Использование rhHsp70 для регуляции активности иммунокомпетентных клеток

Данилевский, Михаил Игоревич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Использование rhHsp70 для регуляции активности иммунокомпетентных клеток
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Использование rhHsp70 для регуляции активности иммунокомпетентных клеток"

иОЭ4УВБЬБ На правах рукописи

Данилевский Михаил Игоревич

Использование гЬШр70 для регуляции активности иммунокомпетентных клеток.

03.00.04-биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 1 ОКТ 2009

Москва

-2009

003478556

Работа выполнена на кафедре биологической химии лечебного факультета ГОУ ВПО Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова

Научный руководитель

член-корр. РАМН, доктор химических наук, профессор Северин Сергей Евгеньевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор

Глухов Александр Иванович

доктор биологических наук, профессор

Колесапова Екатерина Федоровна

Ведущая организация Учреждение Российской академии

наук Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Защита состоится "22" октября 2009 г. в 13_часов на заседании Диссертационного совета Д 001.010.01. при Учреждении Российской акдемии медицинских наук Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБМХ РАМН. Автореферат разослан"/Р" 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, JI у

кандидат химических наук '/ир Е.А. Карпова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Многие формы онкологических заболеваний до сих пор трудно поддаются современным методам терапии, основанным на хирургическом вмешательстве, использовании химиотерапии и лучевой терапии. Поэтому наряду с совершенствованием классических методов крайне актуальными являются исследования, направленные на создание новых стратегий борьбы с раком с помощью иммунотерапии, целью которых является как предупреждение развития опухолей, так и их элиминация, в частности, с использованием белков теплового шока (БТШ, Hsp) для специфической активации иммунной системы.

В 1980-х годах в экспериментах Р. К Srivastava и соавторов была обнаружена способность выделенных из опухолевых тканей БТШ разных семейств - Hsp70, gp96, Hsp90 - индуцировать клеточный противоопухолевый иммунный ответ (Srivastava Р. К. et al., 1998; Udono H. et al., 1994). Иммуногенность таких препаратов определяется присутствием в их составе опухолеспецифических антигенов (ОСА) или их фрагментов -опухолеспецифических пептидов (ОСП) - в виде прочно связанных комплексов с БТШ (Suto R. et al., 1995; Srivastava P. К. et al., 1998; Przepiorka D. et al., 1998; Ishii T. et al., 1999). Это открытие стимулировало исследования, направленные на создание реконструированных противоопухолевых вакцин на основе рекомбинантных белков Hsp70 и gp96 в виде комплексов с ОСА, в том числе с синтетическими МНС-рестриктированными ОСП, или в виде фьюжен-белков БТШ с ОСА, или в виде ДНК-вакцин, содержащих гены БТШ и ОСА (Blachere N.E. et al, 1997; Li Z et al., 2004; Wang X.Y. et al, 2005; Zhang X. et al, 2007).

Высокая иммуногенность комплексов ОСА с нативными и рекомбинантными Hsp70 и gp96 обусловлена способностью этих БТШ транспортировать ОСА в важнейшие антигенпредставляющие клетки организма - в дендритные клетки (ДК) (Arnold-Schild D. et al-, 1999; Noessner N. et al., 2002). В результате процессинга экзогенных антигенов в ДК образуются как пептиды, которые могут встраиваться в молекулы МНС класса II, так и

пептиды, которые могут встраиваться в молекулы МНС I, презентироваться в контексте этих молекул Т-лимфоцитам и распознаваться Т-клеточиым рецептором CD4+ и CD8+ цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ) соответственно. Полагают, что БТШ оптимизируют этот процесс, обеспечивая транспорт ОСП через внутриклеточные мембраны в те везикулы клетки, где происходит формирование комплексов пептидов с белками МНС I и II.

Кроме того, показано, что многие БТШ обладают иммунорегуляторной активностью и стимулируют созревание незрелых ДК и секрецию ДК цитокинов ИЛ-1, ИЛ-6, ФНОа и ИЛ-12, которые обеспечивают и поддерживают индукцию и пролиферацию антигенспецифических, в том числе, опухолеспецифических ЦТЛ (Kuppner М.С. et al., 2001; Asea A. et al., 2002, 2005). Однако, сведения об иммунорегуляторной активности БТШ весьма противоречивы. Важно отметить, что при исследовании даже высоко очищенных от эндотоксинов нативных и рекомбинантных эукариотических БТШ одни авторы обнаруживают у Hsp70 способность ускорять созревание ДК и активировать их функции (Asea А., 2005, 2007; Tsan M.F. et al., 2004), в то время как другие не находят у этого белка свойств цитокина и показывают, что его способность усиливать презентацию антигенов целиком определяется влиянием Hsp70 на внутриклеточную доставку пептидов при использовании антигенов в виде комплексов с Hsp70 (Bausinger Н. et al., 2002; Bendz H. et al., 2007). Разногласия в оценке иммунорегуляторной активности БТШ MOiyr зависеть как от особенностей использованных препаратов Hsp70, так и от выбранных клеточных моделей.

В связи с этим целью настоящей работы явилось изучение влияния рекомбинантного белка IIsp70AlB человека (rhHsp70) на активность ДК человека разной стадии созревания и возможности оптимизации противоопухолевого клеточного иммунного ответа при использовании реконструированных комплексов Hsp70 с ОСА.

Для достижения поставленной цели были сформулироваиы следующие задачи:

1. Выделение и очистка rhHsp70AlB из бактериальной массы штамма клеток E.coli, трансформированных экспрессионной плазмидой pQE80-hHSP70AlB, конструкция которой содержит полноразмерную последовательность гена HSP70A1B.

2. Характеристика полученного белка по молекулярной массе и иммунохимической активности с помощью электрофореза в ПААГе и иммуноблоттинга.

3. Исследование влияния rhllsp70 на активность NK-клеток, уровень секреции ФНОа незрелымиДК (нзДК) и зрелымиДК (зрДК) и способность ДК разной степени зрелости стимулировать пролиферацию и цитотоксическую активность (ЦТА) лимфоцитов.

4. Исследование возможности оптимизации индукции опухолеспецифических ЦТЛ при использовании комплексов ОСП MelanA/Mart с rhHsp70.

5. Исследование возможности оптимизации индукции опухолеспецифических ЦТЛ при использовании комплексов ОСА лизатов опухолевых клеток с rhHsp70.

Научная новизна работы.

Впервые обнаружено, что выделенный и очищенный из штамма-продуцента E.coli рекомбинантный белок теплового шока человека rhHsp70AlB по иммунохимическим свойствам отличается от rhHsc70 и rHsp70 М. tuberculosis, несмотря на высокую степень гомологии этих белков.

Впервые обнаружено, что rhHsp70AlB стимулирует секрецию ФНОа и повышает способность дендритных клеток стимулировать спонтанную ЦТА лимфоцитов только при действии на зрелые дендритные клетки.

Впервые показано, что введение комплексов опухолеспецифических антигенов с Hsp70 в ДК можно проводить в присутствии АДФ и Mg2+, что обеспечивает стабильность этих комплексов.

Впервые обнаружено, что использование различных опухолеспецифических антигенов при нагрузке зрелых ДК в форме комплексов с rhHsp70AlB позволяет индуцировать ЦТЛ с более высокой специфической цитотоксической активностью, чем при использовании свободных антигенов.

Практическая значимость исследования.

Обнаружено, что выделенный и очищенный из штамма-продуцента E.coli рекомбинантный белок теплового шока человека rhHsp70AlB обладает иммунорегулирующей активностью, но при этом оказывает разные эффекты на ДК человека на разных стадиях их дифференцировки: ускоряет созревание незрелых ДК и повышает их антигенпредставляющую способность, но активирует только зрелые ДК, стимулируя секрецию ФНОа и повышая их способность стимулировать ЦТА лимфоцитов, что необходимо учитывать, при создании вакцин на основе этого белка.

Обнаруженная возможность проводить введение комплексов антигенов с Hsp70 в ДК в присутствии комплексообразующих агентов АДФ и Mg2+ упрощает и делает более стабильной процедуру введения антигенов в ДК.

Продемонстрированная в работе оптимизация индукции клеточного иммунного ответа при стимуляция лимфоцитов ДК, в которые опухолеспецифические антигены вводили в виде комплексов с rhHsp70AlB позволяет рекомендовать этот белок для разработки реконструированных вакцин и для оптимизации приготовления ДК-вакцин.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на Российском Медицинском Форуме-2006 «Фундаментальная наука и практика» (2006, Москва), на International Scientific-Practical Interdisciplinary Workshop "New Technologies in Medicine and Experimental Biology" (2007, BangkokPattaya, Thailand), на Международной конференции "Физиология и патология иммунной системы" и IV Международной конференции по иммунотерапии (2008 г., Москва), на XII Онкологическом конгрессе (2008 г., Москва), на Иммунологическом форуме с международным участием (2008 г., Санкт-Петербург).

Публикаиии. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ: 3 статьи, опубликованные в журналах, состоящих в перечне ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК, и 5 публикаций, представленных в материалах конференций.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы и список цитированной литературы, включающий 142 источника. Работа иллюстрирована 21 рисунком и 1 таблицей.

Материалы и методы

1. Получение и очистка рекомбинантного Hsp70AlB человека. Белок Hsp70AlB получали из штамма-продуцента E.coli JM109, трансфицированного плазмидой pQE80-HSP70AlB с помощью металл-хелатной хроматографии. Чистоту полученного препарата оценивали по данным электрофореза в 12% ПААГе в восстанавливающих условиях с последующим окрашиванием Coomassie Brilliant Blue R-250 ("Sigma", США). Иммуноблоттинг белков rhHsp70, rhHsc70 и rHsp70 M. tuberculosis проводили по стандартному протоколу с использованием МоАТ к Hsp70 клона ЗАЗ (НуTest). Содержание примеси ЛПС в препарате rhHsp70 определяли с помощью ЛАЛ-теста (Charls Rivers Endosafe Inc.) в соответствии с прописью фирмы-изготовителя.

2. Получение ФИТЦ-производых препаратов. ФИТЦ-меченные препараты rhHsp70 и пептида из коровой области вируса гепатита С HCV2 (YLLPRRGPRL) получали при их инкубации с раствором ФИТЦ в карбонатном буфере. ФИТЦ-меченый rhHsp70 очищали на колонке с сефадексом G50. Очистку ФИТЦ-меченного пептида осуществляли с использованием ВЭЖХ на колонке Delta-Pack 300 Ci8. Детекцию проводили по поглощению в области 495 нм. Собирали фракцию со временем выхода 12,6 мин, замораживали и хранили при -70°С.

