Использование стационарных клеточных культур для изучения процесса старения и факторов, влияющих на его скорость

Хохлов, Александр Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Использование стационарных клеточных культур для изучения процесса старения и факторов, влияющих на его скорость
ВАК РФ 03.00.17, Цитология

Автореферат диссертации по теме "Использование стационарных клеточных культур для изучения процесса старения и факторов, влияющих на его скорость"

ШЗТШТ ЦИТОЛОГИИ Ml СССР

2Ziy

lía правах рулоггапп

УДК 577.34

ХОХЛОВ Алэксгпдр Ншюяипи

тгоЛЧВСМШИ CTAl£'C!Lffi2£X НЛЕТОЧНУХ КУЛЬТУР Д.ЧЛ КЗУЧЕШЩ ПРОЦЕССА СТАРЕНИЯ Г! ОЛКГСГОЗ, ШШЩЖ Ж ЕГО СКОРОСТЬ

03.00.17 - Щпологня

ABTOFmPAT

дпосзртоцш по comumnr ушспй стегана доктора бпожижвсетк тщтх в форкэ научного дашда

sl^W^S v^-гт. i^^o^ fe pfi)

ЛШШГРДД

mii Я, Mot J«} 1589

Рсбо-га шшаава n Ыэсковоиог ш. Ы.В.,£>д:амеава п о Иаонгеум Ш F0Ü0P

Офдщашгиа ошкшьш fiitûjiOiità; АН УСОР, ирофаосор JiOi.ïûp бШЛЭГИЧОШШХ ÜÜJ'U, ЮрЗфоесор док-юр Giiajsora4dCiCUx imytf

Водацая оргашшцза - ШЧ с^ояоглд гоеяа^сйкашго yiKiopcrctora tí. ¿.U.IbpiKo-ro

ЗЩЦ'й С0020Ц*"Я в_________1СЛЗ i', h_„___SöCöö

i;-i jí'u cow.» ji.ct,>7í>.ci iîv^vï^'ai'»

HUíovjiiiH Alf ÇOOP ьа 10JLGC.Í Лж U-Oi, Ъа-гр-П,:;,.'

пр., 4

O ,vocaj'¡-{ar¿*'3 i.e.лс» 0.i¡i;.¡'0£.;,üi.ca и Cúíu.-:Г,o r,.í лэгш АН СССР.

/лторсй'орси1 раасаяаа _ " ___1С0Э r«.

У-iüiiuTi ceiq-joïûpb кщд. едал, наук

Л.'й.ШмрОЕЗ

t.L'.üi'oii,;««

heoïjiïfî mWGTiZi ¿II CCD?

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА PAHOTti АктуМкПость_гщдбМ?/«. В настоянное вреня стало совершенно ясно, что без исследований фувд ментальных зхатгзмов старения невозможно существенно увеличить продолжительность яизнп людей и снизить их заболеваемость. Улучшение социальных условий в развитых странах позволило достичь фактического прадед сродттэП продолжительности ."Ш31Ш. Дпльпейиие сдвиги в этой области возмозяш лтазь п., тем вмешательства в те тонкие механизма, которые определяют максимальные (видовые) сроки существоваи .w опгаппзма. Несомненна такие необходимость поиска различных факторов той или иной природа, замедляющих старение (геропротекторов), а такте выявления _ факторов, его ускоряющих (геропр юторов). Однако исследование фундаментальных механизмов старения, как и поиск геропротекторов и геропромоторов, в экспериментах. in vivo сопряжено со значительными трудности!«!. При -оперечнш послодовапиях (когда одновременно изучают .особей разного возраста) истинную картину возрастай изменений могаэт искажать избирательное ш? arparme некоторых особей. Лонгитудиналыше ге (на протяжении Есей кизни организмов) исследования требуют гигантских затрат материальных средств и, что самое ванное, времени: в случае изучения старения человека продолжительность эксперимента сопостг та с продолжительностью кпзнп исследователей. Использование короткоплвущпх видов (типа дрозофилы) но решает проблем,, в целом, ибо пе -оториэ процессы на клеточном и даго молекулярном уровне протекают у них . иначе, чем у человека, ' cí .реште которого интересует пас в первую очередь.

Обнаружение "феномена Хейфлика" (Hayíliolc, ííoorheac., 1961: Hayfliok, 1965). то ость "старения" диплоидных клеток in vitro, кптс vnrínroou п ттпрзое д^ло ^ ру:~: гсрсотслсгам oííoKiTsir/ü

модель для поучения механизмов как непосредственно клэтошюго старения, так л ого ускорения и замедления под действием различных Факторов. Однако довольно скоро выяснялось, что "старение" ' клеток in vitro но вполне адекватно их старении in vivo. Иначе говоря, характер пзмепетш некоторых клеточных параметров различая при увеличении числа пассегей, пройденных диплозднши клетками п ■ культуре, н при старении целого организма (см.,н пример, Schuoidor, iiitoui, 1976). Кроме того, и модель Хейфлика требовала для получения достоверных результатов довольно длительных (до года) исследован* \

D связи с сызескаЗанЕКМ становится -ясной актуальность работ,

шшравле шх на создание новых, моделей, обеспечивающих достаточно быстрое получение соответствующих результатов в экспериментально-геронтологических исследованиях. При атоц видна к необходимость использования в етга моделях культивируемых клеток, обеспечивающих изучение фундаментальных (цитологических и молекулярно-биологических) механизмов клеточного отарения в "чистом" виде, то есть бео нейрогуморалышх воздействий, которым клвтгш подвергаются в организме.

Цель и задачи исследовашш. Основная цель настоящей работи состояла в разработке о -омои^ю цитологических и математических »лэтодов нескольких шюточных моделей для интенсивного изучения в экспериментах in vitro механизмов старения, причем модели долаш бшш подкрепляться соответствующей теорией старения. Бшш поставлены следующие конкретшо задачи: 1) Мотетом седамантещш в щелочном градиенте сахарозы оценить количество щелочелабильних участков и одаошт-вих разрлвов е Д!И б культивируешь метках с различным ыитотическш потенциалом; 2' В сравнении о закономерности возрастаю: изиэпепий клеток in vivo исследовать оаконсж. рностн изменений при 'стационарном старении" культивируешь клеток (то есть., при зачедл-эшш скорости их ■ пролиферации пасла порэсева к в процессе пребывания в стационарной фаза роста): а) количества щалочелабплышх участков и одношнешх разрывов в ДНК; 1) количества сашюк ДЩ-белок; в)' ураиш «етшглровашш ДНК; г) уровня спонташшх п шгдуцировая та мутагеном «истринских хроматпдша обманов (СХО); д) способности ..лоток реагировать на стимуляции пролиферации; 3) Разработать клеточпо-ккпетпчзауя вдоль для пслодоввяия геропротокторов к геропромоторов (практачаскво подходи и математический аппарат) п нс.лдтать с ео покоцьн как кзвосишо в горопталогическом отношение факторы (ионкзирущая радиация, апюксвдшга-те4 эпротектор эппгвд), так в Факторы, характер влияния котор х по процэсо старения пока да ясен (олоктромагшшюо поло, алк-лзрущзо соединение); 4) Изучать повмогнов влияние возраста патера па иролЕфератквную активность моток хориона сз плода; б) С поноцью • статистического 'анализа дашшх литературы оценить пролпфэратшзнуа активность клеток человека при некоторых прогероидных ' заболеваниях; С) О^ориуттрспэть теории старения, основаннуп на признании ве^щай poia в, этом процессе ограничения меточной пролиферации, вашшавцзго пшзшклшв первичных "старческих* 'ш...юнешШ в клетках-

- :з -

¡Нйучнвя 'ЯовйЭйа ¡работы. 'В (работе 'впервые проведено систбматизировапаое 'исследование фэномена "стационарного старения" 'По ■ сетям |разкШ1 оспектид. "а 'Призере некоторых ваяшх п чмроптологнческсм отнопояии параметров (количество пелочелабильных 'учйетков Ч! однс литэгах .разрывов в ДНК, уровень» ее -ггетплирования, 'Количество сливок ДНК-белок)-, 'а тшке такого пироко используемого •в щггогепетячейкпх 'псследбваштх 'показателя., кбк уровень СХО, 'показагэ ;пр:"и1йг.:ос'ггь 'использования стационарных тслаточпых культур для пмучанпл фуяд;_*,енталшшх >ме4£Шзмоч старения организмов. 'Проделана 'ПОваЛ 'Натематйческал 'модель, адекватно описывающая 'котетяку |роста 'кулъиганрубкух 'клеток 'й позволящэл оистро оценивать 'цел^З ряд 'ваших характеристик 'клеточной популяцпп. 'Впервые 'показана 'возможность 'исследования геропротекторов п горопро'гаторов с Пойойфй разработанная клвточно-кинсп.гческоП додели. Сфорг.!ууШр^ваза 'новая 'концонцйя старения, ггозволящяя ответить ¡на тшогио 'йопросн-, стоящие 'Перед геронтологией. Книга "иПрол;!$ера1|йя "й старение'"., 'в 'которой 'обобщены "как ■зксшршенталышй 'Материал-, получошшй диссертантов, так •л лзтературнне данные по рассматриваемому вопросу., является 'ййрво'З 'отечественно'*? "Юногрвфтто!, 'специально посвященной 'йспользованйп чд'льтивирусйпс. вдоток для »изучения т-еханизглов старения.

'Научно-практическое значение__работа. Использование

разработанных в ¡янссортацзи -клеточных 'йодеЛеЗ позволяет,быстро (за 2-3 •пе'гз'ля) ш с тюиш материальны я затратам проводить исследования, 'поправлешиге па 'уточнение характера возрастных пз!'9нотггтЯ клеток, а '-аш> тестирование различных факторов, влияниях на скорость старепия. Полученные данные об изменения при "стационарном старении" количества иелочелаОильншс участков -а однонитевнх разршзов в днл, уровня ее мчтшшровашш, а юга количества егшвок ДНК-белок необходимо учитывать в нолекулярно-генетичеекпх исследованиях, проводимых на |сультивируе?сих ¡слетках (например, при постановке опытов по оценке процессов репарации ДНК). Результаты, касащнеся пзкепешй уровня СХО, нукно пртпшать во внимание при тестировании мутагенных соединения путем оценки этого. параметра. Разработанная клеточно-шщетическая модель дает возкоёпость оценивать детый ряд параметров, характерязугоцтх гелоточнуй популяцию, что делает ее полезной для различного рода цитологических исследований!. Представляется п*лЗсообразга:м п прикенейш? дттой коделй для сцепка биологического возраста органична и исследования о

Праге роиднши заболеваниями.

Апробация работы. Результаты работа были допогэщ шш представлены и обсувдени па Всесоюзной симпозиума "Влишаз радиации на рогуляторные лро^эсса в клетка" (Пуцано, 1976), 2ГР Ыаадународаоы генетической конгрессе (Цо^ква, 1978), И уавдународноы геронтологическои конгрессе (Токио, 1978), Всесоюзно« симпозиуме "Иолэкулярныа и клеточные иэхапизш старения, 1901" (Киев, 1981), vi Всесоюзной съезде геронтологов н гериатров (Кизинев, 1982), Всесоюзной научной конференции "Использование моделей патологических состояний при поиска биологически активных препаратов" (Иосква, 1983), Первой съезда Белорусского общества геронтологов ч гериатров (Минск, 1983), Первом Всесоюзном съезде медицинских генетиког (Киев, 1984). XIV Ежегодной конференции Европейского общества по иутагенау внешеП среда (Москва, 1984), 2-м Сшиозиуш по цзтогенэтике старения Гзшшсп, 1984), конференции Ыоип "Биологические проблэш старения п увеличения продол2штельности сизни" (Уосква, 1985), иэадуняоодной конференции "Механизш старания п долголетия" (Сухуми, 1986), V Всесоюзно« съезде геронтологов и гориатров (Тбилиси, 1988).

Объем и структура.работа. Для аецаты дассартащш продсташщотся совокупность работ: 40 публикаций в отечественных в иэздупародщых кздашшх и книга "пролиферация и старение" (II.: BlffllFH, 1С83, 176 о., Ю авт.л.), цолико}.! нышсшшая автором диссертации. Кинга содерзагг весь основной материал диссертации, а тшез обзргй обаор литература (372 названия).

II. МАТЕРИАЛ И Ш'ОДУ 15С0ЯЩ0ВАШШ

Эксперименты по исследовании методом содл:'энтйц.щ__в грз,тутектй

щелочной са.арози ДНК клоток о различным штотиче скип ртотщаг,ом проводили на дшиюидпых 4лбробластах 8-12-тдэлчшх с^брсояов человека шш взрослых тщшкдуукэв, ь тетя на кг.эг<ах SoLz стандартной лшши. Биопсив, культивнраашша диллопденх фЮросластов во флаконах Карреля п анализ их карсотста проводила по общепринятой ыэтодгке (Hayfliok, 1$б5{ Кухаронко и др., 1974). Среда роста как для фабробластов, так и для шаток HaLa состояла из БШ среда Игло с глтеамшюи, 3L& гхщролазатв лактальбуишш и .,02 сиворотк" крупного рогатого скота. Лннийлыа 6-202-яио градиент! сахарозы (30 мл) готовил;, в нитроцаллялозша пробиргсаз. по стандартной кэтодако (Белозерский, 1970) на осноео р^стшра следусаого состава: 0.1 П Vnoa + 0.9 ы НаС1 + о.ооэ ы ШиЭДУА

(Ono, oimda, 1974). Лгаиругпха раствор СОСТОЯЛ ИЗ 0.5 и и&ОП И ОИ U Нс^ЭДТА. ДНК клеток »штата, тткубяруя их в среде, содеряацаЯ 1 шиси/мл ^-тпшдина. Эту сроду добавляли в культивационный флакон сразу посла пссева и него клеток. Сеикентационный анализ ДНК проводили по несколько «одфщпровшшоа методике, разработанной Мак-Грассом п Впльямсам (íioGrath, v/iiilama, 1966). За сутки до опито роду заменяли па норадЕосктивную. 0.5 мл суспензии клеток, снятых со стекла тр:тснксм (1 -5x1 о6 члеток/мл), поносили на градиент долочной сахарозы, куда предварительно наслаивали 1.5 мл лпзпрухгцэго раствора (с о.г5 додецилсульфато натрия). Лизис клеток п денатурация ДНК происходила непосредственно па градиенте в течение 10 -i при штатной температуре в темноте. После этего градиента центрифугировали и течение 7.5 ч (20°С, 12500 об,;,пт) по ЦэптрЕфуго VAG-601 (бакет-ротор 3x35 ил). После центрифугирования грпдпвнты фракционировали на 16 фракций, начиная от дна пробируси. ДШС полученных фракций осаждали 7-1075-ной трнхлоруксусной кислотой {TaJ ), наносили па фяльтри "TVhatman Згтта" и промывали их ТХУ п отлловчм спиртом. Радиоактивность фильтров определяли по сцгзтшшщюншх счетчиках "intortecimiquo SL-30" пли "Bootar.in IS-355".

Для того, нтоСи подвергнуть клетки "стационарному старотта", поступали следукяцтм образом. Клетки культивационного флакона с только кто образовавшемся монослоем (т.е., 1сак правило, на 3 - 4-0 сут после посева 1:5 - 1 ;6) снимали со стекла трипсином и по 1/5 -1ЛО часта клоточноЗ суслепзип (посев 1 :5 - 1:20) помещали в токпо гэ флаконы (понпщишшовиа или флакони Карроля). Культивпроваппэ проводила в герметически Закрытых флаконах без смены среда. Чзрзз разное врэмя после посова анализировали определенные клоточинэ этрауетру; "ртппл т того, что'."стационарное'старение" начинается при зспзллоши ■• разгшойенйл гслэток и продолжаотбй во врш?щ прэбцвшп!я"'пх в стационарной фазо роста (когда проляфэрзйил клотси полностьЬ подавляется вследствие контактного тормогонил).

