Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование аберрантной экспрессии рековерина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование аберрантной экспрессии рековерина"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правахрукописи

САВЧЕНКО Марина Сергеевна ИССЛЕДОВАНИЕ АБЕРРАНТНОЙ ЭКСПРЕССИИ РЕКОВЕРИНА

03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва-2005

Работа выполнена в отделе сигнальных систем клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор П.П. Филиппов Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Э.Н. Григорян доктор медицинских наук, старший научный сотрудник А.А. Штиль

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится 30 мая 2005 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 29 апреля 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук

MB. Медведева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рековерин - Са+-связывающий белок позвоночных животных с молекулярной массой 23,3 кДа, состоящий из 201 аминокислотного остатка [Dizhoor et al., 1991; Lambrect, Koch, 1991]. В норме рековерин локализован в фоторецепторных клетках сетчатки глаза, где Са2+ -зависимым образом регулирует фосфорилирование родопсина, ин-гибируя активность родопсинкиназы. В пределах сетчатки рековерин экспрессируется преимущественно в наружных сегментах палочек и колбочек, а также в нейронах более высокого порядка - в биполярных и ганглиозных клетках. Кроме того, рековерин обнаружен в эпифизе. В молекуле рековерина присутствуют 4 потенциальных Са2+ -связывающих участка типа EF-hand; его N-конец ацилирован остатками жирных кислот [Dizhoor et al., 1992; Flaherty etal.,1993].

Рековерин также относят к паранеопластическим, или онконевральным, антигенам, которые представляют собой белки, в норме экспрессирующиеся исключительно в пределах нервной системы. Однако при злокачественной трансформации клеток экспрессия этих белков выявляется также и в опухолях, локализованных вне нервной системы. Иммунная система организма реагирует на аберрантную экспрессию нейрональных белков в опухоли выработкой аутоантител, которые в некоторых случаях могут приводить к специфическим неврологическим нарушениям, развивающимся на значительном удалении от места локализации опухоли и ее метастазов, и быть причиной развития соответствующего неврологического синдрома.

К началу данной работы было известно, что при паранеопластической дегенерации сетчатки, ассоциированной с мелкоклеточной карциномой легких (МККЛ), в крови пациентов присутствует высокий титр аутоантител против рековерина, а в опухоли экспрессируется рековерин.

В то же время оставалось неизвестным,

• экспрессируется ли рековерин в опухолях при немелкоклеточной карциноме легких (НМККЛ), которая составляет более 80% от всех регистрируемых случаев рака легких?

• какова частота экспрессии рековерина в опухолях легких?

• каковы молекулярные механизмы, лежащие в основе аберрантной экспрессии реко-верина в злокачественных опухолях?

• какова частота встречаемости аутоантител против рековерина при раке легких, а также при других злокачественных заболеваниях?

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучение аберрантной экспрессии ре-коверина при злокачественной трансформации. В соответствии с этой целью в работе решались следующие задачи.

• Изучение аберрантной экспрессии рековерина в опухолях легких и определение частоты этой экспрессии.

• Исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе аберрантной экспрессии рековерина в злокачественных опухолях.

• Определение частоты встречаемости аутоантител против рековерина в сыворотке крови пациентов с различными злокачественными заболеваниями.

Научная новизна и практическая значимость работы. В процессе выполнения настоящей работы впервые определена частота экспрессии рековерина в опухолях легких, которая составляет 76%. Получены данные, свидетельствующие о том, что мРНК рековерина может быть выявлена в тканях, не относящихся к тканям нервной системы. Установлено, что дсмстили-рование участков промотора и первого экзона гена рековерина вовлечено в регуляцию экспрессии рековерина в клеточной линии рака легких in vitro. Продемонстрировано, что ацети-лирование гистонов не участвует в проявлении аберрантной экспрессии рековерина in vitro. Показано, что аутоантитела против рековерина могут присутствовать в сыворотке крови больных различными злокачественными заболеваниями, причем наибольшая частота их встречаемости составляет 17% при раке легких.

Полученные результаты по обнаружению аутоантител против рековерина в сыворотке крови пациентов с различными злокачественными заболеваниями при полном отсутствии аутоантител против рековерина в сыворотке крови здоровых индивидов, а также тот факт, что рековерин экспрессируется в большей части проанализированных опухолей рака легких, создают основу для последующего клинического применения рековерина в качестве маркера злокачественной трансформации тканей.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ, на семинарах НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ (НИИФХБ МГУ) и отдела сигнальных систем клетки НИИФХБ МГУ, а также на ряде научных конференций: XIII и XIV зимних международных молодежных научных школах "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2001 и 2002), Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Москва, 2001 и 2002; Санкт-Петербург, 2003), Европейских респираторных конгрессах (Берлин, 2001; Стокгольм, 2002; Вена, 2003) и других.

Публикации. Результаты работы представлены в 5 статьях, опубликованных в научных журналах, и в 11 тезисах докладов.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 20 рисунками и 6 таблицами. Библиографический указатель включает 133 цитированных работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

К моменту начала данной работы в литературе сложилось устойчивое мнение, что экспрессия рековерина в опухоли возможна только при одновременном присутствии у пациента аутоантител против рековерина с высоким титром и паранеопластической дегенерации сетчатки. Однако в нашей лаборатории были получены данные, свидетельствующие о возможности существования антител к рековерину в сыворотке крови пациентов с диагнозом рак легких и в отсутствие синдрома паранеопластической дегенерации сетчатки, что поставило под сомнение описанную выше схему. Кроме того, подробное изучение литературы по рассматриваемому вопросу показало, что экспериментальные данные, подтверждающие эту гипотезу, были получены не всегда корректно и в объеме, удовлетворяющем условиям статистического анализа. Это дало нам основание полагать, что существующая теория не учитывает все возможное разнообразие процессов, потенциально способных происходить при раке легких, и, возможно, применима только для такого частного случая, как развитие синдрома ретинопатии, ассоциированной с раком легких, вследствие аутоиммунного ответа организма на экспрессию рековерина в опухоли.

Наряду с тем, что полученные нами предварительные данные не укладывались в общепринятую теорию, следует также отметить, что имевшаяся информация об экспрессии ре-коверина в норме и при злокачественной трансформации была крайне ограниченной. Например, оставалось неизвестным, возможна ли экспрессия рековерина в нормальных тканях, отличных от сетчатки, или же она появляется только в опухолях. Также ничего не было известно о возможных молекулярных механизмах, лежащих в основе аберрантной экспрессии рековерина в злокачественных опухолях. Поэтому в задачи настоящего исследования входило, прежде всего, определение экспрессии рековерина в опухолях, а также выяснение механизма появления - или увеличения - этой экспрессии при злокачественной трансформации.

1. Рековсрин в раковых опухолях и нормальных тканях. 1.1. Иммуногистохимический анализ срезов опухолей легких.

Нами было проведено цитоиммуногистохимическое изучение экспрессии рековерина в парафинированных срезах опухолей рака легких. При этом в исследование были включены опухоли как МККЛ, так и НМККЛ. На рис. 1 представлены типичные примеры проведенного нами цитоиммуногистохимического исследования экспрессии рековерина в срезах опухолей легких с использованием поликлональных (моноспецифических) антител к нему. Видно, что экспрессия рековерина присутствует как в опухоли МККЛ (рис. 1А), так и НМККЛ (рис. 1Б). О наличии рековерин-положительной реакции в клетках опухоли на рис. 1А и рис. 1Б свидетельствует коричневое окрашивание цитоплазмы (реже - клеточных ядер). Опухолевые клетки, дающие рековерин-положительную реакцию, располагаются гетерогенно, группами, они выявляются по границам опухоли с прилежащей тканью, а также в зонах опухоли вокруг фокусов детрита и вокруг стенок кровеносных сосудов опухоли. Отметим, что окрашивание отсутствует в зоне стромы.

Следует подчеркнуть, что как по данным иммуногистохимического анализа, имеющимся в литературе [Dizhooг et э1., 1992], так и по результатам нашего цитоиммуногистохи-мического исследования срезов здоровых легких (данные не показаны), в нормальной ткани легких экспрессия рековерина отсутствует. Кроме того, было проведено контрольное окрашивание срезов, полученных от пациентов с МККЛ и НМККЛ, которое выполнялось в отсутствие антител против рековерина (рис. 1В) и с использованием антител, предобработан-ных «экзогенным» рековерином (рис. 1Г). Отсутствие коричневого окрашивания в этих контролях свидетельствует о специфичности наблюдаемой нами реакции.

Таким образом, результаты цитоиммуногистохимического исследования свидетельствуют о том, что экспрессия рековерина присутствует как в опухолях МККЛ, так и НМККЛ. Отметим, что экспрессия рековерина в опухолях НМККЛ продемонстрирована нами впервые.

