Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетические и молекулярно-цитогенетические подходы для ускоренного создания селекционного материала растений с заданными свойствами
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические и молекулярно-цитогенетические подходы для ускоренного создания селекционного материала растений с заданными свойствами"
004609688
На правах рукописи
КАРЛОВ ГЕННАДИИ ИЛЬИЧ
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ УСКОРЕННОГО СОЗДАНИЯ СЕЛЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА РАСТЕНИЙ С ЗАДАННЫМИ СВОЙСТВАМИ
специальности: 03.01.06- биотехнология (том числе нанобиотехнологии) 03.02.07 - генетика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
3 0 СЕН 2010
Москва 2010
004609688
Работа выполнена в Российском государственном аграрном университете -МСХА имени К.А.Тимирязева
Научный консультант:
Доктор биологических наук, профессор Л.И.Хрусталева
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук А.В.Поляков Доктор биологических наук А.А.Поморцев Доктор сельскохозяйственных наук Н.И.Тимин
Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН
Защита состоится октября 2010 г. в 14:30 на заседании диссертационного совета Д.220.043.10 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А.Тимирязева по адресу: 127550, г.Москва, ул.Тимирязевская, 49. Факс: +7(495) 9777001, сайт www.timacad.ru
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И.Железнова РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева.
Автореферат разослан и размещен на сайте __
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук
Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Важной и актуальной проблемой в селекции растений является задача создания селекционного материала с заданными свойствами. Создание такого материала до сих пор остается сложной и, в отдельных случаях, трудновыполнимой задачей. С одной стороны, с появлением технологий генной инженерии стало возможным создание таких растений. Однако, несовершенство этих технологий и возможность генетической модификации только единичных признаков не всегда позволяет применять их на практике. С другой стороны классическими методами селекции создано огромное количество ценного селекционного материала. Применение и интеграция новых технологий молекулярно-генетической оценки этого материала в селекционный процесс позволит значительно сократить время создания генотипов с заданными свойствами.
За последние два десятилетия использование молекулярно-генетических методов позволило исследовать физическую и функциональную организацию геномов многих сельскохозяйственных культур (Collard and Mackil, 2007). Одним из основных понятий, объединяющих эти методы, является понятие «молекулярно-генетический маркер». Внедрение ДНК-маркеров позволяет значительно сократить затраты труда, ускорить и удешевить селекционный процесс, а также контролировать перенос хозяйственно-ценных генов от одного организма другому (Francia at al. 2005). В настоящее время разработано большое количество типов молекулярно-генетических маркеров, которые основаны на различных классах последовательностей геномной ДНК. Они позволяют выявлять генетическое разнообразие на молекулярном уровне организации ДНК, что является базисом, на котором основаны все дальнейшие теоретические (филогения, изучение организации генома) и прикладные (картирование, маркирование генов, генотипирование) исследования.
При отборе нужных генотипов в расщепляющихся популяциях, селекционер сталкивается обычно со следующими проблемами:
1) Для отбора генотипа по заданному признаку необходима большая расщепляющаяся популяция;
2) Необходимо дождаться нужного поколения (F5, F6);
3) Становится достаточно сложно проводить отбор в популяции по нужному признаку, если его проявление зависит от условий окружающей среды;
4) Чаще всего приходится ждать до поздних этапов онтогенеза растений, чтобы провести отбор по признаку;
5) Трудно проводить накопление генов, например устойчивости, так как сложно провести отбор генов в присутствии уже существующих (Gupta and Varshney, 2000).
з
О)
Помочь решить данные проблемы может использование близко сцепленных с признаком молекулярных маркеров, полученных различными методами.
До недавнего времени в селекции сельскохозяйственных культур использовались только морфологические маркеры. Они могли проявляться на различных этапах развития растений, идентифицироваться визуально или в результате биохимических исследований. При этом проявление тех или иных признаков в значительно степени зависит от условий внешней среды. Традиционные методы селекции на устойчивость требуют создания инфекционных фонов и трудоемкую оценку каждого образца. Проведение таких работ связано со значительными затратами труда и времени. Селекционный процесс для однолетних культур затягивается до 10, а для двулетних до 20 лет.
Использование ДНК-маркеров позволяет значительно сократить затраты труда, ускорить и удешевить селекционный процесс, а также контролировать перенос хозяйственно-ценных генов от одного организма другому. Наиболее эффективными молекулярными маркерами являются те, которые основаны на характерных особенностях нуклеотидных последовательностей самих генов. Для разработки таких ДНК-маркеров необходимо выявить различия в структуре последовательностей ДНК локусов (генов) у форм растений отличающихся по проявлению признака, например по устойчивости к фитопатогену.
Цель и задачи исследования. Цель исследований - разработка комплексной системы анализа геномов растений, основанной на использовании современных молекулярно-генетических и молекулярно-цитогенетических технологий для эффективной и ускоренной селекции растений
Задачи исследования
1. Разработать систему идентификации родительских геномов и мониторинга чужеродного генетического материала в селекционных программах с использованием межвидовой гибридизации.
2. Изучить особенности организации геномов растений, представителей различных семейств, для разработки эффективных ДНК-маркеров.
3. Разработать методологию использования молекулярных и молекулярно-цитогенетических маркеров на различных этапах селекционного процесса.
4. Разработать новые подходы изучения механизмов формирования 2п-гамет с целью преодоления межвидовой несовместимости при создании ценного селекционного материала.
5. Исследовать возможности использования 18811-РС11-маркеров для оценки исходного селекционного материала и при создании эффективных ДНК-маркеров.
6. Клонировать и охарактеризовать последовательности генов устойчивости растений и их аналогов.
7. Создать ДНК-маркеры на хозяйственно-ценные гены томата, риса, огурца, малины и хмеля.
Научная новизна и практическая значимость. Адаптирована методика геномной in situ гибридизации на межвидовых гибридах лилий и изучен геномный состав этих гибридов, получаемых с использованием 2п-гамет. Вперые установлен механизм формирования 2п-гамет у межвидовых гибридов лилий, основанный на редукции первого деления мейоза (FDR). На основе разработанного метода многоцветной геномной in situ гибридизации на лилиях впервые подтверждена возможность создания трехгеномных гибридов (2п=36).
Разработана оптимизированная методика совместного применения дифференциального окрашивания хромосом, геномной гибридизации in situ и ДНК-маркирования, позволяющая проводить эффективное выявление межгеномных транслокаций у тритикале и пшеницы.
Впервые продемонстрирована возможность использования высокоповторяющейся геномспецифичной последовательности ДНК GenBR-1 для визуализации генома В капустных в разном геномном окружении.
С помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) впервые установлена геномная организация высокоповторяющихся последовательностей ДНК Ту-1 -copia-поцобных ретротранспозонов томата. Показано, что у томата ретротранспозоны локализованы в прицентромерных гетерохроматиновых регионах хромосом. Подтверждена эффективность использования пахитенных хромосом томата для такого анализа. Для растений с крупными геномами (лилии, крокусы, тюльпаны и лук) показано равномерное распределение Ty-1-copia-подобных ретротранспозонов, за исключением С-бэндинг положительных регионов хромосом, где они не выявляются.
Впервые клонирована высокоповторяющаяся субтеломерная последовательность ДНК хмеля. С помощью FISH анализа показана субтеломерная локализация этой последовательности на хромосомах. Выявлено, что эта последовательность может служить цитогенетическим маркером для идентификации хромосом хмеля. Впервые установлено, что последовательности генов рибосомной РНК (45S и 5S) являются эффективными цитогенетическими маркерами для идентификации трех из 10 хромосом хмеля с использованием флуоресцентной гибридизации in situ.
Выявлен высокий полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК (ISSR) на видовом и межвидовом уровнях у видов Solanum, Humulus lupulus, Cucumber и Rubus. Рекомендован набор ISSR праймеров для анализа исходных родительских и гибридных форм при внутри- и межвидовой гибридизации, а также форм растений томата с различным уровнем интрогрессии генетического материала. На основе выявленного полиморфизма ISSR создана интегрированная генетическая карта межмикросателлитных последовательностей ДНК томата и
высокоэффективные ДНК-маркеры для выявления пола у растений хмеля и признака ремонтантное™ малины.
Впервые проведено клонирование двух последовательностей ДНК, специфичных для хромосомы Y мужских растений хмеля. На основе анализа клонированных последовательностей созданы эффективные ДНК маркеры для выявления пола растений хмеля, которые могут использоваться в селекционном процессе.
Впервые клонированы фрагменты последовательностей генов устойчивости подсолнечника остролистного. Установлена их высокая степень гомологии с ранее клонированными генами устойчивости растений.
Идентифицированы молекулярные маркеры WA-типа ЦМС риса. Идентифицированы и картированы молекулярные маркеры, тесно сцепленные с геном восстановления фертильности R/4, расположенные на длинном плече 10-й хромосомы риса.
Продемонстрирована высокая эффективность сравнительного анализа ДНК локусов генов устойчивости у устойчивых и неустойчивых генотипов растений для создания надежных ДНК-маркеров. Созданы кодоминантные CAPS-маркеры генов устойчивости к фузариозу (12) и ветрициллезу (Ve) томата. Созданы ДНК диагностикумы на гены устойчивости томата - к фузариозу и вертициллезу, хмеля - на определение пола растений, риса - на ЦМС и ген восстановления фертильности, и оптимизированы условия применения ДНК маркеров на гены устойчивости томата к нематоде, ВТМ, кладоспориозу. Предложены оптимальные высокопроизводительные методики выделения ДНК для массового скрининга селекционного материала. Разработаны методы и схемы высокопроизводительной оценки на наличие хозяйственно-ценных признаков в исходном селекционном материале с помощью ДНК технологий. Получены перспективные формы томата, сочетающие несколько генов устойчивости к болезням и вредителям в одном генотипе, и создан коммерческий гибрид Fb
Выносимые на защиту положения.
1.Методология использования молекулярно-генетических и молекулярно-цитогенетических методов в селекции основанная на:
• достижениях в геномике и биоинформатике;
• надежности и эффективности молекулярно-генетических и молекулярно-цитогенетических ДНК-маркеров;
• возможности ускорения селекционного процесса в два раза и сокращения расходов при создании гибридов Fi овощных культур;
• предлагаемой схеме интеграции ДНК технологий для сопровождения селекционного процесса.
2. Схема интегрированных исследований для сопровождения селекционного процесса.
3. Эффективные ДНК-маркеры для селекции растений по хозяйственно-ценным признакам.
4. Механизм формирования 2п-гамет межвидовых гибридов лилий, основанный на редукции первого деления мейоза (FDR).
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на XIX International Symposium on Improvement of Ornamental Plants (Angers, France, 1999), Fifth International Solanaceae Conference (Nijmegen, 2000), Международной научно-практической конференции «Селекция и семеноводство овощных культур в XXI в.» (Москва, 2000), научной конференции «Памяти Грегора Менделя» (Москва, 2001), научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А.Р.Жебрака и 70-летию образования кафедр генетики в Московской с.-х. академии им. К.А.Тимирязева (Москва, 2002), International Hop Growers' Convention (Dobrna-Zalec, Slovenia 2003), 2-й научной конференции МОГИС им.Н.И.Вавилова «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003), 4th International Iran and Russian Conference in Agriculture and Natural Resources (Shakhrekord, Iran, 2004), XV Federation of European Societies of Plant Biology (FESPB) Congress (Lyon, France, 2006), Второй Вавиловской международной конференции «Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке: состояние, проблемы, перспективы» (Санкт-Петербург, 2007), International Conference "Molecular Mapping and Marker Assisted Selection in Plants" (Vienna, Austria, 2008), международной конференции «Научное наследие Н.И.Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства» (Москва, 2007), конференциях преподавателей и сотрудников РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева 1997-2008 гг.
Связь работы с крупными научными программами. Исследования проводились в рамках проектов РФФИ (00-04-49561-а, 01-04-06522-мас, 06-04-49753-а), государственных контрактов с Министерством образования Российской Федерации в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002—2006 годы", государственных контрактов с Федеральным агентством по науке и инновациям в рамках ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы" и ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы, а также государственных контрактов с Министерством сельского хозяйства Российской Федерации.
Публикации. По материалам докторской диссертации опубликовано 65 работ, из них 25 научных работ в рецензируемых журналах из «Перечня...» ВАК РФ, 1 патент на изобретение и 1 авторское свидетельство.
Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты получены автором лично и совместно с коллегами из центра молекулярной биотехнологии, кафедры генетики, международного института исследований растений PRI (Wageningen, Нидерланды), Университета Хохенхайма (Германия), а также с аспирантами и студентами, работавшими под руководством диссертанта. Соискателю принадлежат разработка программы исследования, схемы основных экспериментов и теоретическое обобщение полученных результатов. Доля личного участия
в публикациях, выполненных в соавторстве, пропорциональна числу соавторов. Автор выражает большую благодарность научному консультанту,
д.б.н., профессору Л.И.Хрусталевой, а также сотрудниками центра молекулярной биотехнологии, кафедры генетики, аспирантам и студентам, которые принимали участие в экспериментальных работах и обсуждении результатов. Автор выражает признательность Григорию Федоровичу Монахосу, директору селекционной станции им. Н.Н. Тимофеева, и Александру Александровичу Соловьеву, заведующему кафедрой генетики РГАУ-МСХА, за предоставленный селекционный растительный материал для проведения исследований и ценные советы. Особую признательность автор выражает академику РАСХН В.С.Шевелухе за помощь, поддержку и ценные советы при обсуждении полученных результатов исследований.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на стр.
машинописного текста, включает_таблицы, _рисунка, состоит из
введения, обзора литературы, материалов и методов исследования,
результатов и обсуждения, выводов, списка литературы включающего_
отечественных и зарубежных источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования выполнены в 1996-2009 годах в Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А.Тимирязева.
В работе использовали 6 форм межвидовых гибридов лилий (PRI, Wageningen), семена первичных тритикале АД-1, АД-3, АД-4, межамфиплоидного гибрида (МАГ) и перспективных линий тритикале 49107 и 497-07 (ГНУ НИИСХ Юго-Востока), селекционные формы тритикале, сорта и линии яровой и озимой пшеницы, коллекцию видов томата и их межвидовые гибриды и моносомно-дополненные формы (кафедра генетики РГАУ-МСХА), расщепляющиеся по хозяйственно-ценным признакам селекционные популяции томата (Селекционная станция имени Н.Н.Тимофеева, агрофирмы «Ильинична», «Гавриш», «Манул»), набор видов Brassicaceae с геномом В (коллекция ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии), коллекцию из более 60 форм и сортов хмеля (ВНИПТИХ, Цивильск, Центр молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА, Университет г.Штутгарта, Германия), ЦМС линии капусты пекинской Brassica pekinensis (Селекционная станция имени Н.Н.Тимофеева), селекционные линии риса с WA-типом ЦМС и генами восстановления фертильности (Иран) (4 ЦМС линии: Neda-A, IR67017-180-2-1-2-A, Usen-A, IR68897-A, 4 их соответствующих фертильных аналогов (линий закрепителей) Neda-B, IR67017-180-2-1 -2-В, Usen-B, IR68897-B; 7 фертильных линий восстановителей: IR24, IR28, Amol2, IR36
IR62030, IR60966, Amoll; 7 Популяций F2), аллоцитоплазматические линии пшеницы (РУДН), 64 образца ДНК, выделенные из растений F2 расщепляющейся популяции межвидового гибрида S. lycopersicum X S. pennellii (образцы ДНК подготовлены и предоставлены док. A. W. van Heusden, PRI, Wageningen, The Netherlands).
Цитологические препараты готовили по стандартным методикам приготовления постоянных препаратов методами раздавливания и
распластывания митотических и мейотических хромосом (Пухальский и др., 2004; Zhong Х.-В. et al., 1996).
Геномную in situ гибридизацию осуществляли по стандартной методике (Schwarzachen, 1992), с некоторыми модификациями. Хромосомы контрокрашивали пропидий-йодидом или DAPI 1 мг/мл. Анализ результатов проводили на флуоресцентных микроскопах "Axiophot" и "Axiolmager" ("Zeiss", Германия) с соответствующими системами фильтров. Для анализа изображений производили фотосъемку на пленку Fuji 400 или использовали цифровую фотокамеру с соответствующим программным обеспечением. После проявки пленку сканировали в компьютер и обрабатывали изображение, используя программу Photoshop CS.
Выделение ДНК осуществляли из молодых листьев или семядолей вегетирующих растений, а также этиолированных проростков пшеницы, ржи и тритикале по стандартным методикам с некоторыми модификациями (Bernatzky and Tanksley, 1986; Van der Beek et al., 1991; Fulton et al., 1995).
Праймеры для амплификации и флуоресцентные ДНК-зонды синтезированы в ЗАО «Синтол», Москва. Амплификацию проводили на амплификаторах «Терцик» («ДНК-технология», Москва) и «DNA Engine Tetrad 2» (Bio-Rad, USA). Детекцию флуоресценции осуществляли на приборе «Джин» с программным обеспечением фирмы изготовителя («ДНК-технология», Москва). Условия проведения амплификации были индивидуальны для каждого из праймеров. В некоторых случаях производили оптимизацию условий амплификации.
Продукты ПЦР разделяли в 1,5-2% агарозном геле с буфером TBE при напряженности поля 6 V/cm. В качестве маркера молекулярного размера использовали «100 bp leader» (Fermentas).
Клонирование ПЦР-продуктов проводили с помощью набора pGEM®-T Easy Vector Systems (Promega, USA) в соответствии с инструкцией, предложенной производителем.
Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программных пакетов GeneDoc (Multiple sequence alignment editor and shading utility. Ver. 2.6.002. Copyright® by K. Nicholas), Clone manager 6 version 6.00 (Sei Ed Central). Поиск гомологичных последовательностей и их анализ проводили в открытых базах генетических данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), Sol Genomic Network
(http://www.sgn.cornell.edu/about/tomato_project), EMBL-EBI
(http://www.ebi.ac.uk).
Филогенетическая модель родства исследованных видов была построена путем обработки данных ISSR-PCR-анализ с помощью кластерного анализа по методу невзвешенного попарного арифметического среднего UPGMA (Nei et al., 1983). В качестве филогенетической дистанции между двумя видами брали отношение полученных при сравнении количества полиморфных ISSR-фрагментов к общему количеству ISSR-фрагментов.
Обработку данных по расщеплению и расчет генетических расстояний проводили с помощью программного пакета MapMaker/EXP 3.0 (Lincoln et al. 1992). Для анализа сцепления по отдельным маркерам, частота рекомбинации между маркером и локусом была рассчитана с использованием метода максимального правдоподобия (Allard, 1956).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ РОДИТЕЛЬСКИХ ГЕНОМОВ И МОНИТОРИНГА ЧУЖЕРОДНОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА В СЕЛЕКЦИОННЫХ ПРОГРАММАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОТДАЛЕННОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ.
Успешная межвидовая гибридизация является базой для интрогрессии хозяйственно-ценных признаков в культурные растения. В зависимости от объекта, целей и задач, стоящих в процессе интрогрессии генетического материала, требуется разработка различных систем мониторинга чужеродного генетического материала. Они могут быть основаны на молекулярно-цитогенетических и молекулярно-генетических методах, как в отдельности, так и их комлексе. 1.1. МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ. 1.1.1.Геномная гибридизация in situ на межвидовых гибридах лилий. В процессе межвидовой гибридизации в международном центре исследований растений PRI, Нидерланды, создан ряд форм и гибридов лилий разного уровня плоидности и геномного состава. Ранее было показано, что фертильные растения межвидовых гибридов лилий образуют 2п-гаметы (Van Tuyl, J.M. et al., 1989, Tuyl, J.M. et al., 1997). Однако механизм возникновения таких гамет и возможность их использования в селекционных программах по созданию новых форм лилий оставались неизвестными. В нашей работе была впервые использована геномная гибридизация in situ для идентификации родительских геномов в межвидовых гибридах лилий, а также выяснения механизмов возникновения 2п гамет. Гибрид F1: L.longtflorum 'Gelria' х азиатский гибрид 'Whilito' (LA). В результате геномной in situ гибридизации оказалось возможным четко различить оба родительских генома, L. longijlorum и азиатского гибрида, в LA-гибриде (рис. 1а). Двенадцать хромосом с зеленой флуоресценцией принадлежат L. longijlorum. Проба равномерно гибридизовалась по всей длине этих хромосом. Остальные двенадцать хромосом с синей флуоресценцией принадлежат азиатскому гибриду 'Whilito' и визуализованы методом контрокрашивания красителем DAPI. Нами наблюдался очень низкий уровень перекрестной гибридизации меченой ДНК L. longijlorum на хромосомы, имеющие происхождение от азиатского гибрида 'Whilito'. Сайты гибридизации генов рибосомной ДНК были детектированы на трех хромосомах, имеющих происхождение от L. longijlorum и на трех - от азиатского гибрида.
Гибриды F¡: Азиатский гибрид х (L.longiflorum х азиатский гибрид) (ALA). На рисунке lb показан результат геномной in situ гибридизации на растении ALA-2. В качестве пробы были использованы ДНК L.longiflorum (зеленая флуоресценция) и ДНК плазмиды рТА 71 (красная флуоресценция), контрокрашивали DAPI (синяя флуоресценция). Это растение является триплоидом(2п=36) вследствие образования нередуцированных 2п-гамет LA-гибридом, который использовался в качестве отцовской формы для получения ALA растений. В растении ALA-1 обнаружено пять рекомбинантных хромосом, восемь нерекомбинантных хромосом от L. longiflorum и двадцать три хромосомы азиатского гибрида. Одна из рекомбинантных хромосом содержала четыре сегмента, полученных от геномов L. longiflorum и Азиатского гибрида, что указывает на три сайта рекомбинации (рис lb). Три хромосомы имели два сайта кроссинговера и одна хромосома имела один сайт, который был близко расположен к рДНК региону хромосомы азиатского гибрида. В общей сложности в ALA-1 было обнаружено десять точек рекомбинации и было обнаружено два и семь рДНК-сайтов, принадлежащих L. longiflorum и азиатскому гибриду соответственно.
%япя* , -и —
Рис I . Геномная гибридизация т situ на межвидовых гибридах лилий, a. (L.longiflorum х азиатский гибрид (синие хромосомы) (LA) b. Fi (азиатский гибрид х [L.longiflorum х азиатский гибрид (ALA)) с. Fi восточный гибрид (красные хромосомы) х (L. longiflorum х азиатский гибрид). Стрелками указаны сайты рекомбинации. L.longiflorum - зеленые хромосомы, азиатский гибрид - синие хромосомы, восточный гибрид - красные хромосомы).
В растении ALA-2 (2п=36) выявлено три рекомбинантных хромосомы, 10 принадлежащих L.longiflorum и 23 азиатскому гибриду. Две
рекомбинантные хромосомы имели по два сайта кроссииговера и одна - один сайт. Три и шесть сайтов рДНК, принадлежащих L. longiflorum и азиатскому гибриду соответственно, было обнаружено в этом растении. Растение ALA-3 (2п=36) имело 12 хромосом от L. longiflorum и 24 хромосомы азиатского гибрида. В растении ALA-4 было обнаружено 48 хромосом, из них 12 имеют свое происхождение от L. longiflorum.
Гибрид F¡: Восточный гибрид х (L. longiflorum х азиатский гибрид) (OLA). Для визуализации и анализа геномной организации трехвидового гибрида мы успешно использовали метод многоцветной геномной in situ гибридизации. В растении OLA (2п=36) все три родительских генома были четко различимы (рис 1с). Анализ кариотипа показал, что данный гибрид содержит по 12 гомеологичных нерекомбинантных хромосом каждого родителя L.longiflorum, восточный гибрид и азиатский гибрид.
Итак, адаптированный нами применительно к лилиям метод геномной in situ гибридизации позволил четко различить геномы L.longiflorum, восточных и азиатских лилий в гибридах, полученных при их скрещиваниях. Исходя из этого, мы можем заключить, что L.longiflorum, восточная и азиатская лилии содержат в своих геномах различающиеся семейства высоко- и среднеповторяющейся ДНК. Изменчивость этих типов ДНК считается источником дифференциации видов (Dean and Schmidt, 1995). Такая дифференциация и позволяет визуализовать геномы в межвидовых гибридах с использованием геномной in situ гибридизации (Schwarzacher et al. 1992).
Мониторинг чужеродного хроматина при интрогрессии генетического материала от одного вида к другому является очень важным. На данный момент геномная in situ гибридизация - наиболее эффективный метод для такого мониторинга и позволяет четко установить геномный состав межвидовых гибридов. Нами этот метод успешно применен на межвидовых гибридах лилий. При этом нам удалось визуализовать сайты рекомбинации и таким образом показать возможность интрогрессии генетического материала. Основным преимуществом метода геномной гибридизации in situ является и то, что интрогрессию в гибридах лилий из-за слабой изученности их геномов, невозможно установить с использованием других молекулярных методов (RFLP, RAPD, AFLP и др.).
Успех интрогрессии полностью зависит от гомеологической рекомбинации между родительскими геномами в мейозе Fj гибридов и от их фертильности (van Tuyl and DeJeu, 1997). Растения F¡ L. longiflorum x азиатский гибрид обычно полностью стерильны. Для преодоления этой проблемы на лилиях в настоящее время используются два подхода: ми-тотическое удвоение хромосом и применение растений, формирующих нередуцированные 2п-гаметы (van Tuyl et al, 1989). Последний подход наиболее предпочтителен для селекционных программ, в которых упор делается на использование интрогрессии генетического материала от одного вида к другому. Формирование нередуцированных гамет связано обычно с двумя типами нарушения мейоза: 1. отсутствием первого мейотического
деления (first division restitution - FDR); 2. отсутствием второго мейотического деления (second division restitution - SDR) (Mok and Peloquin, 1975; McCoy, 1982; Hermsen, 1984). Для использования гибридных растений, формирующих 2п-гаметы в селекционных программах, необходимо знать путь формирования таких гамет (FDR или SDR). В нередуцированных гаметах, образующихся в результате FDR, в каждую гамету попадают несестринские хроматиды каждой гомологичной хромосомы, в то время как в результате SDR сестринские хроматиды попадают в одну гамету (Ramana, 1979). В случае межвидовых гибридов по одной хроматиде от каждого родителя попадает в гаметы, сформированные в результате FDR. Отсутствие гомологичных хромосом L.longiflorum в ALA и OLA гибридах указывает на механизм FDR формирования 2п-гамет в LA-гибридах, которые были использованы в качестве отцовской формы
При анализе геномов гибридных растений ALA-I и ALA-2 нами продемонстрировано наличие рекомбинации между геномами L.longiflorum и азиатских гибридов. Эти данные указывают на формирование хиазм в процессе формирования 2п-гамет. Отсутствие рекомбинантных хромосом в растениях ALA-3, ALA-4 и OLA, вероятно, связано с полным подавлением или низким уровнем спаривания между гомеологичными хромосомами.
