Исследование ассоциации полиморфных маркеров Агё35301п и в73А гена Р7 с ИБС и ИМ.

3.1.6. Исследование ассоциации полиморфных маркеров С(-1654)Т и

А(-1641)в гена РЯОС с ИБС и ИМ.

3.1.7. Исследование ассоциации полиморфного маркера А1а455Уа гена ТНВВ с ИБС и ИМ.

3.1.8. Исследование ассоциации полиморфного маркера 0(-455)А гена ТОД с ИБС и ИМ.

3.2. Исследование ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с неблагоприятным исходом ИБС.

3.2.1. Изучение ассоциации полиморфного маркера С(-1654)Тгена РЯОС с неблагоприятным исходом ИБС.

3.2.2. Изучение ассоциации полиморфного маркера 0(-455)А гена РОВ с неблагоприятным исходом ИБС.

4. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование ассоциации ряда генов системы гемостаза с ишемической болезнью сердца"

В настоящее время сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной инвалидности и смертности в экономически развитых странах (Воег\утк1е, 1996), при этом на долю ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда приходится примерно две трети случаев смерти от сердечно-сосудистых заболеваний.

Известно, что данные сердечно-сосудистые патологии являются многофакторными заболеваниями с многочисленными звеньями патогенеза. Для таких заболеваний характерен сложный механизм формирования фенотипа, в основе которого лежит взаимодействие генетических факторов с факторами внешней среды (ваШоп, 1995). При этом для каждого конкретного заболевания можно выделить группу так называемых генов-кандидатов, продукты которых могут быть прямо или косвенно вовлечены в развитие данной патологии.

Исследование молекулярно — генетических основ многофакторных заболеваний относится к одной из наиболее серьезных задач современной генетики. Знание генетических факторов, предрасполагающих к развитию заболевания и его осложнений, имеет важное прогностическое значение и может использоваться при досимптоматической диагностике, т.е. до появления каких-либо клинических или биохимических симптомов болезни.

Современная стратегия исследования генетической составляющей многофакторных заболеваний включает в себя поиск полиморфных маркеров в генах, могущих вносить вклад в развитие заболевания (генах-кандидатах) и оценку их ассоциации с заболеванием (Пузырев, 1997). Под ассоциацией полиморфного маркера с заболеванием понимают достоверно различающуюся частоту встречаемости определенного аллеля или генотипа этого маркера у больных и у здоровых лиц одной и той же популяции.

Установление ассоциации гена с заболеванием и последующая оценка индивидуального генетического риска имеют важное значение для разработки дифференцированного подхода к профилактике и лечению данной патологии и ее осложнений в зависимости от наследственной предрасположенности конкретного пациента. Подобные исследования позволяют точнее и надежнее оценивать генетический риск развития заболевания и прогнозировать его течение.

Исходя из современных представлений о механизмах развития ИБС, можно выделить группу кандидатных генов, белковые продукты которых участвуют или потенциально могут быть вовлечены в патогенез ИБС и ее осложнений. Среди таких генов-кандидатов особого внимания заслуживают гены системы гемостаза (Hopkins, 1989), играющие важную роль в развитии данной патологии (Paul, 1999).

Изучение аллельного полиморфизма генов системы гемостаза у больных ИБС и ИМ, а так же у здоровых лиц общей популяции позволило найти аллели, в различной степени ассоциированные с предрасположенностью к развитию этих заболеваний в разных этнических группах.

Цели и задачи работы

Целью данной работы было изучение ассоциации полиморфных маркеров нескольких генов-кандидатов, кодирующих белковые факторы системы гемостаза, с ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов, кодирующих фактор свертывания крови V (Е15), фактор свертывания крови VII (Р7), (3-цепь фибриногена (РОВ), РЗ-субъединицу интегрина аНЬрЗ (1ТСВЗ), аНЬ-субъединицу интегрина аИЬрЗ (1ТОА2В), ингибитор активатора плазминогена типа 1 (РЬАЫН!), протеин С (РЯОС) и тромбомодулин (ТНВЦ>) в группах больных ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда, а так же в группе здоровых индивидов среди русских г. Москвы.

2. Провести сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов полиморфных маркеров данных генов-кандидатов в исследованных выборках больных и здоровых индивидов для выявления ассоциации изученных маркеров с развитием болезни и определения вклада данных генов в наследственную предрасположенность к патологии.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Чудакова, Дарья Александровна

выводы.

1. Определены частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов РЬАИШ, 1ТвВЗ, 1ТСА2В, ТНВВ, ГОД РЯОС в группах больных ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда, а также в контрольной группе русских г. Москвы.

2. Для ряда полиморфных маркеров генов РЬАЫН1, Р5, 1ЮВЗ, 1ТСА2В, П, ТНВБ, РОВ, РЯОС показано отсутствие ассоциации с ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда у русских г. Москвы.

3. Обнаружена ассоциация полиморфного маркера С(-455)А гена РСВ с уровнем фибриногена у женщин, больных ишемической болезнью сердца.

4. Обнаружена ассоциация полиморфного маркера С(—1654)Т гена РЯОС с развитием неблагоприятного исхода при ишемической болезни сердца. Носители генотипа СС имеют повышенный риск неблагоприятного исхода, тогда как носители генотипа СТ имеют сниженный риск неблагоприятного исхода при ИБС.

5. Обнаружена ассоциация полиморфного маркера (7(-455)А гена РСВ с развитием неблагоприятного исхода при ишемической болезни сердца. Носители аллеля А имеют повышенный риск неблагоприятного исхода, в то время как носители аллеля С и генотипа СС имеют пониженный риск неблагоприятного исхода при ИБС.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чудакова, Дарья Александровна, Москва

1. Аасрум М., Придз X., Избирательное выключение генов тканевого фактора, фактора X и фактора VII у мышей: участие этих факторов в эмбриональном развитии // Биохимия. 2002. 67. 30—39.

2. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А., Полиморфизм ДНК в популяционной генетике // Генетика. 2002. 38. 1173-1195.

3. Балуда В.П, Баркаган З.С., Гольдберг Е.Д, и др. Лабораторные методы исследования системы гемостаза//Томск. 1980. 313 с.

4. Баркаган З.С., Геморрагические заболевания и синдромы // М. Медицина. 1980. 336 с.

5. Вашкинель В.К., Петров М.Н., Ультраструктура и функция тромбоцитов человека // JL Медицина. Ленингр. Отд-ние. 1982. 87 с.

6. Дугина Т.Н., Киселева Е.В., Чистов И.В., Умарова Б.А., Струкова С.М., Рецепторы семейства PAR — связующее звено процессов свертывания крови и воспаления // Биохимия. 2002. 67. 77—87.