3. Культивирование клеток. Клетки Т-В-клеточной гибридомы линии Т2 культивировали в пластиковых флаконах ("Costar", США) в среде RPMI 1640 ("Sigma", США) с добавлением 10% сыворотки плодов крупного рогатого скота (СПК, "Gibco",ClIIA), 50 мкг/мл гентамицина; клетки адснокарциномы предстательной железы человека линии Dul45 - аналогично, но в среде DMEM; клетки аденокарциномы предстательной железы человека линии LNCaP - в смеси сред RPMI 1640 ("Sigma", США) и DMEM ("Sigma", США) (1:1), с добавлением 10% СПК и 5% сыворотки лошади ("Gibco", США), 50 мкг/мл гентамицина, в увлажненной среде при температуре 37°С в С02-инкубаторе при содержании С02 5%.

4. Получение дендритных клеток человека. НзДК получали из моноцитов периферической крови человека с использованием цитокинов ГМ-КСФ (предоставлен к.б.н. JI.E. Петровской, Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова) и ИЛ-4 (препарат ГУЗ"МНИИМЭ"). ЗрДК - при культивировании нзДК в течение 3 суток в присутствии ФНОа (50 нг/мл) и простагландина Е2 (1 мкг/мл).

5. Анализ фенотипа ДК. Фенотип ДК исследовали с использованием ФИТЦ-меченных антител к антигенам CD80, CD83, CD86 ("PharMingen", США) при помощи проточного цитофлуориметра EPICS-XL ("Coulter Electronics", США).

6. Определение уровня связывания и накопления ФИТЦ-меченного препарата rhHsp70 и пептида HCV2 проводили с помощью соответствующих ФИТЦ-мечешгых производных на приборе EPICS-XL ("Coulter Electronics", США).

7. Определение антигенпредставляннцей способности (АПС) ДК. АПС

ДК оценивали по уровню стимуляции пролиферации аллогенных Т-лимфоцитов с использованием 3Н-тимидина, который добавляли в культуральную среду на последние 18 часов культивирования. Уровень радиоактивности измеряли с помощью жидкостного сцинтилляционного

счетчика (LKB RakBeta). Интенсивность биосинтеза ДНК оценивали в импульсах/минуту.

8. Получение комплексов rhHsp70 с опухолеспсцифичсскими и вирусоспецифнческими антигенами проводили, смешивая rhHsp70 с пептидами или смесью лизатов (LNCaP и Dul45 в массовом соотношении 1:1), полученных путем проведения трех циклов замораживание (жидкий азот) -оттаивание (водяная баня, 37°С) клеток. При этом массовое соотношение rhHsp70 : антиген составляло в случае пептидов 1:1, а в случае лизатов - 1:2,5, с таким расчетом, чтобы конечная концентрация rhHsp70 при добавлении комплексов к культурам клеток составляла 20 мкг/мл. Далее смесь инкубировали в буферном растворе при +37° С в течение 60 минут, а затем вносили АДФ ("Sigma", США) и MgCl2 до конечных концентраций 0,5 мМ и 2 мМ соответственно и продолжали инкубацию еще 60 минут. Конечный объем смеси составлял 1/15 от объема среды в культурах.

9. Обработку ДК rhHsp70, пептидами, ОСА лизатов опухолевых клеток и комплексами rhHsp70 с антигенами проводили в присутствии полимиксина В (Sigma) (50 мкг/мл) для исключения влияния возможных примесей ЛПС. ДК собирали, ресуспендировали в свежей ПКС с цитокинами, добавляли к ним rhHsp70 в концентрации 20 мкг/мл и инкубировали на протяжении 4 или 18 часов в обычных условиях культивирования. Для нагрузки ДК комплексом rhHsp70+airrnieiibi ДК собирали, отмывали в бессывороточной среде RPMI 1640, ресуспендировали в среде AIM-V ("Gibco", США) и добавляли к ним комплекс гЫЬр70+антигепы. Инкубация с антигенами проводилась в СОг-инкубаторе на протяжении 4 часов в случае комплексов, полученных с использованием пептидов, или с пептидами и 18 часов в случае комплексов, полученных с использованием лизатов, или с лизатами опухолевых клеток (LNCaP и Dul45 в соотношении 1:1, концентрация белка лизата 60 мкг/мл).

10. Индукция антигснспецифичсских ЦТЛ. Контрольные и нагруженные антигенами ДК смешивали с аутологическими лимфоцитами в

соотношении 1:10. Индукцию ЦТЛ проводили в 24-луночном планшете ("Corning",США), каждая лунка содержала и 2,5-106 лимфоцитов в 1

мл среды. На следующий день после стимуляции и далее два раза в неделю к клеткам добавляли 30 ед/мл ИЛ-2 ("Sigma",США). На восьмой день проводили рестимуляцию лимфоцитов ДК, нагруженными соответствующими антигенами в описанных выше условиях. На 7 день после рестимуляции лимфоциты собирали, отмывали и использовали для определения цитотоксической активности (ЦТА) в отношении различных клеток мишеней.

11. Определение цитотоксической активности ЦТЛ с использованием хрома-51. ЦТА в отношении клеток Т-В-клеточной гибридомы человека линии Т2 или карциномы предстательной- железы линии LNCaP определяли в цитотоксическом тесте с использованием хрома-51. Для этого клетки-мишени линии Т2 и LNCaP инкубировали в 100 мкл среды с хромом-51 (150 мкКи) в течение 1 часа. Часть клеток Т2 в течение 1 часа нагружали пептидом для получения пептидспецифических клеток-мишеней. Затем клетки-мишени отмывали и добавляли в круглодонный 96-луночный планшет по 5 тысяч клеток на лунку к антигенспецифическим ЦТЛ, которые предварительно вносили в планшет в количестве 25-200 тысяч клеток на лунку. Соотношение клетки-мишени: клетки-эффекторы составляло от 1:5 до 1:40. Через 4 ч инкубации платы центрифугировали и по 100 мкл надосадочной жидкости собирали во флаконы для измерения радиоактивности на сцинтилляционном счетчике RackBeta ("LKB", Швеция). ЦТА лимфоцитов рассчитывачи по

формуле. Ц ГА ~ [РАопьгг Р Аспонтанный выход] * РА(Максимальный выход-спонтанный

выход)хЮ0%, где РА(0ПЬГГ) и РА(с„ый выход) - радиоактивность проб, где инкубировались опухолевые клетки-мишени с клетками-эффекторами или только клетки-мишени соответственно.

12. Определение концентрации цитокииов. Концентрацию ИФу и ФНОа в культуралыюй среде, собранной через 24 часа после рестимуляции лимфоцитов ДК, определяли с помощью ИФА в соответствии с прописью производителя.

13. Статистическая обработка результатов проводилась по методу Стьюдента с помощью компьютерной обработки данных в программе Microcal Origin 5,0.

Результаты и обсуждение.

1. Характеристика чистоты и иммунохимических свойств препарата rhHsp70AlB. После индукции экспрессии гена rhHsp70 в клетках Е.соН целевой белок в равной степени накапливается как в растворимой фракции цитоплазмы, так и в виде телец включения, что отличает данный штамм от описанных ранее систем экспрессии Hsp70, где основная масса (95%) рекомбинантного белка нарабатывалась в Е.соН в виде нерастворимых телец

А Б

Рис. 1. Элекгрофореграмма

м 1 " (А) и иммуноблот (Б)

препаратов Hsp70.

■шт

"Hi* ; М - белковые маркеры

молекулярной массы;

"ЧИП'ШШР

— 1 - rhHsp70A!B;

** ■ 2 - rHsp70 М. tuberculosis-,

3 - rhHsc70.

включения. Использование белка, содержащегося в тельцах включения, требует предварительной процедуры рефолдинга, не всегда приводящей к формированию нативной структуры, поэтому мы работали с белком, полученным из растворимой фракции. Процедура очистки с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-25 и аффинной хроматографии с использованием иминодиацетат-сефарозы, активированной ионами никеля, позволяет получить белок, чистота которого по данным электорофореза в ПААГе в присутствии ß-меркаптоэтанола составляет не менее 99% (рис. 1А). При исследовании иммунохимических свойств полученного белка rhHsp70 и белков rhHsc70 и rHsp70 М. tuberculosis с помощью иммуноблоттинга специфическое окрашивание белковой полосы МоАТ к Hsp70 обнаружено

только в случае rhHsp70, что свидетельствует о существовании особенностей в строении этих белков, несмотря на высокую степень консервативности. По результатам JIAJI-теста содержание эндотоксина в полученных нами препаратах составляло от 150 до 480 нг ЛПС на 1мг белка rhHsp70. В связи с этим все эксперименты проводили с использованием полимиксина В, связывающего ЛПС.

2. Исследование способности rhHsp70AlB связываться и эндоцитироваться дендритными клетками разной степени зрелости. На следующем этапе исследования была изучена способность ДК связывать и эндоцитировать rhHsp70 и специфичность связывания rhHsp70 с ДК. Полученные результаты представлены на Рис. 2 и из них следует, что rhHsp70 при инкубации с ДК при +4 °С связывается с этими клетками (Рис. 2А, кривая 2),

Рис. 2. Связывание и эпдоцитоз меченного ФИТЦ гЬШр70 дендритными клетками. А - связывание ФИТЦ-гЬШр70 (20 мкг/мл) при +4°С (2);

Б - связывание ФИТЦ-гЬШрУО при +4«С (2) и в присутствии 5-и кратного избытка немеченого гЬ№р70 (3); В - эндоцитоз ФИТЦ-гЫЬр70 при +37°С (4); А-В -1 - аутофлуоресценция клеток.

и что связывание носит специфический характер, т.к. предварительная инкубации ДК в присутствии 100 мкг/мл немеченого гШзр70 полностью блокирует связывание меченного ФИТЦ гЫТйр70 с ДК (Рис.2Б, кривая 3 по

сравнению с кривой 2). При инкубации ДК с меченным ФИТЦ гЬНБр70 при +37 °С обнаружено значительно более высокое накопление красителя в ДК, чем при исследовании связывания при +4 °С (Рис.2 Б, кривая 4 по сравнению с Рис.2А, кривая2), что свидетельствует об интенсивном эндоцитозе этого белка ДК.

3. Исследование влияния гЬН5р70А1В на созревание ДК. Для исследования влияния гЬНзр70 на созревание ДК этот белок смешивали с полимиксином В для инактивации незначительной примеси ЛПС в препаратах

ч зв

>. 25

S 20 S

t> ф

а 15 с

Л «

1 Ф

® s

1 □ -Контроль

2 н -rhHsp70

- 3 83 -ФНО альфа

CD80 CD83 С 086

Молекулы клеточной поверхности дендритиых клгток

Рис.3. Влияние rhHspTO на созревание ДК. Представлены данные одного из трех типичных экспериментов.