Следует особо подчеркнуть тот факт, что наличие рековерина в опухоли было выявлено нами как при МККЛ, так и при НМККЛ. Известно, что МККЛ относится к опухолям, имеющим нейроэндокринное происхождение, в то время как НМККЛ является собирательным названием для опухолей, происходящих из эпителиальных и железистых клеток легких. Одним из основных свойств опухолей нейроэндокринного происхождения является экспрессия большого спектра антигенов нейроналыюй дифференцировки. Поскольку экспрессия ре-коверина обнаружена нами как в опухолях МККЛ, так и НМККЛ, очевидно, что она с происхождением опухоли не связана.

Рис. 1. Иммуногистохимический анализ экспрессии рековерина в опухолях у пациентов

с МККЛ/НМККЛ. А. Срез опухоли МККЛ, инкубированный с поликлональными (моноспецифическими) антителами против рековерина (5 мкг/мл). Б. Срез опухоли НМККЛ, инкубированный с поликлональными (моноспецифическими) антителами против рековерина (5мкг/мл). В. Срез опухоли МККЛ, инкубированный без первичных антител. Г. Срез опухоли МККЛ, инкубированный с первичными антителами против рековерина, истощенными по рековерину. Во всех случаях срезы окрашивали с помощью вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена. Увеличение х200.

Далее мы провели определение частоты экспрессии рековерина в опухолях легких. В исследование было взято 84 среза, полученных от пациентов с диагнозом рак легких. В их число входило 44 среза от пациентов с МККЛ и 40 срезов, полученных от пациентов с НМККЛ. При МККЛ экспрессия рековерина была отмечена в 30 из 44 срезов, что составляет 68% частоты экспрессии рековерина. При НМККЛ - в 34 из 40 срезах, что составляет 85% частоты экспрессии. Средняя частота экспрессии рековерина в опухолях легких составила 76%.

1.2. Анализ экспрессии мРНК рековерина в раковых опухолях.

На следующем этапе нашей работы мы провели определение мРНК рековерина в опухолях методом ПЦР с обратной транскриптазой. Для анализа экспрессии мРНК рековерина в раковых опухолях использовали образцы опухолей легких, молочной железы и кожи (мела-нома). После выделения кДНК из соответствующих образцов и ее амплификации для подтверждения того, что полученная нами кДНК действительно принадлежит рековерину, проводилось секвенирование продуктов ПЦР. Данные, полученные в ходе определения экспрессии рековерина в опухолях легких, молочной железы и при меланоме, представлены в таблице 1.

Таблица 1. Экспрессия мРНК рековерина в раковых опухолях.

Тип рака Количество Образцов Рековерин-негативные Рековерин-позитивные

Количество % Количество %

Рак легких* 27 9 33 18 67

Рак молочной железы 14 6 43 $ 57

Меланома 45 16 36 29 64

*Графа «Рак легких» представляет сводные данные по МККЛ и НМККЛ.

Как видно из таблицы 1, мРНК рековерина синтезируется в опухолях рака легких с частотой 67%. Эта величина близка к частоте экспрессии рековерина в опухолях легких, полученной нами методом цитоиммуногистохимии (76%). Сходные величины получены и при определении частоты экспрессии мРНК рековерина в опухолях других тканей: при меланоме эта частота составляет 64%, при раке молочной железы - 57%.

Таким образом, можно заключить, что в злокачественных опухолях легких (как в МККЛ, так и в НМККЛ) экспрессируется рековерин. Этот вывод сделан на основании цито-иммуногистохимических исследований с использованием поликлональных (моноспецифиче-

ских) антител против рековерина и анализа присутствия мРНК рековерина в опухолях. Анализ опухолей на наличие в них мРНК рековерина свидетельствует о том, что мРНК рековерина экспрессируется в опухолях не только при раке легких, но также и при раке молочной железы и меланоме. При этом как сам факт экспрессии, так и ее величина варьируют от образца к образцу и, по-видимому, не имеют четкой корреляции с видом ткани (частота экспрессии во всех опухолях примерно одинакова и составляет 60-70%).

1.3. Анализ экспрессии мРНК рековерина в тканях в норме.

В настоящее время принято считать, что в норме рековерин синтезируется только в сетчатке глаза. Наличие рековерина в тимусе и в эпифизе является своего рода исключением, подтверждающим общее правило, т.к. в эпифизе присутствуют клетки, аналогичные фоторе-цепторным клеткам сетчатки. По литературным данным, рековерин не встречается в других видах нормальных тканей [Maeda et al., 2000]. Однако следует заметить, что выводы об отсутствии экспрессии гена рековерина в нормальных тканях были сделаны в этой работе на основании анализа всего лишь одного образца каждого вида ткани.

В предыдущем разделе мы показали, что частота экспрессии рековерина в трансформированных тканях составляет около 70%. Можно предложить две равновероятных гипотезы, объясняющие возрастание количества рековерина в опухолях по сравнению с нормальными тканями. Согласно первой гипотезе, рековерин вообще не экспрессируется в норме, и его экспрессия появляется только после злокачественной трансформации клеток. По второй гипотезе, рековерин может экспрессироваться также и в норме, однако уровень его экспрессии при этом крайне низок; когда же происходит злокачественная трансформация клеток, количество рековерина резко возрастает.

Одним из доводов в пользу второго предположения является существование в организме диффузной эндокринной системы, представленной совокупностью одиночных гор-монпродуцирующих клеток или их групп, расположенных во всех органах; эту систему еще называют APUD-система (от Amine Precursor Uptake and Decarboxylation). Апудоциты, или нейроэндокриннные клетки, характеризуются активным синтезом биогенных аминов и полипептидных гормонов таких, как серотонин, допамин, бомбезин, гастрин-релизинг пептид, кальцитонин и энкефалин. Как считают некоторые исследователи, апудоциты имеют общее происхождение с клетками нервной системы, в которых, как говорилось выше, может синтезироваться рековерин. В этой связи мы решили исследовать, действительно ли в некоторых нормальных тканях, отличных от сетчатки, присутствует экспрессия рековерина.

Мы провели определение мРНК рековерина в образцах нормальных тканей легких, молочной железы и кожи (т.е. в тех органах, в опухолях которых мРНК рековерина определялась нами ранее - см. таблицу 1). Результаты анализа представлены в таблице 2. Из таблицы видно, что мРНК рековерина присутствует приблизительно в половине проанализированных образцов.

Таблица 2. Экспрессия мРНК рековерина в нормальных тканях.

Тип ткани Количество образцов Рековерин-негативные Рековерин-позитивные

Количество Количество %

Легкие 8 4 50 4 50

Молочная железа 5 . . .3 60 2 40

Кожа 2 1 50 1 50

Таким образом, мы впервые продемонстрировали, что в нормальпых тканях, отличных от сетчатки, присутствует мРНК рековерина.

На следующем этапе работы методом количественного ПЦР нами было проведена оценка количества мРНК рековерина в отдельных образцах здоровой ткани легких, молочной железы и кожи, а также в соответствующих опухолях. Результаты определения представлены на рис. 2.

Рис. 2. Количественное определение мРНК рековсрина в нормальных тканях и раковых опухолях.

На рис. 2 видно, что среди проанализированных нами образцов нормальной ткани самый высокий уровень мРНК рековерина наблюдался в легких; количество мРНК рековерина в коже и в молочной железе было несколько ниже. Заметим, что хотя определенное нами в нормальных тканях количество мРНК рековерина и имело тот же порядок, что и в опухолях, уровень мРНК рековерина в тканях в норме был заметно ниже уровня мРНК рековерина в соответствующих опухолях.

Таким образом, рековерин способен синтезироваться в тканях, подвергшихся злокачественной трансформации. Кроме того, наши данные свидетельствуют о возможности экспрессии мРНК рековерина и в нормальных тканях, отличных от сетчатки. Следует подчеркнуть, что факт присутствия мРНК рековерина в нормальных тканях показан нами впервые Выше мы рассмотрели две гипотезы, которые могут объяснить появление экспрессии реко-верина в опухолях, локализованных вне нервной системы. Согласно первой гипотезе, реко-верин вообще не синтезируется в норме, а его наличие в раковых опухолях является следствием процессов злокачественной трансформации, происходящих в клетках. Вторая гипотеза предполагает, что рековерин присутствует в норме и вне тканей нервной системы (возможно, в клетках APUD-системы). Наши данные свидетельствуют в пользу второй гипотезы, предполагающей, что экспрессия рековерина при раке является следствием увеличения экспрессии белка, уже существующей в норме.

2. Исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе аберрантной экспрессии рековерина в злокачественных опухолях.

