Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование иммуноферментного метода анализа фитогормонов для характеристики начальных этапов роста проростков кукурузы, пшеницы и овса

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Использование иммуноферментного метода анализа фитогормонов для характеристики начальных этапов роста проростков кукурузы, пшеницы и овса"

р Г 5 од

? п НОЛ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ И ФОТОСИНТЕЗА РАН

На правах рукописи

ИВАНОВА Елена Петровна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММУНОФЕРИЕНТНОГО МЕТОДА АНАЛИЗА ФИТОГОРМОНОВ ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАЧАЛЬНЫХ ЭТАПОВ РОСТА ПРОРОСТКОВ КУКУРУЗЫ, ПШЕНИЦЫ И ОВСА

( 03.00.04 - биохимия растений )

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 1994

Работа выполнена в Институте биологии башкирского отделени АН РАН и в Институте почвоведения и фотосинтеза РАН

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор В.И.Кефели, кандидат медицинских наук С.Ю.Веселое

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В.М.Липкин, кандидат биологических наук И.Р.Прохоренко

Институт теоретической и экспериментальной биофизики

Защита состоится "20" декабря 1994 года в 10 часов на э седании Специализированного совета по присуждению ученой степе кандидата биологических наук ( Д.200.29.01 ) в Институте пое ведения и фотосинтеза РАН по адресу 142292, Московская обл., г.Пущино, ИПФС РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИПФС РАН.

Ведущее предприятие:

Автореферат

1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

/ /

-3-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В растениях су-[ествует особый класс веществ - фитогормонов, осуществляющих ре-■уляцию метаболических процессов на дальних расстояниях. В насто-щее время физиологические функции ауксинов, цитокининов, гиббе-еллинов, абсцизовой кислоты, этилена и брассинолидов не вызывают омнений. Современная концепция гормонов растений тесно связана с акими актуальными проблемами сельского хозяйства и биотехнологии, ак формирование и хранение урожая, размножение растений, культу-а клеток и тканей, формирование новых генетических измененных ипов растений и т.д. ( Lang,. 1956; Kutachek, et.al., 1981 ).

Однако до сих пор некоторые моменты биохимии, а также меха-измы действия эндогенных регуляторов на начальных этапах росто-ых процессов у проростков остаются во многом неясными. Это отно-лтся, в частности, к их синтезу, транспорту, проявлению функци-яальиой активности, компетентности клетки к восприятию гормо-1Льного сигнала, функционированию гормонов как единой регулятор-эй системы растения. Решение этих вопросов во многом зависит от пользования адекватных методов определения содержания эндоген-IX фитогомонов в растении, поиск которых продолжается в настоя-зе время.

Новые возможности для решения разнообразных проблем гормо-иьной регуляции открываются с внедрением иммунохимических мето->в определения фитогормонов в сочетании с адекватной подготовкой ютительного материала.

Иммунохимические методы давно используются в биохимии жирных. Однако они долгие годы оставались за пределами интересов юхимиков фитогормонов, поскольку растительные гормоны по своей ■ироде яляются гаптенами, т.е. неполноценными иммуногенами, и не особны к выработке антител в крови животных. Тем не менее, в чале 1980-х годов было описано получение иммунной сыворотки к ксинам, а затем цитокининам, гиббереллинам и абсцизовой кислоте eiler, 1983). В настоящее время продолжается процесс совершенст-вания иммунных методов тестирования фитогормонов. При этом проходит основательная перестройка всей системы анализа, но суть о остается прежней: получение конъюгата фитогоромона с белком и другим носителем для придания ему свойств антитела, получение мунной антисыворотки ( АС ) на этот конъюгат и использование ее я определения содержания гормона различными способами.

Наряду с эндогенными регуляторами роста в настоящее время известно огромное количество синтетических соединений, влияющих на биохимию и ростовые процессы растений. Хорошо изучено герби-цидное действие таких веществ, как глифосат ( Н-фосфонометилгли-цин ) и триаллат ( Н,Н-диизопропил-3-(2,3,3-трихлораллил)тиокар-бамат ). Однако в литературе описаны, как побочные, эффекты их применения, проявляющиеся при обработке растений физиологическими дозами этих гербицидов и связанные с регуляторами роста - ауксинами и, в некоторой степени, АБК и цитокининами. Такое негерби-цидное действие возможно, имеет более важное значение, как для понимания глубинных механизмов действия гербицидов, так и в плане исследований гормональной системы растения.

Цель работы заключалась в разработке конкурентного варианта иммуноферментного метода анализа содержания эндогенных фитогормонов с применением его для характеристики начальных этапов роста проростков кукурузы, пшеницы и овса, а также в выяснении особенностей действия гербицидов глифосата и триаллата на уровень гормонов у этих растений.

В задачи исследования входило:

1. Разработка системы экстракционной очистки свободной индо-лилуксусной кислоты ( ИУК ) из растительных экстрактов с целью использования для определения этого гормона иммуноферментным методом .

2. Разработка иммун^ферментных тест-систем для определения содержания ИУК также исследование специфичности полученной на ауксины антисыворотки к различным соединениям индольной природы.

3. Получение иммунных сывороток для определения природных и синтетических цитокининов. Выяснение возможных пределов применения иммуноферментной тест-системы на зеатинрибозид для определения содержания эндогенных цитокининов, а также их синтетического аналога - 6-бензиламинопурина ( БАП ).

