Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование гуминовых препаратов для детоксикации и биодеградации нефтяного загрязнения

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Использование гуминовых препаратов для детоксикации и биодеградации нефтяного загрязнения"

На правах рукописи

Салим Кайд Мохамед

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГУМИНОВЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДЕТОКСИКАЦИИ И БИОДЕГРАДАЦИИ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ

03.00.16-Экология 02.00.13 - Нефтехимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

МОСКВА 2004

Работа выполнена в Российском государственном университете

нефти и газа им. И.М. Губкина на кафедре промышленной экологии и в

Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова на кафедре органической химии химического факультета

Научные руководители: доктор химических наук, в.н.с.

ИЗ. Перминова

кандидат химических наук Н.Ю. Гречшцева

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

В Л. Келарев

доктор биологических наук, профессор Ш>. Градова

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии

микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Защита состоится « 10 » февраля 2004 г. в 12 час. 00 мин. в ауд. 202

на заседании диссертационного совета Д 212.200.12 при Российском государственном университете нефти и газа им. И. М. Губкина по адресу: 119991, Москва ГСП - 1, Ленинский проспект, д.65.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного университета нефти и газа им. И. М. Губкина.

Автореферат разослан « 26 »января 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат технических наук

Иванова Л. В.

2004-4

26961

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Загрязнение окружающей среды нефтяными углеводородами неизбежно в условиях деятельности современного нефтедобывающего комплекса. В связи с этим разработка новых и совершенствование существующих технологий восстановления нефтезагрязненных земель являются актуальными проблемами охраны окружающей среда.

В современных технологиях рекультивации нефтезагрязненных почв наиболее широко используются процессы сорбции и биодеградации. Одним из перспективных направлений является применение сорбентов и стимуляторов на основе природных соединений, в частности, гуминовых веществ. Гуминовые вещества составляют 50-80% органического вещества почв и твердых горючих ископаемых. Запасы гуминовых материалов огромны - это низкосортные угли, торф, сапропель, и др. Они обладают высоким сродством к гидрофобным органическим соединениям, проявляют детоксицирующие, редокс-медиаторные и адаптогенные свойства в условиях химического загрязнения. Несмотря на уникальное сочетание указанных свойств, гуминовые вещества до сих пор не нашли широкого применения в практике рекультивации. Это связано с тем, что отсутствуют систематические исследования по сорбционно-детоксихационным и биостимулирующим свойствам гуминовых веществ в условиях нефтяного загрязнения. Как следствие, отсутствуют критерии выбора гуминовых препаратов для их использования в рекультивационных технологиях.

Цель работы: оценить перспективность использования гуминовых препаратов в сорбционных и биодеградационных технологиях восстановления нефтезагрязненных почв.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

• изучить сорбционно-детоксикационные свойства ряда гуминовых препаратов по отношению к нефтяным углеводородам в условиях модельного загрязнения;

• изучить химические взаимодействия в системе нефть - песок - растворы гуминовых препаратов;

• исследовать стимулирующие свойства гуминовых препаратов по отношению к биопрепарату в условиях модельного и реального нефтяного загрязнения;

• исследовать стимулирующие свойства гуминовых препаратов по отношению к аборигенной микрофлоре нефтезагрязненных почв;

• предложить способ применения гуминовых препаратов для рекультивации нефтезагрязненных земель.

Научная новизна. Впервые систематически исследованы сорбционно-детоксикационные свойства гуминовых препаратов и выделенных из них фракций в отношении нефтяных углеводородов. Показано, что максимальной сорбционно-детоксикационной способностью обладали наиболее гидрофобные препараты - гумат из леонардита и гиматомелановые кислоты.

Установлено преимущественное связывание гуминовых препаратов с полициклической фракцией нефти - асфальтенами и смолами, что подтверждает гипотезу о гидрофобном связывание как ведущем механизме взаимодействия гуминовых веществ с нефтяными углеводородами.

Впервые исследованы стимулирующие свойства гуминовых препаратов в отношении специализированного биопрепарата и аборигенной микрофлоры и показан максимальный стимулирующий эффект в условиях реального загрязнения. Высказано предположение о повышении неспецифической сопротивляемости микроорганизмов в качестве механизма стимулирующего действия гуминовых препаратов.

Практическая значимость работы. Показана перспективность применения гуминовых препаратов в качестве стимуляторов биодеградации нефтяного загрязнения как специализированными биопрепаратами, так и аборигенной микрофлорой загрязненных почв.

Рекомендованы дозы внесения гуминовых препаратов (не выше 10 кг/га или 0.01 %), способствующих достижению максимального детоксицирующего и стимулирующего эффекта при проведении биоремедиации нефтезагрязненных почв.

Установлена большая эффективность применения беэбалластных гуматов, произведенных по технологии мокрой экстракции, по сравнению с полученными механохимической обработкой угля.

Полученные данные по максимальному сродству гуминовых препаратов к связыванию полициклических нефтяных углеводородов позволяют рекомендовать применение гуминовых сорбентов для рекультивации загрязнений тяжелой нефтью.

Опробовано применение гуминовых препаратов в полевых условиях при рекультивации нефтяного разлива по технологии МГУ с использованием биопрепарата Родер. Предложен способ использования гуминовых препаратов в качестве сорбентов.

Апробация работы. Отдельные части работы были представлены на Международном научно-практическом семинаре НАТО «Использование гуматов для рекультивации загрязненных сред: от теории к практике» (23-28 сентября 2002, Звенигород, Россия) и на 2 Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (10-14 ноября 2003, Москва, Россия).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 2 тезисов докладов.

Структура диссертационной работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литераторы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, и приложений.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность исследования, сформулированы цель и задачи исследования, научная новизна н практическая значимость работы.

В первой главе дан литературный обзор по последствиям нефтяного загрязнения почв, методам рекультивации, используемым для восстановления нефтезагрязненных почв, охарактеризованы преимущества и недостатки описанных методов. Дана характеристика объекта исследования - гуминовых веществ (ТВ), которые представляют собой наиболее обширный класс природных соединений, входящих в состав органического вещества почв, природных вод и твердых горючих ископаемых. Для строения ГВ характерно наличие двух структурных блоков, традиционно определяемых в терминах "ароматический каркас" и ''углеводная периферия" (Рис. 1).

* К1е1пЬешре1 Р /ШЬгесМ-ТЬаег-АгсЬЬл, 1970, В<114, Н.1, Б. 3-14.

Наличие ароматического каркаса обеспечивает способность ГВ к связыванию органических соединений, которое происходит по механизму гидрофобных взаимодействий. Поэтому по мере возрастания вклада ароматического каркаса в структуру ГВ, увеличивается их сродство к гидрофобным органическим соединениям. Максимальная ароматичность характерна для ГВ угля, что определяет их высокую связывающую способность по отношению к нефтяным углеводородам (НУ). Экологическим следствием химического связывания с ГВ является детоксикация НУ ввиду недоступности образуемых аддуктов для живых организмов. Это позволяет рассматривать ГВ как природные детоксиканты. Кроме того, ГВ могут ускорять процессы биотического разложения НУ благодаря редокс-медиаторным и адаптогенным свойствам. Однако в настоящее время практическое применение ГВ ограничивается единичными примерами, которые даны в обзоре. Сделан вывод об отсутствии систематических исследований по возможности применения ГВ для рекультивации нефтезагрязненных почв.

Во второй главе описаны материалы и методы. Приведены характеристики двух коммерческих гуминовых препаратов, полученных по разным технологиям. Даны характеристики сырой нефти и способ ее обработки для получения тяжелой нефти. Описана нефтезагрязненная почва месторождения Беледжари (Азербайджан) Приведены данные по специализированным микроорганизмам-деструкторам нефти (биопрепарат «Родер», сертификат № 77 99 04.515Д.004855.08.01 Минздрава РФ). Описаны методики выделения гуминовых и гиматомелановых кислот, методики гравиметрического определения общего и фракционного содержания нефтяных углеводородов в почве, методика определения фракционного состава нефти с помощью жидкостной хроматографии (ТУ 38.115.203-81) на хроматографе типа ХЖ-1, снабженного катарометром; методика биотестирования и определения микробной активности почв. Указаны методы структурного анализа гуминовых препаратов.

В третьей главе приведены результаты и их обсуждение, которые включают:

ЭЛ. Исследование сорбционных и детоксицируинцих свойств гуминовых

препаратов в отношении нефтяных углеводородов

3.1.1. Выбор и характеристика гуминовых препаратов.

В качестве гуминовых препаратов (1XI) использовали два коммерческих гумата калия, произведенных из угля по различным технологиям, и две выделенных из них фракции ГВ, существенно различающихся по гидрофобности: высокогидрофобные спирторастворимые гиматомелановые кислоты и нерастворимый в этаноле остаток

гуминовых кислот. Первый препарат (ГТГ) представлял собой гумат калия «Powhumus» (Humintech Ltd., Дюссельдорф, Германия), произведенный по стандартной технологии мокрой щелочной экстракцией из окисленного угля (леонардита). Второй препарат (ИГ) - смешанный гумат K/Na отечественного производства - «Гумат-80» (ОАО «Гумат», Иркутск, Россия). Данный гумат получают путем механохимической обработки бурого угля и смеси К2СОз/Ыа2СОз Препарат ИГ фракционировали на спирторастворимые гиматомелановые кислоты (ИГМК) и нерастворимый в этаноле остаток гуминовых кислот (ИГК). Твердые гуминовые препараты представляли собой аморфные порошки черного цвета. ИГ и ПГ хорошо растворимы в воде; ИГМК и ИГК хорошо растворимы в водной щелочи. Все ГП характеризовали методами элементного анализа и 13С ЯМР спектроскопии.