7. Зубаиров Д.М., Тимербаев В.Н., Байкеев Р.Ф., Биохимия животных и человека // Республ. Межвед. Сб. научн. тр. Киев. Наукова думка. 1989. №13. с 1-10.

8. Карпов P.C., Дудко В.А., Атеросклероз: патогенез, клиника, функциональная диагностика, лечение // Томск. STT. 1998. 650 с.

9. Коган А.Е., Струкова С.Е., Протеин С: Механизмы активации и антикоагулянтоного действия // Биохимия. 1993. 58. 823-844.

10. Мари Р., Гренер Д., Мейес П. и др., Биохимия человека // М. Мир. 1993. т. 2.415 с.

11. Офозу Ф.А. Тромбоциты как модель регуляции свертывания крови на клеточных мембранах и ее значение // Биохимия. 2002. 67. 56-65.

12. Парфенова Е.В, Плеханова О.С., Ткачук В.А. Система активаторов плазминогена в ремоделировании сосудов и ангиогенезе // Биохимия. 2002. 67. 139-156.

13. Патрушев Л.И., Генетические механизмы наследственных нарушений гемостаза // Биохимия. 2002. 67. 40-55.

14. Пузырев В, Степанов В, Паталогическая анатомия генома человека // Новосибирск. Наука. 1997. с 70-98.

15. Сидоренко Б.А., Грацианский H.A., Хроническая ишемическая болезнь сердца // М. Медицина. 1992. т 2. с 5-52.

16. Сидоркина А.Н., Сидоркин В.Г., Преснякова М.В., Биохимические основы гемостаза и диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови И Н.Новгород. ННИИТО. 2001. 92 с

17. Струкова С.М., Ткачук В.А., Протеиназы системы свертывания крови и фибринолиза как клеточные ретуляторы // Биохимия. 2002. 67. 3-5.

18. Шиффман Ф.Д. Патофизиология крови // М.-Спб. «Издательство БИНОМ» «Невский диалект». 2000. 448 с

19. Шулутко Б.И., Макаренко С.В., Ишемическая болезнь сердца // Ренкор. Санкт-Петербург. 1998.

20. Яровая Г.А., Блохина Т.Б., Нешкова Е.А., Контактная система. Новые представления о механизмах активации и биорегулирующих функциях // Биохимия. 2002. 67. 16-29.

21. Aiach М., Nicaud V., Gelas М.А., et al., Complex Association of Protein С Gene Promoter Polymorphism With Circulating Protein С Levels and Thrombotic Risk//Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1999. 19. 15731576.

22. Anderson G.M., Shaw AR., Functional characterization of promoter elements involved in regulation of human В beta fibrinogen expression. Evidence for binding of novel activator and repressor proteins // J. Biol. Chem. 1993. 268. 22650-22655.

23. Anderson J.L., King G.J., Bair T.L., Elmer S.P., Associations between a polymorphism in the gene encoding glycoprotein Ilia and myocardial infarction or coronary artery disease // J Am Coll Cardiol. 1999. 33. 72733.

24. Bajaj S.P., Rapaport S.I., Brown S.F., Isolation and characterization of human factor Vll. Activation of factor Vll by factor X // J. Biol. Chem. 1981.256. 253-259.

25. Becker R.C., Spencer F.A., Thrombin: Structure, Biochemistry, Measurement, and Status in Clinical Medicine // J. Thromb. Thrombol. 1998.5.215-229.

26. Behague I., Poirier O., 1996. 6 Fibrinogen Gene Polymorphisms Are Associated With Plasma Fibrinogen and Coronary Artery Disease in Patients With Myocardial Infarction // Circulation. 93. 440-449.

27. Bennett J.S., Vilaire G., Catella-Lawnson F., Rut A.R., Fitzgerald G., The P1A2 alloantigen does not alter the affinity of GPIIbllla for fibrinogen or RGD-containing peptides // Blood. 1997. 90. 154

28. Berliner J.A., Heinecke J.W., The role of oxidized lipo-proteinsin atherogenesis // Free Radic Biol Med. 1996. 20. 707-727.i

29. Berg K., Twin studies of coronary heart disease and its risk factors // Acta genet Med Gemell. 1984. 33. 349-361.

30. Bernardi F., Faioni E.M., Castoldi E., et al., A factor V genetic component differing from factor V R506Q contributes to the activated protein C resistance phenotype//Blood. 1997. 90. 1552-1557.

31. Bertina R.M., Koeleman B.P.C., Koster T., Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C // Nature 1994. 369. 64-67.

32. Bertina R.M., Molecular risk factors for thrombosis // Thromb. Haemost. 1999. 82. 601-609.

33. Boerwinkle E., Ellsworth D., Hallman M., Biddinger A., Genetic analysis of atherosclerosis: a research pparadigm for the common chronic diseases //Hum Mol. Genet. 1996. 5. 1405-1410.

34. Boers G.H., Smals A.G., Trijbels F.J., Heterozygosity for homocystinuria in premature peripheral and cerebral occlusive arterial disease // N. Engl. J. Med. 1985.313.709-715.

35. Born G.V.R., Fibrinogen: How to explain its risk factor status // Abstr. 3rd Int. Fibrinogen Symp. "Hemostasis, Inflamm. and Cardiovasc. Disease", Ulm, May 3-4, 1996 Fibrinolysis. 1996. 10. Suppl. 1.

36. Bottiger C, Kastrati A, Koch W, Mehilli J, Seidl H, Schomig K, von Beckerath N, Schomig A., HPA-1 and HPA-3 polymorphisms of the platelet fibrinogen receptor and coronary artery disease and myocardial infarction // Thromb Haemost. 2000. 83(4). 559-62.

37. Bray P.F. Integrin Polymorphisms as Risk Factors for Thrombosis // Thromb. Haemost. 1999. 82. 337-344.

38. Bray P.F, Michelson A.D, Furman M.I, Salmon J, Bolton E, Afshar-Khargan V, Lopez J. Correlating genetic variations in adhesive receptors with platelet function // Blood. 1999. 94. 216a.

39. Brookes A.J., The essence of SNP // Gene. 1999. 234.177-186.

40. Brown D.L., Gorin M.B., Weeks D.E. Efficient strategies for genomic searching using the affected-pedigree-member method of linkage analysis // Am. J. Hum. Genet. 1994. 54. 544-552.

41. Brown E.T., Fuller G.M. Detection of a Complex That Associates With the 13 Fibrinogen G-455-A Polrmorthism // Blood. 1998. 92. 3286-3293.

