Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОРОДА ПРИ ОЦЕНКЕ УСТОЙЧИВОСТИ БОБОВЫХ КУЛЬТУР К ВИРУСУ ЖЕЛТОЙ МОЗАИКИ ФАСОЛИ

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОРОДА ПРИ ОЦЕНКЕ УСТОЙЧИВОСТИ БОБОВЫХ КУЛЬТУР К ВИРУСУ ЖЕЛТОЙ МОЗАИКИ ФАСОЛИ"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРОПРОМЫШЛЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи ЧУМИКОВ Игорь Алексеевич

УДК 632.911 : (635.65: 578.864.3)

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОРОДА ПРИ ОЦЕНКЕ УСТОЙЧИВОСТИ БОБОВЫХ КУЛЬТУР К ВИРУСУ ЖЕЛТОЙ МОЗАИКИ ФАСОЛИ

(Специальность 06.01.11 — защита растений от вредителей и болезней)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1988

оо$С$С£/?#£/с — £ебс££:Ас/ г/ Уы^^^

Работа выполнена на кафедре защиты растений Университета дружбы народов им. П. Лумумбы.

Научный руководитель — доктор сельскохозяйственных наук, профессор Ю. И. Помазков.

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Л. Н. Трофимец, кандидат биологических наук, доцент В. А. Шмыгая.

Ведущее учреждение — Всесоюзный научно-исследовательский институт защиты растений. ,

защита состоится « /$. > . ЪЩ>4-<А. . 1988 г.

в «ФТ-тг» час. на заседании специализированного Совета К 120.35.03 в Московской" сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 49, ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан « .-У. » . 1&Ьес№'£ . . 1988 г.

Ученый секретарь • специализированного совета — кандидат сельскохозяйственных наук, ,

доцент л_—г-;-У-Р^--^"^. К. Торянская

ОНДЛЯ. ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исслодований. В настоящее время серьезным •препятствием роста урожайности многих культур, в том числе и таких экономически ценных, как бобовые, являются вирусные заболевания . Наиболее радикальным способом защиты растений от фитопа-тогенных вирусов считается создание и использование в производстве устойчивых сортов и форм." Успех селекционной работы в значительной степени зависит от: уровня теоретических исследований в области иммунитета.растений..Задача фитовирусологии состоит в том, чтобы как можно глубже изучить механизм устойчивости с тем, чтобы сделать возможной разработку.новых подходов к созданию устойчивых форм растений и разработать надежные критерии и способы дифференциальной оценки устойчивости селекционного материала к вирусам на. разных уровнях (Коваленко А . Г . , 1883).

В многочисленных:исследованиях, посвященных физиологочЗио-химическим аспектам взаимоотношений растений и фитовирусов, показано, что инфекция оказывает существенное влияние на процессы накопления и расхода энергии зараженного растения. Причем наибольший интерес: привлекает специфика изменения таких основных энергетических процессов кислородообмена, как фотосинтез и дыхание, которые следует рассматривать в качестве интегральных механизмов, регулирующих формирование системы растение-хозяин-патоген (Серова З.Я'. идр ; , 1282) . 3 настоящее время указанные процессы кислородообмена изучаются в основном с помощью чувствительного и быстрого, полярографического (амперометрического) метода (Зеленский М.И.г- 19 8 6) , который и лег в основу данного исследованиям Функционирование фотосинтетичоского и дыхательного аппаратасопределяется.: структурным и Функциональным состоянием

основных органолл зеленого растения: хлоропластов» ядер и митохондрий, мембранным комплексам которых принадлежит важная роль в устойчивости к повреждающему действию вируса. Успешно используется сейчас для изучения кислородообменных процессов и более новая модель - изолированные протопласты, восполняющие отсутст- • вие промежуточной системы между изолированными органоллами и тканями листа. Протопласты весьма интенсивно применяются также в фитовирусологических исследованиях ( Muraktshi , I984;

"WooJ , 19 85), но практически отсутствуют данные по влия-яию вирусного инфицирования протопластов на их метаболизм, в •частности на фотосинтез и дыхание. Изучение данного вопроса может внести существенный вклад в познание физиологических основ фитоиммунитета, что откроет новые подходы к регулированию виру-'соустойчивости и созданию оффективянх экспресс-методов её оценки.

Целью данного исследования является изучение возможности использования полярографического метода определения кислородо-обмона для оценки устойчивости бобовых культур к широко распространенному вирусу желтой мозаики фасоли (ВШ5 ) . Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. выявить влияние механического и векторного инфицирования ЕШБ на кислородообмен протопластов и хлоропластов, митохондрий и ядер, выделенных из листьев различных по устойчивости сортов гороха в динамике патогенеза;

2 . установить дифференциацию фотосинтетической и дыхательной активности изолированных протопластов-различных по устойчивости сортов гороха при инфицировании В Ш . \N vitro , для чего отработать методику инфицирования;

3. установить изменения кислородообмона изолированных хлоропластов, митохондрий к ядер различных по устойчивости.сортов

гороха при инкубации с очищенным препаратом EEHS-w vitro ;

4. установить, корреляционные зависимости влияния EDS на изменение фотосинтетйческой активности протопластов и хлоропдас-тов гороха в модельных экспериментах ш vitro ; •

5. провести оценку устойчивости к BBS сортов и видов бобовых культур с .различной половой порахаемастью возбудителем на основе полярографического метода определения кислорода.