3. Определение содержания ауксинов и цитокининов в проростках кукурузы с помощью разработанного нами варианта иммуноферментного анализа.

4. Выяснение особенностей действия гербицидов глифосата и триаллата, как возможных ингибиторов синтеза и транспорта фитогормонов в проростках кукурузы и злаковых культур.

Научная новизна. Разработан вариант конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа ауксинов, который

юзволяет в динамике определять содержание эндогенных фитогормо-[ов в тканях растений на начальных этапах роста проростков. Приеденные в работе данные показывают, что простой экстракционной чистки вполне достаточно для подготовки материала к иммунофер-¡ентному анализу ауксинов. Она позволяет освободиться от основной ассы интерферирующих иммунореактивных компонентов. Это значи-ельно ускоряет процедуру определений и увеличивает точность и адежность метода. Установлено, что иммуноферментная тест-система бладают высокой специфичностью к природным эндогенным ауксинам, ричем иммунореактивность метилированной индолилуксусной кислоты казалась значительно выше кросс-реактивности антител по отноше-ию к другим испытуемым веществам индольной природы.

Полученная на эеатинрибозид антисыворотка позволяет с высо-ой точностью и чувствительностью определять природные цитокинины еатинового типа в неочищенном экстракте. С помощью антисыворотки 6-бензиламинопурин-рибозиду ( БАП-рибозиду ) впервые удалось ровести раздельное определение цитокининов синтетического проис-эждения группы БАП и природных соединений, использование конъю-атов различных цитокининов позволяет изменять специфичность им-¡гноферментной системы, приспосабливая ее к экспериментальным за-1чам.

С помощью иммуноферментного метода определения содержания 1Догенных фитогормонов в тканях растений подтверждена справедли-зсть классического представления о гормональной регуляции путем зменения как количества, так и соотношения различных фитогормо->в. Показано, что под действием глифосата в проростках кукурузы >оисходит уменьшение общего содержания ауксинов, которое корре-грует с ингибированием роста растений. Аналогичные результаты Iлучены при обработке проростков пшеницы триаллатом. Обнаружено, ■о снижение содержания эндогенных ауксинов зависит от концентра-[И гербицида в растворе, которым обработаны растения. Отмечена гложительная корреляция между содержанием эндогенных ауксинов и оростью роста растений пшеницы.

Практическая значимость. Разработанные ми экстракционная очистка растительного материала и иммунофер-нтные тест-системы позволяют с высокой точностью и чувствитель-стью определять природные фитогормоны. Высокая надежность и орость анализов необходимы для решения разнообразных проблем рмональной регуляции. С помощью АС к БАП-рибозиду можно прово-

дить определение цитокикиков синтетического происхождения группы БАП и кинетина в культуре тканей, где они широко используются, а также в различных модельных системах при изучении механизма действия этих гормонов. Определение содержания эндогенных фитогормо-нов с помощью иммуноферментного анализа, а также выяснение механизма действия гербицидов на рост культурных растений могут быть полезны для ускорения внедрения результатов теоретических разработок в практику селекции и сельского хозяйства.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзной конференции молодых ученых "Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов" ( УФА, 1987 ), на 7-й Всесоюзной конференции "Методы получения и анализа биохимических препаратов" ( Юрмала, 1987 ), на III-й Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки ( Петрозаводск, 1988 ), на 2-ом съезде Всесоюзного общества физиологов растений ( Минск, 1990 ).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объетов и методов, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 117 страницах, содержит 23 рисунка, 6 таблиц. Список использованной литературы включает 195 наименований, из них 78 на русском языке.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований служили колеоп-тили кукурузы ( Zea nays L. > линии ВИР-38, надземная часть растений пшеницы сорта Московская 35 и овса сорта Астор в стадии кущения, выращенные на дистиллированной воде при '26*С.

Подготовка растительного материала для иммуноферментного анализа. Растительный материал ( 1-2г ) гомогенизировали в жидком азоте и проводили экстракцию 80%-м этанолом в течении 16ч при 0*С. Полученный спиртовой экстракт после фильтрации или центрифугирования упаривали до водного остатка ( фракция 1 >. Для выделения свободной ИУК рН раствора доводили до 2-3 и экстрагировали эфиром в соотношении 2:1 ( органическая фаза/водная фаза ) ( фракция 2 ).Кислые индолы затем реэкстрагировали 1%-м раствором бикарбоната натрия в соотношении 2:1 ( органическая фаза/водная фаза ) ( фракция 3 ). Дальнейшая очистка достигалась путем подкис ления водной фазы и вторичной экстракцией эфиром ( фракция 4 ).

Для определения содержания цитокининов использовали водный

эстаток ( фракция 1 ) после замораживания, оттаивания и центрифугирования. Содержание свободной АБК определяли в конечном экстракте ( фракция 4 ).

Разделение компонентов фракций 1-3 проводили с по-чощью бумажной хроматографии в системе растворителей изопропа-чол: аммиак : вода ( 10:1:1 >. Носитель Whatean 1. Вторичный эфирный экстракт подвергали тонкослойной хроматографии на пластинках Си-пуфол UV-254 в той же системе растворителей. После хроматографи-эования содержимое каждой зоны элюировали 80%-м этанолом. Элюат рпаривали, сухой остаток метилировали и проверяли на иммунореак-гивность иммуноферментным методом. Содержание связанных форм ИУК эпределяли после их гидролиза с последующей экстракцией.