42. Cargill M., Altshuler D., Ireland J., Characterization of single-nucleotide polymorphism in coding regions of human genes // Nature Genetics. 1999. 22. 231-238.

43. Carmeliet P., Clotting Factors Build Blood Vessels // Science. 2001. 293. 1602-1604.

44. Carter A.M, Catto A.J., Bamford J.M., Grant P.J., Association of the Platelet Glycoprotein lib HPA-3 Polymorphism With Survival After Acute Ischemic Stroke// Stroke. 1999. 30. 2606-15.

45. Chan W.P., Lee C.K., Kwong. Y.L., et al., A novel mutation of Arg 306 of factor V gene in Hong Kong Chinese // Blood. 1998. 91.1135-1139.

46. Charlesworth C., Sniegovski P., Stephan W., The evolutionary dynamics of repetitive DNA in eukaryotes.// Nature. 1994. Vol. 371. P. 215-220.

47. Chen F., Jian Z., Xie Q., Polymorphism of human platelets alloantigens in Chinese patients with acute myocardial infarction and acute ischemic stroke // Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2000. 80. 332-5.

48. Colman, R.W., Schmaier, A.H., Contact system: a vascular biology modulator with anticoagulant, pro fibrinolytic, antiadhesive, and proinflammatory attributes //1. Blood. 1997.90. 3819-3843

49. Cox N .J., Bell G.I., Disease associations, chance artifactors susceptibiility genes? // Diabetes. 1989. 38. 947-950.

50. Cooke G.E., Bray P.F., Hamlington J., Pham D.M. P1A2 polymorphism and efficacy of aspirin // Lancet. 1998. 351. 1353-5.

51. Cortellaro M., Cofrancesco E., Boschetti C., Mussoni L., For the PLAT group. Increased fibrin turnover and high PAI-1 activity as predictors of ischemic events in atherosclerotic patients: a case-control study // Arterioscler. Thromb. 1993. 13. 1412-7.

52. Covas D.T., Biscaro T.A., Nasciutti D.C., Guerrievo J.F., Gene frequencies of the HPA-3 and HPA-5 platelet antigen alleles among the Amerindians //Eur. J. Haematol. 2000. 65. 128-131.

53. Cui J., Eitzman D.T., Westrick R.J., Christie P.D., Spontaneous thrombosis in mice carrying the factor V Leiden mutation // Blood. 2000. 96. 42224226.

54. Dahlback B., Carlsson M., Svensson P.J., Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C // Proc Natl Acad Sci U S A 1993. 90. 1004-1008.

55. Dalmon J., Laurent M., The human beta fibrinogen promoter contains of hepatocite nuclear factor 1-dependent interleukin-6-responsive element // Mol. Cell. Biol. 1993. 13. 1183-1193.

56. Dawnson S., Hamsten A., Wiman B., Henney A., Humphries S., Genetic variation at the plasminogen activator inhibitor locus is assotiated with altered levels of plasma plasminogen activator inhibitor-1 activity // Arterioscler. Thromb. 1991. 11. 183-90.

57. Dittman W.A., Majerus P.W., Structure and function of thrombomodulin: a natural anticoagulant. Blood. 1990. 75. 329-36.

58. Diuguid, D.L., Rabiet, M.J., Furie, B.C., Liebman H.A, Molecular basis of hemophilia B: a defective enzyme due to an unprocessed propeptide is caused by a point mutation in the factor IX precursor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. 83. 5803-5807.

59. Doggen C.J, Manger Cats V., Bertina R.M., Reitsma P.H., A genetic propensity to high factor VII is not associated with the risk of myocardial infarction in men // Thromb. Haemost. 1998. 80. 281-5.

60. Doggen C.J., Bertina R.M., Cats V.M., Reitsma P.H., Rosendaal F.R., The 4G/5G polymorphism in the plasminogen activator inhibitor-1 gene is notassociated with myocardial infarction // Thromb. Haemost. 1999. 82. 11520.

61. Doggen C., Bertina R., Fibrinogen polymorphisms are not associated with the risk of myocardial infarction // Br. J. Haemotol. 2000. 110. 935-943.

62. Du X, Ginsberg MH., Integrin alpha lib beta 3 and platelet function // Thromb Haemost. 1997. 78. 96-100.

63. Durante-Mangoni E, Davies GJ, Ahmed N, Ruggiero G, Tuddenham EG., Coronary thrombosis and the platelet glycoprotein IIIA gene PLA2 polymorphism // Thromb Haemost 1998. 80. 218-9.

64. Economou E., Bergen A., Warren A., Antonarakis S. The polyadenylate tract of Alu-repetitive elements is polymorphic in the human genome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. 87. 2951-2954.

65. Edwards A., Hammond H.A., Jin L., Caskey C.T., Chakraborty R. DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats // Am. J. Hum Genet. 1991. 49. 746-756.

66. Emmerich J., Poirier O., Evans A., Myocardial infarction, Arg506 to Gin factor V mutation, and activated protein C resistance // Lancet. 1995. 345. 321-5.

67. Erickson L., Ficl G., Lund J., Boyle T., Polites H., Development of venous occlusion in mice transgenic for the plasminogen activator inhibitor gene // Nature. 1990. 346. 74-76.

68. Ericsson P., Kallin B., van't Hooft F.M., Barenholm P., Hamsten A., Allele-specific increase in basal transcription of the plasminogen activator inhibitor—1 gene is associated with myocardial infarction // Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. 92. 1851-1856.

69. Ernst E., Fibrinogen an independent cardiovascular risk factor // J. Ing. Mod. 1990. 227. 365-372.

70. Estelles A., Tormo G., Aznar J., Reduced fibrinolytic activity in coronary heart disease in basal conditions and after exercise // Thromb. Res. 1985. 40. 373-383.

71. Faioni E.M., Franchi F., Bucciarelli P., et al., Coinheritance of the HR2 haplotype in the factor V gene confers an increased risk of venous thromboembolism to carriers of factor V R506Q (factor V Leiden) // Blood. 1999. 94.3062-3066.

72. Feng D.L, Lindpaintner K, Larson M.G., Increased platelet aggregability associated with platelet GPIIIa P1A2 polymorphism: the Framingham Offspring study // Arterioscler Thromb Vase Biol. 1999. 19: 1142-1147

73. Feng D.L., Tofler G.H., Larson M.G., et al.,The Plasminogen Activator Inhibitor-1 Gene 4G/5G Polymorphism and Cardiovascular Disease: The Framingham Heart Study // 48th Annual Scientific Session of ACC. 1999. New Orlean. USA. Abst. 1191.