Известно, что синтез белков в тканях в процессе развития или при злокачественной трансформации может быть связан с такими процессами, как деметилирование CpG-участков промотора гена соответствующего белка или ацетилирование гистонов. При этом процесс экспрессии гена может регулироваться как исключительно одним, так и несколькими механизмами одновременно.

Ген рековерина человека локализован на коротком плече хромосомы 17р13.1 [Wiechman et э1., 1994; McGinnis et э1, 1995]. Промотор гена рековерина относится к классу промоторов, бедных CpG-парами. Известно, что тканеспецифичные гены с промоторами такого типа часто демонстрируют высокий уровень метилирования в тканях, где они не экспрессируются, по сравнению с тканями, в которых осуществляется их экспрессия.

Для того, чтобы выяснить, что именно лежит в основе регуляции экспрессии мРНК рековерина при злокачественной трансформации, мы провели исследование влияния различных агентов на уровень экспрессии рековерина в модельной системе, которой стала клеточная линия рака легких N0^82, экспрессирующая мРНК рековерина. В ходе исследования использовали следующие вещества: 5'-аза-2'-деоксицитидин, который, будучи ингибитором метилтрансферазы, является деметилирующим агентом; трихостатин А - ингибитор гистон-деацетилазы, а также бутират натрия, который является неспецифическим ингибитором гис-тондеацетилазы и веществом, вызывающим преодоление «молчания генов», обусловленного метилированием.

В ходе исследования клеточную линию N0^82 культивировали в присутствии 5'-аза-2'-деоксицитидина, трихостатина А или бутирата натрия, либо без них. Также был изучен эффект совместного действия на N0^82 их следующих комбинаций: 5'-аза-2'-деоксицитидин совместно с трихостатином А и 5'-аза-2'-деоксицитидин совместно с бутиратом натрия. После инкубации в исследуемых клетках определяли изменение уровня экспрессии мРНК рековерина. Результаты определения представлены на рис. 3. Из рисунка видно, что 5'-аза-2'-деоксицитидин и бутират натрия стимулируют увеличение экспрессии мРНК рековерина в исследуемой клеточной линии, в то время как инкубация в присутствии трихостатина А на уровень экспрессии не влияет.

Op) 1018

39« 344 255

ptltttpHH

(-ШК

1 2 3 4 3

Рис. 3. Электрофореграмма продуктов ПЦР, полученных из клеточной линии NCI-H82.

1 - ДНК маркеры, 2 - до обработки, 3-5 после инкубации в присутствии трихостатина А (3), бутирата натрия (4) и 5'-аза-2'-деоксицитидина (5).

Для количественной оценки эффектов 5'-аза-2'-деоксицитидина, трихостатина А, бутирата натрия, а также комбинаций 5'-аза-2'-деоксицитидин + трихостатин А и 5'-аза-2'-деоксицитидин + бутират натрия, на уровень синтеза мРНК рековерина в клеточной линии NCI-H82 мы использовали метод количественного ПЦР. Результаты представлены на рис. 4. Как видно из рисунка, культивирование в присутствии 5'-аза-2'-деоксицитидина индуцирует пятикратное увеличение количества мРНК рековерина в исследуемых клетках (р=0,006). Инкубация в присутствии бутирата натрия приводит лишь к небольшому (двукратному) эффекту стимулирования экспрессии гена рековерина (р=0,05). Трихостатин А не вызывает дополнительного увеличения уровня синтеза мРНК рековерина как в случае, когда применяется отдельно, так и в сочетании с 5'-аза-2'-деоксицитидином. Одновременное воздействие на клетки 5'-аза-2'-деоксицитидина и бутирата натрия дает синергический эффект, который выражается в шестикратной стимуляции синтеза мРНК рековерина (р=0,015).

Таким образом, аберрантная экспрессия гена рековерина в клеточной линии NCI-H82 стимулируется деметилирующим агентом 5'-аза-2'-деоксицитидином и - в меньшей степени - бутиратом натрия. Напротив, специфический ингибитор гистондеацетилазы, трихостатин А, не влияет на синтез мРНК рековерина in vitro.

Итак, 5'-аза-2'-деоксицитидин, который является деметилирующим агентом, увеличивает количество мРНК рековерина в клетках рака легких. Этот факт указывает на возможную взаимосвязь изменения количества мРНК рековерина и уровня метилирования участков промотора и первого экзона гена рековерина в исследуемых клетках. Эффект незначительной стимуляции экспрессии мРНК рековерина бутиратом натрия остается пока без объясне-

ний в связи с тем, что механизм действия этого вещества до сих пор не изучен. В то же время, отсутствие влияния трихостатина А на увеличение количества мРНК рековерина in vitro говорит о том, что процесс ацетилирования гистонов, скорее всего, не вовлечен в аберрантную экспрессию рековерина в раковых клетках.

Рис. 4. Изменение уровня синтеза мРНК рековерина в клеточной линии N0^82 под

воздействием различных агентов. Над столбцами указано количество копий мРНК рековерина; внизу показаны условия инкубации. ДАЦ - 5'-аза-2'-деоксицитидин; ТСА -трихостатин А; БН - бутират натрия.

Далее мы провели исследование влияния 5'-аза-2'-деоксицитидина на уровень метилирования участков промотора и первого экзона гена рековерина в клеточной линии N0^82, а именно на уровень метилирования 13 CpG-участков, присутствующих в этой области. С помощью метода бисульфитного сиквенса нами были получены профили метилирования области промотора и первого экзона гена рековерина в клетках N0^82 до и после культивирования в присутствии 5'-аза-2'-деоксицитидина (рис. 5). Как можно видеть из рисунка, область промотора и первого экзона гена рековерина в клетках N0^82 после культивирования клеток в присутствии 5'-аза-2'-деоксицитидина метилирована гораздо меньше, чем в его отсутствие. Определение уровня метилирования для каждого CpG-участка показало, что 5'-аза-2'-деоксицитидин вызывает снижение уровня метилирования для всех CpG-участков, кроме 310 и 314, для которых разница в уровне метилирования до и после инкубации в присутствии 5'-аза-2'-деоксицитидина статистически недостоверна (рис. 6).

Рис. 5. Профиль метилирования промотора гена рековерина в клеточной линии N0-

Н82 до и после обработки 5'-аза-2'-деоксицитидином. Количество кружков по вертикали соответствует количеству исследованных образцов. Черные кружки обозначают метилированный цитозин, белые - неметилированный цитозин.

Рис. 6. Уровень метилирования области промотора и первого экзона гена рековерина в клеточной линии N0^82 до и после инкубации в присутствии 5'-аза-2'-деоксицитидина.

Таким образом, можно полагать, что деметилирование промотора и первого экзона гена рековерина может быть вовлечено в аберрантную экспрессию рековерина.

Далее мы проанализировали уровень экспрессии рековерина в клеточной линии N0-Н82 до и после воздействия различных агентов (рис. 7). Как видно из рисунка, экспрессия рековерина выявляется только после культивирования клеточной линии N0^82 в присутствии бутирата натрия (рис. 17, дорожка 6). Культивирование же клеток с 5'-аза-2'-деоксицитидином, которое вызывало даже большее, чем после инкубации с бутиратом натрия, увеличение уровня мРНК рековерина (рис. 3), к экспрессии самого рековерина не приводит (рис. 7, дорожка 4).

К

30 -Ь

г

20 -1 шт . ' * l&h "

1 2 3 4 5 6

Рис. 7. Иммуноблот белковых экстрактов клеточной линии NCI-H82 после действия различных агентов, окрашенный поликлональными (моноспецифнческими)

антителами к рековерину. 1 - маркеры; 2 - экстракт сетчатки; 3-6 - NCI-H82 до (3) и после культивирования с 5'-аза-2'-деоксицитидином (4), трихостатином А (5) и бутиратом натрия (6).

Из полученных нами данных следует, что экспрессия мРНК рековерина в клетках рака легких in vitro не является достаточным условием для экспрессии соответствующего белка в этих же условиях. Механизм, с помощью которого бутират натрия стимулирует экспрессию рековерина, остается, однако, неизвестным. Хотя на основании наших данных но измерению уровня мРНК рековерина в клеточной линии NCI-H82 методом количественного ПЦР (напомним, что количество мРНК рековерина после инкубации клеток в присутствии бутирата натрия увеличивалось всего лишь в два раза - см. рис. 4), можно предположить, что стимулирующее действие бутирата натрия на экспрессию рековерина реализуется, скорее всего, не на уровне транскрипции, а на уровне трансляции.