• Научная новизна результатов. Епервые проведено инфицирование изолированных протопластов контрастных по устойчивости сортов гороха вирусом желтой козааки фасоли w vitro с посладущим ' . определением их фотосинтетической и дыхательной активности полярографическим методом. • '-.•'"

Исследован характер изменения фотосинтетической и дыхательной активности протопластов и клеточных органелл, выделенных из' контрастных по устойчивости к КУ.Э сортов гороха в динамике патогенеза. При этом' для инфицирования растений- использовались различные штаммы возбудителя.

С помощью иммувофлуорвсцентного метода окрашивания протопластов показано,; что иммунный к Bsafi сорт горох Перфекшя является факультативно.устойчивым., * •

Впервые установлена качественная дифференциация фотосинтв-тической.'активности изолированных хлоропластов контрастных по устойчивости сортов гороха, вызванная инкубированием органелл с очищенным препаратом ECS m vitro , • на основе чего разработана методика экспресс-оценки вирусоустойчивости бобовых культур.

Установлены-корреляционные зависимости.изменения фотосинтетической активности протопластов и-хлоропластов гороха под влия-ниом Ш2Л5.. . • •' " ' .

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на научной конференции молодых ученых TSC АН*СССР (IS65 г) , на научной конференции молодых ученых в Университете дружбы народов имени ПатрксаЛумумбы (I9S6 г) , на научных конференциях профессорско-преподавательского со става*сельскохозяйственного*факуль-' тета УДИ (IS85 , 1986 гг) , на расширенном заседании кафедры защиты растений УДН (1987 г) и кафедры сельскохозяйственной фитопатологии ТСХА (1987 г) . По результатам; исследований опубликовано 2 статьи, подана заявка на изобретение'за №4147 8 91'и получено положительное решение ГоскомкзобретениЙ от 2 8.05.87.

Объем работы. Диссертация состоитгйз введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей 4 главы, выводов и списка цитированной литературы, насчитывающего 3 09 наименований, в том числе 237 на иностранных языках. Работа изложена на 147 -страницах масинописного текста, содержит 35 таблиц, II рисунков, 4 фотографии. • . <ь

?/есто. УСЛОВИЯ, материал и методика исследований. Все исследования проводкдись в Главном ботаническом саду АН СССР на базе отдела защиты растеши! (группа вирусологии) и лаборатории биотехнологии. . •

3 качестве модели: была выбрана система "вирус желтой мозаики фасоли - бобовые растения". Непосредственными объектами исследования являлись три идентифицированных-тамга ВЕ.Н> (BosL.et3i. , 1974) : D25 (типичный),.Е1СЗ (гадтой мозаики гороха) и EI97 (некроза гороха) и два контрастных по восприимчивости к ЕЕЛЙ сорта гороха: Рамонсквй 77 (восприимчивый) и Перфектен (невосприимчивый, считаыцийся иммунным) . •

Очистку Е£ЗД5 проводили по методике Хаттинга ( HutbNga , 1973 , 1974) в HciioJl модификации на ультрацентрифуге "Всокпаы

L8-5S". Концентрации вируса определяли на спектрофотометре 05-4. Качество очищенных вирусных препаратов оценивали элект-ронномикроскопичсским методом на электронном микроскопе "PKthps ЕЛ-301". На основе полученных препаратов Н25Ф была приготовлена антисыворотка с титром 1:1024.

Ккслородообмен при фотосинтезе и дыхании протопластов и органвлл определяли полярографическим методом. Был использован универсальный полярограф CH-I05 (производства ЕНР) с модифицированным электродом Кларка (Трушанов, 1973). .Платиновый катод был отделен от реакционной сроды тефлоном толщиной 20 мкм. Чувствительность ячейки - 0,01 А*д/моль, калибровку скалы поляро-графа.проводили регулярно. *

Выделение протопластов бобовых культур проводили по описанной методике ( PojNar et al. , К84) в нашей модификации: РН среды выделения доводили до 7.0; в среду дополнительно вводили HEPES-буфер (50 мм), декстран сульфат калия (0,5%). Концентрация целлшазы "OKozufcaR- 10й ~ 1%, мацерозима R- 10 - 0,3$. Подсчет протопластов осуществлялся в камере Горяева. Жизнеспособность изолированных протопластов оценивали окрашиванием мо-тиленовым' синим (Hooley, № Cai-they, 1980); Количество зараженных вирусом протопластов определяли иммунофлуоресценгным методом (Otsuki.TakeW, I9S9), для выделения глобулиновой фракции использовали полученную нами антисыворотку к E2.S.

Подсчет инфицированных окрззенных ШТЦ протопластов осуществляли с помощью микроскопа "Polyvar " (Австрия). Для подтверждения репликации вирионов в изол1!рованных протопластах проводили электронномикроскопкческий анализ ультратонких срезов протопластов. Ззливку.. протопластов в эпон-аралдит осуществляли общепринятыми 1.:етока?.'Д, в качестве буфера на стадии фиксации ис-

пользовался НЕРЕ8 (50 мм) в 0,6 М растворе сорбита.