74. Feng DL, Lindpaintner K;. Larson M G; Christopher J. Platelet Glycoprotein Ilia PlA Polymorphism, Fibrinogen, and Platelet Aggregability//Circulation. 2001. 104. 140-8.

75. Le Flem L., Picard V., Emmerich J., Gandrille S., Fiessinger J.N., Aiach M., Alhenc-Gelas M., Mutations in promoter region of thrombomodulin and venous thromboembolic disease // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1999. 19.1098-1104.

76. Folio M., Ginsburg D., Structure and expression of the human gene encoding plasminogen activator inhibitor, PAI-1 // Gene. 1989. 84. 447— 453.

77. Folsom A.R., Wu K.K., Davis C.E., Population correlates of plasma fibrinogen and factor VII, putative cardiovascular risk factor // Atherosclerosis. 1991. 91. 191-205.

78. Folsom A.R., Wu K.K, Rosamond W.D., Sharrett A.R., Chambless L.E., Prospective study of hemostatic factors and incidence or coronary heart disease: the Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) Study // Circulation. 1997. 96. 1102-8.

79. Friesewinkel O., Marbet G.A., Ritz R., Factor VII and protein-C markers are no prognostic indicators in acute coronary heart disease // Schweiz. Med. Wochenschr. 1993. 23. 82-4

80. Fuentes-Prior P., Iwanaga Y., Hub.er R., Pagila R., Rumennik G., Seto M., Morser J., Light D.R., Bode W., Structural basis for the anticoagulant activity of the thrombin- thrombomodulin complex // Nature. 2000. 404. 518-25.

81. Fujikawa K., Heimark, R.L., Kurachii, K., and Davie, E.W., Activation of bovine factor XII (Hageman factor) by plasma kallikrein. // Biochemistry. 1980. 19. 1322-1330

82. Fuster V., Badimon L., Badimon J.J., Chesebro J.H., The pathogenesis of coronary artery disease and tne acute coronary syndromes // N. Engl J. Mod. 1992. 326. 242-50.

83. Galtion D., Gavanna J. Kay A., Zhang Q., Coronary artery disease in Europe: what are the genetic risk factors? // J. of the Royal College of Physicians in London. 1995. 29. 429-430.

84. Gandrille S., et al., Incidence of activated protein C resistance caused by the Arg506Gln mutation in factor V in 113 unrelated symptomatic protein C-deficient patients // Blood. 1995. 86. 219-224.

85. Gardemann A., Humme J., Strieker J., Nguen Q.D., Assotiation of the platelet glycoprotein Ilia P1A1/A2 polymorphism to coronary artery disease but not to nonfatal myocardial infarction in low risk patients // Thromb. Haemost. 1998. 80. 214-217.

86. Gardemann A., Lohre J., Katz N., Tillmanns H., The 4G4G genotype of the plasminogen activator inhibitor 4G/5G gene polymorphism is associated with coronary atherosclerosis in patients at high risk for this disease // Thromb Haemost. 1999. 82. 1121-6.

87. George J.N., Caen J.P., Nurden A.T., Glancmann's thrombastenia: the spectrum of clinical disease//Blood. 1990. 75. 1383-1395.

88. Ghosh S., Collins F.S., The geneticist's approach to complex disease // Annu. Rev. Med. 1996. 47. 333-353.

89. Girelli D.; Russo C.; Ferraresi P.; Olivieri O., Polymorphisms in the factor VII gene and the risk of myocardial infarction in patients with coronary artery disease // New Eng. J. Med. 2000. 343: 774-780.

90. Goldberger A., Kolodziej M., Poncz M., Bennett J.S., Newman P.J., Effect of single amino acid substitutions on the formation of the P1A and Bak alloantigenic epitopes // Blood. 1991. 78. 681-7.

91. Goldschmidt-Clermont PJ, Coleman L, Pham Y, et al. Higher prevalence of GPIIIa P1A2 polymorphism in siblings of patients with premature coronary heart disease // Arch Pathol Lab Med. 1999. 123. 1223-1229.

92. Goodall AH, Curzen N, Panesar M, Hurd C, Increased binding of fibrinogen to glycoprotein IIIa-proline33 (HPA-lb, P1A2, Zwb) positive platelets in patients with cardiovascular disease // Eur Heart J. 1999. 20. 706-8.

93. Green F., Hamsten A., The role of beta-fibrinogen genotype in determining plasma fibrinogen levels in young survivors of myocardial infarction and healthy controls from Sweden // Thromb. Haemost. 1993. 70. 915-935.

94. Green F.G., Humphries S., Genetic determinants of arterial thrombosis // Baillieres. Clin. Haematol. 1994. 7. 675-92.

95. Gregg J.P., Yamane A.J., Grody W.W., Prevalence of the factor V-Leiden mutation in four distinct American ethnic populations // Am. J. Med. Genet. 1997. 73. 334-336.

96. Guyer M.S. Collins F.S., How is the Human genome project doing, and what have we learned so far? // Proc. Natl. Acad. Sci. Usa. 1995. 92. 10841-10848.

97. Hall J.M., Lee M.K., Newman B., Linkage of early-onset familial breast cancer to chromosome 17q21 //Science. 1990. 250. 1684-1689.

98. Hamada H., Petrino M., Kakunaga T., Seidman M., Stollar B. Characterization of genomic Poly(dT-dG) Poly(dC-dA) sequences: structure, organization and conformation // Mol. Cell. Biol. 1984. 4. 26102621.

99. Hamada H., Seidman M., Howard B., Gorman C. Enchanced gene expression by Poly(dT-dG) Poly(dC-dA) sequence // Mol. Cell. Biol. 1984. 4. 2622-2630.

100. Hamsten A., Wiman B., De Faire U., Blombaeck M. Increased plasma levels of a rapid inhibitor of tissue plasminogen activator in young survivors of myocardial infarction // New England Journal of Medicine. 1985.313. 1557-1563.

101. Hamsten A, De Faire U., Walldius G., Dahlen G., Plasminogen activator inhibitor in plasma: risk factor for recurrent myocardial infarction // Lancet. 1987.2. 3-9.

102. Harvald B., Hauge M., Coronary occlusion in twins. Acta. Genet. Med. Gemellol. 1970. 19. 248-250.

103. Hato T., Minamoto Y., Fukuyama T., Fujita S., Polymorphisms of HPA-1 through 6 on platelet membrane glycoprotein receptors are not a geneticrisk factor for myocardial infarction in the Japanese population // Am. J. Cardiol. 1997.80. 1222-1224.

