Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование молекулярных маркеров для создания интегрированной генетической карты групп сцепления межмикросателлитных последовательностей ДНК томата

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Использование молекулярных маркеров для создания интегрированной генетической карты групп сцепления межмикросателлитных последовательностей ДНК томата"



На правах рукописи

ТИКУНОВ ЮРИЙ МИХАЙЛОВИЧ

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ИНТЕГРИРОВАННОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КАРТЫ ГРУПП СЦЕПЛЕНИЯ МЕЖМИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК ТОМАТА

Специальности 03.00.23 — биотехнология

03.00.15 — генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2002

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

Научный руководитель: докт. биол. наук, Л. И. Хрусталева

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Б. С. Народицкий, кандидат биологических наук А. А. Соловьев,

Ведущая организация - Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится « 2002 г. в « »

часов на заседании диссертационного совета Д220.043.10 в Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 49. Ученый совет МСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

Автореферат разослан « /■?- » 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совет

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Создание генетических карт на основе молекулярных маркеров является современной высокоэффективной технологией для надежной и ускоренной селекции растений непосредственно по генотипу (Pillen et al., 1996; Haanstra et al., 1999; Saliba-Colombani et al., 2000). Молеку-лярно-генетические маркеры на основе микросателлитных последовательностей ДНК в настоящее время являются одними из самых популярных для изучения геномов многих видов организмов (Schlotterer et al. ¡998).

Томат - ценная сельскохозяйственная культура* с развитой системой производственных и селекционных технологий и хорошо изученная в генетическом плане (Жученко, 2001). Большое количество молекулярно-генетических маркеров, полученных с использованием таких методов как RFLP, RAPD и AFLP, локализовано на генетической карте томата (Tanksiey et al., 1992; Grandillo and Tanksiey, 1996; Haanstra et al., 1999). Однако до сих пор не было проведено исследований, которые позволили бы интегрировать маркеры на основе широкого спектра микросателлитных последовательностей в уже имеющиеся генетические карты томата. Исследования по физической и генетической локализации микросателлитов в геноме томата касались ограниченного количества их типов, и основывались на методах, использующих длинные микросателлитные последовательности (Grandilo and Tanksiey, 1996; Areshchenkova and Ganal, 1999; Areshchenkova and Ganal,

2002). ~ ..... ; \ ■

Получение насыщенной маркерами карты томата позволит вести направленную селекцию этой культуры по ценным хозяйственным признакам, включая количественные, и проводить' клонирование генов. Генетические карты являются также мощным инструментом для изучения организации, функционирования и эволюции генома (Tanksiey et al., 1992).

Цель и задачи. Целью данной работы явилось создание интегрированной генетической карты групп сцепления межмикросателлитных последовательностей (ISSRs) генома томата Lycopersicon esculentum.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

• Изучить организацию микросателлитных и межмикросателлитных последовательностей в геноме Lycopersicon ssp.

• Определить степень полиморфизма межмикросателлитных последовательностей на межвидовом уровне.

• Исследовать особенности физической локализации межмикроса-теллитных последовательностей на хромосомах томата/

• Выяснить возможность использования межмикросателлитных маркеров для Филогенетических исследований.

Определить розможнестУ^йвЩ^АЙщии м (кросателлитов вблизи генов устойчивости тс

Моск. акадэмии

им. К. ДьГГихиоез^эа»

Инв. Hi

Научная новизна 1 Создана интегрированная карта групп сцепления межмикросателлитных последовательностей ДНК томата

2 Приоритетными являются полученные данные с использованием линий томата WSL6 и IL6-3 с интрогрессиями в хромосоме 6, свидетельствующие о возможности физической локализации микросателтитов и межмикросателлитных последовате 1ыюстей ДНК тома га вне прицентромерной области хромосом томата

3 Впервые использованное комбинирование ISSR-праймеров и прай-меров д ¡я ампчификации аналогов генов устойчивости растении (R.GA) с вплетет ьствует о возможности юкализации микросатет ттов в структуре генов устойчивости томата к патогенам или в непосредственной близости от них

4 С использованием (IbSR-PCR) выявлена высокая степень оо шмор-физма межмикросателлитных последовательностей у пяти видов томата На основе выявленного полиморфизма создано филогенетическое дерево исспе-дованных видов томата

Практическая значимость. Предложен набор нраймеров на основе чежмикросатет-итных последоватепьностеи для маркирования генотипов томата на межвидовом уровне и использования в селекции гомата при межвидовой гибридизации дтя выявления гибридов и изучения интрофессий генетического материхча в поспедующих поколениях

Показана возможность испочьзования межмикросатечлитных маркеров для маркирования генов устойчивости томата к патогенам

Межмикросате.1литкые маркеры могут ^спешьо быть применены Д1Я филогенетических исстедоваций Lvcopersicon ььр

Созданная интегрированная i-енетичесяая карта групп сцепления может быть использована для направленной селекции томата и клонирования генов хозяйственно ценных признаков

Апробация работы Результаты работы доложены на 5-й международной конференции по Solanaceae (23-29 Июля, 2000, Nijmegen, The Vetherbnds), на ежегодной научной конференции ученых МСХА (1499, Москва), на Конференции молодых ученых «Моподые ученые - во ¡рождению сепьского хозяйства России» (2000, Брянск), на Генетической конференции !.освященнои 100-летию со дня рождения А Р Жебрака и 70-аетию образования кафедр генетики в Тимирязевской академии (2002, Москва), на ¡гседа-княч кафедры сельскохозяйственной биотехнологии МСХА

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, 1 направлена в печать

Структура и объем работы Диссертация состоит из глав, выводов, списка "¡итераторы, включающего/^'наименований, в т ч иностранных авторов Материалы диссертации изложены / страницах машинописного текста, содержат/.-7 табздц, /¿'рисунков и фотографий

Автор благодарен, профессору кафедры с -х биотехнологии Л И Хру-сталевой за ценные замечания при проведении исследований, обсуждении

резу чьтагов изчоженных в диссертационной работе и ее подготовке

Автор признателен заведующему кафедрой с.-х. биотехнологии МСХА им. К. А, Тимирязева,, академику РАСХН В. С. Шевелухе за полезные советы и поддержку при проведении исследований. , - -

Автор сердечно благодарит зав. лабораторией регуляторов роста, к. б. н. Г. И. Карлова за неоценимую помощь оказанную им при проведении исследований и подготовке по их результатам диссертации.

Искреннюю благодарность автор выражает за помощь и поддержку сотрудникам кафедры с.-х. биотехнологии Г. Н. Андреевой и Т. В. Даниловой.

Глубокую признательность за помощь автор выражает Dr. A. W. van Heusden из PRI, The Netherlands.

ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии МСХА им. К. А. Тимирязева.

Был использован следующий растительный материал:

1. Lycopersicon esculentum Mill., сорт "Marglob"1,

2. Lycopersicon pennellii (Corr.), LA3162

3. Lycopersicon cheesmanii Riley, (CGN 17086)',

4. Lycopersicon humboldtii (CGN 15822)1,

5. Lycopersicon hirsutum Humb., (CGN 15914)'

6. Lycopersicon esculentum Mill. - мутантная форма Mo504'

7. Растение Fi межвидового гибрида!,, esculentum XL. kirsutum1

8. 64 образца ДНК, выделенные из растений F2 расщепляющейся популяции межвидового гибрида Lycopersicon esculentum X Lycopersicon pennellii

9. Lycopersicon esculentum-. линии IL 6-3 and WSL б2 с интрогрессиями участков из хромосомы 6 Lycopersicon pennellii в хромосоме 6 Lycopersicon esculentum.

1 - Растения, предоставленные кафедрой генетики МСХА им. К. А. Тимирязева;

- - Растения, предоставленные Maarten Koornneef, Wageningen Agricultural University, The Netherlands -

3 - Образцы ДНК подготовлены и предоставлены A. W. van Heusden, PRI, Wageningen, The Netherlands

Геномную ДНК выделяли по методике Van der Beek et al. (1991) из молодых листьев растений томата!

ISSR-праймеры (таблица 1) подбирали после анализа литературных данных по эффективности их использования на других видах растений. Все праймеры были синтезированы в ЗАО «Синтол», Москва.

Для проведения ISSR-PCR на видах томата и линиях с интрогрессиями были использованы праймеры с 1 по 14 (таблица 1). Генетическое картирование было проведено на растениях F2 расщепляющейся популяции межвидо-

вого гибрида £усорегх1соп ехси!еп1ит X ¿усоремгсоп реппеИн Для этих целей использованы все праймеры, представленные в таблице 1, за исключением тех которые дали неудовлетворительные резутьтаты при анализе видов томата и линий с интрогрессиями

Таблица 1

ISSR-праймеры

1 Код Последовательность Код Последовательное!» j

праймера праймера 1

11 K10 [AC]sYO 14 K21 [GATAJi

,2 K.12 [ACjsG i 15 K24-2 LCAlsT

j K.19 i [ACJ8YA 16 K25 [AG]sG '

1 4 K23 i [GA]aG 17 K26 [AGlbT

5 K24 | [GAJgA 18 K27 [AG]SC

,0 Г K18 [GA]sC 19 K28 IGT]5A

17 KM [GAJgYC 20 К2Ч [TG]SC

8 K16 [CA^RC 21 КЗО [1G]SG '

I9 K17 [CA13A n — K31 [TG1<A

10 K22 [CA]6GT 23 КЗ 2 [GAAIf,

r 11 K13 [AG]SYT 24 КЗЗ , [CT]SA 1

1 12 K15 LGTJ*YC 25 К34 | [GT]SG

13 K20 1 [CT]ST

Для проведения PCR с использованием комбинированной системы праймеров ¡SSR-RGA были выбраны четыре синтетических олигонуклеоти-до, применявшихся ранее в качестве PCR-праимеров дгя амптификации RG А-последовательностей у цитрусовых (Deng et al, 2000)

1) Fl I 5'-GG(A/G/T) GT(A/G/T) GGN AA(A/G) AC(A T) AC,

2) Rll 5*-AGI GC( Aj C/T) AG Nf GGN AGN С С,

3) R16 5'-AGN (jC(A/G1 ) AGN GG(C/T) AAN CC,

4) R1S 5'-AA\ GC(AС/ Г) AGN GG(CTT) AAN CT

Все четыре праймера были синтезированы в ЗАО «Синтот», Москва

IbSR-PCR проводили по модифицированной методике Prevost и Wilkinson (¡999) ISSR-RGA-PCR проводите по модифицированной методике Deng et а' (2000)

Продукты ПЦР разделяли в 2%-м агарозном гете i. буфером ТВЕ при напряжении 6 V/см После окрашивания бромистым этидием продукты ПЦР были визуализированы с помощью источника УФ света и задокументированы фотокамерой «Зениг-К.» Электрофоретические профили продуктов FSSR-PCR и JSSR-RGA-PCR анализировали с помощью программы ONE D<scan 1 3 CSP Int

Филогенетическая модель родства пяти исследованных видов томата была построена путем обработки данных ISSR-PCR с помощью кластерного анализа по методу невзвешенного попарного арифметического среднего -UPGMA (Nei et al., 1983).