и спустя 30 мин добавляли к культуре ДК в концентрации 20 мкг/мл. Для получения контрольных зрДК в качестве факторов созревания использовали ФНОа (50 нг/мл) и препарат лейкинферон (100 МЕ/мл), содержащий ИФа и смесь цитокинов. Полученные результаты представлены на Рис.3. Оказалось, что при действии Hsp70 на ДК спустя 48 часов после добавления белка отмечается небольшое увеличение экспрессии молекул CD80 и CD86: возрастает средняя интенсивность флуоресценции клеток (MFI) на 2-4 усл. ед. (Рис.3) и на 5-10% возрастает количество ДК, экспрессирующих эти маркеры. Увеличение экспрессии маркеров созревания при инкубации ДК с ФНОа и

лейкинфероном было в несколько раз выше, чем при инкубации с гШзр70, и, тем не менее, полученные результаты свидетельствуют об ускорении созревания ДК в присутствии Н«р70.

4. Изучение влияния белка гЬНвр70 на уровень секреции ФНОа дендритными клетками человека. Для изучения влияния белка гЬНяр70 на способность ДК секретировать ФНОа гЬНБр70 в концентрации 20 мкг/мл добавляли к нзДК и к зрДК в полной культуральной среде и продолжали культивирование в течение 24 часов. После этого кульгуральную среду собирали для исследования содержания ФНОа с помощью ИФА.

А Б

Нврез!ЬЕдеш{11пга>ЕК11егки Зретьедешришы'ктспки

Рнс.4. Влияние

I белка гЬШр70 на уровень секреции ФНОа незрелыми (А) и зрелыми (Б) дендритными клетками.

Кт>ро№ ЛЩЯ) Кошрот. ЛйрЯ

Полученные результаты представлены на Рис.4. Показано, что после культивирования гШзр70 с нзДК не обнаружено значимых изменений в концентрации ФНОа, а после культивирования со зрДК она возрастала на 52%. Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что гЬНзр70 повышает секрецию клетками ФНОа только при действии на зрДК.

5. Изучение влияния гЫЬр70 на антигенпредставляющую способность ДК. Для исследования влияния гШзр70 на активность ДК анализировали его влияние на антигенпредставляющую способность нзДК. Для этого ДК, собранные на шестые сутки культивирования инкубировали с гЬНзр70 в течение 18 часов. Затем ДК рассаживали в 96-ти луночные планшеты в количестве 0-10000 клеток на лунку в 100 мкл среды и к ним вносили аллогенные лимфоциты (200 тысяч/лунку в 100 мкл среды). Смешанные

культуры инкубировали 5 суток в обычных условиях культивирования и по включению 3Н-тимидина, оценивали уровень стимуляции пролиферации

■е зоо

| .50

| 250

350

Рис.5. Влияние гМ1$р70 на антигеппредставляющую активность ДК человека. 1 - контрольные ДК;

2 - ДК после культивирования в течение 18 часов с гЬШр70.

0 1:160 1:80

лимфоцитов контрольными ДК и ДК, обработанными г(1Шр70. Представленные на Рис.5 результаты показывают, что предварительная инкубация нзДК с гЬНБр70 в течение 18 часов приводила к более интенсивной стимуляции пролиферации аллогенных лимфоцитов, чем при их стимуляции контрольными ДК. Таким образом, обработка ДК гЬНзр70 приводит к повышению их антигенпредставляющей способности.

6. Изучение влияния белка гЬШр70 на способность дендритных клеток человека стимулировать неспецифическую ЦТА лимфоцитов. Для изучения влияния гШ5р70 на способность ДК разной стадии дифференцировки влиять на уровень спонтанной ЦТА лимфоцитов нами были использованы клетки-мишени линии Т2. Полученные результаты представлены на Рис.6. Из них видно, что при обработке зрДК в течение 4 часов белком гЬН5р70 наблюдалось небольшое повышение их способности стимулировать спонтанную ЦТА в отношении клеток Т2 (Рис. 6Б, кривая 2). Обработка нзДК гЬНхр7П не оказывала значительного влияния на уровень неспецифической ЦТА в отношении клеток-мишеней Т2. Аналогичные данные получены в отношении клеток Т2, обработанных пептидом, и в отношении клеток линии

ЬпСаР. Таким образом, гЬ№р70 только при действии на зрДК повышает их способность к стимуляции спонтанной ЦТА лимфоцитов.

та

о 10 а зэ 4)

Соотношение эффектор:мишень

Соотношение 'Эффектор:мишень

Рис.б. Влияние обработки ДК белком гЬНврТО на уровень ЦТА индуцированных лимфоцитов. А - незрелые ДК; Б - зрелые ДК; 1 - контрольные ДК; 2 - ДК, обработанные гЬШрТО.

Резюмируя полученные результаты можно заключить, что гЬН5р70 специфически связывается и эндоцитируется ДК человека. Взаимодействие ЛШрУО с нзДК приводит к стимуляции их созревания, повышению антигенпредставляющей активности. Взаимодействие гЫ1йр70 со зрДК приводит увеличению уровня секреции ФНОа зрелыми ДК. При культивировании зрДК, обработанных предварительно гЬНзр70, обнаружено повышение ЦТА стимулированных ими лимфоцитов.

Таким образом, в условиях, исключающих действие возможной примеси ЛПС благодаря использованию полимиксина В, обнаружено, что гЬНзр70А1В обладает иммунорегулирующей активностью.

7. Изучение влияния белка г11Шр70 на активность естественных киллеров. НБр70 может оказывать влияние на систему врожденного иммунитета, регулируя активность естественных киллеров (КК-клеток). Целью данного раздела работы явилось исследование влияния гЬНкр70 на активность

МК-клеток. Для этого с помощью проточной цитофлуориметрии исследовали содержание гранзима В - одного из белков, определяющих механизм цитолитического действия Т^К-клеток на клетки-мишени. Для этого мононуклеарные лимфоциты, выделенные из периферической крови в течение 24 часов, инкубировали в присутствии ИЛ-2 для активации МК-клеток, а затем

г? о

§ 60

8- 50 ч:

о о

40 30 20 10 о

Рис. 7. Активация !ЧК-клсток при культивировании лимфоцитов в присутствии гЫЬ|)70.

на 48 часов вносили препарат гЬНзр70. После окончания инкубации проводили окрашивание клеток меченными фикоэритрином антителами к СЭ56, специфически связывающимися с МК-клетками, Затем клетки фиксировали и проводили реакции внутриклеточного окрашивания клеток меченными ФИТЦ антителами к гранзиму В. Показано, что внесение препаратов гШзр70 к мононуклеарным лейкоцитам приводило к увеличению количества Ж-клеток , и, кроме того, под влиянием гЬНБр70 происходило повышение доли КК-клеток, содержащих гранзим В (Рис.7), что свидетельствует об усилении их цитолитической активности. Таким образом, использование препаратов гЬНзр70 повышает функциональную активность ЫК-клеток, что может иметь

1 2 С056СгВ+

большое значение при создании вакцин на основе препарата рекомбинантного гЬН5р70.

8. Влияние обработки ДК комплексом гЬН$р70 с опухолеспецифическим пептидом на антигенспецифическую ЦТА индуцированных лимфоцитов. Специфическую ЦТА лимфоцитов индуцировали с помощью ДК, нагруженных пептидом Ме1апА/Маг1 или комплексом гЬН5р70-пептид, контролем служили необработанные ДК (Рис.8).

Соотношение эффсктор:мншень

Рнс.8. Антнгенспецифическая ЦТА лимфоцитов, пндуцировашых контрольными зрДК (1) или зрДК, нагруженными пептидом 1\1е1апА/1\1а|Ч (2), пли комплексом пептида Ме1апА/Маг1 с гЬ№р70 (3), в отношении клеток Т2, рассчитанная по разности ЦТА в отношении контрольных клеток линии Т2 н специфических для данного пептида клеток-мишеней Т2, полученных при инкубации клеток Т2 с этим пептидом.

Инкубация лимфоцитов со зрДК, обработанными комплексом гЬН5р70-пептид (Рис.8, кривая 3), позволяет получить более высокий уровень специфической ЦТА по сравнению с теми случаями, когда лимфоциты инкубировали с контрольными ДК (Рис.8, кривая 1) или ДК, обработанными свободным пептидом (Рис.8, кривая 2). В последних двух вариантах уровень ЦТА был практически одинаков. Таким образом, введение пептида в зрДК в виде комплекса с гШ5р70 позволяет уже после двух стимуляций лимфоцитов такими ДК индуцировать специфический цитотоксический ответ, чего не происходит при введении в ДК свободного пептида.

9. Влияние обработки ДК комплексом гЬШр70 с ОСА лизата опухолевых клеток на антигенспсцифическую ЦТА индуцированных лимфоцитов. Результаты, полученные при индукции ЦТЛ нзДК, нагруженными комплексами гЬНзр70 с лизатами опухолевых клеток, представлены на Рис.9. Сравнивая ЦТА лимфоцитов, индуцированных нзДК, которые были нагружены лизатом (кривая 2) или комплексом пептидов лизата с

СЬопюиснЕ эффекгормшаъ

Рис.9. Аптигснспецифическая ЦТА лимфоцитов, индуцированных контрольными нзДК (1) или нзДК, нагружеными лизатом опухолевых клеток (2), или нзДК, обработанными гШ8р70 (3) или комплексом пептидов лизата с гЬШр70 (4). Представлены данные одного из трех типичных экспериментов.

гЬШр70 (кривая 4), с контрольными нзДК (кривая 1) и с нзДК, обработанными только гЬШр70 (1фивая 3), следует отметить следующее. При взаимодействии нзДК, нагруженных только лизатом опухолевых клеток, при двух циклах стимуляции лимфоцитов не удавалось получить ЦТЛ с ЦТА более высокой, чем при использовании контрольных ДК, более того, в этих условиях отмечено снижение ЦТА лимфоцитов. При стимуляции лимфоцитов нзДК, обработанными только гШзр70, их ЦТА не отличалась от контроля. И только при индукции ЦТЛ нзДК, нагруженными комплексами гЫ1Бр70 с лизатами опухолевых клеток (кривая 4), ЦТА лимфоцитов была более высокой, чем при остальных рассмотренных условиях. Полученные результаты свидетельствуют о том, что использование комплексов гШзр70 с пептидами лизатов опухолевых

клеток, даже в случае использования нзДК, позволяет индуцировать более активные ЦТЛ.