Для. йззИбш!я'йолйчествэ свлочелабильных участков и_однопнтэсщ

ряфпзов ДНК в »бташюиарпо стврекзих* клетках таюко вспользоволп г-етод НлК-Грэсса я Е:яльямсэ. Зкспорэл'епты проводили на клетках китайского хомячка линии BHdii-РАРгэ (клон 2372а) л ембрионалыяп дйпйоидпшс фибрсбласгах человека птамма üMT-814, прошэдктх 27 удвоонлЯ' клеточной популяции (У1Ш). Клеткп вурапшволи на среде Иглз с глстпютюм, еодорзарcef! 10% (для клеток хомячка) ,лп 20?, (для ¡¡ябробластов человека) стеороттл крупного рогатого скота. В

- 6, -u

случае клеток, хомячка, пди> пэросош; & ораду вводили %-тшдан по конечной) концентвации. о.э> мвКнЛщ. fti аа» 14-15 ч до лизиса сроду заменяла) не недадаоактивну^. В( сдував фабробластов человека 3Н-тиыидиН| (0.5 мкКи/ыл), ввоаИЛШ а( среду через сутки посла. шресева,1|:2' (заизвд( среда, на, нерадцоакишув пе^д лизпсоц. клэтои на производила)- Лизис «лоток проводы» Bj растворе (0.5 ш НаОШ + о.1 цнагздш,. наслоенное на, варрпшУг лдодцзнтов щелочной сахарозы, (0.1 II NaOHi +. 0.9' Ui HaOh Ь 0.003» Mi Ц^ЭДГАь. обьви< б из),, при комнатной, теипература а- темноте (81,5. ч( в> сдаао- клаток, хоыячка» & 6 ч в случае. йроробластрв человека). Градаангш центризм ировага на цэвтрифурв "ВеоЬ-ап, 16-50" (ротор Вй-40», 850Qi обЛин). В, седиаэ клеток хощгака, центрифугировав!», пдовз-дал) njpti 2G?C в точение, 16 ч, а, в: случае fc6po6ластов. чалована» - njpi ю?с & тенепаа. 1(7( чь Градаанты, igaKiwoaipoaajaii ца( 19 > uamioai о» кш> пробир:ги

ДНК осавдшш: юггной) та D) холодильнике,, наносила! на. •fa^tssan, 3as" ш прошвалЗ) их, 10$г-Н01Ь ТХУ. а спкртош Радиоактивность шсдашаш Фзльтров определяла! на. гадкостшщ сщштиллпциощшХ( счетчиках- "L'arii пг (иодаль. 6880, Soarl&. Analytic,. Ino.), ИЛИ) "Intertoohniqua БЬ-ЗО* (Сранция). Прл. посфэении,седашанто1ща1Л1110гю.фракцию в расчет, напршцашщк

Экспериуонты, по. изучают, количества___свдвок. ДНК-бэлэк, п

"стационарно стареющих" клетках, проводила иа клетках майского хоыячкаеыбраоналъных дишюцдпшь ф1бробластах< человек'* ста^-а, Э2, прошедзцх 8 УКП, И! ©Юробластах» больной» нигшнтиой; ксеродгрлзЗ) сэнцины, итамуа. ИМГ-1013,. пропадай* 9- УКП. Клэтзш. хомячка, шравдвалн на. той! ta среда,, что к-, п прздадутцдх оксперш-юнтах, и, 4ябробласт обоих ютов - на- такоД: гз средэ с добавлениеи 103 пуд^винной, сыворотки человека. б процессе акспе^яшанта клэтки пересевали. *.клетта хомячка- - 1:5,. оыбриональныв ф Зробластц человека - 1:3 и, фрбрабласш больной, пигиоитной гсеродариоС -1:2),. вводя в среду. ^гтищщш (о.з ШКИ/Ш, удельная озг-чвность 22 Ки/шоль), 1*С-валив, (Ю ыкКи/цл, 26 Ки/шоль) и 14С-лоСцип (2 -ихКы/ыл, 32-56 Ku/шоль). Для. опредэлокпя галпчаства сплео* ДНК-балок использовали. ютод хрсыатогрсфци на оксиаиатито (Рупасос и др., 1970) в модифицированием виде.

Исследование уровня метилирования ¿щ в _ культивируема__кхотках

Ци__разных____121<ШШ!ЩШого____старания^ проводили на

традефорыцювашщх клетках катайско1 • хомячка линии B1 Idll-PAI2Q (iu<?y. 2372q),. эмбрЁкашльшх диплоидашх фиоробластах ча«.авзка штеша. t:.lT-ai 4 иа ЗЬ-м. пассакэ и но диилоцдашх флброблаотаг

больной пигментной ксеродермоа гянщинн (штамм ЮТ-1013) на Б-н пассазе. Клетки культивировали на среде Игла, mдержавшей либо 103 снвороткп крупной!» рогатого скота (клетки китайского хомячка), либо ios сиво, 10пш круппого рогатого скота, и Ь% пуповинной сыворотки человека (вмбриональные диплоидные фяброблртга), либо 15S сыворотки крупного рогатого скота и Б% пуповинной сыворотки человека '($абробласты больной пигментной ксеродерлой). Клетки, которые росли во флаконе в течение .°-4 дней посла посева, 'пересевала в несколько новых флаконов в отношении 1:6 (к„.зтнп кзтайского хомячка), 1:2 (эмбриопалыше фибробласты человека) п 1:4 (клетки больной пигментной ксеродермой). Прч посеве в среду роста вводам. б-^Н-уридин (ЧССР, удельная активность 18 Ки/юю.:ь) до конечной концентрации 2 мкКи/мл. Через определенное время клетки из 1-2 флаконов снимали со стекла трипсином, суспендировали в растворе Хэнкса, осавдали на центрифуге с охлаждением (900 g, 10°0, 6 глин), суспендировали в 80^-ном этаноле, оставляли па 1 ч при комнатной температуре, снова осаздалп центрифугированием, суспендировали осадок в 902-ном и затем абсолютном спирте п полученную суспензию ставили в холодильник до завершения опыта. Получив клетки всех "возрастов", их далее исследовала с помощью двумерной тонкослойной хроматографии на целлюлозе по методике, описанной ранее (Кирпос и др., 1981), в модифицированном виде. Уровень метилирования (УМ) ДКК рассчитывали по формуле: ¿11=100'т^с/(с+т с), где тьо означает Б-метатоитозин, а 0 -одтозин. Состав ДНК оценивали по сутаэ радиоактивностей цитозина, тимина и Б-метилшТозина, которую принимали за 60 мол.7, п па основании отой величины вычисляли "какущёвся" содержание ГЦ-пар.

Эксперименты ш-изучении уровня СХО в._"стационарно__стареющих?

15летаахх_я_Т8^а_скоросга^_шаин__

проводили на клетках китайского хомячка Blldli-PA?28 (¡слон 2372^) по трем схемам. По схеме 1 флаконы выдергивали без пересева 15, 5 и 2 сут- За сутки до пересева в половину флаконов каздой групта добавляли 0.2 гот/мл тпофэсфагзда. Нутагеп от? "-тали и флаконы пересевали (1:5). вводя в сроду роста ю ют/)и Б-бромдозоксиуридипа (БДУ). Через SS ч после пересева с БДУ клетки фиксировали. По схомэ 2 флаконы выдергивали без пэрэсосз 13, 5 п 2 сут. Затем все флакопм порэсеволи с БДУ (10 ютл?л). Клзтгя фиксгровао через зб, 40 и 44 ч после Пересева с БДУ. По схеме 3 фпакога гздертгталл Озэ шзросева 23. 20, 15, 9, 5 и 2 сут. За i ч до пересева с ЬДУ в половину флаконов 1саядой

группы добавляла тиофосфамэд (4.8 ют/ш). Коицонтрацая щта^оиа бшш подобрана так, чтобы ее произведешь па врэпл вкспоовдиа Oiiao так2и еэ, :сах в опито, пройденной по схеиэ 1. Чзраз час Щ'тагон отшваля и флаконы пересевали с БДУ (ю tscr/цл). Клока 2-дпзшзго "возраста" фиксировала чзраз 38 ц 44 ч, остальные - только чороз 44 ч посла по poca i;a 'с БДУ. Приготовление препаратов и даф^ранвдальнув окраску састрянсках хроалгдд проьодмд ш рака описанной иотодако (Чзботарэв п др., 1970). Прл опрэдзлашш урашя CIO ua каздШ флакон просчитывала па 25 ытс^за, прл подсчзто соотшиашт иатозов - по 150 изтефаз. Отдельно подсчитывав ШТ^ЗЫ ПйрБОШ, второго В трэтього ПЛ^С С^ЗДУКЦ'ЗХ ц;позоз. Длз шчаслошш коЕффщиепта II, характор1*зуи;ого соотаоаопао uiiroüob, попользовали фэриулу, прадлохаппую А.Н.Чобог1рсш:л (Чаботсрсш, 1985):

п S±

2 (---• i)

1=1 21'1

ц ----------------- , (1)

n ÍJL

2--

1*1 2*-1

г;;з i - нсюр uatooc., a - его 4as«o-¿ü. uuíooq

гацуляцгл "Зи" услиш> счягсяз раыы 3.

r.,)Kf)Tfip?ix (¡уттороц просодика ü оксшог^айч-гд. ua w&vjzzpjbvjiz. и&этх штатского хатки (Juown 2lidii-F¿í20), &а5раошш>ш£ дшшядиих CaOpoOjjciwax üíCiUia ШГ~ан, ¿0 У1Ш, h пи

с^сшнэкошон культура г-íoso:: ¿cuolepluv.i китайского zo:wü'm ьарс^зссл-- cpA¿ 1а\ш с юг c¿£0&u¿i крупного рогатого скота, а дороолиз'ш - ордj ига с

ю,"; сиюрош! крупного рогатого cava i* io.J щиоьшшоа шйороиз чз£аьзка. Для пояуиэшя jquiim рос-га oyi«icoíír-íücr-a ойсйсида ЕО й'пиои Каррлзл ели шаадаи^оьлэ íwü-^aii, iwaa Ччто чзрог кш.кио 24-ч vrsTm с 3 Законов сш.;:ддц роотьорц мрс-ва и .orpismasu с шиооы) иглзр Горлом количество кроток ш 1 guacoa (на каудой флшсои просчитала 4 китлоры Горлова), ййш срода ьо ,1шшшиах по производили. Kpnnjo роста сусшывошюй культура íumtok „йпгоплаз,"^, шрсдзваешй ио изгоднао, omcmmoü расое (КíUH'fíiiiob и др., колучаш," оцешшая в алшшотох с^опзиахш

оптическую шюпюс'!'«}, содирзаний ДНК еда содерзашю Солка.

Ксслэдуя влияние__т-излучешш па кинетику___роста__клэто-д

китайского хомячка, часть флаконов облучали (установка

-----------------

"Стебель-За", источепк Со, мощность дозы 10 рад/сок) п дозе 2Б0

пли Б00 рад через З.б ч поело посева. Изучая шгаянш__тио^осфамидз

на кинетику роста клеток__китайского_хомячка, через ^ ч после

посева в честь флаконов добавляли Ю, 12.5 или 15 шег/мл мутагена. Через ¿ ч 15 гош его отшвалп. Концентрация и время действия мутагена били выбрани таким образом, чт^бц ого цитогенэтическиЯ зффзкт (уровень индуцированных СХО) примерно соответствовал щггогепэтпческому оффокту 7-излучвпия в использованных дозах.

Обработку клеток___китайского__хомячка___щгакочастоттм

елэктрсиагяптным полем (13 кГц, о.ез Э) проводили в находиваелся Eprj'.Q в термостата соленоиде. Ее начинали через 2 ч после посева,

причем длилась она 22 ч. В огштах по изучению___шляния

аятиокепданта эпигпда на кинетику роста__

©ЗЕЗЗластов_препарат добавляли при посеве в часть

флаконов до коязчноЗ концентрации ю""5 шп Ю-7 и. ¡'ггэшо эти концентрации балл ранее признаны зффжтившст в опитах in vitro (Дксютпна и др., 1901). Оценивая влияние эпиптда на,.кинетику роста культура клеток кккоплаакя, в ■ оштгаэ культивационные флакост при ззс'ез клеток вводили препарат до конечной концентрация Ю~-> Ii.

Изучал рлИЯ1и:з ■ возраста-чатери па , пролкфзративнур тспгопооть

клеток.хориона оо__плода, образш ткани хориона (о1соло и ьт)

поручали из области плацопторяых ворскл во время прэрэтгзяя бзрекоиноста.на 6-1 г-Д кэдоло. Для получения препаратов пржодаш н-зтодику Сиг,'.они с соавторам (simoni et al., 1983). Используя стп птипярята. для каждого образца тгеапл гякроскопкропзлз 15000 свободно ¿ssssax ядер и рзеепшшалл те:: називссстЯ Чсскззатоль пролг&зратишой истшкюста", т.о. чгсло raié'tzsmx, плзстлкс:?, приходящихся па зооо таких пдэр.

Математическую обработку дапшх л пострсс*:"Э притих роста проводила па ЭЕУ "Howlett-Paoterd S33C3", Hctrlott-Paotord G5B", "i'.pplo Но" И "Sharp TIZ-GOO".

III. ШУЩДОВАШ СТ1СУШ •ЧЯЩВДШЯГО 6ШЕБГ"

йЯая ецявнгоэмзя теория стармтая лолгзз, по-е;ш~'С'5У. давать' oteo? яэ слэдухцпо вопроси:

1) Сот ли гзхаппем старопзя есого сивого - еявотгах, p.acTsrrd!, СзкторпЗ, гргбоо я т.д.?' .nof, то долям подвигаться поскольйо шхс1псг.;о0, сСьйсгвшзое старей« лобнх киви* организмов.

Несомненно, что при атом необходимо и дать четкое определение того, что хэ это все-таки такое - старение одноклеточных организмов и растения.

2) Почему наряду со стареющими организмами существую? в нестареющие (пресноводная гидра, некоторые виды рыб и др.)?

3) Почему у разных видов разная продолжительность шазгш?

4) Почему раковые клетки "бессмертны", т.о. обладают (в отличие от нормальных клеток) неограниченным митотическш потенциалом (иными словами, для них нп существует "лимита Хейфлика")? На втот вопрос можно в не отвечать, если не признавать причинно-следственной связи "фонойона ХеЕфлика" с процессом старения.

Б) Каким образом "ускользает" от старения ^родыаевая линия, т.о. совокупность половых клеток, обеспечивающая передачу генетической ннфор»ац>ш в практически бесконечном ряду поколений?

6) И, наконец, как быть с фактическим "бессмертием" вегетативно размнокащихся растений, а такт популяций бактерий, некоторых простеС шх, водорослей и микоплазы?

Если ученый способен ответить па все ото вопросы, "о его гипотеза должна, по-видимому, удовлетворять и следующему требованию: постулируемые в качестве первичных изменения в организма долины "о времени появляться so других изменений D организме, сопрововдащих старение.

На наш взгляд, позволяет ответить на все вта вопроси теория, в основе которой локгг признание ведущей роли ограничения пролиферации в накоплении с возрасто" в оргашзг.е на сияхх рааыд уровнях, начшая с молекулярного, дефектов, приводящие, в сеоз очэредь, к старению.

Согласно отой теории, пусковые механизмом накоплони.. в клетках такого рода повреждений является уцоньаениа ср дней скорости пролиферации клеток организма или неточной популя-да ic^j некоторого 1сритического уровня; у нестареющих со организмов и клеточных популяций средняя скорость пролз^рацшз iy.oto;: достаточно велика, чи ц обеспечивает им (организму ила клоточг.о2 популяции, но но отдельной клетко!) "бессмэртпо".

Нам представляется правдоподобной слэдувдая последовательность событий, щяьодянда. к накоплению ь стареюцих оргашгзцах а клеточных культурах дефектов ДНК, которые ш считаем главными ь развитии впоследствии нроцесге старания. Скорость споьгаяпого ковра адеДНК достаточно гэлнка. Рто ц дзпургошзащш, шзывазыая

тепловая даяеешеа молекул, в свободнорадикалъгио повреядения, п окнслвййэ осйоввшй. Больвая ч сть таких поъревдешй! устраняется систешет репарации однако некоторые яэ них "ускользай?" от этих сэстея вследствие тех или - тих прачйи;'* папример, пз-оа гаггоступиоста суперспйралпзоваяинх а , тфвкированних белками участков !Ш для репярирукзтх ферлептов. Tarasí образш, в ДНК .~эОоЭ клоткя в течение некоторого определенного периода временя с ПэкотороЙ вероятность?) возникает хотя бн одяй перепарируокыЯ дефект. Если клеточная популяция целиком состоит из веделящихся клеток, то по прошествия некоторого времени каздая клетка этой популяция будет ккэть хотя бы одяо повреадеме в своей ДНЯ. Среднее пз число дефектов па клетку будет монотонно возрастать., Если се хотя би часть клеток в рассматриваемой популяции делится, то ситуация будет зависеть от соотношения двух пс^азателей: средней, скорости деления клетки (в расчете на вей популяции) я скорости возникновегая спояташшх дефектов ДНК. Если первый показатель достаточно шсок, то появление пошхх Евповреядеппых клеток будет эдпт гораздо быстрее, чея накопление в популяция клеток с яоврвядепшт ДНК (разтгногвшм клеток с рассматрпввеинмя дефоктаггз ДНИ га считаем невоз:.юп2Г1 ¿»поо значительно затяздлерчця). Есля еэ первый показатель нигз некоторого "барьера", соответствущего состоянию равновесия. (когда относительное содержание поврездепйй ДНК з популяция. остается постошкт«), та Наблгдсем увеличение со временем средпэго числа гозвреэдешй па геле псу (хотя п более та дленное, чем в популяции, состоящей целпкш из неделящихся клеток).