Генетическое картирование ISSR-маркеров проводилось с использованием программы JoinMap 2.0 в PRI, Wageningen, The Netherlands.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Полиморфизм межмнкросателлитных последовательностей ДНК томата на межвидовом уровне

Праймеры К10 - К24 были использованы для проведения ISSR-PCR геномной ДНК каждого из 5 видов в трёх повторностях. Эксперименты проводились с трехкратным повторением.

С помощью 9 из 14 ISSR-праймеров: К10, К11, К12, К13, К15, К16, К17, К18, К19 были получены четкие электрофоретические профили для каждого из пяти видов томата. Пример полученных профилей с использованием праймеров К13 и К15 представлен на рис. 1.

Рис, 1. ^БЯ-профили пяти видов томата — а - б, справа налево: сИееэтапН, Ь. ЫгяиШт, Ь. ИитЬоЫШ, Ь. е$си!еп(ит, Ь. реппеПи, полученные с использованием двух праймеров: а —К13.6-К15.

При анализе этих профилей был выявлен высокий полиморфизм меж-микросателлитных последовательностей ДНК исследованных видов томата (таблица 2, 3)

Проведение 158К.-РСЫ с праймером К10 на растении Гч межвидового гибрида Ь е.чси1епгит X 1. ЫгШит, позволило получить эчектрофоретиче-ский профиль КБЯ-фрагментов геномной ДНК данного гибрида, в котором присутствовали все ^БЯ-фрагменты, характерные для обеих родительских форм (рис 2)

Гаким образом, с помощью кЧЯК-РСК была выявлена высокая степень полиморфизма межмикросатетлитных последовательностей у пяти изученных видов рода ¿vco^гer5Icon Это позволило провести четкое маркирование этих видов томата Так же была проведена идентификация I ибридного расте ния, полученного от скрещивания Ь е$си1ешит X Ь ктитт

Таблица 2

Полиморфизм межмикросатепитных последовательностей, выявленный при сравнении эпектрофоретических [ЗБЯ-профилей пяти видов томата

11раймер

Тип по- I Общее количество втора 1 1БЬК-фрагментои у пяти видов томата

Количество полиморфных ^фрагментов

ЫО

[АСЬ\0

19

18

| К12 Г[АС:ЬС7 I 22 22

К19 1 [АС]чУА 18 15 1

К23 [С,Л]50 Шмер 1

К24 , [САЬА Птохая амглификация

1 [ОАЬС ' 24 23

1 К11 | [ОА|8УС 1 16 15 1

[ К.16 1 [СА]$ЯС 25 22

К17 (СА1кЛ | 25 22

К.22 , [САЬОТ Плохая амптификация

К13 [ао;8ут 21 '8 1

К15 , [ОТЪУС . 13 12

К20 ' К-'П.т Плохая амплификация

I К21 I [ОАТА]*

Нет амплификации при темп отжига 55 С Стабый полиморфизм при 45°С (4 неполиморфных фрагмента у 4 из пяти видов и 1 очень слабый фрагмент у £ /игзшит)

о

.'.;••■•' Таблица 3

Соотношение общего количества 155К.-фрагментов и полиморфных - фрагментов ДНК у видов томата

Всего фрагментов/полиморфных фрагментов

L. esculentum - L. pennellii 148/108

L. esculentum — L. hirsutum 126/101

L. esculentum — L. humboldtii 111/43

L. esculentum — L. cheesmanii 108/47

L. pennellii - L hirsutum 133/98

L. pennellii - L. humboldtii 146/115

L. pennellii - L. cheesmanii 134/100

L. hirsutum - L. humboldtii 122/84

L hirsutum - L. cheesmanii 122/91

L. humboldtii - L. cheesmanii 98/41

Рис. 2. Идентификация межвидового гибрида Ь. езси1ептт (Мо504) X Ь. Ыгяитт с помощью ^ЭИ-праймера К10. Справа налево: Маркер размеров, Ь. Ытмит, Р) £.. еясикпшт (Мо504) X Ь. Мгшит, Ь. еяси-1епШт (Мо504),

2. Использование ^И-маркеров для изучения филогенетических связей рода ЬусореЫсоп

Данные, полученные при анализе электрофоретических профилей, были использованы для создания филогенетического дерева пяти исследованных видов томата. Для создания этой модели, данные ^БЯ-РСИ, были проанализированы с помощью кластерного анализа по методу ШЧЗМА (Мех с! а!.. 1983). Результаты представлены в виде дендрограммы (рис. 3). В постро-

енной нами модели выделяется близкородственная группа видов в составе £ е$си1епмт £ китЬоШш н £ скеезтапи Виды £ реппеИи и £ НюиШт находятся на равном удалении от этой группы и друг от друга

Таким образом, кластерный анализ результатов ШБЯ-РСЯ позволили построить филогенетическое дерево пяти изученных в данной работе видов томата

С£_ &8си1епшт

__С ЬитЬоШп

-и сЬвозтапн

-Л/гзишт

-реппеНп

-1-1-1-1-1-1-

08 О 7 06 05 04 ОЗ

Рис 3 Филогенетическая модель родства пяти видов томата, построенная с помощью анализа данных ЮБЯ-РСЛ методом иРвМА

3. 188К-РСЛ на лннинх £. ехси1ептт \VSL6 и 1Ь 6-3 с интрогрессиями и физическое картирование 1Ь8К-маркеров

Для проверки возможности использования метоха ГЬ81?.-РС11 Д"я ссн-дэния генетических карт были использованы две 7шши £ еи.и1епшт \VSI.b и 11.6-3 с интрогрессиями в хромосоме 6

При использовании 1Ь8Я-праймеров К10, К11, К12, К13, К15, К16, К17, К18 были получены электрофоретические профили данных тений (рис 4), в которых было отмечено наличие 22 фрагментов от £ реппеИи и исчезновение 13 фрагментов £ си1епшт Используя информацию о характере интрогрес-сий в хромосоме 6 линий \VSL6 и II. 6-3, мы смогли провести физическую локализацию 13 133Г1-маркерон на хромосоме 6 £ лси1емит относите шно некоторых морфологических маркеров (рис 5)

5 из 13 маркеров расположены в области интрогрессии шнии \VSL6, включая короткое плечо и большую часть д тинного плеча хромосомы 6, исключая только область перекрытия интрогрессии с участком интрогрессии 1Ь6-3 В этой области также токализованы чорсЬото^ическяе маркеры у и т-2 4 маркера расположены в об шсти интрогрессии 11.6-3, не включая область ее перекрытия с интрогрессией В данном участке также рас-потожен ген Еще 4 ШБК-маркера локализованы в самой у ¡чои области,

которая расположена вокруг морфологического маркера с и соответствует участку перекрытия интрогрессий линий и 11,6-3.

Рис 4. Результаты разделения продуктов ШБИ-РСК, полученных при анализе линий с интрогрессиями, используя праймер К10. Слева направо: I. £ реппе1-1и, 2. ¡1,6-3, 3. WSL6; 4. £ ехси1епшт А, В — ^БЯ-фрагменты £ реппеПи, выявленные в линиях 11.6-3 и С - ^БЯ-фрагмент £ ехсгйепшт, отсутствующий в линиях 1Ь6-3 и WSL6.

К12-1, К12-2, К13-1, К16-1, К17-1

, К12-3, К17-2

Рис 5. Физическая карта хромосомы 6 £ ехси1еп!ит с локализованными на ней 13 ГЭБИ-маркерами.

' 1К15-1, К15-2, , ]К16-2, К17-3

I аевси1еп{ит 11.6-3 ■реппеНп

Таким образом, используя ^БЯ-РСЛ на линиях £ ехси1еггшт \VSL6 и 1Ь6-3, с интрогрессиями было выявлено 13 потенциальных ^БЯ-маркеров, которые были физически локализованы на хромосоме 6 томата.

4. PCR с использованием комбинаций ISSR-праймеров с праймерами для амплификации последовательностей RGA - аналогов генов устойчивости растений

Для исследования возможности локализации микросателлитов вблизи генов устойчивости растений был проведён анализ двух видов томата L. escu-lentum и L. pennettii с помощью PCR, в котором использовались комбинации ISSR-праймеров К11 и К18 с четырьмя праймерами для амплификации консервативных участков генов устойчивости растений - так называемых аналогов генов устойчивости (RGA).

Модификация условий PCR, которая заключалась в снижении температуры отжига праймеров до 45°С, позволила получить четкие электрофорети-ческие профили, при использовании всех четырех комбинаций ISSR- и RGA-праймеров на L. esculentum и L. pennellii (рис.6).

При анализе полученных данных были отмечены фрагменты ДНК, не типичные для ISSR-профиля. Также было отмечено исчезновение характерных ISSR-фрагментов в профилях ISSR-RGA.

.1 2 3 4 5 6 05 9 10 Kb

C- — ê—*щ Ш : 4 - ■ tr** .1 P* гЩ r - » V * ■■ v —

fc^î Si

s

Рис. 6. Электрофоретические профили двух видов томата L. esculentum и L. pennellii, полученные путем комбинирования при проведении PCR ISSR-праймера Kl 1 и четырех праймеров для амплификации консервативных участков RGA генов устойчивости растений. Виды: 1,3, 5, 7, 9 - L. pennellii;; 2,4, 6, В, 10 - L. esculentum. Комбинации праймеров: 1,2- ISSR Kl 1; 3, 4 - ISSR , Kll/RGA F11; 5, 6 - ISSR Kll/RGA R11; 7, 8 - ISSR Kll/RGA R16; 9, 10 -ISSR-Kll/RGA RI 8; Kb-маркер размеров.

Таким образом, использование комбинаций ШБЯ-праймеров с прайме-рами для амплификации аналогов генов устойчивости (КОА) дало результаты, свидетельствующие о возможности присутствия микросателлитов в структуре генов устойчивости или в непосредсгвенной близости от них

5. Создание интегрированной карты групп сцепления межмнкросатсл-литных последовательностей ДНК томата

При проведении 1Ь8К-РСЯ на растениях Кг межвидового гибрида Ь ш1епшт X /. реппейи быто выявлено 82 !55Я-маркера (таблица 4)

Таблица 4

Распределение 185К-маркеров по хромосомам томата

| Хромосомы ¡БЬЯ-маркеры

1 1 I К11Е1*, К17Е2, К11Р2, К18Р1, К24Р2 К2"РЗ

2 ' К12ЕЗ, К19Е2,К27Р1,К32Р!