Иммуноферментный анализ фитогормонов. 1ри получении антисыворотки ( АС ) к ауксину, зеатину и 6-бензи-1аминопурину ( БАП ) перед началом иммунизации кроликов было про-5едено ковалентное связывание гормонов с БСА ( "Serva", ФРГ ) для 1ммунизации, и с овальбумином ( "Sigma", США ) для адсорбции на юлистироловые планшеты. Конъюгацию цитокининов проводили по Эр-1анжеру и БеЙзеру ( Erlanger, Beiser, 1964 ), ауксинов и АБК - по ¡•учс и др. ( Futchs, et.al., 1971 ). Иммунизацию кроликов прово-1или путем внутримышечного введения 1мг конъюгата гормона с БСА в 1,5 мл полного адъюванта Фрейнда ( "Dynatech", Швейцария ). Повторные иммунизации выполняли с интервалом в 2 недели в течение 1-х мес, используя то же количество иммуногена с 0,5 мл неполного |дъюванта Фрейнда ( "Dynatech", Швейцария ). Сыворотку отделяли |ерез неделю после последней иммунизации.'

Конъюгат гормона с овальбумином в 0,05 M натрий-карбонатном буфере (рН 9,7) наносили в лунки полистиролового планшета ( Фирма inbro ) и выдерживали в течение 1,5ч при 37*С для сорбции на вердой фазе ( сенсибилизация ). После 3-кратной промывки раство-IOM, содержащим 0,9% NaCl и 0,05% Твин-20 ( "Loba", Австрия ), в унки вносили АС, разведенную в 10000 раз раствором, содержащим ,9% NaCl, 0,5% БСА и 0,05% Твин-20, вместе с раствором тестируе-ых веществ или растительным экстрактом. Инкубировали 1ч при 37*С. оличество иммуносорбированных антител ( AT ) оценивали при помои вторичных ослиных диагностических AT против иммуноглобулинов ролика, меченых пероксидазой < Институт эпидемиологии и микроби-логии им.Н.Г.Гамалеи, Москва ). При определении ферментативной ктивности связавшейся пероксидазы в качестве субстрата использо-али Н2О2, а хромогена - ортофенилендиамин ( Erlanger, Beiser, 964 ). Хромофорный ответ определяли по интенсивности окраски, олученные АС связывались в твердофазной иммуноферментной системе

с конъюгатом соответствующего гормона с овальбумином и не реагировала с овальбумином.

Опыты проводили в 4-5 биологических повторностях с последующей статистической обработкой данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ II. Специфичность иммуноферменткого анализа гормонов. II.1. Экстракционная очистка растительного материала и особенности иммуноферментного анализа ауксинов.

В растительных тканях одновременно присутствует большое количество соединений, близких к ИУК по структуре или физиологической активности. Поэтому особое значение имеет анализ их иммуноре-активности по отношению к полученной к ИУК сыворотке, а также хроматографическое распределение иммунореактивного материала растительных экстрактов на разных стадиях очистки. Для оценки имму-нореактивности вещества определяют его количество, ингибирующее ферментативную активность на 50%.

Спиртовой экстракт из семян кукурузы содержит несколько им-мунореактивных компонентов: с Rf 0-0,1; 0,4-0,5 и 0,9-1,0 ( рис.1 А ). При хроматографировании на бумаге в зоне с Rf 0-0,1 могут находиться индолпировиноградная кислота, индолацетиласпартат и индолил-3-ацетилглюкоза. ИммунореактивныЙ материал зоны с Rf 0,4-0,5 соответствует положению метчика ИУК, а в зоне с Rf 0,9-1,0 вероятно наличие метилированной ИУК и других нейтральных индолов. Экстракция исследуемых образцов эфиром приводила к исчезновению компонента из зоны c"Rf 0-0,1 ( рис.1 Б >. Вероятно, в этой области находится индолил-ацетил-глюкоза. При повторной экстракции кислых индолов из эфира в раствор соды ( рис.1 В ) на хроматограмме оставался лишь иммунореактивный компонент с Rf, соответствующим положению метчика ИУК ( рис.1 Г).

Таким образом, для подготовки к иммуноферментному анализу ауксинов вполне достаточно лишь экстракционой очистки материала. Это значительно ускоряет процедуру определений.

В табл.1, приведены значения иммунореактивности промежуточных метаболитов биосинтеза ИУК, аналогов ИУК и других производных индола. С целью повышения иммунореактивности ИУК проводили ее метилирование. Зависимость хромофорного ответа от количества метилированной ИУК имела сигмоидную форму с линейной областью от 1 до 100 пг. Однако метилирование приводило к появлению иммунореактив-

н и

е

а

I

с и и а

нг.экв.ИУК 4321-

нг.экв.ИУК 4321-

1 1

п

0)5

П

г

-94321-

4321-

0*,5

.«5,

0)5

П

о;5

иг

Рис.1. Распределение ижунореактивности по зонам хроматограмм.