Результаты, полученные при индукции ЦТЛ зрДК, нагруженными комплексами гШБр70 с пептидами лизатов опухолевых клеток, представлены на Рис.10.

Рис.10. Антигенспецифическая ЦТА лимфоцитов в отношении клеток-мишеней линии ЬпСаР, индуцированная контрольными зрДК (1) или зрДК, нагруженными л тагом опухолевых клеток (2), или зрДК, обработанными белком гЫ1$р70 (3) или комплексом пептидов лизата с гМЬр70 (4).

Сравнивая ЦТА лимфоцитов, индуцированных зрДК, которые были нагружены лизатом или комплексом пептидов лизата с контрольными зрДК и со зрДК, обработанными только гЫЬр70, следует отметить, прежде всего то, что при взаимодействии зрДК, нагруженных только лизатом опухолевых клеток при двух циклах стимуляции лимфоцитов, также не удавалось получить ЦТЛ с ЦТА, более высокой, чем при использовании контрольных ДК. Аналогичные значения ЦТА индуцированных лимфоцитов получены и при стимуляции лимфоцитов зрДК, обработанными только гШзр70, хотя при высоком соотношении эффектор:мишень более заметно выявляется стимулирующее действие гЫТяр70. И только при индукции ЦТЛ зрДК, нагруженными комплексами гЬШр70 с пептидами лизатов опухолевых клеток

(кривая 4), ЦТА лимфоцитов была существенно более высокой, причем ЦТА при низких соотношениях эффектор:мишень очень существенно превосходила уровень ЦТА, наблюдаемый при остальных рассмотренных условиях, превышая его на 20 - 40%.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что использование комплексов гЬНзр70 с лизатами опухолевых клеток, в случае зрДК, позволяет индуцировать ЦТЛ с наиболее высокой ЦТА.

10. Содержание ИФу и ФНОа в культуральной среде лимфоцитов через 24 часа после рестимуляции ДК. Результаты, полученные при исследовании влияния предварительной инкубации ДК с лизатом опухолевых клеток, белком гЬНзр70 или комплексом гШзр70 с антигенами из лизатов

Рис. 11. Содержание ИФу в культуральной среде лимфоцитов через 24 часа после 2-й стимуляции нзДК (А) или зрДК (Б) после предварительной инкубации ДК (18 часов) с препаратом гКНхр7(1 или комплексом г1|Н*р70 с антигенами из смеси лизатов опухолевых клеток.

опухолевых клеток на способность ДК стимулировать секрецию ИФу и ФНОа лимфоцитами, представлены на Рис.11 и Рис. 12. Из этих результатов видно, что содержание ИФу в культуральной среде лимфоцитов через 24 часа после рестимуляции лимфоцитов ДК было максимальным в том случае, если ДК предварительно подвергались обработке комплексом гШ5р70 с антигенами из лизатов опухолевых клеток. Такой эффект наблюдался как в случае обработки

комплексом зрДК, так и в случае обработки комплексом нзДК. Содержание ИФу в культуральной среде лимфоцитов, инкубировавшихся с такими ДК, было в несколько раз выше, чем содержание И Фу в культуральной среде лимфоцитов, инкубировавшихся с ДК, обработанными белком гЬНБр70 или лизатом, или с контрольными ДК.

Обработка ДК белком гШ5р70 приводила к тому, что при последующей инкубации таких ДК с лимфоцитами, содержание ИФу в культуральной среде снижалось по сравнению с контролем в случае обработки гЫ1зр70 нзДК и увеличивалось в случае такой обработки зрДК. Обработка нзДК лизатом опухолевых клеток приводила к двукратному повышению концентрации ИФу в среде.

Рис.12. Содержание ФНОп в культуральной среде лимфоцитов, через 24 часа после 2-й стимуляции нзДК (А) или зрДК (Б) после предварительной инкубации ДК (18 часов) с препаратом )ЬШр70 или комплексом гЬШр70 с антигенами из смеси лизатов опухолевых клеток.

Аналогичные результаты по влиянию комплекса гЬН8р70 с антигенами из лизатов опухолевых клеток были получены в отношении ФНОа (Рис.12). Предварительная обработка ДК таким комплексом приводила к тому, что содержание ФНОа в культуральной среде лимфоцитов, индуцированных такими ДК, было более высоким, чем в других сериях. Таким образом, использование для стимуляции лимфоцитов ДК, обработанных комплексами ОСА с гШзр70, приводит к повышению секреции лимфоцитами ИФу и ФНОа.

Выводы.

1. Обнаружено, что выделенный и очищенный из штамма-продуцента E.coli рекомбинантный белок теплового шока человека rhHsp70AlB по иммунохимическим свойствам отличается от rhHsc70 и rlísp70 М. tuberculosis.

2. Показано, что rhHsp70AlB специфически связывается и эндоцитируется дендритными клетками человека.

3. Показано, что rhHsp70AlB ускоряет созревание незрелых дендритных клеток человека и повышает их антигенпредставляющую способность, а также индуцирует цитолитическую активность NK-кдеток.

4. Обнаружено, что rhHsp70AlB стимулирует секрецию ФНОа и повышает способность дендритных клеток стимулировать неспецифическую ЦТА лимфоцитов при действии только на зрелые дендритные клетки.

5. Показано, что введение комплексов антигенов с Hsp70 в дендритные клетки можно проводить в присутствии АДФ и Mg2+, что обеспечивает стабильность этих комплексов.

6. Обнаружено, что использование различных опухолеспецифических антигенов при нагрузке зрелых дендритных клеток в форме комплексов с rhIísp70AlB позволяет индуцировать ЦТЛ с более высокой специфической цитотоксической активностью, чем при использовании свободных антигенов.

7. Показано, что стимуляция лимфоцитов дендритными клетками, в которые опухолеспецифичсские антигены вводили в виде комплексов с rhHsp70AlB, сопровождалась более высоким уровнем секреции цитокинов ФНОа и ИФ-у.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Савватеева Л.В., .Гороховец Н.В., Черников В.А., Данилевский М.И., Северин С.Е. Получение рекомбинантного HSP70 человека. // Тезисы докладов Российского Медицинского Форума-2006 «Фундаментальная наука и практика». - Москва,2006. - С.119.

2. Савватеева Л.В., Гороховец Н.В., Черников В.А., Данилевский М.И., Северин С.Е. Получение рекомбинантного HSP70A1B человека. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2007. - №3. - С.38-42.

3. Savvateeva LV, Gorokhovets NV, Chernikov VA, Danilevskiy MI, Severin SE. Recombinant human HSP70 and its potential application in cancer immunotherapy. // Abstracts of the International Scientific-Practical Interdisciplinary Workshop "New Technologies in Medicine and Experimental Biology". - Bangkok-Pattaya,2007. - P.62.

4. Данилевский М.И., Москалева Е.Ю., Гороховец H.B., Попова О.Н., Северин С.Е. Иммунорегулирующая активность рекомбинантного Hsp70AiB человека. // Российский иммунологический журнал. - 2008. - т.2. - С. 123.

5. Москалева Е.Ю., Данилевский М.И., Гукасова Н.В., Морозова Н.С., Гороховец Н.В., Попова О.Н., Северин С.Е. Влияние препаратов человеческого и туберкулезного рекомбинантных белков теплового шока HSP70 на активность дендритных клеток и естественных киллеров. // Аллергология и иммунология. - 2008. - т.9(3) - С.257.

6. Гороховец Н.В., Данилевский М.И., Москалева Е.Ю., Северин С.Е. Характеристика рекомбинантного белка теплового шока Hsp70AlB человека как основы для создания противоопухолевых вакцин. // Материалы XII Онкологического конгресса. - Москва,2008. - С. 212.

7. М. И. Данилевский, Е.Ю. Москалева, Н. В. Гороховец, О.Н. Попова, . Д.Л. Беляев, С.Е. Северин. Влияние рекомбинантного белка теплового шока

Hsp70 человека на активность дендритных клеток разной стадии созревания. // Молекулярная Медицина. - 2009. - №3. - С.45-51.

8. Данилевский М.И., Москалева ЕЛО., Попова О.Н., Макаров В.А., Сахибов Я.Д., Сагдиева Н.Ш., Позднякова Л.П., Свешников П.Г., Северин С.Е. Влияние АДФ на способность дендритных клеток человека индуцировать антигенспецифические ЦТЛ in vitro. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2009. - №4. - С.28-33.

Подписано в печать: 16.09.2009

Заказ № 2508 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Данилевский, Михаил Игоревич

Список сокращений. Стр.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Основные свойства белков теплового шока.

1.1.1. Открытие иммуногенных свойств комплексов

Hsp70 с пептидами.

1.1.2. БТШ. Классификация и функции.

1.1.3. Особенности генов, полиморфизм, строение и локализация БТШ70.

1.2. Рецепторы Hsp70.

1.2.1. Toll-like рецепторы.

1.2.2. Рецептор CD40.

1.2.3. Эндоцитирующие рецепторы: CD91 и scavenger».

1.3. Возможные клетки-мишени для Hsp70.

1.3.1. Влияние на дендритные клетки.

1.3.2. Влияние на естественные киллеры (NK-клетки).

Глава 2. Материалы и методы.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Характеристика чистоты и иммунохимических свойств препарата rhHsp70А1В.

3.2. Исследование влияния rhHsp70AlB на свойства и функции ДК.

3.2.1. Характеристика ДК.

3.2.2. Исследование способности rhHsp70AlB связываться и эндоцитироваться ДК разной степени зрелости.

3.2.3. Исследование влияния rhHsp70AlB на созревание ДК.

3.2.4. Изучение влияния белка rhHsp70 на уровень секреции ФНОа дендритными клетками человека.

3.2.5. Изучение влияния rhHsp70 на антигенпредставляющую способность ДК.

3.2.6. Изучение влияния белка rhHsp70 на способность дендритных клеток человека стимулировать неспецифическую (спонтанную) ЦТА лимфоцитов.

3.3. Изучение влияния белка rhHsp70 на активность естественных киллеров.

3.4. Исследование влияния АДФ на функции ДК.

3.4.1. Исследование влияния АДФ на способность ДК эндоцитировать ФИТЦ-меченный пептид.

3.4.2. Исследование способности зрелых ДК, обработанных вирусоспецифическим пептидом или лизатами опухолевых клеток в присутствии АДФ, индуцировать продукцию ФНОа и ИФу лимфоцитами.