Хлорофилл в суспензии протопластов определяли по Арнону (1949) . Протопласты культивировали в среде Аоки-Такебе (196 9) .

Хлоропласты выделяли по модифицированной методике Робинсон и Вискич (ЯоЫ^ОЫ , 1977) . Интактность хлоропластов

оценивали по Лаяли (ЬШсу еЬ а1. , 1975) . ИзоЗшрованио митохондрий и определение их дыхательной активности проводили по описанной методике (ЫасгеЫ, НааЬпаЫ , 19 80) . Ядра выделяли по методике Чен (СЬе.ы, 1975), дыхание по Рубину (1973). Статистическая обработка данных проводилась по Доспехову (19 85) . Использовался метод оценки существенности разности сопряженных выборок, корреляционный и дисперсионный анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. Влияние инфицирования ВЫ.» на фотосинтетическую и дыхательную активность различных по устойчивости сортов гороха в динамике патогенеза.

Изучалось влияние инфицирования тремя итаммами 2£№ на фотосинтетическую и дыхательную активность протопластов, выделенных из листьев на разных этапах развития заболевания. Проведен серологический тест образцов по Ухтерлони'. Было установлено количество инфицированных клеток кммунофлуоресцентным методом (для штамма Е108) .

Заражение восприимчивого гороха приводит к существенному снижению фотосинтетической активности (8СА) протопластов, выделенных из инокулирова:шых листьев, на протяжении 3-8 суток после инфицирования в зависимости от штамма (более сильно выражено действие Е19 8) .

Несколько иная тинденцня откопается у протопластов листьев

верхних ярусов инокулированных растений вбспри&ччивого гороха. На протяжении 3-4 суток после заражения их ФСА сильно повидана по сравнению с контролем, затем приближается к контрольным значениям и начинав с 16-ти суток (инкубационный период закончен) ОС активность протопластов снижается, что ассоциировано с появлением мозаичности листьев. Протопласты, выделенные из инокулированных листьев устойчивого гороха, обладают повышенной ССА во все сроки тестирования в течение 4-х суток после заражения. ССА протопластов листьев верхних ярусов инфицированных растений существенно от контроля не отличается (табл.1) .

При инфицировании тремя птаммама Ш.55 устойчивого гороха дыхательная активность протопластов, выделенных из инокулированных. листьев, существенно повышена по сравнению с контролем в течение 4-х суток от заражения. Заражение восприимчивого гороха вызывает существенное увеличение скорости поглощения кислорода протопластами, выделенными из неинокулированных листьев верхних ярусов инфицированных атаммом EI98 растений, на протяжения 3 суток тестирования. Дыхательная активность протопластов из инокулированных листьев гороха Рамонского достоверно от контроля не отличается.

Серологический анализ показал, что вирус не обнаруживается в листьях устойчивого гороха, сок инокулированных листьев восприимчивого сорта давал положительную реакции с антисывороткой через 3 суток, а неинокулированных верхних листьев - через 8 суток после инфицирования.

С помощью иммунофлуоресцентного метода окрзгивакия протопластов было установлено, что при механической инокуляции первоначально инфицируется небольшое число клеток (через 2,5 часа после заражения у устойчивого сорта - 5 на IOCOGO клеток, у

Таблица I '

Изменение фотосинтетичоской активном» протопластов гороха в динамике патогенеза ВШЬ при механической инфицировании (отклонение скорости выделения кислорода от контроля - ыкМ

Од/мг хл. х час)

Ыашг Время от инокуляции до выделения протопластов (сутки) 1л05

Вариант ! да» Г0~,Г- 1 : 2:3: 4 : 8 : 10 : 12 : 16 :: 20 : 22 Мер.

1. Устойчивый сорт (ино-:;улпрован-п ш листья,

2. Устойчивый сорт (не-г.нокулиро-валныо ЛИСТЬЯ

верхнего яруса)

3. ВОСПРИИМЧИВЫЙ

куйт(ено-

ванние листья)

4. ЪОСПРИШ-

ЛИСТЬЯ верхнего

яруса)

В 25 17 4 19 7 14 4 10,5 9 7 7 7 5 6 0,4 -3 6 -2 7 -2 7 8 6 4,25

Е 198 20 4 41 1 30 4 г- 1 5 10 5 10 ,2 5 7 -0,9 6 5 -4 0 -5 1 13 8 8,3

Е 197 14 9 19 ,0 12 7 9,5 7 3 4 0 2 7 -2,0 3 1 -0 9 -3 0 7 2 4,0

. НСРС5 = 7 7

В 25 4 8 2 0 -2 ,5 -4,7 -2 0 0 9 -3 5 -3,2 0 7 -2 5 1.0 2 5 2,3

Е 1Б8 7 8 7 5 4 7 -2,0 -4 2 2 0 2 5 0,9 2 5 -3 4 -4 3 3 8 1.5

Б 197 7 8 4 5 -5 ,2 -4,3 -5 5 -1 3 0 8 -0,8 4 5 2 7 2 7 3 6 1,3

н% = 1 7

В 25 -7 5 -15 7 -15 ,9 -7,7 -5 0 0, 9 -2 0 -2,7 -3 4 2 7 -0 3 5 8 3,6

К 198 -5 7 -21 0 -28, 9-17,7 -10 7 -7 5 -2, 4 0,5 -2 5 -0 9 -0 7 9 0 6,3

£ 197- -2 4 -7,7 -7 7 -4,8 -0 7 -0 9 -3, 7 2,2 2 2 4 3 -1 0 .3 .4 1.7

НСРС5 = 5 7

В 25 5 0 32 3 37 8 15,4 3 7 8 2 3 0 1,0 -7 9 -27 7 32 3 15 ,8 9,3

Е 195 5 7 45 7 37 7 35,9 17 7 7 5 3 2 -0,7 -21 ,5 -45 0 -52 1 24 ,8 12.7

Е !Б7 2 7 28 0 31 2 20,5 11 7 5 3 0 9 0,9 -12 5 -30 ,2 -50 6 17 ,7 Ю.5,

Н*05

14,3

се

и'Г гл И*

НЛиШ1

восприимчивого - 7 на 100000). Но если у устойчивого это количество инфицированных клеток сохраняется практически неизменным на протяжении 22 суток от инокуляции, то у восприимчивого число содержащих вирус клеток быстро увеличивается, а на четвертые сутки отмечено системное распространение его в.верхние ярусы листьев. Но обнаружено качественных различий в изменении кисло-родообмена под влиянием различных штаммов BSMS, хотя количественно влияние их дифференцируется. Наиболее сильно выражено влияние штамма Е 198.

!.5еханическое инфицирование восприимчивого гороха приводит к снижению ФСА хлоропластов,- выделенных из листьев, испытавших инокуляцию ЕйД$. По мере старения этих листьев разница с контролем уменьшается. На ранних.стадиях патогенеза ССА хлоропластов неинокулированных верхних листьев зараженных растений повкгана по сравнению с контролем, затем постепенно приближается к контрольным значениям (примерно через 8-12" дней) и на стадии видимых симптомов существенно ниже контрольных данных. Отмеченная тенденция сохраняется пря инфицировании всеми использованными ктам-мами БЕИЗ,. наиболее сильно проявляясь для .штамма Е 198 и наименее для Е'197,

СЁА хлоропластов, выделенных из механически инокулированных ВЕМЗ листьев иммунного гороха повышена по сравнению с контролем в течение первых трех суток от инокуляции, затем не отличается существенно от контроля. ССА верхних неинокулированных листьев инфицированных.растений достоверно не отличается от контрольных показаний. .

Был также испытан другой способ инфицирования - с использованием векторов - тлея Му5"2 fewitae. При о том выявленная пря механическом.инфицировании тенденция изменения ССА хлоропластов

полностью сохраняется. Т.е. способ заражения на влияет на дифференциацию ССА разных сортов гороха при инфицировании ЗКШ JN vivo.

Не отмечено существенных отличий от контроля в изменении дыхательной активности митохондрий, выделенных из листьев гороха на разных этапах патогенеза B2J.S.

Показано, что ядра, выделенные из инокулированных листьев устойчивого гороха, значительно медленнее, по сравнению с контролем, поглодают кислород через 1,2 и 4 суток после инокуляции. Подобное явление не отмечено у восприимчивого сорта.

2. Дифференциация фотосинтетической и дыхательной активности различных по устойчивости к ВНШ сортов гороха при инокуляции IN vitro в искусственных модельных системах.

Обнаруженные изменения кислородообмона растений на различных стадиях развития вирусного заболевания но позволяют полностью понять механизм устойчивости гороха к Ш№ а действие вируса на органеллы, что вызвало необходимость постановки ряда опытов с использованием следующих моделей взаимодействия IN vitro : изолированные протопласты гороха - очищенный вирусный препарат Ш№ ; хлоропласт - ЗЕ.М2; митохондрии - ESMS; ядра - ЕШ> .

Инфицирование протопластов w viiro проводили по методике Мотойсли и Опаши (Motoyoshi , Oshma , 1975) без искусственных индукторов (типа поли - L - орнитина или ПЭГа) , чтобы максимально приблизиться к условиям заражения IN VIVO .

Показано, что.инокуляция протопластов гороха устойчивого сорта Порфекпн и восприимчивого Рамонский дает практически одинаковый, результат: 12% зараженных Н2.Й протопластов Иерфекши и

15$ Рамонского, т.е. исходная устойчивость штактных растений но сохраняется на клеточном уровне.

Но получено достоверньк отличий от контроля в изменении ды-хатеЛа.ной активности протопластов у обоих сортов. Существенно отличается от контроля фотосинтетическая "активность протопластов Перфеюш и Рамонского. Через I час культивирования после инокуляции Е&Ш наблюдается возрастание ОСА, а в остальные сроки тестирования - снижение по сравнению с контролем (через 72 часа -на 17,2% у Рамонского и на 14,73 У Перфект) .

Был испытан ese один способ инфицирования протопластов, представляющий собой модификацию предыдущего. По назему предположению связывание вирусных чвстиц' с протопластами и проникновение в них происходит в мостах разрыва плазмодесм, поэтому чем раньше после выделения из обработанных ферментами листьев протопласты будут инокулированн вирусом, тем больнее их количество окажется зараженным.

Результаты эксперимента показывают, что испытанный способ инокуляции протопластов гороха BSMS оказался более эффективным. Количество зараженных вирусом протопластов увеличилось более чем в два раза, достигнув у Перфехгн 28$ а Рамонского 32$.

ФСА инфицированных протопластов также повьшхна через I час культивирования после-инокуляции, а в последующие сроки тестирования отмечено снижение кислородовыделяшей активности протопластов (через 72 часа - на 32,6$ у Рамонского и на 25,4$ у Перфекин) (табл.2) , что видимо, являотся непосредственным следствием вирусной репликации, поскольку, отмечена сильная положительная корреляция между количеством инфицированных протопластов гороха и степенью подавления их ОСА (у Нер1>екш +• 0,84, у Рамонского 0,71).

иммунность сорта Перрокгн следует считать факультативной устойчивостью в соответствии с современной классификацией

(AtabcW , DorokW. IS84).

Таблица 2

Влияние 1шфицирования протопластов гороха Ш№ (EI98) w vitro на их фотосинтетическую и дыхательную активность (отклонения скорости выделения и поглощения кислорода от контроля в мкМ 02/мг хл. х час)

8!

1!

о :

о !

Вариант

Количество инфицированных протопластов, %

Отклонение скорости фотосинтеза от контроля

Отклонение скорости дыхания от контроля

Отклонение инфицированных протопластов , в %

I а

Э Я §&

Rg

•g

и

Продолжительность куль-Сорт тивирования после инокуляции, час

Отклонение скорости фотосинтеза от контроля

Отклонение скорости дц-хаикя от контроля

I : 24 48 : 72

Перфекшн О 10 12 12

Рамонский О 12 15 15

Перфекшн 4,6 -6,7 . -II.2 -10,

Рамонский 15,0 -14,3 -10,2 -12.

Перфекта 5,4 " 8,4 0,6 6,

Рачонский -1.8 -17,4 -13,8 -5,

Перфекан 17 25 28

Рамонский 19 27 32

g j Перфекшн 5,2 -8,3 - -14,0 ■ -22,!

Рамонский 28,7 -15,6 -12,8 -25,

Перфекшн 6,0 7,8 4,2 -1,

Рамонский 0,0 7,2' 12,0 6,

Jcp.

НСР,

05

2.7 2,4

8,2 13,1

5,1

9.6

2.7

12,6 23,1

4,2 6,4

4,9 3,4

5,2 II.5

2,8

12,4 18,7

6,2 8,0

g

Впервые ооущестьлоно заражение ш уу11-о изолированных протопластов гороха вирусо:.! желтой мозаики фасоли из группы потиви-русов с последудакм определением'их кпслородсосг.еиа. 35»|1ШТ;1Б-

ность заражения подтверждена иммунофлуаресцентным методом. Били .также приготовлены ультра'тонкко срезы инфицированных протопластов гороха, и наличие вирионов в них зарегистрировано на элект-роиномикроскопических фотографиях.

Для инокуляции хлоропластов Ш уМ-'о использовали методику, которая применялась для инфицирования протопластов (штамм ВИЗ -Е 19 8) .

Были также испытаны различные сроки инкубации с КаЖ при 4= 20* С и 4*0. '

Результаты показывают, что существенное повышение скорости фотосинтетического выделения кислорода хлоропластами устойчивого сорта гороха Перфекшн по сравнению с контролем на 16-30,5 отмоча-ется при инкубации с Ей.® в течониа 3 0 минут. I и 3 часов и

•= 4*С. Инкубация с вирусным препаратом в течение суток и более но вызывает существенных отличии от контроля. ФСА хлоропластов восприимчивого сорта Рамонский ингкбпрована действием вирусного препарата до 53$. В этом случае уменьшение скорости фотосинтоти-ческого выделения кислорода существенно по сравнению с контрольным вариантом во все сроки тестирования при 4*С (табл.3) .

Для Иерфекан выявлена сильная обратная корреляция между продолжительностью инкубации с Щ2.В и степенью активации фотосинто-тического выделения кислорода в % к контролю ( г = -0,78), для Рамонского - сильная прямая корреляция ( г = 0,81) между продолжительностью инкубации и степенью кнгибированкя ФСА в % к контролю. Установлено, что изменения ФСА хлоропластов не связаны с изменениями их кнтактности.

Наш был испытан также спектрофотометрический метод, позволяющий определить изменение концентрации вируса в розулътпто контакта с хлоропластами.

Таблица 3

Изменение скорости фотосиятотического выделения кислорода хлоропдастами гороха при инкубации с ВШЭ (Е 198) при Ь = 4*С (в мкм 02/мг хл . х час) .

Продолжительность экспозиции, час

} 0,5 : 1,0 : 3,0 :24,0 :48,0 :72,0 1

Jcp-

P05

1. HoploiEJI + 112,4 110,5 90,6 49,7 35,6 20,6 + вирус 86,7 85.0 77,7 44,5 30,7 19,2

12,6 12,3

2. Контроль-

3. Рамонскпй + +• вирус

4. Контроль

90,5 84,5 70,7 21,5 14,5 10.0

97,9 99,6 8В.7 40,5 30,9 17,9

14,0 5,8

Отмечается существенное уменьшение концентрации вируса в результате его сусяандирования в среде с изолированным! хлоропдастами гороха. Причем хлорспласты устойчивого к Е5Е.В гороха Пер-фе:си1 связывают меныпе вирионов и первоначально адсорбированное количество вируса мало изменяется по мере увеличения продолжительности инкубации..Корреляция между продолжительностью инкубации и количеством связанных с хдоропдастами Перфексн вирусных частиц несущественна. Хлоропласты,восприимчивого сорта связывают большее количество вирионов и. при увеличении срока контактирования количество это возрастает. Выявлена сильная прямая корреляция между продолжительностью инкубации и количеством связанного вируса ( г = 0,96) ." Через 72 часа хлоропласты Рамоиского связывает- 63,2л вирусных частиц, а Перфекшн - 10,6$.

Проведенный анализ донных показал; что корреляция между степенью"изменения ОСА хлоропластов Псрфеггн и количеством связанных с ними вирусных частиц несущественна. Установлена сильная прямая зависимость уменьшения ССА хлоропластов Рамонского от количества связанных вирионов ( г = 0,93) . Было испытано также • действие на хлоропласты гороха другого ствмма В2.Й (В 25) . Результаты опыта аналогичных подученным для стакма S 19 8.

• Л 15

• Влияние инкубации с вирусным препаратом на дыхательную активность митохондрий устойчивого гороха Иерфеклн несудостяонла. Дыхательная активность митохондрий восприимчивого сорта Рамонс-кий существенно понижена по сравнонию с контролем во все сроки инкубации, кроме 24 и 48 часов. При еж:.', митохондрии бистрсо утрачивают свои функции при хранении in vtti-o , чем хлоропласты. Отмечона тохзо слабая тенденция снижения дыхательной активности ядер устойчивого гороха Дерфекан при инкубации с K-J.55, но существенные отклонения от контроля выявлены только при продолжительности инкубации в течение 1,2 и 3-х часов. .Максимальная разница с контроле:.! зарегистрирована при 3-х часовой инкубации.

Дыхательная активность ядер гороха Рамснский но отличается существенно от контроля. '

Следовательно, наиболее оптимальной для дальнейшего применения в качестве экспресс-теста на устойчивость к вирусу оказалась система "изолзрованнко хлоропласты - вирусный пропарат", поскольку ее использование дало достоверные качественно дпЛо-реяцированкые результаты по изменению ССА хлоропластов под влиянием вирусного препарата w vrtro в зависимости от устойчивости исходного интпктного растения. Преимуществами является также быстрота, полная контролируемость всех экспериментальных условий и, следовательно, сведение влияния артефактов к минимуму, возможность автоматизации основных этапов тестирования и простота проведения.

Необходимо выделить слодунцие условия, собдкденио которых обеспечит получение надобных результатов, используемых в качестве критерия иммунности к ВЕКИ.

Концентрация хлорофилла в .суспензии хлоропластов при экспозиции с EH.1J IN vitro составляет 6G-I00 Mia1/ мл; концентрация вируса' DO-ICG мкг/мл, PII среды экспозиции равен 8,0; продолхитоль-

ность -инкубации может варьировать от 1,5-2,5 часа и более, оптимальная температура инкубации +4°С. Обязательно перемешивание суспензии. Следует также подчеркнуть необходимость по.тучения исходных здоровых растений, гошгснных по возрасту и условиям выращивания.

Отработанная на горохе методика выделения хлорспластов и оценки их ССА после экспозиции с BBS IN vttro использована для тестирования вирусоустойчивостп других сортов и форм бобовых культур.

При отом сохраняется тенденция» отмеченная в аналогичных экспериментах с горохом: скорость фотосинтетического выделения кислорода хлоропластами устойчивых форм увеличивается по сравнению с контролем в результате инкубации с вирусным препаратом, воспршщчивых - уменьшается (табл.4).

3 А К Л ЮЧ ЕНИ'Е

3 результате проведенных исследований:изучено влияние вирусного заболевания (ВШЬ) на фотосинтеткческую и дыхательную .функции контрастных по устойчивости сортов гороха на различных экспериментальных моделях: от целого растения в динамике патогенеза до клеточных органелл, инкубированных с очищенным вирусным препаратом IN vitro . Во всех случаях тестирование изменения указанных функций растения осуществлялось с помощью полярографического метода определения кислорода, что позволяло стандартизировать и частично автоматизировать основные этапы исследования.

Анализируя полученные результаты и учитывая универсальный характер изменения фотосинтетической активности растений при инфицировании различными нтаммзми возбудителя и разных способах заражения, а также данные иммунофлуоресцентного теста по олреде-

Таблица 4.

Оценка устойчивости некоторых бобовых культур к КЛЙ с использованием полярографического метода определения кислорода

Вид и сорт Результаты •механической : Результаты :серологическо Скорость выделения кислорода, мкм ОАля" хл-ла х час

инокуляции : го теста контроль : + вирус !отклонение от : контроля

Горох

К-7842 (каталог SIP) 10/0 - 110 5 125 2 14 7

К-7859 (каталог ШР) 10/0 - 97 8 • 108 3 10 5

К-7824 (каталог ВИР) 10/0 - 98 0 110 2 12 2

НсмчиновскиЙ 76G 10/8 ++ 115 7 '99 ,7 -16 0

Нормою.! I 10/9 114 0 96 2 -17 8

Бобы

Русские черные 10/9 +t S0 5 75 0 _ -15 5

& 15 (солекщи ШИК) 10/10 +-+ 81 4 69, 0 -12 4

Р-5 (селекции ВНЛК) 10/10 • н- 87 8 76 9 -10 9

Лгапн белый

дружба 10/0 * 85 2 92 4 7,2

.".шин желтиЛ

КсроганскиЛ 10/8 • н- IC0 .3 83 5 -16,8

Примечание: 3 числителе - количество инокулировашшх растений, в знаменателе - количество заразившихся;

т1 - четкая соропозитиглая реакция сска листьев с ддС (1.5Л) + - слабая сероиезитшшзл реакция сока листьев с ДЕ.С (1,5$) - - отсутствие ссрояозитиьноЛ реакции

лона» количества инфицированных клеток к характер изменения £СА протопластов и хлоропластов инокулированных ШШ> \ы vitro , можно предположить, что вирусная репликация в клетках растения вызывает угнетенно фотосинтетичоской_функция независима от исходной устойчивости растения. Тем не менее в ходе-репликации, видимо, образуется вещество, или комплекс, веществ, которые проникают из первично инфицированных в>окружающие клетки и ткани и избирательно влияют на ход метаболических процассов, о именно вызывает значительное усиление фотосинтетической активности данных тканей у устойчивого к ESM2 сорта гороха, с чем,: очевидно, связано ограничение распространения вируса. Не исключено, что указанное вещество может являться транспортной формой возбудителя. '

Характер влияния вирусного препарата:на изолированные хлоропласта я их функции от vitro позволяет предполагать, что эти органеллы играют определенную роль в иммунных- реакциях устойчивых форм растений или. непосредственно связаны с факультативной устойчивостью, с которой ш сталкиваемся в данном случае.

Дифференциация изменения ОСА хлороплзстов двух сортов гороха при инкубация с 222,© ш vitro , отражающая исходную полевую устойчивость интактных растений, дала основания для разработки ' экспресс-теста оценки иммунитета бобовых к ЕЫЗ . Успешное испытание этого теста на некоторых' бобовых культурах, различных по ус-тойчкьести к данному вирусу, позволяет рекомендовать его для экспериментального исследования на других культурах с использованием различных вирусов. '• ....•**••'

ВЫВ О Д Ы

I. Сравнительная оценка фотосинтетической и дыхательной активности сортов гороха, различающихся по устойчивости к БЕ.О, с помощью полярографического метода определения кислорода выявила

дифференциацию ответных реакций на инфицирование в зависимости от,степени их устойчивости.

' 2. Найдено, что протопласты, выделенные из зараженных листьев устойчивого сорта Порфокии, характеризуются существенно повышенной, а из восприимчивого Рамонского пониженной по сравнению с контролем скоростью фотосинтеза и дыхания в течение первых 3-4 суток после инфицирования. Резкое усилсЧио иСА отмечается также на протяжении 3-4 суток у протопластов, выдолонных из листьев верхних ярусов растений восприимчивого сорта, удаленных от.места инокуляции. На поздних стадиях инфекционного процесса ФСА этих протопластов значительно понижена. ССА протопластов из неинокулированных верхних листьев зараженных растений устойчивого сорта Пер]5екшн от контроля не отличается.

. 3. Иммунофлуоресцентным методом было установлено, что при механической инокуляции первоначально инфицируется небольшое количество клеток: через 2,5 часа поело заражонкя у 11ср1о1ЛИ - 5 на'1000 00 клеток, у Рамонского - 7 на ЮСООО.У иммунного сорта указанное количество вируссодержаидос клеток сохрзняотся практически неизменным в течеш».о 22 суток от инокуляции, и системного распространения инфекции не происходит. У восприимчивого сорта число инфицированных клеток быстро увеличивается и через 4 суток отмечается распространение вируса в верхние ярусы листьев.

4. Сравнительный анализ ФСА хлороплаотов в динамике патого-неза НШ5 показал, что сохраняется выявленная у протопластов дифференциация в зависимости от устойчивости сорта, и способ заражения, (механический или с помоцью пороносчиков) не влияет на характер изменения £СА хлоропластов.

5.. дыхательная активность митохондрий из зораг.онннх растений в ходе развития заболевания но отличается суссстьонко от контроля.

Отмочено, что ядра, выделенные из пнокулирозаниых ВШ& лпстьев устойчивого сорта Перфокш в течение 4 суток после заражения слабее поглощают кислород по сравнению с контролем, тогда как ядра восприимчивого сорта Рамонский характеризуются незначительным усилением дыхания.

0. Найдено, что качественный,характер изменения Лотосинте-тнческой и дыхательной активности протопластов и хлоропластов но зависит от стамма Ш^В (Б25, Е198 и К197) , используемого для инокуляции. Количественные различия показателей.изменения ССА под действием разных атаммов вируса"несущественны.

7. Продемонстрирована возможность инфицирования изолированных протопластов гороха Перфекшн (12%) и Рамонский (15£) ВШВ боз искусственных индукторов, в частности поли - Ь - орниткна. ПродлсЛенная модификация способа :шфицяроБания позволяет достигать большей эффективности заражения (соответственно 2 8$ у Пер-фекпн и 325? у Рамонского) . • • •

8. Отсутствие устойчивости к ЕМ 5 у протопластов гороха сорта ЛорЛек-н позволяет отнести сорт к факультативно устойчивым к денному вирусу. .

9. Инфицирование протопластов 3Е.Б JKvit.ro вызвало однотипную ответную реакцию у обоих сортов: возрастание ФСА через I час поело инокуляции и снияенио в послодувдие трое суток. Отмечена сильная прямая корреляция ксаду числом инфицированных протопластов и степенью подавления их ССА (для Парфокан г = 0,84, для Рамонского г я 0,71), что позволяет считать отмоченные изменения С0А вирусиндуцированнкми. Вирусная репликация в изолированных протопластах доказана электронно-микроскопическим исследованием ультратонких срезов протопластов.

10. Инкубация изолированных хлоропластом гороха с счищенным препаратом ЕЯ1.'Л ш уЬЬуо пр-ьодкт к качсст1«чшо ;4:!.}ср«>шш-рокпшшм изменениям их чСЛ: погилнкп скорости I ОТОС ННТРТНМОС -

кого выделения кислорода по сравнению с контролем у устойчивого сорта и снижению у восприимчивого. Достоверные отличия от контроля- регистрируются при продолжительности.инкубации не менее 30 минут и t= 4*C. Выявлена сильная обратная корреляция между продолжительностью 'инкубации и степенью активации ОСА й % к контролю у'Перфокш ( г = - 0,78) и сильная прямая корреляция между продолжительностью инкубации и степенью кнгнбИ' вания' ССА у Ра-монского( г = 0,81).

11. Отмечено существенное уменьшение исходной концентрации ВЫФ в среда с изолированными хлоропдастсми гороха, На; 1доно,что хлоропласты устойчивого сорта Нерфегсш связывают меньиэ вирусных частиц, чем хлоропласты восприимчивого сорта Рамонский. Вы-яачона сильная прямая корреляция между количеством связанных с хлоропластеми сорта Рамонский внрионов и продолжительностью инкубации ( г , = 0,93) , а также степенью подавления SCA в % контролю (:г. = 0,88).

12. Иродложен экспресс-метод оценки устойчивости бобовых культур к вирусу желтой мозаики фасоли с помощью полярографического метода измерения скорости фотосинтетичоского выдолошш кислорода -хлоронластами при их инкубации с очищенным препаратом возбудителя ш vitro , Определены оптимальные параметры прово-дешщ оценки устойчивости бобовых культур к ВЫЛ5, обеспечнзашие получение достоверных результатов (продолжительность инкубации; температура; концентрация хлорофилла, вируса; РН среды).

Подана заявка на получение авторского свидетельства на разработанный нами способ оценки устойчивости бобовых растений к ВНМ5 за $ 4I4789I, на которую тлеется положительное решение Гос-комизобретенкй от 2 6.G5.87.

пРАктечЕскиз рекомендации ,

1. Способ оценки устойчивости бобовых растений к Л5Ш по • изменению скорости фотосинтетического выделения кислорода изолированными хяоропластами при инкубации о очищенным вирусным препаратом можно рекомендовать для широких производственных испытаний на различных сортах и видах бобовых культур.

2. Рекомендуется испытать подобныйспособ оценки вирусоус-тойчявоети на другях кудьтурах о использованием различных фато-'

вирусов. '•';•';- . ' V •'..... • '

Список работ, опубликованных по теме диссертации: ' • ''

1. Чумиков И.А. ' Дифференциация фотохимической активности : хлоропластов бобовых при инкубации с В2ЛФ. Реф. аурнал "Защита ", с.-х. растений от, вредителей it болезней"; 1987, а I, стр;16*

2. ChumKovi. «stal.Agunos asfectos ен 1а ш1екке1а- .'-cion cJe los afitJos- cowo. vectores <Ц log .YIKUS vege-' tates сол sus plaHtasThosye4era'S.,,.Gwiino АопсМаУЭ&Ч.лОз). ,'♦"_

3. Авторское свидетельство №1407457 на изобретение ;• • "Способ оценки устойчивости бобовых'культур к вирусу желтой мозаики Ппеоа!"'. ••' -' ; ; - • . ' ' '• - •'

Л 58452 26.07.88 г. Объем 1'/г п. л.

Заказ 1942. Тираж 100

Типография Московской с.-х. академии им. К. А. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44

Бесплатно