1

&

1

)

чости у индолилмолочной, индолилпропионовой, индолилкарбоновой, ¡>еноксиуксусной кислот и триптофана, но она оказалась крайне низ-сой. После метилирования усиливалась иммунореактивность индолил-<асляной, нафтилуксусной кислот и 2,4-Д. Сходной с метилированной 1УК иммунореактивностыо обладала метилированная индолилмасляная сислота ( синтетическое соединение ). Иммунореактивность также >ыла обнаружена у нейтральных производных индола: индолацетальде-■ида, индолацетонитрила и индолацетамида. Однако эти соединения в >астении находятся в незначительных количествах и не мешают опре-1елению эндогенной ИУК.

При инкубации с пероксидазой, автоклавировании, прогревании ;ислого раствора и фотоокислении иммунореактивность препарата ИУК 1адала и в конечном счете снижалась до предела чувствительности вакцин. Эти данные свидетельствуют о том, что продукты окисления

Таблица 1. Иммунореактивность соединений в тест-системе с лами к ИУК.

антите-

Наэвание вещества

Количества вещества, вызывающего подавление_реакции на 5022 мкг

Самих веществ ТЙетилирован. форк

Шикимовая кислота Антраниловая кислота

Триптофан 2,015 ¿ 0 211

Индолацетамид 0,029 + 0 004

Индолацетонитрил 0,011 0 003

Индолацетальдегид 0,081 + 0 005

Индолилпировиноградная кислота -

Индолилуксусная кислота (ИУК) 1,023 + 0 114

Индолилпропионовая кислота Индолилкарбоновая кислота Индолилмасляная кислота Индолилмолочная кислота Нафтилуксусная кислота 2д4-^ихлорфеноксиуксусная

Феноксиуксусная кислота

2,843 + 0,223

10,152 + 5,113 +

0,396 0,311

2,025 ± 0,463

2,214 ± 0,154 0,000015i0,000004 0,694 ± 0,124 10,262 ±. 0,867 0,00005±0,00001 2,314 ± 0,231 0,011 ± 0,001 0,004 ± 0,001

4,223 £ 0,423

ИУК не обладают иммунореактивностью и не мешают определению содержания ИУК в растительных экстрактах.

XI.2. Специфичность иммуноферментной тест-системы к природным ци-токининам и реакции на синтетические аналоги.

На рис.2 показана зависимость хромофорного ответа в иммуноферментной тест-системе от логарифма концентрации ЗР. Она имела сигмоидную форму с линейным отрезком от 0,5 до 50 пкмоль на образец. Добавление вместе с АС свободного ЗР приводило к уменьвению связывания антител ( АТ ) с твердой фазой. Зеатин, дигидрозеатин, изопентениладенин, БАП-рибоэид, кинетин-рибоэид, кинетин и анили-иопурин также ингибировали связывание АТ с конъюгатом ЗР, иммобилизованного на планшете. Это свидетельствует об их способности связываться с АТ к ЗР. Однако они уступали последнему по сродству к АС и, следовательно, по способности конкурировать с конъюгатом ЗР за специфические ат. Аденин, аденозин и его moho-, ди- и три-фосфаты, а также циклический аденозинмонофосфат не проявляли им-мунореактивности в концентрациях до 5 мкг на пробу.

В табл.2, представлены количества исследуемых веществ, вызы-

Рис.2. Зависимость хромофорного ответа от содержания в лунках производных аденина.

Конъюгат зеатинрибозид-овальбумин при сенсибилизации лунок разведен 1:10000. Разведение антисыворотки - 1:10000. 1 - зеатинрибозид; 2 -зеатин; 3 - ИПА; 4 - дигидрозеатин; 5 - БАП-рибозид; 6 - БАП; 7 -аденин, аденозин, аднозинмоно-, ди-, трифосфаты, циклический адено-зинмонофосфат ( каждое соединение испьггывалось по отдельности )

Рис.3. зависимость хромофорного ответа от содержания в лунках планаета производных аденина.

Концентрация цитокинина в коиыогате БАП-рибозид-овальбумин, который использовали для сенсибилизации, составляет 8*10 М. Разведение антисыворотки к БАП-робозиду - 1:10000. 1 - БАП-рибозид; 2 БАП; 3 - ки-нетинрибозид; 4 - ИПА; 5 - кинетин; 6 - зеатинрибозид; 7 - дигидрозеатин; 8 - зеатин; 9 - аденин, аденозин, аднозинтрифосфат ( каждое соединение испытывалось по отдельности )

Таблица 2. Специфичность антисыворотки к зеатинрибозиду в тест-системе с конъюгатом зеатинрибозид-овальбумин

Соединение Количество вещества, вызывающее БОж-ное ингибирование реакции, нноль на образец Кросс-реа|тивность,

Изопентениладенин 6,542 £ 0,865 0,135 £ 0,033

Зеатин 0,028 £ 0,005 21,332 £ 1,568

Зеатинрибозид 0,006 £ 0,001 100,000 ± 0,000

дигидрозеатин 3,047 £ 0,052 0,224 £ 0,023

Кинетин 35,175 £ 2,630 0,017 £ 0,003

6-бензиламинопурин 50,893 £ 3,523 0,010 £ 0,001

Кинетинрибозид 11,253 £ 1,563 0,050 £ 0,008

БАП-рибозид 9,147 £ 0,968 0,074 £ 0,009

Анилинопурин 40,589 £ 3,114 0,015 £ 0,002

вающие 50%-е ингибирование реакции. Полученная нами АС обладала высоким сродством к ЗР и зеатину, причем рибозиды обладали более высокой иммунореактивностыо, чем свободные основания. АС проявляла иммунореактивность и по отношению к другим цитокининам, однако сродство к ним АТ оказалось крайне низким. Тест-система реагировала лишь на очень высокие, нефизиологические концентрации этих цитокининов. Следовательно, иммунореактивность тестируемых экстрактов соответствовует содержанию в них главным образом производных зеатина.