104. Heymans S., Luttun A., Nuyens D., Theilmeier G., Inhibition of plasminogen activators or matrix metalloproteinases prevents cardiac rupture but impairs therapeutic angiogenesis and causes cardiac failure //Nat. Med. 1999. 5. 1135-42.

105. Heeb M., Kojima Y., Greengard J., Griffin J., Activated protein C resistance: Molecular mechanisms based on studies using purified Gln506-factor V // Blood. 1995. 85. 3405-5.

106. Heinecke J.W., Lusis A.J., Paraoxonase -gene polymor-phisms associated with coronary heart disease: Support forthe oxidative damage hypothesis? // Am J Hum Genet. 1998. 62. 20-24.

107. Heinnch J., Balleisen L., Schulte H., Assmann G., van de Loo J., Fibrinogen and factor VII in the prediction of coronary risk: results from the PROCAM study in healthy men // Arterioscler. Thromb. 1994. 14. 549.

108. Heinrich J., Balleisen L., Fibrinogen and factor 7 in the prediction of coronary risk. Results from the PROCAM study in healthy men // Arterioscler. Thromb. 1994. 14. 54-63.

109. Henry M., Chomiki N., Scarabin P., Alessi M.C., Pieretti F. Five Frequent Polymorphisms of the PAI-1 Gene // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1997. 17. 851-858.

110. Hopkins P.N., Williams R.R., Human genetics and coronary heart disease: a public health perspective // Annu. Rev. Nutr. 1989. 9. 303-345.

111. Hummel L., Importance of the fibrinogen concentration as an independent risk factor for ischemic heart disease // Wien Med. Wochenschr. 1993. 143. 469-72.

112. Humphries S.E., Panahloo A., Montgomery H.E., Green F., Yudkin J., Gene-environment interaction in the determination of levels of haemostatic variables involved in thrombosis and fibrinolysis // Thromb. Haemos.t 1997. 78. 457-61.

113. Hunault M., Arbini A.A., Lopaciuk S., Carew J.A., Bauer K.A., The Arg353Gln Polymorphism Reduces the Level of Coagulation Factor VII In

114. Vivo and in Vitro Studies // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1997. 17. 2825-2829.

115. Iacoviello L., Burzotta F., Castelnuovo A. D., The 4G/5G polymorphism of PAI-1 promoter gene as a risk factor for myocardial infarction: a metaanalysis //Tromb. Hemost. 1998. 80. 1029-1030.

116. Iacoviello L., Castelnuovo A., de Kniff P., D'Orazio A., Amore C., Polymorphisms in the Coagulation Factor VII Gene and the Risk of Myocardial Infarction // New. Engl. Journal of Medicine. 1998. 338. 7985.

117. Ireland H., Kunz G., Kyriakoulis K., Stubbs P.J., Lane D.A., Thrombomodulin gene mutations associated with myocardial infarction // Circulation. 1997. 96. 9-11.

118. Jansson J., Nilsson T., Olofsson B., Tissue plasminogen activator and other risk factors as predictors of cardiovascular events in patients with severe angina pectoris//Europ. Heart J. 1991. 12. 157-161.

119. Jeffreys A.J., Wilson V., Thein S.L Hyper variable "minisatellite" regions in human DNA // Nature. 1985. 316. 76-79

120. Jelinek W., Schmid C. Repetitive sequences in eukaryotic DNA and their expression // Ann. Rev. Biochem. 1982. 51. 813-844.

121. Jogin R., Chaoming Zhou, Rinku Majumder, Powers D. D., Wienreb G, Lemtz B.R., Role of Procoagulant Lipids in Human Prothrombin Activation // Biochemistry. 2002. 41. 935-949.

122. Juhan-Vague I., Alessi M.C., Plasminogen activator inhibitor in plasma: risk factor for recurrent myocardial infarction // Lancet. 1993. 2. 3-9.

123. Juhan-Vague I, Pyke S., Alessi M., Jespersen J., Haverkate F., On behalf of the ECAT study group. Fibrinolytic factors and the risk of myocardial infarction or sudden death in patients with angina pectoris // Circulation. 1996. 94. 2057-63.

124. Junker R., Heinrich J., Schulte H., van de Loo J., Assmann G., Coagulation factor VII and the risk of coronary heart disease in healthy men // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1997. 17. 1539^4.

125. Kalafatis M., Mann KG., Factor V Leiden and thrombophilia // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1997. 17. 620-627.

126. Kane W.H., Ichinose A., Hagen F.S., Davie E.W., Cloning of cDNAs coding for the heavy chain region and connecting region of human factor V, a blood coagulation factor with four types of internal repeats // Biochemistry. 1987. 26. 6508-6514.

127. Kannel W.B., Wolf P.A., Castelli W.P., D'Agostino R.B., Fibrinogen and risk of cardiovascular disease // JAMA 1987, 258, 1183-6

128. Kannel W.B., D'Agostino R.B., Wilson P.R., Diabetes, fibrinogen, and risk of cardiovascular disease. The Framingham experience // Am. Heart. J. 1990. 120.672-676.

129. Kiesel W., Human plasma protein C. Isolation, characterization and mechanism of action by a-thrombin // J. Clin. Invest. 1979. 64. 761-769.

130. Kim H.O., Kickler T.S., Blacmore K., Gene frequencies of the five major human platelet antigens in African American, white, and Korean populations//Transfusion. 1995. 35. 863-867.

131. Koopman J., Haverkate F., Lord S.T., Grimbergen J., Manucci P.M., Molecular basis of fibrinogen Naples associated with defective thrombin binding and thrombofilia. Homozygous substitution of Bp 68 Ala -> Thr // J. Clin. Invest. 1992. 90. 238-244.

132. Krishnamurti C., Alving B., Plasminogen activator inhibitor type 1: Biochemistry and evidence for modulation of fibrinolysis in vivo // Semin. Thromb. Hemostas. 1992. 18. 67-80.

133. Kroll H, Fechter A, Gardemann A., The role of the glycoprotein lib fibrinogen receptor subunit T2622G gene polymorphism (HPA-3) on coronary artery disease and acute myocardial infarction // Thromb Haemost. 2001. 85. 182-3.

134. Kunz G., Ohlin A.K., Adami A., Zoller B., Svensson P., Lane D.A., Naturally occurring mutations in the thrombomodulin gene leading to impaired expression and function // Blood. 2002. 99. 3646-53.

135. Lane D.A., Grant P. J., Role of hemostatic gene polymorphisms in venous and arterial thrombotic disease // Blood. 2000. 95. 1517-1532.

136. Lander E.S. The new genomics: global views of biology // Science 1996 274. 536-539.

137. Landolfi R, De Cristofaro R, De Candia E, et al., Effect of fibrinogen concentration on the velocity of platelet aggregation // Blood. 1991. 78. 377-381.