3. Аутоантитела против рековерина в качестве потенциального маркера злокачественной трансформации.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что аутоантитела против рековерина присутствуют в сыворотке крови больных раком легких и в отсутствие паранеопластической дегенерации сетчатки. Однако недостаточное количество имеющихся данных не давало возможности для корректной оценки частоты встречаемости аутоантител против рековерина как при раке легких, так и при других онкологических заболеваниях. Мы провели определение частот встречаемости аутоантител против рековерина в образцах сыворотки крови пациентов с диагнозом рак легких, а также с другими различными онкологическими заболеваниями. Для анализа применяли метод иммуноблоттинга, в качестве антигена использовали рекове-рин. Инкубацию блотов рековерина в присутствии сыворотки крови проводили при начальном разведении 1:20. Иммунохимический сигнал регистрировали с помощью диаминобензи-дина, в некоторых случаях - с помощью хемолюминесцентного метода (ECL-system). Применение различных методов визуализации таких, как диаминобензидиновый или метод ECL, не влияло на количество рековерин-положительных образцов сыворотки. В дальнейшем при серийном анализе образцов сыворотки крови пациентов с различными доброкачественными и злокачественными заболеваниями мы использовали диаминобензидиновый метод как более удобный. Пример определения аутоантител против рековерина в образцах сыворотки крови представлен на рис. 8. Из рисунка видно, что при начальном разведении 1:20 сыворотка крови пациентов с аутоантителами против рековерина окрашивает рековерин на им-муноблоте.

kDa

1 2 3 4 3 б 7

Рис. 8. Определение аутоантител против рековерина в сыворотках крови методом иммуноблоттинга. 1 - блот белковых маркеров (окраска Ponceau S); 2-3 - контрольные пробы: блот рековерина, окрашенного (2) кроличьими поликлональными (моноспецифическими) антителами против рековерина (1 мкг/мл) или (3) сывороткой крови здорового индивида; 4-7 - блот рековерина, окрашенного сывороткой крови, содержащей аутоантитела против рековерина и полученной от пациентов с МККЛ (4), НМККЛ (5), раком молочной железы (6) и сывороткой крови пациента с раком печени (7), не содержащей аутоантитела против рековерина. Разведение всех образцов сыворотки крови составляло 1:20.

С помощью описанного подхода мы проанализировали 229 образцов сыворотки крови пациентов с МККЛ, НМККЛ и пациентов с неопухолевыми легочными заболеваниями на присутствие в них аутоантител против рековерина. Оказалось, что аутоантитела против рековерина обнаруживаются в крови 15 пациентов с МККЛ из 99 (соответствует частоте встречаемости антител 15%). Анализ образцов сыворотки крови пациентов с НМККЛ на присутствие в них аутоантител против рековерина выявил их у 9 пациентов из 44, что составляет около 20% случаев. Отметим, что аутоантитела против рековерина присутствовали в крови представителей всех гистологических типов НММКЛ -плоскоклеточного рака, крупноклеточного рака и аденокарциномы. Ни один из 150 контрольных образцов сыворотки крови, полученных от здоровых индивидов, положительной реакции на аутоантитела против рековерина не дал. У пациентов с неопухолевыми заболеваниями легких аутоантитела против рековерина были обнаружены только в двух случаях из 86 (2%). Заметим, однако, что этими пациентами были ликвидаторы последствий аварии на Чернобыльской АЭС и их пульмонологические заболевания могут быть потенциально предраковыми.

Далее нами было проведено определение титра аутоантител против рековерина в 536 образцах сыворотки крови пациентов с другими онкологическими заболеваниями различной этиологии и локализации. В исследование были взяты пациенты со злокачественными опухолями молочной железы, кожи, пищеварительного тракта, выделительной системы, а также женской и мужской половой системы. Оказалось, что наиболее часто аутоантитела против рековерина встречаются у больных раком легких - 24 положительных случая из 143 проанализированных, частота встречаемости аутоантител против рековерина при этом равна 17%. На втором месте по частоте встречаемости аутоантител против рековерина в сыворотке крови пациентов находится рак яичника - 4 позитивных случая из 40, что составляет 10% встречаемости. Соответствующие цифры при других видах рака были следующие: рак шейки матки - 3 из 40 (8% встречаемости); меланома кожи - 2 из 36 (6%); рак молочной железы - 5 из 94, рак тела матки - 2 из 43, рак желудка - 2 из 42, рак мочевого пузыря - 1 из 21 (все это соответствует 5% встречаемости аутоантител против рековерина). При раке пищевода аутоантитела против рековерина были обнаружены у 1 пациента из 10, при раке мужской половой системы - у 1 из 13. Также аутоантитела против рековерина были обнаружены в двух случаях у пациенток с миомой матки. Следует заметить, что аутоантитела против рековерина не были обнаружены ни в одном из образцов сыворотки крови, взятой от пациентов с заболеваниями щитовидной железы (рак, аденома, киста, узловой зоб, тиреодит), толстого кишечника (рак и аденома), раком почки и раком печени.

Таким образом, методом серийного анализа образцов сыворотки крови пациентов с

чаемости аутоантител против рековерина наблюдается при раке легких (17%), а в остальных случаях не превышает 10%. При этом ни у одного из больных раком легких не было зафиксировано паранеопластической дегенерации сетчатки. Аутоантитела против рековерина впервые обнаружены при раке шейки матки, желудка, пищевода, семенников и мочевого пузыря. Отметим, что в сыворотке крови здоровых индивидов аутоантитела против рековерина не выявляются.

В литературе описаны случаи, когда антитела против паранеопластических антигенов, в том числе и рековерина, встречались раньше, чем у этих пациентов обнаруживали опухоль. Хорошо известно, что чем раньше выявлен рак, тем выше шансы на то, что терапия сможет подавить развитие опухоли, или даже на то, что болезнь буцет излечена. Факт, что аутоанти-тела против рековерина могут быть детектированы задолго до того, как рак будет обнаружен с помощью традиционных диагностических методов, позволяет рассматривать эти аутоантитела как перспективный маркер злокачественной трансформации клеток. Что же касается экспрессии рековерина в опухолях легких (см. раздел 1.1), высокая частота этой экспрессии позволяет рассматривать рековерин как потенциальную мишень для иммунотерапии рака легких.

выводы

1. Показано, что рековерин экспрессируется в опухолях немелкоклеточной карциномы легких.

2. мРНК рековерина выявлена в нормальных тканях, не относящихся к тканям нервной системы.

3. Получены данные, указывающие на вовлечение деметилирования участков промотора и первого экзона гена рековерина в регуляцию экспрессии рековерина в клеточной линии рака легких in vitro.

4. Установлено, что ацетилирование гистонов не участвует в проявлении аберрантной экспрессии рековерина in vitro.

5. Определены частоты экспрессии рековерина в опухолях легких и встречаемости аутоантител против рековерина в сыворотке крови пациентов при раке легких, которые составляют, соответственно, 76% и 17%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бажин А.В., Савченко М.С., Шифрина О.Н., Филиппов П.П. Серийный анализ образцов сыворотки крови больных мелкоклеточной карциномой легких на присутствие в них антител против рековерина. Тезисы докладов на XIII зимней международной научной школе

"Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 2001, стр. 97.

2. Bazhin A.V., Shifiina O.N., Savchenko M.S.. Tikhomirova N.K., Goncharskaia MA, Gor-bunova V.A., Senin I.I., Chuchalin A.G., Philippov P.P. Low titre autoantibodies against recov-erin in sera of patients with small cell lung cancer but without a loss of vision. Lung Cancer 2001; 34(1), 99-104.

3. Shifrina O.N., Bazhin A.V., Savchenko M.S.. Chuchalin A.G., Philippov P.P. Detection of antibodies against recoverin in the serum of patients with small cell lung cancer in the absence of cancer-associated retinopathy. Proc. of11-th European respiratory congress, Berlin, 2001, p. 395s.

4. Бажин А.В., Шифрина О.Н., Савченко М.С., Чучалин А.Г., Филиппов П.П. Серийный анализ образцов сыворотки крови больных мелкоклеточной карциномой легких на присутствие в них антител против рековерина в отсутствие синдрома ретинопатии. Тезисы докладов на II Национальном конгрессе по болезням органов дыхания, Москва, 2001, стр. 11.

5. Савченко М.С., Гончарская МА, Бажин А.В., Филиппов П.П. Серийный анализ образцов сыворотки крови пациентов с различными онкологическими заболеваниями на присутствие в них аутоантител против рековерина. Тезисы докладов на XIVзимней международной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 2002, стр. 114.

6. Shifrina O.N., Bazhin A.V., Savchenko M.S.. Chuchalin A.G., Philippov P.P. Antirecoverin autoantibodies in sera of patients with non-small cell lung cancer in the absence of cancer-associated retinopathy. Proc. of12-th European respiratory congress, Stockholm, 2002, p. 156.

7. Шифрина О.Н., Демура СА, Бажин А.В., Савченко М.С., Коган ЕА, Филиппов П.П. Экспрессия рековерина в ткани рака легких. Тезисы докладов на 12 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания, Москва, 2002, стр. 180.