Таким образом, полученная нами АС на зеатинрибозид позволяет с высокой точностью и чувствительностью определять природные ци-токикины зеатинового типа.

Для оценки специфичности взаимодействия полученной АС на БАП-рибозид использовали ряд природных и синтетических физиологически активных цитокининов, а также их неактивных аналогов.

Как видно из рис.3, добавление свободного БАП-рибозида в тест-систему вызывало ингибирование связывания АТ с конъюгатом БАП-рибозид-овальбумин. Зависимость хромофорного ответа от логарифма концентраций добавленного гормона имела сигмоидную форму с линейным отрезком от 0,05 до 50 пкмоль. Добавление БАП, кинетина и кинетинрибозида ингибировало связывание АТ с конъюгатом в меньшей степени, чем БАП-рибозид. Линейная область ответа для БАП находилась в диапазоне концентраций от 0,5 до 500 пкмоль. Кинетин-рибозид, кинетин и изопентениладенин обладали близкой реактив-

Таблица 3. Специфичность антисыворотки к БАП-рибозиду в тест-системе с конъюгатом БАП-рибозид-овальбумин

Соединение Количество вев вызывающее 503 ингибирование ции, нйоль на ¡ества, -ное реак-образец Кросс- реактивность,

Язопентениладенин 0,070 ± 0, 008 2 943 ± 0,125

Зеатин 12,223 ±. 0, 865 0 016 ± 0,006

Зеатинрибозид 4,578 ±, 0, 221 0 054 ± 0,006

Цигидрозеатин 7,156 + 0, 421 0, 032 + 0,006

(инетин 0,100 + 0, 015 2, 056 ± 0,147

Синетинрибозид 0,054 + 0, 006 4, 123 ± 0,154

5-бензиламинопурин 0,010 ± 0, 005 20 458 + 1,563

ЗАП-рибозид 0,002 £ 0, 001 100, 000 ± 0,000

^денозин, аденин 0 0

юстыо, однако по сравнению с БАП-рибозидом она была на 2 порядка 1еньше. Реактивность зеатина, зеатинрибозида и дигидрозеатина ¡казалась на 4 порядка менызе, чем БАП-рибозида.

Как видно из табл.3, АС на БАП-рибозид в тест-системе с онъюгатом БАП-рибозид-овальбумин проявляла более высокую иммуно-еактивность к рибозидам, чем к соответствующим им свободным ос-ованиям. Из других изученных соединений наибольшим сродством к С на БАП-рибозид обладала БАП, слабее изопентениладенин и кине-ин. Низкое сродство наблюдалось у цитокининов зеатинового типа.

Таким образом, использование конъюгатов различных цитокиии-ов позволяет изменять специфичность иммуноферментной системы, риспосабливая ее к экспериментальным задачам. С помощью АС к зе-гинрибозиду и БАП-рибозиду впервые удалось провести раздельное пределение цитокининов синтетического происхождения группы БАП и риродных соединений.

Определение с помощью иммуноферментного метода содержания гормонов в проростках кукурузы и злаковых культур.

IV.1. Зависимость скорости роста колеоптилей кукурузы от эндогенного содержания в них ауксинов.

С помощью иммуноферментного анализа нами было проведено >авнительное исследование зависимости скорости роста зоны растя-жия неотделенного от проростка колеоптияя кукурузы от содержа-|я в нем ИУК.

Как видно из рис.4, скорость роста колеоптиля кукурузы рас-

мм/6ч нг/колеоптиль

Рис.4, Скорость изменения длины колеоптиля ( гистограмма ) и содержание в нем ауксинов ( кривая ) при прорастании семян злаков.

тяжением ( контролируемая по содержанию ДНК ), незначительная в первые 54ч, постепенно увеличивалась, достигая максимума в период 84-90ч, после чего быстро падала. Содержание свободной Формы эн-дс.енного ауксина в растущей части колеоптиля неуклонно увеличивалось после 86ч, достигая максимума к 84ч и затем быстро уменьшалось .

Таким образом, новый методический подход с использованием иммуноферментного анализа позволил установить корреляцию скорости роста зоны растяжения колеоптиля и содержания в нем свободной формы эндогенного ауксина, что подтверждает справедливость классического представления о регуляции скорости роста клеток растяжением путем изменения в них количества ИУК.

С другой стороны, в процессе роста проростков кукурузы наблюдалось увеличение содержания в них также связанных форм ауксинов ( табл.4 ). При этом в эндосперме содержание обеих форм гормона снижалось. По-видимому, в данном случае имеет место перераспределение эндогенных ауксинов из эндосперма в проросток. Следовательно, ограничение транспорта гормона, как и изменение соотношения его форм также могут вносить определенный вклад в регуляцию роста колеоптиля кукурузы.

Таблица 4. Содержание свободных и связанных ауксинов в проростках и эндосперме кукурузы в нг ИУК на 1 проросток.