138. Lasne D, Krenn M, Pingault V, et al. Interdonor variability of platelet response to thrombin receptor activation: influence of P1A2 polymorphism // Br J Haematol. 1997. 99. 801-807.

139. Lawson J.H., Mann K.G., Cooperative activation of human factor IX by the human extrinsic pathway of blood coagulation.// J.Biol. Chem. 1991. 266. 11317-11327.

140. Lee A. J., Fibrinogen in relation to personal history of prevalent hypertension, diabetes, stroke, intermittent claucidation, coronary heart disease, and family history: the Scotish Heart Health Study // Br Heart J. 1993. 69.338-42.

141. Li H., Gyllensten U.B., Gui X., Saiki P.K., Erlich H.A., Arncheim N., Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells//Nature. 1988. 335. 414-417.

142. Li Y., Chen C., Yeh P., Lin H., Chang B., Lin J., Guo H., Wu H., Shi G., Lai M., Chen J., Functional mutation in the promoter region of thrombomodulin gene in relation to carotid atherosclerosis //Atherosclerosis. 2001. 154. 713-9.

143. Liang R., Lee C.K., Wat M.S., Kwong Y.L., Clinical Significance of Arg306 Mutations of Factor V Gene // Blood. 1998. 92. 2599-2600.

144. Liu C.Y., Koehn J.A., Morgan F.J., Characterization of fibrinogen new York I. A dysfunctional fibrinogen with a deletion of Bb (9-72) corresponding exactly to exon 2 of the gene // J. Biol. Chem. 1985. 260. 4390-4396.

145. Lu D., Kalafatis M., Mann K., Long G., Loss of membrane-dependent factor Va cleavage: A mechanistic interpretation of the pathology of protein C Vermont// Blood. 1994. 84. 687-90.

146. Lunghi B., et al., Detection of new polymorphic markers in the factor V gene: association with factor V levels in plasma // Thromb. Haemost. 1996. 75.45-48.

147. Lunghi B., Iacoviello L., Gemmati D., Dilasio M.G., Castoldi E., Pinotti M., Detection of new polymorphic markers in the factor V gene:association with factor V levels in plasma // Thromb. Haemost. 2000. 84. 357-8.

148. Mackness M.I., Mackness B., Durrington P.N., Connelly P.W., Hegele A., Paraoxonase: biochemistry, genetics and relationship to plasmalipoprotein // Curr Opin Lipidol. 1996. 7. 69 -76.

149. Mamotte CD, van Bockxmeer FM, Taylor RR., PIal/a2 polymorphism of glycoprotein Ilia and risk of coronary artery disease and restenosis following coronary angioplasty // Am J Cardiol. 1998. 82.13-6.

150. Mansfield M.W., Stickland M.H., Grant P.J., Plasminogen activator inhibitor—1 promoter polymorphisms and coronary artery disease in non— insulin-dependent diabetes//Thromb. Haemost. 1995.74. 1032-1034.

151. Marlar R. A., Kleiss A.J., Griffin J.H., An alternative extrinsic pathway of human blood coagulation//Blood. 1982. 60. 1353.

152. Maryama I., Recombinant Thrombomodulin and Activated Protein C in the Treatment of Dissiminated Intravascular Coagulation // Thromb. Haemostas. 1999. 82. 718-721.

153. Matsuda M., Sugo T., Yoshida N., Terukina Sh., Yamazumi K., et al, Structure and Function of Fibrinogen: Insights from Disfibrinogens // Thromb. Haemostasis. 1999. 82. 283-290.

154. Meade T.W., North W.R., Chakrabarti R., Haines A.P., Stirling Y., Population-based distributions of haemostatic variables // Br. Med. Bull. 1977. 33. 283-8.

155. Meirhaeghe A, Bauters C, Helbecque N, Hamon M, McFadden E, Lablanche JM, Bertrand M, Amouyel P., The human G-protein beta3 subunit C825T polymorphism is associated with coronary artery vasoconstriction // Eur Heart J 2001.Vol.22(10).P.845-848.

156. Miesfield R., Kiystal M., Arnheim N. A member of new repeated sequence family which is conserved eucaryotic evolution is found between the human delta- and beta-globin genes // Nicleic Acids Res. 1981. V. 9. P. 5931-5947.

157. Mikkelsson J., Perola M., Wartiovaara U., et al., Plasminogen activator Inhibitor-l (PAI-1) polymorphism, Coronary Thrombosis, and

158. Myocardial Infarction in Middle-aged Finnish Men who died suddenly // Tromb. Hemost. 2000. 84. 78-82.

159. Nakabayashi M., Yamamoto S., Suzuki K., Analysis of thrombomodulin gene polymorphism in women with severe early-onset preeclampsia 11 Semin. Thromb. Hemost. 1999. 25. 473-9.

160. Nawroth P.P., Stern D.M., Modulation of endothelial cell hemostetic properties by tumor necrosis factor // J. Exp. Med. 1990. 163. 740-745.

161. Ngo I.S.L., Pace R., Richard M.V. Methods for analysis of multiple cystic fybrosis mutations // Hum.Genet. 1991. 87. 613-617.

162. Nguyen G., Horellou M.H., Kruithof E.K.O., et al., Residual plasminogen activator inhibitor activity after venous stasis as a criterion for hypofibrinolysis: a study in 83 patients with confirmed deep vein thrombosis//Blood. 1988. 72. 601-605.

163. Nicolaes G., Thomassen M., Tans G., Rosing J., Hemker H., Effect of activated protein C on thrombin generation and on the thrombin potential in plasma of normal and APC-resistant individuals // Blood. Coagul. Fibrinol. 1997. 8. 28-5.

164. Nishiuma S., Kario K. Genetic variation in the promoter region of the beta-fibrinogen gene is associated with ischemic stroke in a Japanese population // Blood. Coagul. Fibrinolisis. 1998. 9. 373-382.

165. Nordt T.K., Sawa H., Fujii S., Sobel B.E., Induction of plasminogen activator inhibitor type-1 by proinsylin and insylin in vivo // Circulation. 1995.91.764-70.

166. Norlund L., Holm J., Zoller B., Ohlin A.K., A common thrombomodulin amino acid dimorphism is associated with myocardial infarction // Thromb. Haemost. 1997. 77. 248-51.

167. Norlund L., Holm J., Zoller B., Ohlin A.K., The Ala25-Thr mutation in the thrombomodulin gene is not frequent in Swedish patients suffering from ischemic heart disease // Thromb. Haemost. 1999. 82. 1367-8.