Использование наряду с геномной пробой рибосомальной ДНК рТа 71 позволило получить дополнительную информацию и идентифицировать хромосомы, несущие ядрышкообразующие регионы. Проанализировав распределение рДНК в ALA-1 растении, мы также получили дополнительное подтверждение образования 2п-гамет через FDR механизм.
Таким образом, использование геномной гибридизации in situ позволило получить нам ценную информацию о частоте рекомбинации между геномами L. longiflorum и азиатского гибрида в образующих 2п гаметы Fp гибридах. Результаты нашей работы указывают на то, что такие Fj-гибриды могут быть использованы для интрогрессии генетического материала от одного вида к другому.
1.1.2. Геномная гибридизация in situ на моносомно дополненных линиях томата. Геномная гибридизация in situ продемонстрировала свою эффективность и в случае анализа дополненных линий томата по второй хромосоме S. lycopersicoides. При этом мониторинг чужеродного хроматина в геноме томата возможно было проводить, как на митотических, так и мейотических хромосомах.
1.2. СОВМЕСТНОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ.
1.2.1. Тритикале. Тритикале - это относительно новая и перспективная культура, получившая признание производителей сельскохозяйственной продукции в последние десятилетия. В производстве представлены в основном гексаплоидные тритикале. Причем, как демонстрируют исследования, перспективные линии и сорта тритикале часто
несут замещения или транслокации (Zillinsky, 1980; Gustafson, Lukaszewsky, 1984; Соловьев, 2007). Замещения и транслокации хромосом позволяют решать проблемы, характерные для яровой тритикале, как это показано в отношении признаков хлебопекарных качеств зерна, устойчивости к прорастанию на корню, толерантности к ионам алюминия и другие (Rybka, 2003; Oracka and tapinski, 2006; Wos et al., 2006). Таким образом, идентификация и подробная молекулярно-генетическая характеристика таких линий является важной проблемой. Эта информация будет основой для создания новых перспективных линий тритикале с заданными свойствами.
Идентификация хромосом и их участков может быть выполнена с использованием различных методов - дифференциального окрашивания, молекулярного маркирования, геномной гибридизации in situ. Применение комплексного подхода с использованием разных методов позволяет осуществлять надежную идентификацию хромосомных наборов тритикале.
С целью разработки такого подхода в нашей работе использовалась модельная линия тритикале 131/7, несущая пшенично-ржаную транслокацию. Для идентификации хромосом, вовлеченных в эту транслокацию, применяли в комплексе молекулярно-генетические и молекулярно-цитогенетические методы. На первом этапе была физически картирована точка транслокации с использованием адаптированного нами метода геномной гибридизации in situ после дифференциального окрашивания на одной и той же метафазной пластинке (Рис.2).
Рис.2. Совмещение дифференциального окрашивания и гибридизации ш situ на одной и той же метафазной пластинке хромосом линии тритикале 131/7 (генетический материал ржи имеет желтый цвет, пшеницы - красный).
После анализа рисунка дифференциального окрашивания хромосом нами определено, что в геноме линии 131/7 присутствует замещение 2В хромосомы на 2В-хромосому и транслокация длинного плеча хромосомы 2В в хромосому 2R.
Однако, применение только цитологических маркеров для характеристики хромосом не может полностью исключить ошибок при идентификации генетического материала (Devos et al., 2000, Pestsova et al.,
2000; Salina et al., 2003). Для подтверждения данных молекулярно-цитогенетического анализа нами был использован метод молекулярного маркирования. Для этого экспериментальным путем были подобраны микросателлитные маркеры, специфичные для конкретных хромосом. Отсутствие амплификации таких маркеров на других геномах дало возможность нам использовать их как STS-маркеры. Это позволило удешевить проведение такого анализа, так как не требуется проведение дорогостоящего денатурирующего гель-электрофореза. К преимуществам такого подхода можно отнести и отсутствие необходимости выявления полиморфизма исходных форм, участвовавших в создании тритикале. Нами были подобраны следующие микросателлитные маркеры на длинное и короткое плечи 2В хромосомы: Xwmc317, Xwmc361, Xwmc332,Xgwml20, Xwmc441, Xbarcl67, Xbarcl064, Xbarcll39, Xwmc592, Xwmc477, Xbarcl3, Xgwm429 (рис. 3), а также маркеры, специфичные на короткое и длинное плечо всех хромосом генома D (Табл.1).
Таблица 1.
Результаты амплификации микросателлитных маркеров, специфичных для D-генома у линии тритикале 131/7.
Локали- SSR- Наличие Локал SSR- Наличие
зация маркер ампли- изация маркер ампли-
фикации фикации
1DL Xbarc271 - 4DS Xwmc285 -
IDS Xb arc 149 - 5DL XbarcllO -
2DL Xgwm349 + 5DS Xwmc233 -
2DS Xwmclll + 6DL ХЬагсЮЗО -
3DL Xbarc270 - 6DS Xbarcl96 -
3DS ХЬагсб' - 7DL Xbarc53 -
4DL Xbarcll83 - 7DS Xwmc506 -
Примечание: здесь и далее + маркер присутствует, - - маркер отсутствует.
Маркеры Xwmc317, Xwmc361, Xwmc332, Xgwml20, Xwmc441, Xbarcl67, Xbarcl064, Xbarcll47, локализованные в длинном плече хромосомы 2В, присутствовали в геноме линии 131/7. Маркеры Xwmc592, Xwmc477, Xbarcl3, Xgwm429 отсутствовали в геноме линии 131/7 (рис. 3). Таким образом, точка рекомбинации находится между маркерами Xwmc592, локус 63,9 сМ, и Xwmc441, локус 76,8 сМ, по карте сцепления (Wheat, Consensus SSR, 2004 NA-SSR-2004-2B, http://wheat.pw.usda.gov). По физической карте (Wheat, Physical, SSR, http://wheat.pw.usda.gov) точка рекомбинации располагается в районе C-2BL2-0.36.
Для подтверждения замещения хромосомы 2R на хромосому 2D использовали молекулярный STS-маркер на локус запасного белка Sec-2, картированный в коротком плече хромосомы 2R.
%
V
NlwfU
Чавд»120
ЧлшкЗ!"
xs«mi» XfcireW!
Xi-.iivH/Oi
Рис 3. Локализация точки транслокации между хромосомой пшеницы и ржи на физической и генетической картах.
1.2.2. Выявление интрогрессии хроматина ржи в геном пшеницы.
Для выявления хроматина генома ржи мы использовали рожь-специфичный ДНК-маркер (RYE) (Ribeiro-Carvalhot et. al., 1997, Katto et al., 2004). С помощью этого маркера можно идентифицировать даже небольшие интрогрессии хроматина ржи (Ribeiro-Carvalhot et. al., 1997).
11 22334455
Рис 4. Электрофорез продуктов ПЦР с праймерами, специфичными на генетический материал ржи (1. Аллоцитоплазматическая линия пшеницы (3.2/94), 2. Аллоцитоплазматическая линия пшеницы (8/96), 3. Тритикале 131/7, 4. Рожь 'Вятка' К-9367, 5. Пшеница мягкая 'Энита').
Как видно из рисунка 4 наличие амплификации наблюдается только у линий с наличием хроматина ржи. При этом наличие цитоплазмы ржи не оказывает никакого влияния на амплификацию. При анализе селекционных линий тритикале с использованием этого маркера была выявлена линия, предполагаемый октаплоидный амфидиплоид АД-4, с наличием амплификации по этому маркеру, однако, фенотипически являющаяся мягкой пшеницей. Молекулярно-цитогенетический анализ показал, что
предполагаемый октаплоидный амфидиплоид АД-4 имел в своем генотипе 42 пшеничные хромосомы, при этом одна пара хромосом после геномной гибридизации in situ показала гибридизацию с меткой на рожь в субтеломерном участке (рис. 5).
Эти данные позволяют отнести АД-4 к мягким пшеницам (2п=42), при этом пара хромосом её в субтеломерном регионе несёт интрогрессию генетического материала ржи. Это и обуславливает амплификацию рожь-специфичного маркера (RYE). Таким образом, на примере линии АД-4 можно видеть, что наличие амплификации рожь-специфичного маркера и маркеров на D-геном совсем не обязательно могут следовать о том, что данная форма является октаплоидной тритикале. То есть использование только молекулярных маркеров без цитогенетических оценок может привести к получению ложных результатов.
Таким образом, рожь-специфичный маркер (RYE) можно использовать для выявления истинных аллоцитоплазматических линий пшеницы с цитоплазмой ржи, не несущих в своем геноме интрогрессий хроматина ржи, а также для быстрого скрининга линий и гибридов пшеницы на наличие хроматина ржи.
Рис. 5. Геномная in situ гибридизация линии пшеницы АД-4 (Генетический материал ржи имеет желтый цвет, пшеницы - красный).
Разработанная нами методика скрининга, основанная на совместном использовании дифференциального окрашивания хромосом, геномной гибридизации in situ и анализа с использованием молекулярных ДНК маркеров, позволяет проводить эффективное выявление замещений и межгеномных транслокаций у тритикале и пшеницы.
1 ^КОНВЕРТИРОВАНИЕ ДНК-МАРКЕРОВ В
МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ НА ПРИМЕРЕ КАПУСТНЫХ, ХМЕЛЯ И ТОМАТА.
1.3.1. Молекулярно-цитогенетическое маркирование генома В капустных с использованием геном-специфичного ДНК маркера. На растениях с относительно небольшим содержанием ДНК на геном,
применение геномной гибридизации in situ во многих случаях затруднено. Это, прежде всего, связано с относительно низким количеством видоспецифичных повторяющихся последовательностей ДНК в сравнении с крупными геномами. Применение геном-специфичных повторяющихся последовательностей ДНК для FISH-анализа может помочь в преодолении это проблемы.
Ранее Панкиным с соавторами (2006) была клонирована высокоповторяющаяся последовательность GenBRl, специфичная для генома В капустных. С использованием флуоресцентной гибридизации ш situ эта последовательность нами была локализована на хромосомных препаратах видов с различным геномным составом. В результате было выявлено, что эта последовательность локализуется в прицентромерных регионах всех хромосом генома В (рис.6). Таким образом эта последовательность может служить не только молекулярным, но и цитогенетическим маркером генома
............................. а А 1 ж Ш * • щ *« т ¿it
fr # * ^fr -—~ . Ф
■ « « * Ф ♦ * * • \ * v 'V" ф *
Ф.
Рис.6. Флуоресцентная гибридизация in situ маркера GenBR-1 на метафазных пластинках трех видов Brassica a. B.carinata CGN04035, b. B.nigra CGN06639, с. B.napus ТАА02.
1.3.2. Хромосом-специфичные маркеры на примере половых хромосом хмеля. Хмель обыкновенный (Н. 1ири1т) имеет 20 хромосом и характеризуется ХХУХУ-системой половых хромосом. Отличия в структурной организации между половыми хромосомами и аутосомами могут быть установлены при их цитогенетическом изучении. Механизм их эволюционного формирования и структурно-молекулярные различия к настоящему времени остаются мало изученными. В нашем исследовании было проведено кариотипирование мужских и женских растений хмеля с использованием методов молекулярной цитогенетики. На первом этапе были использованы цитогенетические маркеры на основе последовательностей рибосомальных генов и дифференциального ОАР1-окрашивания (Рис.7). В результате использования последовательностей рибосомальных генов были четко идентифицированы три из десяти хромосом. Между мужскими и
женскими генотипами различий по этим хромосомам не наблюдалось. При наложении результатов с результатами БАП-окрашивания удалось идентифицировать половые хромосомы. При этом X хромосома, в отличие от других хромосом, имела ОАР1 положительный бэнд в прицентромерной области (Рис.7). Однако, воспроизводимость такого метода окрашивания не высока.
Рис.7. Идиограмма кариотипа мужских и женских растений хмеля обыкновенного. (Верхняя часть - DAPI окрашивание, нижняя - FISH маркеры).
Для создания надежного цитогенетического маркера половых хромосом хмеля нами было проведено клонирование и изучение высокоповторяющейся субтеломерной последовательности ДНК хмеля обыкновенного. В результате рестрикционного анализа геномной ДНК хмеля была выделена, клонирована и локализована на хромосомах повторяющаяся последовательность ДНК размером 380 п.о. Эта последовательность является надежным цитогенетическим маркером половых хромосом хмеля (Рис.8).
4
? S 9
> -10
Рис.8. Кариограмма хмеля обыкновенного (1-9 - аутосомы, 10 - половые хромосомы (X -слева и У-справа))
1.3.3. Повторяющиеся последовательности как молекулярно-цитогенетические маркеры для изучения их хромосомной организации.
Повторяющиеся последовательности ДНК занимают до 90 и более процентов генома растений. Они группируются в кластеры тандемно организованных последовательностей ДНК или диспергированы по всему геному. Значительная часть диспергированных повторов представляет собой мобильные генетические элементы. Информация о локализации ретротранспозонов на хромосомах позволит судить о том, какая часть генома может быть замаркирована с помощью молекулярных маркеров, полученных на основе последовательностей ДНК ретротранспозонов.
Нами проведена амплификация пула фрагментов гена обратной транскриптазы TyJ-copia-подобных ретротранспозонов томата, тюльпана, лука и ирисов.
С использованием метода флуоресцентной in situ гибридизации у растений с крупными геномами (тюльпан, лук, ирисы) нами выявлено относительно равномерное распределение сигнала по всей длинне хромосом, за исключением сайтов ядрышкообразующих регионов и тандемноорганизованных последовательностей ДНК. В отличие от вышеуказанных растений при флуоресцентной гибридизации in situ ретротрансозонов на пахитенные хромосомы томата выявлена их локализация в прицентромерном гетерохроматине (Рис. 9). Методом Саузерн-гибридизации показана локализация Ту 1-copia-no добных ретротранспозонов в высокометшшрованных областях генома томата.
Рис. 9. Результат флуоресцентной in situ гибридизации на хромосомы S. lycopersicum меченным продуктом реакции ПЦР с вырожденными праймерами на участок обратной транскриптазы ретротранеткяона Ту I-copia (красный) и 45S рДНК (зеленый). А - сигнал на метафазвых хромосомах; Б - пахитенные хромосомы томата; В - сигнал на митотической и пахитенной 6 хромосоме томата; Г - сигнал на пахитенных хромосомах томата
1.4. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМОВ РАСТЕНИЙ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА У ОТДАЛЕННЫХ ГИБРИДОВ.
1.4.1. Использование ISSR-PCR. Молекулярно-генетические методы анализа, основанные на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР), за последние 20 лет стали одними из самых популярных и используются в
настоящее время для изучения многих видов организмов. Они отличаются высокой эффективностью, производительностью, хорошей воспроизводимостью и относительной экономичностью. Позволяют выявлять молекулярные маркеры на хозяйственно-ценные признаки. Все вышеперечисленные достоинства в полной мере относятся к методу ISSR-PCR, основанному на амплификации межмикросателлитных последовательностей геномной ДНК с помощью праймеров, созданных на основе того или иного микросателлита (Zietkiewicz et al., 1994). К достоинствам этого метода можно отнести и его универсальность, возможность использования на различных организмах, в том числе и на видах с мало изученными геномами.
В качестве модельного объекта в этом исследовании был использован томат. Для изучения полиморфизма межмикросателлитных последовательностей ДНК видов рода Solanum было использовано 14 ISSR-праймеров. Каждый из 14 праймеров был использован для проведения ISSR-PCR геномной ДНК каждого из пяти видов: S. cheesmanii, S. habrochaites, S. humboldtii, S. lycopersicum, S. pennellii в трёх повторностях, с трехкратным повторением. С помощью 9 из 14 ISSR-праймеров были получены четкие электрофоретические профили для каждого из пяти видов томата. Пример, полученных профилей с использованием праймеров К13 и К15, представлен на рис.10. При сравнении ISSR-профилей видов томата был выявлен высокий полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК
исследованных видов томата. Наибольшее количество ISSR-фрагментов было
получено при
использовании праймеров К16 и К17, основанных на
динуклеотидном повторе [CA], а наименьшее - при использовании праймера К15 -[GTJ8YC.
Рис. 10. ISSR-профили пяти видов томата - а-б, справа налево: S, cheesmanii, S. hirsutum, S. humboldtii, S.lycopersicum, S. pennellii, полученные с использованием двух праймеров: а-К13, б- К15.
Проведение ISSR-PCR с праймером К10 на растении Fj межвидового гибрида S.lycopersicum X S. hirsutum, позволило получить электрофоретический профиль ISSR-фрагментов геномной ДНК данного гибрида, в котором присутствовали все ISSR-фрагменты, характерные для обеих родительских форм (рис.11). Однако не все ISSR-праймеры обладали способностью
идентифицировать данный гибрид. ^И-фрагменты, типичные для 5. ЫгяШит, не всегда выявлялись в профилях проанализированного гибрида. Также наблюдалось появление фрагментов не свойственных ни для одной из родительских форм.
Рис.11. Идентификация межвидового гибрида S.lycopersicum (Мо504) X S. hirsutum с помощью ISSR-праймера К10. Справа налево: Маркер размеров, S. hirsutum, Fi L. esculentum (Mo504) X S. hirsutum, S. esculentum (Mo504).
Таким образом, с помощью ISSR-PCR была выявлена высокая степень полиморфизма межмикросателлитных последовательностей у пяти видов рода Solanum, выбранных в качестве объектов исследования в данной работе. Это позволило провести четкое генотипическое маркирование проанализированных видов томата. Так же была проведена идентификация растения, полученного при проведении межвидовой гибридизации S.lycopersicum X S. hirsutum.
Использование ISSR-PCR для мониторинга интрогрессии чужеродного хроматина на примере линий томата S.lycopersicum WSL6 и IL 6-3 с интрогрессиями в хромосоме 6. Для проверки возможности использования метода ISSR-PCR для выявления интрогресси и создания генетических карт были использованы две линии S.lycopersicum WSL6 и IL 6-3 с интрогрессиями в хромосоме 6. Используя карту интрогрессий в хромосоме 6 линий WSL6 и IL 6-3 (Weide et al., 1993), мы смогли провести физическую локализацию 13 ISSR-маркеров на хромосоме 6 S.lycopersicum в соответствии с регионами интрогрессий (рис. 12).
\г
WS
хж
1. Ь. регтеИи;
2. Ш6-3; 3. WSL 6; 4. £. е&сШепшт (Мо504);
Рис. 12 Физическое картирование КБН-маркеров на линиях X. езсикпшт WSL6 и 1Ь 6-3 с интрогрессиями
Пять из 13 маркеров расположены в самом протяжённом регионе хромосомы, который соответствует участку интрогрессии линии \VSL6, включая короткое плечо, большую часть длинного плеча и исключая только область перекрытия интрогрессии \VSL6 с участком интрогрессии 1Ь6-3 (Рис.13). В этой области также локализованы морфологические маркеры у\ и т-2. Четыре маркера расположены в регионе длинного плеча хромосомы 6, который соответствует интрогрессии 11,6-3, не включая область его перекрытия с интрогрессией \VSL6. В данном участке также расположен ген gib-1. Ещё 4 КБЛ-маркера локализованы в самой узкой области, которая расположена вокруг морфологического маркера с и соответствует участку перекрытия интрогрессий линий \VSL6 и 1Ь6-3.
К12-1, кп-г, ки-1.
■даБЬ 6 ш б-з
Рис. 13. Физическая карта 6-й хромосомы Б^усорегвмит с локализованными на ней 13 КЗЯ-маркерами.
Таким образом, использование карты интрогрессий в хромосоме 6 линий 1Ь6-3 и \VSL6 позволило физически локализовать 13
последовательностей на хромосоме 6 томата. 8 из 13 последовательностей потенциально расположены вне прицентромерной области.
Использование 155Я-маркеров для создания интегрированной генетической карты групп сцепления межмикросателлитных последовательностей ДНК томата. Для создания интегрированной карты групп сцепления межмикросателлитных последовательностей ДНК томата с помощью ИБЯ-РСЯ нами была проанализирована популяция из 64 растений Р2 межвидового гибрида 5.1усоретсит X Б. реппеИН, ранее использовавшихся при создании генетической карты, основанной на АБЬР маркерах. При этом были использованы праймеры ранее продемонстрировавшие полиморфизм между двумя видами томата. Данные по расщеплению КБК-маркеров были получены для 14 праймеров. Всего при анализе исследуемой популяции было выявлено 82 КБЛ-маркера. Для создания интегрированной генетической карты пригодными из них оказались 48 КБЛ-маркеров, которые разделились на 11 групп сцепления, отнесённым к хромосомам 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12. Маркеров, относящихся к хромосоме 11, выявлено не было (Табл. 2).
Таблица 2
Распределение ^Я-маркеров по хромосомам томата_
Хромосомы ISSR-маркеры
1 К11Е1*, К17Е2, К11Р2, К18Р1, К24Р2, К27РЗ
2 К12ЕЗ, К19Е2, К27Р1, К32Р1
3 КИЕЗ, К12Е1, К18Е1, К27Е2, К18Е2, К18Р4, K13P3, К24РЗ
4 К17ЕЗ, К30Е1, К12Р1, К12РЗ, К30Е2
5 К15Е6, К13Р4, К24Е1, К26Е4, К17Р5
6 К12Е4, К17Р1, К17РЗ, К26Р2
7 К15Е5, К19ЕЗ, К13Р1, К17Р2, К27Р2, К17Е1
8 К32Е1, К12Р2, К18Р5
9 К10Е1, К16Е2, К16Е4
10 К26Е1, К26Е2, К27ЕЗ, К26РЗ
11 маркеры не выявлены
12 К15Е4
♦Жирным шрифтом обозначены маркеры, интегрированные в генетическую карту (рис. 10).
Из 48 КБК-маркеров, отнесенных к различным группам сцепления, 32 были интегрированы на генетической карте групп сцепления томата относительно уже имеющихся молекулярно-генетических маркеров. 21 маркер показал незначительную степень сцепления, что не позволило отнести их к выявленным группам сцепления и интегрировать в ранее созданную генетическую карту (Рис. 14).
Таким образом, картирование ^Я-маркеров генома томатов показало, что межмикросателлитные последовательности и микросателлиты могут располагаться вне прицентромерной области хромосом томата. Этот результат наряду с тем фактом, что метод КЗЯ-РСЯ достаточно прост в использовании и хорошо воспроизводим, свидетельствует о высокой
потенциальной эффективности использования межмикросателлитных маркеров для дальнейшего картирования генома томата и других видов.
Хромосома 3
А 6 В
Рис.14 . Пример интегрированной генетической карты по третьей группе сцепления
А - интегрированная генетическая карта групп сцепления межмикросателлитных последовательностей ДНК томата; Б - генетическая карта томата, созданная Tanks ley et al. (1992); В - генетическая карта томата созданная Haanstra et al. (1999). Красным цветом на трех картах обозначены области локализации ISSR-маркеров. Синим цветом на карте Haanstra et al. (1999) обозначена область, где AFLP-маркеры располагаются с наибольшей плотностью. Черная вертикальная полоса слева на карте А обозначает приблизительную локализацию прицентромерной облас ти хромосом.
Показанная возможность равномерного покрытия генома томата ISSR-маркерами делает их чрезвычайно привлекательным инструментом для маркирования генов хозяйственно-ценных признаков при проведении селекции с помощью маркеров (MAS - Marker Assisted Selection).
2. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДНК-МАРКЕРЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ И ХАРАКТЕРИСТИКИ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА.
2.1. Межсортовой полиморфизм ISSR-маркеров у хмеля обыкновенного. Структура и организация генома хмеля до настоящего времени мало изучены. Единичные работы посвящены оценке возможности применения некоторых молекулярных маркеров для идентификации сортов хмеля, филогенетических исследований, маркирования пола. Низкий уровень полиморфизма RAPD- и RFLP- маркеров образцов хмеля европейского и североамериканского происхождения выявлен Pillay и Kenny, 1996 и Patzak et al. 1999. В нашей работе проведено исследование межсортового полиморфизма ISSR-маркеров у хмеля обыкновенного. Оценивается возможность применения этого типа маркеров для филогенетических исследований, идентификации сортов хмеля и маркирования хозяйственно-ценных признаков.
Продукты амплификации были получены для 21 из 23 протестированных ISSR-праймеров, 19 праймеров обеспечили амплификацию полиморфных фрагментов ДНК. Их размер варьировал от 120 п.н. до 1900 п.н., а количество (учитывали только хорошо различимые фрагменты) - от 5 до 20 фрагментов на 1 праймер (в среднем 9 фрагментов на 1 праймер). Двадцать один праймер обеспечил амплификацию 183 фрагментов ДНК, из них 106 (57,9%) были полиморфными. Уровень полиморфизма, полученный нами для ISSR-маркеров выше AFLP-полиморфизма выявленного Seefelder et al., 2001 - 43,5% и RAPD-полиморфизма, описанного Sustar-Vozlic и Javornik, 2000 - 38,6%.
Обнаружены ISSR-маркеры, специфичные для отдельных сортообразцов. К 692266 из Японии: праймер К15 - отсутствует фрагмент размером 550 п.н.; К17 - получен фрагмент 250 п.н., отсутствующий у других сортов. Образец из местной популяции Алтая ЧА 89/19: К1б -отсутствуют фрагменты 300 п.н. и 500 п.н. Сорта Михайловский и Аполлон: отсутствуют отрезки размером 250 п.н. (К22) у первого и 450 п.н. (К24А) у второго.