13 К11ЕЗ, К12Е1, К18Е1, К27Е2, К18Е2, К18Р4 ЮЗРЗ, К24РЗ

4 К17ЕЗ, К30Е1, К12Р1, К12РЗ, К30Н2

' 5 К15Е6, К13Р4, К24Е1, К26Е4, К.17Р5

'б К12Е4, К17Р1, К17РЗ, К26Р2

К15Е5, К19ЕЗ, К13Р1, К17Р2, К17Е1, К27Р2

8 К32Е1, К12Р2, К1№5

9 К10Е1, К16Е2, К16Н4

10 К26Е1, К26Е2, К27ЕЗ, К26РЗ

11 маркеры не выявлены

12 К.15Е4

*Жирным шрифтом обозначены маркеры, интегрированные в генетическую карту (рис 7)

32 из 82 маркеров были интегрированы в генетическую карту хромосом 1, 2, 3, 4, 5, О, 7, 8, 9, 10 томата с помощью программы .1отМар 2 0 (рис 7а, б) 37 маркеров показали незначите тану ю степень сцепления, хотя 16 из них удалось отнести к определенным хромосомам томата Расщепление по 13 маркерам оказалось сильно нарушенным, что не позволило использовать их д-я картирования

I аким образом, была создана интегрированная генетическая карта групп сцепления межмикросателлитных последовательностей ДНК томата Сравнительный анализ интегрированной карты с картой Наапыта ее а! (1999), в основе которой лежит та же популяция растений Р2, показал, что 15 15511-маркеров сцеплены с ЯРИ' и АРЬР маркерами, локализованными вне при-центромерной области хромосом томата

хромосома 1

106111 ■

131 ■ 134136'

СТ233 ЯУУЛЙ ТСЗО) ЯУЗЭ 1УЛМ9 1УУ43 . Т023в Т<324

1 ТОМ ггзз сгаг

К17Е24-

В1 тэм

К11Е14-К11Р24-

ТС59 ТС71 19

• т<згов

• Т«37

■ Тв430

■ Т0430Ь

■ твгм

■ Т<5259 ' Т(»81

хромосома 2

о к««} *

хромосома 3

■ К19Е2 4-

ЯУУ43 I Тй1в7 1«УС59 • ТС1В9

*

Тб234

40. 41 -

К27Е2«

Т0222 ■ К18Е1 4 ТО214

К12Е1<

ТБ311

Тв359

хромосома 4

ТВ1В2

К17Р1 4 К17ЕЗ < К12РЗ 4 АОМ

• то?т

хромосома 5

О-Л- Т0441

212427-

К26Е4 4-

ЕЗЗМ4М7Я

Е35Ш?.т

К24Е1 4—

К13Р4 4-

(.УУИЯ

К1ВЕв4—

ТС358

Т023 82

хромосома 6

о —я- езгздямм

£35т 53-67

езгшг-134

£Э5/п5в-1СЗ £35тМ-Э58 В32М50-13* Е32Л48-И4

Т0178

К17Р14-

Тв2»

Езал<50.г04 К17РЗ+-

• риит^еч)

К12Р44—

. Р14М«М5вр

Рис. 7а. Интегрированная карта групп сцепления межмикросателлит-ных последовательностей ДНК томата (хромосомы 1 - 6). маркеры выделены стрелками. Приблизительное положение прицен-тромерных областей обозначено слева черной вертикальной линией.

хромосома 7

хромосома 8

ТС20 ЮЗЕ 5 *

-4- — "ЪПС

9 1 1 I - "О вЗ 21 ■ I " Т0202

К17Р2 4*

К13Р1«— - К19ЁЗ*»

. еэзд<59 589

. Едомча-зд

. Е32Ш4-29?

- ез<сМ4? еа

4 Е32ЛЛ61 92 ёЭ5М47 14? < Е 35т £3-150 " Е32/ТГК9-" £35М4 7-565 " Р-ИМ54-А35Р " Р14М50-21Д " РИМ50-29в

- К12Р2*-

-

4а -*-■»- Р14М60-200 «6 -Ц-Ч- К52Е1 48 -т4-> Е32М47-477

хромосома 9

0 ЕЭ5М4? 249

Э -«-г- ЕЭ5А*50-б00

хромосома 10

и --1-1-

5

Ед8Л(53.136 еа.м47 27?

Ё32М81 а еэетбз за

Е32М«0>" 2 3 ЕЗа/М5С-«=96

6 5М«7 *0Ц 9 635Л1*9 2л5

б в ¿"ем/мва-т

(=35444 £-65

ЕЭ2Ап<» 3 2?2 8 Е39/М50 202

ЕУ»»Г4Ч. 4 ЕЭ2М4Г 134

Ё32М5 0-242 1 1 8

тО<е54

Ео5А»62 134 К10Е1 Тв 223

Е53/М«0-201

РУ М54 35а

, езллнв-з « , еэ М4М2?

езз.'ызо-ггэ

Ш)

63^59-225

р

[

I ЕЭ&М50-Э62 635^48-315

| езялюсм^з 1 ля £зял*$о-зеб

€35,7443-2 П Ч54-1Уавр

■ "иьг а

1

кг £3«—

Т0420 К16Е1^ К26Е2+-

тч^гое

Рис 76 Интегрированная карта фупп сдепчения межмикросатет--штных посчедоватеаьностей ДНК томата (хромосомы 7-10) 1Ь8Я-маркеры выделены стречками Приб чтите 7ьное положение прицентромерных об 1астеЙ обозначено слева черной вертикальной линией

выводы

1. Создана интегрированная генетическая карта межмикросателлитных последовательностей (ISSRs) ДНК томата, на которой 32 ISSR-маркера локализованы относительно уже имеющихся RFLP- и AFLP-маркеров.

2. На созданной генетической карте групп сцепления межмикросателлитных последовательностей ДНК томата 15 ISSR-маркеров локализованы вблизи RFLP- и AFLP-маркеров, расположенных вне прицентромерной области.

3. Физическое картирование ISSR-маркеров на хромосоме 6 линий с интрог-рессиями показало, что микросателлиты локализованы не только в прицентромерной области, но и в других областях данной хромосомы.

4. Выявлен высокий полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК на межвидовом уровне у пяти видов рода Lycopersicon ssp.: L. esculentum, L. pennellii, L. cheesmanii, L. humboldtii, L. hirsutum.

5. Идентифицированы пять видов рака. Lycopersicon ssp., а также Fi межвидовой гибрид L. esculentum X L. hirsutum с использованием ISSR-маркеров.

6. Рекомендован набор ISSR-праймеров для анализа исходных родительских и гибридных форм при межвидовой гибридизации.

7. Впервые использованное при проведении PCR комбинирование ISSR- и RGA-праймеров, позволило получить фрагменты ДНК видов Lycopersicon esculentum и Lycopersicon pennellii длиной от 90 до 1230 п. н., располагающиеся между микросателлитами и аналогами генов устойчивости (RGA) томата.

8. На основе ISSR-маркеров построена филогенетическая модель пяти видов томата, которая согласуется с данными по филогении, полученными с использованием других молекулярно-генетических методов маркирования.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1 Тик>нов Ю М , Хрусталева Л И, Андреева Г Н , Карлов Г И Полиморфизм межмикросатевдитных последовательностей ДНК культурного и диких видов томата Сетьскохозяйственная биотехнология Избранные работы Том 2 Я1од редакцией Шевелухи В С «Евразия+», 2001, с 27-40

2 Тикунов Ю М, Андреева Г Н , Карлов Г И Использование межмикроса-тет-итного полиморфизма ДНК для идентификации видов и сортов томата Тезисы докладов международной конференции «Селекция и семеноводство овошных культур в XXI веке», шочь 2000, Москва

3 Tikunov Yu М , Andreeva G V and G I Karlov Using of inter-simp'e repeat-PCR (ISSR-PCR) for identification of tomato .species and cultivars Abstract of The Fitth international Solanaceae Conference, 23 - 24 July 2000, Nvjmegen, The Netherlands

4 Тикунов Ю M , Хрусталева Л И , Андреева Г Н, Картов Г И Изучение межмикросателтитного полиморфизма ДНК видов томата Тезисы док ia-дов научной конференции Памяти Грегора Менделя, февраль 2001, Москва

s Тикунов Ю М , Данилова Т В , Хрусталева Л И , Андреева Г Н, Карпов Г И Изучение полиморфизма межмикросателтитных последовательностей (ISSR) геномной ДНК различных организмов Гезисы докладов на>ч-ной генетической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А Р Жебрака и 70-летию образования кафедры генетики в МСХА им К А Тимирязева, февраль 2002, Москва

6 Tikunov Yu М , Khrustaleva L 1 and G I Karlov Inter-simple sequence repeat (ISSR) polymorphism m L\copersicon Euphytica, 2002 (направлено в печать)

Отпечатано с готового оригинал-макета

Объем Зак.2/5". Тираж /ОО

АНО «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тикунов, Юрий Михайлович

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Микросателлиты

1.1.1. Типы микросателлитов

1.1.2. Механизмы эволюции микросателлитов

1.1.3. Локализация микросателлитов

1.1.4. Функциональное значение микросателлитов

1.1.5. Подходы к изучению генома, основанные на микросателлитных последовательностях ДНК

1.1.6. Использование методов, основанных на микросателлитных маркерах в селекции растений

1.1.7. Гены устойчивости растений и их маркирование с использованием микросателлитов

1.1.8. Использование микросателлитных в филогении растений

1.2. Филогения томата

1.3. Рекомбинационное картирование генома томата

2. Материалы и методы исследований

2.1. Объекты исследований

2.2. Методы исследований

2.2.1. Выделение геномной ДНК

2.2.2. lSSR-праймерьг

2.2.3. RGA-праймеры 42 2.2.4.1SSR- и RGA-PCR

2.2.5. Филогенетические исследования

2.2.6. Генетическое картирование

3. Результаты исследований

3.1. Полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК томата на межвидовом уровне

3.2. Использование ISSR-маркеров для изучения филогенетических связей видов рода Lycopersicon

3.3. ISSR-PCR на линиях L. esculentum WSL6 и IL6-3 с интрогрессиями в хромосоме

3.4 Физическое картирование ISSR-маркеров на линиях L. esculentum WSL6 и IL6-3 с интрогрессиями в хромосоме

3.5. PCR с использованием комбинирования ISSR-праймеров и праймеров для амплификации аналогов генов устойчивости (RGA)

3.6. Использование ISSR-маркеров для создания интегрированной генетической карты групп сцепления межмикросателлитных последовательностей ДНК томата

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1. Полиморфизм межмикросателлитных последовательностей (ISSRs) томатов и его использование.