Если все вышесказанное верно, то долита быть верно я следующее гтзлсгсшто: чём гтл гпгГпрят^ттпшл активность клзточноЗ

популяции, теп г,:ойьсе скорость накопления в езЯ повреждений и, соответственно, скорость ее старения.

Першо данные, свидетальствувдие в пользу данного шлоглштя, б'ЕЛИ ног,я получеш в экспериментах по псслэдовзтго с ись'шъп

гэтода седгегэнтащт в градиенте .цэлочпой .сахарозы.. ДНК_клеток__с

раг личвыц штотпчееккм потенциалом.

Б тобл.1 приведены , результаты эксдаржэптоп по определена срэднэвзЕзгепнга констант сэдпшнтощпг ДНИ ембрпональшп фзброблзстов, человека четырех птезлов, фибробластов взросла лвдеЗ четырех птеггеов а. слеток HoLa. о па рис.1 - прочий содп.гэп? "шгп о щелочной градиента сахарозы ДНК геле ток Hela, эмбриональных • "СТ", получошшх

Таблица 1. Сравнение средневзвешенных констант седиментации ДИ в относительных единицах (BQTH) вцбриональных Сибробдестов человека, Яибробластов 2Б-30-лэтнях ладей в клеток Bola

Тип клеток

"отн

Эырион&шше {ибробласты (гатамш •744", "ЛЗ", *18и" и "ДЗ") 7.10 ^ 0.17

вибробласты взрослых доноров ( маьаы "СР. "34", "АХ". "35") 6.63 ± 0.15

Клетка Hela 9.65 * 0.25

величинами

статистически достоверны (р < 0.001).

оти

1 Z 3 Ь s Б 7 8 $ 10 11 11 13 Ц 1э

По^зр Фрашш

Риои. Профили седшзнтацал в цзлочноа градазнто сасарозл схз-

бриопалышх ф^бробластов человека (-). &:бробхас?ов

взрослого донора (- -----) и кдэток floLa (-<•— —«-).

о? 25-летнего донора.

11з рисунка в .таблица ыогшо едцоть, что ДНК шатох Па1а оз десантирует со значительно больше сшростьп, чаи ДЩ е^брпонЕшышх фабробдротов, 5юторая, в свов очародь, сэдааытируох быстрее, чей ДНК "взрослых" клеток.

Следует подчеркнуть, что окспера. .анты ставали на флбробластах, грооздашх разное число 1Л1. Эмбриональные клоии исследовав ш 0-41-м ппсаяах, а клетки взрослых л дай - на 8-33-ц пассеках. Тем не маноо, сравнение полученных результатов ыезду собо2, од-видашоуу, шолш корректно, т.к. при исслодовашги всех

зрэчаолэшшх в тсбл.1 птк«ов фябробластов чоловока »га Сило Зпарусепо статистически до говорного у еньшепия скорости эдпментацип ДНК с увеличением числа пройденных пассакей. Правда, з других атаках (по включенных п табл.1) гды ПЬбладали нэбольпоо !гэпьгеипо скорости седиментации ДШ в процессе па сировапия. птпо текоо укепъсениэ гс-.эло ire сто ятаь па смгых последних, рэдзес-гвугщлх деградации культур«!, naccasax, а приведенные внгл эзультаты получены па клэткох, сг,э не иступивших в Фазу зградации.

По-ипдгагому, в случае культур, "старэюпщх" In vitro, клопе! зроходят "барьер", о котором говорилось вшо, только па cat,ад ослодншс naccasax. Поэте'ту и деградация ДШ обнаруживав von о лысо непосредственно перед "пролифоротивноЯ гибелыз" культуры, огда процесс "старения" вступает в своя терминальную стадии, мошю ограппчепио пролиферации па последних пассапах приводит к петшшеггу" старению клеток, выракаидсмуся в накоплении в шк ааяпчш« дофзктов, в тем число и молекулярпо-гопетпчвеких.

!'л полагаем, что феномен "старения" клеточных культур "по еГ.флику" является всего лгпь выражением неспособности клеток к еограшпеппену долошта, которая никогда но проявляется в ■ргакизгэ. Впрочем, и сам ХеПфлгас в последних своих работах '/сказывает сходные соображения (например, Hayfliok, 1979).

Что 1.э касается оСнару::е шсЛ нг-ми разыщи в молекулярной массе J5K культивируемых диплоидных Фпбробластов разного возраста, то iHc ?тагет Сыть объяснена елвдукщм образом. В "наследство" от .опора ¡слетки получают определенную проли-форапшнуи активность, оторуп спи сохраняют в течение значительного числа пассагеЯ in 'ltro. ''он старсо лопор, тон пролпФооатнвная активность ого клеток [итэ а тем, соответственно, Сольвэ дофхжтов ДИК обнаруживается в ;эгашЛ !.*о''энт срекенл в клеточной популяции. В то го время при гассировшши 1л 7itro этот показатель' йе. ¡гоняется до самых гослэдних пассаЪэй,'' -iicoftja. nparai[opairnfiim • октнбпосгь начинает ¡уцэствешо спиваться.. .-..'•. "« '..;' '.

Из всего сказанного, вытекает дна" очень- загшхх вывода. ПоргаЛ сасоэтся" проСледо "бессмертных" клеточных лпгяЯ, то ,вбт_ лигой слеток с програШпопйнм- потенЦиалйй УКП.' Согласно излойзшкн вето 13121!% в. та*снХ' клетках колекулярязя:-масса .ДЕЛ игп-э, чем в юрмалъшк; ф?бр'"пластах,- способна "стареть" In vitro, i'u юлзгеом, что- такие "бессмертные" клетки отличаигсяг от нормальных "гсо1Ч>. .'¿гь тем, что .обладают больной скоростьо , р&к.що£згош.

По-видимому, отсутствие как nporpasaaj ограничения количества делений (проявляющейся при "старении" in vitro), так в способности к терминальной дафференцировке (реаяьзувдэйся для башашства краток in vivo) в приводит г току» что такие клеточные линии никогда не переходят "барьер", после которого начинается накопление молекулярво-генетнческнх дефектов в происходит "запуск" процесса старения.

Второй вывод касается стационарных клаточных культур в заключается в той, что подртление пролиферации культпшрувинх клеток должно проводить к резкому ускоренно процесса накопления в клеточной популяции дефектов в, как следствие, в ускоренному "старению" всей культура. Шсль о том. что в находяда. за в стационарной фазе росте культивируемых клетках долшш накапливаться повреждения, сходные с поврекдаяпямз клеток старопдего организма, высказывалась в целом ряде публикаций (Гринберг, 1971; Ворсанова, 1977; Dell'Oroo, 1975 и др.). Процесс накопления таких повреждений в культивируемых клетках о увеличением времени после пересева (т е. при скиде mm скорости пролиферации клеток в в процессе дальнейшего их прибивания в стационарной фазе) мы назвали "стационарным старением". №ше будут ЕЗЛОЕ8НЫ данные, полученные нами при изучении "стационарного старения" различных культивируемых клеток.

На рас.2 представлены результаты одного па оксперзыентов по

изучению деградации ДНК в__покоящихся__культивируемых__клетках.

Видно, что седнхантограша ДНК клеток китайского хоиячкя 10-суточноа культура значительно сыевдна в сторону более легких фракций по сравнению с седейюнтогршшэй ДНК клеток 3-суточной культуры. т.е. культуры, находящейся в поздней лол-фаза. В случсо 17-суточной культуры седаинтограь&ш оказалась еоэ более сдвинутой вправо, хотя DTOT второй эдвнг явно мьньса первого. Об а той свидетельству!«? п результат расэтов первых мо«ттов седЕыантогра.'^!. Их величина составляя, соответственно, 7.73, 10.16

Ы 10.28.

сходные даннуэ бита получены и па диплоидных фабробластах человека. По каре "стационарного старения" етпх клеток такса происходит смещение седшдентограглг ДНК в сторону бола о лэгшс: фракций. Величины первых моментов седаантогр до в одноа ез ысспзржг чтов составили 6.59, ß.7? ы 11.04 для ДНК 3-, 7- и 1о-суточках культур, соответственно.

Получошые рэзультаты позволяют полагать, что в ДНК

Рпс.2. Профили седиментации в сгвлочном градиента сахарозы ДШС лизатов клеток китайского хо?лячка из культур разного "возраста". 1-3 - клетки пз 3-суточной, 1 о-суточной п 17-суточной культур, соответственно.

культпЕпруешз гига тоге прт их "стационарном старении" накапливаются оддонитвЕш разрыва п/шш цзлочодабпльныо участка.

Нам представляется, что эти данные необходимо учитывать при постановке опытов по оценке процессов репарации ДНК в культивируемых клетках, óo из . них становится яенш, что средневзвешенная молекулярная, касса .ДШС контрольных клеток зависит от врекэнп, проаэдаего после пересева культуру.

Проведенное пата исследование "возможности накопления__аыгоок в

кегдшшео "ДИК-болок" при "стационарном. старении" представлялось

ЦОЛОСООироЗПшч i¿0 ¿Jlüjijг.»чи;л COOvpoÜóbj-inw. i'jGfljí 1, i, COi'wto^nO ivüiO^Oit

горхшнод прёгашйЗ старзшш является прогрессируйте шшшлопш сливок шздг башка, пуклошрвккп игблот&я а друпш íлахфог^охог:улг;лт¿ .сала сфорйуларо'вана Бьэрйстенсм eso в 1941-1942 годах (BjorkBteri, 1941, 1942) п разшта в его дальнейших работах (Bjoriiotcn, 19SO, 19?4) на''бтаовз как собственных данпнх, тан п результатов, получе'пёк'.' Лруш.я исследователям. В последние год! пояпзлея ряд пубйайцЙ ("•лхельсон, 1S33Прокофьева п др., 19&2, 1933: Дэйтлог" и др., 1931; !mdioIcon-..;.ot al., 1984), сщдэтольотву*ййх ' з пользу данной концепций. •• В частности, представляет ;пнте1.ес тот .факт,' что клэткп больных . прогорт,эй из сиасоСщ-й речзрзцп! йодтдаровапппс езивок ДШС-белок- (ЦеЯТляз и др., 1-93D, хотя других- дефектов систеш репарации;- ]ЩК в ппх

обнаружит! не удалось (Прокофьева и др., 1981).

Наши дошшо об изменении коэМицианта "14С/%" (характеризующего относительное количество балка, коаалэнтко овязшшого с ДНК) в различных кульиапфуемнх клэтках при их "стационарном .старении" представлены на ряс.э. В порти эксперимента, проь.,дешю!л на клетках |ситаЙского хомячка, определяли ©тот ковйлцизнт для 3-, 6-, 10-, 15- и 22-дновшх культур (рыс.З, о), а во втором - для 11-, 14-, 54-, 20-, 33- Й 40-днзешх (рис.3, б).' Нормальные дапдоцднца сибрпон&яшга

о П4 м ' '

а ^ « . 1 . 1 У'*'и /Г Г ."«-1 , -1,..... !

г « 6 , , , , ги ао 2 , , , ,

го

Вриа: куль'-аглроялпп«, оуг

Рис.з. Еамсшосуь кшчшш ыю&здэдга (водсаоаая 2

чонйчш)'о'л вр^-ли», щшоддао пасла н^рисоьа юшо»;. а к б - шш ии'шсисого таи (два ьч:скари:.:з^а), , в иор:лалы!ио ыл5рзоп:ш.Ц1Ц1 ¿пзрблгош

г - доробластц больная ллюьтпоЯ ксародорзй. Кедуш мч!» иродиг-ыВЬ'^'А сооо» средах 2«) ¡:олучл:а;.:;:

По 6 хроаатогр&хйчои.х; колотись*

¿ыоробласти чолэьоиа па^с^ц^^.л, и шкса-и: Слз нарос г;;:; '.--ч^ши 3, С, ю л 19 дишй (рис.3, п), а вютиу большой п.л'оашой иоо[я&р,*эпа '»очзиш 3, С, 0 и 12 дйс-З (рпа-.з/г). Гогульгсгл кавдого ькспсф^ши'а балл оиоп^аи с пссога.» ргрссцэпгого оналнаа. Ладли рагроосаи и праьс-дош па

Видно, что по всях случаях прл "стационарно;,! старашы" иог^фщкоиг и1'?С/'Н" еозр^стазт, что сьедлольс-гсуог • о кькншкип в клетках сшвок 'мокду иолокулмл Д:1и и Сзлков. Иэдэ, одасиэ, ьыачть, 450 регрессия оказалась значив (р<О.СО) только в случае яайоолзй длительного аксиоритнта с клеткылх ш^окого

хомячка (рис.3, 0). Это позволило нам цродполокить, что, ш-пзрвых, для выявления тонких молекулярных изменений 2-3-недельного "стационарного старения" уже недостаточно (необходим 5-6 недель), а во-вторых, что, чем больше скорость пролиферации клеток исследуемой культуры (у клеток китайского хомячка она гораздо выае, чем у других изученных iuiotok), тем. более вырагшш возшпсащие в них. при ограничении пролиферации "возрастные" изменения.

Хотелось бы так® отмотать следующее. Коз(1ф£циочт п14С/%", конечно, не монет слузить точным показателем абсолютного количества сшивок ДНК-белок в изучаемых клетках, ибо он в значительной степени зависит от конкретных условий данного эксперимента. Только его увеличение или уменьшение позволяют сделать вывод о возникновении иди исчезновении', соответственно, ковалентпих связей мевду молекулами ДНК и белков. Тем не менее, при обеспечении одинаковых концентраций меченых предшественников, объемов среда роста и количества посахянных во флакон клеток мокно провести ориентировочную сравнительную оценку количества спонтанных сшивок ДНК-белек в клетках разных культур. Так как опыты на нормальных эмбриональных фибробластах и фибробластах больной пигментной ксеродэрмой ставились практически идентично, оценка величин коэффициента "14С/%" (ось ордашат на рис.3, в,г) дала нем возможность предположить, что во втором случае этот показатель изначально выше а в процессе культивирования изменяется о меньшей степени. Несомненно, что этот феномен нуждается- в дальнейшем исследовании.

Результата целого ряда работ (обзор данных см. Ванюшин, 1933; ?loclin, 1984; Goldstein, HimooM.er Reis, 1934; Holliday, 1985) позболпы* полагать, что содсрг:а™е Е^'стилцитозгн!; э ' ДНК суцествопно изменяется в процьссе развития и старения организмов. Енла получены данные (Романенко п др., 1981) о том, что'длительное введение мышам героиротектора-антпоксиданта эпигида приводит к увеличения сппглщогося с возрастом содеркапия в ДНК Б-метилцитозпна. Что *е капается культивируемых клеток, то нам известно очень мало раоот-, в, котошх была сделана попытка проанализировать возмокнук, взаимосвязь изменений уровня метилирования со старением in vitro. Авторы одной из этих работ (Wilson, Jones, -198?.) показали, что с увеличением числа пройденных пассажей содержание 5-метилцптознна в ДНК нормальных диплоидных клеток снижается,^а в ДНК клеток "бессмертных" линий

- 18 -

остается веизыашшм. Сходные данвиа бита подучош с другшл автораыз (Falraoather et al., 1987), шявакзтя спвклша содзраания в ДНК Бнгетилцатозина при стареюш 1л vitro дшшшдшд ф^бробластов человека итеьы? imo-5. Представляется пнторослпы танго тот факт, что импульсное воздействие па клешей иао-5 еяалоггш цнтознна, 6-озацптцдшюц шш б-азадазоксгщшэдзшц, шзиващша снагениэ уровня мзтилзрэвсяия ДШ1, приводит г» уизпьпвнш) свойственного отел клеткол потоицзала У1Ш (Fairsзаttor ot al., 1987t Hollidajr, 1935, 1985).

1'л изучплп уровень нотшвтроваш;я ДНК ri_к^льтлгар^угпгл'г

китайского хомячка и человека через разное время., после__по^эсою,

Т.о. на разшд стадиях "стмг.юнаршго старантлл".

Получонша данные прздстевлзш в таб*.2. Вадао, им относительное содорглнлз Б-штялцитоззша «зелэтся о "возрастем" только у глоток китайского . Статистически достоезр^э

(Г<0.05) различия 0или шявлзпи иегду 3- н п-дазвк^'л:, и TcUZCj поеду 3- л 17-даовшаш китшя. Отсутствию глрагэпши ЕзгшюдаЗ "хсасуцэгося" содержания ГЦ-пар в ДНК "озьоллот полагать, чю to врзыя прзбцвшм тютек з стацгопарясй фззэ но происходи? сусзствешого ишяешш радаоьктивносга в штохоадраяшуа ДЖ с наш, чом у ядорвоа ДНХ, "ка^усЕЛся" составом и/Еяи содэрзанпги Б-иэтилцитозина.