Генетические расстояния и ISSR-группы сортов хмеля. Максимальные значения коэффициентов различия (от 0,45 до 0,53) получены для югославского сорта Аполлон, украинского Сполэчны и российских сортообразцов (Ранний, Чувашский местный, Гуслицкий, Подвязный, Э 88/20, Михайловский, Дружный), японского клона К-692266 и теми же российскими образцами. На основе значений коэффициентов различия был проведен кластерный анализ и построена дендрограмма. Большинство российских сортообразцов, а так же украинский сорт Заклад, Литовский местный и чешский Жатецкий поздний образуют один большой кластер. Европейские сорта, а также небольшая часть российских и украинские сорта образуют второй большой кластер. В нем российские образцы Э 88/20 (Чувашия, образец из местной популяции), Цивильский (НИПТИХ, Чувашия) и Сумерь (РНИСХ) образуют отдельный подкластер. Особняком стоят японский клон К-692266 и образец из местной популяции Алтая ЧА 88/19, которые генетически отдалены как от российских, так и от европейских сортов. До середины XIX века в России выращивали сорта и сортосмеси хмеля, созданные народной селекцией. К концу XIX века после завоза богемских, баварских и английских сортов хмеля они частично заменили российские. Широко применяли интродукцию иностранных сортов в 70-80-х годах XIX века и на Украине. В результате на хмельниках образовывались смеси отечественных и иностранных сортов. Этим можно объяснить например то, что полученный в результате клонового отбора из сортосмеси Житомирской области Клон 18, входит в один кластер с европейскими сортами.
Таким образом, в нашей работе выявлен высокий уровень межсортового ISSR-полиморфизма хмеля обыкновенного. Классификация сортов, полученная с помощью ISSR-ПЦР анализа генетического полиморфизма сортов хмеля, отражает существенные генетические различия
между российскими, европейскими и дальневосточными группами сортов, но не согласуется с количественными показателями (средние продолжительность вегетации, масса хмеля с растения, содержание альфа-кислот) исследованных сортов. Данные, полученные в результате ШБК-ПЦР анализа, могут быть использованы в селекционном процессе для классификации и идентификации сортов хмеля, подбора пар для скрещивания с учетом их эколого-географического происхождения.
2.2. Молекулярно-генетические маркеры для исследования генетического разнообразия и маркирования признаков у малины. При
выборе метода для молекулярно-генетического анализа малины мы, прежде всего, исходили из того, что структура и организация генома малины мало изучены и, следовательно, необходимо опираться на те методы, которые не требуют предварительного знания о последовательности анализируемой ДНК. Также необходимыми условиями при выборе метода для нас были: простота использования, скорость проведения анализа и низкая стоимость.
Для изучения полиморфизма межмикросателлитных последовательностей ДНК видов и сортов малины было использовано 15 18811-праймеров. Продукты амплификации были получены для одиннадцати из пятнадцати протестированных праймеров. Десять праймеров обеспечили амплификацию полиморфных фрагментов.
В целом эффективными оказались только 8 из 15 18511- праймеров. С помощью этих восьми праймеров были получены четкие электрофоретические профили для каждого из генотипов малины.
При сравнении КБЛ-профилей образцов малины был выявлен высокий полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК. С помощью восьми выбранных праймеров оценили генетическое разнообразие видов и сортов малины. Было проанализировано 223 ампликона, из которых полиморфными оказались 202, что составило 90,6 %. В целом выявлено широкое варьирование генетического полиморфизма в зависимости от праймера и группы анализируемых образцов. Всего учитывали 4 группы образцов: виды малины, ремонтантные сорта, обычные сорта и общая группа, объединяющая все сорта и виды. Самый высокий уровень полиморфизма наблюдался в объединенной группе сортов и видов, где он варьировал от 71,4 до 96,8 %, и в среднем составил 89,2%, что можно объяснить тем, что в данной группе наряду с сортами учитывали данные по отдельным видам, которые имели большое количество уникальных фрагментов, специфичных только для данного вида и повышающих общий уровень полиморфизма. Межвидовой полиморфизм колебался в пределах от 66,7 до 94,7 % и в среднем по восьми праймерам составил 82,75 %. Наименьший же уровень полиморфизма наблюдался в группе неремонтантных сортов, где он составил 45,4 % однако, в среднем он составил 74,6 % и был очень близок к среднему уровню полиморфизма ремонтантных сортов - 74,1 %. В целом, как видно из полученных результатов, геном малины отличается высокой степенью полиморфизма межмикросателлитных последовательностей ДНК.
В дендрограмме, построенной на основании результатов, полученных при использовании всех восьми праймеров, наблюдалась четкая кластеризация по группам исследуемых образцов. В частности, выделились все ремонтантные сорта и сорта с летним типом плодоношения, образовав отдельные кластеры. В кластер неремонтантных сортов также попал стародавний сорт Новость Кузьмина, который в наших исследованиях являлся представителем вида малины красной ЯиЬш х<1ает I.
Молекулярное маркирование признака ремонтантности у малины с использованием ЮЗЯ-РСЯ. При использовании праймера (АС)8УА был обнаружен специфический маркерный фрагмент длиной около 270 п.н., присутствующий во всех 15 исследуемых сортах ремонтантной малины. Можно предположить, что данный фрагмент является маркером признака ремонтантности малины, так как при проведении РСЯ-анализа сортов малины с обычным неремонтантным типом плодоношения он не амплифицировался (рисунок 15).
1 2 3 4 5 6 М 7 8 9 10 11 12 И И
,, ■ ** {* » ' Ж:
>,'-■ У'л ■ * * /V? ^¿д ¿йй
' - ^ - • N
_ ( Щ ' Ш Е &
— - ' ■■ - * - !" Я л
:§: т > тт т -■■ * * ** **
«•» V » : а* :/"■ *
Ш ' **** '• '4 270
Рис. 15. Молекулярное маркирование ремонтантных сортов малины. Неремонтартные сорта: 1-Новость Кузьмина, 2-Пересвет, 3- Рубин брянский, 4- Брянская, 5- Бальзам, 6-Вольница; Ремонтантные сорта: 7-Элегантная, 8-Надежная, 9-Августина, 10- Заря вечерняя, 11- Абрикосовая, 12-Бабье лето1, 13-Бабье лето2, 14-Геракл, М-маркер размеров (1216,1045, 926,632,313,241).
2.3. Молекулярно-генетические маркеры для исследования генетического разнообразия и маркирования признаков у огурца.
2.3.1. КБЯ полиморфизм. Уровень ^БЯ полиморфизма был иучен на двух сортах, двух коммерческих гибридах Р) и 14 селекционных линиях различного происхождения. Четырнадцать из 19 использованных праймеров выявили различный уровнь полиморфизма, который варьировал от 10 до 80%. Несмотря на высокий полиморфизм применение этого метода для маркирования устойчивости огурца к мучнистой росе не позволило выявить маркеров этого признака.
Таким образом, мы изучили полиморфизм межмикросателлитных последовательностей геномной ДНК видов, сортов и линий рода
Lycopersicon, Humulus, Cucumber и Rubus с помощью ISSR-PCR. Метод ISSR-PCR, который позволяет амплифицировать последовательности ДНК, расположенные между соседними повторяющимися последовательностями ДНК - микросателлитами, показал себя как простой, эффективный и надёжный метод изучения полиморфизма генома томатов. Проведение экспериментов в ходе исследования часто было разорвано по времени, при этом использовались разные партии реактивов. В таких условиях метод ISSR-PCR проявил высокую воспроизводимость результатов, что является одним из важнейших критериев, определяющих эффективность различных молекулярно-генетических методов. Как и RAPD-PCR, ISSR-PCR не требует знания нуклеотидной последовательности ДНК для создания праймеров, что является преимуществом этих методов молекулярного маркирования. Однако, ISSR-PCR проявляет более высокую воспроизводимость по сравнению с RAPD-PCR. Это связано с тем, что ISSR-праймеры могут быть использованы при гораздо более высоких температурах отжига в ходе амплификации, чем достигается высокая специфичность реакции (Kojima et al., 1998). Кроме того, ISSR-PCR позволяет получить комбинированные фрагменты ДНК, которые состоят из универсальной части, соответствующей какому-либо микросателлиту, и специфической межмикросателлитной последовательности. Данные, полученные с помощью ISSR-PCR, могут отражать как полиморфизм межмикросателлитных последовательностей, так и особенности организации в геномах изучаемых растений самих микросателлитов.
2.4. Анализ гомологов генов устойчивости к фитопатогенам.
Наиболее актуальным на сегодняшний день является создание сортов и линий растений с генетической устойчивостью к фитопатогенам. К настоящему времени клонирован ряд генов устойчивости, проведена их молекулярная характеристика и выявлены их консервативные области (Feuillet at al., 2003, Wisser at al, 2005). Таким образом, с помощью амплификации с праймерами на консервативные домены можно клонировать последовательности гомологичные генам устойчивости к фитопатогенам
2.4.1. Огурец. Нами было использовано 10 пар праймеров на различные домены генов устойчивости. В результате была получена амплификация фрагментов различной длины, хорошо разделяемых в полиакриламидном геле. Полученный полиморфизм был использован для маркирования усточивости огурца к мучнистой росе. При использовании изогенных линий был получен фрагмент, который маркировал этот признак (Рис. 16).
- » - в Щ -
______— i-i Si м S3---
... „„,. ^
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Рис.16. Электрофоретические профили ПЦР продуктов образцов огурца при использовании пары праймеров XLLR. 1-7 - неустойчивые образцы; 8 - 14 -устойчивые образцы;15 - маркер «100 bp leader».
2.4.2. Подсолнечник. С использованием комбинаций вырожденных праймеров, созданных на основе консервативных NBS - доменов генов устойчивости, нами проведена амплификация и последующее клонирование фрагментов аналогов генов устойчивости подсолнечника Helianthus argophyllus. Сиквенсы клонированных ПЦР - продуктов различались между собой и имели сродство к отрезкам NBS - доменов уже известных генов устойчивости и аналогов генов устойчивости растений, относящиеся к разным классам. Наибольшее сходство выявлено с участками NBS - доменов культурного подсолнечника и других представителей семейства сложноцветных. Два клонированных фрагмента имеют открытую рамку считывания, остальные последовательности имеют стоп-кодоны, являясь, по-видимому, псевдогенами. Проанализированные аминокислотные последовательности Helianthus argophyllus включают в себя консервативные участки, свойственные NBS домену продуктов генов устойчивости.
Таким образом, наличие полиморфизма между гомологами генов устойчивости может быть использовано при создании молекулярно-генетических маркеров.
3. РАЗРАБОТКА И СОЗДАНИЕ ДНК МАРКЕРОВ НА ХОЗЯЙСТВЕННО-ЦЕННЫЕ ПРИЗНАКИ ДЛЯ ОЦЕНКИ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА И УСКОРЕНИЯ СЕЛЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА.
3.1. Маркеры, связанные с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС). ЦМС растений широко используется в сельском хозяйстве при производстве гибридных семян. Она позволяет устранить затраты, связаные с ручной кастрацией, и тем самым снизить себестоимость
семян. Растения с ЦМС образуют стерильную пыльцу, которая не способна к оплодотворению. Это явление известно у многих сельскохозяйственных культур. ЦМС является результатом взаимодействия цитоплазматических и ядерных компонентов. Многочисленные исследования сосредоточены на различиях в митохондриальных геномах между линиями с ЦМС и их линиями закрепителями. Однако высокая степень полиморфизма митохондриального генома между линией с ЦМС и ее закрепителями не позволяет идентифицировать митохондриальные факторы, контролирующие мужскую стерильность.
3.1.1. Рис (Oryza sativa). Геномную ДНК ЦМС линий (А линий) и их линий закрепителя (В линий) риса использовали в качестве матрицы для ПЦР анализа.
Амплификация митохондриальной ДНК RAPD-методом. Для выявления полиморфизма митохондриальной ДНК между ЦМС линиями и их закрепителями ЦМС использовали RAPD метод с применением 34 RAPD-праймеров (Operon Technology, USA). Геномную ДНК ЦМС линии Neda-A (А линии) и ее линии закрепителя Neda-B (В линии) использовали в качестве матрицы для ПЦР с RAPD-праймерами. В RAPD - анализе, 30 из 34 праймеров воспроизводимо амплифицировали ДНК, среди которых четыре выявили полиморфизм между линией ЦМС Neda-A и ее фертильным аналогом закрепителем Neda-B. Праймеры ОРА09, ОРА14, ОРС02 и ОРС05, с высокой воспроизводимостью выявляли полиморфные фрагменты между двумя изогенными линиями. ОРА09 и ОРА14 амплифицировали специфичные фрагменты для стерильной линии, длиной -200 п.н и -800 п.н., соответственно. Для идентификации RAPD маркеров и их ассоциации с цитоплазматической мужской стерильностью, ДНК 4-х стерильных линий и их линий закрепителей была амплифицирована с 4 идентифицированными полиморфными RAPD праймерами. Только один RAPD- праймер (ОРС05) амплифицировал фрагмент, размером -500 п.н, специфичный для всех 4-х линий ЦМС (рис.17).
Рис. 17. ПЦР амлификация RAPD-праймером ОРС05. Pl: Neda-A и В; Р9: IR67017-180-2-1-2-А и В; PIO: Usen-A и В; Pl 1: IR68897-A и В. Стрелками показан полиморфный бэнд.
При амлификации ДНК 4-х ЦМС линий и линий закрепителей с использованием комбинации RAPD- праймеров серии А (ОРА01-04) и серии В (ОРВ02-04), всего 12 пар, праймеры OPAQ1-OPB04 выявили полиморфизм
между ЦМС линиями и линиями закрепителями. С комбинацией праймеров ОРА01-ОРВ04 амплифицировался полиморфный фрагмент размером -370 п.н., специфичный для ЦМС линий (рис. 18).
м Nc.ia ÍR670Í7 L'sca ШШ»?'-CMS 14. CMS N CMS N cm Kl
Jg Iff WS : . HS
■ЩЖ
-' ?
W'-m
- 370 bp
Рис. 18. ПЦР с комбинацией RAPD-праймеров ОРА01-ОРВ04
Эти результаты отражают различие в цитоплазматическом геноме линий с ЦМС и их закрепителей. Обнаруженные RAPD-маркеры могут использоваться для создания линий с ЦМС в селекционных программах гибридного риса, а также в оценке чистоты семян.
SCAR маркеры ЦМС. Для идентификации молекулярных маркеров, различающих генотипы ЦМС линий и линий закрепителей, были разработаны 2 специфичных праймера (SCARmtOlF и R) на основе митохондриальной последовательности AY187000 от линий "Zhenshan 97-А" и 2 специфичных праймера (SCARmt02F и R) на основе митохондриальной последовательности AY181205 от линий "Zhenshan 97-В", соответственно (Yang et al., 2002). Одна пара специфичных праймеров SCARmtOlF и R при ПЦР дала кодоминантные фрагменты, различающие генотипы ЦМС линии и линии закрепителя (рис. 17). Амплифицируемые фрагмент у всех линий закрепителей был немного длиннее, чем у ЦМС линий.
Рис. 17. Образцы ПЦР - амплификации праймером SCARmtOl. S- ЦМС. N- закрепитель
Результаты секвенирования показали, что фрагмент ДНК у линии закрепителя (1R68897-B) на 6-7 п.н. длиннее, чем у ЦМС линий. Сравнение секвенированной последовательности локуса SCARmtOl у ЦМС линии "Neda-A" с последовательностями ДНК базы данных ГенБанк показало, что данная последовательность почти полностью (96%) гомологична участку митохондриальной последовательности риса линии 93-11 (подвида indica) и линии Nipponbare (подвида japónica).
Выявление молекулярных маркеров генов восстановления фертильности риса. С целью выявления полиморфных молекулярных маркеров, сцепленных с /^генами, первоначально была проведена ПЦР -амплификация ДНК восьми генотипов (Neda-A, IR24, IR28, IR36, IR62030, IR60966, Amoll и Ашо12) с использованием 2-х SSR-праймеров, имеющих сцепление с RJ3 и Rf4 генами. SSR маркер RM1 имеет сцепление с RJ3 геном на коротком плече 1-ой хромосомы (Не et al., 2002), a RM171 с Rf4 на длинном плече 10-ой хромосомы (Jing et. al, 2001). Оба праймера детектировали полиморфизм между ЦМС линией (Neda-A) и 7 фертильными линиями. Для проведения первоначального анализа, индивидуальные растения F2 разделяли на две группы, состоящие из десяти растений каждая (В SA- анализ). При этом, группы растений различаются между собой по аллелям исследуемого гена, распределение же остальных признаков в пределах группы - случайное. Результат этого первоначального тестирования показал, что SSR- маркер RM1 в популяциях Neda-A/IR36 и Neda-A/IR60966, сцеплен с R/3 геном на коротком плече 1 -ой хромосомы, а RM171- с Rf4 в популяциях Neda-A/IR24, Neda-A/IR28, Neda-A/Amoll и Neda-A/Amol2 на длинном плече 10-ой хромосомы.
Высокоразрешающее картирование региона гена Rf4. Так как Rf4 ген был картирован между двумя маркерами RM171 и RM304, нами выбраны допольнителные SSR- маркеры на генетической карте риса [McCouch et al., 2002] и разработаны новые праймеры на основе последовательностей EST- и RFLP-маркеров в этом регионе. Праймеры (SPRFA01-03), созданные на основе последовательности ранее клонированого гена RflA, не выявляли полиморфизма между родительскими линиями даже после рестрикции с 14 рестриктазами (CAPS-маркеры). Кроме того, два других RFLP- маркера (S10019 и S12564) не обнаруживали полиморфизм между двумя родительскими линиями. BSA-анализ показал, что один SSR маркер, RM6737, находится в этом регионе и был тесно сцеплен с R/4 геном на расстоянии 1.6 сМ. Кроме вышеупомянутых маркеров, два разработанных нами праймера на основе последовательности АВ110443 (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/), АВ443 F и R, амплифицировали два полиморфных фрагмента ДНК, специфичных для стерильной линии, размерами -400 и -500 п.н., соответственно. Они были тесно сцеплены с рецессивным г/^-аллелем (рис. 18) на расстоянии -0.5 и 1.03 сМ, соответственно. Эти два маркера локализованы нателомерной стороне между RM171 и геном Rf4.
S рй
Б I vi I о ' »л ' • ' ' о
U О-НОО^ rH «
Рис. 18. Высокоразрешающее картирование Ц/4 гена на длинном плече 10-ой хромосомы риса
Физическая локализация гена Rf4. Для определения физической локализации Rf4- гена и сцепленных с ним маркеров использовали программу BLASTN (http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Genome/PlantBlast.shtml75) в базе данных геномной последовательности ДНК сорта 93-11
(http://rise.genomics.org.cn/rice/index2.jsp). Этот поиск дал возможность идентификации контигов, несущих сцепленные с Rf4 маркеры, от SSR-маркера RM6737 на одной стороне (центромерной) до маркера АВ443 на другой (теломерной). Сравнение последовательностей праймеров SSR-маркера RM6737 и праймеров АВ443 с последовательностью ДНК сорта 9311 показало, что последовательности праймеров RM6737 находятся в контиге Ctg030205, а последовательности праймеров АВ443 - в Ctg030228. Физическая карта, построенная на основе этих данных состояла из 15 контигов, охватывая -206 т.п.н подвида indica риса.
Так как общей характерной особеннотью Л/-генов растений является кодирование пентатрикопептидного (PPR) белка, имеющего в своём N-конце последовательность, необходимую для транспорта в митохондрию [Bentolila et al., 2002; Akagi et al., 2004], этот регион был проанализирован на наличие таких генов программами MitoProt II (http:// ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html) и Pfam 11.0 (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/Stroctare/cdd/wrpsb.cgi'). Результаты этого анализа показали, что среди -45 генов в этом регионе, только пять генов, включая OsIFCC036677, OsIFCC036680, OsIFCC036693, OsIFCC036694 и OsIFCC036695Ha контигах Ctg30207, Ctg30216, Ctg30225, Ctg30225 и Ctg30227, соответственно, удовлетворяли критериям характерным для Rf- генов (рис. 19).
RM6737-*--206 kbp-р. АВ443
30207 .... 30216 ........ 30225 .... 30227 30228
OS1FCD036677 OslFCD036680 OsffCD036693 OslFCD036694 OsifCD036695
Num.ofPPRs: U PPR 5 PPR 16 PPR 14 PPR 16 PPR
Рис. 19. Структура фрагмента ДНК, несущего маркеры, сцепленные с R/4- геном на 10-ой хромосоме подвида риса indica
В нашем исследовании молекулярные маркеры, сцепленные с геном восстановления фертильности ЦМС WA-типа риса, были успешно идентифицированы и картированы на длинном плече 10-ой хромосомы с использованием SSR-маркеров и разработанных нами праймеров в комбинации с BSA-анализом. Сравнение разных молекуляных карт сцепления маркеров показывает, что три гена восстановления фертильности 3-х ЦМС-типов (ВТ, HL и WA) тесно сцеплены на длинном плече 10-ой хромосомы риса. Однако, как показано в нашей работе, три пары праймеров, разработаные на основе последовательности гена RflA не выявили полиморфизм между исходными родителями даже после обработки с 14
рестриктазами. Поскольку данный ген является функциональным для ЦМС ВТ-типа, т. е. линии, несущие RflA восстановливают фертильность ЦМС ВТ, а не ЦМС WA (например, линия МТС-1 OR, несущая данный ген, восстановливает фертильность только для ЦМС ВТ; [Akagi et al., 2004]), можно отметить, что ген восстановления фертильности ЦМС WA отличается от гена RflA.
3.1.2. ДНК-маркеры для изучения ЦМС у Brassica.
Для исследований были взяты фертильные и стерильные растения капусты пекинской В. pekinensis (Lour.) Rupr., капусты абиссинской (горчицы эфиопской) В. carinata A. Braun, турнепса В. rapa L. var. rapa (L.) Thell., капусты цветной В. oleráceo convar. botrytis (L.) Alef. var. botryíis L., капусты белокочанной В. oleráceo L. convar. capitata L. Alef. var. capitata L. f. alba DC, горчицы сарептской В. juncea (L.) Czern., брюквы В. napus L. var. napobrassica (L.) Rchb., редиса Raphanus sativus L. var. radícula Pers., рапса В. napus L. ssp. oleífera (Metzg.) Sinsk. В опыте использовались стерильные растения как с типом ЦМС ogura, так и с неизвестным типом. Для изучения молекулярной структуры митохондриальной ДНК фертильных и стерильных форм растений использовался метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). На основании литературных данных о нуклеотидных последовательностях, специфичных для того или иного типа ЦМС, были синтезированы 12 пар праймеров. Для ПЦР анализа на тип ЦМС Ogura использовали семь пар праймеров, специфичных на данный тип стерильности - Ogl и Og2, ogu-5' и ogu-3', orfl38-5' и огП38-3, orfl38-Fl и orfl38-R, orfl38-F2 и orffl-Rl, orfB-F и orffi-R2, TRNAFM-F и TRNAFM-R (Motegi et al., 2003; Giancola et al., 2007). При проведении ПЦР с этими праймерами амплифицировались фрагменты ДНК ожидаемых размеров. В результате было выявлено, что у образца с неизвестным типом ЦМС, спонтанно возникшей в результате межвидовой гибридизации, амплифицируется ДНК только с прамерами на Ogura тип ЦМС. Клонирование и секвенирование полученных продуктов подтвердило их полную гомологию с митохондриальной ДНК специфичной для Ogura типа ЦМС.
3.2. Создание ДНК маркеров генов устойчивости на основе данных сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей устойчивых и неустойчивых генотипов.
Наиболее эффективными молекулярными маркерами являются те, которые основаны на характерных особенностях нуклеотидных последовательностей самих генов устойчивости. Для разработки таких ДНК-маркеров необходимо выявить различия в структуре локусов генов устойчивости у устойчивых и чувствительных к фитопатогену генотипов. Сравнительный анализ и изучение организации кластеров и локусов генов устойчивости у устойчивых и неустойчивых генотипов в пределах одного вида проливает свет на эволюцию формирования устойчивости к различным фитопатогенам. Информация о структуре локусов у неустойчивых форм
растений, аналогичных таковым у устойчивых генотипов, дополнит наши знания о строении и функциях доменов, свойственных генам устойчивости. В нашем исследовании был проведен анализ нуклеотидных последовательностей генов, входящих в состав 12 и Ve, у неусточивых форм томата.
3.2.1. Создание ДНК маркера на основе данных анализа локуса 12 у устойчивых и неустойчивых генотипов томата.
Для сравнительного анализа локуса 12 у устойчивых и неустойчивых к фузариозу генотипов томата были использованы два праймера UP78 и LF79. Праймеры были синтезированы на основании нуклеотидной последовательности ранее клонированного гена 72С-2 (Ori N. etal., 1997). При проведении ПЦР с данными праймерами синтезировались ПЦР-продукты размером около 1100 п.н. Причем фрагменты одинакового размера синтезировались как на устойчивых, так и на неустойчивых генотипах. Для выявления полиморфизма между устойчивыми и неустойчивыми к фузариозу генотипами томата, ампликон был обработан ретриктазами. При гидролизе ПЦР-продукта рестриктазой Асс I были выявлены отличия между устойчивыми и неустойчивыми генотипами. При анализе рестрикционной картины было выявлено, что сумма размеров рестрикционных фрагментов у устойчивого генотипа значительно превышает размер ПЦР-продукта до рестрикции. Нами было сделано предположение, что с помощью данной пары праймеров синтезируются ПЦР-продукты с нескольких генов-гомологов, входящих в состав кластера 12, и каждый из них имеет свои сайты рестрикции для рестриктазы Асс I. Важно отметить, что структура локуса 12 у устойчивых генотипов достаточно хорошо изучена, и данный локус перенесен в S.lycopersicum из дикого вида S.pimpinellifolium (Segal et al., 1992; Ori N. et al., 1997; Simons et al, 1998; Sela-Buurlage et al. 2001; Couch, 2006). С другой стороны, структура аналогичного локуса у S.lycopersicum не изучена, и остается неизвестным, какие гены-гомологи входят в его состав у неустойчивых генотипов. Анализ клонированных ПЦР-продукгов показал, что с праймерами UP78-LF79 на гомозиготных устойчивых растениях синтезируются два гена гомолога из локуса 12. Один из гомологов имеет два сайта рестрикции для рестриктазы Асс I, а второй не имеет сайтов рестрикции для этой рестриктазы. Секвенирование показало, что один из клонированных генов-гомологов имеет высокую степень гомологии к ранее изученному гену I2C-5 (Simons, G. et al., 1998), входящему в состав локуса 12 S. pimpinellifolium и, также как и ген 12С-5, не имеет сайта рестрикции Асс 1 в исследованном регионе. Второй клонированный ген-гомолог хотя и имеет высокую степень идентичности к ранее клонированным генам из локуса 12, является уникальным по наличию одного сайта рестрикции Асс I, а также по его положению. Ни один из ранее изученных генов-гомологов локуса 12 не имел сайта рестрикции в положении, характерном для клонированного нами участка ДНК из локуса, аналогичного 12.