8. Bazhin A.V., Savchenko M.S.. Shifiina O.N., Goncharskaia M.A., Jaques G., Chuchalin AG., Philippov P.P. Frequencies of the presence of anti-recoverin autoantibodies in sera of patients with different kinds of cancer. Proc. Of 7-Th European Symposium On Calcium Binding Proteins InNormalAnd TransformedCells, Brussels, 2002, p. 233.

9. Savchenko M.S.. Bazhin A.V., Shifiina O.N., Demoura SA, Kogan EA, Chuchalin AG., Philippov P.P. Antirecoverin autoantibodies in the patient with non-small cell lung cancer but without cancer-associated retinopathy. Lung Cancer 2003; 41 (3); 363-367.

10. Бажин А В., Шифрина О.Н., Савченко М.С., Тихомирова Н.К., Чучалин А.Г. Исследование применимости методов ELISA и иммуноблота для выявления аутоантител против рековерина в сыворотке крови больных мелкоклеточной карциномой легких. Пульмонология 2003; 3; 62-65.

11. Bazhin A.V., Savchenko M.S.. Kobljakova I.V., Philippov P.P., Belousov E.V., Jaques G. Stimulation of the aberrant expression of the paraneoplastic antigen recoverin in small-cell lung cancer cell lines. Abstracts Of The 10th World Conference On Lung Cancer, Vancouver, 2003, p. S125.

12. Savchenko M.S.. Bazhin A.V., Shifrina O.N., Chikina S.Y., Demoura SA, Kogan E.A., Chuchalin AG., Philippov P.P. Recoverin as a paraneoplastic antigen in lung cancer. Abstracts Of European Respiratory Society Annual Congress, Vienna, 2003, p. 199s.

13. Shifrina O.N., Bazhin A.V., Savchenko M.S., Philippov P.P., Chuchalin AG. Clinical and prognostic significance of autoantibodies against recoverin in non small cell lung cancer. Ab. stracts of European Respiratory Society Annual Congress, Vienna, 2003, p. 394s.

14. Бажин А.В., Савченко M.C., Жак Г., Филиппов П.П. Индукция экспрессии паране-опластического антигена рековерина в клеточных линиях мелкоклеточного рака легких. Тезисы докладов на 13 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания, С-Петербург, 2003, стр. 136.

15. Bazhin A.V., Savchenko M.S.. Shifrina O.N., Demoura SA, Chikina S.Y., Jaques G., Kogan EA, Chuchalin AG., Philippov P.P. Recoverin as a paraneoplastic antigen in lung cancer: the occurrence of anti-recoverin auto-antibodies in sera and recoverin in tumors. Lung Cancer 2004; 44(2); 193-198.

16. Bazhin A.V., Savchenko M.S., Belousov E.V., Jaques G., Philippov P.P. Stimulation of the aberrant expression of a paraneoplastic antigen, recoverin, in small cell lung cancer cell lines. Lung Cancer 2004; 45(3); 299-305.

Отпечатано в копицентре Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел. 939-3338 тираж 100 экз. Подписано в печать 26.04.2005 г.

71S

а ¿005

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Савченко, Марина Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Рековерин и другие паранеопластические антигены".

1. Рековерин.

1.1. Рековерин как белок зрительной трансдукции.

1.1.1. Тканевая и клеточная локализация.

1.1.2. Основные характеристики.

1.2. Рековерин как паранеопластический антиген.

1.2.1. Аберрантная экспрессия рековерина в опухолях и клеточных линиях.

1.2.2. Современные представления о причинах развития паранеопластической дегенерации сетчатки у онкологических больных.

1.2.3. Модельные системы САЯ-синдрома.

1.2.4. Механизмы паранеопластической дегенерации сетчатки.

1.2.5. Влияние аберрантной экспрессии рековерина на процессы, происходящие в раковых клетках.

2. РНК-связывающие белки и соответствующие им неврологические синдромы.

2.1. Ни-антиген ы.

2.2. Ш-антигены.

3. ДНК-связывающий белок Уо-антиген и паранеопластическая дегенерация мозжечка.

4. Потенциалзависимые кальциевые каналы и миастенический синдром Ламберта-Итона.

5. Потенциалзависимые калиевые каналы и нейромиотония.

6. Ацетилхолиновый (никотиновый) рецептор и миастения.

7. Амфифизин и синдром "скованного человека".

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Реактивы.

2. Материалы.

3. Аналитические процедуры.

3.1. Определение концентрации белков.

3.2. SDS-электрофорез в полиакриламидном геле.

3.3. Нативный электрофорез в полиакриламидном геле.

3.4. Иммуноблоттинг.

3.5. ELISA.

3.6. Цитоиммуногистохимический анализ серийных парафиновых срезов опухолевых тканей.

4. Получение рекомбинантного миристоилированного рековерина.

5. Получение иммобилизованных белков.

6. Выделение поликлональных моноспецифических антител против рековерина.

7. Культивирование клеточных линий.

8. ПЦР с обратной транскриптазой.

9. Количественный ПЦР с обратной транскриптазой.

10. Анализ уровня метилирования ДНК при помощи бисульфитного сиквенса.

11. Выделение р26 из тканей крысы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Рековерин в раковых опухолях и нормальных тканях.

1.1. Экспрессия рековерина в злокачественных опухолях.

1.1.1. Иммуногистохимический анализ срезов опухолей легких.

1.1.2. Анализ экспрессии мРНК рековерина в раковых опухолях.

1.2. Экспрессия рековерина в нормальных тканях.

2. Исследование механизмов аберрантной экспрессии рековерина.63 2.1. Анализ статуса метилирования области промотора и первого экзона гена рековерина в нормальных тканях и раковых опухолях.

2.2. Исследование влияния различных агентов на уровень экспрессии рековерина в клеточной линии рака легких.

2.2.1. Влияние ДАЦ, ТСА и бутирата натрия на уровень экспрессии мРНК рековерина.

2.2.2. Изменение уровня метилирования области промотора и первого экзона гена рековерина в N0-1-182 под воздействием ДАЦ.

2.2.3. Исследование влияния ДАЦ, ТСА и бутирата натрия на уровень экспрессии рековерина.

3. Рековерин как потенциальный маркер злокачественной трансфомации.

3.1. Серийный анализ опухолей легких на присутствие в них экспрессии рековерина.

3.2. Серийный анализ образцов сыворотки крови онкологических больных на присутствие аутоантител против рековерина.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование аберрантной экспрессии рековерина"

Аутоиммунные неврологические заболевания, возникающие в организме вследствие наличия злокачественной опухоли, или так называемые паранеопластические синдромы (ПНС), проявляются в виде разнообразных симптомов, возникающих вследствие повреждения органа или ткани, дистанционно удаленных от места локализации опухоли или ее метастазов. Неврологические ПНС могут поражать любую область, относящуюся к нервной системе - центральную нервную систему [1], зрение [2], периферические нервы [3], нервно-мышечные сочленения [4] и другие. Некоторые из ПНС воздействуют только на определенные участки (например, лимбический энцефалит) или клетки определенного вида (например, клетки Пуркинье в мозжечке). В иных случаях патологическое воздействие затрагивает несколько уровней нервной системы (энцефаломиелорадикулит).

При всем разнообразии симптомов и признаков ПНС можно выделить их общие характерные особенности. Очень часто неврологическое расстройство проявляется раньше, чем с помощью современных диагностических методов будет замечена опухоль, являющаяся его причиной. На сегодняшний день причиной развития ПНС считается экспрессия злокачественной опухолью белков, которые в норме (в отсутствие трансформации) не синтезируются тканью, где локализована опухоль. Некоторые из этих белков строго специфичны для нервной ткани, другие могут содержать эпитопы, идентичные эпитопам ней-рональных белков. Такие белки называют паранеопластическими (он-коневральными) антигенами, или ПНА.

Возможный механизм ПНС может сводиться к следующему. Нервная система относится к иммунопривилегированной зоне, т.е. она защищена от деструктивного действия иммунной системы наличием гематотканевого (гематоэнцефалического и гематоокулярного) барьера. Но в случае аберрантной экспрессии раковой опухолью белков, специфичных для нервной ткани, их попадание в кровоток вызывает выработку аутоантител против них, поскольку эти белки являются "чужими" для иммунной системы. Аутоантитела затем преодолевают гематотканевый барьер и выводят из строя тот белок-антиген, на который они были выработаны, что и приводит к дегенерации ткани [5].

Особенный интерес в изучении ПНА представляет тот факт, что заболевания, вызываемые ими, могут быть диагностированы за месяцы или даже за годы до определения у того же пациента раковой опухоли. В связи с этим чрезвычайно важным кажется изучение не столько собственно ПНС и их проявлений, сколько самих ПНА, их свойств и причин, вызывающих их экспрессию в опухоли.