Элементный анализ ГП. Содержание С, Н, N определяли на элементном анализаторе Carlo Erba Strumentazione-1106. Зольность определяли ручным сжиганием. Содержание О рассчитывали по разности. Данные элементного анализа использованных препаратов приведены в Табл. 1. В связи с высокой зольностью коммерческих гуматов калия о содержании элементов в составе их органической части судили на основании анализа обессоленных гуминовых кислот, выделенных из этих препаратов (ПГК и ИГК).

Таблица 1.

Элементный состав гуминовых препаратов в расчете на беззольную пробу.

Препарат Содержание элементов (% масс) Атомные Соотношения Зольность,

С Н N О НУС О/С %

ПГ 52.2 4 58 1 35 41 87 1 05 0 60 26 4

ПГК 56 4 4.10 1.21 38.29 0.87 0.50 7.8

ИГ 46.2 3.60 1.40 48.80 0.93 0.80 28.2

ИГК 59.0 3.69 1.76 35.55 0.75 0.45 3.3

ИГМК 55.7 3.58 1.50 39.22 0.77 0.53 14.1

Высокая зольность коммерческих препаратов не позволила получить достоверные данные о составе их органической части, так как наличие калия приводит к образованию карбонатов и, как следствие, к недоопределению углерода и переопределению кислорода. Поэтому между собой сравнивали только низкосолевые формы препаратов.

Из данных элементного анализа рассчитывали атомные соотношения Н/С и О/С, которые являются косвенными характеристиками ненасыщенности и окисленности ГП, соответственно. Можно отметить высокую степень ненасыщенности и низкую степень окисленности всех использованных препаратов, что характерно для ГВ угля. Наиболее низкие соотношения Н/С (0.75 и 0.77) наблюдались для ИГК и ИГМК, что свидетельствует о большем вкладе в их структуру ненасыщенных фрагментов.

13С ЯМР спектроскопия ГП. 13С ЯМР спектры ГП регистрировали на спектрометре АС 400 Вгикег (ФРГ) в количественных условиях: время задержки между импульсами - 8 секунд. Содержание углерода различных типов определяли интегрированием соответствующих спектральных областей (м.д.): 220-185 - С кетонных и хинонных групп (Сс-о); 185-165 - С карбоксильных и сложноэфирных групп (Ссоо); 165-145 - ароматический О-замещенный С (Сдг-о); 145-100 - С незамещенных ароматических фрагментов (Сдг); 100-50 - алифатический О-замещенный С (Сд^-о); 50-5 - алифатический незамещенный углерод алкильных групп (САЛ-ноо).

Данные 13С ЯМР спектроскопии приведены на Рис. 2 и в Табл. 2. Как видно из приведенных спектров, для ГВ угля характерен максимальный вклад ароматических структур и практически полное отсутствие углеводных периферических фрагментов: основная часть спектральной интенсивности сосредоточена в области 100-165 м.д. Отсутствие углеводной периферии определяет гидрофобный характер ГВ угля.

Таблица 2

Распределение углерода в структуре ГП по данным спектроскопии ЯМР 13С

Препарат Доля углерода в составе фрагментов, % ЕСА, £САШ

Сс-о Ссоон Сдг-о Сдг-н Сдш-О Сд1к

ПГ 4.9 13.2 11.0 50.0 9.0 15.0 61.0 24.0

ИГ 5.9 20.6 10.0 43.0 6.0 15 0 53.0 21.0

ИГК 9.1 13 5 13.0 41.0 9.4 14.0 54.0 23.0

ИГМК 5.9 14.8 10.0 42.0 12.0 15.0 52.0 27.0

£Са, , Сдг-о* Сдг-н - суммарные содержание ароматического углерода;

^Сда- Сдис-о* СНп - суммарные содержание алифатического углерода.

Коммерческий гумат ПГ, полученный из леонардита, характеризовался гораздо большей ароматичностью (61 %) по сравнению с гуматом ИГ, полученным из бурого угля (53 %). При этом для гумата ИГ наблюдалась максимальная спектральная интенсивность в области карбоксильного углерода (20 %), превосходя типичные

Рис. 2. Спектры ЯМР 13С гуминовых препаратов, использованных в работе.

содержания карбоксильного углерода для ГВ от 10 до 15%. Это может быть связано с существенным вкладом карбоната, присутствующего в данном препарате в больших количествах в силу специфики его получения (путем тонкого помола угля со смесью К2С03 и ИагСОз). По сравнению с исходным препаратом ИГ, для спирторастворимой фракции ИГМК наблюдалось повышенное содержание алкильного углерода (27% по сравнению с 21 %) и более низкое содержание карбоксильного углерода, что определяет более высокую гидрофобность данной фракции. Для спирто-нерастворимых ИГК наблюдалось максимальное содержание хинонных и фенольных фрагментов, что согласуется с более гидрофильным характером этой фракции. В целом по содержанию ароматического углерода препараты можно расположить в следующий ряд: ПГ > ИГК > ИГ > ИГМК, который является отражением большей степени гумификации леонардига по сравнению с бурым углем.

3.1.2. Характеристика нефти

В работе использовали сырую и тяжелую нефть. Характеристика сырой нефти (Западная Сибирь), содержание, % масс: смолы - асфальтены - 8.5-11.0; твердые парафины - 2.9-3.5, сера - 0.10-0.06; вязкость при 50 "С - 3.0-3 3 сПа, плотность при 20 "С 0.81-0.86 г/см3, температура затвердевания -8 °С; содержание углеводородных газов С2-С4 - 1.67% масс. Тяжелая нефть получена на кафедре смазочного масла факультета Химической технологии и экологии РГУ нефти и газа им. И.М. Губкина путем отгона легколетучих фракций из сырой нефти при температуре 272 "С. Такой прием применяли для имитации застарелого нефтезагрязнения. Количество отогнанной фракции, кипящей ниже 272 °С, составило 25 %.

Для определения фракционного состава сырой нефти использовали гравиметрический метод (метод колоночной хроматографии), для тяжелой нефти -жидкостную хроматографию. Результаты приведены в Табл. 3.

Таблица 3

Фракционный состав сырой и тяжелой нефти, % масс.

Углеводороды Сырая нефть Тяжелая нефть

Парафино-кафтеновые 52.9 52.7

Моноароматические 12.0 12.5

Смолы 5.2 5.2

Полиядерные ароматические 29.9 29.6

углеводороды + асфальтены

и

Сходный состав сырой и тяжелой нефти отражает специфику использованных методов определения, регистрирующих только НУ с Тип, > 220°С. Можно отметить хорошую сходимоть данных, полученных двумя разными методами.

В качестве натурных объектов использовали сильно- и слабозагрязненные почвы с месторождения Беледжари (Азербайджан). Содержание нефти в сильнозагрязненной почве составляло 180 г/кг, в слабозагрязненной почве - 2 г/кг. Часть высокозагрязненной почвы разбавляли песком до содержания НУ 30 г/кг.

3.1.3. Исследование сорбционно-детоксикационной способности гуминовых

препаратов по отношению к нефтяным углеводородам

Для оценки перспективности использования гуминовых препаратов в качестве сорбентов, способствующих детоксикации нефтяного загрязнения, проводили лабораторные вегетационные эксперименты на сырой и тяжелой нефти с внесением гуматов. Тест-объект - пшеница; тест-отклик - надземная сухая биомасса и длина растений. В качестве модельного грунта использовали кварцевый песок (рН 6.8).

Для создания модельного загрязнения использовали дозу нефти, вызывающую 30-50% угнетение тест-отклика, что позволяет фиксировать как явно выраженные, так и слабые эффекты детоксикации. Для выбора рабочей дозы строили шкалу токсичности. Для этого нефть вносили в песок в дозах от 2 до 70 г/кг песка, соответствующих уровням загрязнения от слабого до умеренного:. В загрязненный грунт (300 г) вносили семена пшеницы. Регистрацию тест-отклика проводили через 30 дней после начала эксперимента. Полученные результаты приведены на Рис. 3.

Рис. 3. Диапазоны токсичности нефтяного загрязнения. А: тест-отклик - длина растений пшеницы, Б: тест отклик - сухая биомасса растений.

Сопоставление эффективных доз нефти, вызывающих 50% снижение тест-отклика (ЭД50) показывает, что сухая биомасса растений оказалась более чувствительным параметром к дозе вносимой нефти (ЭД50 = 2 г/кг), но менее чувствительной - к качеству нефти: ЭД50 для сырой и тяжелой нефти практически не различались. Длина растений оказалась более чувствительной к качеству нефти, но менее чувствительной - к дозе: ЭД50 для сырой и тяжелой нефти составили 12 и 18 г/кг, соответственно. Шкалы токсичности по длине растений характеризовались более пологим углом наклона, что позволяет более достоверно оценить изменение токсичности в экспериментах по детоксикании. Поэтому в дальнейшем в качестве тест-отклика использовали длину растений. В качестве модельного загрязнителя использовали тяжелую нефть при дозе внесения 10 г/кг, соответствующей ЭД30.

В качестве тестируемых гуминовых препаратов использовали оба коммерческих гумата калия - ПГ и ИГ - как наиболее доступные и дешевые препараты, а так же ИГМК в качестве максимально гидрофобного препарата, для которого предполагали самое высокое сродство к связыванию нефтяных углеводородов. Дозы внесения гуматов устанавливали на уровне доз внесения типичных сорбентов - 0.01 и 0.1 % масс Для этого гуматы вносили в загрязненный песок в виде концентрированных растворов (2 и 25 г/л, соответственно) при соотношении песокграствор 10:1 (масс). Так как изменение уровня токсичности нефтяного загрязнения в присутствии ГП может быть обусловлено их собственным воздействием на тест-объект, то одновременно с токсическим эффектом оценивали собственное влияние ГП на тест-объект. Полученные данные приведены в Табл. 4.

Таблица 4

Уровень токсичности нефти (10 г/кг) в присутствии ГП и собственный эффект ГП

Препарат Отклик, % от контроля

и доза его внесения без нефти в присутствии нефти

Контроль 100 45±4

ИГМК 0,01* 111±5 65±4

ИГМК 0,1 83±4 46±3

ПГ0.01 95±4 54±3

ПГ0,1 77±4 53±3

ИГ 0,01 98±4 43±4

ИГ 0,1 72±3 20±4

* 0.01 и 0.1 - дозы внесения ГП, % масс.

Результаты по оценке собственного эффекта ПТ на рост пшеницы показывают, что в низких дозах С0.01%) ГП не оказывали существенного воздействия на рост растений-небольшой стимулирующий эффект наблюдался только для препарата ИГМК. В то же время увеличение дозы внесения до 0.1 % вызывало замедление роста растений в присутствии всех использованных ГП на 20-30%. Особенно резко негативное действие высоких доз ГТГ проявилось для препарата ИГ в присутствии нефти. Тест-отклик уменьшился до 20% по сравнению с 45% в контроле с нефтью.

Характер описанного негативного действия гуматов на рост растений позволяет предположить, что его причиной является защелачивание среды при внесении растворов гуматов в высоких концентрациях. Так, наиболее выраженное негативное действие наблюдается для препарата ИГ, содержащего большие количества карбонатов натрия я калия в силу специфики его получения (рН концентрированных растворов ИГ больше 10). При этом эффект стимуляции наблюдается для препарата ИГМК, при растворении которого вносили минимальное количество щелочи, создавая рН 7.

Анализ результатов по влиянию ГП на токсический эффект нефти показывает существенное снижение токсичности нефти в вариантах со внесением низких доз наиболее гидрофобных препаратов - ПГ и ИГМК: относительное увеличение тест-отклика дня них составило 44 и 22%, соответственно. При этом увеличение дозы ГП не приводило к дальнейшему снижению токсичности нефти, а в случае препарата ИГ вызывало значительное угнетение роста растений.

Принимая во внимание линейность шкалы токсичности нефти в диапазоне 0-18 г/кг песка (Рис. 3), указанное относительное увеличение тест-отклика на 44 и 22% численно совпадает с величиной кажущегося уменьшения содержания нефти в присутствии тестируемых препаратов по отношению к контролю с нефтью. Данная величина - относительное уменьшение содержания нефти - широко используется для оценки эффективности биорекультивации нефтяного загрязнения, когда производится прямое определение нефтяных углеводородов в загрязненном грунте до и после проведения рекультивации. Численное совпадение величины относительного снижения токсичности, определяемой из экспериментов по детоксикации, и величины уровня деградации нефти, определяемого методами химического анализа, дает возможность сопоставить эффективность применения ГП в сорбционно-детоксикационных и биодеградационных технологиях.

В целом данные по сорбционно-детоксикационным свойствам использованных ГП позволяют сделать вывод о перспективности применения ГП в качестве сорбентов-детоксикантов при проведении фиторемедиации низкозагрязненных почв (< 30 г/л).

3.1 4. Изучение химических взаимодействий в системе нефть - песок - растворы гуминовых препаратов Для более глубокого понимания характера взаимодействий в тестированной системе: песок - нефть - растворы ПТ был проведен экстракционный анализ содержания и состава нефти, переходящей в раствор ГП в процессе биотестирования. Анализ проводили для модельных систем, сходных с экспериментами по детоксикации.

Экстракционные эксперименты проводили для ПГ, ИГ, ИГМК и ИГК. В песок вносили нефть из расчета 30 г/кг и добавляли растворы ГП с концентрациями 0.02 - 10 г/л в соотношении 1:16 (песок:раствор, масс.). Полученную суспензию встряхивали в течение 12 часов, декатировали раствор и экстрагировали его гексаном. Общее содержание нефти, перешедшей в водную фазу, определяли гравиметрически.

Полученные результаты по влиянию ГП на извлечение нефти в водную фазу приведены на рис 4. Обращает на себя внимание сходный ход зависимости содержания нефти в водной фазе от концентрации ГП для трех препаратов из сходного источника: ИГ, ИГК и ИГМК. Для всех трех препаратов содержание нефти в водной фазе резко возрастает до концентрации ГП 1 г/л и затем резко падение при увеличении содержания ГП до 5 г/л и выше. Для препарата ПГ степень извлечения нефти достигает максимума при концентрации ПГ 5 г/л и затем лишь незначительно падает.

0,12

| 0,02 | и

—ПГ 0,15 ъ»

-■-иг 5 0,12

-•-ИГМК •9-

-в-и пс »0,08 ф

Ж

¡0,06

§0,03

о

-ИГ -ПГ

23456789 10 Концентрация ГП, г1п

О 1

23456789 10 Концентрация ГП, гУл

Рис. 5. Влияние ГП на содержание нефти в водной фазе: А - в отсутствие буфера;

Б - в присутствии 0.1 М карбонатного буфера (рН 10.4).

Оценка абсолютного содержания нефти в водной фазе показала, что при малых концентрациях ГП оно превосходит содержание ГП. Следовательно, наблюдаемый рост содержания нефти в диапазоне концентраций ГП<1 г/л не может быть объяснен процессами связывания с растворенными ГП, а имеет иную природу. Нами было высказано предположение, что данный процесс обусловлен резким возрастанием рН при внесении сильно щелочных растворов ГП (рН 10-11).

Снижение содержания нефти в водной фазе при увеличении концентрации ГП свыше 1 г/л может быть обусловлено образованием агрегатов НУ и ГП и их последующим высаливанием из высокощелочных растворов, приводящему к интенсивной сорбции на песке. Это тем более вероятно, что резкое падение содержания НУ в растворе наблюдается при концентрации ГП 5 г/л, соответствующей критической концентрации мицеллообразования растворов ГВ.

В связи с изложенным, важно отметить иной ход аналогичной зависимости для препарата ПГ (исходный рН 9): монотонное возрастание содержания нефти до концентрации ПГ 5 г/л и лишь несущественное снижение при 10 г/л. По-видимому, в случае ПГ определяющим является процесс солюбилизации НУ за счет связывания с ГВ. При этом в силу низкой ионной сипы агрегаты НУ-ГВ остаются в растворе.

Для выявления роли рН в рассматриваемых взаимодействиях, аналогичные эксперименты были проведены для препаратов ИГ и ПГ в условиях постоянной ионной силы и рН в среде 0 1 М Ыа2СОз (рН 10 4) (Рис. 4Б). Введение высокощелочных растворов буфера в систему приводило к резкому возрастанию содержания нефти в водной фазе даже в отсутствие ГП: 0 12 г по сравнению с 0.02 г для дистиллированной воды при рН 5 5 При этом введение ПГ в концентрации ниже 1 г/л приводило к некоторому повышению, а ИГ - к понижению содержания нефти. Увеличение концентрации ГП свыше 1 г/л приводило к резкому снижению содержания нефти в растворе, при более высоком остаточном содержании в случае препарата ПГ.

Полученные закономерности позволяют сделать следующие выводы о характере взаимодействия ГП и НУ в исследованной системе: 1) высокие значения рН нивелируют солюбилизирующее действие низких доз гуминовых препаратов, приводя к пептизации нефти за счет ионизации кислотных трупп; 2) увеличение концентрации ГП в щелочных растворах свыше 1 г/л приводит к резкому снижению содержания нефти в растворе за счет образования гидрофобных агломератов ГВ-НУ и их последующего высаливания; 3) максимальное солюбилизирующее действие в условиях щелочного рН проявлял гумат калия из леонардита (ПГ), обогащенный ароматическими фрагментами.

Описанные выше закономерности объясняют существенное увеличение токсичности нефтяного загрязнения при введении высокой дозы самого щелочного препарата - ИГ, содержащего карбонаты калия и натрия. По-видимому, при этом происходит резкое высвобождение нефти в раствор, что усиливает токсичность среды. В то же время для ПГ и ИГМК, обладающих большим сродством к связыванию нефтяных углеводородов, усиления токсичности не наблюдается.

Помимо общего содержания нефти в растворе, представляло интерес изучить изменение фракционного состава растворенной нефти в присутствии ГП для

понимания механизма их взаимодействия с различными НУ. Для этой цели нефть, извлекаемую из растворов ГТТ гексаном, подвергали дальнейшему фракционированию.

Фракционный состав нефти определяли методом жидкостной хроматографии (ЖХ), который позволяет определять содержание парафино-нафтеновых углеводородов; моноциклических ароматических углеводородов (МАУ); бициклических ароматических углеводородов (БАУ); полициклических ароматических углеводородов (ПАУ); смол и асфальтенов. Для этой цели экстракт нефти сорбировали на силикагеле и пять первых фракций смывали смесью изооктана, дихлорэтана, зггилацетата и этилового спирта в количествах 8.0, 0.2, 0.2, 0.8-1.0 мл соответственно; для извлечения асфальтенов использовали смесь хлорбензола и этилового спирта в соотношении 3:1. Полученные результаты приведены в Табл. 5.

Таблица 5.

Содержание нефтяных фракций, перешедших в водный раствор различных ГП, %

Р-р ГП, г/л Парафины МАУ БАУ ПАУ Смолы Асфальтены

Исх. нефть 52.713.4 12.5±2.5 8.011.4 11.512.5 5.211.4 10.211.4

Нефть в диет. Воде 56.2± 3.4 13.9±2.5 7.811.4 8.011.4 5.711.4 8.311.4

ПГ 0.2 50.7±3.4 12.0±2.5 8.011.4 8.511.4 7.011.4 12.012.5

ПГ 1 55.3±3.4 11.712.5 8.811.4 8.511 4 4.411.4 11.312.5

ПГ5 54.2±3.4 14.112.5 11.011.4 8.911.4 6.011.4 6.011.4

ПГ 10 55.7± 3.4 11.012.5 9.411.4 7.111.4 9.511.4 7.211.4

ИГ 0.2 53.8± 3.4 14.612.5 9.011.4 11.011.3 7.511.3 4.311.4

ИГ 1 54.7± 3.4 12.412.5 9.211.4 10.311.4 4.111.4 9.311.4

ИГ 5 59.3± 3.4 14. Ш.5 11.012.5 7.111.4 5.111.4 3.511.4

ИГ 10 58.4± 3.4 4.011.4 8.311.4 9.711.4 13.212.5 6.411.4

ИГМК0.2 52.61 3 4 12.012.5 11.312.5 9.611.4 7.511.4 7.011.4

ИГМК1 48.2+3.4 15.7+2.5 9.611.4 9 4+1.4 5.511 4 14.512.5

ИГМК5 54.6± 3.4 12.7+2.5 9.711.4 8.211.4 8.311.4 6.511.4

ИГМК 10 59.,4±3.4 10.1+1.4 6.8+1.4 9.711.4 12.012.5 12.012.5

ИГК0.2 54.4+3.4 8.211.4 12.012.5 10.611.4 10.111.4 4.911.4

ИПС 1 53.2±3.4 11.411.4 10.11.4 11.312.5 8.011.4 9.511.4

ИГК5 47.4±3.4 14.712.5 10.611.4 11.812.5 8.311.4 7.211.4

ИГК 10 43.8± 3.4 14.212.5 8.0111.4 8.2+1.4 1612.4 9.711.4

*± 1.4 %, 2.5 % и 3.4% - стандартные ошибки для диапазонов величин 1-10, 10-30 и 30-80 %, соответственно, согласно ТУ 38.115.203-81.

Присутствие различных ГП приводит к изменению растворимости как низкомолекулярных ароматических углеводородов, так и смол, и асфальтенов. При этом степень изменения различна для разных ГП. Обращает на себя внимание, что присутствие 1 г/л ГП способствует небольшому увеличению содержания асфальтенов в водной фазе для всех исследуемых препаратов, в то время как увеличение концентрации ГП до 10 г/л способствовало возрастанию содержания смол.

Наблюдаемый эффект может быть обусловлен предпочтительным взаимодействием ГП с асфальтенами за счет наличия в их структуре конденсированных ароматических систем и образованием соответствующих комплексов. При низком содержании ГП такие комплексы находятся в растворе, при увеличении концентрации ГП (до 10 г/л) возможно образование более крупных агломератов с дальнейшей сорбцией их на песке. Увеличение содержания смол в водной фазе может быть обусловлено конкуренцией ГП за связывание с асфальтенами.

В целом, полученные данные позволяют сделать вывод о предпочтительном сродстве ГП к высокомолекулярным ароматическим компонентам нефти.

3.2. Изучение стимулирующего действия гуминовых препаратов на деградацию

нефти биопрепаратом «Родер» в модельных системах

Для оценки стимулирующей способности ГП в отношении бактерий-нефтедеструкторов проводили эксперименты по деградации нефти биопрепаратом «Родер». В качестве ГП использовали ИГ, ИГМК, ИГК и гумат железа - HTK-Fe3+. Гумат железа вводили в выборку исследуемых препаратов в качестве потенциального редокс-медиатора окислительной деградации нефти. Препараты вносили в дозах 0.001, 0.01 и 0.1% (масс), охватывающих весь диапазон возможных эффектов ГП: от стимулирующих (0.001%) до сорбционных (0.1%). В качестве микроорганизмов-нефтедеструкторов применяли биопрепарат Родер, который представляет собой концентрат живых или лиофильно высушенных высокоактивных клеток бактерий {Rhodococcus rubber Ac-1513D и Rhodococcus erythropolis Ac-1514D). Дяшплй препарат сертифицирован и применяется в технологии биодеградации МГУ.

Эксперименты проводили на тяжелой нефти. В качестве грунта использовали кварцевый песок; доза нефти - 42 г/кг. Деградацию проводили в климатической камере, любезно предоставленной д.б.н. Маториным Д.Н., на кафедре биофизики Биофака МГУ. Опыт проводили при температуре 27°С, бет освещения. Биопрепарат вносили 4 раза через каждые 2 недели. Пробы отбирали до внесения биопрепарата и через каждые две недели после внесения.

3.2.1. Влияние гуминовых препаратов на общий уровень биодеградации нефти

Определение общего содержания нефти в грунте и ее фракционного состава проводили гравиметрически. В качестве растворителей использовали хлороформ (для определения общего содержания нефтеуглеводородов); гексан, бензол и смесь бензол-этиловый спирт в соотношении 1:1 (для извлечения парафиновой, ароматической и тяжелой фракции нефти, соответственно).

Уровень деградации нефти (X) оценивали как относительное уменьшение содержания нефти в присутствии ГП (биопрепарата «Родер» или при их совместном присутствии) (С) по сравнению с концентрацией нефти в контроле (Со):

X = С° " С х 100 %

С.

Схема опыта включала следующие варианты: грунт+нефтъ - отрицательный контроль (К-); грунт+нефть+биопрепарат Родер - положительный контроль (К+); грунт+нефть+биопрепарат Родер+ГП. Результаты представлены на рис. 6.

Рис 6. Деградация нефти биопрепаратом «Родер» в присутствии Г*П в различных дозах (% масс): 1- 0.001,2 - 0.01, 3-0.1.

Внесение биопрепарата (К+) приводило к существенному возрастанию уровня деградации нефти: от 8±1 % за первые две недели до 20±2 % к моменту окончания эксперимента. При этом уровень деградации нефти в отсутствие биопрепарата не превышал 4 %. Внесение тестируемых ГП в стимулирующих дозах (0.001 %) интенсифицировало биодеградацию нефти, при этом для препаратов ИГ, ИГМК и ИГК стимулирующий эффект проявлялся в первые две недели эксперимента, тогда как для гумата железа - по истечении 8 недель. Увеличение дозы приводило к увеличению стимулирующего эффекта только для препарата ИГМК. В целом увеличение продолжительности эксперимента до 8 недель сопровождалось нивелированием стимулирующего влияния ГП на процесс биодеградации нефти.

3 2.2. Влияние ГП на фракционный состав нефти в процессе биодеградации

В связи с тем, что микроорганизмы препарата «Родер» в первую очередь разлагают алифатическую фракцию нефти и в меньшей степени - тяжелую фракцию, представлялось интересным оценить влияние ГП на эффективность биодеградации различных фракций нефтяного загрязнения. Изучение изменения фракционного состава нефти в процессе биодеградации показало, что внесение ГП в наибольшей степени стимулирует разложение тяжелой полициклической фракции (Табл. 6) и практически не влияет на алифатическую и ароматическую фракции.

Таблица 6.

Биодеградация тяжелой фракции нефти в загрязненном грунте в присутствии ГП

Препараты Уровень деградации, %

2 недели 4 недели 8 недели

К+ 16.1± 1.6 16.6± 0.1 9.810.7

К- 2.8±0.9 1.1± 0.8 1.0± 0.5

ИГК 0.001» 14.7± 0.3 13.7+ 0.3 1.0± 0.3

ИГК 0.01 11.6±0.3 13.6±0.3 29.9± 0.4

ИГК 0.1 18.7± 0.3 10.91 0.4 28.810.1

ИГМК 0.001 0.5± 0.8 12.2±0.1 32.211.1

ИГМК 0.01 10.810.1 11.8± 1.1 25.610.1

ИГМК 0.1 15.1± 0.4 4.8±0.1 29.911.1

ИГ 0 001 11.7+0.6 4.5± 1.1 20.410.5

ИГ 0.01 8.1± 0.5 1.7±0.5 12.710.1

ИГ 0.1 0.4± 0.5 15.5± 0.1 14.6+0.3

ГКРе3+0.001 16.8± 0.4 15.7±0.3 12.610.1

♦0.001,0.01 и 0.1 означают дозы внесения ГП, % масс.

Наибольший эффект наблюдали для ИГК и ИГМК практически при всех дозах внесения по истечении 8 недель. Соответствующие уровни деградации составили 26 -32 % по сравнению с 10% в положительном контроле. Полученные данные позволяют отнести стимулирующий эффект ИГМК, наиболее ярко проявившийся для общего содержания нефти через 8 недель, за счет усиленной биодеградации тяжелой фракции нефти в присутствии данного ГП.

Отмеченный характер влияния ГП на интенсивность процесса биодеградации нефти, по-видимому, обусловлен их адаптогенным действием на микроорганизмы-нефтедеструкторы. Однако полученные результаты не позволяют говорить о наличии статистически значимого стимулирующего эффекта ГП на препарат «Родер» в условиях проведенного лабораторного эксперимента.

3 J. Изучение стимулирующего действия гуминовых препаратов на деградацию нефти аборигенной микрофлорой и биопрепаратом «Родер» в почве Для оценки перспективности использования ГП в целях стимуляции аборигенной микрофлоры необходимо было перейти от модельного грунта (песка) к реальной загрязненной почве со сформированным микробным сообществом, обогащенным бактериями-нефтедеструкгорами. Кроме того, для выработки практических рекомендаций по использованию ГП необходимо было выяснить характер влияния ГП на биодеградацию нефти биопрепаратом Родер в условиях реальной почвы.

Для постановки экспериментов использовали слабо- и сильнозагрязненную почву из района аварийного разлива нефти (месторождение Беледжари, республика Азербайджан) с содержанием НУ 2 и 180 г/кг, соответственно. Для создания условий умеренного загрязнения, высокозагрязненную почву разбавляли песком до содержания НУ 30 г/кг. Для стимуляции аборигенной микрофлоры и биопрепарата Родер в почву вносили удобрительную смесь и ГП. В ходе эксперимента контролировали общее содержания нефти и микробную активность почвы. Общая длительность опыта была 6 недель. Отбор проб проводили каждую неделю. В качестве ГП использовали ГТГ в дозе внесения 0.01 % масс. Выбор данного препарата был обусловлен его высокой детоксицирукнцей способностью по отношению к нефтяному загрязнению.

При низком содержании нефти в почве (30 г/кг) внесение ПГ не оказывало стимулирующего эффекта на биодеградацию нефти как специализированной, так и аборигенной микрофлорой (Рис. 7). Степень биоразложения нефти как в присутствии, так и в отсутствие ГП оставалась практически постоянной и составляла 34 %.

Рис. 7. Влияние ПГ (0.01 % масс.) на биодеградацию нефти в нефтезагрязненной почве: (А) умереннозагрязненная почва (30 г/кг); (Б) высокозагрязненная почва (180 г/кг)

Совершенно иной характер эффектов наблюдался для высокозагрязненной почвы. Так, внесение ПГ способствовало явной активации аборигенной микрофлоры: уровень деградации нефти в присутствии ГП составил 26 % по сравнению с 15% в контрольном варианте. При этом аборигенная микрофлора в присутствии ПГ по активности не уступала, а даже превосходила биопрепарат Родер. В свою очередь, внесение ПГ способствовало и стимуляции активности биопрепарата, но в меньшей степени, чем аборигенной микрофлоры: уровень биодеградации на момент окончания эксперимента в варианте ПГ+Родер составлял 20% по сравнению с 15% для Родер+удобрительная смесь.

Определение численности микроорганизмов показало, что количество углеводородокисляющих бактерий оставалось высоким в течение всего процесса биодеградации нефти во всех его вариантах. В присутствии ГП как для сильно-, так и умереннозагрязненной почвы наблюдали более стабильное сохранение численности активных клеток бактерий. Можно предположить, что ГП положительно влияют на микроорганизмы в стрессовых ситуациях, например, при деградации нефти.

Полученные уровни биодеградации нефти аборигенной микрофлорой (20-25 %) в присутствии выбранной рабочей дозы ПГ (0.01 %) оказались сопоставимы с величиной снижения токсичности нефти (22%), найденной в экспериментах по детоксикации загрязненного модельного грунте при внесении такой же дозы ПГ. Приведенные оценки показывают перспективность применения гуминовых препаратов как в сорбциоино-детоксикационных технологиях с последующей фиторемедиацией, так и в биодеградационных технологиях рекультивации в варианте с использованием биопрепаратов и, в особенности, для стимуляции аборигенной микрофлоры.

3.4. Апробация способа комбинированного применения гуминового препарата и биопрепарата «Родер» при биоремедиации натурного загрязненного участка Полученные результаты по сорбционно-детоксицирующей и стимулирующей способности гуминовых препаратов позволили остановить выбор на гумате калия леонардита (ПГ, «РошЬшши») для апробации способа его комбинированного применения с биопрепаратом «Родер» в условиях полевого эксперимента. Апробация была проведена одним из авторов технологии МГУ с применением сертифицированного биопрепарата «Родер» - В.П. Мурыгиной, сотрудником кафедры химической этимологии химического факультета МГУ.

Эксперимент проводили в июне 2002 на участке № 20 Возейского месторождения (Усинский район Республики Коми, НГДУ «Комиарктикнефть»), Для апробации технологии МГУ с применением биопрепарата Родер и гуминового

сорбента была выделена делянка площадью 0,2 га, расположенная на юго-западной оконечности загрязненного нефтью болота. Уровень нефтяного загрязнения составлял 460 - 740 г/кг.

После предварительной очистки проводили три обработки биопрепаратом «Родер» с раствором удобрений через каждые две недели. Перед вторым внесением биопрепарата на сильно загрязненные фрагмента делянки (на нативную нефть) вручную был нанесен гуминовый сорбент (препарат ПГ) в количестве от 4,0 г/м2 до 20,0 г/м2, что соответствует дозе внесения 0 0005-0.002 % (масс). Перед третьим внесением биопрепарата «Родер» были посеяны вручную семена травосмеси (овес и тимофеевка).

Комбинированное применение биопрепарата «Родер» и гуминового препарата «РочагЬшпив» при неблагоприятных погодных условиях показало снижение уровня загрязнения на 21-51 %, в зависимости от начальной концентрации нефтяного загрязнения, причем наиболее активно процесс деградации проходил в период первых двух обработок. На Рис. 8 показаны начальное состояние делянки (конец июня 2002 г) и ее вид в середине сентября 2003 г.

А Б

Рис. 8. Состояние загрязненной делянки: А - до начала рекультивационных работ, Б - через год после проведения комбинированной обработки биопрепаратом «Родер» и гуминовым препаратом «Ро\Иштш».

Благодаря особенностям применяемой технологии биорекультивации, уже в сентябре 2002 г, через три месяца после обработки, наблюдали 60-75% покрытие площади делянки проростками травосмеси, а через год после биообработки (в сентябре 2003 г) площадь травяного покрытия составляла 85% (по оценке ФГУП «Комимелиоводхозпроект» и Института Биологии УрО РАН в Республике Коми).

Полученные результаты свидетельствует об успешной апробации гуминового сорбента-детоксиканта «РохуИшпив» в варианте комбинированного применения с биопрепаратом Родер для рекультивации нефтезагрязненного натурного участка.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Перспективность применения гуминовых препаратов в качестве сорбентов-детоксикантов и биостимуляторов при проведении рекультивации нефтезагрязненяых почв продемонстрирована результатами лабораторных и полевых экспериментов. Максимальные эффекты детоксикации и стимуляции получены в условиях сильного нефтяного загрязнения почв.

2. Сорбционно-детоксицирующая способность гуминовых препаратов в отношении нефтяных углеводородов возрастает в ряду: гумат калия бурого угля < гиматомелановые кислоты бурого угля < гумат калия леонардита, совпадающим с рядом гидрофобности препаратов. Максимальное снижение токсичности нефтяного загрязнения вызывают дозы внесения гуматов < 0.01 %; более высокие дозы угнетают рост растений.

3. Максимальная стимулирующая способность гуминовых препаратов проявляется для аборигенной микрофлоры высокозагрязненных почв: присутствие гумата калия из леонардита: увеличивало уровень деградации нефти на 40%. Аналогичного эффекта для низкозагрязненвых почв не наблюдается.

4 Стимулирующий эффект гуминовых препаратов по отношению к биопрепарату «Родер» менее выражен, чем для аборигенной микрофлоры Наибольший эффект достигался для гумата калия леонардита в условиях высокозагрязненной почвы: уровень деградации нефти возрастал на 25%. Для условий модельного грунта прирост уровня деградации нефти не превышал 15%. Высказано предположение об адаптогенном механизме наблюдаемого эффекта биостимуляции.

5. Солюбилизирующее действие гуминовых препаратов по отношению к нефтяным углеводородам проявляется при их низких содержаниях в растворах (< 1 г/л). Концентрации гуминовых препаратов > 1 г/л способствуют образованию нерастворимых аддуктов с нефтяными углеводородами. Связывание происходит преимущественно с полициклической фракцией нефти - смол и асфальтенов.

6. Апробация предложенного способа комбинированного применения гумата калия из леонардита и биопрепарата «Родер» при проведении биорекультивации высокозагрязненного натурного участка по технологии МГУ показала высокую эффективность проведенной обработки.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Салеем Каид М., Перминова И.В., Гречшцева Н.Ю., Мурыгина В.П., Мещеряков C.B. Использование гуминовых препаратов при биорекультивации нефтезагрязненных почв. Экология и промьшшенность России, 2003, апрель,

2. Салеем Кавд М., Перминова И.В., Гречшцева Н.Ю., Мещеряков С.В. Изучение детоксицирующей способности гуминовых препаратов по отношению к нефтяному загрязнению почв. Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе, 2004 (в печати).

3. Saleem К.М., Mikailov G.G., Minygina V.P., Perminova I.V., Grechishcheva N.Y., Mescherikov S.V. Influence of humates on degradation of oil by oil-oxidizing microorganisms. Proceedings of the 2nd International Congress «Biotechnology - state of the art and prospects of development». Nov. 10-14, 2003. Moscow, Russia. 2004 {In Press).

4. Saleem K.M., Perminova I.V., Grechishcheva N.Y., Murygina V.P., Mescherikov S.V. Application of humic substances for biological remediation of oil polluted soil. Abstract book. Use of humates to remediate polluted environments: From theory to practice. Sept. 23-29,2002. Zvenigorod, Russia, p. 30-31.

5. Салеем Каид M., Перминова И.В., Гречшцева Н.Ю., Мурыгина В.П., Мещеряков С.В. Влияние гуминовых веществ на деградации нефти микроорганизмам нефтедеструктрами. Тезисы докладов 2-го Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 10-14 ноября 2003, Москва. Т. 2, 206-207.

с. 19-21.

Салим К.М.

Выражение признательности

Автор выражает глубокую признательность:

Мещерякову C.B. - заведующему кафедрой промышленной экологии РГУ им. И.М. Губкина - за помощь в процессе подготовки и написания диссертации.

Мурыгиной В.П. - сотруднику кафедры энзимологии Химфака МГУ - за научные консультации и практическую помощь в постановке экспериментов по биодеградации нефти, за деятельное участие и неформальный интерес к работе.

Пахомову М.Д. - персонально, а также Магадову P.C. и Магадовой JLA. -сотрудникам кафедры органической химии и химии нефти РГУ им. И.М. Губкина - за помощь в обсуждении результатов.

Филиповой О.И. - персонально, а также Куликовой H.A. и Лебедевой Г.Ф. -сотрудникам кафедры общего земледелия факультета почвоведения МГУ - за помощь в постановке и проведении вегетационных экспериментов.

Материну Д.Н. - сотруднику кафедры биофизики Биофака МГУ - за предоставление климатической кафедры для проведения экспериментов.

Сотрудникам лаборатории физической органической химии Химфака МГУ - за поддержку и участие в работе.

Подписано в печать ■ (XI. 2004 года. Заказ № 0¥. Формат 60x90/,6. Усл. печ. ■ Тираж ¿.ОО экз.

Отпечатано на ризографе в отделе оперативной печати и информации Химического факультета МГУ.

I

1

)

<

(

!

i \

t

i I

s

I

i

\

P.1934

РНБ Русский фонд

2004-4 26961

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Салим Кайд Мохамед

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1 1. Нефтяное загрязнение почв и его экологические последствия.

1.2 Способы восстановления нефтезагрязненных почв.

1.2.1. Потенциальная способность природных экосистем к самоочищению.

1.2.2. Характеристика способов восстановления нефтезагрязненных почв.

1.2.3. Биологические методы восстановления нефтезагрязненных почв.

1.2.3.1. Мшфоорганизмы-деструкгоры углеводородов нефти.

1.2.3.2. Способы активизации естественного разложения углеводородов нефти в почве.

1.3. Общая характеристика гуминовых веществ.

1.3.1. Функции гуминовых веществ.

1.3.2. Применение гуминовых веществ для восстановления нефтезагрязненных почв.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1 Материалы и оборудование.

2.2 Техника эксперимента.

2.2.1 Выделение гуминовых препаратов.

2.2.2. Анализ гуминовых препаратов.

2.2.3. Изучение химических взаимодействий в системе нефть-песок-растворы гуминовых препаратов.

2.2.3.1 Методика определения общего количеста экстрагируемой нефти с гравиметрическим окончанием.

2.2.3.2 Методика определения состава экстрагируемой нефти с использованием жидкостной хроматографии.

2.2.4. Химические методы анализа нефтезагрязненной почвы.

2.2.4.1. Методика определения общего содержания нефти в почве.

2.2.4.2. Методика определения фракционного состава нефти в почве гравиметрическим методом гравиметрическим методом.

2.2.5. Методики токсикологических экспериментов.

2.2.6. Эксперименты по биодеградации нефти.

2.2.6.1. Изучение влияния ГП на деградацию нефти if биопрепаратом «РОДЕР» на модельной системе.

2.2.6.2. Изучение влияния ГП на биодеградацию нефти на реально загрязненной почве.

2.2.6.3. Методика использования комбинированного способа применения ГП и биопрепарата Родер при биоремедиации на натурном загрязненном участке.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Исследование сорбционных и детоксицирующих свойств гуминовых препаратов в отношении нефтяных углеводородов.

3.1.1 Выбор и характеристика гуминовых препаратов.

3.1.2. Исследование сорбционно-детоксикационной способности гуминовых препаратов по отношению к нефтяным углеводородам.

3.1.3. Количественная оценка детоксицирующей способности гуминовых препаратов.

3.1.4.Изучение химических взаимодействий в системе нефть - песок - растворы гуминовых препаратов.

3.2. Изучение стимулирующего действия гуминовых препаратов на деградацию нефти биопрепаратом «Родер» в модельных системах.

3.2.1. Влияние гуминовых препаратов на общий уровень биодеградации нефти.

3.2.2. Влияние ГП на фракционный состав нефти в процессе биодеградации.

3.3. Изучение стимулирующего действия гуминовых препаратов на деградацию нефти аборигенной микрофлорой и биопрепаратом «Родер» в почве.

3.4. Апробация способа комбинированного применения гуминового препарата и биопрепарата «Родер» при биоремедиации натурного загрязненного участка.

ВЫВОДЫ. ц, ВЫРАЖЕНИЕ ПРИЗНАТЕЛЬНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование гуминовых препаратов для детоксикации и биодеградации нефтяного загрязнения"

Загрязнение окружающей среды нефтяными углеводородами неизбежно ** в условиях деятельности современного нефтедобывающего комплекса. В связи с этим разработка новых и совершенствование существующих технологий восстановления нефтезагрязненных земель являются актуальными проблемами охраны окружающей среды.

В современных технологиях рекультивации нефтезагрязненных почв наиболее широко используются процессы сорбции и биодеградации. Одним из перспективных направлений является применение сорбентов и стимуляторов на основе природных соединений, в частности, гуминовых веществ. Гуминовые вещества составляют 50-80% органического вещества почв и твердых горючих ископаемых. Запасы гуминовых материалов огромны - это низкосортные угли, торф, сапропель, и др. Они обладают высоким сродством к гидрофобным органическим соединениям, проявляют детоксицирующие, редокс-медиаторные и адаптогенные свойства в условиях химического загрязнения. Несмотря на уникальное сочетание указанных свойств, гуминовые вещества до сих пор не нашли широкого применения в практике рекультивации. Это связано с тем, что отсутствуют систематические исследования по сорбционно-детоксикационным и биостимулирующим свойствам гуминовых веществ в условиях нефтяного загрязнения. Как следствие, отсутствуют критерии выбора гуминовых препаратов для их использования в рекультивационных технологиях.

Указанные проблемы определили постановку целей и задач настоящей работы.

Целью работы являлось исследование перспективности использования гуминовых препаратов в сорбционных и биодеградационных технологиях восстановления нефтезагрязненных почв.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• изучить сорбционно-детоксикационные свойства ряда гуминовых препаратов по отношению к нефтяным углеводородам в условиях

•ф модельного загрязнения;

• изучить химические взаимодействия в системе нефть - песок - растворы гуминовых препаратов; исследовать стимулирующие свойства гуминовых препаратов по отношению к биопрепарату в условиях модельного и реального нефтяного загрязнения; исследовать стимулирующие свойства гуминовых препаратов по отношению к аборигенной микрофлоре нефтезагрязненных почв; предложить способ применения гуминовых препаратов для рекультивации нефтезагрязненных земель.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Экология", Салим Кайд Мохамед

ВЫВОДЫ

1. Перспективность применения гуминовых препаратов в качестве щ сорбентов-детоксикантов и биостимуляторов при проведении рекультивации нефтезагрязненных почв продемонстрирована результатами лабораторных и полевых экспериментов. Максимальные эффекты детоксикации и стимуляции получены в условиях сильного нефтяного загрязнения почв.

2. Сорбционно-детоксицирующая способность гуминовых препаратов в отношении нефтяных углеводородов возрастает в ряду: гумат калия бурого угля < гиматомелановые кислоты бурого угля < гумат калия леонардита, совпадающим с рядом гидрофобности препаратов. Максимальное снижение токсичности нефтяного загрязнения вызывают дозы внесения гуматов < 0.01 %; более высокие дозы угнетают рост растений.

3. Максимальная стимулирующая способность гуминовых препаратов проявляется для аборигенной микрофлоры высокозагрязненных почв: присутствие гумата калия из леонардита: увеличивало уровень деградации нефти на 40 %. Аналогичного эффекта для низкозагрязненных почв не наблюдается.

4. Стимулирующий эффект гуминовых препаратов по отношению к биопрепарату «Родер» менее выражен, чем для аборигенной микрофлоры. Наибольший эффект достигался для гумата калия леонардита в условиях высокозагрязненной почвы: уровень деградации нефти возрастал на 25%. Для условий модельного грунта прирост уровня деградации нефти не превышал 15%. Высказано предположение об адаптогенном механизме наблюдаемого эффекта биостимуляции.

5. Солюбилизирующее действие гуминовых препаратов по отношению к нефтяным углеводородам проявляется при их низких содержаниях в растворах (< 1 г/л). Концентрации гуминовых препаратов > 1 г/л способствуют образованию нерастворимых адцуктов с нефтяными углеводородами. Связывание происходит преимущественно с полициклической фракцией нефти - смол и асфальтенов.

6. Апробация предложенного способа комбинированного применения гумата калия из леонардита и биопрепарата «Родер» при проведении биорекультивации высокозагрязненного натурного участка по технологии МГУ показала высокую эффективность проведенной обработки.

ВЫРАЖЕНИЕ ПРИЗНАТЕЛЬНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность:

Мещерякову С.В. - заведующему кафедрой промышленной экологии РГУ им. И.М. Губкина - за помощь в процессе подготовки и написания диссертации.

Мурыгиной В.П. - сотруднику кафедры энзимологии Химфака МГУ -за научные консультации и практическую помощь в постановке экспериментов по биодеградации нефти, за деятельное участие и неформальный интерес к работе.

Пахомову М.Д. - персонально, а также Магадову Р.С. и Магадовой Л.А. - сотрудникам кафедры органической химии и химии нефти РГУ им. И.М. Губкина - за помощь в обсуждении результатов.

Филиповой О.И. — персонально, а также Куликовой Н.А. и Лебедевой Г.Ф. - сотрудникам кафедры общего земледелия факультета почвоведения МГУ - за помощь в постановке и проведении вегетационных экспериментов.

Маторину Д.Н. - сотруднику кафедры биофизики Биофака МГУ - за предоставление климатической кафедры для проведения экспериментов.

Сотрудникам лаборатории физической органической химии Химфака МГУ - за под держку и участие в работе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Салим Кайд Мохамед, Москва

1. Oil and gas journal. June 10, 2002. vol. 100.23. p74-76.

2. Доклады международной конференции по энергетике (IEА) нояб. 2003г.

3. Справочник нефтепереработка: Справочник // Подред. Г. А. Ластовкина, Е. Д. Радченко и М. Г. Рудина. Л.: Химия, 1986.648 е.,ил.

4. Иванова Л.В., Корнеев М.И., Юзбашев В.Н. Технология переработки нефти и газа // Изд. «Химия» М. 1966, с. 420.

5. В.Ж.Аренс, А.З.Саушин, С.М.Гридин, А.О.Гридин «Очистка окружающей среды от углеводородных загрязнений», издат-во «Интербук», 1999г

6. Шульгин А.И.//Эффективная технология рекультивации нарушенных земель //ЭКиП России.,2000 г.

7. Другов Ю.С., Родин А.А. Экологические анализы при разливах нефти и нефтепродуктов, С-Пб,2000 г.

8. Справочник «Технологии восстановления почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами», изд-во РЭФИА, НИА- Природа, М-2001 г.-185 с.

9. Справочник «Технология восстановления почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами», изд-во РЭФИА, НИА-Природа. .:М-2003.г-257.

10. А.А. Зубайдуллин. К вопросу рекультивации нефтезагрязненных земель на верховых болотах. Биологические ресурсы и природопользование: Сб. науч. труд. г. Нижневартовск: Изд-во Нижневарт. пед. ин-та, 1998, Вып. 2, с. 106-116.

11. П.Лушников С.В., Завгороднев К.Н., В.В. Бобер //Очистка воды и почвы от нефти и нефтепродуктов с помощью культуры микробов деструкторов// ЭКиП,1999 г.

12. Гарейшина А.З., Ахметшина С.М., Гараев И.Х. //Комплексная технология ликвидации нефтяных загрязнений с дальнейшей рекультивацией почвы.// Нефтяное х-во, 1998, № 2, стр.69-70.

13. Николаев Н.М., Круглов А.Н. // "Технологии восстановления нефтезагрязненных территорий АО "Лукойл Лангепаснефтегаз". // Тез. докл. научно-практич. конфер. по экологическим проблемам, 1995 г, Москва, с 30-31.

14. Murygina V. P., Arinbasarov М., Kalyuzhnyi S. Bioremediation of oil polluted aquatic systems and soils with novelpreparation "Rhoder".// Biodegradiation 11: 385-389, 2000.

15. Arthur S., Kurzydlo, McBean Е. A. et al. (eds.) Remediation of soil and grondwater, 251-270, 1996.

16. Di Gregorio S., Serra R., Villani M. Appling cellular automata to complex envionmental problems: The simulation of the bioremediation of contaminated soils. // Theoretical computer Science 217 (1999). 131-156.

17. Коронелли T.B., Аракелян Э.И., Комарова Т.И., Ильинский В.ВJ! микробиология. 1994.

18. Хлесгкин Р. В., Самойлов Н. А., Шеметов А. В. Ликвидация разливов нефти при помощи синтетических органиченских сорбентов.// Экология № 2 с.46-49 1999г.

19. Шульга А.Н., Карпенка Е.В.,Елисеев С.А.,Туровский А.А., Корнелли Т. В. // Микробиология. 1990. Т 59. Вып. 3. С.443-447.

20. Кононова М. М. Органическое вещество почвы. М: Изд-во МГУ, 1963.

21. Орлов Д. С. Химия почв. М., Изд-во МГУ, 1992.

22. Киреева Н.А., Юмигузина Х.А., Кузяхметов Г.Г. рость и разветие растений овса на почвах, загрязненных нефтью// Сельск. биология. 1996. №5.С. 48-54.

23. ГотгшлакГ.//Метаболизм бактерий//Москва.,1987 г.,245 с.

24. Vasudevan N., Rajaram P. Bioremediation of oil sludge-contaminated soil. // Environmental International, vol.26, pp.409-411,2001.

25. Исмаилов Н.М., Паковский Ю.Ш. Биодинамика загрязненных нефтью почв // Миграция загрязняющих веществ в почвах и сопредельных средах. Л., 1985.

26. Ильинский В.В., Семяняко М.Н., Юферова С.Г., Троши-на Н.Н., Коронелли Т.В. Азотно-фосфорные удобрения для стимуляции биодеградации нефтяных УВ в морской среде // Вестник МГУ. Сер. биол. 1991. №2.

27. Leahy J.G., Golwell R.R. Microbial. Degradation of hydrocarbons in the environment // Microbial.Rev 1990. - Vol. 53,N3- p.305-315.

28. Кахаткина М.И. Состав гумуса пойменных почв, загрязненных нефтью // Рациональное использование почв и почвенного покрова Западной Сибири. Томск, 1986

29. Измаилов Н.М.,Пиковский Ю.Ч. Современное состояние методов рекультивации нефтезагрязненных земель // восствновление нефтезагрязненных почевнных экосистем. М.: 1988,- с.222-236.

30. Li G., Huang W., Lerner D. N., Zhang X. Enrichment of degrading microbes and bioremediation of petrochemical contaminants in polluted soil. // Water res.vol.34, №15 pp. 3845-3853,2000.

31. Биотехнологие методы ликвидации загрязнения почв нефтью и нефтгепродуктами. «Обзорная информация» ВНИИОЭНГ. Нефтяная и газовая промышленность. М.: 1993, cl-20.

32. Самосова С.М., Фильченкова В.И., Кипрова Р.Р, и др.Микрофлора черноземных почв и ее активность при загрязнении нефтью // Казанск. Ин-т биол.Казан. фил. АН СССр. К.: 1983. с.18.

33. Зб.Звягенцев Д. Г. почва и микроорганизмы. М.: Издательство МГУ, 1989.

34. Москвченко М.В., Стабникова Е.В., Иванов В.Н., Панежда И.А. Использование биогенных поверхностно-активных веществ в микробиологической очестке почвы от кглеводородов нефти. Микробиология. 1993, 59. Вып. 1. с75-78.

35. Фахрутдинов А. И. Влияние вариантов рекультивации нефтезагрязненной почвы на рост и развитие растений //Материалы межвузовской конференции молодых ученых. 15-19 апреля 2002г. -С-Пб.: Российский гос.пед. ун-т им. А.И. Герцена, 2002. — С.32-33.

36. Кононова М. М. Органическое вещество почвы. М: Изд-во МГУ, 1963.

37. Орлов Д. С. Химия почв. М., Изд-во МГУ, 1992.

38. Орлов Д. С. Свойства и функции гуминовых веществ. В сб.: Гуминовые вещества в биосфере. М.: Наука, 1993, с.16-27.

39. Rashid М.А. Geochemistry of marine humic compounds. Springer-Verlag, Oxford, 1985,243 p.

40. Линник П. H., Набиванец Б. И. Формы миграции металлов в пресных поверхностных водах. JL: Гидрометеоиздат, 1986,268 с.46.0рлов Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. М.: МГУ, 1992.

41. Humic substances and their role in the environment. John Wiley & Sons 1988. p. 133-148.

42. Bollag J.-M., Mayers K.//Sci. Total Environ., 1992, v. 117/118, p. 357-366.

43. Schnitzer M., Khan S.U. Humic substances in the environment. N.Y., Marcel Decker, 1972, p. 12-17.5О.Орлов Д. С. Гумусовые кислоты почв. М.: Изд-во МГУ, 1974.

44. Ziechmann W.//Huminstoffen. Problemen, Methoden, Ergebnisst. Weinheim: Verlag Chemie, 1980,480 p.

45. Stevenson F.J.//Geochemistry of Soil Humic Substances. In: Humic substances in soil, sediment and water. Aiken G.R., McKnight D.M., Wershaw R.L., MacCarthy P. (Eds.), N.Y., John Wiley & Sons, 1985, p.13-52.

46. Rice J.A., MacCarthy P. // Org. geochem., 1991, v. 17, No5, p. 635-648.

47. С1арр С.Е., Emerson W.W., Olness A.E. // Humic substances II. In search of structure. Ed. by Hayes M.H.B., McCartney P., Malcolm R.L., Swift R.S. J. Wiley & sons, 1986

48. Liao W., Christman R., Johnson J.D., Millington D.S.//Environ. Sci. Technol., 1982, v. 16, No.7, p. 403-410.

49. Stevenson F.J. Humus chemistry. Genesis, composition, reactions. N.Y., Wiley Interscience, 1982, p. 221-237

50. Ковалевский Д.В. Исследование структуры гумусовых кислот методами спектроскопии ЯМР *Н и 13С. Дисс. канд. хим. наук, Москва, 1998,142 с.

51. Krosshavn М., Bjorgum J.O., Kraiie J. and Steinnes E.I.//Soil Sci., 1990, v.232,p.141-148.

52. Preston C.M., Blackwell B.A.//SoU Sci., 1985, v. 139, No I, p. 88-96.

53. Shin H.S., Moon H. //Soil Sci., 1996, v. 161, No 4, p. 250-256.

54. Frund R., Ludemann H. D.//Sci. Total Environ., 1989, v. 81/82, p. 157168.

55. Ricca G. and Severini F. // Geodemm, . 993, v. 58, p. 233-244.

56. Conte P., Piccolo A., Van Lagen В., Buurman P. and De Jager P.A. // Geoderma, 1997, v. 80, p. 339-352.

57. Cook R.L., Langford C.H. // Environ. Sci. Technol., 1998, v. 32, p. 719725.

58. Humic substances in the Suwannee river, Georgia: Interactions, properties, and proposed structures. Averett R.C., Leenheer J.A., McKiiight D.M., and Thorn K.A. (Eds.) U.S. Geological survey water-supply paper 2373,1994.

59. Knulst J.C., Boershke R.C., Loemo S. // Environ. Sci. Tech., 1998, v. 32, N l,p. 8-12.

60. TrainaSJ., Novak J., SmeckN.E.//J. Environ. Qua!., 1990, v. 19, p.151-153.

61. Кауричев И.С., Панов Н.П., Розов H.H. Почвоведение. 1989, М, Агропромиздат, с. 719.

62. Белькевич П.И., Чистова Л.Р. Торф и проблема защиты окружающей среды. 1979, Минск "Наука и Техника", с.61.

63. Harvey G.R., Deborah А.В., at. si.//Marine Chem., 1983, v. 12, p.l 19132.

64. ShinozukaN., Lee C.//Marine Chem., 1991, v. 33, p. 229-241.

65. Hayano S., Shinozuka N Л Yukagaku, 1982, v. 31, p. 357-362.

66. Hayase K., Tsubota H.// Geochim. Cosmochim. Acta, 1983. v. 47, p. 947952.

67. Chen Y., SchnitzerMMSoil Science, 1978, v. 125, No 1, p. 7-15.

68. ShinozukaN., Lee C., Hayand S.//Sci. Total Envir., 1987, v. 62, p.311-314.

69. Petersen R.C., Kullberg AM Vatten, 1985, v. 41, p. 236-239.

70. Gauthier T.D.,Sitez W.R., Grant C.L. I I Environ.Sci. Tehnol., 1987,v. 21, p.243-248.

71. McCarthy J.F.Roberson L.E. // Chemosphere, 1989, v. 19, p.1911-1920.

72. Chin Y.P.,Aiken G.R., Damelsen K.M. // Environ.Sci. Tehnol., 1997, v.31,p.l630-1635.81. between organic chemicals and Senesi N. // Nature of interactions dissolvedhumic substances and the influence of environmental factors. In: Organic

73. Substances in Soil and Water: Natural Constituents and Their Influences on

74. Contaminant Behaviour. Beck A.J., Jones K.C., Hayes M.H.B. (Eds.), Royal Soci.1. Chem., 1993, p. 73-101.

75. Левинский Б.В.ДСалабин Г.А.// Гуматы из Иркутска и их эффективность//Химия в сельском хозяйстве, 1997 г.,30-32 с.

76. Христева JI.A. 1973. Действие физиологически активных гуминовых кислот на растения при неблагоприятных внешних условиях. В кн.: Гуминовые удобрения: Теория и практика их применения, т. 4, 5-23.

77. Смычник Т.Б. Получение и свойства водорастворимых уминовых препаратов из торфа. Дисс. докт. техн. наук, Минск, 1992.

78. Gardea-Torresdey, J. L.; Tang, L.; Salvador, J. M.//J. Hazard. Mater., 1996, v. 48, No. 1-3, p. 191-206.

79. Христева JI.A. 1973. Действие физиологически активных гуминовых кислот на растения при неблагоприятных внешних условиях. В кн.: Гуминовые удобрения: Теория и практика их применения, т. 4, 5-23.

80. Luoma, S.N. 1983. Bioavailability of trace metals to aquatic organisms. Sci.Total Environ., 28, 1-22.

81. McCarthy, J.F., Jimenez, B.D. 1985. Reduction in bioavailability to bluegills of polycyclic aromatic hydrocarbons bound to dissolved humic material. Environ. Toxicol. Chem. 4, 511-521

82. Oris, J.T., Hall, А.Т., Tylka, J.D. 1990. Humic acids reduce the photo-Induced toxicity of anthracene to fish and daphnia. Environ. Toxicol. Ch 9, 575-583.

83. Servos, M.R., Muir, D.C.G., Webster, G.R.B. 1989. The effect of dissolved organic matter on the bioavailability of polychlorinated dibenzo-p-dioxins. Aquat. Toxicol. 14, 169-184.

84. Vymazal, J. 1984. Short-term uptake of heavy metals by periphyton algae. Hydrobiologie. 119,171-179.

85. Chiou, C.T., D.E. Kile, T.I. Brinton, R.L. Malcolm, J.A. Leenheer, P. MacCarthy. 1987. A comparison of water solubility enhancements of organic solutes by aquatic humic materials and commercial humic acids. Environ. Sci. Technol. 21,1231-1234.

86. Wang, Z-D., Gamble, D.S. and Langford, C.H. 1990. Interaction of atrazine with Laurentian fulvic acid: binding and hydrolysis. Anal. Chim. Acta 232:181-188.

87. Field, J.A. 2001. Recalcitrance as a catalist for new developments. In: Papers of the Farewell seminar of Prof.dr.ir. Gatze Lettinga. Eds. Van Lier, J. and Lexmond, M. March 2001, Wageningen, The Netherlands, pp. 34-41.

88. Lovely, D.R., Coates, J.D., Blunt-Harris, E.L., Pillips, E.J.P., Woodward, J.C. 1996. Humic substances as electron acceptors for microbial respiration.Nature,382,445-448.

89. Алексеева Т.Л., Панова И.И., Бурмистрова Т. И., Терещенко Н.Н., Стахина Л. Д. Перспективы использования торфа для очистки нефтезагрязненных почв. С. 58-65,2002.

90. Гофман Я.А. Патент RU № 2124397 Дата публ.: 1999.01.10

91. Дружинин В.Л., Зорькин А.М. Патент RU № 2185236С1 Дата публ.:2002.10.20.

92. СибНИИТорфа Патент RU № 2137559 Дата публ.: 1999.09.20 МПК: В09С1/10

93. В.П. Мурыгина, С.В. Калюжный. Сравнительная оценка эффективности применения методов стимуляции аборигенной микрофлоры и биоагументации для биоремедиации загрязненных нефтью болотистых почв Западной Сибири. М. Г.У., Химический факультет, Москва-2001.

94. Мякина Н.Б., Аринушкина Е.В. //Методическое пособие для чтения результатов химических анализов почв.// Москва, Изд. МГУ, 1991, с.35.

95. Сб. Физико-химические методы исследования почв.//, Изд. МГУ, 1994 г., с.37.

96. Методика определения группового состава сырья методом жидкостной хроматографии. // Всесоюзый научно-исследовательский институт технического углерода, 1983г.

97. Аринушкина Е.В. //Руководство по химическому анализу почв .//Москва, Изд. МГУ, 1970, 512 стр.

98. Rosa Margesin, Astrid Zimmerbauer, Franz Schinner. Soil lipase activity-a useful indicator of oil biodegradation.Biotechnology Techniques 13: 859-863. 1999.

99. J.G. Bundy, G.I. Paton and CD. Campbell Microbial communities in different soil types do not converge after diesel contamination. Journal of Applied Microbiology 2002, 92, c.276-288

100. Сергиенко C.P., Таимова Б.А., Талалаев Е.И. Высокомолекулярные неуглеводородные соединения нефти. Смолы и асфальтены. М.: Наука, 1979,269 с.

101. Сергиенко С.Р. Высокомолекулярные неуглеводородные соединения нефти. М.: Изд «ХИМИЯ», 1964, 545 с.

102. Дияров И. Н., БатуеваИ. Ю., Садиков А. Н., Солодова Н. Л. Химия нефти. Руководство к лаборатурным занятиям. Л.:Химия, 1990.-240 с.

103. Новиков Ю. В. Экология окржаюая среда и человека- М.: ФАИР- ПРЕСС, 2000. 320 с.

104. Корте Ф., Бахадир М., Клайн В., Парлар Я. Шойнерт И. Экологическая химия: Пер. С Нем./ под ред. Корте Ф.-М.: Мир, 1997.396 с.

105. Другов Ю. С. Экологическая аналитическая химия.-М.: 2000.432 с.

106. Al-Khatyb A. Environmental chemistry of soils: Пер. с Arab. 1998.- 454с.

107. Ahmad Fuzy Usif. Apparaturs and methods of water and soils analization.-Riad (K.S.A.): Пер. с Arab. 1999.-464 с.

108. Белькевич П.И., Чистова Л.Р. Торф и проблема защиты окружающей среды. Минск, 1979, с. 38-56.

109. Смычник Т.Б. Получение и свойства водорастворимых уминовых препаратов из торфа. Дисс. докт. техн. наук, Минск, 1992.

110. Каролев В.А., Некрасова М. А., Митоян Р.А.// Электрохимическая очистка грунтов от зягрязнений.// Экология и промышленность россии, август 1998.С. 11-14.

111. Минеев В.Г., Сычев В.Г.,Практикум по агрохимии., МГУ,М., 2001 г.,689 с.

112. Глебова Г.И.// Гиматомелановые кислоты и их место в системе гумусовых веществ// автореферат на диссертацию.,МГУ.,1980 г.,23 с.

113. Данченко Н.Н., Перминова И.В., Гармаш А.В., Кудрявцев А.В.//Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. 1998. Т. 39. № 2. С. 127-131.

114. Гречищева Н.Ю. Взаимодействие гумусовых кислот с полярными ароматическими углеводородами: химические и токсикологические аспекты // дисс. конд.хим.наук.

115. Парафино-нафтеновые углеводороды