Таким образом, нами впервые было показано, что в состав локуса 12 у S. lycopersicum входит, по меньшей мере, два гена-гомолога. Один из них
имеет высокую степень сродства к ранее клонированному гену 12С-5, и, возможно, данный ген входит в состав кластера у неустойчивой формы. Второй клонированный нами фрагмент ДНК является ранее неизвестной, уникальной последовательностью ДНК, входящей в состав локуса 12.
На основании обнаруженных различий в строении локуса 12 у устойчивых и неустойчивых генотипов томата, нами был разработан ДНК-маркер устойчивости томатов ко 2-й расе фузариоза. Созданный ДНК-маркер является кодоминантным, т.е. позволяет выявлять скрытых носителей неустойчивого аллеля - гетерозиготные по данному признаку генотипы. Еще одной важной особенностью предложенного нами маркера является то, что маркерная последовательность находится внутри локуса 12. Таким образом, исключается несцепленное наследование ДНК-маркера и признака.
3.2.2. Создание ДНК-маркера на основе данных анализа локуса Уе у устойчивых и неустойчивых генотипов томата.
Для сравнительного анализа локуса Уе у устойчивых и неустойчивых форм томата, нами были синтезированы две пары праймеров (УУН+УУМ; УУР2+УУ112), которые позволяют амплифицировать участок гена Уе1 (КалусИик, 2001) протяженностью около 1500 п.н. Данный участок расположен в начале гена. В результате ПЦР с синтезированными праймерами и на устойчивых, и на неустойчивых генотипах были получены ампликоны одинакового размера. Таким образом, можно сделать вывод, что у неустойчивых генотипов томата локус в целом присутствует, однако его функциональность нарушена в результате изменений на молекулярном уровне. Так как явных различий между устойчивыми и неустойчивыми генотипами непосредственно после ПЦР выявить не удалось, было проведено клонирование ПЦР-продуктов, полученных на устойчивой и неустойчивой формах томата.
Анализ нуклеотидных последовательностей клонированных участков гена Уе показал высокую степень гомологии по данному локусу между устойчивыми и неустойчивыми генотипами томата. Поиск последовательностей с высокой гомологией к клонированным фрагментам в базе данных СепВапк дал схожие результаты на устойчивом и неустойчивом к вертициллезу генотипах. Как и ожидалось, была обнаружена высокая степень гомологии к ранее клонированным генам Уе1 и Уе2. Анализ нуклеотидных последовательностей полученных клонов не выявил никаких крупных (дедеций, инсерций, дупликаций) различий между локусами Уе устойчивых и неустойчивых форм томата. Следующим шагом нашей работы был поиск полиморфизма по сайтам рестрикции в этом локусе между устойчивым и неустойчивым генотипами. Обнаружение такого полиморфизма позволило бы создать молекулярный маркер непосредственно на ген Уе. При анализе ПЦР-продукта, полученного с парой праймеров УУР1+УУШ, полиморфизма по сайтам рестрикции между устойчивым и неустойчивым генотипами нами обнаружено не было. ПЦР-продукты, полученные с парой праймеров УУР2+УУ112, были также проверены на полиморфизм по сайтам рестрикции на устойчивых и неустойчивых
генотипах. Одна из рестриктаз - ХЬа I - позволила выявить различия между устойчивыми и неустойчивыми к вертидиллезу формами томата. Было выявлено, что в регионе, амплифицируемом с помощью указанной пары праймеров, у неустойчивого генотипа имеется один дополнительный сайт рестрикции для рестриктазы ХЬа I по сравнению с устойчивым генотипом. Такой сайт возникает благодаря однонуклеотидной замене в последовательности ДНК, в результате чего появляется новый стоп-кодон.
Таким образом, нами показано, что в локусе Уе у неустойчивых генотипов томата (5. 1усорегзкит) находятся последовательности ДНК, имеющие высокую степень гомологии к ранее изученным генам Уе! и Уе2, расположенным в аналогичном локусе устойчивых форм. В данном регионе нам удалось выявить полиморфизм по сайту рестрикции ХЬа I между устойчивыми и неустойчивыми формами томата. На основании выявленного полиморфизма был создан эффективный кодоминантный ДНК-маркер (Рис.20).
1 2 3 4 5 6 7
Рис. 20 . Рестрикция ПЦР-продуктов с рестриктазой ХЬа 1 (1 - Мегана (устойчивый гомозиготный); 2 - Moneymaker (неустойчивый); 3 - Белый налив (неустойчивый); 4 -Ампаро (устойчивый гомозиготный); 5 - Indiko (гетерозигота); 6 - Durason (гетерозигота); 7 -Pitenza (гетерозигота).
Примененный нами методологический подход - сравнительный анализ локусов генов устойчивости у устойчивых и неустойчивых к фузариозу и вертициллезу генотипов томата - позволил нам выявить нуклеотидные последовательности новых генов-гомологов у неустойчивых форм томата. Анализ данных локусов у неустойчивых форм томата был проведен впервые. На основании выявленных нами различий между устойчивыми и неустойчивыми генотипами томата по локусам устойчивости к фузариозу и вертициллезу созданы новые эффективные ДНК-маркеры, а на их основе ДНК-диагностикумы. Эти диагностикумы были испытаны на расщепляющихся популяциях и продемонстрировали высокую эффективность при оценке селекционного материала на наличие генов устойчивости к фитопатогенам. Применение таких диагностикумов позволяет снизить затраты и сократить сроки создания устойчивых форм томата в два раза.
3.3. Использование межмикросателлитного полиморфизма для создания ДНК маркеров. Для создания ДНК-маркера на пол хмеля обыкновенного был использован метод анализа межмикросателлитных последовательностей ДНК (ISSR-PCR), который продемонстрировал высокую эффективность в ранее проведенных нами исследованиях на этой культуре. Двадцать два ISSR праймера были применены для амплификации ДНК на 53 женских и 33 мужских образцах растений хмеля различного географического происхождения. В результате два праймера после амплификации продемонстрировали специфичные бенды для мужских растений. Эти бэнды были клонированы и секвенированы. На основе этих сиквенсов были созданы пол-специфичные STS маркеры (Рис. 21).
М male female с М male female с
I щ . щ
947 j 831 ■ ; jgj - ' " ■ ' -
564 ФЯШ ^— ц
а Яг ж mm mm <«_ ^ b
Рис. 21. Результат амплификации ЭТЭ-маркеров БТЗ-КШ (а) и 8Т5-К22 (Ь) на мужских и женских образцах хмеля обыкновенного.
4. ВЫБОР ОПТИМАЛЬНОГО ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО МЕТОДА ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК.
Для проведения массового скрининга растительного материала с использованием ДНК-маркеров требуются удобные и высокопроизводительные методики выделения ДНК. Нами были протестированы семь методов выделения ДНК на 8 культурах. В результате часть методик демонстрировала воспроизводимые результаты только на отдельных культурах. В связи с низким содержанием полифенольных соединений и других ингибиторов полимеразной цепной реакции в растительном материале огурца, на этой культуре возможно применение упрощенной методики выделения ДНК, основанной на инкубации материала в слабом растворе щелочи с последующей нейтрализацией его соляной кислотой. Следует отметить, что на этой культуре амплификацию специфичных продуктов отмечали и при экстракции ДНК кипячением в стерильной воде. Однако в целом для всех культур наилучшие результаты показал экспресс-метод выделения ДНК с наличием в экстракционном буфере ББЗ.
5. АВТОМАТИЗАЦИЯ АНАЛИЗОВ.
При массовых анализах стадия электрофореза, необходимая для визуализации результатов ПЦР, остается достаточно трудоемкой, занимает до половины времени, необходимого для скрининга популяций, расщепляющихся по маркируемому признаку. Избежать данную стадию, а также автоматизировать детекцию и хранение результатов и предотвратить контаминацию ПЦР-продуктом, позволяет метод флуоресцентного маркирования, основанный на применении молекулярных беконов.
Нами был синтезирован зонд на нуклеотидную последовательность, отсутствующую у неустойчивых форм растений, который используется в комбинации с ранее подобранными праймерами УБ+УЯ (рис. 22). В ходе ПЦР, при наличии устойчивого аллеля, зонд гибридизуется на ДНК-мишени и разрушается Тац-полимеразой, в результате чего флуоресцентная метка освобождается, и мы можем детектировать излучение определенной длины волны.
* 700_«_720
т ^ ас а со - \.а .1 г ч 1; о <\ ласа а д * г а с I с а а £ ? .г тг лее?* - л г 1 ->г чя»С: .
АТАЭТТАТАТСТТАвТвИаОМСААбТТАСТСАТАТАвААОЗТАаСТТ.ВДТСТ ОАТТ ССАСССА ТТАТАвААТАТСТААЗвА
ТвАААТААААААТТС А АА ТА АМТАТАТССТТТС А А ТСА Т ТАСАТЯТАААЗвЗТАТСАС Т
ТеСТАТТСАвААОЗЗвААААТв! А ТТ
Рис. 22. Сайты гибридизации праймеров (зеленый) и флуоресцентного зонда (красный) в локусе Уе томата.
На рисунке 23 представлены результаты детекции флуоресценции на приборе «Джин». Высокий уровень сигнала по каналу РАМ («Специфика») указывает на то, что в исследуемом образце присутствует доминантный аллель гена устойчивости томата к вертициллезу. Уровни сигнала представлены графически в правой части окна программы. Образцы, несущие признак устойчивости к вертициллезному увяданию, отмечаются знаком «+» в колонке «Результат», образцы, чувствительные к заболеванию, отмечаются знаком «НД» («нет детекции») в той же колонке. В качестве фоновых по уровню флуоресценции образцов, используется та же реакционная смесь, что и для других образцов, но без добавления матричной ДНК. Это позволяет избежать ложных результатов, вследствие спонтанного разрушения зонда Тац-полимеразой.
Пробирка ! Образец Г Рш»и*г ЖЭ§Як «ш
W ^Устойчивый 6,30 № S
2/0 : Устойчивый 3,77 1.17
3« i Устойчивый 1,95 1,13 !
4.« : Устойчивы» ■¡■¡И 2,59 1.17
6ДЗ ! Устойчивый г 2,70 1ЙЗ
&0 ; Устойчивый Ш1ШШ§1§ 2,46 1ЯЗ
7J0 : Устойчивый ЩШШш 2,63 1.21
6Ю : Устойчивый WKHnl 4,05 1#
S/Q Неустойчивый 1.05 0,96
Ш : Неустойчивый ж 1.01 0?2
11 Л) ; Неустойчивый 1,10 1» ;
2/фон(СЫ} <$кж 1Д1 1fl> S
i Стацифкм «™ 8К
Рис.23. Результаты детекции флуоресценции у устойчивых и неустойчивых к вертициллезу форм томата.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Нами продемонстрированы возможности молекулярно-генетических и молекулярно-цитогенетических подходов для создания селекционного материала растений с заданными свойствами. Эффективность применения таких методов зависит от каждого конкретного случая и напрямую связана с возможностью ускорения селекционного процесса. Стратегия применения должна основываться на надежности, эффективности, информативности и взаимодополняемости вышеуказанных подходов, а также базироваться на достижениях в геномике и биоинформатике. При этом в программах с использованием методов отдаленной гибридизации на первых этапах главную роль могут играть современные молекулярно-цитогенетические методы исследований.
ВЫВОДЫ
1. Адаптированная методика геномной in situ гибридизации позволяет идентифицировать геномный состав межвидовых гибридов лилий, получаемых с использованием 2п-гамет. Установлен механизм формирования 2п-гамет основанный на редукции первого деления мейоза (FDR). С использованием разработанного метода многоцветной геномной in situ гибридизации для лилий впервые установлена возможность создания трехгеномных гибридов (2п=36). Показана возможность преодоления стерильности межвидовых гибридов лилий и получения форм с различным геномным составом при использовании образцов формирующих 2п-гаметы.
2. Оптимизированная методика совместного применения дифференциального окрашивания хромосом, геномной гибридизации in situ и ДНК-маркирования, позволяет проводить эффективное выявление межгеномных транслокаций у тритикале.
3. Высокоповторяющиеся геномспецифичные последовательности ДНК на примере GenBR-1 (специфичного для генома В) могут быть использованы в качестве молекулярно-цитогенетических маркеров геномов капустных.
4. Высокоповторяющиеся последовательности ДНК Гу-У-сорю-подобных ретротранспозонов являются эффективными молекулярно-
цитогенетическими маркерами для изучения организации геномов растений. Показано, что у томата ретротранспозоны локализованы в прицентромерных гетерохроматиновых регионах хромосом. Подтверждена эффективность использования пахитенных хромосом томата для такого анализа. Прицентромерная локализация ретротранспозонов указывает на невысокую эффективность ДНК маркеров создаваемых на их основе для маркирования хозяйственно-ценных признаков томата. В тоже время для растений с крупными геномами (лилии, крокусы, тюльпаны и лук) показано равномерное распределение Ту-У-сор/д-подобных ретротранспозонов, за исключением С-бэндинг положительных регионов хромосом, где они не выявляются.
5. Клонирована высокоповторяющаяся последовательность ДНК хмеля -размером 378 п.о., которая является эффективным цитогенетическим маркером для идентификации половых хромосом хмеля. С помощью FISH анализа показана субтеломерная локализация этой последовательности на аутосомах. Для X и Y хромосом выявлено характерное распределение сайтов гибридизации. Поиск в геномных базах данных не выявил гомологий с ранее клонированными последовательностями ДНК.
6. Установлено, что последовательности генов рибосомной РНК (45S и 5S) являются эффективными цитогенетическими маркерами для идентификации трех из 10 хромосом хмеля с использованием флуоресцентной гибридизации in situ.
7. Выявлен высокий полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК (ISSR) на видовом и межвидовом уровнях у видов Solanum, Humulus lupulus и Rubus. Рекомендован набор ISSR праймеров для анализа исходных родительских и гибридных форм при внутри- и межвидовой гибридизации, а также форм растений с различным уровнем интрогрессии генетического материала. На основе выявленного полиморфизма ISSR-маркеров создана интегрированная генетическая карта межмикросателлитных последовательностей ДНК томата и высокоэффективные ДНК-маркеры для выявления пола у растений хмеля и признака ремонтантности малины.
8. Созданы эффективные SCAR маркеры для выявления пола растений хмеля.
9. Идентифицированые молекулярные маркеры WA-типа ЦМС риса и молекулярные маркеры, тесно сцепленные с геном восстановления фертильности R/4, могут быть использованы в селекционных программах по созданию гибридного риса.
10. Клонированы фрагменты последовательностей генов устойчивости подсолнечника. Установлена их высокая степень гомологии с ранее клонированными генами устойчивости растений.
11. Продемонстрирована высокая эффективность сравнительного анализа локусов генов устойчивости устойчивых и неустойчивых генотипов растений для создания надежных ДНК-маркеров. Сравнительный анализ
ДНК последовательностей показал высокую степень гомологии меаду нуклеотидными последовательностями локусов Ve и 12 у устойчивых и неустойчивых генотипов томата. У аллеля /2 неустойчивого генотипа S.tycopersicum выявлены последовательность, имеющая высокую степень гомологии к гену I2C-5, и ранее неизвестная последовательность ДНК, гомологичная гену 12 S. pimpinellifolium. Создан ДНК маркер гена устойчивости к фузариозному увяданию томата. Выявлен полиморфизм по сайту рестрикции рестриктазы Xba I между аллелями гена Ve устойчивых и неустойчивых генотипов и на основании данного полиморфизма создан кодоминантный CAPS-маркер.
12. Установлено наличие Ogura-rana ЦМС, возникшей в растениях капусты пекинской Brassica pekinensis Jusl, в результате межвидовой гибридизации с турнепсом и капустой абиссинской.
13. Созданные ДНК диагностикумы на гены устойчивости томата - к фузариозу и вертициллезу, хмеля - на определение пола растений, риса -на ЦМС и ген восстановления фертильности, и оптимизированые условия применения ДНК-маркеров на гены устойчивости томата к нематоде, ВТМ, кладоспориозу позволяют в значительно мере (в два раза) ускорять селекционный процесс по вышеуказанным генам.
14. Предложенью оптимальные высокопроизводительные методики выделения ДНК позволяют проводить массовый скрининг селекционного материала.
15. Разработаные методы и схемы высокопроизводительной оценки на наличие хозяйственно-ценных признаков в исходном селекционном материале с помощью ДНК-технологий дают возможность создавать перспективные формы томата, сочетающие несколько генов устойчивости к болезням и вредителям в одном генотипе, в частности в созданном коммерческом гибриде Fi Албаши.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
1. Karlov G.I., Khrustaleva L.I., Lim К.В., Tuyl J.M.van. Homoeologous recombination in 2n-gametes producing interspecific hybrids of Lilium (Liliaceae) studied by genomic in situ hybridization (GISH).// Genome, 1999, Vol.42,N 4. - P. 681-686.
2. Karlov G.I., G.N.Andreeva, I.A. Fesenko, L.I. Khrustaleva Characterization and chromosome location of Tyl-copia group retretransposons in some Alliaceae, Liliaceae and Iridaceae species.// Cytogenetics and Cell Genetics, 1999, v.85,1-2. P.135.
3. Lim, K.B., van Tuyl, J.M., Khrustaleva, L.I., Karlov, G.I. and de Jong, J.H.. INTROGRESSION OF INTERSPECIFIC HYBRIDS OF LILY USING GENOMIC IN SITU HYBRIDIZATION (GISH).// Acta Hort. (ISHS) 2000,508:105-112
4. Karlov G. I., Babina D. V., Tikunov Y. M., Khrustaleva L. I. Chromosome organization of Tyl-copia-like retrotransposons in tomato.// Abs. of Fifth International Solanaceae Conference. Botanical Garden of the University of Nijmegen, 2000, p. 40 - 42.
5. Карлов Г.И., Андреева Г.Н., Хрусталева Л.И. Характеристика линии тритикале, несущей пшенично-ржаную транслокацию. С.-х. биотехнология. - М„ 2000; Т.1. - С. 39-43.
6. Карлов Г.И., Хрусталева Л.И., van Tuyl J.M. Использование геномной in situ гибридизации для изучения гомеологичной рекомбинации в межвидовых гибридах лилий, формирующих 2п-гаметы. С.-х. биотехнология. - М., 2000; Т.1. - С. 44-52.
7. Андреева Г.Н., Карлов Г.И., Семенов О.Г., Мохаммед Резаул Карим Характеристика аллоцитоплазматических форм яровой пшеницы Т. aestivum на цитоплазме Seeale cereale с использованием методов геномной in situ гибридизации и белковых маркеров. С.-х. биотехнология. - М., 2000; Т.1. - С. 53-58.
8. Тикунов Ю.М., Андреева Г.Н., Карлов Г.И. Использование межмикросателлитного полиморфизма ДНК для идентификации сортов и видов томата. Междунар.науч.-практ.конф."Селекция и семеноводство овощных культур в XXI в.":[Материалы]. - М., 2000; Т.2. - С. 238.
9. Иванова C.B., Долгодворова Л.И., Карлов Г.И., Кучковская Е.В. Морфометрическая и цитогенетическая характеристика гаплоидов томата// Генетика, 2000, т.36, № 1. - с. 52-61.
Ю.Данилова Т.В., Карлов Г.И. Физическая локализация 45S- и 5S-рибосомной ДНК на хромосомах хмеля обыкновенного (Humulus lupulus L.). Материалы конференции Памяти Грегора Менделя. - М., 2001. - С. 32.
11.Тикунов Ю.М., Хрусталева Л.И., Андреева Г.Н., Карлов Г.И. Полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК культурного и диких видов томата. С.-х. биотехнология. - М., 2001; Т.2. -С. 27-40.
12.Данилова Т.В., Тикунов Ю.М., Weber G., Карлов Г.И. Молекулярное маркирование пола у хмеля (Humulus lupulus L.) с использованием ISSR-ПЦР. С.-х. биотехнология. - М., 2001; Т.2. - С. 47-54.
13.Тикунов Ю.М., Хрусталева Л.И., Андреева Г.Н., Карлов Г.И. Изучение межмикросателлитного полиморфизма ДНК видов томата. Материалы конференции Памяти Грегора Менделя. - М., 2001. - С. 136.
14.Соловьев A.A., Кирюхова О.Б., Карлов Г.И., Андреева Г.Н., Комахин P.A., Бабина Д.В. Выделение и цитологическая характеристика моносомно дополненной линии культурного томата со 2-й гомеологичной хромосомой Solanum lycopersicoides. С.-х. биотехнология. - М., 2001; Т.2. -С. 61-67.
15.Фесенко И.А., Хрусталева Л.И., Карлов Г.И. Изучение организации сателлитного повтора 378 пн в терминальном гетерохроматине Allium fistulosum. Генетика, 2002, т.38, № 7. - с. 894-903.
16.Тикунов Ю.М., Данилова Т.В., Хрусталева Л.И., Андреева Г.Н., Карлов Г.И. Изучение полиморфизма межмикросателлитных последовательностей (ISSR) геномной ДНК различных организмов. Материалы науч.генет.конф.,посвящ.100-летию со дня рождения А.Р.Жебрака и 70-летию образования кафедр генетики в Моск.с.-х.акад.им.К.А.Тимирязева. - М., 2002. - С. 316-317.
17.Фесенко И.А., Хрусталева Л.И., Карлов Г.И. Использование оптического картирования для изучения структуры генома лука-батуна. Материалы науч.генет.конф.,посвящ. 100-летию со дня рождения А.Р.Жебрака и 70-летию образования кафедр генетики в Моск.с.-х.акад.им.К.А.Тимирязева. - М., 2002. - С. 336-337.
18.Карлов Г.И., Фесенко И.А., Андреева Г.Н., Тикунов Ю.М., Хрусталева Л.И. Изучение физической организации Tyl-copia и Ty3-gypsy подобных ретротранспозонов в геноме томата, лука, тюльпана и крокуса Материалы науч.генет.конф.,посвящ. 100-летию со дня рождения А.Р.Жебрака и 70-летию образования кафедр генетики в Моск.с,-х.акад.им.К.А.Тимирязева. - М., 2002. - С. 136.
19.Shevelukha V.S., Kuklev M.Y., Karlov G.I. Cloning and characterization of Nbs-Lrr class resistance-gene analogs sequences in sunflower.// Acta agriculturae Serbica, 2003, vol. 8, iss. 15, pp. 3-9.
20.Tikunov Yu. M., Khrustaleva L. I., Karlov G. I. Application of ISSR markers in the genus Lycopersicon.// Euphytica. 2003, v.131, № 1, pp. 7181.
21.Karlov G.I., Danilova T.V., Horlemann C., Weber G. Molecular cytogenetics in hop (Humulus lupulus L.) and identification of sex chromosomes by DAPl-banding.// Euphytica, 2003, v. 132, № 2, pp.185190.
22.Данилова T.B., Карлов Г.И. Возможности использования ISSR-ПЦР-анализа в селекции хмеля обыкновенного (Humulus lupulus £.). Актуал.пробл.генетики. - М., 2003; Т.2. - С. 115-117.
23 .Danilova T.V., G.I. Karlov ISSR polymorphism in hop.// Proceedings of the Scientific Commission International Hop Growers' Convention I.H.G.C. Ed. Elisabeth Seigner. 2003. P.87-91.123c.
24.Данилова T.B., Данилов C.C., Карлов Г.И. Исследование молекулярно-генетического полиморфизма сортов хмеля обыкновенного (Humulus lupulus L.) с использованием ISSR-ПЦР-анализа.//Генетика, 2003, т.39, № 11. - с. 1484-1489.
25.Тикунов Ю.М., Хрусталева Л.И., Карлов Г.И., van Heusden A.W. Изучение генетической и физической организации микросателлитов (SSRs) и межмикросателлитных последовательностей (ISSRs) в геноме томата Актуал. пробл. генетики. - М., 2003; Т.2. - С. 230-231.
26.Kuklev M.Y., I.A. Fesenko, G.I. Karlov Fluorescence targeting of Verticillium dahliae resistance gene (Ve) in tomato with molecular beacons. Abstracts of Proceedings of the 4th International Iran and Russian Conference in Agriculture and Natural Resources. 2004, P. 94-95.
27.Ahmadikhah A., V.S. Shevelukha, G.I. Karlov The study of inheritance of fertility restoration in CMS-WA system. Abstracts of Proceedings of the 4th International Iran and Russian Conference in Agriculture and Natural Resources. 2004, P. 95-96.
28.Amini J, I.A. Fesenko, G.I. Karlov Comparison of SCAR PCR and artificial inoculation with the disease-causing agent for determination resistance to Fusarium wilt of tomato. Abstracts of Proceedings of the 4th International Iran and Russian Conference in Agriculture and Natural Resources. 2004, P. 4.
29.Soloviev A.A., Karlov G.I., Divashuk M.G., Bazaleev N.A. Morphological and cytogenetic characterization of translocated spring triticale line 131/7. Acta agriculturae Serbica, 2005, vol, 10, iss. 19, pp. 17-23.
30.Ahmadikhah A., Karlov G. I. Molecular mapping of the fertility-restoration gene Rf4 for WA-cytoplasmic male sterility in rice. Plant Breeding, 2006, Vol. 125, Issue 4. - P. 363-367.
31.Куклев М.Ю., Фесенко И.А., Карлов Г.И. Разработка флуоресцентной тест-системы для выявления устойчивых к вертициллезу форм томата. / Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии, 2006; №4. - С. 115-119.
32.Соболев В.В., Карлов Г.И., Соболева А.Г., Озеровский А.В., Казаков И.В., Феськов А.А. Использование ISSR-маркеров для молекулярно-генетической идентификации и паспортизации сортов малины.// С.-х.биология. Сер.Биология растений, 2006, №5. - С. 48-52.
33.DaniIova T. V., Karlov G. I. Application of inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism for detection of sex-specific molecular markers in hop (Humulus lupulus L.).// Euphytica, 2006, vol. 151, Issue 1, p. 15-21.