4.2. Генетическое картирование межмикросателлитных последовательностей ДНК томата.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование молекулярных маркеров для создания интегрированной генетической карты групп сцепления межмикросателлитных последовательностей ДНК томата"

За последние два десятилетия использование молекулярно-генетических методов позволило исследовать физическую и функциональную организацию геномов организмов, входящих в разнообразные таксоны. Одним из основных понятий, объединяющих эти методы, является понятие «молекулярно-генетический маркер». В настоящее время разработано большое количество типов молекулярно-генетических маркеров, которые основаны на различных классах последовательностей геномной ДНК.

Выявление генетического разнообразия на элементарном молекулярном уровне организации ДНК является основной задачей, для решения которой используются методы молекулярно-генетического маркирования. Результаты решения этой задачи - это тот базис, на котором основаны все дальнейшие теоретические (филогения, изучение организации генома) и прикладные (картирование, маркирование генов, генотипирование) исследования.

Молекулярно-генетические маркеры, создаваемые на основе таких последовательностей ДНК как микросателлиты, стали за последние 10 лет одними из самых популярных и используются в настоящее время для изучения многих видов организмов. Система методов маркирования, использующая микросателлитные последовательности, обладает высокой эффективностью, которая в данном случае складывается из высокой воспроизводимости результатов, простоты использования и требования относительно малого количества времени и финансов. Все эти достоинства в полной мере относятся к методу ISSR-PCR, основанному на амплификации межмикросателлитных последовательностей геномной ДНК с помощью PCR-праймеров, созданных на основе того или иного типа микросателлитов.

Культурный томат Lycopersicon esculentum на сегодняшний момент является одним из самых изученных в генетическом плане видов растений.

Будучи модельным объектом, для многих генетических исследований томат является также ценной сельскохозяйственной культурой с развитой системой производственных и селекционных технологий. Большое количество молекулярно-генетических маркеров, полученных с использованием таких методов как RFLP, RAPD и AFLP, локализовано на генетической карте томата. Однако до сих пор не было проведено исследований, которые позволили бы интегрировать маркеры на основе широкого спектра микросателлитных последовательностей в уже имеющиеся генетические карты томата. Возможно, это позволило бы получить более насыщенную генетическую карту томата и заполнить пробелы, связанные с особенностями локализации тех или иных маркеров. Насыщенность генетических карт маркерами разных типов предоставляет возможность синтеза данных об их организации в геноме и тем самым обеспечивает лучшее понимание структуры, функционирования и эволюции генома. Также это может являться основой для увеличения эффективности селекции сельскохозяйственных культур, в частности томата, по различным признакам, особенно количественным.

Особенности организации микросателлитов в геноме томата, а так же других видов растений, выявлены только для некоторых типов этих последовательностей. Эти особенности заключаются в том, что большинство исследованных микросателлитных последовательностей локализованы в прицентромерной области хромосом томата. Однако специфика методов, использованных для данных исследований, состоит в изучении полиморфизма длинных микросателлитов (>20 повторов). Метод ISSR-PCR, основан на использовании в качестве праймеров коротких (8 повторов - 16 п. н.) синтетических микросателлитных последовательностей и, следовательно, позволяет изучить организацию в геноме более коротких микросателлитов.

Таким образом, изучение микросателлитов и их организации в геноме томата имеет большое практическое значение. Методы молекулярного маркирования, основанные на этих последовательностях, могли бы послужить мощным инструментом в практических целях для повышения эффективности селекции по многим признакам, такой широко распространённой и популярной сельскохозяйственной культуры как томат. Также данные методы могут быть использованы для проведения исследований, касающихся фундаментальных вопросов систематики томатов, организации и эволюции генома этой культуры.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось создание интегрированной генетической карты групп сцепления межмикросателлитцых последовательностей (ISSRs) генома томата Lycopersicon esculentum.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

1. Изучить организацию микросателлитных и межмикросателлитных последовательностей в геноме Lycopersicon ssp.

2. Определить степень полиморфизма межмикросателлитных последовательностей на межвидовом уровне

3. Исследовать особенности физической локализации межмикросателлитных последовательностей на хромосомах томата.

4. Выяснить возможность использования межмикросателлитных маркеров для филогенетических исследований

5. Определить возможность локализации микросателлитов вблизи генов устойчивости томата к патогенам.

Научная новизна. С использованием метода ISSR-PCR у пяти видов томата изучен широкий спектр межмикросателлитных последовательностей, находящихся между различными типами микросателлитов. Выявлена высокая степень полиморфизма межмикросателлитных последовательностей на межвидовом уровне томата. На основе выявленного полиморфизма создана филогенетическая модель исследованных видов томата.

Приоритетным являются полученные данные с использованием линий томата WSL6 и IL6-3 с интрогрессиями по хромосоме 6. Показана возможность физической локализации микросателлитов и межмикросателлитных последовательностей ДНК томата вне прицентромерного гетерохроматина.

Впервые использованное при проведении PCR комбинирование ISSR-праймеров и праймеров для амплификации аналогов генов устойчивости растений (RGA) позволило говорить о возможности локализации микросателлитов в структуре генов устойчивости томата к патогенам или в непосредственной близости от них. Некоторые из фрагментов, полученные таким методом, могут являться потенциальными маркерами генов устойчивости томата к патогенам и вредителям.

Практическая значимость. Предложен набор праймеров на основе межмикросателлитных последовательностей для маркирования генотипов томата на межвидовом уровне и их использование в селекции томата при межвидовой гибридизации для выявления гибридов и изучения интрогрессий генетического материала в последующих поколениях.

Показана возможность использования межмикросателлитных маркеров для прямого маркирования генов устойчивости томата к патогенам.

Межмикросателлитные маркеры могут успешно быть применены для филогенетических исследований Ly copers icon ssp.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Пятой международной конференции по Solanaceae (23-29 Июля, 2000, Nijmegen, Netherlands), на Ежегодной научной конференции учёных МСХА (1999, Москва), на Конференции молодых ученых «Молодые учёные -возрождению сельского хозяйства России» (2000, Брянск), на Генетической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А. Р. Жебрака и 70-летию образования кафедр генетики в Тимирязевской академии, на заседаниях кафедры сельскохозяйственной биотехнологии МСХА.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л. Микросателлиты

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Тикунов, Юрий Михайлович

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК томата на межвидовом уровне

Для изучения полиморфизма межмикросателлитных последовательностей ДНК видов рода Lycopersicon было использовано 14 ISSR-праймеров: с К10, К11, К12, К13, К15, К16, К17, К18, К19, К20, К21, К22, К23 и К24 (таблица 5). Каждый из 14 прайм еров был использован для проведения ISSR-PCR геномной ДНК каждого из пяти видов: L. cheesmanii, L. hirsutum, L. humboldtii, L. esculentum, L. pennellii в трёх повторностях, с трехкратным повторением.

С помощью 9 из 14 ISSR-праймеров: К10, К11, К12, К13, К15, К16, К17, К18, К19 были получены четкие электрофоретические профили для каждого из пяти видов томата. Пример, полученных профилей с использованием праймеров К13 и К15, представлен на рис. 2.

При сравнении ISSR-профилей видов томата был выявлен высокий полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК исследованных видов томата (таблица 6). При этом анализировали как мажорные фрагменты, так и минорные, так как они обладали высокой воспроизводимостью. Проведение ISSR-PCR с использованием праймера К21 - [GATA]4 при температуре отжига 55°С, которая использовалась для всех других праймеров, продуктов PCR получено не было. При снижении температуры отжига данного праймера до 45°С были получены четкие не полиморфные электрофоретические профили у видов L. humboldtii, L. cheesmanii, L. esculentum, L. pennellii. В профиле L. hirsutum при этом присутствовал один фрагмент со слабой интенсивностью.

Использование праймеров К20, К22, К23, К24 привело к получению профилей с качеством, проявлямшемся в образовании шмера (К23) и очень / слабой интенсивности (К20, К22, К24), не позволяющими проводить их дальнейший анализ. Изменение условий при проведении PCR не дало возможности улучшить результаты амплификации при использовании данных праймеров. а б - -ШШЬ **** вир Я --.«и» ЯШшШШ&к '^w.tsiyjiffl : ЩШШШШш-■ - -1 'Л' * ^ ШШКт ** шШШ/к ***** rriit.iiiijM *чщя1 тяш шяш

Рис. 2. ISSR-профили пяти видов томата - а-б, справа налево: L. cheesmanii, L. hirsutum, L. humboldtii, L. esculentum, L. pennellii, полученные с использованием двух праймеров: а - К13, б - К15.

Наибольшее количество ISSR-фрагментов было получено при использовании праймеров К16 и К17, основанных на динуклеотидном повторе [СА], а наименьшее - при использовании праймера К15 - [GT]sYC. Из пяти видов томата, исследованных в данной работе, наибольшее количество ISSR-фрагментов было выявлено у L. esculentum.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тикунов, Юрий Михайлович, Москва

1. Гостимский С. А., Кокаева 3. Г. и В. К. Боброва. 1999, Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений. Генетика, т. 35, №11, 1538 1549.

2. Данилова Т.В., Тикунов Ю. М., Weber (г. Карлов Г. И. 2001, у Молекулярное маркирование пола у хмеля (.Hamulus lupulus L.) с использованием ISSR-ПЦР. Сельскохозяйственная биотехнология. Том II. М.: Воскресенье.

3. Жученко А. А., 1973. Генетика томатов. Кишенёв, «Штиинца».

4. Кочиева Е. 3. и Т. П. Супрунова. 1999. Идентификация видового и сортового полиморфизма у томатов. Генетика, т. 35, №10, 1386 1389.

5. Кочиева Е. 3., Супрунова Т. П. и С. К. Семёнова, 1999. Использование RAPD-анализа для идентификации сортов баклажанов (,Solarium melongena L.), Генетика. Т. 35, №8, 1165 1168.

6. Оганисян А. С., Кочиева Е. 3. и А. П. Рысков. 1996. Маркирование видов и сортов картофеля с помощью метода RAPD-PCR. Генетика, т. 32, №448-451.

7. Ajibade S. R., Weeden N. F., Chite S. M. 2000. Inter simple sequence repeat analysis of genetic relationships in the genus Vigna. Euphytica 111: 47-55.

8. Akagi H, Yokozeki Y, Inagaki A, Nakamura A, Fujimura T (1996) A co-dominant DNA marker closely linked to the rice nuclear restore gene, Rf-1, identified with inter-SSR fingerprinting. Genome 39:1205-1209

9. Akagi, H., Y. Yokozeki, A. Inagaki & T.T. Fujimura, 1996. Microsatellite DNA markers for rice chromosomes. Theor Appl Genet 93: 1071-1077.

10. Akkaya, M.S., R.C. Shoemaker, J.E. Specht, A.A. Bhagwat & P.B. Cregan, 1995. Integration of simple sequence repeat DNA markers into a soybean linkage map. Crop Sci 35:1439-1445. .

11. Arcade, A., Anselin, E, Faivre Rampant, P., Lesage, M.C., L. E. Paques & D. Prat, 2000. Application of AFLP, RAPD and ISSR markers to genetic mapping of European and Japanese Larch. Theor Appl Genet 100: 299 307.