Настоящая работа посвящена исследованию одного из ПНА, ре-коверина, аберрантная экспрессия которого в опухолях может приводить к развитию специфического ПНС — паранеопластической дегенерации сетчатки.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

РЕКОВЕРИН И ДРУГИЕ ПАРАНЕОПЛАСТИЧЕСКИЕ

АНТИГЕНЫ»

1. Рековерин.

Рековерин - это Са -связывающий белок, принимающий участие в фототрансдукции [6]. С другой стороны, рековерин известен как ПНА, ответственный за развитие паранеопластической дегенерации сетчатки при раке [7].

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Савченко, Марина Сергеевна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что рековерин экспрессируется в опухолях немелко-клеточной карциномы легких.

2. мРНК рековерина выявлена в нормальных тканях, не относящихся к тканям нервной системы.

3. Получены данные, указывающие на вовлечение деметилирова-ния участков промотора и первого экзона гена рековерина в регуляцию экспрессии рековерина в клеточной линии рака легких in vitro.

4. Установлено, что ацетилирование гистонов не участвует в проявлении аберрантной экспрессии рековерина in vitro.

5. Определены частоты экспрессии рековерина в опухолях легких и встречаемости аутоантител против рековерина в сыворотке крови пациентов при раке легких, которые составляют, соответственно, 76% и 17%.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савченко, Марина Сергеевна, Москва

1. Gultekin, S.H., Rosenfeld, M.R., Voltz, R., Eichen, J., Posner, J.B. and Dalmau, J. (2000). Paraneoplastic limbic encephalitis: neurological symptoms, immunological findings and tumour association in 50 patients. Brain 123, 1481-1494.

2. Goldstein, S.M., Syed, N.A., Milam, A.H., Maguire, A.M., Lawton, T.J. and Nichols, C.W. (1999). Cancer-associated retinopathy. Arch. Ophthalmol. 117, 1641-1645.

3. Rudnicki, S.A. and Dalmau, J. (2000). Paraneoplastic syndromes of the spinal cord, nerve, and muscle. Muscle Nerve 23, 1800-1818.

4. Carpentier, A.F. and Delattre, J.Y. (2001). The Lambert-Eaton myasthenic syndrome. Clin. Rev. Allergy Immunol. 20, 155-158.

5. Ho, T.W., McKhann, G.M. and Griffin, J.W. (1998). Human autoimmune neuropathies. Annu. Rev. Neurosci. 21, 187-226.

6. Dizhoor, A.M., Ray, S., Kumar, S., Niemi, G., Spencer, M., Brolley, D., Walsh, K.A., Philipov, P.P., Hurley, J.B., Stryer, L. (1991). Recoverin: a calcium sensitive activator of retinal rod guanylate cyclase. Science 251, 915-918.

7. Subramanian, L. and Polans, A.S. (2004). Cancer-related diseases of the eye: the role of calcium and calcium-binding proteins. Bioch. Biophys. Res. Com. 322, 1153-1165.

8. Ray, S., Zozulya, S., Niemi, G.A., Flaherty, K.M., Brolley, D., Dizhoor, A.M., McKay, D.B., Hurley, J.B. and Stryer, L. (1992). Cloning, expression, and crystallization of recoverin, a calcium sensor in vision. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89, 5705-5709.

9. Lambrecht, H.-G. and Koch, K.-W. (1991). Light-dependent phosphorylation a 26 kd calcium binding protein from bovine rod outer segments. FEBS Lett. 317,45-48.

10. Дижур A.M., Некрасова Э.Н., Филиппов П.П. (1991). Новый специфичный для фоторецепторных клеток белок с молекулярной массой 26 кДа, способный связываться с иммобилизованным делипидизиро-ванным родопсином. Биохимия 56, 225-229.

11. Korf, H.W., White, В.Н., Schaad, N.C. and Klein, D.C. (1992). Recov-erin in pineal organs and retinae of various vertebrate species including man. Brain Research 595, 57-66.

12. Milam, A.H., Dacey, D.M. and Dizhoor, A. (1993). Recoverin immu-noreactivity in mammalian cone bipolar cells. Vis. Neurosci. 10, 1-12.

13. Wiechmann, A.F. and Hammarback, J.A. (1993). Expression of recoverin mRNA in the human retina: localization by in situ hybridization. Exp. Eye Res. 57, 763-769.

14. De Raad, S., Comte, M., Nef, P., Lenz, S.E., Gundelfinger, E.D. and Cox, J. A. (1995). Distribution pattern of three neural calcium-binding proteins (NSC-1, VILIP and recoverin) in chicken, bovine and rat retina. His-tochem. J. 27, 524-535.

15. McGinnis, J.F., Stepanik, P.L., Jariangprasert, S. and Lerious, V. (1997). Functional significance of recoverin localization in multiple retina cell types. J. Neurosci. Res. 50, 487-495.

16. Dalil-Thiney, N., Bastianelli, E., Pochet, R., Reperant, J. and Versaux-Botteri, C. (1998). Recoverin and hippocalcin distribution in the lamprey (Lampreta fluviatilis) retina. Neurosci. Lett. 247, 163-166.

17. Bastianelli, E. and Pochet, R. (1994). Calbindin-D28k, calretinin, and recoverin immunoreactivities in developing chick pineal gland. J. Pineal. Res. 17, 103-111.

18. Bastianelli, E., Polans, A.S., Hidaka, H. and Pochet R. (1995). Differential distribution of six calcium-binding proteins in the rat olfactory epithelium during postnatal development and adulthood. J. Comp. Neurol. 354,395-409.

19. Gorodovikova, E.N., Gimelbrant, A.A., Senin, I.I. and Philippov, P.P. (1994). Recoverin mediates the calcium effect upon rhodopsin phosphorylation and cGMP hydrolysis in bovine retina rod cells. FEBS Lett. 349(2), 187-190.

20. Gorodovikova, E.N., Senin, I.I. and Philippov, P.P. (1994). Calcium-sensitive control of rhodopsin phosphorylation in the reconstituted system consisting of photoreceptor membranes, rhodopsin kinase and recoverin. FEBS Lett. 353(2), 171-172.

21. Makino, C.L., Dodd, R.L., Chen, J., Burns, M.E., Roca, A., Simon, M.I. and Baylor, D.A. (2004). Recoverin regulates light-dependent phosphodiesterase activity in retinal rods. J. Gen. Physiol. 123(6), 729-741.

22. Klenchin, V.A., Calvert, P.D. and Bownds, M.D. (1995). Inhibition of rhodopsin kinase by recoverin. Further evidence for a negative feedback system in phototransduction. J. Biol. Chem. 270 (27), 16147-16152.

23. Wiechmann, A.F. and Hammarback, J.A. (1993). Molecular cloning and nucleotide sequence of a cDNA encoding recoverin from human retina. Exp. Eye Res. 56, 463-470.

24. Wiechmann, A.F., Akots, G., Hammarback, J.A., Pettenati, M.J., Rao, P.N. and Bowden, D.W. (1994). Genetic and physical mapping of human recoverin: a gene expressed in retinal photoreceptors. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 35,325-331.

25. Kretsinger, R.H. (1980). Structure and evolution of calcium-modulated proteins. CRC Crit. Rev. Biochem. 8, 119-174.

26. Flaherty, K.M., Zozulya, S., Stiyer, L. and McKay, D.B. (1993). Three-dimensional structure of recoverin, a calcium sensor in vision. Cell 75, 709-716.

27. Senin, 1.1., Fischer, T., Komolov, K.E., Zinchenko, D.V., Philippov, P.P. and Koch, K.W. (2002). Ca2+-myristoyl switch in the neuronal calcium sensor recoverin requires different functions of Ca2+-binding sites. J. Biol. Chem. 277(52), 50365-72.

28. Ames, J.B., Porumb, T., Tanaka, T., Ikura, M. and Stiyer, L. (1995). Amino-terminal myristoylation induces cooperative calcium binding to recoverin. J. Biol. Chem. 270, 4526-4533.

29. Hughes, R.E., Brzovic, P.S., Klevit, R.E. and Hurley, J.B. (1995). Calcium-dependent solvation of the myristoyl group of recoverin. Biochemistry 34, 11410-11416.

30. Zozulya, S. and Stryer, L. (1992). Calcium-myristoyl protein switch. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11569-11573.

31. Thirkill, C.E., Tait, R.C., Tyler, N.K., Roth, A.M. and Keltner, J.L. (1992). The cancer-associated retinopathy antigen is a recoverin-like protein. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 33(10), 2768-2772.

32. Adamus, G., Ortega, H., Witkowska, D. and Polans, A. (1994). Recoverin: a potent uveitogen for the induction of photoreceptor degeneration in Lewis rats. Exp. Eye Res. 59(4), 447-455.

