Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЕЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ АНТИСЫВОРОТОК К НЕКОТОРЫМ МОЗАИЧНЫМ ВИРУСАМ КАРТОФЕЛЯ

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЕЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ АНТИСЫВОРОТОК К НЕКОТОРЫМ МОЗАИЧНЫМ ВИРУСАМ КАРТОФЕЛЯ"

Я-22506

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРОПРОМЫШЛЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

Всесоюзный научно-исследовательский институт фитопатология

На правах рукописи

ЛЯЛЬКО Раиса Васильевна

УДК 576.858:632.38:57$.5«5:635.21

Использование культуры растительных тканей для получения диагностических антисывороток к некоторым мозаичным вирусам картофеля

[06. 01, И,—защита растений от вредителей и болезней)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва—1987

"¡Ос&ссУ^ /-а&е/сесЗ' ¿£с€?ссе>е.с#сС£. исс

Работа выполнен» в 1980—1985 гг, в лаборатории вирусологии Среднеазиатского научно-исследовательского института фитопатологии

Научный руководитель: канд. биологических наук Горбунвва Н, И.

Официальны« оппоненты: доктор с.-х. ваук

профессор Трофимец Л. Н.

канд. биологических наук Васильева Г. Я.

Ведущее учреждение: Всесоюзный ордена Трудового

Красного Знамени научно-исследовательский институт защиты растений

л

Зашита диссертации состоится «

/д . мсиь ,

в часов на заседании Специализированного совета К 120,

66. 01 во Всесоюзном научно-исследовательской игституте фнтопа-тологии.

Адрес: 143050, Московская область, Одинцовский р-н, п-о Большие Вя»*мы.

С диссертацией можно ознакомиться к библиотеке института.

Автореферат разослан

«/У . марго-

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат биологических наук К. Д. Титова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В" Основ них направлениях экономического и социального развитая СССР ва 1986-1990 годи ала период до 2000 года" предусмотрено дальнейшее увеличение производства и повышение качества картофеля, улучи вниз его сохранности, снижений потерь урсвая от болезней, вредителей и сорняков.

Вирусные заболев амия наносят паи больший уцерб культуре картофеля по сравнению о другими болеэ пни к, сншсая урожай на IO-S О; а ухудшая качество клуСвеа /•ireidemann и. , 1979; Аыброссв А. Л., Елоцкая i.B., 1930/. ¡Зиенво по этой причине семеноводство картофеля в развитых странах переведено на безвирусную основу, ко® о рая и редусшт риг аэт освобождение растений от в заболев распространенных вирусов в пошздь» различных методов, В процессе получения и размножения посадочных материал постоянно контролируется на присутствие вирусов, Одним из основных методов при эгом является серологический.

Для пригоговлеЕНЯ диагностических сывороток используют очищенные вирусные препараты, выделенные из растений. Ойдеизвестно, что очистка вирусов сопряжена о определеиниии трудностями (калий выход за счет ыиханйческэй потеря их в процессе очистки« иИзкоа концентрация некоторых вирусов в растениях и т.д.), Кроне того, spi культивировании различных вирусе® в р а ш е нпях-хоэя ев ах су-цестзуот адасаость смоаивания нескольких возбудителей поорзд-CS20U переноса tee наоехоншя или механического пврезарааеш«.

Цогод размножения вирусов в культура ткани растений пиевт ряд преимуществ, так кок позволяет 'обходиться без дорогостоящих ТОПЛИЧ1ШХ длецагей, кошшч&ет необходимость вырадиванид к ухода за'больший количество« растения* борьбу о штгочиеленгсши изез-кошлмьперанасчякаш зкруешае болезнен* Недостагкоа метода является вязкая концентрация вирусов в каллусах по сравнения с растеншши/ одначо разработка оптииальтк условий-культивирования ин^ицироэшися каллу сных тканей моает повысить вьэсод г л руса и обеспечить получение виоокоактигнего антигена* сз об одного ст пигыонтов, удаленно которых при проведении очистка представляв собой одну из слсшш задач.

■ Цель и яздачя наозедовоктй. Задачей 'исследований 'яьааась разработка цатода-раэшсиенниаедотсрих ^оэадчцьос зарусоз яз;~ то4»ля (х, У,3 и^Ы) .в' культуре: тканеа растения а целях■ приготовлений на их оснавв-'дйагностичзстах1 антивдг/сцьгс еазэрогз;:.

В сэваи о этим веойсодпао было изучить «едущие вопросы:

- иод образь sкэйш-накопитела, содеряоцн в вируш X, У, s , II картофеля s высокой концентрации; ",-

- гзучкгь диягшшу ншоплвния вирусов л каллусншс тканях п -опрзделаїь сроки использования их в серологических целях;

- - хцевюь птаїсіовііа различна X и У вирусов со способности нанашивать ся в культура ткааа растений я по их «питая во а активности;- ...

■ - разработать слое осі дзигееяыюго культигироваэияХ и У ва-русоз а ршшх каплусньк тканях;

- изучить розиодвость храпения антигенов X и У виру cos в культуре ксавл; ;

. - ПОЛуЩІТі ВНСОКОаІГЇЯЕІІНв специфические антисаворэтхи к X» : у, s « и II виру сан карто фоля на основе антигенов* разшаїеанкх в каллусных тканях.