12. Arens, P., Odinot, P., Van Heusden, A.W., P. Lindout & B. Vosman, 1995. GATA- and GACA-repeats are not evenly distributed throughout the tomato genome. Genome 38: 84 90.

13. Areshchenkova, Т. & M. W. Ganal, 1999. Long tomato microsatellites are predominantly associated with centrOmeric regions. Genome 42: 536 544.

14. Areshchenkova, T. and M. W. Ganal, 2002. Comparative analysis of polymorphism and chromosomal location of tomato microsatellite markers isolated from different sources. Theor Appl Genet 104:229-235.

15. Ayres, N.M., P.D. McClung, P.D. Larkin, H.F.J. Bligh, C.A. Jones & W. Park, 1997. Microsatellites and a single-nucleotide polymorphism differentiate apparent amylose classes in an extended pedigree of US rice germplasm. Theor Appl Genet 94: 773-781.

16. Bachman, M., J. Tarmilonis, A. Bent & C. Nickell, 1999. Identification of SSR markers linked to brown stem rot resistance in soybean. In: International Plant & Animal Genome VII Conference: Abstract P242, 17th-21st Jan., 1999, San Diego, CA.

17. Baker В., Zambryski P., Staskawicz B. and S.P. Dinesh-Kumar, 1997. Signaling in plant-microbe interactions. Science 276:726 733.

18. Becker, J. & M. Helm, 1995a. Barley microstellites: allele variation and mapping. Plant Molecular Biology 27: 835-845.

19. Becker, J. & M. Heim, 1995b. Mapping of digested and undigested random amplified microsatellite polymorphisms in barley. Genome 38: 991-998.

20. Beckmann, J.S. & M. Soller, 1990. Toward a unified approach to genetic mapping of eukaryotes based on sequence tagged microsatellite sites. Biotechnology 8: 930-932:

21. Bell, C. J. & J. R. Ecker, 1994. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics 19: 137- 144.

22. Benabdelmouna A., Peltier D., Humbert C. and M. Abirached-Darmency, 1999. Southern and fluorescence in situ hybridization detected three RAPD-generated PCR products useful as introgression markers in Petunia. Theor Appl Genet 98:10-17.

23. Beyermam, В., P. Nurnberg, A. Weihe, M. Mexiner, J.T. Epplen & T. Borner, 1992. Fingerprinting plant genomes with oligo-nucleotide probes specific for simple repetitive sequences. Theor Appl Genet 83: 691-694.

24. Blair, M.W. & S.R. McCouch, 1997. Microsatellite and sequence-tagged site markers diagnostic for the rice bacterial leaf blight resistance gene xa-5. Theor Appl Genet 95: 174-184.

25. Bligh, H.F.J., R.I. Till & C.A. Jones, 1995. A microsatellite sequence closely linked to the Waxy, gene of Oryza sativa. Euphytica 86: 83-85.

26. Bohn M., Utz H. F., Melchinger A. E. Genetic similarities among winter wheat cultivars determined on the basis of RFLPs, AFLPs and SSRs and their use for predicting progeny variance. Crop Sci 39:228-237.

27. Bowcock AM, Ruiz-Lineares A, Tonfohrde J, Minch E, Kidd Ж, Cavalli-Sforza LL (1994) High resolution of human evolutionary trees with polymorphic microsatellites. Nature 368:455-457

28. Brmkmann B, Klmtschar M, Neuhuber F, Huhne J, Rolf В (1998) Mutation rate in human microsatellites: influence of the structure and length of the tandem repeat. Am J Hum Genet 62:1408-1415

29. Brondani, R. P. V, Brondani, C., R. Tarchini & D. Grattapaglia, 1998. Development, characterization and mapping of microsatellite markers in Eucalyptus grandis and E. urophylla. Theor Appl Genet 97: 816 827.

30. Brondani, C., P. Vianello, B. Rosana & M.E. Ferreira, 1999. Conservation of SSR loci in wild and cultivated Oryza species. In: International Plant & Animal Genome VII Conference: Abstract P452, 17th-21st Jan., 1999, San Diego, CA.

31. Broun, P. & S. D. Tanksley, 1996. Characterization and genetic mapping in simple sequence repeats in the tomato genome. Mol Gen Genet 250: 39-49.

32. Brunei D. 1994. A microsatellite marker in Helianthus annuus L. Plant Mol Biol 24(2): 397-400.

33. Bryan, G.J., A.J. Collins, P. Stephenson, A. Orry, J.B. Smith & M.D. Gale, 1997. Isolation and characterization ofmicrosatellites from hexaploid wheat. Theor Appl Genet 94: 557-563.

34. Caranta, C., Palloix, A., Lefebvre, V., and Daubeze. A.M. 1997. QTLs for a component of partial resistance to cucumber mosaic virus in pepper: Restriction of virus installation in host-cells. Theor. Appl. Genet. 94: 431-438.

35. Cecikc C., Battey N. H. and M. J. Wilkinson. 2001. The potencial of ISSR-PCR primer-pair combination for genetic linkage analysis using the seasonal flowering locus in Fragaria as a model. Theor Appl Genet 103:540-564

36. Charlesworth B, Morgan MT, Charlesworth D (1993) The effect of deleterious mutations on neutral molecular variation. Genetics 134:1289-1303

37. Charters, Y.M., A. Robertson, M.J. Wilinkson & G. Ramsay, 1996. PCR analysis of oilseed rape cultivars (Brassica napus L. ssp. oleifera) using 57-anchored simple sequence repeat (SSR) primers. Theor Appl Genet 92: 442447.

38. Chen, X.S., Y. Temnykh, Y. Xu, Y.G. Cho & S.R. McCouch, 1997. Development of microsatellite map providing genome-wide coverage in rice (Oryza sativa L.). Theor Appl Genet 95:553-567.

39. Cho, Y.G., McCouch, S.R., Kuiper, M., Kang, M.R., Pot, J., Groenen, J.T.M., and Eun, M.Y. 1998. Integrated map of AFLP. SSLP and RFLP markers using a recombinant inbred population of rice (Oryza saliva L). Theor. Appl. Genet. 97: 370-380.

40. Cifarelli, R.A., M. Gallitelli & F. Celliini. 1995. Random amplified hybridization microsatellites (RAHM): isolation of a new class of microsatellite-containing DNA clones. Nucl Acids Res 23:3802-3803.

41. Condit, R. & S.P. Hubbell, 1991. Abundance and DNA sequences of two-base repeat regions in tropical tree genomes. Genome 34:66-7.1.

42. Cox, R and S. M. Mirkin. 1997. Characteristics enrichment of DNA repeats in different genomes. Proc. Natl. Acad. Sci. 94:5237-5242.

43. Cregan, P.B., T. Jarvik, A.L. Bush, R.C. Shoemaker, K.G. Lark, A.I. Kahler, N. Kaya, T.T. VanToai, D.G. Lohnes, J. Chung & J. Specht, 1999. An integrated genetic linkage map of the soybean genome. Crop Sci 39: 14641490.

44. Cuadrado, A. & T. Schwarzacher, 1998. The chromosomal organization of sequence repeats in wheat and rye genomes. Chromosoma 107: 587 594.

45. Davila, J.A., Y. Loarce & E. Ferrer, 1999. Molecular characterization and genetic mapping of random amplified microsatellite polymorphisms in barley. Theor Appl Genet 98: 265-273.

46. Deng, Z., Huang, S., Ling, P., Chen, C., Yu, C., Weber C. A., G. A. Moore & Jr. Gmitter, 2000. Cloning and characterization of NBS-LRR class resistance-gene candidate sequences in citrus. Theor Appl Genet 101: 814 -822.

47. Di Rienzo A, Donnelly P, Toomajian C, Sisk B, Hill A, Petzl-Erler L M, Haines G, Barch DH (1998) Heterogeneity of microsatellite mutations withinand between loci and implications for human demographic histories. Genetics 148:1269-1284

48. Dib C, Faure S, Fizames C, Samson D, Drouot N, Vignal A, Millasseau P, Marc S, Hazan J, Seboun E, Lathrop M, Gyapay G, Morissette J, Weissenbach J (1996) A comprehensive genetic map of the human genome based on 5,264 microsatellites. Nature 380:152-154

49. Dow, B;D„ M.V. Ashley & H.T. Howe, 1995. Characterization of highly variable (GA/CA)n microsatellites in the bur oak, Quercus macrocarpa. Theor Appl Genet 91: 137-147.

50. Echt, C. S., May-Marquardt, P., M. Hseih & R. Zahorchak, 1996. Charactrization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome 39: 1102 1108.

51. Echt, C.S. & P. May-Marquardt, 1997. Survey of microsatellite DNA in pine. Genome 40: 9-17.

52. Ellis J. and D. Jones, 1998. Structure and function of proteins, controlling strain specific pathogene resistant in plants. Curr Opin Plant Biol 1:288 293.

53. Ender, A., K. Schwenk, T. Stadler, B. Streit & B. Schierwater, 1996. RAPD identification of microsatellites in Daphina. Molecular Ecology 5:437-441.

54. Eujayl, I., Baum. M., Powell, W., Erskine, W., and Pehu, E. 1998. A genetic linkage map of lentil (Lens sp.) based on RAPD and AFLP markers using recombinant inbred lines. Theor. Appl. Genet. 97: 83-89.

55. Fahima T„ M.S. Roder, A. Grama & E. Nevo, 1998. Microsatellite DNA polymorphism divergence in Triticum dicoccoides accessions highly resistant to yellow rust. Theor Appl Genet 96:187-195.

56. Fang, D., R. R. Krueger & M. L. Roose, 1998. Phylogenetic relationships among selected Citrus germplasm accessions revealed by inter simple sequence repeat (ISSR) markers. J Am Soc Hortic Sc 123: 616 617.

57. Fransz P.F., Stam M., Montijn В., Ten Hoopen R., Wiegant J., Kooter J.M., Oud O. and N. Nanninga, 1996. Detection of single-copy genes and chromosome rearrangements in Petunia hybrida by fluorescent in situ hybridization. Plant J 9(5):767-774.

58. Fransz P.F., Alonso-Blanco C., Liharska B.T., Peeters A.J.M., Zabel P. and J. H. de Jong, 1996. High-resolution physical mapping in Arabidopsis thaliana and tomato by fluorescence in situ hybridization to extended DNA fibres. Plant J 9(3):421-430.

59. Fuchs J., Kloos D.U., Ganal M. W. And Schubert I. 1996. In situ hybridization of yeast artificial chromosome sequences on tomato and potato methaphase chromosomes. Chromosome Res 4: 277-281.

60. Fuchs J. and I. Schubert, 1995. Localization of seed protein genes on metaphase chromosomes of Vicia faba via fluorescence in situ hybridization. Chromosome Res 3:94-100.