То, что уровсль цатиетровднпя ДНК ¡::шг.отсл только пр "стационарной старошш" обладагццх глсокоЛ пралг^орэтЕиоН активность» клеток китсЗскаго хомячка, объяснится, на нгл взгляд, слэдущшл образом. Цатилпровашга ДНК у аукараот ивдяэ тел, ш-видаиому, одним из механизмов регуляшш экспрзсски roaos и клеточной дпйорэнцирошш (Кудрянова, Вашшп, 1976; Вангшш, 1 £03). В свгзи с опзл уровень иэтшшрования ДНК долгзн ^ущзствашо гзнлться только при сильно вираишшх регуляторнчх цзуонашшх. Шэнпо такое изшшшо претерпевай клл-ки китайского хс.'-шчка, шреходящпо из лог-фззи ("возраст" 3 сут), где скорость us проя&Теращш очень высока, в стационарную фаз у, гдэ ода практически падает до нуля. В случае других культур это г шропад оштаителько конъвэ шраази в силу изначально гораздо Солаа шшкоИ скорости пролиферации клеток. Вон ,ю:зю, что прп значительно^ гвэлзгчонка времени "стационарного старания" отих ..латок ш 6j и в 1Ш оoaej/uiTai егшшдо уровня v. тилнровшшй ДНК, сходазз с паблвдаомш при старания in vivo (Валкая, 1953) пли In vitro (Wileon, Joribc, 19335 Faliwcathor ot al., 19S7). 1ЙШ.Ш СЛОБШЛ,

Гоблгца 2. Уровень гатшйроваштя ДНК в "стационарно стзрокцгос" культивируемых клетках

Тш клеток "Возраст" культур!, сут Уровень штилл-ровзния ( + оппбка среднего) "Каяуцоося" содерза-нпе ГЦ=пар ( + ояибка среднего)

Клетка китайского хомячка 3 6 11 17 4.37 + 0.45 3.61 + 0.19 3.2G + О.СЗ 3.29 + 0.13 41.94 + 0.88 '2.60 + 0.23 40.75 + 0.22 42.38 ± 0.41

Ембрпонелышь диплоидные фи-бробласти чело-сока 3 6 - 11 3.8S + 0.21 3.91 + 0.0S 4.14 + 0.11 45.82 + О.БЗ 44.76 + 0.24 43.07 + 0.13

Фибробластн больной пигментной ксо-родермой G 10 15 4.38 + 0.21 3.85 + 0.10 4.24 + 0.35 44.63 + 0.52 45.81 + 0.33 44.26 + 1.06

ситуация, суля по всему, очень сходна с той, которая выявилась nprt исследовании изменений количества список ДНК-белок в "стацпонарпо старзщчх" клетках.

После обпарутюшм около 15 лет наза^ фэпомэпа СХО (Бголина, ¡Захаров, 1972; 1л tt, 1973) появился цмый ряд работ, посвящоттнх нз,гчешта возможных возрастных изменений частот!! ksic спонтанных, таге я индуцированных разлитыми агептага СХО (краткий обзоп данных см. Won et al., 1983). Однако результаты этих исследований достаточно противоречивы. Особенно ото касается; спонтанного уровня СХО. Имеются сообщения о ого погатаншп (Лекава, Читашвилп, 1982) п шипении (ДеОова, 1934; Лильп, 1984; Попова и др., 19G2; Яковепко, Платонова, 1979; Coh,. 1931; Schmidt, Sanger, 1931) о возрастом, a такяэ об отсутствий'.'изменений этого показателя при старении (Hédnor et al., 1-90'2; '.Schngide.r, Smith, 1931). Что ГЭ касается уровня щдущфецз^нйнх" СХО, то ir:;a>1:;op й. его сотрудники показала, что ой; .¿йзшается' при старепйп. KS!.:^in;-.V.t'tro, тяк и in vivo (ПакапШй -bV 'ail'.,, 1900;. Sóhnaidéí,'. fliltón| 1979). В TO re время автора?й 'было йтвМво' . увоЩчйш;о уровня

гяяушфовшпгп clco с возрастом о клетках костного тобгя гттгтзй (Дплъп, 1934) к jtífj?joix£TTax чзловека (Дебовэ, '1904).

Тшаг! образец, даншэ. об изменениях уровня СХО при стор-этда

очень противоречивы. Одной из причин втого является, по-ввдшоцу, (значительная нектдитшдуальвая вариабельность по уровня спонтанных и индуцированных СХО (Дебова, 1934). Крона того, больсой разброс „анных в вышеуказанных работах ыогэт быть связан с тем, что пссладоваыия проводились, как правило, на чрезвычайно шодаородооД 1£латочной популяции. В частности, наиболее часто нсслодуеша лимфоциты периферической крови очень сально отличается друг от друга по "возрасту".

В связи с в пи нам представлялось целесообразный провести исследования уровня СТО ь культивируемых шютках на р азных стадиях ;гх "стационарного старо¡тя". Данная цодольная система позволяет поставить больаув часть клеток изучаемой популяции в практически одинаковые условия, синхронизировав как ыопекулярные, так в ЦЕТогеиетическиа изменения в них с пошцьв "барьера" в вида искусственного ограничения пролифорации. При етоц степень такого ограничения во иного раз шею той, которая достигается в уславши 1п у1то (по крайней царе, для тех клеток, на которых обычно проводятся исследования СХО: лимфоцитов периферической крова, клеток костного шзга, клеток селезенки).

Результаты аксперакшто, проведенного по схсиэ 1, представлюцы в табл.3. Видно, что о увеличением "возраста" глоток уровень спонтанных СХО непроршшо растет (регрессия оначгаа, р<0.05).

Таблица 3. Уровень СХО в кулъташируоьых клотпах китайского хоаячка через различное время поело посева

Время культиви- Число СХО па клетку* рования, сут __

Споыташшо Шщуццроврчныо

твофосфаьшдоа

, 2 6.82 + 0.Б4 36.88 + 1 .Ьо

б 7.33+0.79 , 49.70 + 2.69

16 • 8.04 + 0.63 47.64 + 2.67

^Указаны 95$=ше доварителыше интервалы. Достоверность различий: 1) в спонтанном уровне СХО - ыевду 2= и 1~=суточщуи клетками (р=0.004); 2) в уровне индуцированных СХО - уезду

2= и Ь=суточнышт (р^1.1 'Ю'9), а такыэ мазду 2= и 1б=суточ-

шмн (р-1.8'10"9) метками

Уровень та СХО, пндуцироваппих тиофосфагшдом, от 2- до Б-дневного "возраста" резко увеличивается <~ на 35S), а "атем практически пэ гэняется до 15-дневного "возраста". Ш предполоЕИлн, что отсутствие разницы в уровне СХО, иидуцировашшх тиофосфамидом, t-здду 5- и 15-ДП9ИППЛ1 клэтпвщ свидетельствует сиз отсутствии шг.гзпошй! активности enere?,ы репарации ДНК, функционирование котороГ. проявляется в виде СХО, в процессе "стационарного старения". Резкое га увеличение этого показателя от 2- до Б-дневного "возраста", па пая взгляд, связано со след^лшм обстоятельством. Клопа! подвергали воздействию мутагена в точение 2-1 ч. В то ез время продолжительность '-ле точного цикла использованных в работе клеток составляет 16 ч. Тагам образом, в случае активно деляпихся клеток (2-даевные культуры) часть пндуцироваппах повуеадопна успевает до введения БДУ npctTii чзрзз рзалнкацпз ДНК, и поэтому СХО, к которым эти говрекдвния приводят.-(а СХО, по всой видимости, образуются тленно вследствие поврогздепля ДНК - Eolcnon, Cobros, 1975), не ВЫЯВЛЯЮТСЯ при шсроскопировании. В случео яо 5-дневпнх культур, состоянии практически па юо* из покоящихся хслзток, почти псо индуцировашшо порроцдопия-"прэд^естЕ9шитки СХО4 проходят черзз репликации ДНК в присутствии БДУ (после стимуляции клеток к долошпо при пересеве) и реализуются в гади?шв при гафоскоплровапкл СХО. Частично ото полотепи'" относится и к дзщ*п<, касатцпмс>» уровня «топтанных СХО.

Для проперта этого прэдполопзйия бил проведен окспорпшнт по схеме 3, в котором врегш действия мутагена было достаточно мало по сравнению с длггольностьо юиточпого цикла. Кроме того, в этом случае Сило увеличено вреил "стационарного старения" для уточнения характера "позрпепшх* измонений количества как спонтанных, так и птятанровзйгшх СХО.

Порэд этим зкеперпмэптем ш провели вспомогательный ошт (схема 2), в котором клэткп фиксировали через 36, 40 и 44 ч после пзрэсева с БДУ. В опыте по схешэ 1, когда клетки фиксировали черзз 3S ч послэ пересева с БДУ, подсчет числа СХО у 5-дпевных и, в особенности, 15-дневпых клеток оказался довольно трудооютш, так как липь не'болЬпая" часть клеток успевала пройти 2 цикла рзл~нкации в присутств5га' БДУ и имэлз дифференциально окрашенные сзстрннсгаю хрег'атиди. Поэтов целесообразно .фиксировать клзтет па болзе поздних ¿роках. Р^спорикепт по схеме Z и был поставлен с целью подбора. удобных сроков фиксации (для клеток, "возраст" которых составляет 5 и более дней) и выяснения вопроса о том, влияет ли

время фиксации на получаемые значения уровня С20 б клетках.

Приведенные в табл.4 результаты вспомогательного опыта по садка 2, во-первых, позволили нам заключить, что боличшш уровня СХО, определяемые через 35 п 44 ч ьосле поросева, во различаются ыззду собой (первая строка таблицы), а во-вторых, подтвердили вывод о возрастании частоты спонтанных СХО при "стационарном старанаа" клеток, сделанный на основании дохших мсспзршонта по схеме 1 (рзгрессия значима, р=0.026).

Результаты ' вкспоржэн^а пи схе:.:э 3 представлены на рг.с.4. Вздно, что по ыэре увеличения "возраста" клеток спонтанный уроЕэпь СХО (рис.4, а) непрерывно растет (от 6.78 для 2-даевных до 13.9 для 23-даавшх клеток, регрессия бысэко значима - р=1.64'1 о"6). Уизпьпэшю времена воздействия на клатка алкша^ увдеы агоитоы с 24 до 1 ч, как мы и полагали, привело к нсчоэеовзшй разшщц в уровпз индуцированных СХО мэзду 2- и б-доовньш клаткеыы. Хотя уваличешэ Времени эксперимента до 23 сут дало вез ге возг^оглость выявить некоторое возрастание отого показателя в процзссо "стационарного старонп" (регрессия значима, р=о.ои5), необходшао заметить, что количественно ото увеличение соответствует нззлэнзшпз уровня спонтанных СХО (рис.4, б). Видно, что лшпш рагроссш, характеризующие рост уровня спонтанных в индуцированных СХО, иду? практически параллельно. Это позволяет полагать, что па ограничение пролкфэ рации само по сабо, т "старзшг" киток в

Таблица 4. Изузнешю уровня спонтанных СХО в процесса "стационарного старания" кульгавггртошх платок китайского гоглгаса (фшссацил через 44 ч посла пэросова с ДДУ, угхзгяи 93&-ШЮ доверительные интервала)

"Возраст" клеток, сут

Число спонтанных СХО па клэтку

Первый флакон

Второй флакон

Срэдазо

2 б 13

6.04 + 1.18 6.92 ± 1.05 7.84 -ь 0.76

в.00 + 0.89* 7.24 + 1.30 7.32 + 1.36

6.Ш + 0.74 7.03 1 0.80 7.68 + 0.76

^Списания чорзо 33 п шеи пзросава.с ЕДУ

стационарной фазе роста не приводят к изменении качества СЮ, индуцированных 1-часовым воздействием тиофосфашдол. Эти далшэ согласуются с результата?®! рабсгы (Дебова, ъа4), проведенной па лш.5фоцитах периферической крова новорондепшх п взрослых лвдэЯ (большая выборка). В ней было показано, что уровень СХО в клетках» оцениваемый посла их обработки тиофосфашдом ила штьмлцшюм С, увеличивается с возрасте?! донора. Однако при втом разница кэзду

" -*- "V *%! Ш.-Г V Ч О 10 СЫ

Врсш! пудьтшкфОЕштя клеток до пересева о ЕДУ, 07т

Рпс.4. Зависимость уровня спонтанных (а) ииндуцированных (б) СХО от "возраста" культивируемых клеток китайского хомячка. Указаны 95*-ны9 доверительные интервалы

уровнями спонтанных и индуцированных СХО от возраста практически не зависит, то.есть количество "собственно индуцированных" СХО вз иеняется при старении.

йухно отметить, что при оценке уровня СХО (как спонтанных, тек - ~гтж~тп*уут>атттгг) и я-тетя клетках (схема 3) были объединены данные, полученные при фиксации через 36 и 44 ч после пересева о ЦДУ (в последнем случае было проанализировано всего 22 клетки на два флакона для спонтанных СХО я 8 клеток одного флакона - для индуцированных СХО). Это оказалось возможным, ибо, как и в опыте го схеме 2, разницы «еаду этими данными не было обнаружено.

Одной из характерных черт клеток старого организма является их сшшэнная прояиферативнвя активность. В частности, было п.казаво, что лвдфоциты пврп$ерачвско8 крова пржилнх людей медленнее входят В цикл, у них растянут Оу , в* а1., 1979). В другой

работе при помос; ^1»'г>1тиальноЯ окрасил, с' ЕДУ Сило обняпугано, что в, 'люф.'кдтог» молодых ппдивидбв - число клеток,

Тпйдг'дп Б. Влняшхз "стационарного старошш" Еультавзруашх клаток китайского хшячка на скорость их продазгонЕЯ по поело сислулящш к дэдзшга (о кгажсы сг.сгор^мзпто баю проанализировано по 2 флакона квелого "Бозраста"; просчптшюлз со 160 клеток но фпакои)

ЗЛСШрИИЗНТ Врагш от иомзнта пересева с БДУ до ыошнта фиксации, ч "Возраст" Кос№щкоцт П 1ШЭТ0К. сут озз нута- с 1зутагспо.м гена

По схеиэ 1 . 33 ' 2 Б 1Б 1.81*'*** 1.61. 1.29 1.78 1.2" 1.61

/ . ' '•>;'-• 33 2 Б 13 1.76 1.32 1.29 -

Па схом 2 40 4 " 2 Б 13 2.10 1.60 1.71 '—

.■'.., '' > ' 44 - '' 2 Б 13. 2.41** 1.70 1.78 —

По схеиз 3 • '44 ' 2 Б 9 1Р 20 23 2.79 1.85 2.23 1.55 1.93 1.07 2.4/ 1.89 2.08 1.СЗ 1.0Э 1.БЭ

*Анашзнровагд 3 флакона

^Анализировала 1 флшссш " ***Для одного из фзакосов просчитана 110 ком::

: щшздпшх са 72 ч одно долзниз, составдлэт два дзлзппя - 242, три долепил н солзо • €83. Для клауов старых лигой от сэл^пши СССТПВШШ зо;;, 42© Н 28«, СООТБОТСТВЗЩО (Кскз1сг, 1978). По ко . только возраст оргеназ^-^озянна", но с срсгля пробивашя илзтоп а лстояяш со?"м (обзор дашшх си. Епифанова и др., 1933) прапорцй нальни стонет их углуолэтл ь к-фазу кдзточюго щзиа, что шро^затся в удешзшт прорзплзкативдого периода послз

стимуляция к дэлзшпэ.

В табл.б привздоии результат псхего исслэдопаппп шптшптд

(которуп характеризует корИяцпопт II) посла пзрзссвэ с БДУ. Набллдаотся явная тенденция к cmtromm пэличиш П прл "стшгопарпом стсронип", особенно от 2- до б-длзв novo "возраста". Интересно ттгя отглзтлть, что мзпду коптролышш п сОр"ботсгаи::л мутагеном влоткгях одного "возраста" пот рззкоП розгащц по кооФГ-ншопту П. Это позволило сдолать вывод, что тоо Георгия в нспользопзтюЯ дозе ко глзотает знячитольпо!! задержи продстг-готш г^зтои по циклу. Более того, в слу^пэ "стпрж" (15-дппшх. lia сксспрлпнта по cxcr-a 1 п гз-дгюпгш га zrtcvopcronta по охст 3) xumotc дяго наблюдалось некоторое уг.эл:гтццч скороси ia кдхшХоршш (послэ стимуляции к дожита) под рхпялрси нутвгоиа. К co:n;:oinm, недостаток дапгопс но иозголяет ед-жть к.т>соЛ-л::бз опрздолзпша илрл о сути- отого Фо;га;:знп, с: •л.-.отодьст&уя .-»тчь о и?сОхо;гл'0стл ого, долшсСгпх геедо дошита. ГСКС1 OÎpCC'!, no.4j"!OI!i:'M ncni.. рзоультзтч ИОДТЕОрГДО!:? то? что "с^шюпйрнэ старо! сиз" клетки (ш толк» пор? ильина, ко :» тртяс.Тор(1рог«шчл), как и глот,m, стярзг'пп in vivo, со грзгловзм углубляются в состояние покоя.