3.4.3. Исследование влияния АДФ, добавляемого при нагрузке ДК пептидными антигенами и антигенами из лизатов опухолевых клеток, на способность ДК активировать неспецифическую и индуцировать антигенспецифическую ЦТА лимфоцитов.

3.5. Изучение эффективности индукции антигенспецифических ЦТЛ при использовании комплексов rhHsp70 с антигенами для оптимизации введения антигенов в дендритные клетки человека

3.5.1. Изучение влияния обработки дендритных клеток человека свободным меланомаспецифическим пептидом MelanA/Mart и его комплексами с rhHsp70 на цитотоксическую активность индуцированных ими ЦТЛ в зависимости от степени зрелости дендритных клеток

3.5.2. Изучение влияния обработки дендритных клеток человека комплексами rhHsp70 с пептидами лизата опухолевых клеток на цитотоксическую активность индуцированных ими ЦТЛ в зависимости от степени зрелости дендритных клеток.

3.5.3. Анализ уровня секреции цитокинов ИФу и ФНОа лимфоцитами после их стимуляции ДК, обработанными комплексами rhHsp70 с антигенами лизатов опухолевых клеток.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование rhHsp70 для регуляции активности иммунокомпетентных клеток"

В 1980-х годах в экспериментах Р. К Srivastava и соавторов была обнаружена способность выделенных из опухолевых тканей БТШ разных семейств - Hsp70, gp96, Hsp90 - индуцировать клеточный противоопухолевый иммунный ответ [1,2]. Иммуногенность таких препаратов определяется присутствием в их составе опухолеспецифических антигенов (ОСА) или их фрагментов — опухолеспецифических пептидов (ОСП) - в виде прочно связанных комплексов с БТШ [1,3-5]. Это открытие стимулировало исследования, направленные на создание реконструированных противоопухолевых вакцин на основе рекомбинантных белков Hsp70 и gp96 в виде комплексов с ОСА, в том числе с синтетическими МНС-рестриктированными ОСП, или в виде фьюжен-белков БТШ с ОСА, или в виде ДНК-вакцин, содержащих гены БТШ и ОСА [6-9].

Высокая иммуногенность комплексов ОСА с нативными и рекомбинантными Hsp70 и gp96 обусловлена способностью этих БТШ транспортировать ОСА в важнейшие антигенпредставляющие клетки организма - в дендритные клетки (ДК) [10,11]. В результате процессинга экзогенных антигенов в ДК образуются пептиды, которые могут встраиваться в молекулы МНС класса II и пептиды, которые могут встраиваться в молекулы МНС I, презентироваться в контексте этих молекул

Т-лимфоцитам и распознаваться Т-клеточным рецептором CD4+ и CD8+ цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ) соответственно. Полагают, что БТШ оптимизируют этот процесс, обеспечивая транспорт ОСП через внутриклеточные мембраны в те везикулы клетки, где происходит формирование комплексов пептидов с белками МНС I.

Кроме того, показано, что многие БТШ обладают иммунорегуляторной активностью и стимулируют созревание незрелых ДК и секрецию ДК цитокинов ИЛ-1, ИЛ-6, ФНОа и ИЛ-12, которые обеспечивают и поддерживают индукцию и пролиферацию антигенспецифических, в том числе, опухолеспецифических ЦТЛ [12-14]. Однако, сведения об иммунорегуляторной активности БТШ весьма противоречивы. Важно отметить, что при исследовании даже высоко очищенных от эндотоксинов нативных и рекомбинантных эукариотических БТШ одни авторы обнаруживают у Hsp70 способность ускорять созревание ДК и активировать их функции [13-15], в то время как другие не находят у этого белка свойств цитокина и показывают, что его способность усиливать презентацию антигенов целиком определяется влиянием Hsp70 на внутриклеточную доставку пептидов при использовании антигенов в виде комплексов с Hsp70 [16,17]. Разногласия в оценке иммунорегуляторной активности БТШ могут зависеть как от особенностей использованных препаратов Hsp70, так и от выбранных клеточных моделей.

В связи с этим целью настоящей работы явилось изучение влияния рекомбинантного белка Hsp70AlB человека (rhHsp70) на активность ДК человека разной стадии созревания и возможности оптимизации противоопухолевого клеточного иммунного ответа при использовании реконструированных комплексов Hsp70 с ОСА.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

3. Исследование влияния rhHsp70 на активность NK-клеток, уровень секреции ФНОа незрелыми ДК (нзДК) и зрелыми ДК (зрДК) и способность ДК разной степени зрелости стимулировать пролиферацию и цитотоксическую активность (ЦТА) лимфоцитов.

Научная новизна работы.

Впервые показано, что введение комплексов опухолеспецифических антигенов с Hsp70 в ДК можно проводить в присутствии АДФ и Mg~ , что обеспечивает стабильность этих комплексов.

Практическая значимость исследования.

Обнаруженная возможность проводить введение комплексов антигенов с л 1

Hsp70 в ДК в присутствии комплексообразующих агентов АДФ и Mg упрощает и делает более стабильной процедуру введения антигенов в ДК. Продемонстрированная в работе оптимизация индукции клеточного иммунного ответа при стимуляция лимфоцитов ДК, в которые опухолеспецифические антигены вводили в виде комплексов с rhHsp70AlB позволяет рекомендовать этот белок для разработки реконструированных вакцин и для оптимизации приготовления ДК-вакцин.

Bangkok-Pattaya, Thailand), на Международной конференции "Физиология и патология иммунной системы" и IV Международной конференции по иммунотерапии (2008 г., Москва), на XII Онкологическом конгрессе (2008 г., Москва), на Иммунологическом форуме с международным участием (2008 г., Санкт-Петербург).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ: 3 статьи, опубликованные в журналах, состоящих в перечне ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК, и 5 публикаций, представленных в материалах конференций.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Данилевский, Михаил Игоревич

Выводы.

2. Показано, что rhHsp70AlB специфически связывается и эндоцитируется дендритными клетками человека.

3. Показано, что rhHsp70AlB ускоряет созревание незрелых дендритных клеток человека и повышает их антигенпредставляющую способность, а также активирует NK-клетки.

4. Обнаружено, что rhHsp70AlB стимулирует секрецию ФНОа и повышает способность дендритных клеток стимулировать спонтанную ЦТА лимфоцитов при действии только на зрелые дендритные клетки.

5. Показано, что введение комплексов антигенов с Hsp70 в дендритные клетки можно проводить в присутствии АДФ и Mg , что обеспечивает стабильность этих комплексов.

6. Обнаружено, что использование различных опухолеспецифических антигенов при нагрузке зрелых дендритных клеток в форме комплексов с rhHsp70AlB позволяет индуцировать ЦТЛ с более высокой специфической цитотоксической активностью, чем при использовании свободных антигенов.

7. Показано, что стимуляция лимфоцитов дендритными клетками, в которые опухолеспецифические антигены вводили в виде комплексов с rhHsp70AlB, сопровождалась более высоким уровнем секреции цитокинов ФНОа и ИФу.

Заключение.

В результате проведенной работы был выделен из штамма-продуцента, очищен и охарактеризован рекомбинантный белок Hsp70AlB человека. Используемый при очистке протокол позволяет получить белок с чистотой не менее 99% (рис. 1). Чистота препарата подтверждена данными электрофореза и иммуноблоттинга. Кроме того, с помощью иммуноблоттинга показано отсутствие взаимодействия препаратов rhHsc70 и rHsp M.tuberculosis в отличие от rhHsp70 с использовавшимися нами МоАТ к белку rhHsp70 (рис. 2). Этот факт свидетельствует о том, что, несмотря на очень высокий уровень гомологии между белками семейства HSP70, их иммунохимические свойства имеют значительные различия, что может обусловливать различия и в иммунорегулирующих свойствах. Содержание эндотоксина в полученных нами препаратах rhHsp70 согласно результатам JIAJI-теста составляло от 150 до 480 нг ЛПС на 1мг белка. В связи с этим, а также для исключения влияния на результаты исследований возможных примесей ЛПС в других реактивах, все эксперименты проводили с использованием полимиксина В, связывающего ЛПС.

Иммунорегуляторные свойства rhHsp70AlB и иммуногенные свойства его комплексов с ОСА были изучены нами в экспериментах с ДК.

В экспериментах с ФИТЦ-меченным белком нами показано, что rhHsp70AlB связывается с ДК, причем это связывание является высокоспецифическим (рис. 4). Уровень связывания rhHsp70 с ДК зависит от степени их зрелости, достигая более высоких значений при взаимодействии белка со зрелыми ДК, что, по всей видимости, связано с увеличением количества рецепторов к Hsp70 при созревании ДК (рис. 5). В соответствии с литературными данными, одним из наиболее вероятных рецепторов в этом случае является CD40 [101,102]. Показана также способность ДК накапливать rhHsp70AlB. Таким образом, rhHsp70AlB специфически взаимодействует с ДК и, следовательно, может оказывать влияние на их свойства и функции.

Взаимодействуя с незрелыми ДК, rhHsp70 несколько ускоряет их созревание, что наблюдается по повышению уровня экспрессии CD80, CD86 и в меньшей степени CD83 (рис. 6). Тем не менее, созревание, индуцированное rhHsp70, выражено в значительно меньшей степени, по сравнению с созреванием, вызванным ФНОа и лейкинфероном, и ДК, полученные при обработке rhHsp70, занимают промежуточное положение между зрелыми и незрелыми ДК. Таким образом, для получения полноценных зрелых ДК недостаточно сигнала только от rhHsp70. В то же время в исследовании по изучению влияния rhHsp70 на АПС незрелых ДК, проведенные в аллогенной системе, выявили стимулирующие свойства rhHsp70 (рис. 8).

Кроме того, показано, что обработка зрелых ДК белком rhHsp70 приводит к увеличению уровня секреции ФНОа (рис. 7) и повышает их способность к индукции спонтанной ЦТА лимфоцитов (рис. 9).

Таким образом, в условиях, исключающих действие незначительной примеси ЛПС благодаря использованию полимиксина В, обнаружено, что rhHsp70AlB обладает иммунорегулирующей активностью.

Для образования комплексов ОСА с rhHsp70 необходимо использовать

АДФ и Mg2+ и целесообразно добавлять приготовленные комплексы, не удаляя эти компоненты, что обеспечило бы более длительную стабильность комплексов. Но поскольку присутствие АДФ и Mg в смеси для получения комплексов могло повлиять на результаты исследований при добавлении к

ДК, нами было изучено их воздействие на способность ДК индуцировать специфические ЦТЛ. Эксперименты, проведенные с этой целью, показали

2+ отсутствие отрицательного влияния АДФ и Mg на накопление зрелыми ДК антигенов. Более того, инкубация зрелых ДК с АДФ приводила к повышению их способности активировать лимфоциты, что оценивалось по уровню продукции цитокинов индуцированными лимфоцитами (рис. 12). В целом же,

2+ влияние АДФ и Mg на функции ДК является незначительным по сравнению с эффектами, обусловленными воздействием на ДК комплексов rhHsp70-антиген.