168. Ny T., Sawdey M., Lawrence D., Millan J.L., Loskutoff D.J. Cloning and sequence of cDNA coding for the human ^-migrating endothelial-cell-type plasminogen activator inhibitor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. 83.6776-6780.

169. Ohara Y., Peterson T.E., Harrison D.G., Hypercholesterolemia increases endothelial superoxide anion production // J Clin Invest. 1993. 91. 25462551.

170. Paul F.B. Integrin Polymorphisms as Risk Factors for Thrombosis. 1999 Thrombosis and Haemostasis, 82, 337-344.

171. Peyruchaud O., Nurden A., Bourre F., Bilateral linkage between a new deletion polymorphism in intron 21 of the GP lib gene and the HPA-3b (Bakb) determinant//Br J Haematol. 1995. 91(3).747-51.

172. Plescia J., Altieri D., Activation of Mac-1 (CD1 lb/CD 18)-bound factor X by released cathepsin G defines an alternative pathway of leucocyte initiation of coagulation // Biochem. J. 1996. 319. 873-879.

173. Prins M.H., Hirsh J., A clinical review of the evidence supporting a relationship between impaired fibrinolytic activity and venous thromboembolism//Arch. Intern. Med. 1991. 151. 1721-1731.

174. Princen H.M., Moshage H.J., Emeis J.J., Fibrinogen fragments X, Y, D, E increase levels of plasma fibrinogen and liver mRNAs coding for fibrinogen polypeptides in rats // Thromb. Haemost. 1985. 53.212-215.

175. Rees D.C., et al, World distribution of factor V Leiden // Lancet. 1995. 346. 1133 1134.

176. Ridker P.M., Hennekens, C.H., Lindpaintner K., Stampfer M.J., Mutation in the gene coding for coagulation factor V and the risk of myocardial infarction, stroke, and venous thrombosis in apparently healthy men // New Eng. J. Med. 1995. 332. 912-917.

177. Ridker P.M., Hennekens C.H., Schmitz C., Stampfer M.J., Lindpaintner K., P1A1/A2 polymorphism of platelet glycoprotein Ilia and risks of myocardial infarction, stroke and venous thrombosis // Lancet. 1997. 349385.

178. Ridker P.M., Hennekens C.H., Lindpainter K., Arterial and venous thrombosis is not assotiated with the 4G/5G polymorthism in the promoter of the plasminogen activator inhibitor gene in a large cohort of US men // Circulation. 1997. 95. 59-62.

179. Ridker PM, Stampfer MJ. Assessment of genetic mark-ers for coronary thrombosis: promise and precaution // Lancet. 1999. 353. 687-8.

180. Ridker P.M., Evaluating novel cardiovascular risk factors: can we better predict heart attacks // Ann. Intern. Med. 1999. 130. 933-7.

181. Robbert H.L., van de Poel, Meijers J.C.M., Rosing J., C4b-Binding Protein Protects Coagulation Factor Va from Inactivation by Activated Protein C //Biochemistry. 2000. 39. 14543-14548.

182. Roest M., van der Schouw, Banga J.D., Tempelman M.J., Plasminogen Activator Inhibitor 4G Polymorphism Is Associated With Decreased Risk of Cerebrovascular Mortality in Older Women // Circulation. 2000. 101. 67-70.

183. Rong J.X., Rangaswamy S., Shen L. et al., Arterial injury by cholesterol oxidation products causes endothelial dysfunction and arterial wall cholesterol accumulation//Arterioscler Thromb Vase Biol. 1998. 18. 18851894.

184. Rossaak J.I., van Rij A.M., Jones G.T., Harris E.L. Association of the 4G/5G polymorphism in the promoter region of plasminogen activator inhibitor—1 and abdominal aortic aneurysms // J. Vase. Surgery. 2000. 31. 1026-1031.

185. Rosendaal R.F., et al., Factor V Leiden (resistance to activated protein C) increases the risk of myocardial infarction in young women // Blood. 1997. 89. 2817-2821.

186. Ruddock V., Meade T. W., Factor VII activity and ischaemic heart disease: Fatal and non-fatal events // Q. J. Med. 1994. 87. 403-6.

187. Sadler J.E., Thrombomodulin structure and function // Thromb. Haemost. 1997.78. 392-5.

188. Saiki R., Scharf S., Faloona F., Mullis K., Horn G et al, Enzymatic amplification of P-globin genomic gene sequence and restriction site analysis for diagnosis of stickle cell anaemia // Science. 1985. 230. 13501354.

189. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular cloning, a laboratory manual. Cold. Spring Harbor Press, 1989. Cold Spring Harbor, N.Y.

190. Savage B., Alums-Jacobs F., Ruggeri Z.M., Specific synergy of multiple substrate-receptor interactions in platelet thrombosis formation underflow//Cell. 1998. 94. 657-666.

191. Schumm, J.W., R.G. Knowlton, J.C. Braman, D.F. Barker, D. Botstein, G. Akots, V.A. Brown, T.C. Gravius, C. Helms, K., Hsiao et al., Identification of more than500 RFLPs by screening random genomic clones. //Am. J. Hum. Genet. 1988. 42. 143-159.

192. Sell S.M., Song C., Booyse F.M., PCR-RFLP genotyping assay for the Bel I polymorphism of the beta-fibrinogen gene // Genet. Test. 2001. 5. 45^46.

193. Shadle P.J., Ginsberg M.H., Plow E.F., Barondes S.H., Platelet-collagen adhesion: inhibition by a monoclonal antibody that binds glycoprotein lib // J Cell Biol. 1984. 99. 2056-2060.

194. Shatti S.J., Signaling Through Platelet Integrin allbp3: inside-out, outside-in, and sideways // Thromb. Haemost. 1999. 82. 318-325.

195. Singer M. Highly repeated sequences in mammalian genomes // Int. Rev. Cytol. 1982. 76. 67-112.

196. Silveira J.R., Kalafatis M., Tracy P.B. Carbohydrate Moietis on the Procofactor Factor V, but Not the Derived Cafactor Factor va, Regulateits Inactivation by Activated Proteein C // Biochemistry. 2002. 41. 1672-1680.

197. Simpson, H.C.R., Meade, T.W., Stirling, Y., Mann, J.I., Chakrabarti, R.R., Woolf, L., Hypertriglyceridaemia and hypercoagulability // Lancet. 1983.2. 786-790.

198. Smith E.B., Thompson W.D., Fibrin as a factor in atherogenesis // Thromb. Res. 1994. 73. 1-19.

199. Smith F.B., Lee A.J., Fowkes F.G.R., Prince J.F., Rumley A., Lowe G.D.O., Hemostatic factors as predictors of ischemic heart disease and stroke in the Edinburgh Artery Study // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1997.17.3321-5.