: IV. КПИЕША РЛ£"Я07Ш!Я КЛЕТОК Ц СТАРШИЕ .

ïcmcaïîi'Ji рога кудмивиру.-"!«. г.-.зток под шаятокн ¡•xï:ux -¡.ьктсрсв г.озьолгет сделз*ь оардзлзпшю вшзод.1 сб r.n<to сзпх :и:гос:, уелсвпЛ их сугрствссош. C:io';;:sojiiny}j in~j)of"-;iir-j кс-лю иолркпь я при ершяттэлдои лс;лодовзк::л р-з-г.л :;:а г.;лтс::. С-5 отел спидотельстлуот

'Л рлд nv:.c.:::::.:: догггпх. В частности,

... ^'-''.U . .. - s/j : , ^ 4'J 4VVJ ХЧ- Л V o-j TiU 'iVt J диич/^у^

rjxr^^r;: ГлЗуэЗлосгоз 1злоЕока, уел :.;:;сз г'рутез гпзллотсл яртося г;: ¡.оста in vitro п тон пзпьез высота "пг.зз'о"', г.ерзктерпзукзпл ::ас:азшун плотность }сло точной шпулл^гл» ::а стсЗ крсоЛ {Schnoidsr, C.-sith, 1931). Сходдиэ взимижз Сет гзявлопя Я прл ;.:эуч31вгл старзппл in vitro, то есть уво.тз:;::.! плела пзссггеЯ, з.'орчзлкпг"! кулмшифзгс?к;.а клэткё:" ^sssola ofc al., lî'Ji; L'acioira-Coolho, 1977; Ï'aoioira-Coollio ci cl., 1975; Chhnhi ot al., 1500). К ссг.элошш, в больглшотеэ тгт satfox. автора ¿ефльзуст Еырзг»ппо "плотность клогок В СОСТО.ГТГЛ СО"СПу~ОГО Г'рЙОСЛОЯ", которсо из ПОЗЕОЛЛЗТ судить О тс:,!, -:,.'iTO . é ^¿cTE3Tiwa«fcj7a пгкзряла в работе, ибо лэтгпх грптзрйЬз/

"сомкнутости" клеток но существует. Ш предпочитаем использовать ЕыраЕзние "насыщающая плотность клеточной культуры", вкладывая в него следующий сшсл: насицавдая плот. 'сть - ато такая плотность клеток в культуре, при которой полностью прекращается их равыноЕэние. При ©том надо заметить, что волггчина ое для разнш; клзток liozeT очень сильно различаться и определяется, по-вадашиу, тонкими иахашзшши иэхаслаточных контактов (Конев, Цасуль, 1977}.

В связи с вшесказаннш интересны такса дашшз о той, что шкоторце стероидные горыонч, уволичиващие продолжительность шзни культивируемых диплоидных фибробластов человека, шзававт взшнения кинэтшш роста этих клеток, свидетельствущие об их "01:0л0еэшш" (Kondo ot al., 19331 liaoieirs-Coolho, 1966). Itpoia того, хотелось ou отавтить, что в некоторых случаях изиепзпнз юшатшш роста in vitro глоток человека свлдотолъствуот о паличиа у пх донора определенных заболзвахшй а патологических процессов (Orîmaald et ai., 1933).

К сосалешш, до сих пор, насколько нш известно, из сусэствует ; штода количественной оцешаг изменений кинетики роста культивируешх 1слзтох. Зкспэршлзнты такого рода ставятся, каа правило, следувдим образом.

В насколько куль-гавациошшх флаконов аасовазтся одинаковой количество меток, о затеи чароз определенные интервалы врашпа 1ЕЛЭТ1Ш одного или нескольких флаконов сшаазотся со стокла н с поглодью специального счетчика (Coulter Counter) либо обычных icsiiop Горлева оценивается их количество па флакоя ела па единицу площади. В результате исследователь получает набор окспериценталышх точек, ошсывахцах рост числа клеток со фшазез со временем. Соединяя ото точка, получаю-? лсшвую кривую, позволяющую в первом приблиЕошш судить о кинетика роста Ессладуоиой клоточной попултщз. Точные выводы затруднены, пбо по -ч такой ломаной кривой очень слоено оценит') как скорость разщюгония . клзток в лог-фазе, так п насщащую плотность культура. ,. Использование опрэдоленных цатеизтичесюз иэтодов позволяет "сгладить" оту кривую. Однако ншл пз известны работы, в которых были бы разработаии точные способы построения ?аких кривых, обаспачиващаэ количественную, orimty различных киштичэскях токазотолэй клеточной {су«.ьтуры, в частности, крут.:зпы кривой роста и уровня "плато" на ней. В связи с -mm ш попытались разработать иоде ль. позволяадув решать эту задачу о достаточной г^йпаю-э • достоверности, ■ .' .

Для аппроксимации подученных данных использовали уравнение лзгкстяческой кривой Вархалста-Шрла (Мэрда, 1979; Сшя, 1970), в интегральной фор?.я имеет/за сдэдущпй вид:

Г_ • t

И0 • К * в а

nt ---— . (2)

* t

К - Н0 • (1 - в и )

ГДЗ nt - ЧПСЛЗЕНОСТЬ раз?Ш01ШЕЦ9ЙСЯ популяции в иомзпт времени t;

II- - численность популяции а нулевой цоизнт вре«зпп; г_ -0 • ■ <ш; 1 и ыгповьлная роадаеиость (г), определяемая как —-— •--, пра

- t

гплой плотности поьулящш (то есть сколько возможное значрнг.0 з?); & - внсота "плато" па кршмЗ роста популяции.

Это уравнение с пзкоторцма оговор:ссг.а используется анализа чакшсцерностей роста популяций илекошггашпх, а токгэ простейших а Сахтэрзй Шэрдя, 1/79; Сши, 1970).

D связи с том, что далеко но все посагэшшэ во флакон клоткя способна пршсрапиться п начать рзэшютгзться (Usuro, 1974), tsi оспзпилз в уравнэшш (2) aQ (галичество посагзшшх клеток) па п1 -число юзток, пршфэштзяхея к флакону через 24 ч посла посева. О связи с этой все кривые роста начинаются пнэпло с 24-часовой точка. ; ■

Вводя в 3FJ аксЕзркйпталыша ■ дашше, нэтодсн паимэпьвпп квадратов получала оцешш всох трах параязтров (1Ц, К а ги), пзобходпшх для построения кинетических крнвнх о помощью графопостроителя ЭШ. Попнткп подбора параметров к и гщ спэдэшш в ЭШ определенного значения Щ, установленного э слсдаргззопта, показали, что такой способ ухудшает- ссютветстгяэ

—- -■"■• «ч • » •ли»»«««,*« п*»т*лчиямгтпт tnm *лптп|

11* »W1J IfcWlMWM MUMbtw и»т . .......ч «Ч —• . . .

Адекватность урзвнешш (2) оценивала с пс'кязьо.шгода еяалттза остатков (Дрэйтар, Сют, 1973). ;

IIa рзс.5 прэдетавлеиц дашшз, полученные при пзучешя кинетики роста культпшруеиах клеток. Сказалось, что расчетам кшштпчеекгз щатэ со всох случаям (различила клоткп и разлзчшэ культивацпопшэ флакона) адекватно списывает зкегоригентальпгр рззультаты (р>0.05). В связи с этим р дальнейших ехсперичонтах гл1 всегда шрезивадц кдатки только в пэгещшштовчх фла..онах, ■ | Дая того, чтобы убедиться, что уравнен ia (2) дейстаг, лЬй> ■ vazov бить использовано дая тс мза кинотеки ростп iuotts

повавпсига от ИХ Пр'ЛрОДЫ и условий культнплровашш, ш с поглоппло ипадого-даГроваго гргфзчзского преобразователя "пр goGíi DieiUscr" проанализировала дашш другпз авторов, пссп^тзсл

tffVf - „ Uo

Рас.Б.

Кппоппса роста культпвя-руогдхх клзток. а - клзт-кп китайского хклпка, шреэдваошз со флзкоггах Ксррсля пло^ад.» ПО ci:2; О - ТО ЕО МОТКИ,

пзаогпз в пошп^Г-ГЛЕа-Ei:;t флзкош«; в - s;r5pc?-Еа."1я:э дпялоидппо Сласгл чзловска, «цр«^:-есо^з в гашпсштЕгх длакоиах

со::::;; i^vncsp;smz клетс:;. Г-лзлизу С:тгп г^зхтщ-:!

рзеультпп!, ' колучошйе, • lin ; Д^ХЗПСЕГ: ЛЗГЗ'ПГ;;:

iIr:3po6;.:.c¡iiX человека "(Koiido bV;'cl.;, 1933), t::5pr.on.mtt7X гтрттлк ([лГрзСг.ззта:: (Haaioira-Coellio c.t" ''¿Г.,. .1975), ГЛЛСГОггтетаТ' вдаткох человзкз (Orírnbllá, 1933), cycrcrrr: гк^оцвтвх (Adolfo -ot ' cl^ ; в Те::':: г л

п:.з::арготг-;зсип: клзткпх Aclioieplaric. láiülcrli Ql&ïyzzrrm я jp. 1933). Оказалось, что сэ созх 'случаях уроктспо' (2}".адзгагьтгл СПГ.СЦЕ20Т rj.*ji3xin;y роста • клзхоп (р>0.05). . Ашт^'й.шзфоваг. :;::с!*ор;г;зпгел1ш;о дшпшз с помогая nïoro уравнения, ш в капцзг слуппо юдучаом шо.ио опрэдодзшго опглзщя пЬрзЛтра v.. (reрз:;торпзую53го способность клеточкой вя&клцгй х: раз5'~Згз1КЬ :: онродолякуго крутизну ростовой кривой) и пзр^.:зтра у (опрздзляицого шеоту "плато" аа отой крлЕСй). -Зхо идззэлпзт просодать jtü осаово анализа bkiieçj роста' тотсоэ lucracîioifipçr срзьАешю разшх газточшх пащулщй;'кЕ1С лз ааростг .рз:-.:.:::огз±:г;г tfik'îi îij паст^з^щзй плотности iieotoï». / ;• • • / ..:1Ьобходп5о ïœsso отстать., '.что .пшо&оойшш йрог^глйЬй

подола ддл отсшшя ютзетш роста культппзруошх клзток позваллот получить пзкоюрую ДОПОЛППТЗЛЬЩГО ПОЛЭЗНуП ЗЕфОриВДО. Каи уггз ухрожалэсь парсмэтр гп прэдставляот собоЛ шюпзынув роздэсцость при лалоЗ плотпостя популист. Пяпз сяовсгл, при малой шюхсостп

ЕГЗТСП

(П. 1 -----1— • -----(3)

йЪ 1Ц

Пусть п гс"0!;т врэизпи ^ число клэтоз равно щ, а в ютит грг-ззп ^ оно составлпзт . Тогда, штогрзруя в тлгх прэдзлзх урагпэппэ (3), получим

Гп • (хг - Ц) - 1а 2 Еирапэпг.-э - ^ прэдставляот собой пэ что пноа, кап время улвозсяя клзточпоЛ популяция (Туда). Тшст обрззоу,

1п 2

ТУДВ- — а

Веля Си П шпулщш! долились псо кхзтт, то Л/ПТвЛЬПОСТЬ кгзтотного шплз (?вд) била Си рант Туда. Однако,'кпе нэвэотшэ, го пса злака, Л2гэ.пртярошпгпэся к юсорхпостя роста, способны п ДЭЛ31СТ (Г'аиго, 1974). ПОЗТСМУ и 0СГ,2!1 случсэ будзт СПраЕОДЛПЕЗ Оораулз: Д ;

гп -Над .'■■-V 1а---

а . ; Тэд-----, и)

Гп

г.'.э У - сбг.оэ число клэтек, а Пвд - число нэдэ.гтгпел клэтох в гсгзточноЗ популяция. Еслз пары;<этр Т1£Ц г.звэсгэн, ш кругах скспзргз^нтоп, пропэдзппих, ПСПр'.ГУЭр, ' с пешцкэ игя Ц'лггрягорюя !гпгссгс!га (АЬгИог о* а1., 1975)» со гояшяэтея • ео.?,'.*о.'2:ость оцопит{» окмслгатахсэ содоряаго:? пэлэлятдхся аг.зт з гсолэдув!аЗ г^ультурз. Прообразовав уравнзнс? (4). калуга:

Если га для данной культуры известна величина -, то тот

Сыть решена обратная вадача - вычисление

Таким образом, полученные нами данные позволяют полагать, что предложенная модель адекватно описывает кинетику роста сашх разных культивируемых клеток и обеспечивает возможность оценка как времени УКП, так и относительного содергания в этой популяции неделящихся клеток. "

Разработав вышеописанную модель, названную ваш клеточно-кинетической. ш, естественно, поставила перед собой задачу испытания на неб некоторых факторов, ;лтересных в геронтологическоы отношении. Основываясь ва фактах, пзлогенных в начале данного раздела, ш предположили, что воздайствшз гепопротекторами и геропрошторани должно сдвигать параметры, определящие кинетику роста клеточной популяции (по-видишцу, главным образом еь шсадавдую плотность), в сторону влечений, свойственных, соответственно, "колодам" а "старым"-«'клеткам. Ваш so математический аппарат должен был обесточить воздашэсть количественной оценки таких сдвигов. В пэрвув очередь ш проанализировали гшала-издученЕЭ. продставлявдэо собо2 ' классический прдоер геропроштора (Валенчик, 1970; Комфорт, 19575 Кутлахыэдов, 1986; Двиб, 1980; Потапенко, Акгфьов, isoi j

№0.6. Влияние гамма-излучения, на кийетшсу роста кУльтивируешх кг лток китайского юиячка • (1 - - контроль; -г - обдученю в дозе 2Б0_ рад; -з- облученив в дозе БОО.род)' •

Подученные результаты представлены па рис.6. Видно, что по поре увеличения дозы облучения как крутизна кривой роста, так и высота "плато" на вей снизаются. Об этом rte свидетельствуют и еначения рассчитанных для каздого графика параметров гш и К. Оказалось, что оба показателя практически линейно зависят от досц облучения (R2 « 0.979 для к; R2 « 0.S99 ДЛЯ г>и).

Цэдй ряд имещихся дашшх позволяет полагать, что ионнз1..зуюг;эо пздучеппа ведет себя как гаропромотор, повреадая ДНК облучаешх организмов (Потапешсо, Ашгфьев, »931; Потапенко, 1984). Если это 1зрэдГСсЛс,;:енио верно, то и другие ДНК-трошше агента долшш ускорять старепиа. Было установлено (Alexander, 1966), что нокоторио химические мутагены действительно вызывают сокращунпе продолжительности гшзни окспарнментальных епботшх. Однако очень сильный иутагэн, шнофункциональный алкилирушси-i агеит ч'тплмотансульфопат, ¡.е оказывает в этом отношении ешгзтного действия (Alexander, 1966). В отой связи представлялось шггераснш шлепать, как влияет на кинетику роста культшгпруршх клеток ДГСк-троппое хспческоэ собдзнзнпз.

Мы пссладоваяя нз папэй клеточно-кшгатпческой гадолз нзвэстшгз fumrnpyirpift агент ттоДосфагад. На ряс.7 представлены результат

Bpc-ti Еулмявпровшпш, оут

П:с.7. Влиянгэ краткоьренэш: ж> воздействия таофосфаыпдмд иа юшетпку роста культивируемых клеток китайского хомячка (1 - контроль; 2-ю мкг/ил тпофосфавдда; 3 - 12.г мкг/мл таофосфакнда; 4-15 («г/мл тиофосфшида)

атого опита. Оказалось, что и в о'гом случеэ высота "плато" 1й пряной роста попппаатся под дайствнем изучаемого „актора, причем

величина показателя К опять-таки практически линейно зависим сгг концентрации тиофосфашда в среда роста (й2 •» 0.99). Однако для показателя га такой хорошей линейной зависимости "доза-ефЕокт" получено не было №2 - 0.21). Величины гга составили 1.29, 1.65, 0.77 и о.до для контроля и концентраций тиофосфамада ю, 12.5 п 15 нкгЛш, соответственно. Таким образом, в атом случае да монотонность изменения параметра гп с увеличением дозы воздействия отсутствовала. В связи с этим был сдзлаы вывод о топ, что, хотя тиофосфамяд и являэтся геропроыотором (это слэдуот ЕЗ факта пошшэпия высоты "плато" па кривой роста клоток), одншсо изхашз.^ ого действия слачительпо отличается от кэханизма доЛствпя гагаа-излучения. К такому ю выводу ранее прпзлэл и Ы.и.Еплзпчп:: (1970), анализировавший "витбрэвисный" (то ость проявляемся с укорочении продолютольности шзпи) вффект химических иу таганов.