Исследования, проведенные нами для изучения иммуногенных свойств комплексов rhHsp70 с антигенами, показали, что введение опухолеспецифического пептида в зрелые ДК в виде комплексов с rhHsp70 позволяет за два цикла стимуляции такими ДК индуцировать специфическую ЦТА лимфоцитов, чего не происходит при введении в ДК свободного пептида (рис. 16). Более того, нагрузка ДК комплексами rhHsp70 с лизатами опухолевых клеток, даже в случае использования незрелых ДК, позволяет индуцировать более активные ЦТЛ (рис. 17; рис. 18). Также показано, что предварительная обработка ДК комплексами rhHsp70 с антигенами лизатов опухолевых клеток, независимо от степени зрелости ДК, приводит к значительному повышению секреции ИФу (рис. 19) и ФНОа (рис. 20) индуцированными лимфоцитами, что свидетельствует об оптимизации развития иммунного ответа при использовании комплексов.

Как уже говорилось, различия в эффектах rhHsp70, а, соответственно, и его комплексов с антигенами при воздействии на незрелые и зрелые ДК обусловлены, по всей видимости, соотношением на поверхности клеток рецепторов, участвующих в распознавании rhHsp70. Несмотря на то, что в настоящей работе не ставилось задачи определить данные рецепторы, сопоставление данных литературы и полученных нами результатов позволяет сделать вывод, что эффекты исследовавшегося нами белка rhHsp70AlB косвенно подтверждают участие в его распознавании рецептора CD40, являющегося одним из основных рецепторов, изучаемых в качестве рецептора Hsp70 [101,102]. Данный вывод следует из того, что наблюдавшиеся в наших исследованиях эффекты rhHsp70 и его комплексов с антигенами были наиболее выражены при взаимодействии со зрелыми ДК, на поверхности которых экспрессируется значительно большее количество молекул CD40 по сравнению с незрелыми ДК. В тоже время, не стоит исключать возможности наличия и других рецепторов к Hsp70. Тем не менее, маловероятным является возможное участие TLR4 в наблюдавшихся нами эффектах, так как многие исследования показали необходимость присутствия молекул CD 14 для его взаимодействия с Hsp70 [13,16], а их экспрессия на поверхности зрелых ДК практически полностью прекращается. В тоже время, это еще раз подтверждает, что эффекты rhHsp70, наблюдавшиеся в наших экспериментах, не являются результатом загрязненности ЛПС, для распознавания которых также необходимы молекулы CD14.

В контексте ведущихся в литературе дискуссий о свойствах Hsp70 необходимо отметить, что полученные в наших исследованиях результаты характеризуют белок rhHsp70AlB как перспективный препарат, комплексы с которым позволяют оптимизировать доставку антигенов в ДК, и, в то же время, свидетельствуют о слабой выраженности цитокиновых (так называемых, шаперокиновых) свойств индивидуального белка.

Выявленные в результате настоящей работы различия в эффектах rhHsp70 и его комплексов на ДК разной степени зрелости являются важным аспектом для планирования будущих исследований, в частности, при использовании комплексов rhHsp70 с антигенами в качестве основы для вакцин предстоит решить вопрос о наилучшем способе их введения в организм.

Таким образом, в проведенных исследованиях показано, что полученный нами белок rhHsp70AlB обладает иммунорегулирующими свойствами, а его комплексы с различными антигенами позволяют оптимизировать введение антигенов в ДК, что позволяет рекомендовать использование белка rhHsp70AlB в качестве основы для создания противоопухолевых вакцин, а также для приготовления ДК-вакцин.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Данилевский, Михаил Игоревич, Москва

1. Srivastava РК, Menoret A, Basu S, et al. Heat shock proteins come of age: primitive functions acquire new roles in an adaptive world. // Immunity. — 1998. — Vol.8.-P.657-65.

2. Udono H, Srivastava PK. Comparison of tumor-specific immunogenicities of stress-induced proteins gp96, hsp90, and hsp70. // J. Immunol. 1994. -Vol. 152(1 l).-P.5398-403.

3. Suto R, Srivastava PK. A mechanism for the specific immunogenicity of heat shock protein-chaperoned peptides. // Science. 1995. - Vol.269(5230). — P.1585-8.

4. Przepiorka D, Srivastava PK. Heat shock protein—peptide complexes as immunotherapy for human cancer. // Mol. Med. Today. 1998. - Vol.4(ll). -P.478-84.

5. Ishii T, Udono H, Yamano T, Ohta H, et al. Isolation of MHC class I-restricted tumor antigen peptide and its precursors associated with heat shock proteins hsp70, hsp90, and gp96. // J. Immunol. 1999. - Vol. 162(3). - P. 1303-9.

6. Blachere NE, Li Z, Chandawarkar RY, et al. Heat shock protein-peptide complexes, reconstituted in vitro, elicit peptide-specific cytotoxic T lymphocyte response and tumor immunity.//J. Exp. Med. 1997. - Vol.186. -P.1315-22.

7. Li Z. In vitro reconstitution of heat shock protein-peptide complexes for generating peptide-specific vaccines against cancers and infectious diseases. // Methods. 2004. - Vol.32(l). - P.25-8.

8. Wang XY, Li Y, Yang G, Subjeck JR. Current ideas about applications of heat shock proteins in vaccine design and immunotherapy. // Int. J. Hyperthermia. 2005. - Vol.21(8). - P.717-22.

9. Zhang X, Yu C, Zhao J, et al. Vaccination with a DNA vaccine based on human PSCA and HSP70 adjuvant enhances the antigen-specific CD8+ T-cellresponse and inhibits the PSCA+ tumors growth in mice.J Gene Med. 2007 Aug;9(8):715-26.

10. Arnold-Schild D, Hanau D, Spehner D, et al. Cutting edge: receptor-mediated endocytosis of heat shock proteins by professional antigen-presenting cells. //J. Immunol. 1999. - 162(7).-P.3757-60.

11. Noessner E, Gastpar R, Milani V, et al. Tumor-derived heat shock protein 70 peptide complexes are cross-presented by human dendritic cells. // J. Immunol. 2002. - Vol.169(10). — P.5424-32.

12. Asea A, Rehli M, Kabingu E et al. Novel signal transduction pathway utilized by extracellular HSP70 role of toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4. // J. Biol. Chem. 2002. - Vol.277. - P. 15028-43.

13. Asea A. Stress proteins and initiation of immune response: chaperokine activity of hsp72. // Exerc. Immunol. Rev. 2005. - Vol.11. - P.34-45.

14. Tsan MF, Gao B. Heat Shock Protein and Innate Immunity. // Cellular & Molecular Immunology. 2004. - Vol. 1(4). - P.274-279.

15. Bausinger H, Lipsker D, Ziylan U et al. Endotoxin-free heat-shock protein 70 fails to induce APC activation. // Eur. J. Immunol. 2002. - Vol.32. -P.3708-13.

16. Bendz H, Ruhland SC, Pandya MJ, et al. Human heat shock protein 70 enhances tumor antigen presentation through complex formation and intracellular antigen delivery without innate immune signaling. // J. Biol. Chem. 2007. -Vol.282(43). - P.31688-702.

17. Srivastava PK. Peptide-binding heat shock proteins in the endoplasmic reticulum: role in immune response to cancer and in antigen presentation.// Adv. Cancer. Res. 1993. - Vol.62. - P. 153-77.

18. Udono H, Srivastava PK. Heat Shock Protein 70-associated Peptides Elicit Specific Cancer Immunity.// J. Exp. Med. 1993. - Vol.l78(4). - P.1391-6.

19. Ciupitu AM, Petersson M, Kono K, et al. Immunization with heat shock protein 70 from methylcholanthrene-induced sarcomas induces tumor protection correlating with in vitro T cell responses.// Cancer Immunol. Immunother. 2002. - Vol.51. - P. 163-170.

20. Navaratnam M, Deshpande MS, Hariharan MJ, Zatechka DS, Srikumaran S. Heat shock protein-peptide complexes elicit cytotoxic T-lymphocyte and antibody responses specific for bovine herpesvirus 1. // Vaccine. — 2001. Vol.19(11-12). - P.1425-1434.

21. Wallin RP, Lundqvist A, More SH, et al. Heat-shock proteins as activators of the innate immune system. // Trends Immunol. 2002. - Vol.23. -P.130-135.

22. Tsan MF, Gao B. Cytokine function of heat shock proteins. // Am. J. Physiol. 2004. - Vol.286. - P.739-744.

23. Ritossa FA. A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP in Drosophila. // Experientia. 1962. - Vol.l8. - P.571-573.

24. Tissieres A, Mitchell HK, Tracy U. Protein synthesis in salvary glands of Drosophila melanpgaster: relation to chromosome puffs. // J. Mol. Biol. 1974. - Vol.84.-P.389-398.

25. Fink AL. Chaperone-mediated protein folding. // Physiol. Rev. -1999. Vol.79. - P.425-449.

26. Hard FU, Hayer-Hartl M. Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein. // Science. 2002. - Vol.295. - P.l852-1858.

27. Lindquist S, Craig EA. The heat-shock proteins. // Annu. Rev. Genet. 1988.- Vol.22. -P.631-677.

28. Jaattela M. Heat shock proteins as cellular lifeguards. // Ann Med. -1999.-Vol.31.-P.261-271.

29. Hightower LE, Hendershot LM. Molecular chaperones and the heat shock response at Cold Spring Harbor. Cell Stress Chaperon. 1997. - Vol.2. — P.l-11.

30. Ingolia T.D., Craig E.A. Four small Drosophila heat shock proteins are related to each other and to mammalian alpha-crystallin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982. - Vol.79. -P.2360-2364.

31. Brocchieri L, Conway de Macario E, Macario AJ. hsp70 genes in the human genome: Conservation and differentiation patterns predict a wide array of overlapping and specialized functions. // BMC Evol. Biol. 2008. - Vol.8. - P. 19.

32. Singh R, Kolvraa S, Rattan SI. Genetics of human longevity with emphasis on the relevance of HSP70 as candidate genes. // Front. Biosci. 2007. -Vol.12.-P.4504-4513.

33. Milner CM, Campbell RD. Structure and expression of the three МНС-linked HSP70 genes. // Immunogenetics. 1990. - Vol.32. - P.242-251.