. Научная новизна исстедовастй. IIa основании полученных экспе-раиеигельЕих далных впорзие доказана возшнвость использования кульгурц ткеня расі ou чД в качестве нгяодияелей X» i, s , К виру- ; соб картофеля в цдьях получения даагцосетчесик активарускыг сн-воротсх. Установлено, что сдабовлрулентные итаикы ХЕК а УВК на-к£аии:вштся л культура тй£1ш в более высокой концентрации а обео-печюоэт ПОЛуЧШШЭ СЦЮрОХОК С бОЛЭЭ їцеокии TÎITpûa, 4021 сядьно-гирулоніяие» Выяшгся агинуяярущэй эффект ъ -глюїоїшва, ь -гдю-їаівковоз кзелогы, глицина на репродукцию ХВК к УВК в культуре ткэнп.- РаэраСосаи способ длительного культивирования ХВК в рых-,:Лїй; .Е£ЛЛуСЕд 'кулЬїургЗ с понощья повторной инокузядаи последних ехэрглыап ле$«кіїіоеніін соиои растений, что позволяет значительно довцедтъ хокчвнтрадвэ вируса в вех. Впервые вцделов вирусный прапараї ХВК в чистом гадз из культуры ткави рамоняйи ва его основе полу чопа строг осп ецифячзская высоко активная сиворотка.

Практическая неяттость я реализация результатов работч. Раз-раСотая негод пріготовлшия высок скаче ств еншсс шв орет ок s I, У, 3, И влрус^ы картофеля ва основе антигенов, разивоаевшсс в яудь-* туре ткани растаний. Получены диагностические су в о рот кя к зтюі " варусаи, ÄOicjue апробирована в Среднеазиатски ¿плисла ВУРа ви. H. F. Вавам» а на аоллвкцм картофеля. весе ад эй н летней посадки, : sa прокзводегл«анод ¿азе украинского НІЛ сД шяробиологии, а текзв в Елолегэ-почзбняоу ингавтуте ДЗНЦ АЯ СССР на растениях картофеля в период цветения про оценка-их ва зараженность виру-

ceust.

, АпроДадяя раДотч. Результата работы доложена на копферзнца-ях юлодых ученых /Иооква, ВШШ, 1985» 1935/, на нзп^раащот, . сосаацеакой 25-летяв образования САНИПф / Таздсеит,1984/, ка Всесоюзной' совещании по ¿zpyctaut боло;еяу рассеви1 /агдьтс,1Э&4/» на НГС- й коордикациоялых coaздгзют в IP3I, ISS2, I9S4, 1Э35 гг. и на эасёданнк когиссид со вдрусныи ж ийкаплагазвша бодеэЕЯы растений при отделами защити растеаий ВАШШ, 1935.

Публикация результатов кс^вдовзни.Н. По ыатораалагг диссертации опубликовано 3 работы. .

_ . Стр^тцра и объем Лйссертапгтя. Диссертация состоит из вваде-вия, литературного обзора, описания материалов а истодов ссслодс-занвд, полученных результатов х ш. обсуидэнпя, внводсш, праг^цче-скнх рекомендаций и списка литератур, включающего . 253 пгаогагса» »'юл числе 98 зарубаашнк агаороз. Дио-сортацзя изложена иа 140 ' страницах исшииописеого теаета, вккючает 23 т&блмщ и 16 р£*сул-хоз. i ^ * "

Ваввтиоды я кзтодч ксследоваич{. Объекта«;! иссдздозалгй елу-ашш осяовша вирусы, пызрзаадае шзаичные габол егоши картофеля. (2, У, s , U), серодиагностика кетор^ ькрохс используется в соль-йнскозяйственной практике.

ХВК представлен в-работе двумя miaauaiaií слсбошрулентниа и сильыовируяентнши псрвна из них выделен из растений картофеля на производственник аосадках Ташкентской области, агорой получая яг Украинского !Ш с/х микробиологии , ,

Одаренные препараты двух итемпов увк ( слабазкругентна^о У® и типичного зккс) прасланы из Белорусского' НК£ зациты растений в *¿OJ!DI из И роВШШОП СОСТОЯНИЕ. ' ■

. sBK и 13К получены из украавсяаго ШИ-сД аикроблолагаи, института кертофелъ наг о. хозяйств а РСФСР и Среднеабиагского ^иоала ВЗРа №. Я. й. Вавилов а в клубнях различных copio» картофеля.

.. Вирусы поддакивали на раствипях-хозяолsx, ксторцз иодсльзо-валн для гыделеЕпя ия|шированного каллуса. .

Содзржапяе влрусов в культура ткана определяла путей Скол»* гичэсного титрования на.растениях индикаторах: ХВК на СскрЬгеп* globosa ила Chcaopodlvm ^-ainoa ; УЗК - на дикой форма «ар-:

тофели TE-I ¡ми гибдода s&K» УВЕ выстлала серологччасхн ие-тодон кепейьиоа - агглютинация вг стекле, так пак надежных расто-

акЯ -ИЕДЯкадоров с ивстЕоа рвакцквИ ш заражение атяцд внрусаиа нет.

Ввделениэ ов^ЕКчалс тканей, с оущагтзляли по методикам, гая- . савади в литературе /üurashig« т. » Bkoog Р. .-1962; £утеэ--ко Р.Г., 1Э6 V» Выращивали ткези втераостатноакомнатепри.гг-24°C. На 21-30 дакьго сл е изолироа ааия оОраз оа авэяп ся: в а эксплантатах каллус дассяроваля васвезсу» пвтательаую среду с сдновре-ывннш! определение»! - содержания-вируса л нам.

сов з культуре тканя» в питательную среду добавляли следующие прЕпар^п:; глицин». коричную кислоту,. ь концентрациях

50, 102 и 300иг/л, валиви 1>глютаии новую кислоту 50 л 500 до/л вданин I, 10,г0щ>/л,кинзтив 1,5 и 10 ur/s.