Установив, что горопромотори действительно понижают шсоту "плато" по кривой роста культшнзруешх клоток, r-.ni задались целы) испытать на папой кодвльпой систеиэ какой-либо езезсгсцЗ горонротоктор. Выбор остановили на анткоксиданте шггп'гл (хлоргшгопте 2-аитл-б-?.сттш1-а-оксяп{фажпа), который, как йжо' показано в шюгочислошшх исследованиях'(Обухова, Заануоль, 1934), достоверно замедляет старение окспзрппптальшхх 1цшотных.

Из дошшх, продстсвлзнных па рис.8, видно, что присутстЕЗЭ с сродо роста опигпда приводит к подъему • (как показал соотБОтотвущио расчеты, статистически достоверно:^) "плато" ез

Рис.О. В таяние эппгпда на кинетику роста эмбриональных диплоидных фибробластов человека. 1 - контроль («); 2 - Ц

эппгпда (+ ); 3 10"Т «.эпигида (0)

кривой роста фзбробластов человека, причем до одинаковой велнчшш при обеих попользованных концентрациях препарата.

Сходные результаты были наш получены и при исследовании слияния опигнда на кинетику ' роста прокариотических клеток АсЬо1ер1агжа 1а1(ЦаиИ (рис.9). Правда, в последнем случае егшроксимац.ш не производили, ибо экспериментальные точ]ш п боз этого позволяли сделать вывод о различии иеаду контролем п опытом.

Таким образом, в обоих случаях налицо было "пролифератавное оволосение" клеток под влияниям епигида. Правда, если для горопромоторов нами была выявлена линейная зависимость изменения шсоты "плата" от дозы воздействия, то в случае геропротекторз ш

О 30 100

"Возраст" культуры,ч

Рпо.Э.

Запси.гасть оптической плот поста (а) суспензионной культуры АоЬо1вр1авта 1а1<1-1ад11, о такге содер-шния в ней белка (б) п ДНК (в) от врагани культивирования. Сплошная линия - контроль, пунктирная - юМ впигида. Чзришш 1фуасами обозначены точки, в которых различии статистически достоверны

отой зависимости не получили. По всей видимости, это связано с том, что "омологениа" клеток могэт происходить только до квкого-?о определенного уровня, в то время как понизить их низне способность, цогяо до пуля. Иначе говоря, если опускать "плато" могно до с экой оси абсцисс, то поднимать его удается только до изкотораго "потолка", величина которого определяется как впутрвшвгда шзмоавостями исследуемых .:леток, так и свойствами используемого гэроп^отоктора. В связи с впал представляет шггерпо тот факт, <йо

нам на удалось с помощью эппгида достоверно пз;,:энитъ высоту "плато" на кривой роста культивируемых трансформированных клеток китайского хомяка, обладаадпх неограниченным пролкфэратавш.^ потенциалом и требующих, по-видашлу, очень шцшх горопротекторов для "омоложения".

Хотелось бы ташз откатить следущее. Так как ексшршаит проводился на диплоидных метках 40-го пассата, иольая с уверенностью сказать, что такие кз данные бил! Си получош ц на клотках ранних пассажей. Возмогли, и в ото:з случае "шщностц" опигида не хватило бы для повышешш "плато".

Проблема биологических аффектов олзктроиагшшюп поля (33) в последние года привлекаыт витание всо большего числа псследоватолой как в пааей страда, так и за рубасои. Одз&со о молокулярно-гопвтнчоских нэхштзмах биологического действия 3!Щ езвостно е .в немного, хотя данные ряда работ п свидетельствует о мутагенности этого {актора (Пресман, 1960). Било, в частности, установлено, что воздействие ЗЫП (3.2 ¡¿Гц, 0.83 Э) на культивирует, лимфоциты периферической ьровл человека шсавсот повшзепиэ частоты нарушений типа полиплоидии и сноупло-щш, а тага;о дэснирализацки и возникновения вочоткой кокЯ-игуращш хро?,:осом (Думбадзэ, 1931.). Кроио того, било устаыовлоыо (ДукЗадзэ, Чоботоров, 1935), что э)Й звуковых частот влияет на уровонь С10 в культивируемых клетках шлайского хоиячка. Ряд' шовдкхся даашхх позволяет так&о полагать, что ЗШ1 >,кшот активировать

Гес.10. Влияние воздействия низкочастотны 51Ш па кинетику роста культквируешх клеток китайского хсоячка (1 - контроль; 2 - Э'Л1) ..-.•"' • .

свободаорадакалыше процессы в метке.

В связи с вшесказащш! т попыталась выяснить, как будет себя

сэста низкочастотное__ЭЦП при его испытании на нашей

клэточно-юшетпческоа подели (как гаронротектор ила как горопромотор).

Еа рис.1О привздзнн результаты одного из поставлзшшх экспзрЕЗнюв. Видно, что высота "плато" на кривой рос^а под шаяшка с.'Щ пошпхсэтся, как и и случао воздойствал па клзет цонпзнрущш излученнеи или в^ашруиции агентом. Эти декннз поэво<шла нем предполагать, что низкочастотное 0!51 прэдстзгляз? собой горопрснотср.

Нзооходпмэ этк.тзть, что в случаэ С.'Ш, кок a в amso ¡тхфосзсиида, снпезвиз высота "плато" на сопрова;иалзсь вэличшш гп. Напротив, отот иаршпр дсие пзсколгио зззроо по срошэиаэ с коптролоц (2.16 п 1.об, соотпотствзпио). Сго згадаюльствует о а ом, что «одость" роста влзток (пора.'зтр гю) ;э ^саглз коррзлпруот с шкэдазезэй плотность» культуры (парг.^отр

Для гшгеюгая вопроса а тем, как влияет "дтацисяаргез стсрштз* сультигирусгци илэто:: на кгиоткку их роста (вторая, no-c.uy..:ciy, : спрздоляотся *1л>зрзс"еи" клзтек) посла «орзсоса з ывзуз ерзду, проБзли соответствугзкз ЭКСПарИМОПТЫ.

¿¿asas, ярэдетоаояаих па рс.11, следует, что уреззпь 'тихо" ксксгазлзн в случсз 7-суточгах клзгек (аоходгсгг&ся при

лс.11. Всшнш» "стационарного старэшя" кие ?он китайского i па шнзтику их роста (1 - "• озра^т" штатов 3 сут; 2 -"возраст" клеток 7 cyrs з - "возраст" клатк 14 сут)

Q " ¿ 'A Ú Ú tú i ¿

Бромя куаьтивированпл, су2

посеве в ранней стационарной стадии) и минимален в случг 14-дневных клеток (поздняя стационарная стадия). Клетки 1гк находившиеся в момент посева в лог-фазе (З-суточпые), по уров! "плато" занимают промежуточное положение меду 7- и 14-суточнш, клетками.

Полученные результаты позволяют полагать, что яизнеспособност клеточной популяции, находящейся в ранней стационарной стада роста, является максимальной. Этот вывод согласуется результатам других исследователей, изучавших зависимом устойчивости культивируемых клеток па разных стадиях роста . блеоящину (Тт?еп1;утпап, В1еекоп, 1975) и имурану (Макарова к др 983). Сходные данные были подучены и при изучения изменони термоустойчивости клеток простейшего ТоЪгаЬутепа руг1Гогш1е процессе длительного культивирования (Ирлпна, 1930). ;

Ва счет чего шз изггеняется кинетика роста клеточной популяция Одним из возможных механизмов этого явления коеот быть парохо части клеток в состояние, исключающее деление, при сохранена Еизнеспособности. На такого рода пологзшш построен целый ря теорий клеточного старения. Смоделировать эти изменения на иакэ клеточно-кинетической модели могло путем искусственного изкенони начальной плотности клеточной популяций.1

Из данных, приведенных на ркс.12, видно, что по каре увеличена ' плотности посева высота "плато" па кривой роста тпрэравн

Ч 6 в <0 12 ю

Время культивирования, сут

Рис.12. Влияние плотности посаЗа культивируе?,их клеток китайского хомячка на кинетику их роста. 1-15 тыс^клеток на флакон (»); 2 - 30 тыс клеток на флакон (а ); 3 - 45 тыс клеток цд флакон (+)

возрастает. Надо, однако, заметить, что возрастание это хотя и статистически достоверное, но не очень большое. Величина re га, сарактеризуизчя скорость размножения клеточной популяции, как юказали соответствующие расчеты, увеличивается пропорционально тлотности посева. Эта результаты, на нал взгляд, позголяот полагать, во-первых, что небольпше погрешности в плотпости посева, дапускаеьпю в процоссо эксперимента, п'э должны энатчю сказываться та высоте "плато" кривой роста, а во-вторых, что наблвдаемые d 1СЕЯХ опытах агменопия пасвдавдей плотности культуры под влияготеи различных герспротекторов и геропроыоторов вряд ли могут зпроделяться только изменением 'гасла делящихся клотск в популяций. Зыяспонпе г:э истинных'механизмов этого явления требует,' конечно, ^алыгаГйиз. нослэдований. '

V. ИССЛЕДОВЛШГЕ ВЛИЯНИЯ ВОЗРАСТА МАТЕРИ НА ПРООЕРАТШУО

АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ХОР!ЮНА ЕВ ПЛОДА Известно, что чем выше возраст матери, тем йольео вероятность зоядотая у но э ребенка с той или иной гаяоггтесшт :сэ5прогрс!.,!.'провс15поП пптелогией'. йщшгзлясь скате ршлт-шыо .1хот0сп, к которых делалась попытка объяснить возраста

:аторп" (¡.".itorr.al 053 stfoot) (Eern3t0in, 1579; i'odvoáov, 1901 и ;p.). Б сснсез Солглшсгва из es лзкй полэхзпио со уволчетп п юловзх глотка*: прп старайся числа генетически повр-эгц-епяа. остается ::-лсггм, кпсгл е<;Р""с:? тгчг'о псв?,огд«Ш1ТЯ в ггстагл» пбркояа, ябо йрпктпчота neo етя ,?ctmft'i '.ет о.туиптроюгься при соз^ваппп ^йцвклтви. <?о якодотео} :ют и ^гсзкпя отггогы (iWnatein, 1979; Яъ&гсбо?,

Кг:: у::э yr.wmxniov п •соогптствуг.т'х рзздэлэх ргботтт, irprcrmir.*) про'--'^СЫХ глоток,' судя по вссну, пртгодят тс <zi: а п'х повреждений ггпотячссксго иаторязп.

"rr.r.i ч ио^гп катках тпгкптп глииг?шя, '

сгр-гхпатъ прагг'-ороцетт клотс^ гг'брпояо, пто гогло '! споксбстсовать пог-г'.--э*ггпэ проятпоег! г-озппкгоеош у посинвпго •: :::зггг:1х ггсчэ.т:!. В сп.тги с Gijeo сдэляяа яокчткя клсяпть» а ыхчо? ~.т гозр^ст rnv^rt пч про^г^зрчттгвттуп пктяиюсть "лзтск-:. гголт.

Получоггдп ДЗИПЦ9 ЕрОДСТЛЕЛОШ! па рис. 13. Вгтло, что с т^тгтпгсп гозрг.ста !№оря прэлт&рятянгая агстигаость кяотсге, :ор;:епэ рсэпкгзтсд (когКтщгтепт коррзляцяи рзйЗн -т.БО;, рэгрэс^и/Л; о.оокп<о.сс5). СссвотствуггпИ статпстипестаяЯ тхе

Рте.13. Зависимость показателя пролпфэративной активности клэток хо; юна (пояснения в тексте) от возраста матера

выявил достоверного влияния срока беременности (от б до 12 педаль) на изучаемый показатель. Необходимо отметить, что средняя воличина индекса митотической активности изученных культур оказалась близкой к оценкам отого параметра, сделанным другое исследователя?.^ (В1а1шаюге о» а1., 19335 Т?и1ьпаЪа о4 с1., 1978).

Уменьшение митотической активности глоток хорпопз па псследованпой на1.ш стадии мопзт приводить либо к увзлпчоЕца времени его роста до обычных размеров, либо к уменьшении о тих размеров. Возмохаш и кшше-то коглгансаториые реакции, масютрущиэ троявлзняе па морфологическом уровне выявленного фопомэнз. Окончательный вывод, но-видшому, могет быть сделан только посла проведения соответствующих исследований по большое выборках.

Конечно, состояние клеточной популяции, образущей хорион, но является показателен состояния других клеточных популяций розвявощегося плода, пролифератпвная активность которых ногот р гораздо меньшей стопрни зависоть от возраста матера. Нал пэ известны данные об увеличении- срока развития плода у погзиоя матерой. Впрочем, даг,э небольшое утанкаоние пролЕфератпшоЗ активности клеток 1.:огх)г, как .уко .указывалось, приводить к переходу "барьера", за которым возникает. прогпёсс;фуЕлд5 процесс накопления (на уровне . -всей',. .■у.клё^ачкой-' :,'?/поцу)мцпв) раагачшк молекул •рш-мвб^Бсх^-'-'фйв^.^вййй.:, ':ПрЬ;Vдальнейшей развития вибриона та№я*;лпой]рб^Ьйия'«огут •р4алйз6£йтьс.я в хрокосогяшз ,,?еррац::н, в- сво&.'Ьчэродк прлводяйцо к ' розлйчйм; аномалвш ии

органазиаииом уровне (речь в данной случае, конечно, идэт о иоааицизыа ).

Хотелось бы таюка подчеркнуть, что, как видно на рас. 13, разброс данных да иду разными индгрядама довольно велик, Прола^аративная активность клеток образцов, полученных от некоторых кешшв в возрасте сныша 35 лат, находится на уровне, свойственной 20-2Б-латшш иатарям, На наш взгляд, это иоеет свидетельствовать о снганном риска возникновения аномалий плода у этих сашин. Конечно, это предиолоявшв. иуздаатся а далышйанх цсслг юпаниях на достаточно больших выборках.

VI. ПРОЛИФЕРАЦИЯ КЛЕТОК И БОШНИ ПРЩЕВРЕЫШЮГО СТАРШЯ

Как уго о-гаечалось, аргументируя роль изменение пролифератнвных характеристик клеток организма в процесса старения, « качества одного на доказательств приводят, как правило, тот факт,что потенциал УКП для добробластов ладей с прогеровдными синдрадаыи значительно сникав. Сведения se о других показателях пролпфератавной активности клеток больных о такими синдроышн достаточно разрознены.

Необходимо заметить, . что заболевания классифицируют как прогеропдаые сивдроыа на основании кошлекса клинических и физиологических признаков, считающихся характерными для "пораальвого" старения, но раавпвавдихся раньпа шш с большей скоростью, чей в nopsia. О частности, учитываются характерный "старческий" вид, ранние поседение а выпадение волоо, атвросклеротическиэ проявления, "старческие" избиения геиодшшмнки, повыпанпо частоты возникновения опухолей в зеболзванзя сахарщу диабетом д т.д. . Пряша сэ датам,

Cru НоёауВоНяш rvïiïÎ4 iш\д cüäfiüibamin с Тфодгзз

згболэвапшзиз, 'отсутствует1, поатоиу строгого доказательства ускорения пла болзо раннего начала старения у них нет.

1!з=за этой "развитости" класснфакащш за последние года список прогородщшх синдромоз сильно рзсгпрзлся (Hartin, 1932): крсыэ "классических" синдромов Верера и Хатчш1сона-1'ил$орда в него била палачены и иногае другие заболевания - главным обравом, именно щ слзауказаннку косвшшым клинико^фазнологаческсл признака; . В связи о этим представлялось пнтерасныи собрать п проанализировать шекдиеся п литературе данные исследований in vitro рззлычлид показателей пралифератишюй шгьлаюс.'и клэток дздей о а2бол9ваш1г?я1, классЕфащфуешш! авторана как прогороидниэ

синдромы.

Результаты нвшего анализа представлены в таОл.6. Вольная часть данных получена па конных диплоидных фибробластах. В остальных случаях тип клеток указан. Приведены значения показотелэС пролвферативной активности в процентах от контроля (клэткз здоровых доноров близкого возраста) с опиокоЗ сродного. Показатели рассчитаны как средние из данных всех проанализированных робот, п

- количество источников (в скобках - число работ, в которых объсы сравниваемых выборок позволил сделать вывод о достоверности различий »,'8 Еду ними). В расчеты нэ включали дашшэ тех исследований, в которых авторы сделали гавод об отстствнн влияния паличия прогероидннх синдромов у лвдзй па пролнфэратввауо активность их клеток (пункты "б" в таблица). Использованы следующие сокращения: ТКФ - трансформированные когадае 'фпбробласти; '1ЛЦ - трансформированные лимфоциты; НЛ - поргдалыаю лимфоциты; СЛЦ

- стадулированны мптогеном лимфоциты; СДВ - сахара дисбат взрослых; ЮСД - ввэшлышй сахарный диабет; КВТ - количества моченого тамг тина, вклвчепиого в ДНК клеток за вроия инкубации; СШ ДНК - средняя молекулярная г.асса ДНК, сиптозировшшой за 1 ч инкубации (авторы, использовавшие этот показатель, считают, что ои отражает скорость влопгации ДНК - Fujltrara et ni., 1977).

В таблицу he включены данные по муковисцпдозу - зоболовапив, представлявшемуся нам интересным, ибо, хотя оно нэ откосится к прогероидным синдромам, однако херлетерпзуотся зпачитольпо снтаюшгой продолжительностью кпзни больных. Показано (Thocpcon, Holllday, 1983), что для клеток разных больных с муковисцздосец потенциал УКП мокот быть как больно, так г иэпьпо контроля. Ею свидетельствует об отсутствии связи данного заболевания с пролифэратгашой активность» клеток.

Анализ данных, представленных в тсбл.6, позволил eej сдзлать следувдпе вывода:

1) При прогероидннх синдромах набладоотся явная тенденция к ушпыпошю прол::форатпвной шстивности культивируемых 1-юто;; больных (оцениваемой по сами разным показателе.), хотя

этого уменьшения ,при':' разных,; прбгеропдпнх згболовангях, по-вядакоау, различны, /:'-поска4ку;'{-тфи .одЗгпх Солззпях (сипдрса Дауна, а жеил-телёая^зкйзая),"• ■ "ücá f. ¿tójftGíisro. юказатоя пролифвпчтшзной;-' акттшюсти, . j^^pV-'-ü^i^Sá'iV'^HqK.•..в рзспо2 степ .на, -а/пря других' tGínliq^íí'B'éptiép¿i: 'i^rüp;,!^);,'^аз/игдаоГ.

2) catite ииа ;ш|йгз1»;.;:прн

Таблица 6. Показатели пролиферативной активности клеток лзадай с на которыми прогвроидныын заболеваниями (пояснения в тексте)

Показатели пролиферативной активности

Заболевание Потенциал Эффективность Интенсив- Скорость Насвдащая УКП клонирования ность ра- УЮТ плотность шшкатив- кул1 ури

ного синтеза ДНК

Синдрим

Бартера

30.7*2.9 а-10(6)

19.3*3.9 п«3(2)

66/?

п=1

(ТКФ)

БЗ.З п=1 (О) (КВТ/1 ЕСТ)

46.510.4 п»2(1) (Ш ДНК)

70.112.2 35.0

п*4(0) п»1(О)

___

п-1 (ТЛЦ)

Прогорая ^синдром Хатчинсона-Гилфорда)

а)47.5^9.3 23.8*7.7 п=6(2) п«2(1) 0)порса

12.4 Данных 8)43.9120.5 п=1(1) нет п=2 (1) (КВТ/24 ч) б)норма

п*1

Синдроу бз.2гь.2 шшз , Данных Дауна п»4(1) п°1 нет

V (Й1) * ^

69.815.0 75.6 п*5(5) п-1(1)

норма

(НД>

Атаксия- 61.813.9 59.4И2.0 талоангэ- о=2(1) п»3(2)

ектазкя

09.7 74.9 Дашшх п»1 (1) п»1 (1) нет

{ГГКГ/ЛА

Дисбат п *проддаэ-Сат" (т.о.

СО СТО ЯШ!0

пошзешоЗ гонатичос-К03 прзд-' расноло-гзнностп к дзабату)

а)7^6±5.7 0)71.415.5

п»4(4)

б)пор^а

пИ

п-3(2) О)поруа п»1

33.1

п=1 (СЛЦ)

71.7 . . п=1(1) я-З(З)

(КВТ/24 ч) б)норгга -----

62.2 (СДВ)

'■'■ п=1

(1И)

а)70.915.0 а)55.316.1 П-2(2) .

(СДВ) 1 31.6 п=1 (1) (ПОД)

"классических" > прегероидннх Яатчшсшга-Гадфордэ."

синдромах

Варазра . $

».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нестоящее время для изучения мехашзтв старения в вкспериментах на клеточных культурах применяются две основшэ модели - модель ХеЕфлика в модель "стационарного старения*. Несомненно, что первая гораздо более известна, ибо интенсивно используется укэ в тече1Шв четверти века. Однако целый ряд дашш позволяет полагать, что результаты, полученные на этой Иоделз, часто не совпадают с результатами исследований старения in »Ivo. Кроме того, эксперимента такого рода зачастую на кенее трудоемка, чем опыты на лабораторных животных. Собственно, и cEía Л.ХеЕфлЕк очитает, что кле си in vivo почти никогда но попользуют весь свой пролйферативный потенциал о че достигают фаги III. словака,

организм никогда не стареет из=за асчерпапия клетш&з "лг^шта Хейфлика". он стареет из»за накопления в клетках тех ши пшх п-вреадений вследствие, как полагаем, oí ¿значения ш

пролиферация при возникновении в процесса дифференцировал популяций специализированных покоящихся или размноЕашяхся с ¡шзкой скоростью клеток. Поэтому исследовать мехайизш старения на клеточном уровне нам представляется более целесообразным на кодзлп "стационарного старения", базирующейся па полошш, согласно которому в клетках стационарных плеточных культур со сракэпеа долены возникать различные изменения, сходные с пзкзнешшш клеток стареющего организма. Представлетчй в соответствуших разделах атой работы материал, как нам кажется, свидетельствует в пользу этого положения. Показано, что в стационарнгх культурах действительно накапливаются "возрастЕнэ" "изменения на сашх разных уровнях. Пр.. в той шйвляются текло изменения, как правило, очень быстро - чероз 2-3 подала посла начала оксперикзнта, Это позволяет нем считать шдзль "стационарного стгрзгшл" xopozoß альтернативой модели Хейфлика.

Хотелос бы откатать» что 'данная иодзль, как и разработанная наш клеточно^кинетичаская модель, позволяет такта достаточно бистро п эЗУЕюктшно проводить . исследования потенциальных геропротекторов и горопро~оторов, т.е. ^азичоских или хзгачоскпх факторов, ico то риз, соотвзтствзпно,. зшзддяит плл ускоряют старо низ окспорпкентальшх £2£0T¡H!x. ели Чел0£02й. Оценка. .ex дзиствлл, вообще го г ря, (доат сить ' коррзкп- j -произЕЗдена только, путей снятая кривых ещйвшня контрольной й опытной .популяций esibothlix или лкум. Сдайг такой крйвой вправо озпочаэг зсхзллота пррцзеез старогогя -' (фактор, газывшозЗ! втот сдвиг, иозстэ считать

геропротектороы), влево са - ого ускорение (фактор геропромотор).

К соаальхшю, такого рода эксперименты на людях, во-первых, часто невозмогны по этическим соображениям (если, например, изучаемый химический препарат не охарактеризован фармакологически),, а во=вторых, потребовали бы рвботы по меньшей мэра двух поколений исследователей. Опыты Ее на экспериментальных животных занимают таге» достаточно иного времени и, кроме того, данные, полученные в таких опытах, далеко не всегда ьюгут быть перенесены на человека, старение которого интересует нас в первую очередь.

В связи с вь-чюс-азапным особую актуальность приобретают работы, направленные на разработку различных подходов, обеспешшащих достаточ: о быстрое получение адекватных сведений о действии потеициальных гаропротекторов и геропрошторов, поиском которых занимаются в настоящее время .многие ученые»геронтологи.

Фактически сейчас существует три основных типа таких подходов: 1) с поиэаьв оценки биологического возраста организма; 2) с П01ВЯЫЭ чисто хиняческих модельных систем; 3) с помопц.ю експерюгаптов на клеточных культурах.

Необходим подчеркнуть, что все эта подходы обеспечивают лизь гюсвзнную информации о геропротекторном ила геропрошторном характера действия изучаема факторов, ибо снятия кривых гагизееиоста нэ производится.

Исследования первого типа могут проводиться как па гшвотных, так п па человека. В этой случае (и делаэм вывод о характега дойствая исследуемого фактора по паправлэ!шю сдвига в сторону болэо "молоди" шш "старых" значений некоторого параметра

(¿уаиолш'цчицюл-о, Ошшашчыхшт и г.д.), и.Огирай ел „ йЧя!адм

суцэствзшшм дм процоссэ старания на основании ого корреляции с возрастом. Недостатки такого род-з работ угэ отаэчеки шзэ.

11о второй группе относятся, например, эксперименты па 1.»д1^з:сацх1 "старания" растворов коллагена. Кетодологая Ептзрпрзтацгс! данЕнх отпх оксперпмзптсв сходна с такопсЛ для сэрзоЗ группы исследований. Хотя результаты в такого рода работах ¡.»гут бить получены за достаточно коротзспй срок я с низшая гптораалыпгп затрэтюп, ах нрдазнжость для пиво; ¡в о стара нот чэло&эка представляется пока недостаточно ар^уиоптароваштоЯ. г

11, инсошц, в треть® группу попо "дот чсслэдопшптя на клоточних адктннх спстенах: а) моделз ХеСфйвка (старание 1п ?Нго); 0)

модели "стационарного старения"; в) клоточно^кипотпческой ¡..ogoj В первом случае вывод о геропротекторном или геропромзтор: действии изучаемого фактора делается на основании данных о с влиянии либо на потенциал УКП, либо на скорость тех пли ш изменений клеток в процессе их старения in vitro. В случаэ вто; модели фиксируются изменения скорости накопления тех шш к повреждений в клетках стационарных клеточных культур. Наконец, третьем случае заключение о действии исследуемого фактора дзлаот па основа характера изменения кинетики роста культивируемых клэз - главны),» образом, увеличения или уменьшения насыдзпдей плотное культуры. Име^ло эта модель обеспечивает наиболее баст| получение дапных, поэвоявдих количествзтю охаракторпзо&с исследуемые геропротекторы или геропромоторц.

Пр-одаоюнная в настоящей работе концепция ограничат про.-пгТарпиии как основной причины старения позволяет, на е взгляд, ответить па все вопросы, сфордулировашша в пачоло рзздо III. Итак, по порядку:

1) Еэхаяизм старения един для всего енеого/И в иногоклоточя организмах, и в популяциях одноклеточных процесс старен "запускается" ограничением клеточной пролиферации.

2) У шетарэщах организмов клеточная пролиферация ограппчиваотся Ш:Зо вследствие неограниченного роста, ш; некоторых рыб, либо вследствие • непрерывкой оалзнц всех клат оргаппзма, как у пресноводной гидры).

3) Как правило, чей Сольсо вшгаю размера особей (v.o. ч дольше долятся клетки- оргежпгмз), том больше п вндэе продолжительность кгоШ. Соотпзтсхеэкео, сада га мхзю откоста т известный факт, что -видовая длительность периода развития хоро коррелирует с видовой продзлйитсл!л:зсты5

4) Ракошэ плотки "боссизртпл", £Сз обладает Сольс пролгфэратквной истшшостыз,' чзм порг&здьшз ВЬЭСЭ» В ЕСЛЭДСТВ втого не переходят тот "барьер", са г.этср~: з:а-са orpaiunan пролиферации - в клетках пачепггг nzxxzzanca ражж повроадения.

Б) Половые клетки "старост" тел гз, как с его ост алат::;, upL'i топ интенсивнее, чем больно огрзгггсшз vx пролг'орац^ "Ускользал" от старэтшя аародышзЕой xzszz удастся толь вследствие когцюйпэй выбраковки глагол, несущи "стор-;ос;а.: погревдегая, соотЕотствухотмп сястем&мл оргшсгзиз.

6) Бактерии, ' простейшие, водоросли, ьшкоплязгеи ¡слет

Езгэтатавно разшогшггдахся растений "бессмертны" только до тзх пор, пока способны неограниченно разшюпаться. При ограничении пролиферация гас популяции претерпевают процесс старения и гибнут.

Из разработанных еце в первой трети напего столетня когщетпй (йзальгаузои, 1926; ВЫйэг, 1932} Н1по1, 1903, 1913), согласно которая ог^аничешм роста оргониггюп игразт главанствукцу» роль в развитая процесса старения, пугао призпать нявболэо соогЕОТОтвугкоа исаам представления;! гшотозу Майнота. Угз в самоа начала аока он высказал гасль, что старение ость прямое следствие дзфферсицировкп меток и что дс^фарэкцаровшлшо клотап яз=эп пгшнзнпЛ, вропсиэдггп главам образом в цитсплаокэ во врзш ;.:зрФогеназа, стг. ювятся поспособшля пп к росту, ни к Еосстаповлзшпэ ('Пг.о1, 19СЗ).

В р..дз работ, появившихся совсем недавно, лгратгаению пролиферация такие щ сдается большое значешю в процессе старения (см.обзор Па1(;оп, 1982). Сделана даг.з попытка создания цатеиатичзскоЗ подели, связыващоЗ ограшгюпиэ проли^рацаи а иакоил-эпнэ с возрастом в организма так назиЕйеии "планов" (Сролов, 1933), но пз использующей, к сожалению, никаких окспзриузптальшх датах.

Крс;,:э того, ьу^оствувт прздстязлэнал ^Бахтин, 1980),. согласно ::зтор:л! клзточиго популянил стареет в вш-зраот (яазс и по пегой 1:спцзпшга) вслйдствкэ накопления в больпипство пх клеток ¿:зсбрзтп:::гх из«заэпи2, по угэ нутационного типа, причем нь^сплэннэ глл происходит селздсткю ослпэлзпкя тпттонспвиоотя с ¿г озхлспруадз го отбора.

Рззультача щ'опэдошюга па: а спалззз лзтзратура осиойпшто прэяколояиь нлггпго спрэделзпнсз связи г'/зглу иг'йкени.тн ¿ролгггэрзтилиоя егтгисс^з зугзус:: органика ч'ихи-пш л па^чк-ч у Т.ЭХ н~! ЗЗгЭЛЗГГПГЯ, скгывагст ПрЗГГДЭВрЭМеШОЭ ИЛ!!

усхорэзшсо скряга». Трудно п пасто.-хзз вро:*л прэлполо^ть, ?<шсуп

пользу цэ£"3? Пр-дЛЗСП ПраХТКОСГСЗ !!зетпп!3 п0пг*.!Й!?1!й ДйЯКОГО

оасэлыжэ, одпкго сзссгопио, тго сяггзанзя про>п.*1арптпгппя аитиглссть клп:рзт"0г0 тэлоеокз позволяет огйвотн его к

групх» погде9шюг0 риска еознгхповзпш! иск прогороядпч* гоош аш21, тек а плассачоаст "возрастных" болезней« -йтг склероза а рака.

ОСИСРШЯ 1>УВ0£Ц

1) Иэтодом содпуэи-шш -в градагчтэ гело'пюЗ сахарен показало, что количество рэзр-ывов а г,а«зчелпбильпш '-'чяотгадп п ДНК

■ ь

культивируемы* клеток тем меньше, чем выве гас пролзгферативная активность. , .

2) Установлено, что при "стационарном старении" культивируемых клеток (т.е. при замедлении их пролиферации после пересева в в процессе дальнейшего пребывания в стационарной фазе роста бео смены питательной среда) в них происходят м^лекулярно-генетическпо изменения, сходные по характеру с изменениями клеток старо кцэго организма:

а) накапливаются однонитевые разрывы и иелочзлабнлыше участка в ДНК;

б) увеличиваете количество сшивок ДНК-белок;

в)'в клетках с высокой тгоолифвративной активноел>ю снигаотся содержание в ДИК б-метилцитозина (при неизменности какущегося содержания ГЦ-пар);

г) частота спонтанных сестринских хромати,г шх обменов возрастает, а частота индуцированных сестринских хроматидных обменов остается неизменной;

д) средняя скорость продвижения клеток по клеточному циклу после их стимуляции к делению уменьшается.

Полученные дашша позволили заключить, что стационарные клеточные ' культуры являются удобной кодалью для изучения возрастных изменений на клеточном и молекулярпом уровне. 11:1 3)! Разработана математическая модель, позволяющая адекватно • ■ оценивать 1 кинетику роста любых культивируемых клоток - как i 'вукарнотических (портальных и трансформированных), таге п прокариотических. Показано, что с помоцью этой модели г-огло лэгко 1 риссчитать : злнчину пасшдвдей плотности исследуемой шюточкой " культуры, максимальную скорость ое роста. Броня удвоошл чпсло1шости клеточной популяции и относительное содер-'ашге в ной неделящихся клоток.