200. Solymoss S., Factor V Leiden: who should be tested? // Can. Med. Assoc. J. 1996.155.285-9.

201. Spek C.A., Koster T., Rosendaal F.R., et al., Genotypic Variation in the Promoter Region of the Protein C Gene Is Associated With Plasma Protein C Levels and Thrombotic Risk/7 Arterioscler. Thromb.Vasc. Biol. 1995. 15.214-218.

202. Sugano T., Tsuji H., Masuda H., Nakagawa K., Nishimura H.,

203. Plasminogen activator inhibitor-1 promoter 4G/5G genotype is not a risk factor for myocardial infarction in a Japanese population // Blood. Coagul. Fibrinolysis. 1998. 9. 201-4.

204. Sundell I.B., Nilsson T.K., Ranby M., Fibrinolytic variables are related to age, sex, blood pressure, and body build measurements: A cross-sectional study in Norsjo, Sweden // J. Clin. Epidemiol. 1989. 42. 719— 723.

205. Suzuki K, Dahlback B., Stenflo J., Thrombin-catalyzed activation of human coagulation factor V // J. Biol. Chem. 1982. 257. 6556-6564.

206. Takahashi Y., Tanaka T., Minowa H., Ookubo Y., Sugimoto M., Hereditary partial deficiency of plasminogen activator inhibitor-1 associated with a lifelong bleeding tendency // Int. J. Hematol. 1996. 64. 61-68.

207. Tamaki S., Iwai N., Nakamura Y., Tsujita Y., Kinoshita M., Variation of the factor VII gene and ischemic heart disease in Japanese subjects // Coron. Artery. Dis. 1999. 10. 601-6.

208. Thomson G., Mapping disease genes: family-based association studies // Am. J. Hum. Genet. 1995. 57. 487-498.

209. Tsongalis G.J., Rezuke W.N., Molecular genetics and factor V Leiden mutation analysis // Biotechnol. Intl. 1997. 1. 73-77.

210. Tracy P.B., Eide L.L., Bowie E.J. W., Mann K.G., Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets // Blood. 1982. 60. 59-63.

211. Verheugt F.W.A., Ten Cate J.W., Sturk A., et al., Tissue plasminogen activator activity and inhibition in acute myocardial infarction and angiographically normal coronary arteries // American Journal of Cardiology. 1987. 59: 1075-1079.

212. Wang X.L., Wang J., McCredie R.M., Wilcken D.E.L., Polymorphisms oi factor V, factor VII, and fibrinogen genes: relevance to severity of coronary artery disease // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1997. 17. 246-51

213. Wang D.G., Fan J.-B., Siao C.J., et al. Large-scale identification, mapping and genotyping of single-nucleotide polymorphism in the human genome // Science. 1998. 280. 1077-1082

214. Weiler H., Isermann B.H., Thrombomodulin // J. Thromb. Haemost. 2003. 1. 1515-1531.

215. Weiss E.J., Bray P.F., Tayback M.T., Schulman S.P., The platelet glycoprotein IIIA polymorthism P1A2: an inherited platelet risk factor for coronary thrombotic events // N.Engl. J. Med. 1996. 334. 10901094.

216. Weissenbach J., Gyapay G., Dib C. et. al. A second-generation linkage map of the human genome.//Nature. 1992. Vol. 359. P. 794-801.

217. Weng X., Cloutier G., Genest J. J., Contribution of the -455G/A polymorphism at the beta-fibrinogen gene to erythrocyte aggregation in patients with coronary artery disease // Thromb. Haemost. 1999, 82, 1406-11.

218. Wilcox J.N., Smith K.M., Schwartz S.M., Gordon D., Localization of tissue factor in the normal vessel wall and in the atherosclerotic plaque // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989. 86. 2839^3.

219. Williamson D., Brown K., Luddington R., et al., Factor V Cambridge: a new mutation (Arg306-Thr) associated with resistance to activated protein C//Blood. 1998.91. 1140-1144.

220. Wright J.M., Bentzen P. Microsatellits: Genetic markers for the future // Rev. Fish Biol. Fish. 1994. 4. 384-388.

221. Wu J., Zhou Ch., Majumder R., Powers D., Role of procoagulant Lipids in Human Prothrombin Activation. 1. Prothrombin Activation by Factor Xa in the Absence of Factor Va and in the Absence and Presence of Membrane // Biochemistry. 2002. 41. 935-949.

222. Wu K.K., Aleksic N., Ahn C., Boerwinkle E., Folsom A.R., Thrombomodulin Ala455Val polymorphism and risk of coronary heart disease // Circulation. 2001. 103. 1386-9.

223. Xu G., Jin G., Fu G., Ma J., Shi Y., Tang O., Shan J., Polymorphisms in the coagulation factor VII gene and the risk of myocardial infarction in patients undergoing coronary angiography // Chin. Med. J. Engl. 2003. 116. 1194-7.

224. Yang X.C., Jing T.Y., Resnick L.M., Phillips G.B., Relation of hemostatic risk factors to other risk factors for coronary heart desease and to sex hormone in men // Arterioscler Thromb. 1993. 13. 467-71.

225. Yarnell J.W., Baker I.A., Sweetnam p.M., Bainton D., O'Brien J.R., Whitehead P.J., at al. Fibrinogen, viscosity and white blood cell counts are major risk factors for ischemic heart disease. The Caerphilly and

226. Speedwell Collaborative Heart Disease Studies // Circulation. 1991. 83. 836-44.

227. Yu S, Sher B, Kudryk B, Redman CM., Intracellular assembly of human fibrinogen // J Biol Chem. 1984. 259. 574-4.

228. Zeiher A.M., Fisslthaler B., Schray-Utz B., Busse R., Nitric oxide modulates the expression of monocyte chemoattractant protein 1 in cultured human endothelial cells // Circ Res. 1995. 76. 980-986.

229. Zhang K.Q., Wang B., Wang Z.L., Li Y., Analysis of Human Platelet Antigen Genotypic Frequencies in Chinese Population by PCR Amplification with Sequence Specific Primers // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2001. 9.256-259.

230. Zupanic I, Balazic J., Romel R. Analysis of nine short tandem repeat (STR) loci in the Slovenian population // Int. J. Leg. Med. 1998. 111. 248-250.

231. Zwaal R.F., Schroit A.J., Pathophysiologic implications of membrane phospholipids asymmetry in blood cells // Blood. 1997. 89. 1121-1132.