Негодна.повторной инокуляфи ршонос-кадаусшк *дгл«рур Х-ля-русоаС^а яреди ei омизу чения, пОэтомуподробяо описана в результатах исследований./

Для длительного хранения анфдцирсв шнж каллу сных. ткэл е.Ч ио пшыг&дл различные:протакташц: лактозу,.глицерин, _кмдауи и егарязсвакаув питательные ср еды," к оторшя а алла али пршавиуюся ' после sepecssa каллу сну» гкан£. Контролен служили иифвдирэьавиав каллусвые ткалибвэ покрытия. ..

Для. приготовления диагностических сиаорото« иотсгаь«аваля кроликов .в возрасте S-I2 месяцев, в seo и 2,5-3 кг. Иа лахдид вариант олыт а. включали па г.кролика* Ишуяазировалн «авогнж внутривенно. В качестве сдтигека применяли шрусн, разнноЕЗниыв а культуре С8ани» РеяшувкзацЕэ проводили через несли. Кровь брали на день посла последней икзевдуи»,.

-Очистку ХШС ИЗ ЕаЛЛуСЕОЙ нулхтуры Ditura Straaionium

проводкли по иетодикд, рвкоиеядааанаоз для пллучшкп osiucaaiaa: препаратов из растений. Иццу низ провали *ив си ни: очкцешши препаратом по коибянирсвакши! схеиа {тра знутрикОнких иньеквда в на-цолпщ! адьавшгсои фрейнда и два' внутривенных) с вводе ни е« nmtpo-доз щдигева /Гкутоза Р.В.»,СиСирякова И.й.

. Сйдерлзяа в ярусного белка. в очкдеаноа проларато и количество ойдего белка з каллуceldc экстрактах определили по истоду loypi /Еошсез B.A., IS$7/.

Электрофорез в Еойгакрялиадкоагел* проводили по иеасоду Сефонола в Са^олаЕоИ /Сазонов В.И.,^ Сазонова Ы»П., 12&9/..Статистическая ьн&лиз э ¡receptora нтйгл ata л&ышх - во Снедаяору /Сно--;скор fe.. У., 1?БХ/.

Большая часть, ссследрвааий проведена о ХВК, так как ей рус накапливается в растениях в высокойконцантрацда,- устойчив 1а , легко дяагносадруется серологически и икое* надежные раствшш-нндикаторы.

. РЕЗЯЬТАЩ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

I. РАЗРАБОТКА ОШГШЫШ ЯЛ ШИЗ КМЬТИЗИРОВАНЕЯ >.', , ' * и ВВДССй В ХШЗСШХ.ШЬТИЦ. ' -

При разработав-условий культивирования X, Г,з и Ц вирусов картофеля в каллусных культура* с цель» мзкслзэлъкого 1К накопления изучалась с л едущие вопросы: ри^ор органа растения, раслрсде-леите вируса в каллуских тканях, выявлеше налдуснш культур,спо-собтлс накапливать варуры в: высокой-ковВДктрацди. Проверка Ни-фекцзонкос!и 1каиаЗ,солучошшх из чердаков, стеблей и лесть ав за-рзганжл: растений ду равна, глвтиаоэа табака показэла,что а дир-тозых каллуса* всех исэдтанньк видов растений концентрация шру-са Сила значительно кие, чей в каллусах стеблей п ..чареаков,поэтому в своей работе иы использовали только листовцзтхаии растз-най. Экспериментально покгзаао,.. что спт:щзлышн срохои для изолирования культур является период проявления пврвьл с21ШТ01;аэ аз рамс шт-х озя ев ах после .тх инокуляции. Изучение распределен:« вируса в каллусивс тнакях, выявило присутствзе его зо всех зонах роста, поэтоау в работе ин использовали каллус полйостьй, освободив его лшь от старцх клеток. * ■ _

1,1» Внявжаияа Еэллускш; культго, споообкшс накаилтаать

У.5 , М вирусы в вчсокрй кониэнтр-чт.ддя этой Доли 3 культуру <5изя внделеиы осношше раотения-хозяеза с спсземяо.1 я местной роавдей на заражена«.

При отборе культур в качестве узкыштелвД учитывали иат«нси5 ность роста тканеЗ и степень.- ах ивфокидоиности. Из 36 еспитгла« вцдоа растеика наиболее ооссодк^куи для культввкро?агая ХЁК является Лвстоэые ткаш Са-Ьига' аНгалооша « К1со'Ь1о.па ¡;1иЪ1госа , И. tsЪac'Ltш сорт Ос-хроппта ЗСОО} .'ан- у£К- В. »

К. <1еЬпеу1 г для в Solar.ua ■и.Ьегоэ'цп , чз

1*2* ■ Дщц'.д'ка,.вякал ген яя X а "У'т^; сов в гулгтуэ^ »yft--.it. Пр*/. мэучанян дпаапмс;: разиао^еная ХВК в основ ¡их Iканях-на*о-кт <жх Оххо выявлено, кто в плот>: л по структуре яядлугач лур^а^а

- ? -

руО'прксугс1вовш1-в вноокой кош1«н11радии за'Есеа проишешк яулх-тявироваиия. (бодвв Лв ивсйНвв), в рьхлис калдусак ir. glutinosa и * n.tabacura концентрация его в первых пассатах такав высока,. но эти: тканя начинит утрачивать вирус: значит ельнораньше(посл а . 5-14 квсядвв пассировалзл) /табл. I/,

Таблица I

Дикалака'разшоаошя ХВК л ссесвншс кукьтурах-нэколвдалях .