61. Gall J. G. and M. L. Pardue. 1969. Formation and detection RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparation. Proc Natl Acad Sci USA 63:378383.

62. Garry, P., С. Ken, R. Anthony & L. Peter, 1997. Identification of molecular markers linked to flour colour and milling yield in wheat. In: 5th International Congress of Plant Molecular Biology: 21st-27th Sept., 1997, Singapore.

63. Garza JC, Slatkin M, Freimer NB (1995) Microsatellite allele frequencies in humans and chimpanzees with implications for constraints on allele size. Mol Biol Evol 12:594-603

64. Gianfranceschi, L., N. Seglias, R. Tarchini, M. Komjane & C. Gessler, 1998. Simple sequence repeats for the genetic analysis of apple. Theor Appl Genet 96: 1069-1076.

65. Glenn TC, Stephan W, Dessauer HC, Braun MJ (1996) Allelic diversity in alligator microsatellite loci is negatively correlated with GC content of flanking sequences and evolutionary conservation of PCR amplifiability. Mol Biol Evol 13:1151-1154.

66. Goldman IL, Paran 1, Zamir D (1995) Quantitative trait locuanalysis of a recombinant inbred line population derived from a Lycopersicon esculentum x Lvcopersicon cheesmanii cross. Theor Appl Genet 90:925-932

67. Goldstein DB, Clark AG (1995) Microsatellite variation in North American populations of Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res 23:3882-3886

68. Grandillo, S. & S. D. Tanksley, 1996. Genetic analysis of RFLPs, GATAmicrosatellites and RAPDs in a cross between L. esculentum and L. pimpinellifolium. Theor Appl Genet 92: 957 965.

69. Gupta, M, J. Chyi, J. Romero-Severson & J.L. Owen, 1994, Amplification of DNA markers from evolutionary diverse genomes using smgle primers of simple-sequence repeats. Theor Appl Genet 89: 998-1006.

70. Gupta, P. К., H. S. Balyan, P. C. Sharma & B. Ramesh, 1996. Microsatellites in plants: a new class of molecular markers. Curr Sci 70:45-54.

71. Gupta, P. K. and R. K. Varshney, 2000. The development and use of microsatellite markers for genetic analyses and plant breeding with emphasis on bread wheat. Euphytica 113:163-185.

72. Hamada H., Petrino M. G. and Kakunaga T. 1982. A novel repeate element with Z-DNA-forming potential is widely found in evolutionary diverse eukaryotic genomes. Proc Natl Acad Sci USA 79:6465-6469.

73. Hancock, J. M., 1995. The contribution of slippage-like processes to genome evolution. J. Mol. Evol. 41:1038-1047.

74. Hancock, J. M., 1996. Simple sequences and the expanding genomes. BioEssays 18:421-425

75. Hanson R.E., Zwick M.S., Choi S., Nurul Islam-Faridi M., McKnight D., Wing R. A., Price H.J. and D.M. Stelly, 1995. Fluorescence in situ hybridization of a bacterial artificial chromosome. Genome 38:646-651.

76. Harr B, Zangeri B, Brem G, Schlotterer С (1998) Conservation of locus specific microsatellite variability across species: a comparison of two

77. Drosophila sibling species D. melanogaster and D: simulans. Mol Biol Evol 15:176-184

78. Hentschel CC (1982) Homocopolymer sequences in the spacer of a sea urchin histone gene repeat are sensitive to SI nuclease. Nature 295:714-716

79. Hogenboom, N.G. 1972. Breaking breeding barriers in Lycopcrsicon. 1. The genus Lycopcrsicon, its breeding barriers and the importance of breaking these barriers. Euphytica 21:221-227.

80. Hood, D. W., Deadman, M. E., Jennings, M. P., Bisercic, M., Fleischmann, R. D., J. C. Venter & E. R. Moxon, 1996. DNA repeats identify novel virulence genes in Haemophilus influenzae. Proc Natl Acad Sci USA 93: 11121 — 11125.

81. Huttel, В., P. Winter, K. Weising, W. Choumarte, F. Weigand & G. Kahl, 1999. Sequence-tagged microsatellite site markers for chickpea {Cicer arietenumL.). Genome 42:210-217.

82. Jarret, R.L„ L.C. Merrick, T. Holms, J. Evans & M.K. Aradhya, 1997. Simple sequence repeats in watermelon (Citrullus lanatus (Tbunb.) Matsum. & Nakai). Genome 40: 433-441.

83. John H. A., Birnstiel M. L. and Jones K. W. 1969. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature 223:582-587.

84. Jones D. F. 1917. Linkage in Lycopersicum. Am. Nat. 51:608-621:

85. Joshi, S. P., Gupta, V. S., Aggarwal, R. К., P. K. Ranjekar & D. S. Brar, 2000. Genetic diversity and phylogenetic relationship as revealed by inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism in the genus Oryza. Theor Appl Genet 100: 1311 1320.

86. Joseph A. M., Gosden J. R., Chandley A. C. 1984. Estimation of aneuploidy levels in human spermatozoa using chromosome specific probes and in situ hybridization. Hum. Genet. 66:234-238.

87. Kalendar R., Grob Т., Regina M., Suoniemi A. and A. Schulman, 1999. IRAP and REMAP: two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques. Theor Appl Genet 98:704-711.

88. Kantety, R.V„ X. Zeng, J.L. Bennetzen & B.E. Zehr, 1995. Assessment of genetic diversity in dent and popcorn (Zea mays L.) inbred lines using inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification. Molecular Breeding 1: 365-373.

89. Kanazin V., Marek L. and R. Shoemaker, 1996. Resistance gene analogs are conserved and clustered in soybean. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:11746 -11750.

90. Kashi Y, Soller M (1999) Functional roles of microsatellites and minisatellites. In: Goldstein DB, Schlotterer С (eds) Microsatellites: evolution and applications. Oxford University Press, Oxford, pp 10-23

91. Kennedy, G. С., M. S. German & W. J. Rutter, 1995. The mmisatellite in the diabetes susceptibility locus IDDM2 regulates insulin transcription. Nature Genet 9: 293 298.

92. Kobe B.and J. Deisenhofer, 1994. The leucine-rich repeat: a versatile binding motif. Trends Biochem Sci 19:415 420.

93. Koh, H.J„ M.H. Hen & S.R. McCouch, 1996. Molecular mapping of the ges gene controlling the supergiant embryo character in rice (Oryza sativa L ). Theor Appl Genet 93: 257-261.

94. Kojima, Т., Nagaoka, Т., К. Noda & Y. Ogihara, 1998. Genetic linkage map of ISSR and RAPD markers in einkorn wheat in relation to that of RFLP markers. Theor Appl Genet 96: 37 45.

95. Koorneef M. Т., Bosma D. G., Hanahart C. J., Van der Veen J. H. and J.A.D. Zeevaart, 1990. The isolation and characterization of gibberellm-deficient mutants in tomato. Theor Appl Genet 80: 852-857

96. Korzun, V., M. Roder, A.J. Worland & A. Bomer, 1997a. Application of microsatellite markers to distinguish inter-varietal chromosome substitution lines of wheat (Triticum aestivum L.). Euphytica 95: 149-155.

97. Korzun, V., M. Roder, A.J. Worland & A. Bomer, 1997b. m-trachromosomal mapping of genes for dwarfing (Rhtl2) and vernalization response (Vml) in wheat by using RFLP and microsatellite markers. Plant Breeding 116: 227-232.

98. Kresovich, S., A.K. Szewe-McFadden, S.M. Bliek & J.R. McFer-son, 1995. Abundance and characterization of simple-sequence repeats (SSRs) isolated from a size-fractionated genomic library of Brassica napus L. (rapeseed). Theor Appl Genet 91:206-211.

99. Kubalakova M., Macas J. and J. Dolezel, 1997. Mapping of repeated. DNA sequences in plant chromosomes by PRINS and C-PRINS. Theor Appl Genet 94:758-763.

100. Kulikova O., Gualtieri G., Geurts R., Kim D-J., Cook D., Huguet Th., de Jong J.H., Fransz P.F. and T. Bisseling, Integration of the FISH pachytene and genetics map of Medicago truncatula, 2001. Plant J 27(l):49-58.

101. Lagoda, P.J.L., D. Dambier, A. Graphin, F.C. Baurens, C. Lanaud & J.L. Noyer, 1998a. Nonradioactive sequence-tagged microsatellite site analyses: a method transferable to the tropics. Electrophoresis 19: 152-157.

102. Lagercrantz U, Ellegren H, Andersson L, 1993. The abundance of various polymorphic microsatellite motifs differs between plants and vertebrates. Nucleic Acids Res 21:1111-1115

103. Langer-Safer P. R., Waldrop A. A., Ward D. C. 1981. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci USA 78:6633-6637.

104. Lee JS, Hanford MG, Genova JL, Farber RA (1999) Relative stabilities of dinucleotide and tetranucleotide repeats in cultured mammalian cells. Hum Mol Genet 8:2567-2572

105. Lee, C., Wevrick, R., Fisher, R. В., M. A. Ferguson-Smith & С. C. Lin, 1997. Human centromeric DNA. Human Genet 100: 241 304.

106. Leister D., Ballvora A., Salamini F. and C. Gebhardt, 1996. A PCR-based approach for isoleting pathogene resistance genes from potato wiht potential for wide application in plants. Nature Genet. 14:421 429.

107. Leitch I. J., Leitch A.R. and J. S. Heslop-Harrison, 1991. Physical mapping of plant DNA sequencesby simultanious in situ hybridization of two differently labelled fluorescent probes. Genome 34:329-333.

108. Leroy, X. J., Leon, K., Hily, J. M., P. Chaumeil & M. Branchard, 2001. Detection of in vitro culture-induced instability through inter-simple sequence repeat analysis. Theor Appl Genet 102: 885 891.

109. Levin, I., Gilboa, N., Yeselson, E., S. Shen & A. A. Schaffer, 2000. Fgr, a major locus that modulates the fructose to glucose ratio in mature tomato fruits. Theor Appl Genet 100: 256 262.

110. Levinson G, Gutman GA (1987a) High frequencies of short frameshifts in poly-CA/TG tandem repeats borne by bacterio-phage M13 in Escherichia coli K-12. Nucleic Acid Res 15: 5323-5338

111. Li, J. & M. Niwa, 1996. Microsatellite DNA markers linked to a gene controlling days to flowering in soybean (Glycine max) under short day conditions. Breeding Science 46: 81-84.

112. Lindhout P, Van Heusden S, Pet G, Van Ooijen JW, Sandbrink H, Verkerk R, Vrielink R, Zabel P (1994) Perspectives of molecular marker-assisted breeding for earliness in tomato. Euphytica 79: 279-286

113. Liu, Y.G„ R.M. Biyashev & M.A. Saghai-Maroof, 1996. Development of simple sequence repeat DNA markers and their integration into a barley linkage map. Theor Appl Genet 93: 869-876.