С использованием данной модели установлено, что:

о) тиа-излучение, известное как классичеаспй горопро;.:отор, шзивает уменьшение высоты "плато" па кривой роста культивируоьах клеток (т.е. насыщающей плотности культуры), пропорциональное доза облучения;

б) алкнллрувдй ДНК-тронный агент тиофосфагид такхз уиэпьаазт отот показгтоль пропорционально ко!Г"штрац;ш Гфопарата в срадо рОСТа, - ■ '..";•; ,

' в) ц.исутстша в среде роста горопротогстрра-сйтг.окспдапта ЮТ.тплп йизываот уЬэлнчонпа ejjootu "плато" на кривой роотс

дзплощщыг ®!бробдасюа чаловока! ш прокариотических клеток ¿aholianlftEsa laidlasrdi';;

П); воздайствнв] швкочаототк ^ алвктромапнитным! полом. (13 кГц, 0¿63i Э4, 22; 4i)) приводит к поникании- насвдавдей- тотноота кудькшщ}иамиа.ияэток;

д)> щр1 "стационарном старании" культивируемых клеток их дшв способность, оцениваемая по величине "плато" па. кривой роста посла, пэрэсава в свеаую среду, возрастав.® в- ранней лог-фаза, а затеи» шагается;

е)i уплзчэнпе плотности посева клетож в< 3> раза привода® лизь к кэбалкзэ«й увеличения насщащей плотностт исследуемой* культура.

На, основать .длучэншх данных* смодулировано пологе: ла, сопглспо. которому, . разработанная! шдвль,, назвшхая кэточно-лшатаноской^, могэ® бить использована для изучения роропро;!огороп, (фантомов,, усхоряпглх старение), п. геропротекторов (Сзяторов», ого заиедляк;:©).. Лервые долгны поникать высоту, "плато" залповой) роста« культивируешь клеток,, вторые - понизать ее.

4¡). Установлено,, что с увеличением возраста! гаетдани 1ролг!рративная, активность теток хориона, еа плода прогрессивно зтсшется.

б) С помоадю статистического анализа данных литературы заказало, что при болезнях прездеврашэнного старения, как правило, г^зньсается пролхгГррат1шая активность клеток больных.

6) Сфор.!улирована, теория старения, согласно которой к его ■запуску" приводят ограничение пролиферации iuwtok, составляют )рганшш, пли^ клеточную популяцда. Хотя ссмо ограничат^ [ролкйэрации: не оказывает неблагоприятного воздействия ца фгашзм, ш.:зшю оно приводит к накоплении в клетках- различных

!3(готстоп снпчя.пя чп, i y1 птеи лапппи _ а поми ;» па лзо íucci'.ul'

ровнях, что и йызываэт наруязшзе функционирования всей систет с ■Езлцчениом вероятностям■ гкболи, т.о. старение.

' СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ,, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕУВ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хохлов А.Н. Пролиферация! m старение (Итога-- науки и техники ШШТИ АН СССР, серия 'Обгднс проблем. фиошю-ХЕиическоЙ биологии", Ш 9). - у.: ВИНИТИ. - 1SS8. - 176 с.

2. Епленчик ¡J.M., Хохлов А.Н. О механизмах регуляции системы t. зпаращщ ДНК в клетка // В сб.: Влияние радиации на рогуляторни^ роцзссц в клетке. Тезисы докладов Всесоюзно, .) симпозиума (Пу.дао, 5-23 мая 1976 Г.). - Пущшю. - 1976. - С 5В БЙ !1

3. Валенчик ¡J.H., Третьяк Т.Н., Хохлов А.Н. шзмы воошпшд-

вепия и накопления с возрастом спонтанных повреждений ДНК в кивот-шх клетках // В сб.: Тезисы докладов XIV Международного генетического конгресса. Секционные заседания, ч.1. - 1978. - С. Б74

4. Хохлов А.II., Виленчик М.Ы. Возрастные изменения ДНК диплоидных $ибробластов человека, обнаруженные с помощью изтода центрифугирования в градиенте щелочной сахарозы // Депонировано в ВИНИТИ, И 3379-78Деп от 26 октября 1978 Г. - 9 с.

Б. Bordyohev O.D., Vilenohik Ы.И., Khokhlov А.И. Dcorcaso of tho ША molecular weight of hunian fibroblast!) during e^ainc // The XIth International Congress! of Gerontology, Abotraote for cootional eeoaiona. - Tokyo, Japan. - 1973« - P« 3'.-33

6. Виленчик Ы.М., Хохлов A.H., Бердшов Г.Д. Уменьшенная способность к репарации одношпевых разрывов ДНК у фибробластов взрослых людей по сравнению с екбриональшдлц фибро^ластсад // Доклады СССР. - 1979. - Т. 248. - 4. - С. 993-997

7. Виленчик М.М., Хохлов А.Н., Аксюпша U.C., Обухова Л.К., Мамаев В.Б. Возрастные изменения способности кудьтивзруоглв: ил-ток человекь к репарации ДНК // В сб.: Поврегдоние п ропарацдл ДНК. - Пущипо. - 1980. - С. 56-66

8. Хохлов А.II., Бердышев Г.Д., Виленчик U.U. Зависимость молекулярной массы ДНК клеток человека п их способности к ропарацш! индуцированных гаша-излученлои поврегданий ДНК от штотичестсого

г потенциала этих клеток // В сб.: ч'взисы докладов Всесоюзного симпозиума "Уолекулярные и клеточные ыеханизш стара;шя, 1931". -Киев. - 1981. - С. 176-178

9. Vilenohik U.U., Khokhlov А.Н., Grinbars K.li. Study of spontaneous ША lesiona and ША repair in '.nunan diploid fibroblasts ogod in vitro and in vivo // Btudia biophyoioa. - 1931.-Vol. 85. - li 1. - P. 53-54

Ю. Хохлов A.II. К Еопросу о босгаэртин половых ¡¿лоток // В сб.: Тозпсы и рефераты докладов IV Всесоюзного съезда геронтологов и гериатров, Кишинев, 1'-17 сентября 1982 г. - Киев. - 1932. -С. 409-410

11. Наддарян Т.Л., Хохлов А.Н., Чиркова E.D. Старение ы болззпл: о механизмах возникновения спонтанной патолопш // В сб.: Натерла-лы Все сопкой научной кощк/роншЫ '"''спользовакно моделей патологических состошнШпра. поиска биологически -шепшых препаратов", 2230 пар .-а 1983 Г » ¿ 4 , tl. - U.; - I98i3.;;-: С;. 76-77

12. Хохлов 'А.П., ЧирКохт-E.O.';, НаЬаарян .Ti'JIi Jlcno^okainie лиг.1ю1и-тОР и' культивируемых фпбр&алпстов'че^оЬ?ка для оценки доЯ-

отвая биологически активных препаратов // В сб: Материалы Всесоюзной научной конференция "Использование моделей патологических состояний при поиске биологиче сн активных препаратов", 29-30 марта 1883 Г., Ч.И. - Ii. - 1983. - С. 4-6

13. Хохлов А.Н., Чиркова Е.Ю., Ушаков В.Л. Использование стационарных культур для изучения механизмов клеточного старения // и сб.: Первый съезд Белорусского общества геронтологов и гериатров. Тезисы докладов. - Цинск. - 1983. - С. 188-189

14. хохлов А.Н., Ушаков В.Л., Капитанов A.B., Надаарян Т.Л. Влшнп г еропротектора хлоргидрата 2-этил-6-штнл-3-оксипнридана па пролиферацию меток Aoholeplaßmaiaidlawii // Доклады АД ССОР.

- 13Э4. - Т. 2-4. - й 4. - С. 930-933

16. Хохлов А.Н., Чиркова E.D., Надаарян Т.Л. Использование ота цпонарных культур клеток ылакопитавдих для оценки биологического действия химических и (Доцческих факторов // В сб.: Первый Всаоо шшй съезд медицинС1шх генетиков, Киев, 16-Ю апреля 1984 г. То сзси докладов. - U. - 1833. - С. 366

16. Хохлов А.Н. Исследование потенциальных геропромоторов в окспарпмэнтах на стационарных клеточных культурах // В сб.: ХГ? Ежегодная конференция Европейского общества по мутагенам Енеспей срздц, Посква, 11-14 сентября 1934. Тезисы докладов. U. - 1984. - С. 240

17. Чиркова S.D., Хохлов А.Н., Дуибадзе Г.Г., Чеботарзв А.Н. ?.!одп?13сац'1я "стационарного старения" !сультшшруешх клеток апзктроыагпнтшги полам звуковых частот // Нзезстия АН ГССР. Сэрия биологическая. - 1984. - Т. 10. -3 3. - С. 193-198

18. Хохлов А.Н-., Чиркова E.D., Надаарян Т.Л. Деградация ДШС

ь üu,toiü4iis.cu кудьтшзаруе:.:ых клетках гатапского хомячка // Цитология. - 1S34; - Т. 25. - .1 8. - С. SS5-SG3

19. Чиркова G.C., Головина Н.Э., Надаарян Т.Л., Хохлов A.II. Плэточео-гсшотнчоскоя "одаль для изучения гзропротакторов а гзропрсмоторов // Докладу АН СССР. - 1934. - Т. 278. - ,j 6, -С. 1474-1476

20. Хохлов А.Н., Чиркова E.D., Наджаряп Т.Д. иодояпрованао цзтогвпотнчосиях возрастгшх изменений с помощь» стационарных клеточных культур // В сб.: Цятогенетака старания. Иатари-лы 2 СПГЛТОЗНуМЭ, ТбЗЛЗСП, 10-12 ноября 1S8-1 г. - Тбилиси. - ЮЗ-i. -С. 43-44

• 21. Хохлоа А.Н., Чиркова Е.Ю., ЧэС. гора;. А.IT. Изизиеиая уровня езе*рмзсках хроматина обшноа в культивируемых галках mrrafl-

окого хомячка при ограничении т. 'прояЕфарациа // ¡Штозкячи ш генетика. - 1986. - Т.19. -Й 2. -С. 90-^92

22. Хохлов А.Н. Ограничение пролиферации 'кок (возкоигоя «причина накопления повреждений при старении // >В сб.: 'Исследование шар-ВИЧ1МХ механизмов биологических систеа. Доклада "ШИП, 1583. Об^ая биология. - М.: Наука. - 1985. - С. 60-63

23. Хохлов А.Н., Головина Щ.Э... 'Чиркова ¡Е.'Э.., Щздаарян Т.'Л. >йпа-лиз некоторых кинетических закона;,мрностсй (роста 'культивируем клеток. I. Модель // 'Цитология, - 1535.. -'5. -27. - 0 8. -

С. 960-965

24. Хохлов А.Н.. Головина (И.'Э,., Чиркова ЕЛ).., ¡Надзарян Т.Л. Анализ нзкоторых кинетических ааконошрносте'И ¡роста <кул: тивзруегшх клеток, и. Действие ионизир^адеИ радиации., елиилпруацего агента, Ю13кочастотного электромагнитного поля // ¡Цитология. - 1535. -

Т.27. - № 9. - С. 1070-1075

25. Хохло А.Н., Чиркова ЕЛ)., Горин Л.11. Упрочношю ДНК-болко-вого кошълекса в процессе "стационарного старания" культпвируеглн клеток // Бюллетень оксперпконтальша бдолоши 4а медицина. -1886. - » 4. - С. 416-418

26. Хохлов А.Н. Возмо:зшв ''кехопизмы накопления с 'возраста.: молекулярно-гоиетичосшх 'Поврвзденй! // В сб.з Иадоаюсгь 51 олз-моптарпио собынш процессов старения биологических объектов. - п.: Наукова думка. - 1986. - С. 110-115

27. Хохлов А.Н., Карцева О.Б. Влияние возраста Матери па иролн-феративную активность меток хориона // ¡Цошнйравано в ВКШГШ,

й 1990-В85 от 25 -марта 1986 Г* - 8 с,

28. Хохлов А.Н. О возможности' -оценки бнолошческого возраста организма по кинетике роста 'его клеток в кул;турэ // В сб.: Механизмы старения и долголетия.'Материала лон£оройЦиЗ (Сухуш, 29-30 сентября 1986 г.). - Тбилиси: Сзцниерзба. - 1983. -

С. 175-177

29. Хохлов А.Н., Головина .Ы.Э,, Чиркова 2.В., йадааряя Т.Л. ¿на-лиз некоторых кинетичеспя закономерностей роста |сультиБируешх клеток. III. Влияние плотности посева, геропротоктора-антиоксидан-та, "стационарного старения'" // Цитологся. - 1987. - Т. 29. -

й 3. - С. 353-357

30. Хохлов Л.Н., Чиркова Е.0., Чеботарев а.Н. Йз^эновал уровня сестрпюких хроматидних обменов в куль-шзируегла: клетках китайского хо /ячка при ограничении их пролкфзращз» Доаолшггольшо исследования // Цитология и генетика. - 1987. т Т.21. - й 3. -

1. 186-190

31. Хохлов А.Н. "Возраст" клеточной популяции и кинетика &е юста. Теоретические и прикладные аспекты // В сб.: Структурные» юобешюсти п функциональные свойства биологических систем, [оклады НОШ, 1385. Общая биология. - П.: Наука, - 1937.

!. Б9-62

32. Хохлов А.Н., Кирнос Л.Д., Baimr.m Б.О. Уровень иетилироват шя ДНК н "стацпонврное старание" культивируемых клеток // 'зв9стия АИ СССР. Серия биологически Л. - 1988. - Л 3. - 0. 478-17а

33. Хохлов А.Н. Пролиферация и старение // В сб.: Бволопшокц? фобльм. старения и увеличения продолжительности игзнн (Натерпа^ хшфзрапщш НОШ, 1985 г.). - LÍ.: Наука. - 1933. - С. 40-15

34. Прохоров л.Ю., Хохлов А.Н. Исследование механизмов старошц

¡ псусцы« 0ц9шш &1фшзшн00тп клошфовшшя шаток in Vitro // ( • l сб.: Использование различии ;:зтодоо в изучении биологических потом. Доклады Н01Г\ 1983. Обчая биология. - U.: Наука. - Í063. I. 93-98

25. Гусев ¡J.D., Хохлов А.Н. Зволщиоштя цитогеронто. огия :оеоо аапрззлзхшэ асслэдоадвпЗ шхашзмов отарэшш // В сб,.\ ' ВсасовзшЗ сгэзд гороптологов н гериатров, 22-26 ноября 1Í¡38 г. '.Тбаласа. Тезпсы я рзфзрата докладов, чл - Itooo. - 1S30. ? 1 1. 182-183

36. Прохоров Л.О., Хохлов А.Н. Уэтодиса оцэша ЕфГзкхиваостз брпзовг-Ш1я колонна а датогзроптологзэтвеш) ясоладовяш // 3 ой--

ВсасогзццЯ сгоэд горонтологоз и горзатроа, 32-25 ноября 1GS0 г,, Тбилиси. Тозкси и рефераты докладов, 1.2. - Шив. - 1DB3. - Gf *í3b

37. Хохлов А.Н. Издодь Хейфдякз или ¡юдоль "стационарного ст^-. ¡ зпня" - что луч'гэ? // В сб.: ? Всоссшный съезд геронтологов у эриатроа, 22-25 ноября 1983 г., р.Тбмаси. Тооису и реферата окладов, 4.Z. Кнзв. - 1983. - 0. 683-687 ', V

GO. Прохоров Л.Ю., Хохлов А.Н. Косезшшэ «этодц оцовка оффзл-* зеяостл горопротопторов п геропрсмотороп // В сб.: Бисфш- ' оекпо л бкохгслгсоааз аспэкты (^нкщаиировашя'гзпмх дзетам, окладу Ж1Ш, 1987. Обяая биология. - M.j -Наука. 19 3,. - ; . 83-89 . • ' •

39. Уааков В .Л., Хохлов А.Н. 0. возможной св^за. арадоедрзшн-ого старания организма и изменений проли|«ращш его'чдотий // , сб.: йюфетч&скив а биохимические аспекта '"йУ!п<цноинрсЬс|и1я' ,< пшх «ястеу. Доклады Н0Ш1, '98?. Ойяая <5прлопш» - t*

0S9, с. вз-яз ■ : • \ '" -J- ч'

- sa -

40. Хохлов A.IÍ. Полоьыо клетки п отар-шш // В сб: Биофазп-чоскво и бпохимпчоокиа оспокти функционирования niEiix систем. Помада ШИП, 1937. Обэал биология. - М.: Наука. - 1939. -

0. 1Ю-11Э

41. Хохлоп А.Н. Геронтология, вдтогопотшса п стационарные кло-ïo'imro культуры // В сб.: Цнтогенетшсе стерошш. Материалы IV сигшогтумо, Тбилиси, П&-29 апреля 1909 г. - Тбилиси. - 1939. -

а. эя-зз

УЧАСТОК множительной Т {¿УНИКИ БОНЦ AV.il СССР

.ПОЯП.К ПЕЧАТИ 2г.'б.ви л - 15321 ЗАК.«ВВ ТИРАЖ 100

Информация о работе

Хохлов, Александр Николаевич
доктора биологических наук
Ленинград, 1989
ВАК 03.00.17

Автореферат

Похожие работы