Ввд: растения-;Количества некрозов на ! кист рал ввия-ккдикато оа

источяика :при пасшрояачии через... месяцев

каллуса : ¿ ... 6 . I0 . 14 . ю ; 43 *s Y :НСР0

О.ГймопшГ Yl9,3 238, i" 183,1 165,3 T¿0,5 "sS,6-S'* = 4,85 s-' * * - ■ ' ' ' HCP0 ф ¿24,30

E.glutiDOsa 127,P 1СБ.1 60,5 56,3 0 0 SI

KCPQ^Qg « 8,15

lí.tabscum 115,6: 90,2; 39.3: 6,0 O O S x .2,30 OC|gMS« . - . ^ - _ KCP0t£5 -11,50 ■

Сйнако со- скорости нарастания клезоадои масси и количеству экстрагируемого сока рнхлые каллу сынрзво сходят плстшо в 2 л Солее раз, ^10 очвяь: Ьаяно ярг кассовое варгбетка антитеза.

Даяшгв по иродолягаельностЕ еасравскяя.уНЕ-в ,гсаллусж1к тканях прадставлана в тайлиде 2.

Таблица 2

Динешиэ. накопления УВЕ ЗЕудыуоа. ткала рааеидй ■

Зяд р ас т внял-; Количеств а некроз сз на I лист ргетгакя-кадякатора

ие~очз£Е& titpn пасся do чеоэа^... цзоянеа ' •

• нгллуса : j .. з t í 7 : £- :S х :JíC?0j£g

~ Ч!~38,7 ~ гзТв" " Ta7l~ ~ 5,6 "Ys~ ~

И. eltttiuosa. . 32,8 18,Э Э,7 О S3. ■ ^ 3,£ ■

V * .'■■.';. " ■ НСР0,СБ ¿ 6,2 ,

: Еэ.ггСгкцз.2 ктдно,-что сравнительно высокая концентрация. J5K. сохраняется месяцев гультяЕКровазпя, а аатаа погтснен-

. ко снзггазтся.. Обнаружить зад с на удается сосав 9 (н. glutinosa j : 2 10 (S. dotaeji J цасселеЗ.! * .

г. изучение итащсшл..?азлич»ш x и У е пру с го карт0с2ля по ■

способности шктишься а шьш тхани рдстеняз

2 Л .- Ш та ют уВК. Степень.проявления оглптоиов заболевания, при заражении растений гаабо-и сильнов лрулентшлш сгздгшш XBS в... 1евдЕзе года различна, Наиболее садввов nopaaezaa. наблюдалось зесао," к осень» ¡¿pi оптии&чьнж тештературшсс усаоваяхдля papains Накодлешэ изучаемая шсашов ХВЕв каллусвых культурах дуруава,.глзишоза и табана.Сстрссиет ЗООО при .выделении ■аса период уцоренногопрс явления сашгоаов нара ст евпях-х сз л ев ах прон оссд^ло в з ait oeojj ар костя, характерно а для разиасзсешя ос в янта:«ша растениях: слабовир<улен№1й втами засашшзался в. более зчсохой концв етВ культу раткагш слабый итойи п сохранялся насколько дольне <ptic.I). Прд геделелйн.кадлусозв-кае и скзябре, когда санатпва на'растснаях проявлялись пелбслаа интенсивно» и сильпоенрулзнткий етйим вызывал зкачдтэльаое угнетение растений, каллусообраг овшше са экоплавтатах табзяа снизалось на VO-SC^p. Рост клла^ьной ухелд в nepfitK 3-4 пассажах tskiq . был запет но угнетен, а содержание рчруса в эти тканях возрастало, т.в»; пзявлл-лась обратная зависшоеть и еаду скорость в роагаткана и степами еа инфешяонаости, ... ... ...

Акт паяость калдусеобразования а рост ткани дурааиа нэ.заэи— ' зала от штаыиа шруса.

2*2. йтактты УВ?. йзученда длз аи яки-рази иоде цвя пгэигааз еьявило, чю слабовируъентта шгаиа У0гв «ашс. и. dobnejt ,t н. piuttnosa ■ наздшллэЕЛгл в Сзхьаей гон^ентрапли и сшсрс-чяг -ся в вкл. более /дизельное вреда»

Нг* оси оаал«и влш из л саен нот о исзяо сдетсгь заггаз панка, на использовать в' сораюгачексгх целях креддочкггздьнев сле£сзл рулетные aiavwtr, так н£к они даат bocmiil выход ткякп л Ezpyca с е дли иод среды,-хотя в опродалвящаусятвкяххорСшЗе результата могут бать подучены и-лрг кульгиэироаашя еягьнолнрулэзтгэго итенка.

3, РАЗ РАЕ Cm СПОСОБА ДйilSUsUOT 0 ДУДЬ^З^ШлИЛ IH.

' вирусов штоселя 3 шлусн^сс miotjtlz

Прирост клетэтиоа пассы pixrai хзллуог« Цуя*>-р.ур at пассажа к пассод значмельакД (Селso. чем однако зтг тка-

нн (Ык-рс эяймннкрую? вируса. /ля удлинения ■ срока. к,у№г и-

«ирсейьм тканей с высок за cuj е кц* ozec став рдзрасчтган просси *

пассаж â 4 6 ' •, 8

г слабовкрулвішшй итаіш сиаьваЕярулзагяыа шїош сяабсїярудангшй slicsjii .сальногируле ¡ra шЗ ffixauu

ІИО. І ЙНфОХІСІОННООЇЬ И рост яаллусныг KJJlbïïP '.

ÎT. tabacuQ сорт Остролист 3000 S ПбртЭДЦ о улораяш« (а) и иаксишзлыод (ö) проявлеиаеіі ■ ■ сігагоиов. * ; ' '

а$^еК1Е21Ша способ noctopaoa ЛНСДуЛЬЦЙЯ аГВЯруССИ.

5.1. HcntopK&g tffQKr-THi^t геК^ ПерзозачалздоЗ я непрост о2 • задачей'при разработке- способа повюршго заразения гкддусшс тда-леНявшгось получеяяв стерильного шанузшка. в сограншшеа высокой его Ен^еквдоашсгя. Для пртг^тоалвнся инокушва хани (ша кспыханы различны» известные njiieai сгерпнзгзацса: сока щ^ацд peanas кых расгешП: нролускавиа чзрвз фгаьтр Зв£тоа с ялдсеЕяоа Oí, 'неыбрадаые £ллмры я др. Удоззвтворзтельвыв результата Сшш по-^ лучены хкдь при еспожьзоз&нея хворофорыа, eotopia лргнвнзехси В иедицвнв для вздплвдаявярусавиз фекавпа и ссэтигд ьсд с цзлъп , удаления продут ов,. гсксячтп для культура ткакк, а одаоврва=а- ■ кож сторндязавдя образцов / usyer- а. ,ваее1 к,- , ISCJ/.

Для за piso юш каллуса х-вкрусоц, картофеля ислолззоьаля соя листьев большое растеп&2 Н. debneyi ш К. Glutinosa t собрди— вше в период какйя^адъаого вакошшвзя LHRfcs* Жестья пропниьла s проточной вода в икон и изаелъчадя в гоыстеоязаторв» К свехс-. отжатоиу кяфедаиозноцу сокудойишгая хлороформ (IQí) х шва. . астряхаваля на юл еду в leiesno 10-15 шнус. necia eíciq скоростного цавтрЕфутяроваалн (ЗКЮ об/шн; 10-15 гавут) вздосадочиуэ адддость «подьэшазш дйй эарс^ашя. - ■"

Для кзокухяцяа каллусных ssesos за основу ваог вгбрадвоЕкыЗ ииод / Beachj 2.N. • mráfctsbi ff.H. > 1971/. Работу ярозода- '* га в асептячесяях усаозяяг; Детсяджа дноду.*шз1а в иззвЗ кодд£.тхз-цня Сыза сдедуючеЗ: прайгкэптельЕо.Х г, слегка." iras ехьчтт oro usa-вдтоц каллуса в Ю ил ерэда ш 10 its суспекзяопког куд-ьтури вяосадн в ссерсеьшз хакбочкл с 100 кр взлзта пел-карборунда к добавляла обработанный хворо^оркоя ва^ езщЮЕНкЗ сок. Соотвсзр-вея аасгуса я ивоя^зшна, a latna резке шгояу.кя^д'ж пвдСяргхя эксперта зитальпо. Пздбгагео эффеЕгкзЕоо зарез ess ее служено пря доСаз-лапта 3 ил сисдулага паервиеадЕангд.в irrreejo Tortex в тсчаняз 1-3 инйут вря аярсстя ICOO jtarsfaEzJ a iaayíj. эбессзчетая ' яапЕса сгерясьносхя в надув Еэдбсчку ввоеггк ргевэр сеязцапю-' яа в стрслтсьЕЦЗна (100 ад/лая 50 егДя состггзвгсано), сатга встряхивали я рассзЭДзш на ег&рлзозсг:;э шпеге^ьпуо среду* с коротко растирая алет^л слетелся из scclí roscpi^ocra агара. 2¡i4ck-I® она ость зараженного каллуса гародедпла через С, 15, 30 я ¿0 днеа посла шюкзляц»!. '

3 яроцвссс разрзйтаяя похода гстеслюго гзучалясь .'

такие вопросы как вхвяБиа ncmmxasit;;^ ч сгрсзт^^пщеа на pocs.it

ин^а::цдоішосіь suche;. выявление различий в способности кзаразе-ню каллусшк к суспензионных культур» инокуляция зысокоанфицц-ролшпщх каллусов первых nacccsaa в целях поэшения со держати я вируса в них.'

Получению реззлмаац показали,- что дополнительная инокуля-цгя позволяет повшать пн^екцдонзость тканей до уровня первых, пае caí о à, до&імсіШв пенициллина и стрслтоаацина сразу пседе за-ргг.ецгл отріцатзльного влияния на1 инфекционное» я рост каллусов ио с::азііааги» Анализ иіілевдіснкости кульзур после заражения (тас'л.З) ійгсіїзгл, что концентрация вируса в тх уже через 15дне,1 з^цзетз о;»ю правив aot исходную достпгаот иахишуиа к концу ыесп-ца и мтаюся па'висе:: оу урозка з течз:зіе Z-3-x уссяцез, а затек nceicns:«» с:идассся.. Joapecvaim титра вируса в рпстущай ткани служит 'сііїїлатсльстмоіі.яваоз репродукция патогона внутри і;латок.

■ * Таблица 3

КіОсаздюшость суспеїшопюд и калл ус л о а культур, ' частично утративших.вируо в процесса пассирования, после ' повторного зарамыга.ХЁК'

Kjnbiypa ткана

Количество нзкрозов заї лися раиенш-иидкяатора.. nntí зі пат«нті . -

киоіст- їИскод- :кнокудированнол тканью ;

юкод íiicci ; чеїдз риоц__iS ж; HCPQ Q^

І IJCÍLHblfi * * . • , » - ¡ *

î і б : .15 t- 30 ; fcO :

галлуо 154,0 I9t5 37,3 66,2 .155,3 I?3,3 S 3t a 3,78 суспензия 154,0. 19,5 51,1 £b,8 I44,ü I2T?,5 HCPQ ^=16,00

; Цифровые данные табл/лш 3 свидетельствует о тш, что заражение ¡селлусзоЗ и суспензионной культур дает примерно одинаковый уровень ии^.екдасвностя» однако ишкудявдя каллуса бчзпа рзвода его в суспензий значительно'упрощает методику я сссградает вреда проведения работы, так как щелензяоцние культуры необходимо дополнительно выращивать в течение 7-14 дней. Попиткч повысить титр.вируса о гэмсщыс дополнительно;! аиокуляции зисокоиа^шщро^ bxíhiíí каллусов первых пасс&зея положительных результагов не ли, очевидно, в связи с таи, что все клеточные ълрусслецафичсс ■ .кие сб:;гптори узе сааятн вирусом / Uovikov т.к. .Atabekov v.c. , 1970/. .

3.2. Па^^о? x't'.-лчестах соотнятой, еттагулягл^чх т'зпуко'тг,-; >:'1 g ' к 3.uísí's nos^r.eh;íi копце;irвирусов в куль-

турв ткани растешЩ испытан рзд'вществ,- по датарггур^ш; дсннна стаыуяирущкх репрсдукцвд вирусов. Из;взучайных каии соединения нал более эффективно и универсально яа синтез вирусов в .культура ткани при добавлении их в питательную среду действовали г ли си н-300 иг/я, ь-гзатакиновая кислота,: ь-глгтанин - 50 кг/л. Несколько слабэо и непостоянно оказывала влияние на разшавениа в»-русав велик а киники.. Некоторое.вещества проявляли етицулируо-щее действие избирательно по' отношения к вицгсу. Так кияетян и коричная кислота его эо бета овал к увеличению содержания в тканях ХЗК и не проявляли такого действия на УВХ, а. в болизих концентрациях штибиро'лихл его рсз1шсс;гняе.

езуче1ее боз^нссти £шекьв(г0 хранения А1ГГКГЕ11Ш

да я увя в кгаьтурЕ ткани .

Использозанкз протоктантов (глкцеряяа, лактозы, гкдкой и ага^кзованаоз гтательшк сред) В целях сохранения и:знзспособности клеток ке дало обпздехивоЕЦКх результатов. Поскольку для ишей раОоьц г«-и о подобрав способ хранения вирусного антитела, в доследуадеЛ работа стояла, адача сахри;ек;а; только ик^авдки.коо-тл гкгноа. Долоиктглыыа рззультата.бида получены с и ел сльзш> аллеи лискуш.ноз с$икв кп&ичкрооеяпого кзллуса л экстракта кз него: за 20 кскщез ярэдглчя 1^о;тзе):зогэ кахерюла гп^юя'онзтегь образцов, - КПК и У2К, дочтя но Еэце&иаст,. Материал, кои-серЕлразш:;:::,: с пего-,;!» в: о ¿л ль но а суши, йонсг использоваться ? качестве антигена вре^я года в течепиз продолжит ель кого времени ( до двух лет).

5. РАЗЫБЦГКД ИКС ОТ ОЛЕНИН ДЙЯ'НИДИЩС.та

' шдаан'сжх сазомтсн к ажшк^ ясэаешш е:шсач штодаш на оснше вирусных антигшш, р/дккоеекна . в шлусик шьтурах ~ ■

5.1. тжготогленке дгагноиу.вслха сиворотод г ХВЗ, УВЯ • и КЗЖ с нсшльзоз£ЯЕ5У. кк^ охниоиисго каллусцьго ■ экстракта

. учипаая харылеристгач тканей по кнтелейнссгн. взметано.".' < клеточной вассы к ее кз^еЕЦИотнсзтЕ, в вдгшх пркг »озлен ?л ^аг- *■.. востаиееких щвор&та: ьспо дъзов сш лая рахлцэ, так и глит-^ ше по.структуре келлуеш'о .культура.

Для д1ЯГОТОБле:171д с^г::гега ХКК.з ЛНС брел;: этяодприэа^ле

каллу-гаї пассазей» з ВН и ї!ЗК - І-З-го. Наллусау» ткань го-

иороіззировади, ожшіеля через 2 слоя карли и после иизкоскорост-вого ионгрп^т1.^ова'ш1 (3000 обДан, 10-15 кзут) вводиеи кроли-зчутрзззнао возрасііод«!іи дозаш от 3 до 10 іл через день (? шьеззга). Кровь брали иа 8-ой день посла послвдьеИ иньекади. ' Тир я специфичность лгаучсншя сивороток гоназанн д таблице А.

• Таблица 4 *

Титр и слога {лчногаь сивороток, получеянівс при к ся сліз оаа-ідаї зкстрсятоа дз Иізфшіпрсавицой культура ткани

Зггруо

Яільтура . «каки

: одзяго :цикла

:циа

:п!кои :дсллу-;са ■

Ïfïî0":после ¿іісТТТли.1-* крекінгу-: чкл-:то^е-:аизащш:ксм :ля ■ : :кііл-: ....

. * *луса*

ХВЗ

ш

УЕК ЕВХ E1SIT

B.straaonlun îî.glutlnosa E.deboeyi 5»traderоsua s.tuberoaum

1:128

I:I£6 1:256 1:512

jO

н/рб u/pi

н/рб

1:1024

І її сен іїї084 1:4036

ЇЙ 1:2 1:2 1:2 1:4

1:21:4

^Прочерки а таблица означает отрицательная результат ссатзстсівуяцкк серологических реакциях.

ПримеЕзккз. осзвтленного экстракта для иммунизации кроликов позволило пожучигь сцвэроткц с высоким татрол а удовлетворительно! специ'яедосгыо. Роиуыунизация способствовала значительному погікеаза актеваости сізороіок я вирусам» но при эт"а увелич:гвалел 5нтг и к нориальїіш белкам хозяика-ястоодика каллуса. В тех случаях, когда вир^си разіша^али в каллусах, серологически нород-стэекг^с кархофоли (ХМ, УЗХ), реакцта .о с оно а здоровкх растений . нарт с 5 с."-. ко лазала* даже дольная а;Еорс?ка. Разбазлшжеи сивороток до їьСачего' разг^дег^я (1:8-1:52) устраняется неспецифическая рг-гяция" со гдорзгісіа растёняяии-нхюпитедяиз и улучшается нагляд» езсїі с і розеті: че екга реакцій.

5.2. Ппзчген:*еііт?і;р5 сьдорото* к ХЕК а УЗ К гра гслользоза-н^і і^ія выявления втаивов ХЬЯ л аозы-

аеіігол а^т^саасл активность» опсіракт. из ткаяеї табака, , кн^нш*- ' ¿ованыл. слаСо-г ія ль я оеи рулетах^' зтздха^а, выделениях в перло-.

. дно различила - проявлением еигнионов на разгвншя-хозлеядс.яо-лользозали для иаиуилэации. Поскольку в каллусине кулиурагдур-иана .отклонений в накоплении »ярусов не : наОлвдэлось, дая птаез-wüt лршввялл каллу сц,, видак з явив в пвряод уцерекного дрояглепия свшмиоз, как/наибсяое пгодолзательвдя (taüJ»5J.¡

Таблица 5

Характористико снзоротск, .лолучошшх кщаныав XBJC поел«: двух щедлов иыиунизацвн,

Каллусная ткань

Проявлен;» ГТлгр я специфично os ь сцаорэток к

сикптоноэ î • bi8?wfth

гслобовя р.упенуиоч^: ст лыт лт? н i 'р (3 aíí- i Ь аыййл с ípfc ulñtúiiyo üu.-i . :шя о :соком здо- го гоио-;соксм.эдо-:гоаоло;рового pao; лег пч^- : роя oro pao ;гичкц'лтс;я!я :ныа ад*Я'анв>г_ ..■. . :anTuro:Bcj;o4¡iíaj>- jïnrsnoïîSîj- TTÔip-ÎBOM ïHiuca :тоээ-г iso^îiose-t- . ;кал- тля : . : вика: ля : :луса : : :кал»: ■

____ _ i__; _______:___.__îayça^ _ e

û.sfccaûoniwn уиэрзннэо Iî31i>2 н/рй 1:2046 -

K.tnbacum укоренное 1:8192 а/рб - 1:20ад - -■■

ccj<?

Остролист iООО «аксиыаль- 1:4096 н/рб . - I:I63S4 1:4 -нов ......

Дри условии хорозега poca тканей, кл^алрозешгме ¡гтдауааз 1ВК,'дущка üHTsreKC'j является слабогярулон iiiüíí. итал», . ко торый содержится в хкодях в бссшаоД. ксидан»ркции х обеспочизает получение сшюроюк с более вксокни титром, Скльновируленяшй ВТ1ШЦ, наделенный в период какаиыаиьнсго проявления ситном оа, виз ив ал угнетение роста ткана и превосходил по концентрации слаСэви рулетный итаки в атпх вкоаях*. Сыворотка, получанн?я к сплыгази]ф-лолтнону п1а«му1пуола титр на двапорядяа иле, чей я еяйбому. С&игло для практического применения цело со образ нее ислосьэовать слсбавнрулонтнио щтааиа, raí; кал ожла г шив ал угкогекпя ". луиоебразовашя « роста ткани, -«о.позволяет локучзхь б^-отЗ внхед ткани ишруез с вдк^чы среды- ■

lipa яш:уииззд:« кролнккз шта^адшд УЗД болшуз аитнгеииув активность проявил ихйми у0*

5*3.■ Пгнготгяленио к с.пр-

коп№аив;1руса'я |претт?Г/-угрп | с равливдю.Т стене:п.а частстч. Сргси:-

такьЕОв изучена е фракционного состава балков. в іштактвдх раста-аагаслваллуоныккультургсс- о.шмопіью электрофорез а в полсакрила-иидкои геле показало обедваивость каллусов Салкаци, что оЗьясплат относительную специфичность сивороток при использования для акнуназащш животных • наощщанныхналлу сню, экстрактов.

Поскольку сыворотки ьа были строг о сп ецифи чны, в целях усіра-■ нения реакции о. соком здоровте растаний-ианопитзлеа вируса были получена тасїичзв очидіеішнв экстракты каллусов с псыощ»» обработки ис хлорофорыоа (IQS, 10-15 кин.), что позволило снизить обцва количество белкЬ' с с охраненлек уровня инфекционное!!!.. Анвь логичные рвзулыаты давала лиофилытя сушка каллусисго экогргк-

' Для получения г виру с ного препарата о высокой схепеша) чистоты проведена очистка ІВК из культури ткана в. stramoaiua Количество выделенного вируса в очгаївнноіі препарате, опраделан-вовгаехтрофотометричеоки, составило 150 ііг ва I кг каллуса. Ак-тиген вводили возрастающими дозаии в йебольших Количествах от 25 до 200 шег на инъекция. За один цикл июунизащл использовано го бООшсг вирусного белка па кролика. При внутрикожнж инъекциях проводили шоиестваитге впраскивааия (т. е. в 6-8 точек вдоль позвоночника). Кровь,брали.через 8 дЬеа после последнего зведвния:антигенаи затеи пора оди часки в течение 40 дней. Полученные, раэулиазк шказали," что иаиупизадия лродикоз кикродоза-„ їси очзде иного вируса по нсибкнировщдноз схеме дает возьшность . получать шоокбактивииадчагнос^ичзсілв сиворотки (титр после одного цшела шгьекцаа I:10£4). Наибольшая концентрация штктел отмечалась на 8-15 день после послед кой инфекции. Реакции с со. кои-здоровых растений картофеля и источников каллуса к а ваблв-. далось» т.е. сыворотка характеразоваласЕ строкой спецафичзоотыз. їеким образо«, ва примера ХВК показала воніншіссть получения очищенных виру спіх препаратов га кшкуснык культур и приготовления на их оснсша высокоактивных строг о специфических сыво-. роток. Процесс.очистки вадеса из каллусов прозе,, чек из интакт- , вік растений,^таккан в.каллусах значительно цоньые балков и - подносил отсутствуя! пигненш.

■ - 16 ■'/' . выводы'

X,' Разработан йот од, разня озе нал X» j,s * Н вирусов картофеля в культуре ткани растений и на их основа приготовлены высокоактиз-. нав слоин$яческие.сыворотки отигрок: в ХВК-1:8192-Шб384$ УЗК-1:4056-1:8X92; SBJt-I:ICa4rltBK-I:4056. ; •■.;*■ '

'' Z* Культурани-накопителяшз е иансилальшш содерианиек вирусов являатся листовые каллусы* полученные из растений с системной реакцией на заражение и выделенные в начале проявления самптоцоз, для ХВК: Patura stramonium, Hicotiena gluttaoaa, H. tabacuo сорт Остролист 3000; УЗК-В. elutinosa » H.debaeyi ;SBK и ИВК -Solaiuin tuberosua, Llcopersicon e3culentum.

J. Титр вирусов e длихальноств сохраяваш в культуре ткани зависит от структуры каллусов. Плотные ткакя d.stramonium содержали ХВК в высокой концентрации и сохраняли вирус значительно дольше (более 48 месяцев) ло сравнению с рыкдши (5-14 месяцев ' ХВК а 5-6- УВД), однако они в 2 и более раз уступаю* рыхлы« по скорости нгрзстания клеточной пассы и количеству экстрагируемого из виг сока. < '

4. Большую антигенную активность проявили слаб озирал ен тные штаыш, которые накапливались в культуре ткани в большей концентрации, дольше в них сохранялись к давали саворотку с .белее высокий «строи.

5. Выявлено скшулируадее действие на репродукцию ХВК к УВЯ ' Ь-гляталдна, Ъ-глютаииновоИ кислоты, глицина.. При добавлении их

в шпатель ну о среду ноноднтрашм гарусов увеличивалась в 2-3 раза.

6. Разработан .способ длительного культивирования ХВК и УЗЯ в рыхлис каллусньсс культурах с. помоцъв дополнительной инокуляция последних и вырадпаанея ах на питательные средах* обогаценных од-нпа из «ицулятарав репродукции вирусов.

Консервация ия^адрованной наллусной ткани пожег осуществляться нет одой аномальной сушки. -Диофштаиреввлш! каллус-ниа экстракт не херяех инфекционные и актагекнш: свойств в тече-■ ■ а« длительного времени (до 2-х лет).

^ • - - т. е £ j

8. На примера ХЯЕ показана возыозкость полу чан га очищенного вирусного препарата из лпфниярсванкк наллуеша культур я тоздения на его основе высок оактив и ой ст рог с спaraf ичас;: оз сизо- ■ ротки при вмодьзевакии для кауниэацди глвот;л-к кэкйгилрова:-::;;::

схеї-н тшуиЕэадаа o введением шкродоз антигена.

9. Разработанные усдовля рааиноеешш вирусов а штаммов в . культура ткана растений позволяют "создавать к длительно поддакивать нолдекцип {итояетогвнных вирусов.

' . ^ ПРАКТИЧЕСКИЕ ШШВДАДїШ

В целях проведения полеэой диагностика вирусов на растениях картофеля методов капельной агглютинации готовить диагностцчесюав ал тлеизо ротки Лрще и экошлычнвв о кспатазоганяеи осветленного Юфекцковного каллусного экстракта* так как на его основе удается получать сиворотки удовлетворительного качества без трудоеа-k.ts'ирвіиооов отастнп при кокон расхода каллу сной ткани. Й случае кеойходиисстз приготовлв"кя строгоспецифических сывороток иозша внаелять вирус из каллусньк культур в чисто» вада.

При получении активного антигена не обходимо использовать прнош, разработанше для культ ив яр авания каллусов о выоокой степень*: HHjeitmoimocTK, т.а, вурадивоть каллуси на средах» обогащение РДНІїН из стимуляторов репродукции вирусов (глицин* Ь-гла-такгн, ь-глитауинозйя кислота); работ от ь со мтаамаш вирусов о погшечиой йїмуііогенносви»; дополнительно ин окулировать длятоль-uo пяссярусше ткгшя, но доводя ік до подноДзлаипввдш вируса.

список ашшшшшшх раб аг

I. .Горбунова Н.Е. і Соболева А.£., Лялько Р.В,, Шсвцоза По* лучешо диагностических антивирусная сывороток на oca oso ші-Тйгснов*"разшюя0шая. в культура ткани, іоз, докл. Ввчеадзіи с од он. "Теория ti практика использования иммунитета сД культур к вирусный болчзняц", Вильнюс, 1984, с.211»

¡►• Горбунова Я.И.» Лялько р.В. Получение диагност ическо й сиэо-ротки к У-ікрусу картофеля на основе антигена, раз иц аі енного в культуре ткани. СД Биология, 1985, с. 121-124.

3« Горбунова Н.ЙІ, Шевцова Я.Б., Соболева А.Е., Лялько P.S., Козицкий Г.В. Поддержание коллакіші фитопатогенньк вирусов г ах мамаев э культура ткани растений (Католические рококен-" ; давдя)- ВАОШі, САНЙЗО, М., 1936. '