114. Ma, Z.Q., M. Roder & M.E. Sorrells, 1996. Frequency and sequence characteristics of di-, tri- and tetranucleotide microsatellites in wheat. Genome 39: 123-130.

115. Marra G, Schar P (1999) Recognition of DNA alterations by the mismatch repair system. Biochem J 3 3 8:1 -13

116. Marques, C.M., Araujo, J.A„ Ferreira, J.G., Whetten, R., O'Mal-ley, D.M., Liu, B-H., and Sederoff, R. 1998. AFLP genetic maps of Eucalyptus globulus and E. tereticomis. Theor. Appl. Genet. 96: 727-737.

117. McClean, P.E. and M.R. Hanson. 1986. Mitochondrial DNA sequence divergence among Lycopersicon and related Solanum species. Genetics 112:649-667.

118. McClintock В., 1984. The significance of response of the genome to challenge. Science 226:792 801.

119. McCouch, S.R, X. Chen, 0. Panaud, S. Temnykh, Y. Xu, Y.G. Cho, N. Huang, T. Ishii & M. Blair, 1997. Microsatellite marker development, mapping and applications in rice genetics and breeding. Plant Mol Biol 35: 89-99.

120. Menendez, C.M., Hall, A.E., and Gepts, P. 1997. A genetic linkage map of cowpea (Vigna unguiculatd) developed from a cross between two inbred, domesticated lines. Theor. Appl. Genet. 95:1210-1217.

121. Metzgar, D., J. Bytof & C. Wills, 2000. Selection against frameshift mutations limits microsatellite expantion in coding DNA. Genome Res 10: 72 -80.

122. Michalakis Y, Veuille M (1996) Length variation of CAG/CAA trinucleotide repeats in natural populations of Drosophila melanogaster and its relation to the recombination rate. Genetics 143:1713-1725

123. Miller, J. C. & S. D. Tanksley, 1990. RFLP analysis of relationship and genetic variation in the genus Lycopersicon. Theor Appl Genet 80: 437 448.

124. Modrich P, Lahue R (1996) Mismatch repair in replication fidelity, genetic recombination and cancer biology. Annu Rev Biochem 65:101-133

125. Morgante, M. & J. Vogel, 1994. Compound microsatellite primers for the detection of genetic polymorphisms. US patent application no. 08/326456.

126. Morgante, M., A. Rafalski, P. Biddle, S. Tingey & X.M. Oliveri, 1994. Genetic mapping and variability of seven soybean simple sequence repeat loci. Genome 37: 763-769.

127. Mudge, J., P.B. Cregan, J.P. Kenworthy, W.J. Kenworthy, J.H. Orf & N.D. Young, 1997. Two microsatellite markers that flank the major soybean cyst nematode resistance locus. Crop Sci 37:1611-1615.

128. Nauta MJ, Weissing FJ (1996) Constraints on allele size at micro-satellite loci: implications for genetic differentiation. Genetics 143:1021-1032

129. Nei, M., F. Tajima & Y. Tateno, 1983. Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data. II. Gene frequency data. J Mol Evol 19: 153 170.

130. Paetku, D. & C. Strobeck, 1995. The molecular basis and evolutionary history of a microsatellie null alleles in bears. Molecular Ecology 4: 519-520.

131. Palmer, J. D. & D. Zamir, 1982. Chloroplast DNA evolution and phylogenetic relationship in Lycopersicon. Proc Natl Acad Sci USA 79: 5006 -5010.

132. Panaud, 0„ X. Chen & S.R. McCouch, 1996. Development of microsatellite markers and characterization of simple sequence length polymorphism (SSLP) in rice (Oryza sativa L.). Mol Gen Genet 252: 597-607.

133. Panaud, 0„ X. Chen & S.R. McCouch. 1995. Frequency of microsatellite sequences in rice (Qryza sativa L.). Genome 38:1170-1176.

134. Paniego, N. M. Munoz, M. Echaide, L. Femadez, P. Faccio, R. Zandomeni, E. Suarez & E. Hopp, 1999. Microsatellite development for sunflower. In: International Plant & Animal Genome VII Conference: Abstract P464, 17th-21st Jan., 1999, San Diego, CA.

135. Pasakinskiene I., Griffiths С. M., Bettany A. J. E., Paplauskiene V., Humphreys M. W. 2000. . Anchored simple sequence repeats as primers to generate species-specific DNA markers in Lolium and Festuca grasses. Theor Appl Genet 100:384-390.

136. Pedersen, С. & I. Linde-Laursen, 1994. Chromosomal location of four minor rDNA loci and a marker microsatellite sequence in barley. Chromosome Res 2: 67-71.

137. Pejic I., Ajmone Marsan P., Morgante M., Kozumplick V., Castiglioni P., Taramino G., Motto M. 1998. Comparativ analysis of genetic similarity among maize inbred lines detected by RFLPs, RAPDs, SSRs and AFLPs. Theor Appl Genet 97:1248-1255.

138. Perring, T.M„ A.D. Cooper, R.J. Rodriguez, C.A. Farrar & T.S. Bellows, 1993. Identification of a white fly species by genomic and behavioural studies. Science 259: 74-77.

139. Pillen K., Ganal M.W., Tanksley S.D. 1996. Construction of a high resolution genetic map and YAC-contigs in the tomato Tm-2a region. Theor Appl Genet 93: 228-233.

140. Plaschke, J., M.W. Ganal & M.S. Roder, 1995. Detection of genetic diversity in closely related bread wheat using microsatellite markers. Theor Appl Genet 91: 1001-1007.

141. Pouteau S., Boccara M. and M. A. Grandbastien, 1994. Microbial elicitors of plant defense response activate transcription of retrotransposon. Plant J. 5:535 -542.

142. Powell, W., G.C. Machray & J. Provan, 1996a. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trends Plant Sci 1: 215-222.

143. Powell, W., M. Morgante, C. Andre, M. Hanafey, J. Vogel, S. Tingey & J.A. Rafalaski, 1996b. The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSRmicrosatellite) markers for germplasm analysis. Molecular Breeding 2: 225238.

144. Prasad, M„ R.K. Varshney, J.K. Roy, H.S. Balyan & P.K. Gupta, 2000. The use of microsatellites for detecting DNA polymorphism, genotype identification and genetic diversity in wheat. Theor Appl Genet 100: 584 592.

145. Prevost, A. & M. J. Wilkinson, 1999. A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars. Theor Appl Genet 98:107- 112.

146. Qian W., Ge S., Hong D-Y. 2001. Genetic variation within and among population of wild rice Oriza granulata from China detected by RAPD and ISSR markers. Theor Appl Genet 102:440-449.

147. Rafalski, J. A., S. V. Tingey & J. G. K. Williams, 1991. RAPD markers a new technology for genetic mapping and plant breeding. AgBiotech News and Information 3(4): 645 - 648.

148. Ratnaparkhe, M.B., D.K. Santra, A. Tullu & F.J. Muehlbauer, 1998. Inheritance of inter-simple-sequence-repeat polymorphisms and linkage with a fusarium wilt resistance gene in chickpea. Theor Appl Genet 96: 348-353.

149. Rayburn A. L. and Gill B. S. 1985 Use of biotin-labeled probes to map specific DNA sequences on wheat chromosomes. J. Hered 76:78-81

150. Richardson, Т., S. Cato, J. Ramser, G. Kahl & K. Weising, 1995. Hybridization of microsatellites to RAPD: a new source of polymorphic markers. Nucl Acids Res 23: 3798-3799.

151. Richter Т. E. and P. C. Ronald, 2000. The evolution of disease resistance genes. 42:195-204.

152. Rick, C.M. 1960. Hybridization between Lycopersicon esculenlum and Solarium pennellii. Phylogcnetic and cytogenetic significance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46:78-82.

153. Rick, C.M. 1963. Biosystematic studies on Galapagos tomatoes. Occasional Papers Calif. Acad. Sci. 44:59-77.

154. Rick, C.M. 1963. Barriers to interbreeding in Lycopersicon peruvianum. Evolution 17:216-232.

155. Rick, C.M. 1971. Lycopersicon, p. 468-471. In: I.L. Wiggins and D.M. Porter (eds.). Flora of the Galapagos Islands. Stanford Univ. Press, Palo Alto, Calif.

156. Rick, C.M. 1976. Natural variability in wild species of Lycopersicon and its bearing on tomato breeding. Genet. Agr. 30:249-259.

157. Rico C, Rico I, Hewitt G (1996) 470 million years of conservation of microsatellite loci among fish species. Proc R Soc Lond В Biol Sci 263:549557

158. Rick C. The Tomato. In: Handbook of Genetics", R. C. King ed., New York: Plenum press: 1975, 2:247-280

159. Rick С. M. and Fobes J. F. 1975. Allozyme variation in cultivated tomato and closely related species. Bulletin of the Torrey Botanic Club 102:376-384.

160. Roder, M.S., J. Plaschke, S.U. Konig, A. Bomer, M.E. Sorells, S.D. Tanksley & M.W. Canal, 1995. Abundance, variability and chromosomal location of microsatellites in wheat. Mol Gen Genet 246: 327-333.

161. Roder, M.S., N.L.Y. Lapitan, M.E. Sorrells & S.D. Tanksley, 1993. Genetic and physical mapping of barley telomeres. Mol Gen Genet 238: 294-303.

162. Roder, M.S., V. Korzun, B.S. Gill & M.W. Ganal, 1998a. The physical mapping of microsatellite markers in wheat. Genome 41:278-283.

163. Roder, M.S., V. Korzun, K. Wendehake, J. Plaschke, M.H. Tixer, P. Leroy & M.W. Ganal, 1998b. A microsatellite map of wheat. Genetics 149: 20072023.

164. Russell J. R., Fullr J. D., Macaulay M., Hatz B. G., Jahoor A., Powell W., Waugh R. 1997. Direct comparison of levels of genetic variation among barley accessions detected by RFLPs, AFLPs, SSRs and RAPDs. Theor Appl Genet 95:714-722.

165. Sadder M.T. and G. Weber, 2001. Karyotype of Maize (Zea mays L.) mitotic methaphase chromosomes as revealed by fluorescence in situ hybridization (FISH) with cytogenetic DNA markers. Plant Mol Biol Rep 19:117-123

166. Saliba-Colombani, V., Causse, M., L. Gervais & J. Philouze, 2000. Efficiency of RFLP, RAPD and AFLP markers for the construction of interspecific map of the tomato genome. Genome 43: 29 40.