33. Thirkill, C.E., Roth, A.M. and Keltner, J.L. (1987). Cancer-associated retinopathy. Arch. Ophthalmol. 105, 372-375.

34. Jacobson, D.M., Thirkill, C.E. and Tipping, S.J. (1990). A clinical triade to diagnose paraneoplastic retinopathy. Ann. Neurol. 28, 162-167.

35. Jacobson, D.M. (1996). Paraneoplastic disorders of neuro-ophthalmologic interest. Curr. Opin. Ophthalmol. 7, 30-38.

36. Sawyer, R.A., Selhorst, J.B., Zimmerman, L.E. and Hoyt, W.F. (1976). Blindness caused by photoreceptor degeneration as a remote effect of cancer. Am. J. Ophtalmol. 81, 606-613.

37. Keltner, J.L., Roth, A.M. and Chang, R.S. (1983). Photoreceptor degeneration. Possible autoimmune disorder. Arch. Ophthalmol. 101, 564569.

38. Kornguth, S.E., Klein, R., Appen, R. and Choate, J. (1982). Occurrence of anti-retinal ganglion cell antibodies in patients with small cell carcinoma of the lung. Cancer. 50, 1289-1293.

39. Kornguth, S.E., Kalinke, T., Grunwald, G.B., Schutta, H. and Dahl, D. (1986). Anti-neurofilament antibodies in the sera of patients with small cell carcinoma of the lung and with visual paraneoplastic syndrome. Cancer Res. 46, 2588-2595.

40. Grunwald, G.B., Kornguth, S.E., Towfighi, J., Sassani, J., Simmonds, M.A., Housman, C.M. and Papadopoulos, N. (1987). Autoimmune basis for visual paraneoplastic syndrome in patients with small-cell lung carcinoma. Cancer 60, 780-786.

41. Polans, A.S., Buczylko, J., Crabb, J. and Palczewski, K. (1991). A photoreceptor calcium binding protein is recognized by autoantibodies obtained from patients with cancer-associated retinopathy. J. Cell. Biol. 112(5), 981-989.

42. Yamaji, Y., Matsubara, S., Yamadori, I., Sato, M., Fujita, T., Fujita, J. and Takahara, J. (1996). Characterization of a small-cell-lung-carcinoma cell line from a patient with cancer-associated retinopathy. Int. J. Cancer 65,671-676.

43. Matsubara, S., Yamaji, Y., Sato, M., Fujita, J. and Takahara, J. (1996). Expression of a photoreceptor protein, recoverin, as a cancer-associated retinopathy autoantigen in human lung cancer cell lines. Br. J. Cancer 74, 1419-1422.

44. Maeda, A., Ohguro, H., Maeda, T., Wada, I., Sato, N., Kuroki, Y. and Nakagawa, T. (2000). Aberrant expression of photoreceptor-specific calcium-binding protein (recoverin) in cancer cell lines. Cancer Res. 60, 19141920.

45. Maeda, T., Maeda, A., Maruyama, I., Ogawa, K.I., Kuroki, Y., Sahara, H., Sato, N. and Ohguro, H. (2001). Mechanisms of photoreceptor cell death in cancer-associated retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42 (3), 705-712.

46. Adamus, G. and Amundson, D. (1996). Epitope recognition of recoverin in cancer associated retinopathy: evidence for calcium-dependent conformational epitopes. J. Neur. Res. 45, 863-872.

47. Gery, I., Chanaud, N.P. and Anglade, E. (1994). Recoverin is higly uveitogenic in Lewis rats. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35, 3342-3345.

48. Adamus, G., Guy, J., Schmied, J., Arendt, A. and Hargrave, P. (1993). Role of anti-recoverin autoantibodies in cancer-associated retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2626-2633.

49. Thirkill, C. (1997). Experimental, cancer-induced retinopathy. Occular. Immunol. Inflam. 5(1), 55-65.

50. Adamus, G., Machnicki, M. and Seigel, G. (1997). Apoptotic retinal cell death induced by antirecoverin autoantibodies of cancer-associated retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 283-291.

51. Hollyfield, J. and Rayborn, M. (1987). Endocytosis in the inner segment of rod photoreceptors: analysis of Xenopus laevis retinas using hores-radish peroxidase. Exp. Eye. Res. 45, 703-719.

52. Chen, W., Elias, R.V., Cao, W., Lerious, V. and McGinnis, G.F. (1999). Antirecoverin antibodies cause the apoptotic death of mammalian photoreceptor cells in vitro. J. Neurosci. Res. 57, 706-718.

53. Adamus, G., Machnicki, M., Elerding, H., Sugden, B., Blocker, Y.S. and Fox, D.A. (1998). Antibodies to recoverin induce apoptosis of photoreceptor and bipolar cells in vivo. J. Autoimm. 11, 523-533.

54. Adamus, G. (2003). Autoantibody-induced apoptosis as a possible mechanism of autoimmune retinopathy. Autoimmun. Rev. 2, 63-68.

55. Shiraga, S. and Adamus, G. (2002). Mechanism of CAR syndrome: antirecoverin antibodies are the inducers of retinal cell apoptotic death via the caspase 9- and caspase 3-dependent pathway. J. Neuroimmunol. 132, 7282.

56. Chen, W., Cao, W., Achyuthan, A.M. and McGinnis, J.F. (2001). In vitro inhibition of antirecoverin immunoglobulin-mediated death of mammalian photoreceptor cells. J. Neurosci. Res. 63, 116-123.

57. Ohguro, H., Ogawa, K., Maeda, T., Maeda, A. and Maruyama, I. (1999). Cancer-associated retinopathy induced by both anti-recoverin and anti-hsc70 antibodies in vivo. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 3160-3167.

58. Ohguro, H., Ogawa, K. and Nakagava, T. (1999). Recoverin and hsc70 are found as autoantigens in patients with cancer-associated retinipathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40(1), 82-89.

59. Ohguro, H., Odagiri, H., Miyagawa, Y., Ohguro, I., Sasaki, M. And Nakazawa, M. (2004). Clinicopathological features of gastric cancer cases and aberrantly expressed recoverin. Tohoku J. Exp. Med. 202, 213-219.

60. Liu, J., Dalmau, J., Szabo, A., Rosenfeld, M., Huber, J. and Furneaux, H. (1995). Paraneoplastic encephalomielitis antigens bind to the AU-rich elements of mRNA. Neurology 45, 544-550.

61. Marusich, M.F., Furneaux, H.M., Henion, P. and Weston, J.A. (1994). Hu neuronal proteins are expressed in proliferating neurogenic cells. J. Neurobiol. 25, 143-155.

62. Posner, J.B. and Furneaux, H.M. in Immunologic Mechanisms in Neurologic and Psychiatric Disease, ed. Waksman BH (Raven, New York) 1990; 187-219.

63. Szabo, A., Dalmau, J., Manley, G., Rosenfeld, M., Wong, E., Henson, J., Posner, J.B. and Furneaux, H. (1991). HuD, a paraneoplastic encephalomyelitis antigen, contains RNA-binding domain and is homologous to Elav and Sex-lethal. Cell 67(2), 325-333.

64. Kenan, D.J., Query, C.C. and Keene, J.D. (1991). RNA recognition: towards identifying determinants of specificity. Trends Biochem. Sci. 74, 214-220.

65. Sachs, A.B. (1993). Messenger RNA degradation in eucariotes. Cell 74, 413-421.

66. Levine, T.D., Gao, F., King, P.H., Andrews, L.G. and Keene, J.D. (1993). Hel-Nl: an autoimmune RNA-binding protein with specificity for 3' uridilate-rich untranslated regions of growth factor mRNAs. Mol. Cell. Biol. 13, 3494-3504.

67. Dalmau, J., Furneaux, H., Gralla, R.J., Kris, M.G. and Posner, J.B. (1990). Detection of anti-Hu antibody in the serum of patients with small-cell lung cancer aquantitative western blot analysis. Ann. Neurol. 27, 544-552.

68. Gibson, T.J. and Pastore, A. (1996). Three-dimensional structure and stability of the KH domain: molecular insights into the fragile X syndrome. Cell 85, 237-245.

69. Buckanovich, R.J., Yang, Y.Y. and Darnell, R.B. (1996). The onconeu-ral antigen Nova-1 is a neuron-specific RNA-binding protein, the activity of which is inhibited by paraneoplastic antibodies. J. Neurosci. 16, 11141122.

70. Tuerk, C. and Gold, L. (1990). Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 249,505-510.

71. Yang, Y.Y., Yin, G.L. and Darnell, R.B. (1999). The neuronal RNA-binding protein Nova-2 is implicated as the autoantigen targeted in POMApatients with dementia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13254-13259.