34.Ахмадихах А., Шевелуха B.C., Карлов Г.И. Картирование локусов количественных признаков (QTL), контролирующих восстановление фертильности у риса в стрессовых условиях внешней среды.// Докл. ТСХА / Рос. гос. аграр. ун-т - МСХА им. К.А. Тимирязева. Москва, 2006; Вып. 278. - С. 57-65.
35.Pankin A.A., Chèvre A.M., Karlov G.I., Khavkin E.E. A suite of DNA markers for Brassica genome В. XV Federation of European Societies of Plant Biology (FESPB) Congress. 2006. Lyon, France.
36.Данилова T.B., Куклев М.Ю., Андреева Г.Н., Шевелуха B.C., Карлов Г.И. Клонирование и анализ фрагментов последовательностей генов устойчивости подсолнечника остролистного Helianthus argophyllus.ll Генетика, 2007, т.43, № 4. - с. 482-488.
37.Дивашук М.Г., Карлов Г.И., Соловьев А.А. Использование микросателлитных маркеров для идентификации пшенично-ржаной транслокации у гексаплоидной тритикале. // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии, 2007, № 1. - С. 61-65.
38.Фесенко И.А., Куклев М.Ю., Карлов Г.И. Создание ДНК-маркера гена устойчивости томата к фузариозному увяданию. // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии, 2007, № 1. - С. 66-72.
39.Байназарова А.Н., Карлов Г.И., Хрусгалева Л.И. Изучение полиморфизма генома огурца посевного (Cucumis sativus L.) с помощью ISSR-маркеров. / Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии, 2007, № 1. - С. 56-60.
40.Ahmadikhah A., Karlov G.I., Nematzadeh Gh., Ghasemi Bezdi К. Inheritance of the fertility restoration and genotyping of rice lines at the restoring fertility (Rf) loci using molecular markers.// International Journal of Plant Production, 2007, Vol.1, Issuel, P.13-21.
41.Баназарова A.H., Карлов Г.И., Хрусталева Л.И. Маркирование гена устойчивости огурца к мучнисто росе. Материалы Международной конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяства», 27 - 28 ноября 2007 г. М.: ФГОУ ВПО РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, 2007. - С. 138 - 139.
42.Карлов Г.И. ДНК-маркеры в селекции овощных культур. Материалы Международной конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова -фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяства», 27 -28 ноября 2007 г. М.: ФГОУ ВПО РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, 2007.-С. 140-141.
43.Дивашук М.Г., Александров О.С., Карлов Г.И. Клонирование и анализ субтеломерного повтора ДНК хмеля (Hamulus lupulus). Материалы Международной конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова -фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяства», 27 -28 ноября 2007 г. М.: ФГОУ ВПО РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, 2007.-С.163-164.
44.Дивашук М.Г., Крупин П.Ю., Соловьев A.A., Карлов Г.И. Оптимизация метода последовательного применения дифференциального окрашивания и геномной in situ гибридизации для идентификации транслокаций в геноме тритикале. Материалы Международной конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяства», 27 - 28 ноября 2007 г. М.: ФГОУ ВПО РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, 2007. - С. 164 - 166.
45.Панкин A.A., Шевре A.M., Дивашук М.Г., Карлов Г.И., Хавкин Э.Е. ДНК маркеры генома В в растениях Brassica. Вторая Вавиловская международная конференция «Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке: состояние, проблемы, перспективы». 2007. Санкт-Петербург, Россия.
46.Pankin A.A., Khavkin Е.Е., Chèvre A.M., Divashuk M.G., Karlov G.I. A Suite of SCAR Markers for Brassica Genomes and Its Individual Chromosomes. International Conference "Molecular Mapping and Marker Assisted Selection in Plants". 2008. Vienna, Austria.
47.Куклев М.Ю., Фесенко И.А., Карлов Г.И. ДНК-маркирование локуса устойчивости томата к вертициллезному увяданию. // Труды Института биоресурсов и прикладной экологии / Оренб. гос. пед. ун-т, 2008; в.7. - С. 139-140
48.Фесенко И.А., Хрусталева Л.И., Карлов Г.И. Анализ генома лука батуна (Allium flstulosum) на наличие теломерного повтора (TTAGGG)n // ВЕСТНИК Оренбургского государственного университета, 2008, №87, с. 145-152.
49.Соболев В.В., Соболева А.Г., Андреева Г.Н., Карлов Г.И. Оценка межвидового и межсортового полиморфизма малины и маркирование признака ремонтантности с использованием ISSR-ПЦР анализа. / Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии 2009, №. 2, с. 103-109.
50.Климушнна М.В., Дивашук М.Г., Карлов Г.И. Молекулярно-генетическая характеристика коллекции мягкой пшеницы по генам, отвечающим за хлебопекарные и технологические качества муки. / Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии 2009, №3, с.81-88.
51.Крупин П.Ю., Дивашук М.Г., Хомякова О.В., Дьячук Т.И., Карлов Г.И. Молекулярно-цитогенетическая характеристика первичных тритикале, межамфиплоидного гибрида и перспективных линий селекции НИИСХ Юго-Востока/ Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии, 2009, №3, с. 74-88.
52.Куклев М.Ю., Фесенко И.А., Карлов Г.И. Разработка CAPS-маркера локуса устойчивости томата к вертицилезному увяданию.// Генетика, 2009, т.45, №5, с.656-661.
53.Дивашук М.Г., Крупин П.Ю., Соловьев A.A., Карлов Г.И. Молекулярно-цитогенетическая характеристика линии яровой тритикале 131/7, несущей ржано-пшеничную транслокацию//Генетика, 2010, т. 46, № 2, с. 211-217.
54.Дивашук М.Г., Соловьев A.A., Карлов Г.И. Влияние отбора по фенотипическпм признакам на хромосомную конституцию яровой тритикале// Генетика, 2010, т. 46, № 3, с. 383-388.
55.Карлов Г.И., Фесенко И.А., Андреева Г.Н., Хрусталева Л.И. Хромосомная организация Tyl-copia-подобных ретротранспозонов в геноме томата// Генетика, 2010, т.46, №6, с. 769-773.
Патенты и авторские свидетельства
56.Патент на изобретение №2272840: «Способ молекулярного маркирования пола хмеля обыкновенного (Humulus lupulus L.). Авторы: Данилова Т.В., Карлов Г.И. / 2006 г.
57.Авторское свидетельство №41985: Томат Албаши. Авторы Амчевская Е.В., Волок O.A., Гавриш С.Ф., Карлов Г.И., Морев В.В., Нестерович А.Н. /2007 г.
Публикации в глобальной электронной базе данных генбанков
58.EMBL-European Bioinformatics Institute [Электронный ресурс]: EMBL Nucleotide Sequence Database (A/N: AJ964871-86 - "Identification of resistance gene analogues using PCR with degenerate oligonucleotide primers
in Helianthus argophyllus")/ Danilova,T.V.; Andreeva,G.N.; Kuklev,M.U.; Karlov,G.I..;. - Электрон, дан. - EMBL Nucleotide Sequence Database (EBI), Hinxton, UK, 2005. - Режим доступа: http://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/sva/sva.pl?query=AJ964886&search=Go&snapshot=, свободный.
59.EMBL-European Bioinformatics Institute [Электронный ресурс]: EMBL Nucleotide Sequence Database (A/N: DQ781408 - "Gene fragment of the candidate fertility restoring gene RflB") /Ahmadikhah A., Karlov G.I.;. -Электрон, дан. - EMBL Nucleotide Sequence Database (EBI), Hinxton, UK, 2006. - Режим доступа: http://srs.ebi.ac.uk/srsbin/cgi-bin/wgetz ?-e+[EMBL: DQ781408]+-newld, свободный.
60.EMBL-European Bioinformatics Institute [Электронный ресурс]: EMBL Nucleotide Sequence Database (A/N: DQ781409 - "Gene fragment of the candidate fertility restoring gene RflB") /Ahmadikhah A., Karlov G.I.;. -Электрон, дан. - EMBL Nucleotide Sequence Database (EBI), Hinxton, UK, 2006. - Режим доступа: http://srs.ebi.ac.uk/srsbin/cgi-bin/wgetz ?-e+[EMBL: DQ781409]+-newId, свободный
61.EMBL-European Bioinformatics Institute [Электронный ресурс]: EMBL Nucleotide Sequence Database (A/N: DQ781410 - "Gene fragment of the candidate fertility restoring gene RflB") /Ahmadikhah A., Karlov G.I.;. -Электрон, дан. - EMBL Nucleotide Sequence Database (EBI), Hinxton, UK, 2006. - Режим доступа: http://srs.ebi.ac.uk/srsbin/cgi-bin/wgetz ?-e+[EMBL: DQ7 81410]+-newId, свободный
62.EMBL-European Bioinformatics Institute [Электронный ресурс]: EMBL Nucleotide Sequence Database (A/N: DQ778740 - "Development of SCAR markers for identification of CMS and maintainer lines RT in rice") /Ahmadikhah A., Karlov G.I.;. - Электрон, дан. - EMBL Nucleotide Sequence Database (EBI), Hinxton, UK, 2006. - Режим доступа: http://srs.ebi.ac.uk/srsbin/cgi-bin/wgetz ?-e+[EMBL: DQ778740]+-newId, свободный.
63.EMBL-European Bioinformatics Institute [Электронный ресурс]: EMBL Nucleotide Sequence Database (A/N: DQ858156- " The candidate gene for the fertility restoration of WA CMS in rice") /Ahmadikhah A., Karlov G.I.;. -Электрон, дан. - EMBL Nucleotide Sequence Database (EBI), Hinxton, UK, 2006. - Режим доступа: http://srs.ebi.ac.uk/srsbin/cgi-bin/wgetz ?-e+[EMBL: DQ858156]+-newId, свободный.
64.EMBL-European Bioinformatics Institute [Электронный ресурс]: EMBL Nucleotide Sequence Database (A/N: DQ683439-41 " Identification and sequencing of RAPD markers linked with CMS in rice") /Ahmadikhah A., Karlov G.I.;. - Электрон, дан. - EMBL Nucleotide Sequence Database (EBI), Hinxton, UK, 2006. - Режим доступа: http://srs.ebi.ac.uk/srsbin/cgi-bin/wgetz ?-e+[EMBL: DQ683439-41]+-newId, свободный.
Подписано к печати 10.09.2010
Формат 60x84/16.
Печать трафаретная
Уч.-изд. л. 3,2
Тираж 100 экз.
Заказ № 476
Отпечатано в издательском центре
ФГОУ ВПО МГАУ
127550, Москва, Тимирязевская, 58
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Карлов, Геннадий Ильич
1.ВВЕДЕНИЕ
II. КРАТКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ПЛ. Молекулярно-цитогенетические методы
II.2. Молекулярно-генетические методы (ДНК маркеры)
II.2.1. RAPD-маркеры
II.2.2. STS-маркеры
II.2.3. SSR-маркеры
II.2.4. ISSR-маркеры
II.2.5.RGA -маркеры
II.2.6. QTL (локусы количественных признаков) маркеры
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
IV. 1. Идентификация родительских геномов и мониторинг чужеродного генетического материала в селекционных программах основанных на использовании отдаленной гибридизации.
IV. 1.1. Молекулярно-цитогенетические методы анализа геномов растений.
IV. 1.1.1.Геномная гибридизация in situ на межвидовых гибридах лилий.
IV. 1.1.2. Совместное использование молекулярно-цитогенетических и молекулярно-генетических методов на примере тритикале и пшеницы.
IV. 1 ^.Конвертирование ДНК-маркеров,в молекулярно-цитогенетические маркеры на примере капустных, хмеля и томата.
IV.1.2.1. Молекулярно-цитогенетическое маркирование генома В капустных с использованием геном-специфичного ДНК маркера.
IV. 1.2.2. Хромосом-специфичные маркеры на примере половых хромосом хмеля.
IV. 1.2.3. Повторяющиеся последовательности как молекулярно-цитогенетические маркеры для изучения их хромосомной организации.
IV. 1.3. Молекулярно-генетические методы анализа геномов растений для идентификации генетического материала у отдаленных гибридов.
IV. 1.3.1. Полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК томата на межвидовом уровне
IV. 1.3.2. Использование ISSR-маркеров для изучения филогенетических связей видов род Lycopersicon
IV. 1.3.3. ISSR-PCR на линиях L. esculentum WSL6 и IL 6-3 с интрогрессиями в хромосоме
IV. 1.3.4. Физическое картирование ISSR-маркеров на линиях L. esculentum WSL6 и IL 6-3 с интрогрессиями
IV.1.3.5. PCR с использованием комбинаций ISSR-праймеров с праймерами для амплификации аналогов генов устойчивости (RGA) растений
IV. 1.3:6. Использование ISSR-маркеров для создания интегрированной генетической карты групп сцепления межмикросателлитных последовательностей ДНК томата
IV. 1.4. ДНК-маркеры для оценки и характеристики исходного материала.
IV. 1.4.1. Межсортовой полиморфизм ISSR-маркеров у хмеля обыкновенного.
IV. 1.4.2. Молекулярно-генетические маркеры для исследования генетического разнообразия и маркирования признаков у малины.
IV. 1.4.3. ISSR полиморфизм огурца.
IV. 1.4.4. Анализ гомологов генов устойчивости к фитопатогенам.
IV.1.4.4.1. Огурец.
IV. 1.4.4.2. Подсолнечник
IV. 1.5. Разработка и создание ДНК маркеров на хозяйственно-ценные признаки для оценки исходного материала и ускорения селекционного процесса.
IV.1.5.1. Маркеры, связанные с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС).
IV. 1.5.1.1. ДНК-маркеры для изучения ЦМС у риса (Oryza sativa).
IV. 1.5.1.2. ДНК-маркеры для изучения ЦМС у Brassica.
IV.1.5.2. Создание ДНК маркеров генов устойчивости на основе данных сравнительного анализа1 нуклеотидных последовательностей устойчивых и неустойчивых генотипов.
IV. 1.5.2.1. Создание ДНК маркера гена устойчивости к фузариозу на основе данных анализа локуса 12 у устойчивых и неустойчивых генотипов томата.
IV. 1.5.2.2. Создание ДНК маркера гена устойчивости к вертициллезу на основе данных анализа локуса Ve у устойчивых и неустойчивых генотипов томата.
IV. 1.5.3. Использование межмикросателлитного полиморфизма для создания ДНК маркеров.
IV. 1.6. Выбор оптимального высокопроиз-водительного метода выделения ДНК.
IV. 1.7. Автоматизация анализов.
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Карлов, Геннадий Ильич
VI. выводы
1. Адаптированная методика геномной in situ гибридизации позволяет идентифицировать геномный состав межвидовых гибридов лилий, получаемых с использованием 2п-гамет. Установлен механизм формирования 2п-гамет основанный на редукции первого деления мейоза (FDR). С использованием разработанного метода многоцветной геномной in situ гибридизации для лилий впервые установлена возможность создания трехгеномных гибридов (2п=36). Показана возможность преодоления стерильности межвидовых гибридов лилий и получения форм с различным геномным составом при использовании образцов формирующих 2п-гаметы.
2. Оптимизированная методика совместного применения дифференциального окрашивания хромосом, геномной гибридизации in situ и ДНК-маркирования, позволяет проводить эффективное выявление межгеномных транслокаций у тритикале.
3. Высокоповторяющиеся геномспецифичные последовательности ДНК на примере GenBR-1 (специфичного для генома В) могут быть использованы в качестве молекулярно-цитогенетических маркеров геномов капустных.
4. Высокоповторяющиеся последовательности ДНК Ty-l-copia-подобшлх ретротранспозонов являются эффективными молекулярно-цитогенетическими маркерами для изучения организации геномов растений. Показано, что у томата ретротранспозоны локализованы в прицентромерных гетерохроматиновых регионах хромосом. Подтверждена эффективность использования пахитенных хромосом томата для такого анализа. Прицентромерная локализация ретротранспозонов указывает на невысокую эффективность ДНК маркеров создаваемых на их основе для маркирования хозяйственно-ценных признаков томата. В тоже время .для растений с крупными геномами (лилии, крокусы, тюльпаны и лук) показано равномерное распределение Ty-1-copia-подобных ретротранспозонов, за исключением С-бэндинг положительных регионов хромосом, где они не выявляются.
5. Клонирована высокоповторяющаяся последовательность ДНК хмеля — размером 378 п.о., которая является эффективным цитогенетическим маркером для идентификации половых хромосом хмеля. С помощью FISH анализа показана субтеломерная локализация этой последовательности на аутосомах. Для X и Y хромосом выявлено характерное распределение сайтов гибридизации. Поиск в геномных базах данных не выявил гомологий с ранее клонированными последовательностями ДНК.
6. Установлено, что последовательности генов рибосомной РНК (45 S и 5S) являются эффективными цитогенетическими маркерами для идентификации трех из 10 хромосом хмеля с использованием флуоресцентной гибридизации in situ.
7. Выявлен высокий полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК (ISSR) на видовом и межвидовом уровнях у видов Solanum, Humulus lupulus и Rubus. Рекомендован набор ISSR праймеров для анализа исходных родительских и гибридных форм при внутри- и межвидовой гибридизации, а также форм растений с различным уровнем интрогрессии генетического материала. На основе выявленного полиморфизма ISSR-маркеров создана интегрированная генетическая карта межмикросателлитных последовательностей ДНК томата и высокоэффективные ДНК-маркеры для выявления пола у растений хмеля и признака ремонтантности малины.
8. Созданы эффективные SCAR маркеры для выявления пола растений хмеля.
9. Идентифицированые молекулярные маркеры WA-типа ЦМС риса и молекулярные маркеры, тесно сцепленные с геном восстановления фертильности Rf4, могут быть использованы в селекционных программах по созданию гибридного риса.
10. Клонированы фрагменты последовательностей генов устойчивости подсолнечника. Установлена их высокая степень гомологии: с ранее клонированными генами устойчивости растений.
11. Продемонстрирована высокая эффективность сравнительного анализа локусов генов устойчивости устойчивых и неустойчивых генотипов растений для создания надежных ДНК-маркеров. Сравнительный анализ ДНК последовательностей показал высокую степень гомологии между нуклеотидными последовательностями локусов Ve и 12 у устойчивых и неустойчивых генотипов томата. У аллеля i2 неустойчивого генотипа. S.lycopersicum выявлены последовательность, имеющая высокую степень гомологии.к ,гену I2G-5, и ранее неизвестная последовательность ДНК, гомологичная гену 12 S. pimpinellifolium. Создан ДНК маркер гена устойчивости к фузариозному увяданию томата. Выявлен полиморфизм по сайту, рестрикции рестриктазы Xba I между аллелями* гена Ve устойчивых и, неустойчивых генотипов и на основании данного полиморфизма создан кодоминантныи CAPS-маркер.
12. Установлено наличие Ogura-типа ЦМС, возникшей в,растениях капусты, пекинской Brassica pekinensis. Jusl, в результате межвидовой гибридизации с турнепсом и капустой абиссинской.
13. Созданные ДНК диагностикумы на гены устойчивости томата - к фузариозу и вертициллезу, хмеля — на определение пола растений, риса — на ЦМС и ген восстановления фертильности, и оптимизированые условия применения ДНК-маркеров на гены устойчивости томата к нематоде, ВТМ, кладоспориозу позволяют в значительно мере (в два раза) ускорять селекционный процесс по вышеуказанным генам.
14. Предложенью оптимальные высокопроизводительные методики выделения ДНК позволяют проводить массовый скрининг селекционного материала.
15. Разработаные методы и схемы высокопроизводительной оценки на наличие хозяйственно-ценных признаков в исходном селекционном материале с помощью ДНК-технологий дают возможность создавать перспективные формы томата, сочетающие несколько генов устойчивости к болезням и вредителям в одном генотипе, в частности в созданном коммерческом гибриде Б] Албаши.
V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
Нами продемонстрированы возможности молекулярно-генетических и молекулярно-цитогенетических подходов для создания селекционного' материала растений с заданными свойствами. Эффективность применения таких методов зависит от каждого конкретного случая и напрямую связана с возможностью ускорения селекционного процесса. Стратегия применения должна основываться на надежности, эффективности, информативности и взаимодополняемости вышеуказанных подходов, а также базироваться на достижениях в геномике и биоинформатике.
В программах с использованием методов отдаленной гибридизации на первых этапах главную роль могут играть современные молекулярно-цитогенетические методы исследований, такие как геномная гибридизация in situ, ПЦР анализ родительских геномов и их гибридов с использованием диспергированных повторяющихся последовательностей ДНК и др. Несмотря на трудоемкость и невысокую производительность таких методов, они позволяют выработать оптимальную стратегию для быстрого и контролируемого переноса генетического материала от диких сородичей в культурные растения. В дальнейшем, при создании сортов и коммерческих гибридов.Fj на первый, план должны выходить молекулярно-генетические подходы, позволяющие быстро, надежно и качественно охарактеризовать селекционный материал на наличие тех или иных хозяйственно-ценных генов. И здесь очень важную роль играет наличие ДНК маркеров тесно-сцепленных с генами, контролирующими эти признаки. Такие маркеры (SCAR, CAPS, SSR) в купе с высокопроизводительными технологиями ДНК анализа (выделение ДНК, ПЦР, RT-PCR) могут значительно ускорить селекционный процесс при создании сортов и коммерческих гибридов Fj с заданными свойствами.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Карлов, Геннадий Ильич, Москва
1. Бадаева Е.Д. Эволюция геномов пшеницы: молекулярно-цитогенетическое исследование. Автореф. дис. . докт. биол. наук. - М., 2000. - 48 с.
2. Борисенко Л.Р., Дмитриева Г.А., Ильяшенко Г.А., Савченко Н.И. Ультраструктурные и функциональные особенности пыльников линий озимой пшеницы с мужской стерильностью. // Цитология и генетика, 1982, Т. 16, №3, с. 30-34.
3. Брежнев Д. Д. Томаты, 2 изд., Л., 1964.
4. Бунин М.С. Новые овощные культуры России. М.: ФГНУ "Росинформагротех", 2002. - 408 с.
5. Гордей И.А. Тритикале: Генетические основы создания. -Минск: Навука i техшка, 1992. — 287 с.
6. Гостимский С. А., Кокаева 3. Г., В. К. Боброва. 1999, Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений.-Генетика, т. 35, №11, 1538 1549.
7. Дмитриева А.Н., Борисенко Л.Р., Савченко Н.И. Биохимические и цитогенетичесьсие особенности 4 цитоплазматической мужской стерильности озимой пшеницы. Киев: Наук, думка, 1983. - с. 119.
8. Дубовец Н.И. Тетраплоидные тритикале — получение и цитологический анализ: Автореф. дис. . канд. биол. наук. — Минск, 1988. -19 с.
9. Дубовец Н.И. Тетраплоидные тритикале как модель для формирования гибридных геномов злаков / 11th EWAC Conference. -Новосибирск, 2000. — С. 45.
10. Дубовец Н.И., Бормотов В.Е. Структурные изменения хромосом пшеницы в кариотипе тетраплоидных тритикале // Докл. АН БССР. 1989. -Т. 33, №12.-С. 1125-1127.
11. Дубовец Н.И., Дымкова Г.В., Соловей JI.A., Штык Т.И., Бормотов В.Е. Реконструкция кариотипа гексаплоидных тритикале путём межгеномных замещений хромосом // Генетика. 1995. - том 31, №10. - С. 1394-1399.
12. Жученко А. А., 1973. Генетика томатов. Кишенёв, «Штиинца».
13. Ключарева М.В. Цитоэмбриологическое исследование новых форм тритикале // Бюллетень Главного ботанического сада. 1982. — Вып. 125. - С.79-82.
14. Кочиева Е. 3. и Т. П. Супрунова. 1999. Идентификация видового и сортового полиморфизма у томатов. Генетика, т. 35, №10, 1386 1389.
15. Крупнов В. А. Генная и цитоплазматическая мужская стерильность растений. М.: Колос. 1973. с. 277.
16. Купцов Н.С. Электронномикроскопическое изучение пыльников разных форм сахарной свёклы в ходе микроспорогенеза и гаметогенеза. / Автореф. дис. канд. наук / К. 1972. с. 17.
17. Малышев С.В., A.B. Войлоков, В.Н. Корзун, А. Бёрнер, H.A. Картель. Картирование генома ржи (Seeale cereale 1.) с помощью молекулярных маркеров // Вестник ВОГиС. 2005. - Том 9, № 4. - С. 473480.
18. Мальцева И.В., Шустин В.Г. Сравнение множественных молекулярных форм некоторых ферментов у риса с ЦМС и фертильных образцов // Тезисы конф. молодых ученых-рисоводов. Краснодар, 1991, с. 22-23.
19. Махалин М.А. Межродовая гибридизация зерновых колосовых культур. -М.: Наука, 1992. 239 с.
20. Махалин М.А. Некоторые теоретические и методические аспекты создания новых высокопродуктивных озимых гибридных гексаплоидных тритикале // Теоретические и практические аспекты отдаленной гибридизации. М.: Наука, 1986. - С. 15-24.
21. Мейстер Г.К. Ржано-пшеничные гибриды. М.: Сельхозгиз, 1936.-С. 5-25.
22. Мошкович A.M., Чеботарь A.A. Рожь. Кишинев: "Штиинца" 1976.-С. 14-27.
23. Оганисян А. С., Кочиева Е. 3. и А. П. Рысков. 1996. Маркирование видов и сортов картофеля с помощью метода RAPD-PCR. Генетика, т. 32, № 448 451.
24. Прокофьева-Бельговская A.A. Гетерохроматические районы хромосом. — М., Наука, 1986. — 431 с.
25. Ралько В.П., Палилова А.Н. Экспрессия генов Rf у линий восстановителей фертильности и ЦМС у озимой пшеницы. // Тезисы докл. второго Всес. совещания по генетике развития. Ташкент, 1990, с. 139-140.
26. Ригин Б.В., Орлова И.Н. Пшенично-ржаные амфидиплоиды. — М.: Колос.-1977.-277 с.
27. Сергеев A.B. Культура тритикале: состояние селекции и перспективы. // Доклады научно-практической конференции "Ученые Нечерноземья развитию сельского хозяйства зоны". - М., 1991. - С. 189196.
28. Соловьев A.A. Изучение формообразовательного процесса при скрещивании некоторых форм тритикале. // Автореферат дисс. . канд. биол. наук. М., 2000. - 16 с.
29. Турбин Н.В., Палилова А.Н., Фомченко Н.С. О механизмах действия генов Rf восстановления фертильности в цитоплазме Т-типа у кукурузы. // Докл. АН СССР. 1983, Т. 272, № 6, с. 1469-1472.
30. Хлесткина Е.К., Салина Е.А., Леонова И.Н., Лайкова Л.И., Коваль С.Ф. Использование RAPD- и SSR-анализа для маркирования генов 5гомеологической группы хромосом мягкой пшеницы // Генетика. — 1999. -Вып. 35.-С. 1349-1357.
31. Хрусталева Л.И. Молекулярная цитогенетика в селекции растений // Известия ТСХА. 2007. - Вып. 1. - С. 61-65.
32. Частная селекция полевых культур. / В.В. Пыльнев и др.; под ред. д-ра биол. наук, проф. В.В. Пыльнева М.: КолосС, 2005. - 551 с.
33. Швырев Ю.В. Новые формы тритикале с геномом D и их совместимость с другими видами: Автореф. дис. . канд. с.-х. наук. -Белгород, 1994.-22 с.
34. Щапова А.И., Кравцова Л.А. Цитогенетика пшенично-ржаных гибридов // Новосибирск: "Наука" Сибирское отделение, 1990. 38 с.
35. Щапова А.И. Кариотипы пшеницы // В сб. Цитогенетика пшеницы и ее гибридов. -М. Наука. 1971. С. 30-56.
36. Щапова А.И., Баутина Т. А. Дифференциальная окраска хромосом ржи и пшенично-ржаного амфиплоида // Изв. СО АН СССР. Сер. Биол. Наук 1974-Вып. 2. - С. 134-136.
37. Щапова А.И., Зарипова 3. Кариологический анализ пшенично-ржаных гексаплоидных гибридов Triticale AABBRR х Taestivum L. AABBDD // С.-х. биология. 1984. -№10. - С.92-94.
38. Щапова А.И., Кравцова Л.А., Потапова Т.А. Селекционно-генетические аспекты цитилогической стабильности и семенной продуктивности пшенично-ржаных замещённых форм и тритикале // Сельскохозяйсвенная биология 1986. -№11. — С. 33-37.
39. Щапова А.И., Силкова О.Г., Кравцова Л.А. Частота передачи хромосом 5А, 5D и 5R через гаметы пшенично ржаных ди-моносомиков // Генетика.-1995.-том 31, № 11.-С. 1529-1533.
40. Agarwal M., Shrivastava N., Padh H. Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences // Plant Cell Reports. 2008. Vol. 27, Issue 4, p. 617-631.
41. Agrios G.N. (1990). Plant Pathology. 3th ed. Academic Press,San Diego, CA. 803p.
42. Ajibade S. R., Weeden N. F., Chite S. M. 2000. Inter simple sequence repeat analysis of genetic relationships in the genus Vigna. Euphytica 111: 47-55.
43. Akagi H, Yokozeki Y, Inagaki A, Nakamura A, Fujimura T (1996) A co-dominant DNA marker closely linked to the rice nuclear restore gene, Rf-1, identified with inter-SSR fingerprinting. Genome 39:1205-1209
44. Akkaya, M.S., R.C. Shoemaker, J.E. Specht, A.A. Bhagwat & P.B. Cregan, 1995. Integration of simple sequence repeat DNA markers into a soybean linkage map. Crop Sci 35:1439-1445.
45. Anamthawat-Jonsson K., Schwarzacher T., Leitch A.R. Discrimination between closely related Triticeae spies using genomic DNA as a probe // Theor. Appl. Genet. 1990. - Vol. 79. - P. 721-728.
46. Anamthawat-Jonsson Molecular cytogenetics of introgressive hybridization in plants // Methods in Cell Sci. 2001. - Vol. 23. - P. 139-148.
47. Apolinarska B. Cytogenetical analysis in F3 generation of hybrid hexaploid triticale x substitution lines // Zeszyty Naukowe Akademii Rolniczej w Szczecicie. -1994. -№162. -P.3-8.
48. Apolinarska B. Different chromosome combinations in tetra- and hexaploid level from hybrids of tetraploid rye x tetraploid triticale // Triticale: Today and Tomorrow. 1996. - P. 179-182.
49. Arcade, A., Anselin, F., Faivre Rampant, P., Lesage, M.C., L. E. Paques & D. Prat, 2000. Application of AFLP, RAPD and ISSR markers to genetic mapping of European and Japanese Larch. Theor Appl Genet 100: 299 -307.
50. Arens, P., Odinot, P., Van Heusden, A.W., P. Lindout & B. Vosman, 1995. GATA- and GACA-repeats are not evenly distributed throughout the tomato genome. Genome 38: 84 90.
51. Areshchenkova, T. & M. W. Ganal, 1999. Long tomato microsatellites are predominantly associated with centromeric regions. Genome 42: 536-544'.
52. Areshchenkova, T. and M. W. Ganal, 2002. Comparative analysis of polymorphism and chromosomal location of tomato microsatellite markers isolated from different sources. Theor Appl Genet 104:229-235.
53. Armstrong K.C. N-banding in Triticum aestivum following Feulgen hydrolysis // Theor. Appl. Genet. 1982. - Vol. 61. - P. 337-339.
54. Attempts to Transfer Russian Wheat Aphid Resistance from a Rye Chromosome in Russian Triticales to Wheat / Lukaszewski A. J., D. R. Porter, C. A. Baker, K. Rybka, B. Lapinski. // Crop Sci. 2001. - Vol.41. - P. 1743-1749.
55. Ayres, N.M., P.D. McClung, P.D. Larkin, H.F.J. Bligh, C.A. Jones & W. Park, 1997. Microsatellites and a single-nucleotide polymorphism differentiate apparent amylose classes in an extended pedigree of US rice germplasm. Theor Appl Genet 94: 773-781.
56. Bachman, M., J. Tarmilonis, A. Bent & C. Nickell, 1999. Identification of SSR markers linked to brown stem rot resistance in soybean. In: International Plant & Animal Genome VII Conference: Abstract P242, 17th-21st Jan., 1999, San Diego, CA.
57. Badaev N.S., Badaeva N.D., Bolsheva N.L., Zelenin A.V. Cytogenetical analysis of forms produced by crossing hexaploid triticale with common wheat// Theor. Appl. Genet. 1985. - Vol.70 - P.536-541.
58. Baker B.,; Zambryski P., Staskawicz B. and S.P. Dinesh-Kumar, 1997. Signaling in plant-microbe interactions. Science 276:726 733.
59. Balatero H.C., Darvey N. Influence of selected wheat and rye genotypes on the direct synthesis of hexaploid triticale // Euphytica. 1993. -Vol.66.-P.179-185.
60. Becker J., Heun M. Barley microsatellites: allele- variation and mapping // Plant Mol. Biol. 1995 - Vol. 27. - P: 835-845.
61. Becker, J. & M. Heun; 1995a. Barley microstellites: allele variation and mapping. Plant Molecular Biology.27: 835r845.
62. Becker, J. & M. Heun, 1995b. Mapping of digested and undigested-random amplified microsatellite polymorphisms in barley. Genome 38: 991-998:
63. Beckman, C.H., ed (1987). The Nature of Wilt Diseases of Plants. (St. Paul, MN: American Phytopathological Society).
64. Beckmann, J.S. & M. Soller, 1990. Toward a unified approach to genetic mapping of eukaryotes based, on, sequence tagged microsatellite sites:. Biotechnology 8: 930-932.
65. Bell, C. J. & J. R. Ecker, 1994. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics 19: 137 — 144.
66. Bellaoui M., Grelon M., Pelletier G., Budar F. The restorer Rf0 gene acts post-translationally on, the stability of the ORF138 Ogura GMS-associated protein in reproductive tissues of rapeseed cybrids. // Plant Mol Bio, 1999, Vol. 40, p. 893-902.
67. Benabdelmouna A., Peltier D., Humbert G. and M. Abirached-Darmency, 1999. Southern and fluorescence in situ hybridization detected three RAPD-generated PCR products useful as introgression markers in Petunia. Theor Appl Genet 98:10-17.
68. Bennett M.D. Heterochromatin, aberrant endosperm nuclei and grain shriveling in wheat-rye genotypes // Heredity — 1977 — Vol. 39. — P. 411-419.
69. BennettM.D., Kaltsikes P.J. The duration of meiosis in a diploid rye a tetraploid wheat and wheat and the hexaploid triticale derived from then.// Can. J. Genet. Cytol. 1973. — Vol.15, №4. -P. 453-460". . .
70. Bennett M.Dl, Smith J.B. Confirmation of the identification of the rye chromosome in-1B/1R wheat-rye chromosome substitution and translocation lines // Can; J. Genet. Cytol. 1975. - Vol. 17. - P. 117-120.
71. Bernardo A., Garcia M., Jouve N. The effect of Secale cereale L. heterochromatin on wheat chromosome pairing // Genetica. — 1988. Vol.77. -P.89-95.
72. Bernatzky R., S.D. Tanksley. Toward a saturated linkage map in tomato based on isozyme and random cDNA sequences // Genetics. 1986. - Vol. 112.-P. 887-898.
73. Beyermam, B., P. Nurnberg, A. Weihe, M. Mexiner, J.T. Epplen & T. Borner, 1992. Fingerprinting plant genomes with oligo-nucleotide probes specific for simple repetitive sequences. Theor Appl Genet 83: 691-694.
74. Bietz J.A. Genetic and biochemical studies of nonenzymaticendosperm proteins // E.G. Heyne (ed.) Wheat and Wheat Improvement. ASA, Madison WI. 1987. -P: 215-241.
75. Blair, M.W. & S.R. McCouch, 1997. Microsatellite and sequence-tagged' site markers diagnostic for the rice bacterial leaf blight resistance gene xa-5. Theor Appl Genet 95: 174-184.
76. Blake T.K., Kadirzhanova D., Shepherd K.W., Islam A.K.M.R., Langridge P.L, McDonald C.L, Erpedling J., Larson S., Blake N.K., Talbert LE. STS-PCR markers appropriate for wheat-barley introgression // Theor. Appl. Genet. 1996. - Vol. 93. - P. 826-832.
77. Bligh, H.F.J., R.I. Till & C.A. Jones, 1995. A microsatellite sequence closely linked to the Waxy gene of Oryza sativa. Euphytica 86: 83-85.
78. Bohn M., Utz H. F., Melchinger A. E. Genetic similarities among winter wheat cultivars determined on the basis of RFLPs, AFLPs and SSRs and their use for predicting progeny variance. Crop Sci 39:228-237.
79. Bonhomme S., Budar F., Ferault M., Pelletier G. A 2.5 kb Ncol fragment of Ogura radish mitochondrial DNA is correlated with cytoplasmic male-sterility in Brassica cybrids. // Curr. Genet., 1991, Vol.19, p. 121-127.
80. Bournival, B.L., Vallejos, C.E., and Scott, J.W. (1990). Genetic analysis of resistances to races 1 and 2 of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici from the wild tomato Lycopersicon pennellii. Theor. Appl. Genet. 79, 641-645.
81. Bowcock AM, Ruiz-Lineares A, Tonfohrde J, Minch E, Kidd JR, Cavalli-Sforza LL (1994) High resolution of human evolutionary trees with polymorphic microsatellites. Nature 368:455-457
82. Braun C.J. Siedow J.N. Williams M.E. Levings C.S.D. (1989) Mutations in the maize mitochondrial T-urfl3 gene eliminate sensitivity to a fungal pathotoxin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4435-4439.
83. Brinkmann B, Klintschar M, Neuhuber F, Huhne J, Rolf B (1998) Mutation rate in human microsatellites: influence of the structure and length of the tandem repeat. Am J Hum Genet 62:1408-1415
84. Brondani, R. P. V, Brondani, C., R. Tarchini & D. Grattapaglia, 1998. Development, characterization and mapping of microsatellite markers in Eucalyptus grandis and E. urophylla. Theor Appl Genet 97: 816 827.
85. Brondani, C., P. Vianello, B. Rosana & M.E. Ferreira, 1999. Conservation of SSR loci in wild and cultivated Oryza species. In: International Plant & Animal Genome VII Conference: Abstract P452, 17th-21st Jan., 1999, San Diego, CA.
86. Brosch G., Ransom R., Lechner T., Walton J.D., Loidl P. (1995) Inhibition of maize histone deacetylases by HG toxin, the host-selective toxin of Cochliobolus carbonum. Plant Cell 7: 1941-1950;
87. Broun; P. & S. D. Tanksley, 1996. Characterization and, genetic mapping in simple sequence repeats in the tomato genome. Mol Gen Genet 250: 39-49.
88. Brown G.G., Domaj M., DuPauw M. Molecular analysis of Brassica CMS and its application to hybrid seed production. Proc. // Int. Symp. on Brassicas, 1998, p. 265-274.
89. Brown S.M., Szewc-McFadden A.K., Kresovich S. Development and application of simple sequence repeat (SSR) loci for plant genome analysis // Methods of plant genome analysis of plants (Ed. Jauhar P.P.), New York. CRC. — 1996.-P. 147-162.
90. Bruehl G. W 1987. Soilbome Plant Pathogens. Macmillan Publishing Company, London. 368p;
91. Brunei D. 1994. A microsatellite marker in Helianthus annuus L. Plant Mol Biol 24(2): 397-400.
92. Bryan, G.J., A.J. Collins, P. Stephenson, A. Orry, J.B. Smith & M.D. Gale, 1997. Isolation and characterization ofmicrosatellites from hexaploid wheat. Theor Appl Genet 94: 557-563.
93. Budak H., P.S. Baenziger, B.S. Beecher, R.A. Graybosch, B.T. Campbell, M.J. Shipman, M. Erayman, K.M. Eskridge. The effect of introgressions of wheat D-genome chromosomes into 'Presto' triticale // Euphytica. 2004. - Vol. 137. - P. 261-270.
94. Budar F., Touzet P., De Paepe R. The nucleo-mitochondrial conflict in cytoplasmic male sterilities revisited. // Genetica, 2003, Vol.117, p. 3-16.
95. Burr B., F.A. Burr. Recombinant inbreds for molecular mapping in maize: theoretical and practical considerations // Trends Genet. — 1991. — Vol. 7. — P. 55-60.
96. Callen, D.F„ A.D. Thompson, Y. Shen, H.A. Phillips, R.I. Richards, J.C. Mulley & G.R. Sutherland, 1993. Incidence and origin of "null" alleles in the (AC)n microsatellite markers. Am J Hum Genet 52:922-927.
97. Caranta, C., Palloix, A., Lefebvre, V., and Daubeze. A.M. 1997. QTLs for a component of partial resistance to cucumber mosaic virus in pepper: Restriction of virus installation in host-cells. Theor. Appl. Genet. 94: 431-438.
98. Casacuberta J. M., Santiago N. Plant LTR-retrotransposons and MITEs: control of transposition and impact on the evolution of plant genes and genomes // Gene. 2003. V. 311, p: 1-11.
99. Cecikc G., Battey N. H. and M. J. Wilkinson. 2001. The potencial of ISSR-PCR primer-pair combination for genetic linkage analysis using the seasonal flowering locus in Fragaria as a model. Theor Appl Genet 103:540-564
100. Cermeño M.C., Lacadena J.R. Spatial arrangement analysis of wheat and rye genomes in triticale interphase nuclei by gamma-radiation induced chromosomal interchanges // Heredity. 1983. - Vol. 51 (1). - P. 377-381.
101. Characterization of recombinant hexaploid triticale with improved baking quality / Hohmann U., Zoller J., Robbelen G.,Herrmann R.G., Kazman M.E. // Proceeding 4 International Triticale Symposium, Red Deer, Alberta, Canada. 1998. - Vol.1. -P. 208-217.
102. Charleen M. M., Robert G. B. Chromosome Preparation and Banding // Encyclopedia Of Life Sciences, Nature Publishing Group. 2001. - P. 1-7.
103. Charlesworth B, Morgan MT, Charlesworth D (1993) The effect of deleterious mutations on neutral molecular variation. Genetics 134:1289-1303
104. Charters, Y.M., A. Robertson; MJ. Wilinkson & G. Ramsay, 1996. PCR analysis of oilseed rape cultivars (Brassica napus L. ssp. oleifera) using 5f-anchored simple sequence repeat (SSR) primers. Theor Appl Genet 92: 442-447.
105. Chen, X.S., Y. Temnykh, Y. Xu, Y.G. Cho & S.R. McCouch, 1997. Development of microsatellite map providing genome-wide coverage in rice (Oryza sativa L.). Theor Appl Genet 95:553-567.
106. Cho, Y.G., McCouch, S.R., Kuiper, M., Kang, M.R., Pot, J., Groenen, J.T.M., and Eun, M.Y. 1998. Integrated map of AFLP. SSLP and RFLP markers using a recombinant inbred population of rice (Oryza saliva L). Theor. Appl. Genet. 97: 370-380.
107. Cifarelli, R.A., M. Gallitelli & F. Celliini. 1995. Random amplified hybridization, microsatellites (RAHM): isolation of a new class of microsatellite-containing DNA clones. Nucl Acids Res 23:3802-3803.
108. Cirulli M (ed) (1981) Pathobiology of Verticillium species. Mediterranean Phytopathological Union, Firenze, Italy:
109. Cox, R and S. M. Mirkin. 1997. Characteristics enrichment of DNA repeats in different genomes. Proc. Natl; Acad! Sci. 94:5237-5242.
110. Cregan, P.B., T. Jarvik, A.L. Bush, R.C. Shoemaker, K.G. Lark, A.I. Kahler, N. Kaya, T.T. VanToai, D.G. Lohnes, J. Chung & J. Specht, 1999. An integrated genetic linkage map of the soybean genome. Crop Sci 39: 1464-1490:
111. Cuadrado,. A. & T. Schwarzacher, 1998. The chromosomal organization of sequence repeats in wheat and,rye genomes. Chromosoma 107: 587-594.
112. Dangl J.L., Dietrich R.A. and Richberg M.H. (1996) Death don't have no mercy: cell death programs in plant-microbe interactions. Plant Cell 8: 1793-1807.
113. Darvey N.L., Gustafson J;P. Identification of rye chromosomes in wheat-rye addition lines and triticale by heterochromatini bands // Crop Science.— 1975.-Vol.15.-P.23 9-243.
114. Darvey N.L., Larter E.N. Monosomic segregation in hexaploid triticale cv Rosner // Eur. Wheat Aneuploid News. 1973. — №4 - P.70-76.
115. Delaney T.P. (1997) Genetic dissection of acquired resistance to disease. Plant Phys 113: 5-12.
116. Deng, Z., Huang, S., Ling, P:, CHen, C., Yu, C., Weber C. A., G. A. Moore & Jr. Gmitter, 2000. Cloning and characterization of NBS-LRR class resistance-gene candidate sequences in citrus. Theor Appl Genet 101: 814 — 822.
117. Devey, M. E., Bell, J. C., Smith, D. N., D. B. Neale & G. F. Moran, 1996. A genetic linkage map for Pinus radiata based on RFLP, RAPD, and microsatellite markers. Theor Appl Genet 92: 673 679.
118. Devos K M., Gale M.D. The genetic maps of wheat and their potential in plant breeding// Outlook Agric. 1993. - Vol. 22.-P. 93-99.
119. Devos, K. M. and M. D. Gale. Extended genetic maps, of the homoeologous group» 3 chromosomes of wheat, rye and barley // Theor. Appl. Genet. 1993.-Vol:85.- P. 469-652.
120. Devos, K.M., M.D. Gale. The use of random amplified polymorphic DNA markers in wheat // Theor. Appl. Genet. 1992. - Vol. 84. - P. 567-572.
121. Di Rienzo A, Donnelly P; Toomajian C, Sisk B, Hill A, Petzl-Erler L M, Haines G, Barch DH (1998) Heterogeneity of microsatellite mutations within and between loci- and implications for human demographic histories; Genetics 148:1269-1284 ,
122. Diwan N., Fluhr R., Eshed Y., Zamir D., Tanksley S. D. (1999) Mapping of Ve in tomato: a gene conferring resistance to the broad-spectrum pathogen, Verticillium dahliae race 1 Theor Appl Genet 98: 315.319.
123. Dixon M.S., Jones D.A., Keddie J.S., Thomas C.M., Harrison K., Jones J.D.G. (1996) The tomato Cf-2 disease resistance locus comprises two functional genes encoding leucine-rich repeat proteins. Cell, vol. 84, pp. 451-459.
124. Dow, B;D„ M.V. Ashley & H.T. Howe, 1995. Characterization of highly variable (GA/CA)n microsatellites in the bur oak, Quercus macrocarpa. Theor Appl Genet 91: 137-147.
125. Echt, C. S., May-Marquardt, P., M. Hseih & R. Zahorchak, 1996. Charactrization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome 39: 1102 -1108.
126. Echt, C.S. & P. May-Marquardt, 1997. Survey of microsatellite DNA in pine. Genome 40: 9-17.
127. Eckardt N. A. Retrotransposon polymorphisms affect genie recombination in Maize // The Plant Cell. 2008. V. 20 p.247.
128. Edwards, M. D.; C. W. Stuber, J. F. Wendel. Molecular-marker-facilitated investigations of quantitative-traits loci in maize. I. Numbers, genomic distribution and types of gene action // Genetics. 1987. - Vol. 116. - P. 113-125.
129. Ehdaie В., R.W. Whitkus, J.G. Waines. Root Biomass, Water-Use Efficiency, and Performance of Wheat-Rye Translocations of Chromosomes 1 and 2 in Spring Bread Wheat 'Pavon' // Crop Sci. 2003. - Vol. 43. - P. 710717.
130. Ellis J. and D. Jones, 1998. Structure and function of proteins, controlling strain specific pathogene resistant in plants. Curr Opin Plant Biol 1:288-293.
131. Ellis J., Lawrence G., Ayliffe M., Anderson P., Collins N., Finnegan J., Frost D., Luck J., Pry or T. (1997) Advances in the molecular genetic analysis of the flax-rust interactions". Annu Rev Phytopathol 35: 271-291.
132. Ellis, J.G., Lawrence, G.J., Finnegan, E.J., and Anderson, P.A. (1995). Contrasting complexity of two rust resistance loci in flax. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4185-4188.
133. Ender, A., K. Schwenk, T. Stadler, B. Streit & B. Schierwater, 1996. RAPD identification of microsatellites in Daphina. Molecular Ecology 5:437-441.
134. Endo T.R. Complete identification of common wheat chromosomes by means of the C-banding technique // Japen J. Genet. 1986. - Vol. 61. - P. 8993.
135. Endo T.R., Gill B.S. The detection stocks of commom wheat // Heredity. 1996. - Vol. 87. - P. 295- 307.
136. Fahima T„ M.S. Roder, A. Grama & E. Nevo, 1998. Microsatellite DNA polymorphism divergence in Triticum dicoccoides accessions highly resistant to yellow rust. Theor Appl Genet 96:187-195.
137. Fang, D., R. R. Krueger & M. L. Roose, 1998. Phylogenetic relationships among selected Citrus germplasm accessions revealed by inter simple sequence repeat (ISSR) markers. J Am Soc Hortic Sc 123: 616 — 617.
138. Fields S. and Song O. (1989) A novel genetic system to detect protein-protein interactions". Nature 340: 245-246.
139. Flavell A. J, Dunbar E., Anderson R., Pearce S. R., Hartley R., Kumar A. Tyl-copia group retrotransposons are ubiquitous and heterogeneous in higher plants //Nucleic Acids Research. 1992. V. 20. Issue 14. p. 3639-3644
140. Flor, H.H. (1971). Current status of gene-for-gene concept. Annu. Rev. Phytopathol. 9, 275-296.
141. Fluhr, R. (2001) Sentinels of disease: Plant resistance genes. Plant Physiol., 127, 1367-1374.
142. Frank L.W. Takken and Matthieu H.A.J. Joosten (2000). Plant Resistance Genes: Their Structure, Function and Evolution. European Journal of Plant Pathology, Volume 106, Number 8 / October, 2000, 699-713.
143. Fransz P.F., Alonso-Blanco C., Liharska B.T., Peeters A.J.M., Zabel P. and J. H. de Jong, 1996. High-resolution physical mapping in Arabidopsis thaliana and tomato by fluorescence in situ hybridization to extended DNA fibres. Plant J 9(3):421-430.
144. Fransz P.F., Stam M., Montijn B., Ten Hoopen R., Wiegant J., Kooter J.M., Oud O. and N. Nanninga, 1996. Detection of single-copy genes and chromosome rearrangements in Petunia hybrida by fluorescent in situ hybridization. Plant J 9(5):767-774.
145. Fuchs J. and I. Schubert, 1995. Localization of seed protein genes on metaphase chromosomes of Vicia faba via fluorescence in situ hybridization. Chromosome Res 3 :94-100.
146. Fuchs J., Kloos D.U., Ganal M: W. And Schubert I. 1996. In situ hybridization of yeast artificial chromosome sequences on tomato and potato methaphase chromosomes. Chromosome Res 4: 277-281.
147. Gall J. G. and M. L. Pardue. 1969; Formation and detection RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparation. Proc Natl Acad Sci USA 63:378-383;
148. Gaïlero F.J., Lopez-Solanilla E., Figueiras A.M., Benito. Chromosomal location of PCR fragments as a source of DNA markers linked to aluminium tolerance gènes in rye // Theor. Appl. Genet.—1998. Vol. 96. - P. 426-434. • ;
149. Garry, Pr, C. Ken, R; Anthony & L. Peter, 1997. Identification^ of molecular markers linked to flour colour and milling yield in wheat. In: 5th International: Congress of Plant Molecular Biology: 21st-27th Sept., 1997, Singapore.
150. Garza JC, Slatkin M, Freimer NB (1995) Microsatellite allele frequencies in humans and chimpanzees with implications for constraints on allele size. Mol Biol Evol 12:594-603
151. Gèffroy V., Sévignac. M., De Oliveira J. G. F., Fouilloux G., Skroch P., Thoquet P., Gepts P., Langin T., Dron M. 2000 Inheritance of Partial
152. Gianfranceschi, L., N. Seglias, R. Tarchini, M. Komjane & Ç. Gessler, 1998. Simple sequence repeats for the genetic analysis of apple. Theor Appl Genet 96: 1069-1076.
153. Gill BIS., Friebe B., Endo J.R. Standard karyotype and nomenclature system for description of chromosomes bands and structural aberrations in. wheat" (Triticum aestivum) // Genome; -1991.- Vol. 34:— P.830-839.
154. Glënn TC, Stephan W, Dessauer HC, Braun MJ (1996) Allelic diversity in alligator microsatellite loci is negatively correlated with GC content of flanking sequences and evolutionary conservation of PGR amplifiability. Mol Biol Evol 13:1151-1154.
155. Goldman IL, Paran 1, Zamir D (1995) Quantitative trait locuanalysis of a recombinant inbred line population derived from a Ly copersicon esculentum x Lvcopersicon cheesmanii cross. Theor Appl Genet 90:925-932
156. Goldstein DB, Clark AG (1995) Microsatellite variation in North American populations pf Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res 23:38823886
157. Grandbastien, M.-A. (1998) Activation of plant retrotransposons under sress contitions. Trends Plant Sci. 3, 181 187.
158. Grandillo, S. & S. D. Tanksley, 1996. Genetic analysis of RFLPs, GATA microsatellites and RAPDs in a cross between L. esculentum and L. pimpinellifolium. Theor Appl Genet 92: 957 965.
159. Grant, M. R., Godiard, L., Straube, E., Ashfield, T., Lewald, J., Sattler, A., Innes, R. W., and Dangl, J. L. (1995). Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual specificity disease resistance. Science 269, 843-846.
160. Guedes-Pinto H., Rangel-Figueiredo T., Carnide O. Aneuploidy in high yielding 6x-triticales // Cereal Res. Communic. 1984. - Vol.12, №3/4. — P. 229-235.
161. Gupta P.K., Priyadarshan P.M. Analysis of meiosis in triticale (xTriticosecale Wittmack) x rye (Secale cereale L.) F1 hybrids at three ploidy levels // Theor. Appl. Genet. 1987. - Vol. 73. - P. 893-898.
162. Gupta P.K., Reddy V.R.K Cytogenetics of triticale. 1997. - 3 59 P.
163. Gupta P.K., Varshney R.K., Sharma P.C., Ramesh B. Molecular markers and their applications in wheat breeding // Plant Breed. 1999. - Vol. 118.-P. 369-407.
164. Gupta, M, J. Chyi, J. Romero-Severson & J.L. Owen, 1994. Amplification of DNA markers from evolutionary diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats. Theor Appl Genet 89: 998-1006.
165. Gupta, P. K. and R. K. Varshney, 2000. The development and use of microsatellite markers for genetic analyses and plant breeding with emphasis on bread wheat. Euphytica 113:163-185.
166. Gupta, P. K., H. S. Balyan, P. C. Sharma & B. Ramesh, 1996. Microsatellites in plants: a new class of molecular markers. Curr Sci 70:45-54.
167. Gupta, R.B., K.W. Shepherd, and F. MacRitchie. Effect of rye chromosome arm 2RS on flour protein and physical dough properties in bread wheat//J. Cereal Sci. 1989. - Vol. 10. -P. 169-173.
168. Gustafson J.P. and Bennett M.D. Preferential selection for wheat-rye substitutions in 42-chromosome triticale // Crop Sci. 1976. - Vol. 16. - P. 688693
169. Gustafson J.P. Cytogenetics of Triticale // Cytogenetics of crop plants. New Delhi, 1983. - P.225-250.
170. Gustafson J.P., Drille J.E., Skovmand B. Wheat substitutions in hexaploid triticale // Plant Breed. 1989. - Vol.102, №2. - P. 109-112.
171. Gustafson J.P., Lukaszewski A.J., Robertsjn K. Chromosome substitutions and modifications in hexaploid triticale: a re-evaluation // Genetics and Breeding of Triticale, EUCARPIA meeting, Clermont-Ferrand, 2-5 July. — 1984.-P. 15-27.
172. Gustafson J.P., Qualset C.O. Genetics and breeding of 42-chromosome Triticale. I. Evidence for substitutional polyploidy in secondary Triticale population // Crop Sci. 1974. - Vol. 14. - P. 248-251.
173. Gustafson J.P., Zilinsky F.J. Identification of D-genome chromosomes from hexaploid wheat in a 42-chromosome triticale // Proc. 4th Intern. Wheat Genet. Symp. Columbia, 1973. - P. 225-232.
174. Gustafson J.P., Zilinsky F.J. Influences of natural selection on the chromosome complement of hexaploid triticale // Proc. 5th Intern. Wheat Genet. Symp.-New Delhi, 1978.-P. 1201-1207.
175. Haesaert G., De Baets A.E.G. Preharvest sprouting resistance in triticale. Preliminary results // Triticale: Today and Tomorrow. 1996. - P. 615622.
176. Hamada H., Petrino M. G. and Kakunaga T. 1982. A novel repeate element with Z-DNA-forming potential is widely found in evolutionary diverse eukaryotic genomes. Proc Natl Acad Sci USA 79:6465-6469.
177. Hancock, J. M., 1995. The contribution of slippage-like processes to genome evolution. J. Mol. Evol. 41:1038-1047,
178. Hancock, J. M., 1996. Simple sequences and the expanding genomes. BioEssays 18:421-425
179. Hanson M.R., Sutton G.A., Lu B. Plant organelle gene expression: altered by RNA editing. // Trends Plant Sci., 1999, Vol.1, p. 57-64.
180. Hanson R.E., Zwick M.S., Choi S., Nurul Islam-Faridi M., McKnight D., Wing R. A., Price H.J. and D.M. Stelly, 1995. Fluorescence in situ hybridization of a bacterial artificial chromosome. Genome 38:646-651.
181. Hàtchett, J.H., R.G. Séars, and T.S. Cox. Inheritance of resistance to Hessian fly in rye and; in wheat-rye translocation lines //. Crop Sci. 1999. - Vol. 33.-P. 730-734.
182. He S., Lyznik A., Mackenzie S. Pollen fertility restoration by nuclear gene Fr in CMS bean: nuclear-directed alteration of a mitochondrial population. // Genetics, 1995, Vol Л 39, p. 955-962.
183. Heath M.C. (1998) Apoptosis, programmed cell death and the hypersensitive response. Eur J Plant Pathol 104: 117-124.
184. Hentschel CC (1982) Homocopolymér sequences in the spacer of a sea urchin histone gene repeat are sënsitive to SI nuclease; Nature 295:714-716
185. Heslop-Harrison J. S. Comparative Genome Organization in Plants: From Sequence and Markers to Chromatin and Chromosomes // The Plant Cell. 2000. V. 12. p. 617-635.
186. Heslop-Harrison J.S., Leich A.R., Schwarzacher T. Detection and characterization of 1B/1R translocation in hexaploid wheat // Heredity. — 1990. -Vol. 65.-P. 385-392.
187. Heslop-Harrison J.S., Schwarzacher T. Genomic Southern and In situ hybridization for plant genome analysis // Methods of plant genome analysis of plants (ed. Jauhar P.P.), New York: CRC. 1996. - P. 163-180.
188. Hochman U. Cytology and fertility of primary and secondary tetraploid triticale and advanced populations // Genet, and Breed. Triticale: Proc. ofEUCARPIA Meet. Paris: INRA, 1984. -P.267-275.
189. Hogenboom, N.G. 1972. Breaking breeding barriers in Lycopcrsicon. 1. The genus Lycopcrsicon, its breeding barriers and the importance of breaking these barriers. Euphytica 21:221-227.
190. Homoeologous recombination in 2n-gametes producing interspecific hybrids of Lilium (Liliaceae) studied by genomic in situ hybridization (GISH) / Karlov G.I., Khrustaleva L.I., Lim K.B., Van Tuyl J.M. // Genome 1999. - Vol. 42.-P. 681.
191. Huttel, B., P. Winter, K. Weising, W. Choumarte, F. Weigand & G. Kahl, 1999. Sequence-tagged microsatellite site markers for chickpea {Cicer arietenum L.). Genome 42:210-217.
192. Immonen A.S.T., Varughese G. Use of callus culture to facilitate1. M jproduction of primary triticales // Proc.2 Intern. Triticale Symp. Passo Fundo, Brazil, 1990, 1991 - P. 381-382.
193. Iqbal M.J., Rayburn A.L. Identification of IRS rye chromosomal segment in wheat by RAPD analysis // Theor. Appl. Genet. 1995. - VoF. 91. - P. 1048-1053.
194. Iranil B.N., Bhatial C.R. Chromosomal location of alcohol dehydrogenase gene(s) in rye, using wheat-rye addition lines // Genetica. 1972. -Vol. 43. №2.-P. 195-200.
195. Islam-Faridi M.N., Mujeeb-Kazi A. Vizualization of Secale cereale DNA in wheat germplasm by fluorescent in situ hybridization // Theor. Appl. Genet. 1995. - Vol. 90. - P. 595-600.
196. Isolation and characterization of microsatellites from hexaploid bread wheat / Bryan G., Collins A., Stephenson P., Orry A., Smith J., Gale M. // Theor. Appl. Genet. 1997. - Vol. 94. - P. 557-563.
197. Ittu M., Ittu G., Saulescu N.N. Screening for Fusarium scab resistance in triticale // Triticale: Today and Tomorrow. 1996. - P.527-533.
198. Jarret, R.L„ L.C. Merrick, T. Holms, J. Evans & M.K. Aradhya, 1997. Simple sequence repeats in watermelon (Citrullus lanatus (Tbunb.) Matsum. & Nakai). Genome 40: 433-441.
199. Jauhar P.P., Chibbar R.N. Chromosome-mediated and direct gene transfers in wheat // Genome. 1999. - Vol. 42. - P. 570-583.
200. Jiang J., Friebe B., Gill B. S. Nonisotopic in situ hybridization and plant genome mapping: the first 10 years // Genome. 1994. - Vol. 37. - P. 717725.
201. Jiang J., Gill B. Sequential chromosome banding and* in situ hybridization. // Genome. 1993. - Vol. 36. - P. 792-795.
202. Johal G.S. and Briggs S.P. (1992) Reductase activity encoded by the HM1 disease resistance gene in maize. Science 258: 985-987.
203. John H. A., Birnstiel M. L. and Jones K. W. 1969. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature 223:582-587.
204. Jones D. F. 1917. Linkage in Lycopersicum. Am. Nat. 51:608-621.
205. Jones J.D.G. (1997) Plant disease resistance a kinase with keen eyes. Nature 385: 397-398.
206. Joseph A. M., Gosden J. R., Chandley A. C. 1984. Estimation of aneuploidy levels in human spermatozoa using chromosome specific probes and in situ hybridization. Hum. Genet. 66:234-238.
207. Joshi, S. P., Gupta, V. S., Aggarwal, R. K., P. K. Ranjekar & D. S. Brar, 2000. Genetic diversity and phylogenetic relationship as revealed by inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism in the genus Oryza. Theor Appl Genet 100: 1311-1320.
208. Jouve N., Soler C. Triticale genomic and chromosomes history // Triticale: Today and Tomorrow. 1996. -P.91-118.
209. Jung C., Lelley T. Hybrid necrosis in triticale caused by gene interaction between its wheat and rye genomes // Z. Pflanzenzucht. 1985. -Bd.94, №4. - S. 344-347.
210. Jurriaan J. Mes, Emma A. Weststeijn, Frits Herlaar et al. (1999) Biological and Molecular Characterization of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici Divides Race 1 Isolates into Separate Virulence Groups. Phytopathology, Vol. 89, No. 2, pp. 156-160.
211. Kalendar R., Grob T., Regina M., Suoniemi A. and A. Schulman, 1999. IRAP and REMAP: two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques. Theor Appl Genet 98:704-711.
212. Kanazin V., Marek L. and R. Shoemaker, 1996. Resistance gene analogs are conserved and clustered in. soybean. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:11746- 11750.
213. Kantety, R.V„ X. Zeng, J.L. Bennetzen & B.E. Zehr, 1995. Assessment of genetic diversity in dent and popcorn (Zea mays L.) inbred lines using inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification. Molecular Breeding 1: 365373.
214. Karlov G.I:, G.N.Andreeva, I.A. Fesenko, L.I. Khrustaleva Characterization and chromosome location of Tyl-copia group retrotransposons in some Alliaceae, Liliaceae and Iridaceae species // Cytogenetics and Cell Genetics. 1999: V. 85. p.135.
215. Kashi Y, Soller M (1999) Functional roles of microsatellites and minisatellites. In: Goldstein DB, Schlotterer C (eds) Microsatellites: evolution and applications. Oxford University Press, Oxford, pp 10-23
216. Kataoka T., Broek D., Wigler M. (1985) DNA sequence and characterization of the S. cerevisiae gene encoding adenylate cyclase. Cell 43: 493-505.
217. Kawchuk L.M., Hachey J., and Lynch D.R. (1998) Development of sequence characterized DNA markers linked to a dominant verticillium wilt resistance gene in tomato. Genome, 41: 91.95.
218. Kennedy, G. C., M. S. German & W. J. Rutter, 1995. The minisatellite in the diabetes susceptibility locus IDDM2 regulates insulin transcription. Nature Genet 9: 293 — 298.
219. Kobe B;and J. Deisenhofer, 1994. The leucine-rich repeat: a versatile binding motif. Trends Biochem Sci 19:415 420.
220. Kobe, B., and Deisenhofer, J. (1995b). A structural basis of the interactions between, leucine-rich repeats and protein ligands. Nature 374, 183-1 , 85.
221. Koebner R.M.D., Martin P.K. RAPDs as molecular markers for th< détection of rye chromosomes in . wheat// J. Genet. Breed. 1994. - Vol. 48. -85-88.
222. Koh, H.J„ M.H. Hen & SR. McCouch, 1996. Molecular mapping o^p the ges gene controlling the supergiant embryo character in rice (Oryza sativa L.^à Theor Appl Genet 93: 257-261.
223. Kooman-Gersmann M. (1998) Thé Avr9 elicitor peptide. Cladosporium fulvum; Molecular aspects of recognition. PhD Phytopathology, wageningen University, Wageningen. ,
224. Koorneef M. T., Bosma D. G., Hanahart C. J., Van der Veen J^ jj, and J.A.D. Zeevaàrt, 1990; Thé isolation and characterization of gibberel^jn deficient mutants in tomato. Theor Appl Genet 80: 852-857
225. Korzun V., Malyshev S., Voylokov, Borner A. A genetic map oifrye
226. Secale cereale L.) combining RFLP, isozyme, protein, microsatellite andeneloci / // Theor. Appl. Genet. 2001. - Vol. 102. - P. 709-717.
227. Korzun, V., M. Rôder, A.J. Worland & A. Bonier, 1997a. Applic^.tion of ' microsatellite markers to distinguish inter-varietal chromosome substitution lines of wheat (Triticum aestivum L.). Euphytica< 95: 149-155.
228. Korzun, V., M. Roder, A.J. Worland & A. Bomer, 1997b>. m trachromosomal . mapping of genes for dwarfing (Rhtl2) and vernali^^-Qn response (Vml) in wheat by using RFLP and: microsatellite markers. j>jant Breeding 116:227-232.
229. Kresovich, S., A.K. Szewe-McFadden, S.M. Bliek & J.R. McFer-son, 1995. Abundance and characterization of simple-sequence repeats (SSRs) isolated from a size-fractionated genomic library of Brassica napus L. (rapeseed). Theor Appl Genet 91:206-211.
230. Krishnasamy S., Makaroff C.A. Characterization of the radish mitochondrial orfB locus: possible relationship with male sterility in Ogura radish. // Curr. Genet., 1993, Vol.24, p. 156-163.
231. Krolow K.D. 4x Triticale: Production and use in triticale breeding.// Proc. 4th Intern. Wheat Genet. Symp. Columbia, 1973. - P.237-243.
232. Kruleva M.M., Korol A.B., Dankov T.D., Skorpan V.A. Preygel J. A. The effect of genotype x cytoplasm interaction on meiotic behaviour of maize chromosomes // Genome, 1992, Vol.35, №4, p. 653-658.
233. Kruleva M:M., Korol A.B., Dankov T.D., Skorpan V.A. Preygel J.A. The effect of genotype x cytoplasm interaction on meiotic behaviour of maize chromosomes // Genome, 1992, Vol.35, №4, p. 653-658.
234. Kumar A., Bennetzen J. L. Plant retrotransposons // Annual Review of Genetics. 1999. V. 33. p. 479-532.
235. Kumar S., Colussi P.A. (1999) Prodomains-adaptors-oligomerization: the pursuit of caspase activation in apoptosis. Trends Biochem Sci 24: 1-4, 1999.
236. Ko> J.M., Do G.S., Sun D.Y., Seo B.B., Shin D.C., Moon H.P. Identification and chromosomal organization of two rye genome-specific RAPD products useful as introgression markers in wheat // Genome. — 2002. Vol.45. — P. 157-164.
237. Lafferty J., Lelley T. Introduction of high molecular weight glutenin subunits 5 + 10 for the improvement of the bread-making quality of hexaploid triticale // Plant Breeding. 2001. - Vol. 120. - P. 33-37.
238. Lagercrantz U, Ellegren H, Andersson L, 1993. The abundance of various polymorphic microsatellite motifs differs between plants and vertebrates. Nucleic Acids Res 21:1111-1115
239. Lagoda, P.J.L., D. Dambier, A. Graphin, F.C. Baurens, C. Lanaud & J.L. Noyer, 1998a. Nonradioactive sequence-tagged microsatellite site analyses: a method transferable to the tropics. Electrophoresis 19: 152-157.
240. Landschulz W.H., Johnson P.F. and McKnight S.L. (1988) The leucine zipper: a hypothetical structure common to a new class of DNA binding proteins. Science 240: 1759-1764.
241. Langer-Safer P. R., Waldrop A. A., Ward D. C. 1981. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci USA 78:6633-6637.
242. Lapinski B., Schwarzacher A. Homeologous translocation unblocks expression rye genes in tetraploid triticale // Biuletyn Institutu Hodowli Aklimatyzacji Roslin 1999. - № 211. - P. 214-218.
243. Lapinski B., Schwazacher T. Translocations 5A.5R in improved lines of tetraploid winter triticale // 4th Intern. Triticale Symp. — Canada, 1998. — Vol.l -P.218-221.
244. Lauge R., Joosten M.H.A.J., Van Den Ackerveken G.F.J.M., Van Den Broek H.W.J, and De Wit P.J.G.M. (1997) The in planta-produced extracellular proteins ECP1 and ECP2 of Cladosporium fulvum are virulence factors. Мої Plant-Microbe Interact 10: 735-744.
245. Laver H.K., Reynolds S.J., Moneger F., Leaver C.J. Mitochondrial genome organization and expression associated with cytoplasmic male sterility in sunflower (Helianthus annuus). // Plant J., 1991, Vol.l, №2, p. 185-193.
246. Lawrence, G.J., Finnegan, E.J., Ayliffe, M.A., and Ellis, J.G. (1995). The L6 gene for flax rust resistance is related to the Arabidopsis bacterial resistance gene RPSP and the tobacco viral resistance gene-N. Plant Cell 7, 11 951 206.
247. Lee J.H., Graybosch R.A., Lee D.J. Detection of rye chromosome 2R* using the polymerase chain reaction and sequence-spesific DNA primers // Genome. 1994. - Vol. 37. - P. 19-22.
248. Lee J.H., R.A. Graybosch, S.M. Kaeppler, and R.G. Sears. A PCR assay for detection of a 2RL.2BS wheat-rye chromosome translocation // Genome. 1996. - Vol. 39. - P. 605-608.
249. Lee JS, Hanford MG, Genova JL, Farber RA (1999) Relative stabilities of dinucleotide and tetranucleotide repeats in cultured mammalian cells. Hum Mol Genet 8:2567-2572
250. Leister D., Ballvora A., Salamini F. and C. Gebhardt, 1996. A PCR-based approach for isoleting pathogene resistance genes from potato wiht potential for wide application in plants. Nature Genet. 14:421 — 429.
251. Leitch I. J., Leitch A.R. and J. S. Heslop-Harrison, 1991. Physical mapping of plant DNA sequencesby simultanious in situ hybridization of two differently labelled fluorescent probes. Genome 34:329-333.
252. Leroy, X. J., Leon, K., Hily, J. M., P. Chaumeil & M. Branchard, 2001. Detection of in vitro culture-induced instability through inter-simple sequence repeat analysis. Theor Appl Genet 102: 885 891.
253. Levin, I., Gilboa, N., Yeselson, E., S. Shen & A. A. Schaffer, 2000. Fgr, a major locus that modulates the fructose to glucose ratio in mature tomato fruits. Theor Appl Genet 100: 256 262.
254. Levings C.S.R. Thoughts on cytoplasmic male sterility in maize. // Plant Cell., 1993, Vol.5, p. 1285-1290.
255. Levinson G, Gutman GA (1987a) High frequencies of short frameshifts in poly-CA/TG tandem repeats borne by bacterio-phage M13 in Escherichia coli K-12. Nucleic Acid Res 15: 5323-5338
256. Li, J. & M. Niwa, 1996. Microsatellite DNA markers linked to a gene controlling days to flowering in soybean (Glycine max) under short day conditions. Breeding Science 46: 81-84.
257. Lindhout P, Van Heusden S, Pet G, Van Ooijen JW, Sandbrink H, Verkerk R, Vrielink R, Zabel P (1994) Perspectives of molecular marker-assisted breeding for earliness in tomato. Euphytica 79: 279-286
258. Lindschau M., Ochler E. Unteresuchungen am Konstant intermediaeren additiven Rimpausche Weizen-Roggen bastard // Der Zuchter. — 1935. -Bd.7, №9. S. 228-233.
259. Litt M., Lutty J.A. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene // Am. J. Hum. Genet. 1989. - Vol. 44. - P. 397-401.
260. Liu S., Song Z., Wang.H. Development and molecular cytogenetic identification of 1RS.1BL translocation lines derived from triticale x tritileymus // Hereditas. -2004. Vol.26. - P. 481-485.
261. Liu Y.G., K. Tsunewaki. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis in wheat. II. Linkage maps of the RFLP sites in common wheat // Jpn. J. Genet. 1991. - Vol. 66. - P. 617-633.
262. Liu, Y.G„ R.M. Biyashev & M.A. Saghai-Maroof, 1996. Development of simple sequence repeat DNA markers* and their integration into a barley linkage map. Theor Appl Genet 93: 869-876.
263. Lukaszewski A.J. Cytogenetic manipulation of the endosperm storage protein loci in the improvement of breadmaking quality of triticale // Journal of Applied Genetics. 1996. - Vol.37 a. - P. 22-27.
264. Lukaszewski A.J. Cytogenetically Engineered Rye Chromosomes 1R to.Improve Bread-making Quality of Hexaploid Triticale // Crop science. — 2006. -Vol. 46.-P. 2183-2194:
265. Lukaszewski A.J., Gustafson J.P. Cytogenetics of triticale // Plant Breed. 1987. - Vol.5. - P. 41-93.
266. Ma X.F., Wanous M.K., Houchins K., Rodriguez M.A., Goicoechea P.G., Wang Z., Xie M., Gustafson J.P. Molecular linkage mapping in rye (Secale cereale L) // Theor. Appl. Genet. 2001. - Vol. 102. - P. 517-523.
267. Ma Z., Fang, P., Gustafson, J.P. Polyploidization-Induced Genome Variation In Triticale // Genome. 2004. - Vol. 47. - P. 839-848.
268. Ma, Z.Q., M. Roder & M.E. Sorrells, 1996. Frequency and sequence characteristics of di-, tri- and tetranucleotide microsatellites in wheat. Genome 39: 123-130.
269. Mackowiak W., Lapinski B. On the use of bread wheat and rye variation in Malyszyn triticale breeding // Genet, and Breed, of Triticale. Paris: INRA, 1985. — P.353-362.
270. Makaroff C.A. Cytoplasmic male sterility in Brassica species. // In: The molecular biology of plant mitochondria , C.S. Levings III and I.K. Vasil, eds., Kluwer Academic Publishers, The Netherlands, 1994, p. 515-555.
271. Markert C. L. and F. Moller. Chemical and biochemical techniques for varietal identification // Seed Sci. Technol. 1959. - Vol.1. - P. 181-199.
272. Marques, C.M., Araujo, J.A„ Ferreira, J.G., Whetten, R., O'Mal-ley, D.M., Liu, B-H., and Sederoff, R. 1998. AFLP genetic maps of Eucalyptus globulus and E. tereticomis. Theor. Appl. Genet. 96: 727-737.
273. Marra G, Schar P (1999) Recognition of DNA alterations by the mismatch repair system. Biochem J 338:1-13
274. Martinez I., Bernard M., Nicolas P., Bernard S. Study of androgenetic performance and molecular characterisation of a set of wheat-rye addition lines // Theor. Appl. Genet. 1994. - Vol. 89. - P. 982-990.
275. McClean, P.E. and M.R. Hanson. 1986. Mitochondrial DNA sequence divergence among Lycopersicon and related Solanum species. Genetics 112:649-667.
276. McCouch, S. R.; G. Kochert; Z. H. Yu; G. S. Khush; W. R. Coffman and S. D. Tanksley. Molecular mapping of rice chromosomes // Theor. Appl: Genet. 1988. - Vol; 76. - P. 815-829.
277. McCouch, S.R, X. Chen, 0. Panaud, S. Temnykh, Y. Xu, Y.G. Cho, N. Huang, T. Ishii & M. Blair, 1997. Microsatellite marker development, mapping and applications in rice genetics and breeding. Plant Mol Biol 35: 89-99.
278. Menassa R., El-Rhouby N., Brown G.G. An open reading frame for a protein involved in cytochrome c biogenesis is split into two parts in Brassica mitochondria. // Curr. Genet., 1997, Vol.31, p. 70-79.
279. Menassa R., L'Homme Y., Brown G.G. Posttranscriptional and developmental regulation of a CMS associated mitochondrial gene region by a nuclear restorer gene. II Plant J., 1999, Vol. 17, №5, p. 491-499.
280. Menendez, C.M., Hall, A.E., and Gepts, P. 1997. A genetic linkage map of cowpea (Vigna uriguiculatd) developed from a cross between two inbred; domesticated lines; Theor: Appl. Genet. 95:1210-1217.
281. Merker A. . Chromosome composition of hexaploid triticale // Hereditas. 1975. - Vol.80.-P.41-52.
282. Metzgar, D., J. Bytof & C. Wills, 2000. Selection against frameshift mutations limits microsatellite expantion in coding DNA. Genome Res 10: 72 -80.
283. Michalakis Y, Veuille M (1996) Length variation of CAG/CAA trinucleotide repeats in natural populations of Drosophila melanogaster and its relation to the recombination rate. Genetics 143:1713-1725
284. Miller, J. C. & S. D. Tanksley, 1990. RFLP analysis of relationship and genetic variation in the genus Lycopersicon. Theor Appl Genet 80: 437 448.
285. Mindrinos, M., Katagiri, F., Yu, G.-L., and Ausubel, F.M. (1994). The A. thaliana disease resistance gene RPSP encodes a protein containing a nucleotide-binding site and"leucine rich repeats. Cell 78,1089-1099.
286. Molnar-Lang M., Nagy E.D., Line G., Sutka J. Production and identification of wheat-barley hybrids and translocations using GISH, FISH and SSR markers // EWAC Newsletter. 2003. - Vol. 12. - P. 92 .
287. Morel, J-B. and J.L. Dangl (1999) Suppressors of the Arabidopsis Isd5 cell death mutation identify genes involved in regulating disease resistance responses. Genetics 151, 305-319.
288. Morgante, M. & J. Vogel, 1994. Compound microsatellite primers for the detection of genetic polymorphisms. US patent application no. 08/326456.
289. Morgante, M., A. Rafalski, P. Biddle, S. Tingey & X.M. Oliveri, 1994. Genetic mapping and variability of seven soybean simple sequence repeat loci. Genome 37: 763-769.
290. Motegi T., Nou I.S., Zhou J., Kanno A., Kameya T., Hirata Y. Obtaining an Ogura-type CMS line from asymmetrical protoplast fusion between cabbage (fertile) and radish (fertile). // Euphytica Vol.129, 2003, p. 319-323.
291. Mudge, J., P.B. Cregan, J.P. Kenworthy, W.J. Kenworthy, J.H. Orf & N.D. Young, 1997. Two microsatellite markers that flank the major soybean cyst nematode resistance locus. Crop Sei 37:1611-1615.
292. Muentzing A. Triticale: results and problems. Advances in plant breeding.-1979.-103 p.
293. Murai K., Taketa S., Islam R., Shepherd K.W. Barley allele-specific amplicons useful for identifying wheat-barley recombinant chromosomes // Genes Genet. Syst. -2000. Vol. 75. -P. 131- 139.
294. Nadir E, Margalit H, Gallily T, Ben-Sasson SA (1996) Microsatellie spreading in the human genome: evolutionary mechanisms and structural implications. Proc Natl Acad Sei USA 93:6470-6475
295. Nagaoka T, and Ogihara Y. 1997. Applicability of inter-simple sequence repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers in comparisonto RFLP and RAPD markers. Theor Appl Genet 94:597-602.i
296. Nair C.K.K. Mitochondrial genome organization and cytoplasmic male sterility in plants. J. Biosci., 1993, Vol. 18, Number 3, September, p. 407422.
297. Nei, M., F. Tajima & Y. Tateno, 1983. Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data. II. Gene frequency data. J Mol Evol 19: 153-170.
298. Nivison H.T., Hanson M.R. Identification of a mitochondrial protein associated with cytoplasmic male sterility in petunia. // Plant Cell., 1989, Vol. 1, №11, p. 1121-1130.
299. Nürnberger T., Wirtz W., Nennstiel D., Hahlbrock K., Jabs T., Zimmermann S. and Scheel D. (1997) Signal perception and intracellular signal transduction in plant pathogen defense. J Recept Sign Trans Res 17: 127-136.
300. Ogura H. Studies on the new male sterility in Japanese radish, with special references to utilization of this sterility towards the practical raising of hybrid seeds. // Mem. Fac. Agric. Kagoshima Univ., 1968, Vol. 6, p. 39-78.
301. Paetku, D. & C. Strobeck, 1995. The molecular basis and evolutionary history of a microsatellie null alleles in bears. Molecular Ecology 4: 519520.
302. Palmer, J. D. & D. Zamir, 1982. Chloroplast DNA evolution and phylogenetic relationship in Lycopersicon. Proc Natl Acad Sci USA 79: 5006 -5010.
303. Panaud O., Chen X., McCouch S.R. Development of microsatellite markers and characterization of simple sequence length polymorphism (SSLP) in rice (Oryza sativa L) // Mol. Gen. Genet. 1996. - Vol. 252. - P. 597-607.
304. Panaud, X. Chen & S.R. McCouch, 1996. Development of microsatellite markers and characterization of simple sequence length polymorphism (SSLP) in rice (Oryza sativa L.). Mol Gen Genet 252: 597-607.
305. Panaud, X. Chen & S.R. McCouch. 1995. Frequency of microsatellite sequences in rice (Qryza sativa L.). Genome 38:1170-1176.
306. Paniego, N. M. Munoz, M. Echaide, L. Femadez, P. Faccio, R. Zandomeni, E. Suarez & E. Hopp, 1999. Microsatellite development for sunflower. In: International Plant & Animal Genome VII Conference: Abstract P464, 17th-21st Jan., 1999, San Diego, CA.
307. Paran, I., Goldman, I., Tanksley, S.D., and Zamir, D. 1995. Recombinant inbred lines for genetic mapping in tomato. Theor. Appl. Genet. 90: 542-548.
308. Parniske M. and Jones J.D.G. (1999) Recombination between diverged clusters of the tomato Cf-9 plant disease resistance gene family. Proc Natl Acad Sci USA 96: 5850-5855.
309. Pasakinskiene I., Griffiths C. M., Bettany A. J. E., Paplauskiene V., Humphreys M. W. 2000. Anchored simple sequence repeats as primers to generate species-specific DNA markers in Lolium and Festuca grasses. Theor Appl Genet 100:384-390.
310. Pedersen, C. & I. Linde-Laursen, 1994. Chromosomal location of four minor rDNA loci and a marker microsatellite sequence in barley. Chromosome Res 2: 67-71.
311. Pejic I., Ajmone Marsan P., Morgante M., Kozumplick V., Castiglioni P., Taramino G., Motto M. 1998. Comparativ analysis of genetic similarity among maize inbred lines detected by RFLPs, RAPDs, SSRs and AFLPs. Theor Appl Genet 97:1248-1255.
312. Pena R.J. Factors affecting triticale as a food crop // H. Guedes-Pinto et al. (ed.) Triticale Today and Tomorrow, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. 1996. - P. 753-761
313. Penner G.A. RAPD analysis of plant genome // Method of genome analysis in plants. (Ed. Jauhar P.P.). 1996. - P. 252-264.
314. Pereira de Souza A., Jubier M.-F., Lejeune B. The higher plant nad5 gene: a conserved discontinuous transcription pattern. // Curr. Genet., 1992, Vol.22, p. 75-82.
315. Pouteau S., Boccara M. and M.A. Grandbastien, 1994. Microbial elicitors of plant defense response activate transcription of retrotransposon. Plant J. 5:535-542.
316. Powell, W., G.G. Machray & J. Provan, 1996a. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trends Plant Sci 1: 215-222.
317. Powell, W., Mi Morgante, C. Andre, M. Hanafey, J. Vogel, S. Tingey & J.A. Rafalaski, 1996b. The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Molecular Breeding 2: 225-238.
318. Qian W., Ge S., Hong D-Y. 2001. Genetic variation within and among population of wild; rice Orizà granulata from China detected by RAPD and ISSR markers. Theor Appl Genet 102:440-449:
319. Rayburn A. L. and Gill B. S. 1985 Use of biotin-labeled probes to map specific DNA sequences on wheat chromosomes. J. Hered 76:78-81
320. Reddy M.P., Sarla N. Siddiq E.A. Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding // Euphytica. — 2002. — Vol. 128.-P. 9-17.
321. Ribeiro-Carvalho C, Guedes-Pinto H., Heslop-Harrison J.S., Schwarzacher T. Introgression of rye chromatin on chromosome 2D in the Portuguese wheat landrace "Barbela" // Genome. 2001. - Vol. 44. - P. 11221128.
322. Richardson, T.> S. Cato, J. Ramser, G. Kahl & K. Weising, 1995. Hybridization of microsatellites to RAPD: a new source of polymorphic markers. Nucl Acids Res 23: 3798-3799.
323. Richter T. E. and P. C. Ronald, 2000. The evolution of disease resistance genes. 42:195 — 204.
324. Rick C. The Tomato. In: Handbook of Genetics", R. G. King ed., New York: Plenum press: 1975, 2:247-280
325. Rico C, Rico I, Hewitt G (1996) 470 million years of conservation of microsatellite loci among fish species. Proc R Soc Lond B Biol Sci 263:549-557
326. Riley R. Miller T.E. Meiotic chromosome pairing in triticale // Nature. 1970. - №227. - P. 82-83.
327. Riley R., Chapman V. The inheritance in wheat of crossability with rye // Genet. Res. 1967. - Vol.9. - P.259-267.
328. Roder M.S., Korzun V., Wendehake K., Plaschke J., Tixer M-H., Leroy-P., Ganal M.W. A microsatellite map of wheat // Genetics. 1998. - Vol. 149.-P. 2007-2023.
329. Rogalska S. Additional 6R chromosomes and translocation between 1R/6R in line S-10046 of hexaploid triticale // Hodowla Roslin Aklimatyzcja I Naiennictwo. 1980. - torn 24, zeszyt 4. - P. 357-363.
330. Rogalska S.M., Cubulska-Augustyniak J., Kulawinek A. Aneuploidy in Polish cultivars of winter triticale (xTriticosecale Wittmack) // Genetica Polonica. 1991. -№32. -P* 11-16.
331. Rybka K. An approach to identification of rye chromosomes affecting the pre-harvest sprouting in triticale ZZ J. Appl. Genet. 2003. - Vol. 44(4); - P. 491-496'
332. Saliba-Colombani, V., Causse, M., L. Gervais & J. Philouze, 2000, Efficiency of RFLP, RAPD and AFLP markers for the construction of interspecific map of the tomato genome. Genome 43: 29 — 40.
333. Saraste, M., Sibbald, P.R., and Wittinghofer, A. (1990). The P-loop: A common motif in ATP- and GTP-binding proteins. Trends Biol.Sci. 15, 430434.
334. Sarfatti, M., AburAbied, M., Katan, J., and Zamir, D. (1991). RFLP mapping of 11, a new locus in; tomato conferring resistance against Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici race 1. Theor, Appl. Genet. 82,22-26.
335. Schaible P, Cannon OS, Waddoups V (1951) Inheritance of resistance to Verticillium wilt in a tomato cross. Phytopathology 41: 986.990:
336. Schlegel R. Triticale today and tomorrow ZZ Triticale: Today and Tomorrow. - 1996.- P.21-31.
337. Schloterrer C. Evolutionary dynamics of microsatellite DNA ZZ Ghromosoma. 2000. - Voi.109. - P. 365-371.42 li Schlotterer G, Amos B, Tautz D (1991) Conservation of polymorphic simple, sequence lociin cetacean species-Nature 354:63-65. ■ V ' ■ . . 312
338. Schlotterer C, Pemberton J (1998) The use of microsatellites for genetic analysis of natural populations a critical review. In. DeSalle R, Schierwater B (eds) Molecular approaches to ecology and evolution. Birkhauser, Basel, pp 71-86
339. Schlotterer C, Tautz D (1992) Slippage synthesis of simple sequence DNA. Nucleic Acids Res 20:211-215
340. Schmidt, T. & J.S. Heslop-Harrison, 1996. The physical and genomic organization of microsatellites in sugar beet. Proc Nati Acad Sci USA 93: 87618765.
341. Schnable P.S., Wise R.P. The molecular basis of cytoplasmic male sterility and fertility restoration. // Trends in plant Sci., 1998, Vol.3, №5, p. 175180.
342. Schug MD, Hutter CM, Noor MAF, Aquardo CF (1998a) Mutation and evolution of microsatellites in Drosophila melanogaster. Genetica 102/103:359-367
343. Schug MD, Hutter CM, Wetterstrand KA, Gaudette MS, Mackay TF, Aquadro CF (1998b) The mutation rates of di-, tri- and tetranucleotide repeats in Drosophila melanogaster. Mol Biol Evol 15:1751-1760
344. Scofield S.R., Tobias C.M., Rathjen J.P., Chang J.H., Lavelle D.T., Michelmore R.W. and staskawicz B.J. (1996) Molecular basis of gene-for-gene specificity in bacterial speck disease of tomato. Science 274: 2063-2065.
345. Scrimshaw, B.J. 1992. A simple nonradioactive procedure for visualization of(dC-dA)n dinucleotide repeat length polymorphisms. Bio Techniques 13: 189.
346. Segal, G., Sarfatti, M., Schaffer, M.A., Ori, N., Zamir, D., and Fluhr, R. (1992). Correlation of genetic and physical structure in the region surrounding the 12 Fusarium oxysporum resistance locus in tomato. Mol. Gen. Genet. 231, 179-185.
347. Seo. Y. W., Jang C.S., Johnson J.W. Development of AFLP and STSmarkers for identifying wheat-rye translocations possessing 2RL // Euphytica. -2001.-Vol. 121.-P. 279-287. .
348. Shan X., Blake T.K., Talbert L.E. Conversion of AFLP markers to sequence-specific PCR markers in barley and wheat // Theor. Appl. Genet. — 1999.-Vol. 98.-P. 1072-1078.
349. Sharon, D., P.B. Cregan, S. Mhameed, M. Kusharska, J. Hillel, E. Lahav, C. Epplen & U. Lavi, 1997. An integrated genetic linkage map of avocado. Theor Appl Genet 95: 911-921,
350. Sherman, J. D. & S. M. Stack, 1995. Two-dimensional spreads of synaptinemal complexes from solanaceous plants. VI. High-resolution recombination nodule map of tomato (Lycopersicon; esculentum). Genetics 141: 683-708.
351. Singh M., Brown G.G. Suppression of cytoplasmic male sterility by nuclear genes alters expression of a novel mitochondrial gene region. // Plant Cell, 1991, Vol.3, p. 1349-1362.
352. Singh S., Vipen S. Normal regulation of stamen development and male sterility in tomato // Plant Physiol., 1993, Vol.102, №1, p. 65.
353. Speulman E., Bouchez D., Holub E. and J.L. Beynon, 1998. Disease resistance gene homologs correlate with disease resistance loci of Arabidopsis thaliana. Plant J. 14(4): 467 474.
354. Stam P. and J. W. Ooijen, 2000. JoinMap 2.0. Software for the calculation genetic linkage maps.
355. Stephenson, P., G. Bryan, J. Kirby, A. Collins, K.M. Devos, C. Busso & M.D. Gale, 1998. Fifty new microsatellite loci for the wheat genetic map. Theor Appl Genet 97: 946-949.
356. Strand M, Prolla TA, Liskay RM, Petes TD (1993) Destabilization of tracts of simple repetitive DNA in yeast by mutations affecting DNA mismatch repair. Nature 365:274-276
357. Streisinger G, Owen JE (1985) Mechanisms of spontaneous and induced frameshift mutation in bacteriophage T4. Genetics 109:633-659
358. Tang X.Y., Frederick R.D., Zhou J.M., Halterman D.A., Jia Y.L. and Martin G.B. (1996) Initiation of plant disease resistance by physical interaction of Avrpto and Pto kinase. Science 274: 2060-2063.
359. Tang X.Y., Xie M.T., Kim Y.J., Zhou J.M., Klessig D.F. and Martin G.B. (1999) Overexpression of Pto activates defense responses and confers broad resistance. Plant Cell 11: 15-29.
360. Tanksley, S. D. and C. M. Rick. Isozymic gene linkage map of the tomato: Applications in genetics and breeding // Theor. Appl. Genet. 1980. -Vol. 57.-P. 161-170.
361. Tanksley, S. D., Young, N. D., A. H. Paterson & M. W. Bonierbale, 1989. RFLP mapping in plant breeding: new tools for an old science. BioTechnology 7: 257 264.
362. Tanksley, S.D. Molecular markers in plant breeding // Plant Mol. Biol. Rep. 1983. - Vol. 1. - P. 3-8.
363. Tao Y.Z., Snape J.W., Hu H. The cytological and genetic characterization of doubled haploid lines derived from triticale x wheat hybrids // Theor. Appl. Genet. 1991. - Vol. 81. -P. 369-375.
364. Taramino, G. & S. Tingey, 1996: Simple sequence repeats for the germplasm analysis and mapping in maize. Genome 39: 277-287.
365. Tautz D. Hypervariability of simple sequences as a general source of polymorphic DNA markers // Nucl. Acids Res. 1989. - Vol. 17. - P. 6463-6471.
366. Tautz, D and C. Schlotterer, 1994, Simple sequences. Curr. Opin. Genet. Dev. 4:832-837
367. Tautz, D. & M. Renz, 1984. Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaiyotic genomes. Nucl Acids Res 12:4127-4138.
368. Tautz, D., 1989. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucl Acids Res 17:6463-6471.
369. Thalhammer S., Heckl W.M. Atomic Force Microscopy as a tool in nanobiology.Part I: imaging and manipulation in cytogenetics // Cancer Genomics & Proteomics. 2004. - Vol. 1. - P. 59-70.
370. Thomas C.M., Dixon M.S., Parniske M., Golstein C. And Jones J.D.G. (1998) Genetic and molecular analysis of tomato Cf genes for resistance to Cladosporium fulvum. Phil Trans R Soc Lond B 353 (1374): 1413-1424.
371. Thompson K.F. Cytoplasmic male sterility in oil-seed rape plants. // Heredity, 1972, Vol.29, p. 253-257.
372. Thompson K.F. Cytoplasmic male sterility in oil-seed rape plants. // Heredity, 1972, Vol.29, p. 253-257.
373. Tjamos E.C., Rowe R.C., Heale J.B. and Fravel D.R. (2000). Advances in Verticillium Research and Disease Management. APS Press. St. Paul, MN. 376 p.
374. Topographical changes in rye chromosome ultrastructure caused by the C-banding procedure / Dille J.E., Gustafson J.P., Brown M.Jr., Appels R., Craig S. // Genome. 1987. - Vol.29. - P. 817-822.
375. Tornero, P., Mayda, E., Gomez, M.D., Canas, L., Conejero, V., and Vera, P. (1996). Characterization of LRP, a leucine-rich repeat (LRR) protein from tomato plants that is processed during pathogenesis. Plant J. .10, 315-330.
376. Tsumura-Y., Ohba K., Strauss S. H. 1996. Diversity and inheritánce of inter-simple sequence repeat polymorphism in Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii) and sugi (Cryptomeria japónica). Theor Appl Genet 92:40-45.
377. Van der Beek, J. G., Verkerk, K., P. Zabel & P. Lindhout, 1991. Mapping strategy for resistant genes in tomato based on RFLPs between cultivars: Cf9 (resistance to Cladosporiúm fulvum) on chromosome 1. Theor Appl Genet 84: 106 112.
378. Varshney, R.K., P.C. Sharma, P.K. Gupta, H.S. Balyan, B. Ramesh, J.K. Roy, A. Kumar & A. Sen, 1998. Low level of polymorphism detected by SSR probes in bread wheat. Plant Breeding 117:182-184.
379. Varshney, R.K„ A. Kumar, H.S. Balyan, J.K. Roy, M. Prasad & P.K. Gupta, 2000a. Characterization, development and chromosomal assignment of microsatellite markers in bread wheat. Plant Mol Biol Rep 14: 124 132.
380. Virmani S.S., Sun Z.X., Mou T.M., Jauhar Ali A., Mao C.X. Two-line Hybrid rice breeding manual. / Los Baños (Philippines), 2003, International Rice Research Institute.
381. Vosman, B. & P. Arens, 1997. Molecular characterization of GATA/GACA microsatellite repeats in tomato. Genome 40: 25 33.
382. Voytas D.F., Cummings M.P., Konieczny A., Ausubel F.M. and Rodermel S.R. Copia-like retrotransposons are ubiquitous among plants // Pros. Natl.Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. p. 7124-7128.
383. Wang Y., Tang X., Cheng Z., Mueller L., Giovannoni J., Tanksley S.D. Euchromatin and pericentromeric heterochromatin: comparative composition in the tomato genome // Genetics. 2006. V. 172. Issue-4. p. 2529-2540
384. Wang C., Chen X. Cloning and transcript analyses of the chimeric gene associated with cytoplasmic male sterility in cauliflower (Brassica oleraceae var. botrytis). 2006.Euphytica,
385. Wang, G., R. Mahalingam «fe H.T. Karp, 1998. (C-A) and (G-A) anchored simple sequence repeats (ASSRs) generated polymorphism in soybean, Glycine max L. Merr. Theor Appl Genet 96: 1086-1096.
386. Wang, Y.-H., Thomas, C.E., and Dean, R.A. 1997. A genetic map of melon (Cucumis meló L) based on amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers. Theor. Appl. Genet. 95: 791-798.
387. Wang, Z., J.L. Weber, G. Zhong & S.D. Tanksley, 1994. Survey of plant short tandem repeats. Theor Appl Genet 88: 1-6. ;
388. Warnock, S. J., 1988. A review of taxonomy and phylogeny of the genus Lycopersicon. Hort Science 23: 669 673.
389. Watterson JC (1986) Diseases. In: Atherton JG, Rudich JT (eds) The tomato crop, Chapman and Hall, New York, pp 443.484.
390. Wetzel J.B., Raybum A.L. Use of fluorescence genomic in situ hybridization (GISH) to detect the presence of alien chromatin in wheat lines differing in nuclear DNA content // Cytometry. 2000. - Vol. 41. - P. 36-40.
391. Whitham, S., Dinesh-Kumar, S.P., Choi, D., Hehl, R., Corr, C., and Baker, B. (1994). The product of the tobacco mosaic virus resistance gene N: Similarity to Toll and the interleukin-1 receptor. Cell78, 1101-1115.
392. Wicking, C. & B. Williamson, 1991. From linked marker togene. Trends Genet 7:288- 293.
393. Wierdl M, Dominska M, Petes TD (1997) Microsatellite instability in yeast: dependence on the length of the microsatellite. Genetics 146:769-779
394. Wise R.P., Dill C.L., Schnable P.S. Mutator-induced mutations of the rfl fertility restorer of T-cytoplasm maize alter the accumulation* of l-urfl3 mitochondrial transcripts.//Genetics, 1996, Vol.143, p. 1383-1394.
395. Wise R.P., Gobelman-Werner K., Pei D., Dill C.L., Schnable P.S. Mitochondrial transcript processing and restoration of male fertility in T-cytoplasm maize. // J. Hered., 1999, Vol.90, №3, p. 380-385.
396. Wolff, K., E. Zietkiewicz & H. Hofstra, 1995. Identification of chrysanthemum cultivars and stability of fingerprint patterns. Theor Appl Genet 91:439-447.
397. Wolter M., Hollricher K., Salamini F., Schulze-Lefert P. (1993) The mlo resistance alleles to powdery mildew infection in barley trigger a developmentally controlled defense mimic phenotype. Mol. Gen. Genet. 239: 122128.
398. Xiao, J., J. Li, S. Grandillo, S.N. Ahn, S.R. McCouch, S.D. Tanksley & L. Yuan, 1996. A wild species that contains genes that may significantly increase the yield of rice. Nature 384: 223-224.
399. Xu J. and Earle E. D. 1996a. Direct FISH of 5S r DNA on tomato pachytene chromosomes places the gene at the heterochromatic knob immediately adjacent to the centromere of chromosome 1. Genome 39: 216-221.
400. Xu J. and Earle E. D. 1996b. High resolution physical mapping of 45S (5.8S, 18S and 25S) rDNA gene loci in the tomato genome using a combination of karyotyping and FISH of pachytene chromosome. Chromosoma 104:545-550.
401. Yang, G.P, M.A. Saghai Maroof, C.G. Xu, Q. Zhang & R.M. Biyashev, 1994. Comparative analysis of microsatellite DNA polymorphism in landraces and cultivars of rice. Mol Gen Genet 245: 187-194.
402. Yu, Y.G., M.A. Saghai-Maroof Sc G.R. Buss, 1996. Isolation of a superfamily of candidate disease-resistance genes in soybean, based on a conserved nucleotide binding site. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:11751 -11756.
403. Zamir D, Bolkan H, Juvik JA, Watterson JC, Tanksley SD (1993) New evidence for placement of Ve . The gene for resistance to Verticillium race 1. Tomato Genet Coop 43 : 51.52.
404. Zeitkiewicz, E., A. Rafalski & D. Labuda, 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20: 176-183.
405. Zhang Z., Chen G.-I. Studies of Chromosome Banding with Giemsa in Vicia faba and Allium cepa // Journal of Integrative Biology. 1980. - №2. -P. 108-112.
406. Zhi-Jun Cheng and Minoru Murata. Loss of chromosomes 2R and 5RS in octoploid triticale selected for agronomic traits // Genes Genet. Syst. -2002.-Vol. 77. -P.23-29.
407. Zhong X.-B., Hans de Jong J. and Zabel P. 1996. Preparation of tomato meiotic pachytene and mitotic methaphase chromosomes suitable for fluorescence in situ hybridization (FISH). Chromosoma Res 4:24-28.
408. Zhong, X.-B., J., Fransz, P. F., Wennekes-van Eden J, Zabel P., van Kämmen, A. and J. H. de Jong, 1999. High resolution mapping on pachytene chromosomes and extended DNA fibres by fluorescence in situ hybridization. Plant Mol Biol Rep 14:232-242.
409. Zhue Q., Droge-Laser W., Dixon R.A., Lamb C. (1996) Transcriptional activation of plant defense genes. Curr. Opin. Gen. Dev. 6: 624630.
-
Карлов, Геннадий Ильич
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2010
-
ВАК 03.01.06
- Влияние антропогенного загрязнения на цитогенетический полиморфизм семенного потомства берёзы повислой (Betula pendula Roth) в естественных и искусственных древостоях
- Изучение генетического разнообразия селекционных материалов сахарной свёклы с использованием молекулярных маркеров
- Молекулярно-генетические и молекулярно-цитогенетические подходы для ускоренного создания селекционного материала растений с заданными свойствами
- Цитогенетические реакции лиственных древесных растений на стрессовые условия и перспективы их использования для оценки генотоксичности окружающей среды
- Генетический анализ и селекционное использование признаков состава жировых кислот и токоферолов в семенах подсолнечника