167. Schlotterer C, Amos B, Tautz D (1991) Conservation of polymorphic simple sequence loci in cetacean species. Nature 354:63-65

168. Schlotterer C, Pemberton J (1998) The use of microsatellites for genetic analysis of natural populations a critical review. In. DeSalle R, Schierwater Вeds) Molecular approaches to ecology and evolution. Birkhauser, Basel, pp 7186

169. Schlotterer C, Tautz D (1992) Slippage synthesis of simple sequence DNA. Nucleic Acids Res 20:211-215

170. Schmidt, T. & J.S. Heslop-Harrison, 1996. The physical and genomic organization of microsatellites in sugar beet. Proc Nati Acad Sci USA 93: 87618765.

171. Schug MD, Hutter CM, Noor MAF, Aquardo CF (1998a) Mutation and evolution of microsatellites in Drosophila melanogaster. Genetica 102/103:359-367

172. Schug MD, Hutter CM, Wetterstrand KA, Gaudette MS, Mackay TF, Aquadro CF (1998b) The mutation rates of di-, tri- and tetranucleotide repeats in Drosophila melanogaster. Mol Biol Evol 15:1751-1760

173. Schug MD, Mackay TFC, Aquadro CF (1997) Low mutation rates of microsatellite loci in Drosophila melanogaster. Nat Genet 15:99-102

174. Scrimshaw, B.J. 1992. A simple nonradioactive procedure for visualization of(dC-dA)n dinucleotide repeat length polymorphisms. Bio Techniques 13: 189.

175. Senior, M.L. & M. Heun, 1993. Mapping maize microsatellites and polymerase chain reaction confirmation of targeted repeats using a CT primer. Genome 36: 884-889.

176. Senior, M.L., E.C.L. Chin, M. Lee & J.S.C. Smith, 1996. Simple sequence repeat markers developed from maize sequence found in the GenBank database: map construction. Crop Sci 36: 1676-1683.

177. Sharon, D., P.B. Cregan, S. Mhameed, M. Kusharska, J. Hillel, E. Lahav, C. Epplen & U. Lavi, 1997. An integrated genetic linkage map of avocado. Theor Appl Genet 95: 911-921.

178. Sherman, J. D. & S. M. Stack, 1995. Two-dimensional spreads of synaptinemal complexes from solanaceous plants. VI. High-resolution recombination nodule map of tomato (Lycopersicon esculentum). Genetics 141: 683 -708.

179. Speichier M. R., Ballard S. G. and Ward D.C. 1996. Karyotyping human chromosomes by combinatorial multiflour FISH. Nature Genetics 12:368.

180. Speulman E., Bouchez D., Holub E. and J.L. Beynon, 1998. Disease resistance gene homologs correlate with disease resistance loci of Arabidopsis thaliana. Plant J. 14(4): 467 474.

181. Stam P. and J. W. Ooijen, 2000. JoinMap 2.0. Software for the calculation genetic linkage maps.

182. Stephenson, P., G. Bryan, J. Kirby, A. Collins, K.M. Devos, C. Busso & M.D. Gale, 1998. Fifty new microsatellite loci for the wheat genetic map. Theor Appl Genet 97: 946-949.

183. Strand M, Prolla ТА, Liskay RM, Petes TD (1993) Destabilization of tracts of simple repetitive DNA in yeast by mutations affecting DNA mismatch repair. Nature 365:274-276

184. Streisinger G, Owen JE (1985) Mechanisms of spontaneous and induced frameshift mutation in bacteriophage T4. Genetics 109:633-659

185. Tanksley, S. D., Young, N. D., A. H. Paterson & M. W. Bonierbale, 1989. RFLP mapping in plant breeding: new tools for an old science. BioTechnology 7:257-264.

186. Tanksley, S.D., Bematzky, R., Lapitan, N.L., and Prince, J.P.I988a. Conservation of gene repertoire but not gene order in pepper and tomato. Pro с. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 6419-6423.

187. Taramino, G. & S. Tingey, 1996. Simple sequence repeats for the germplasm analysis and mapping in maize. Genome 39: 277-287.

188. Tautz, D. & M. Renz, 1984. Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes. Nucl Acids Res 12:4127-4138.

189. Tautz, D., 1989. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucl Acids Res 17:6463-6471.

190. Tautz, D and C. Schlotterer, 1994, Simple sequences. Curr. Opin. Genet. Dev. 4:832-837

191. Tegelstrom, H„ 1992. Detection of mitochondrial DNA fragments. In: A.R. Hoelzel (Ed.) Molecular Genetic Analysis of Populations: A Practical Approach, pp. 89-114, IRL Press, Oxford.

192. Temnykh, S.V„ W. Park, N. Ayres, S. Cartinbour, Y.G. Cho, N. Hauck & S.R. McCouch, 1998. A microsatellite map for rice: recent progress and perspectives. In: International Plant & Animal Genome (VI) Conference: 18th-22nd Jan., 1998, San Diego, CA.

193. Tsumura Y., Ohba K., Strauss S. H. 1996. Diversity and inheritance of inter-simple sequence repeat polymorphism in Douglas-fir (Pseudotsuga menziesu) and sugi {Cryptomeria japonica). Theor Appl Genet 92:40-45.

194. Varshney, R.K., P.C. Sharma, P.K. Gupta, H.S. Balyan, B. Ramesh, J.K. Roy, A. Kumar & A. Sen, 1998. Low level of polymorphism detected by SSR probes in bread wheat. Plant Breeding 117:182-184.

195. Varshney, R.K„ A. Kumar, H.S. Balyan, J.K. Roy, M. Prasad & P.K. Gupta, 2000a. Characterization, development and chromosomal assignment of microsatellite markers in bread wheat. Plant Mol Biol Rep 14: 124 132 .

196. Virk P. S., Zhu J:, Newbury H. J., Bryan G. J., Lackson M. Т., Ford-Lloyd В. V. 2000. Effectiveness of different classes of molecular markers for classifying and revealing variation in rice (Oryza sativa) germplasm. Euphytica 112:275-284,2000.

197. Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., Van Delee, Т., Homes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M., and Zabeau, M. 1995. AFLP: A new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 23: 4407-4414.

198. Vosman, B. & P. Arens, 1997. Molecular characterization of GATA/GACA microsatellite repeats in tomato. Genome 40: 25 -33.

199. Vosman, В., P. Arens, W. Rus-Kortekaas & M.I.M. Smulders, 1992. Identification of highly polymorphic DNA regions in tomato. Theor Appl Genet 85: 239-244.

200. Wang, G., R. Mahalingam & H.T. Karp, 1998. (C-A) and (G-A) anchored simple sequence repeats (ASSRs) generated polymorphism in soybean, Glycine max L. Merr. Theor Appl Genet 96: 1086-1096.

201. Wang, Z., J.L. Weber, G. Zhong & S.D. Tanksley, 1994. Survey of plant short tandem repeats. Theor Appl Genet 88: 1-6.

202. Wang, Y.-H., Thomas, C.E., and Dean, R.A. 1997. A genetic map of melon (Cucumis melo L) based on amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers. Theor. Appl. Genet. 95: 791-798.

203. Warnock, S. J., 1988. A review of taxonomy and phylogeny of the genus Lycopersicon. Hort Science 23: 669 673.

204. Weber J. L. and May P. E. 1989. Abundant class of human DNA polymorphism which can be typed using the polymerase chain reaction. Am J Hum Genet 44:388-396.

205. Weber J. L., Wong С (1993) Mutation of human short tandem repeats. Hum Mol Genet 2:1123-1128

206. Weissenbach, J., G. Gyapay, C. Dib, A. Vignal, J. Morissette, P. Mil-lasseau, G. Vaysseix & M. Lathrop, 1992. A second-generation linkage map of the human genome. Nature 359: 794-801.

207. Weising, K„ H. Nybom, K. Wolff & W. Meyer, 1995. DNA Fingerprinting in Plants and Fungi. CRC Press, Boca Raton, Florida.

208. Wicking, С. & B. Williamson, 1991. From linked marker to gene. Trends Genet 7: 288-293.

209. Wierdl M, Dominska M, Petes TD (1997) Microsatellite instability in yeast: dependence on the length of the microsatellite. Genetics 146:769-779

210. Witsenboer, H„ J. Vogel & R.W. Michelmore, 1997. Identification, genetic localization, and allelic diversity of selectively amplified microsatellite polymorphic loci in lettuce and wild relatives (Lactuca spp.). Genome 40: 923936.

211. Wolff, К., E. Zietkiewicz & H. Hofstra, 1995. Identification of chrysanthemum cultivars and stability of fingerprint patterns. Theor Appl Genet 91: 439-447.

212. Wu, K. S. & S.D. Tanksley, 1993. Abundance, polymorphism and genetic mapping of microsatellites in rice. Mol Gen Genet 241:225-235.

213. Xiao, J., J. Li, S. Grandillo, S.N. Ahn, S.R. McCouch, S.D. Tanksley & L. Yuan, 1996. A wild species that contains genes that may significantly increase the yield of rice. Nature 384: 223-224.

214. Xu J. and Earle E. D. 1996a. Direct FISH of 5S г DNA on tomato pachytene chromosomes places the gene at the heterochromatic knob immediately adjacent to the centromere of chromosome 1. Genome 39: 216-221.

215. Xu J. and Earle E. D. 1996b. High resolution physical mapping of 45S (5.8S, 18S and 25S) rDNA gene loci in the tomato genome using a combination of karyotyping and FISH of pachytene chromosome. Chromosoma 104:545550.

216. Yang, G.P, M.A. Saghai Maroof, C.G. Xu, Q. Zhang & R.M. Biyashev, 1994. Comparative analysis of microsatellite DNA polymorphism in landraces and cultivars of rice. Mol Gen Genet 245: 187-194.

217. Yu, Y.G., M.A. Saghai Maroof, G.R. Buss, P.J. Maughan & S.A. Tolin, 1994. RFLP and microsatellite mapping of a gene for soybean mosaic virus resistance. Phytopathology 84: 60-64.

218. Yu, Y.G., M.A. Saghai-Maroof & G.R. Buss, 1996. Divergence and allelomorphic relationship of soybean virus resistance gene based on tightly linked DNA microsatellite and RFLP markers. Theor Appl Genet 92: 64-69.

219. Yu, Y.G., M.A. Saghai-Maroof & G.R. Buss, 1996. Isolation of a superfamily of candidate disease-resistance genes in soybean based on a conserved nucleotide binding site. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:11751 -11756.122

220. Zeitkiewicz, E., A. Rafalski & D. Labuda, 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat. (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20: 176 183.

221. Zhong X.-B., Hans de Jong J. and Zabel P. 1996. Preparation of tomato meiotic pachytene and mitotic methaphase chromosomes suitable for fluorescence in situ hybridization (FISH). Chromosoma Res 4:24-28.

222. Zhong, X.-B., J., Fransz, P. F., Wennekes-van Eden J, Zabel P., van Kammen, A. and J. H. de Jong, 1999. High resolution mapping on pachytene chromosomes and extended DNA fibres by fluorescence in situ hybridization. Plant Mol Biol Rep 14:232-242.