34. Flaherty KM, DeLuca-Flaherty C, McKay DB. Three-dimensional structure of the ATPase fragment of a 70K heat-shock cognate protein. // Nature. -1990. Vol.346. - P.623-628.

35. Cegielska A, Georgopoulos C. Functional Domains of the Escherihia coli dnaK Heat Shock Protein as Revealed by Mutational Analysis // J. Biol. Chem. — 1998. — Vol. 264(35). — P.21122-21130.

36. Caplan AJ, Cyr DM, Douglas MG. Eukaiyotic homologues of Escherichia coli dnaj: a diverse protein family that functions with hsp70 stress proteins. // Mol. Biol. Cell. 1993. - Vol.4. - P.555-563.

37. Kathryn V. Anderson, Gerd Jiirgens, Christiane Nusslein-Volhard. Establishment of dorsal-ventral polarity in the Drosophila embryo: Genetic studies on the role of the Toll gene product. // Cell. 1985. -Vol.42(3). - P.779-89.

38. Anderson KV, Bokla L, Nusslein-Volhard C. Establishment of dorsal-ventral polarity in the Drosophila embryo: the induction of polarity by the Toll gene product. // Cell. 1985. - Vol.42(3). - P.791-8.

39. Lemaitre B, Nicolas E, Michaut L, et al. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/ToII/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. // Cell. 1996. - Vol.86(6). - P.973-83.

40. Medzhitov R, Preston-Hurlburt P, Janeway С A. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. // Nature. -1997. Vol.388 (6640). - P.394-7.

41. Gay N, Keith F. Drosophila Toll and IL-1 receptor. // Nature — 1991. — Vol.351. -P.355-356.

42. Bowie A, O'Neill LA. The interleukin-1 receptor/Toll-like receptor superfamily: signal generators for pro-inflammatory interleukins and microbial products. // J. Leukoc. Biol. 2000. - Vol.67(4). -P.508-14.

43. Poltorak A, He X, Smirnova I, et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. // Science. 1998. -Vol.282. -P.2085-2088.

44. Hoshino K, Takeuchi O, Kawai T, et al. Cutting edge: Toll-like receptor 4 (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide:evidence for TLR4 as the Lps gene product. // J. Immunol. 1999. - Vol.162. — P.3749-3752.

45. Kurt-Jones EA, Popova L, Kwinn L, et al. Pattern recognition receptors TLR4 and CD 14 mediate response to respiratory syncytial virus. // Nat. Immunol. 2000. - Vol. 1. - P.398-401.

46. Smiley ST, King JA, Hancock WW. Fibrinogen stimulates macrophage chemokine secretion through tolllike receptor 4. // J. Immunol. — 2001. Vol.167. - P.2887-2894.

47. Taylor KR, Trowbridge JM, Rudisill JA, et al. Hyaluronan fragments stimulate dermal endothelial recognition of injury through TLR4. // J. Biol. Chem.- 2004. Vol.279. - P. 17079-17084.

48. Termeer C, Benedix F, Sleeman J, et al. Oligosaccharides of Hyaluronan activate dendritic cells via toll-like receptor 4. // J. Exp. Med. 2002. -Vol.195.-P.99-111.

49. Tobias PS, Soldau K, Ulevitch RJ. Isolation of a lipopolysaccharide-binding acute phase reactant from rabbit serum. // J. Exp. Med. 1986. - Vol.164.- P.777-793.

50. Shimazu R, Akashi S, Ogata H, et al. MD-2, a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll-like receptor 4. // J. Exp. Med. 1999. -Vol.189.-P.1777-1782.

51. Viriyakosol S, Kirkland T, Soldau K, Tobias P. MD-2 binds to bacterial lipopolysaccharide. // J. EndotoxinRes. 2000. - Vol.6 - P.489-491.

52. Medzhitov R, Preston-Hurlburt P, Kopp E, et al. MyD88 is an adaptor protein in the hToML-1 receptor family signaling pathways. // Mol. Cell. 1998.- Vol.2.-P.253-258.

53. Muzio M, Ni J, Feng P, Dixit VM. IRAK (Pelle) family member IRAK-2 and MyD88 as proximal mediators of IL-1 signaling. // Science. 1997. -Vol.278.-P.1612-1615.

54. Muzio M, Natoli G, Saccani S, et al. The human toll signaling pathway: divergence of nuclear factor kappaB and JNK/SAPK activation upstream of tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (TRAF6). // J. Exp. Med. -1998. Vol.187. - P.2097-2101.

55. Yamamoto M, Sato S, Hemmi H, et al. TRAM is specifically involved in the Toll-like receptor 4-mediated MyD88-independent signaling pathway. // Nat. Immunol. 2003. - Vol.4(l 1). - P. 1144-50.

56. Yamamoto M, Sato S, Hemmi H, et al. Essential role for TIRAP in activation of the signalling cascade shared by TLR2 and TLR4. // Nature 2002. -Vol.420(6913). -P.324-9.

57. Schwadner R, Dziarski R, Wesche H, et al. Peptidoglycan- and lipoteichoic acidinduced cell activation is mediated by Toll-like receptor 2. // J. Biol. Chem. 1999. - Vol.274. - P. 17406-17409.

58. Yoshimura A, Lien E, Ingalls RR, et al. Cutting edge: Recognition of Gram-positive bacterial cell wall components by the innate immune system occurs via Toll-like receptor 2. // J. Immunol. 1999. - Vol.165. - P. 1-5.

59. Brightbill HD, Libraty DH, Krutzik SR, et al. Host defense mechanisms triggered by microbial lipoproteins through Toll-like receptors. // Science. 1999. - Vol.285. - P.732-736.

60. Means TK, Wang S, Lien E, et al. Human Toll-like receptors mediate cellular activation by Mycobacterium tuberculosis. // J. Immunol. 1999. -Vol.163.-P.3920-3927.

61. Underhill DM, Ozinsky A, Hajjar AM, et al. The Toll-like receptor 2 is recruited to macrophage phagosomes and discriminates between pathogens. // Nature. 1999. - Vol.401. - P.811-815.

62. Bieback K, Lien E, Klagge IM, et al. Hemagglutinin protein of wild-type measles virus activates toll-like receptor 2 signaling. // J. Virol. 2002. — Vol.76.-P.8729-8736.

63. Compton T, Kurt-Jones EA, Boehme KW, et al. Human cytomegalovirus activates inflammatory cytokine responses via CD 14 and Tolllike receptor 2. // J. Virol. 2003. - Vol.77. - P.4588-4596.

64. Kurt-Jones EA, Chan M, Zhou S, et al. Herpes simplex virus 1 interaction with Toll-like receptor 2 contributes to lethal encephalitis. //Proc. Natl.Acad. Sci. USA 2004. - Vol.101. -P.1315-1320.

65. Werts C, Tapping RI, Mathison JC, et al. Leptospiral lipopolysaccharide activates cells through a TLR2-dependent mechanism. //Nat. Immunol. 2001. - Vol.2. - P.346-352.

66. Ogawa T, Asai Y, Hashimoto M, et al. Cell activation by Porphyromonas gingivalis lipid A molecule through Toll-like receptor 4- and myeloid differentiation factor 88-dependent signaling pathway. // Int. Immunol. -2002. Vol.14. - P.1325-1332.

67. Ozinsky A, Underhill DM, Fontenot JD, et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between Toll-like receptors. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000. -Vol.97.-P.13766-13771.

68. Takeuchi O, Sato S, Horiuchi T, et al. Role of TLR 1 in mediating immune response to microbial lipoproteins. // J. Immunol. 2002. - Vol.169. — P.10-14.

69. Cooperstock MS. Inactivation of endotoxin by polymyxin B. // Antimicrob. Agents Chemother. 1974. - Vol.6 - P.422-425.

70. Cavaillon JM, Haeffner-Cavaillon N. Polymyxin В inhibition of LPS-induced interleukin-1 secretion by human monocytes is dependent upon the LPS origin. // Mol. Immunol. 1986. - Vol.23. - P.965.

71. Stokes DC, Shenep JL, Fishman M, et al. Polymyxin В prevents lipopolysaccharide-induced release of tumor necrosis factors from alveolar macrophages. // J. Infect. Dis. 1989. - Vol.160. - P.52.

72. Asea A, Kraeft SK, Kurt-Jones EA, et al. Hsp70 stimulates cytokine production through a CD-14-dependent pathway, demonstrating its dual role as a chaperone and cytokine. // Nat. Med. 2000. - Vol.6 - P.43 5-442.

73. Chen W, Syldath U, Bellmann K, et al. Human 60-kDa heat-shock protein: a danger signal to the innate immune system. // J. Immunol. 1999. -Vol.162.-P.3212-3219.

74. Dybdahl B, Wahba A, Lien E, et al. Inflammatory response after open heart surgery: release of heat-shock protein 70 and signaling through Toll-like receptor-4. // Circulation. 2002. - Vol.105. - P.685-690,.

75. Kol A, Lichtman AH, Finberg RW, et al. Cutting edge: heat shock protein (HSP) 60 activates the innate immune response: CD 14 is an essential receptor for HSP60 activation of mononuclear cells. // J. Immunol. 2000. -Vol.164. -P.13-17.

76. Retzlaff C, Yamamoto Y, Hoffman PS, et al. Bacterial heat shock proteins directly induce cytokine mRNA and interleukin-1 secretion in macrophage cultures. // Infect. Immun. 1994. - Vol.62. - P.5689-5693.

77. Retzlaff C, Yamamoto Y, Okubo S, et al. Legionella pneumophila heat-shock protein-induced increase of interleukin-1 mRNA involves protein kinase С signaling in macrophages. // Immunology 1996. - Vol.89. - P.281-288.

78. Wang Y, Kelly CG, Singh M, et al. Stimulation of Th-1 polarizing cytokines, C-C chemokines, maturation of dendritic cells, and adjuvant function by the peptide binding fragment of heat shock protein 70. // J. Immunol. — 2002. -Vol.169.-P.2422-2429.

79. Galdiero M, DeL'ero GC, and Marcatili A. Cytokine and adhesion molecule expression in human monocytes and endothelial cells stimulated with bacterial heat shock proteins. // Infect. Immun. 1997. - Vol.65. - P.699-707.

80. Asea A, Kraeft SK, Kurt-Jones EA, et al. Hsp70 stimulates cytokine production through a CD-14-dependent pathway, demonstrating its dual role as a chaperone and cytokine. // Nat. Med. 2000. - Vol.6 - P.435-442.