Возраст проростков. Проростки Эндосперм

Свободные Связанные Свободные Связанные

24 120 168 3,2 £ 0,2 22.4 £ 2,1 20.5 £ 2,2 2,3 £ 0,2 58,7 £ 3,1 63,1 £ 6,3 291,4 £ 14,3 47,8 £ 4,4 26,1 £ 3,5 488,1 + 11,7 332,7 £ 10,1 227,6 £ 13,2

Таблица 5. Содержание ауксинов в проростках кукурузы, обработанных глифосатом через 1 и 2-е суток после замачивания в растворе гербицида и в контрольных растениях.

концентрация гли- мЙта' Содержание ауксинов в одном проростке, нг

свободных связанных спиртонераств связанных спиртораствор суммарное

1 су т. ¿ сут. i сут. г. сут. i сут. ¿ сут. i сут. ¿ сут.

0 0,05 0,5 5 17£l 18£l 19£l 8£l 25£l 20+1 16£l 3+1 20£l 20+1 1б£2 7+1 68£2 44+1 20£2 18£2 1,3£0,1 2,8£0,1 3,2£0,1 4,0£0,2 5,8+0,2 5,0£0,2 6,9£0,2 1,5£0, 1 40+4 43£3 43£3 20+2 103+3 76+2 5l£3 28+2

IV.2. Влияние глифосата на содержание свободных и связанных ауксинов в эндосперме и проростках кукурузы.

В настоящее время убедительно доказано, что первичный моха-изм действия глифосата в физиологических ( негербицидных ) кон-ентрациях связан с подавлением иикиматного пути синтеза аромати-еских соединений, в том числе и предшественников ауксинов ( Lee, urnas, 1985 ). Поэтому представляло интерес изучение действия вифосата на эндогенный гормональный статус растений.

Как видно из табл.5, проращивание растений в растворе глифо-ата приводило к снижению в проростках концентрации свободных эн-эгенных ауксинов по сравнению с контролем. Глифосат вызывал так-1 уменьшение количества связанных форм ИУК, нерастворимых в 1ирте. Содержание связанных, растворимых в спирте ауксинов увешивалось через 1-й сутки проращивания при максимальной концент-1ции гербицида, а на 2-е - их содержание уменьшалось. В этой >акции обнаруживают глюкозиды' ИУК, миоинозитол-ИУК и т.д. В це-

нг ИУК/раст. 500

А

-ь

Б

I

168

Время прорастания семян, ч

Рис.5. Содержание свободных ( А ) и связанных ( Б ) ауксинов в контрольных ( незапггрихованно) и обработанных пгафэсатом ( 5 кМ )( заштритрихо-ванно ) в эндосперме кукурузы в процессе прорастания семян.

лом, гербицид вызывал уменьиение суммарного содержания ауксинов, которое коррелировало с ингибированием роста растений.

Эффект уменьшения содержания свободных ауксинов в проростках под действием глифосата нельзя объяснить активацией процесса конъюгации гормона, т.к. при этом не увеличивалось суммарное содержание связанных форм ауксинов. Не удалось также обнаружить активации глифосатом процесса окисления ИУК, поскольку при сравнительной оценке ИУК-оксидаз в контрольных и обработанных глифосатом проростках не обнаружено достоверного изменения активности фермента. Можно предположить, что глифосат вызывал снижение содержания свободных ауксинов в проростках за счет ингибирования синтеза гормона или его транспорта из эндосперма.

В эндосперме содержание свободных и связанных ауксинов снижалось как в контрольных, так и обработанных глифосатом растениях ( рис.5 ). Однако существенных различий по содержанию ауксинов в опыте и контроле обнаружно не было. Наблюдалось даже снижение содержания связанных форм гормона у обработанных глифосатом растений. Можно предполагать, что глифосат подавляет не поступление ауксинов в проросток из эндосперма, а подавляет синтез ИУК при прорастании семян кукурузы.

Как видно из рис.6, глифосат вызывал уменьшение по сравнению

нг/проросток С 80_

60_

40_

20.

15 7

Бремя после обработки гербицидом, сутки

Рис.6. Содержание свободных форм АЕХ в контрольных < незаштриховано ) и обработанных глифосатом ( 5 ММ )( заштриховано ) проростках кукурузы через 1, 5 и 7 суток после помещения на раствор гербицида.

контролем содержания в проростках не только ИУК, но и абсцизо-юй кислоты. Таким образом, прослеживается сопряженность измене-ия уровня этих двух гормонов.

Из рис.7 видно, что в процессе прорастания семян кукурузы, роисходит увеличение содержания цитокининов в корнях и проростах. Обработка глифосатом приводит к снижению уровня гормона в тих органах растения, что может быть следствием ингибирования интеза цитокининов в корнях. В эндосперме обработанных глифоса-ом растений нет отличий по уровню цитокининов по сравнению с онтролем.

Итак, из анализа полученных данных видно, что глифосат влия-г на содержание эндогенных гормонов в проростках кукурузы, что, э-видимому, и определяет ростингибирующее действие гербицида.

IV.2. Особенности действия триаллата на проростки пшеницы и овса.

Принято считать, что первичное действие гербицида триаллата зязано с нарушением процесса митоза, роста клетск растяжением, «гибированием фермента глутатион-З-трансферазы, синтеза белков и

С о д

в р

X

а н и

е Ц

и т о к и н и н о в

нг/ра9л";лие i-

0,12_ 0,08_ 0,04_

i,2_; о.8_;

0,4_

0,6_ 0»4_ 0,2_

гЬ

1 5 7

Время после обработки гербицидом, сутки

Рис.7. Содержание цитокининов в контрольных ( незаштриховано ) и обработанных глифосатсм ( 5 мМ ) ( заштриховано ) эндоспермах ( А ), корнях ( Б ) и проростках ( В ) кукурузы через 1, 5 и 7 суток после помещения на раствор гербицида.

нуклеиновых кислот, а также синтеза липидного комплекса < Кефоли, 1978; Муромцев и др.,1987; Bilang, Sturm,1994; Liu, et.al.,1994). В наших экспериментах воздействие даже минимальных доз триаллата приводило к резкому уменьшению содержания эндогенных ауксинов в проростках как пшеницы, так и овса < рис.8 >. отмечена положительная корреляция между содержанием ауксинов в обработанных три-аллатом растениях и скоростью их роста. Не исключено, что прекращение нормального деления и роста клеток приводит к нарушению

Рис.8. Избиение содержания свободной ИУК в проростках пшеницы (А ) и овса ( Б ) к контролю ( без гербицида ) через 1 и 3-е суток прорастания на разных дозах триаллата.

синтеза и транспорта ауксинов из апикальной меристемы проростка. Таким образом, открываются широкие перспективы использования триаллата в качестве агента, ингибирующего некоторые ауксин-зависи-чые биохимические процессы растительной клетки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Первоочередной задачей исследователей, развивающих концепцию <еханизмов действия гормонов и физиологически активных веществ на растения стала необходимость разработки нового, высокоспецифично-"о, хорошо воспроизводимого и оперативного метода количественного определения регуляторов роста. Разработанная нами модификация метода твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа с ис-юльзованием вторичных меченых антител удовлетворяет всем указан-шм условиям. Данная методика не нуждается в длительной очистке юходного материала, не требует приобретения дорогостоящего обо->удования и может получить широкое право на использование, благо-1аря своей доступности и простоте.

С помощью разработанных нами тест-систем для определения ауксинов и цитокининов природного и синтетического происхождения удалось проследить ряд полохительных и отрицательных корреляций содержания эндогенных гормонов с морфофизиологическими показателями. В качестве удобного инструмента для изучения гормонального нального статуса и выяснения тонких механизмов действия фитогор-монов на ростовые процессы растений могут быть также использованы гербициды в физиологических ( негербицидных ) концентрациях, подавляющие синтез ауксинов и некоторые ауксин-зависимые биохимические процессы в клетке растения. Проведение подобной работы в сочетании с использованием иммуноферментного анализа эндогенных гормонов может быть перспективным в дальнейших эколого-физиологи-ческих исследованиях.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый вариант конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа, который позволяет оперативно определять динамику изменения содержания эндогенных фитогормонов в тканях растений. Получены антисыворотки к ауксинам, природным и синтетическим цитокининам. Проведена детальная оценка свойств метода.

2. Метод проверен на специфичность: а) Показано, что иммуно-реактивность ИУК можно повысить путем метилирования. Стимулированная метилированием иммунореактивность других индольных производных на 2 порядка ниже, чем у самой ИУК. Следовательно, возможное присутствие указанных соединений в экстрактах не снижает специфичности антисыворотки.

б) Показано, что полученная антисыворотка для определения цитокининов имеет высокое сродство к зеатинрибозиду и зеатину. Иммунореактивность сыворотки по отношению к другим цитокининам практически отсутствует.

в) Показано, что разработанный вариант тест-системы для определения синтетического цитокинина 6-бензиламинопурин-рибозида ( БАП-рибозида ) высокоспецифичен и не реагирует с природными ци-токининами. С помощью антисыворотки к БАП-рибозиду впервые удалось провести раздельное определение цитокининов синтетического происхождения группы БАП и природных соединений. Использование конъюгатов различных цитокининов позволяет в некоторых случаях изменять специфичность иммуноферментной системы, приспосабливая ее к экспериментальным задачам.

-213. Метод не требует трудоемкой многостадийной очистки растительного гомогената. Для подготовки к иммуноферментному анализу ауксинов достаточно первичной экстракционой очистки, обеспечиваю-цей освобождение от основной массы интерферирующих иммунореактив-чых компонентов. При этом конечный экстракт содержит в основном ммунореактивный компонент - ИУК, что значительно ускоряет проце-1УРУ определений.

4. Метод обеспечивает высокую воспроизводимость, надежность I скорость анализов, что представляет интерес для развития теории гормональной регуляции растений, а также для внедрения результатов теоретических разработок в практику селекции и сельского хо-¡яйства.

5. С использованием разработанного варианта иммуноферментно-•о анализа: а) Подтверждена справедливость классической конценп-[ии гормональной регуляции: скорость ростового процесса прямо |ропорциональна концентрации ауксинов в клетках растения.

б> Установлено, что регуляция скорости роста растений обес-ечивается путем изменения как количества, так и соотношения раз-ичных фитогормонов.

6.С использованием низких концентраций гербицидов обнаружено:

а) Под действием глифосата подавление скорости роста про-остков кукурузы коррелирует с уменьшением общего содержания аук-инов, цитокининов и АБК. Предполагается, что при прорастании сеян кукурузы происходит синтез ауксинов de novo, причем количест-о синтезируемой ИУК сравнимо с количеством образующихся при гид-олизе связанных форм гормона.

б) Подавление роста проростков пшеницы гербицидом триаллатом акже коррелирует со снижением содержания эндогенных ауксинов, ффект снижения содержания гормонов обратно пропорционален увели-

внию концентрации гербицида.

* * *

Выражаю искреннюю благодарность д.б.н., профессору О.Н.Нулевой ( Москва ) и к.б.н. Г.Р.Кудояровой ( Уфа ) за ценные советы постановке методической и экспериментальной частей работы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Чередова < Иванова ) Е.П., Мустафина А.Р. Влияние триал-1та на содержание свободных ауксинов в проростках пшеницы и яч-эня. - Тезисы докладов на Всесоюзной конференции молодых ученых

"Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов", УФА, 1987, с.137.

2. Чередова ( Иванова ) Е.П., Кудоярова Г.Р., Мустафина А.Р. Содерхание свободных и связанных ауксинов и устойчивость к 2,4-Д у проростков кукурузы. - Тезисы докладов на II1-й Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки, Петрозаводск, 1988, с.35.

3. Чередова ( Иванова ) Е.П., Кудоярова Г.Р., Веселов В.Ю., Мустафина А.Р. Тест-система на ауксины для нужд биотехнологии. Тезисы докладов на V-й Всесоюзной конференции "Методы получения и анализа биохимических препаратов", Юрмала, 1987, с.204.

4. Кудоярова Г.Р., Гюли-Заде В.З., Веселов В.Ю., Чередова С Иванова ) Е.П., Мустафина А.Р. Иммуноферментный анализ активности препаратов 6-БАП. Тезисы докладов на V-й Всесоюзной конференции "Методы получения и анализа биохимических препаратов", Юрмала, 1987, с.268.

5. Кудоярова Г.Р., Мустафина А.Р., Чередова С Иванова ) Е.П. Иммунореактивность высокомолекулярных фракций растительных экстрактов в тест-системе на ауксины. - Тезисы докладов на Ш-й Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки, Петрозаводск, 1988, с.29.

6. Кудоярова Г.Р., Чередова ( Иванова ) Е.П., Гюли-Заде В.З., Мустафина А.Р., Крутьков В.Ю. Влияние глифосата на содержание свободных и связанных ауксинов в проростках кукурузы. - Физиология растений, 1988, т.35, вып.5, с.888-893.

7. Кудоярова Г.Р., Гюли-Заде В.З., Чередова ( Иванова ) Е.П., Мустафина А.Р., Веселов В.Ю., Кулаева О.Н. Зависимость скорости роста колеоптилей кукурузы от эндогенного содержания в них ауксинов, ДАН СССР, 1988, т.301, N 5, с.1277-1279.

8. Кудоярова Г.Р., Каравайко H.H., Веселов В.Ю., Гюли-Заде В.З., Чередова ( Иванова ) Е.П., Мустафина А.Р., Мошков.И.Н., Кулаева О.Н. Иммуноферментная тест-система для определения цитоки-нинов. - Физиология растений, 1990, т.37, вып.1, с.193-200.

9. Кудоярова Г.Р., Коф Э.М., Гюли-Заде В.З., Егуткин Н.Л., Мустафина А.Р., Чередова ( Иванова ) Е.П., Веселов В.Ю. Специфичность иммуноферментного анализа ауксинов. Значение экстракционной очистки растительного материала. В сб.: Иммуноферментный анализ регуляторов роста растений, применение в физиологии растений и экологии, УФА, 1990, с.22-33.

-2310. Кудоярова Г.Р., Чередова ( Иванова ) Е.П., Теплова И.В., Гюли-Заде В.З. Влияние глифосата на содержание свободных и .связанных ауксинов в эндосперме и проростках кукурузы. В сб.: Имму-ноферментный анализ регуляторов роста растений, применение в физиологии растений и экологии, УФА, 1990, с.83-85.

11. Кудоярова Г.Р., Никитина B.C., Чередова ( Иванова ) Е.П., Маркушева Т.В., Кусова И.В. Иммуноферментный анализ в исследованиях микробиологической деградации 2,4-дихлорфеноксиуксус-ной кислоты. В сб.: Иммуноферментный анализ регуляторов роста растений, применение в физиологии растений и экологии, УФА, 1990, с.133-136.

12. Кудоярова Г.Р., Веселое С.Ю., Чередова ( Иванова ) Е.П., Гюли-Заде В.З., Мустафина А.Р. Способ отбора регуляторов роста растений цитокининовой и ауксиновой природы. Авторское свидетельство N 1640654, Россия, 1991.

13. Кудоярова Г.Р., Теплова И.В., Чередова < Иванова ) Е.П. Влияние глифосата на содержание индолилуксусной и абсцизовой кислот при прорастании семян кукурузы, - Физиология растений, 1992, т.39, вып.З, с.579-583.

14. Гюли-Заде В.З., Чередова ( Иванова ) Е.П., Теплова И.В. Метаболизм ауксинов при прорастании семян кукурузы. - Тезисы докладов на 2-ом Съезде Физиологов растений, Минск 24-29 сентября 1990, М., 1992, ч.2, с.60.

8.II.94 г. 3ак.6334р. Ълу.100 экз. Уч.-изд.л. 1.0 Отпечатано на ротапринте в 0НП1 ПНЦ FAH