72. Engebrecht, J.A., Voelkel-Meiman, K. and Roeder, G.S. (1991). Meio-sis-specific RNA splicing in yeast. Cell 66, 1257-1268.

73. Siebel, C.W., Admon, A. and Rio, D.C. (1995). Soma-specific expression and cloning of PSI, a negative regulator of P element pre-mRNA splicing. Genes Dev. 9, 269-283.

74. Gamarnik, A.V. and Andino, R. (1997). Two functional complexes i formed by KH domain containing proteins with the 5' noncoding region ofpoliovirus RNA. RNA 3, 882-892.

75. Ostareck, D.H., Ostareck-Lederer, A., Wilm, M., Thiele, B J., Mann, M. and Hentze, M.W. (1997). mRNA silencing in erythroid differentiation: hnRNP K and hnRNP El regulate 15-lipoxygenase translation from the 3' end. Cell 89, 597-606.

76. Kiledjian, M., Wang, X. and Liebhaber, S.A. (1995). Identification of two KH domain proteins in the alpha-globin mRNP stability complex. EMBO J. 14,4357-4364.

77. Jensen, K.B., Dredge, B.K., Stefani, G., Zhong, R., Buckanovich, R.J., Okano, H.J., Yang, Y.Y. and Darnell, R.B. (2000). Nova-1 regulates neuron-specific alternative splicing and is essential for neuronal viability. Neuron 25,359-371.

78. Furneaux, H., Rosenblum, M., Dalmau, J. et al. (1990). Selective ex* pression of Purkinje-cell antigens in tumor tissue from patients with paraneoplastic cerebellar degeneration. N. Engl. J. Med. 332, 1844-1851.

79. Anderson, N.E., Rosenblum, M., Graus, F., Wiley, R.G. and Posner, J.B. (1988). Antibodies in paraneoplastic syndromes associated with small-cell lung cancer. Neurology 38, 1391-1398.

80. Cunningham, J., Graus, F., Anderson, N. and Posner, J. (1986). Partial characterization of the Purkinje cell antigens in paraneoplastic cerebellar degeneration. Neurology 36, 1163-1168.

81. Dropcho, E.J., Chen, Y.-T., Posner, J.B. and Old, L.J. (1987). Cloning of a brain protein identified by autoantibodies from a patient with paraneoplastic cerebellar degeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4552-4556.

82. Tanaka, K., Tanaka, M., Onodera, O. and Tsuji, S. (1995). Paraneoplastic cerebellar degeneration characterization of anti-Yo antibody and underlying cancer. Rinsho Shikeigaku 35(7), 770-774.

83. Oguro-Okano, M., Griesmann, G.E., Kryzer, T. et al. (1993). N-type (class B) neuronal Ca2+ channels expressed in small cell lung carcinomas of patients with and without Lambert-Eaton myasthenic syndrom (LES). Soc. Neurosci. Abstr. 19, 1755.

84. Lambert, E.H. and Lennon, V.A. (1988). Selected IgG rapidly induces Lambert-Eaton myasthenic syndrom in mice: complement independence and EMG abnormalities. Muscle Nerv. 11, 1133-1145.

85. Birnbaumer, L., Campbell, K.P., Catteral, W.A., Harpold, M.M., Hoffman, F., Home, W.A., Mori, Y., Schwartz, A., Snutch, T.P., Tanabe, T. et al. (1994). The naming of voltage-gated calcium channels. Neuron 13, 505506.

86. Roberts, A., Perera, S., Lang, B. et al. (1985). Paraneoplastic myasthenic syndrome IgG inhibits 45Ca2+-flux in a human small cell carcinoma line. Nature 317, 737-739.

87. Sher, E., Biancardi, E., Passafaro, M. and Clementi, F. (1991). Physiopathology of neuronal voltage-operated calcium channels. FASEB J. 5, 2677-2683.

88. O'Neil, J.H., Murray, N.M. and Newson-Davis, J. (1988). The Lambert-Eaton myasthenic syndrom. A review of 50 cases. Brain 11, 577-596.

89. Motomura, M. (1999). The Lambert-Eaton myasthenic syndrome: a study of 110 Japanese cases. Rinsho Shinkeigaku 39(12), 1237-1239.

90. Pongs, O. (1992). Molecular biology of voltage-dependent potassium channels. Physiol. Rev. 72, 69-88.

91. Lang, B. and Vincent, A. (1996). Autoimmunity to ion-channels and other proteins in paraneoplastic disorders. Curr. Opinion in Immun. 8, 865871.

92. Newson-Davis, J. and Mills, K.R. (1993). Immunological associations of acquired neuromyotonia (Isaacs' syndrom). Report of five cases and literature review. Brain 116, 453-469.

93. Lindstrom, J.M. and Lambert, E.H. (1978). Content of acetylcholine receptor and antibodies bound to receptor in myasthenia gravis, experimental autoimmune myasthenia gravis, and Eaton-Lambert syndrom. Neurology 28, 130-138.

94. Vincent, A. and Newson-Davis, J. (1985). Acetylcholine receptor antibody as a diagnostic test for myasthenia gravis: results in 153 validated cases and 2967 diagnostic assays. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 48, 1246-1252.

95. Karlin, A. (1993). Structure of nicotinic acetylcholine receptors. Curr. Opin. Neurobiol. 3, 299-309.

96. Mamalaki, A. and Tzartos, S.J. (1994). Nicotinic acetylcholine receptor: structure, function and main immunogenic region. Adv. Neuroimmu-nol. 4, 339-354.

97. Newson-Davis, J. (1997). Autoantibody-mediated channelopathies at the neuromuscular junction. Neuroscientist, 337-346.

98. David, C., Mepherson, P.S., Mundigl, O. and Decamilli, P. (1996). A role of amphiphisin in synaptic vesicle endocytosis suggested by its binding to dinamin in nerve terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 331-335.

99. Klenchin, V.A., Calvert, P.D. and Bownds, M.D. (1995). Inhibition of rhodopsin kinase by recoverin. Further evidence for a negative feedback system in phototransduction. J. Biol. Chem. 270(27), 16147-16152.

100. Практикум по Биохимии. (1989). Издательство Московского университета, стр. 85.

101. Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

102. Практикум по Биохимии. (1989). Издательство Московского университета, стр. 320.

103. Senin, I.I., Zargarov, A.A., Alekseev, A.M., Gorodovikova, E.N., Lipkin, V.M. and Philippov, P.P. (1995). N-myristoylation of recoverin enhances its efficiency as an inhibitor of rhodopsin kinase. FEBS Lett. 376(1-2), 87-90.

104. Tikhomirova, N.K., Kochetov, G.A. (1990). Purification of transketo-lase from baker's yeast by an immunoadsorbent. Biochemistry Intern. 22, 31-36.

105. Lie, Y.S. and Petropoulos, C.J. (1998). Advances in quantitative PCR technology: 5' nuclease assays. Curr. Opin. Biotech. 9, 43-48.

106. De Smet, С., De Backer, О., Faraoni, I., Lurquin, С., Brasseur, F. and Boon, T. (1996). The activation of human gene MAGE-1 in tumor cells is correlated with genome-wide demethylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93,7149-7153.

107. Archer, S.Y. and Hodin, R.A. (1999). Histone acetylation and cancer. Curr. Opin. Gen. Dev. 9, 171-174.

108. Eden, S. and Cedar, H. (1994). Role of DNA methylation in the regulation of transcription. Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 255-259.

109. Creusot, F., Acs, G. and Christman, J.K. (1982). Inhibition of DNA methyltransferase and induction of Friend erythroleukemia cell differentiation by 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine. J. Biol. Chem. 257, 2041-2048.

110. Yoshida, M., Horinouchi, S. and Beppu, T. (1995). Trichostatin A and trapoxin: novel chemical probes for the role of histone acetylation in chromatin structure and function. Bioassays. 17, 423-430.

111. Chen, J.S., Faller, D.V. and Spanjaard, R.A. (2003). Short-chain fatty acid inhibitors of hystone deacetylases: promising anticancer therapeutics? Curr. Cancer Drug Targets 3 (3), 219-236.

112. Dalmau, J., Furneaux, H.M., Cordon-Cardo, C. and Posner, J. (1992). The expression of the Hu (paraneoplastic encephalomyelitis/sensory neu-ronopathy) antigen in human normal and tumor tissues. Am. J. Patol. 141, 881-886.

113. Dropcho, E.J. (2002). Remote neurologic manifestations of cancer. Neurol. Clin. 20, 85-122.

114. Musunuru, K. and Darnell, R.B. (2001). Paraneoplastic neurologic disease antigens: RNA-binding proteins and signaling proteins in neuronal degeneration. Ann. Rev. Neurosci. 24, 239-262.