81. McLeish KR, Dean WL, Wellhausen SR, Stelzer GT. Role of intracellular calcium in priming of human peripheral blood monocytes by bacterial lipopolysaccharide. // Inflamation. 1989. - Vol.13. - P.681-92.

82. Gao B, Tsan MF. Induction of cytokines by heat shock proteins and endotoxin in murine macrophages. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. -Vol.317.-P.l 149-54.

83. Gao B, Tsan MF. Endotoxin contamination in recombinant human Hsp70 preparation is responsible for the induction of TNFa release by murine macrophages. // J. Biol. Chem. 2003. - Vol.278. - P. 174-179.

84. Johnson JD, Fleshner M. Releasing signals, secretory pathways, and function of endogenous extracellular heat shock protein 72. // J. Leucocyte Biol. — 2006. Vol.79. - P.425-433.

85. Banchereau J, Bazan F, Blanchard D, et al. The CD40 antigen and its ligand. // Annu. Rev. Immunol. 1994. - Vol.12. - P.881-922.

86. McWhirter SM, Pullen SS., Holton JM, et al. Crystallographic analysis of CD40 recognition and signaling by human TRAF2. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999.-Vol.96.-P.8408-8413.

87. Cheng G, Cleary AM, Ye ZS, et al. Involvement of CRAF1, a relative of TRAF, in CD40 signaling. // Science. 1995. - Vol.267. - P. 1494-1498.

88. Ishida T, Tojo T, Aoki T, et al. TRAF5, a novel tumor necrosis factor receptor-associated factor family protein, mediates CD40 signaling. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol.93. - P.9437-9442.

89. Datta SK, Kalled SL. CD40-CD40 ligand interaction in autoimmune disease. // Arthritis Rheum. 1997. - Vol.40. - P. 1735-1745.

90. Caux С, Massacrier С, Vanbervliet В, et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. // J. Exp. Med. 1994. - Vol.180. -P.1263-1272.

91. Ridge JP, Di Rosa F, Matzinger P. A conditioned dendritic cell can be a temporal bridge between a CD4+ T-helper and a T-killer cell. // Nature. 1998. -Vol.393. -P.474-478.

92. Buhlmann JE, Foy TM, Aruffo A, et al. In the absence of a CD40 signal, В cells are tolerogenic. // Immunity. 1995. - Vol.2. — P.645-653.

93. Bennett SRM, Carbone FR, Karamalis F, et al. Help for cytotoxic-T-cell responses is mediated by CD40 signalling. // Nature. 1998. - Vol.393 -P.478-480.

94. Kiener PA, Moran-Davis P, Rankin BM, et al. Stimulation of CD40 with purified soluble gp39 induces proinflammatory responses in human monocytes.//J. Immunol. 1995.-Vol.155. - P.4917-4295.

95. Ballantyne J, Henry D.L, Muller J.R, et al. Efficient recombination of a switch substrate retro vector in CD40-activated В lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination. // J. Immunol. 1998. - Vol.161. -P.1336-1347.

96. Wang Y, Kelly C.G, Karttunen J.T, et al. 2001. CD40 is a cellular receptor mediating mycobacterial heat shock protein 70 stimulation of CC-chemokines. // Immunity. Vol.15. -P.971-983.

97. Becker T, Hartl F.U, Wieland F. CD40, an extracellular receptor for binding and uptake of Hsp70-peptide complexes. // J. Cell Biol. 2002. -Vol.158.-P.1277-85.

98. Delneste Y, Magistrelli G, Gauchat J, et al. Involvement of Lox-1 in dendritic cell-mediated antigen cross-presentation. // Immunity. 2002. - Vol.17. - P.353-62.

99. Binder R.J, Han D.K, Srivastava P.K. CD91: a receptor for heat-shock protein gp96. // Nat. Immunol. 2000. - Vol. 1. - P.l51-155.

100. Basu S, Binder R.J, Ramalingam T, Srivastava P.K. CD91 is a common receptor for heat shock proteins gp96, hsp90, hsp70, and calreticulin. // Immunity. 2001. - Vol.14. - P.303-313.

101. Robert J, Ramanayake T, Maniero G.D, et al. Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation. // J. Immunol. -2008. Vol. 180(5). -P.3176-82.

102. Chen M, Masaki T, Sawamura T. LOX-1, the receptor for oxidized low-density lipoprotein identified from endothelial cells: implications in endothelial dysfunction and atherosclerosis. // Pharmacol. Ther. 2002. — Vol.95(l). - P.89-100.

103. Shimaoka T, Kume N, Minami M, et al. LOX-1 supports adhesion of Gram-positive and Gram-negative bacteria. // J. Immunol. 2001. - Vol. 166(8). — P.5108-14.

104. Kume N, Murase T, Moriwaki H, et al. Inducible expression of lectin-like oxidized LDL receptor-1 in vascular endothelial cells. // Circ. Res. 1998. -Vol.83(3). -P.322-7.

105. Murase T, Kume N, Korenaga R, et al. Fluid shear stress transcriptionally induces lectin-like oxidized LDL receptor-1 in vascular endothelial cells. // Circ Res. 1998. - Vol.83(3). - P.328-33.

106. Li D, Liu L, Chen H, et al. LOX-1, an oxidized LDL endothelial receptor, induces CD40/CD40L signaling in human coronary artery endothelial cells. //Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. -2003. -Vol.23(5). -P.816-21.

107. Arnold D, Faath S, Rammensee H, Schild H. Cross-priming of minor histocompatibility antigen-specific cytotoxicT cellsupon immunization with the heat shock protein gp96. // J. Exp. Med. 1995. - Vol.182. - P.885-889.

108. Roman E, Moreno C. Synthetic peptides non-cova-lently bound to bacterial hsp 70 elicit peptide-specific T-cell re-sponses in vivo. // Immunology. -1996. Vol.88 - P.487-492.

109. Roman E, Moreno C. Delayed-type hypersensitivity elicited by synthetic peptides complexed with Mycobacterium tuberculosis hsp 70. // Immunology. 1997. - Vol.90. - P.52-56.

110. Blachere N.E, Udono H, Janetzki S, et al. Heat shock protein vaccines against cancer. // J. Immunother. 1993. — Vol.14. - P.352-356.

111. Banchereau J, Steinman R.M. Dendritic cells and the control of immunity. //Nature. 1998. - Vol.392. - P.245-252.

112. Banchereau J, Briere F, Caux C, et al. Immunobiology of dendritic cells. // Annu. Rev. Immunol. 2000. - Vol. 18. - P.767-811.

113. Sallusto F, Schaerli P, Loetscher P, et al. Rapid and coordinated switch in chemokine receptor expression during dendritic cell maturation. // Eur. J. Immunol. 1998. - Vol.28. - P.2760-2769.

114. Gunn M.D, Tangemann K, Tam C, et al. A chemokine expressed in lymphoid high endothelial venules promotes the adhesion and chemotaxis of naive T lymphocytes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol.95. - P.258-263.

115. Dieu M.C, Vanbervliet В, Vicari A, et al. Selective recruitment of immature and mature dendritic cells by distinct chemokines expressed in different anatomic sites. // J. Exp. Med. 1998. - Vol.188. - P.373-386.

116. Chaux P, Moutet M, Faivre J, et al. Inflammatory cells infiltrating human colorectal carcinomas express HLA class II but not В7-1 and В7-2 costimulatory molecules of the T-cell activation. // Lab. Invest. — 1996. — Vol.74. — P.975-983.

117. Marincola F.M., Jaffee E.M., Hicklin D.J. et al. Escape of human solid tumors from T-cell recognition: molecular mechanisms and functional significance // Adv. Immunol. 2000. - Vol. 74. - P. 181 -273.

118. Banchereau J, Schuler-Thurner B, Palucka A.K, Schuler G. Dendritic cells as vectors for therapy. // Cell. 2001. - Vol.106. - P.271-274.

119. Nestle F.O, Alijagic S, Gilliet M, et al. Vaccination of melanoma patients with peptide- or tumor lysate-pulsed dendritic cells. // Nat. Med. 1998. -Vol.4. -P.328-332.

120. Mackensen A, Herbst B, Chen J.L., et al. Phase I study in melanoma patients of a vaccine with peptide-pulsed dendritic cells generated in vitro from CD34(+) hematopoietic progenitor cells. // Int. J. Cancer 2000. - Vol.86. -P.385-392.

121. Murphy G.P., Elgamal A.A., Troychak M.J., Kenny G.M. Follow-up ProstaScint scans verify detection of occult soft-tissue recurrence after failure of primary prostate cancer therapy. // Prostate. 2000. — Vol.42. — P.315-317.

122. Brossart P., Wirths S., Stuhler G., et al. Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses in vivo after vaccinations with peptide-pulsed dendritic cells. // Blood 2000. - Vol.96. - P.3102-3108.

123. Yu J.S., Wheeler C.J., Zeltzer P.M., et al. Vaccination of malignant glioma patients with peptide-pulsed dendritic cells elicits systemic cytotoxicity and intracranial T-cell infiltration. // Cancer Res. 2001. - Vol.61. - P.842-847.

124. Hsu F.J., Benike C., Fagnoni F., et al. Vaccination of patients with B-cell lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritic cells. // Nat. Med. -1996,-Vol.2.-P.52-58.

125. Reichardt V.L., Okada C.Y., Liso A., et al. Idiotype vaccination using dendritic cells after autologous peripheral blood stem cell transplantation for multiple myeloma a feasibility study. // Blood. - 1999. - Vol.93. - P.2411-2419.

126. Gao B, Tsan MF. Recombinant human heat shock protein 60 does not induce the release of tumor necrosis factor a from murine macrophages. // J. Biol. Chem. 2003. - Vol.278. - P.22523-22529.

127. Dhodapkar M.V., Steinman R.M., Krasovsky J., et al. Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. // J. Exp. Med. 2001. - Vol.193. - P.233-238.

128. Multhoff G. Activation of natural killer cells by heat shock protein 70. //Int. J. Hyperthermia. -2002. Vol. 18(6). -P.576-85.

129. Батчикова Н.Б., Кулагина M.A., Луценко C.B. и др. Экспрессия синтетического гена интерлейкина-4 человека в клетках Е. coli. Получение- P.766-776.

130. Гукасова H.B., Москалёва Е.Ю., Родина А.В. и др. Характеристика дендритных клеток человека, полученных с использованием стандартного и "ускоренного" методов культивирования. //Молекул. Медицина 2004. - Vol.2. - Р.38-44.

Информация о работе

Данилевский, Михаил Игоревич
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Использование rhHsp70 для регуляции активности иммунокомпетентных клеток - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы