Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование физических факторов для повышения биологической активности подвижной фракции спермиев эякулята человека

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Использование физических факторов для повышения биологической активности подвижной фракции спермиев эякулята человека"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБЮЛОГІЇ І КРІОМВДИЦИНИ

АХМАД МОХАММАД МОСТАФА

УДК 611.013.11:57.043

ВИКОРИСТАННЯ ФІЗИЧНИХ ФАКТОРІВ ДЛЯ ПІДВИЩЕННЯ БІОЛОГІЧНОЇ АКТИВНОСТІ РУХЛИВОЇ ФРАКЦІЇ СПЕРМІЇВ ЕЯКУЛЯТУ ЛЮДИНИ

03.00.19 - кріобіологія і кріомедицина

втореферат дисертації на здобуття наукового ступеня андидата медичних наук

Харків - 1997

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіологїї І кріомедицини НАН України

Науковий керівник: академік НАН України, доктор медичних наук, професор,

лауреат Державних премій СРСР та України Грищенко Валентин Іванович

Інститут проблем кріобіологїї І кріомедицини НАН України, керівник відділу кріобіологїї системи репродукції

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Цуцаєва Алла Олександрівна

Інститут проблем кріобіологїї і кріомедицини НАН України, зав. відділом кріоімунолопі

кандидат медичних наук, доцент Арнольді Едуард Костянтинович Харківський державний медичний університет, доцент кафедри урології

Провідна установа: Інститут педіатрії, акушерства і гінекології,

відділ реабілітації репродуктивної функції жінки, лабораторія штучної ІнсемІнацД Академії Медичних Наук України м.Київ

Захист відбудеться *‘<£5' "грудну 4097 р. о ~/3^ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д50.21.01 при Інституті проблем кріобіологїї І кріомедицини НАН України (310015, м.Харків, вул.Переяславська, 23)

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту проблем кріобіологїї I кріомедицини НАН України (310015, м.Харків. вул.Переяславська, 23)

Автореферат розісланий ‘ьС&’МсТспарА-1007 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор медичних наук, професор

Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. В останні два десятиріччя вагомо збільшилась пькість безплідного подружжя, в тому числі і в Україні, особливо з чоловічим актором безпліддя (В.І.Аліпов із співавторами, 1986, Ю.С.Паращук, 1994, .Корякін, ААкопян, 1995). Чоловіча репродуктивна система - одна з найбільш >азливих систем організму людини. В наші дні вона зазнає сильної дії кідливих екологічних факторів, внаслідок чого суттєво знижується мцентрація сперміїв в еякуляті здорових чоловіків, зменшуються кінетичні жазники гамет, збільшується вміст морфологічно аномальних клітин ..V. Wagenknecht, 1982, A.C.Wentz, 1986, E.D.CIegg,C.S.Sakaj,P.E.Voytek,1986, Yavetz, A.Mosek, L.Vogev et al,1990). Для лікування безпліддя застосовують їогресивні методи допоміжної репродуктивної технології, а саме - штучну семінацію (внутрішньомажову, внутрішньотрубну, перітонеальну) спермою уювіка або донора, перенос яйцеклітин зі сперміями в маткові труби, траперітонеальний перенос сперміїв і яйцеклітин, екстракорпорапьне іпліднення. Для всіх цих методів важливим є виділення з еякуляту найбільш івноцінних сперміїв -фракції рухливих клітин, а також можливість >ршхострокового (2-5 днів) та довгострокового (місяці, роки) зберігання їх в ологічно повноцінному стані. Актуальним є пошук способів підвищення ертильності сперміїв, T.D.Carrell, W.S. Bradshaw, 1992, повідомили про £ективність використання для підвищення пенетраційної здатності сперміїв одини такого фізичного фактора як гіпотермія.

М.І.Крамар, 1990, Н.Н.Чуб, 1995, показали можливість гіпотермічного Зерігання сперміїв людини в біологічно повноцінному стані при нормоспермії і протязі 24-48 годин. Разом з тим при штучній інсемінації часто виникає гобхідність дворазової інсемінації через добу, тобто в цьому випадку, а також деяких інших, необхідно збереження біологічної повноцінності сперміїв >ловіка на протязі 3-4 діб, причому останнім часом частіше за все це спермії яку латі а чоловіків з оліго-, астено- та олігоастеноспермією.

Можливість збереження запліднюючої активності сперміїв при 4 ‘С на ротязі 4-5 діб показав в своїх дослідженнях на спермі биків М.Г.Ковальов, 990. Він використовував дію штучного додаткового постійного магнітного поля а гамети або на середовище зберігання, для чого застосовував досить просте

обладнання з лінійних магнітів. На гаметах людини такі дослідження проводилися.

Вибраний напрямок досліджень зв’язаний з науковими темами Інстит проблем кріобіологіі і кріомедицини НАН України (шифр 2.2.6,6. та 2.2.6.6.І метою яких є вивчення впливу початкового стану, факте низькотемпературної консервації на збереження репродуктивних клітин, також вивчення механізму підвищення фертильності гамет при дії низьі температур в комбінації з другими фізичними і хімічними факторами.

Мета і задачі дослідження.

Мета дослідження - з'ясувати залежність ефективності виділення еякуляту та гіпотермічного зберігання рухливої фракції сперміїв людини біологічних властивостей еякуляту і дії додаткового штучного постійні магнітного поля на живільне середовище, в якому виділяли і зберігали фракі рухливих гамет.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити таю задачі:

-провести порівняльне вивчення ефективності виділення фракції рухлиі сперміїв із еякуляту людини при порушеннях сперматогенезу та нормоспер методом “спливання”; з’ясувати можливість підвищення її, використовуй живільне середовище, що зазнало дії штучного постійного магнітного п< (ПМП);

-з’ясувати можливу залежність життєздатності, часу переживання кінетичних властивостей чоловічих гамет з рухливої фракції еякуляту, зберігались при 8 *С, від біологічних характеристик еякуляту та дії фізичі факторів - гіпотермії і ПМП;

-виявити залежність ступеню збереження акросом та активності акрозі при гіпотермії у рухливих сперміїв від вихідних біологічних властивосі еякуляту і дії ПМП на живільне середовище;

-дослідити збереження імунобіологічних властивостей сперміїв, зберігались в умовах гіпотермії у середовищі, що зазнавало або не зазнавг дії ПМП, та з’ясуватм можливість використання таких гамет в діагност імунологічного безпліддя.

Наукова новизна одержаних результатів. Нові наукові положен запропоновані здобувачем особисто, такі: збереження біологічної активне чоловічих статевих клітин із рухливої фракції еякуляту при гіпотермії залежі

з

д стану сперматогенезу у пацієнтів. Рухливі спермії, виділені із еякуляту з ормоспермією, зберігаються в біологічно повноцінному стані при гіпотермії овше, ніж клітини, одержані при патосперміях; найменш резистентними при ‘С виявилися рухливі гамети, виділені із сперми чоловіків з лігоастеноспермією. Ці результати одержані вперше і відрізняються від домих раніше (М.І.Крамар, 1990, Н.Н.Чуб із співавторами, 1994) тим, що втори не вивчали залежність збереження при гіпотермії біологічної овноцінності виділених із еякуляту гамет рухливої фракції від стану перматогенезу у пацієнтів, тобто від початкових біологічних характеристик якуляту. Новими є, одержані здобувачем особисто, результати, які свідчать ро те, що виділення рухливої фракції сперміїв із еякуляту людини і подальше берігання їх при 8’С більш ефективно в середовищі, попередньо витриманому штучному додатковому постійному магнітному полі. Це є подальшим озвитком робіт М.Г.Ковальова, 1980-1990 рр.,виконаних на сперміях великої огатої худоби. Дані про збереження сперміями, які були виділені із еякуляту і берігалися при гіпотермії в середовищі Ерла, на яке діяли постійним іагнітним полем, імунобіологічних властивостей, одержані здобувачем вперше.

Виділення рухливої фракції сперміїв з еякулятів по методиці, апропонованій дисертантом, тобто методом “спливання" в середовищі Ерла, опередньо витриманому в постійному магнітному полі з подальшим беріганням при 8'С, застосовується при обслідуванні та лікуванні безплідного одружжя у відділі кріобіології системи репродукції Інституту проблем ріобіології і кріомедицини НАН України на базі 5-го спеціалізованого кліничного ологового будинку м.Харкова, що фіксується в протоколах досліджень та мбулуторних картках подружжя. Таку методику можна рекомендувати для икористання в лабораторіях лікувальних закладів, в яких займаються ііатостикою і лікуванням безпліддя, зокрема методами допоміжної «продуктивної технології, такими як штучна інсемінація спермою чоловіка або іонора, екстракорпоральне запліднення.

Одержані здобувачем дані про залежність збереження рухливої фракції перміїв людини в умовах гіпотермії від вихідних біологічних характеристик якуляту рекомендується брати до уваги дослідникам та працівникам іікувальних установ, що займаються проблемами репродукції людини.

Наукові результати, що виносяться »

захист, отримані дисертантом особисто. Співавтори робіт здобувача В.І.ПІняі та В.Є.Чадаєв, що займаються лікуванням безплідного подружжя, допомагш здобувачу в підборі груп пацієнтів для одержання матеріалу дослідження пр різних ступенях патоспермії та при нормосперміі. Г.Г.Юрченко та М.І.Крамі допомагали здобувачеві освоїти методи дослідження сперми людин М.[".Ковальов та 3.1.Ковальова дали в розпорядження дисертанта д проведення експериментів своє магнітне обладнання (‘магнітну посудину") рекомендації щодо підбору режиму експозиції в ньому живільного середовиц. У публікаціях, що надруковані у співавторстві з указаними дослідникам дисертанту належить ідея і постановка експериментів, статистична оброб» аналіз результатів (загальні висновки).

Про результати досліджень проінформовано на І з'їзді Українське товариства кріобіологіі і кріомедицини (Харків, 1995), на симпозіумах міжнародною участю "Бесплодие. Вспомогательные репродуктивн технологии” (Київ, 1995, 1997), на міжнародному симпозіумі по імунолс репродукції (Київ, 1995).

Публікації

По темі дисертації опубліковано 7 робіт. Головні положення дисерта викладені в 3 статтях профільного журналу, в 2-х статтях в збірниках наукоЕ праць симпозіумів з міжнародною участю та в 2-х тезах доповідей українських наукових форумах.

Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів методів досліджень, п’яти розділів результатів власних експєриментальї досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень та виснові

Повнийобсяг дисертації -/^сторінок. Дисертація містить-?- малюні [^я<Рр-. Список використаних літературних джерел містить

найменувань. /У А<Р С7~&/Ье '/г/сО- зр.

містить

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріалом дослідження були еякуляти чоловіків із безплідного подружжя. Еякуляти поділяли на 4 групи, керуючись рекомендаціями ВОЗ, 1992, згідно яких виділяють: нормоспермію, олігоспермію, астеноспермію, та

олігоастеноспермію.

Для виділення фракції рухливих сперміїв застосовували метод “спливання” (Е-Бгегтап-иоІу еі аі., 1989). В якості живільного середовища використовували середовище Ерла.

При виборі режиму зберігання рухливої фракції сперміїв в умовах гіпотермії керувались методиками, розробленими М.І.Крамар, 1990, та Н.Н.Чуб із співавторами, 1994, у власній модифікації. Так, в якості середовища зберігання ми використовували середовище Ерла, Охолодження суспензії клітин від кімнатної температури до 8'С здійснювали в пластмасових пробірках місткістю 4 мл. Пробірки із суспензією рухливих сперміїв поміщали в скляний ексікатор, в атмосферу якого вводили 5% С02, після чого герметично закривали га ставили в холодильник з температурою 8’С.

Для експозиції живільного середовища в додатковому постійному магнітному полі використовували магнітну "посудину” М.Г. Ковальова, 1990, яка формується з 12-ти постійних полосових магнітів, кожен з яких має магнітну індукцію від центру до полюсів в межах від 0 до 45 мілітеста (тТ). Магніти поєднуються між собою, утворюючи циліндр, який впресовується південним полюсом в дерево. Середовище Ерла в поліетиленовому флаконі об’ємом 250 мл поміщується в магнітну посудину.

При вивченні життєздатності, часу переживання сперміїв та кінетичних властивостей їх користувались оптичною мікроскопією. Для оцінки концентрації і рухливості сперміїв використовували камеру Масіег виробництва Ізраїлю. Життєздатність їх визначали методом суправітального забарвлювання, для визначення часу переживання підраховували в годинах термін зберігання рухливості сперміїв від моменту розжиження еякуляту при 37° С (Е.Н.Паепус, 1991).

Для оцінки ступеню збереження акросоми гамет використовували акросомальний тест (П.Г.Морозов, 1990).

Визначення активності акрозину проводили за методичними рекомендаціями С.-Петербурзького інституту генетики і розведення сільскогосподарських тварин (Л.Г.Мороз, Н.В.Корбан, І.Ш.Шапієв, 1980) в модифікації Н.Ю.Смаглій, 1990.

При вивченні імунобіологічних властивостей гамет керувалися методичними рекомендаціями Харківського медичного інституту, 1983, то рекомендаціями ВОЗ, 1992. Застосовували якісний імунологічний тест - тест контакту сперміїв із цервікальним слизом, а також кількісні - реакцію спермоіммобілізаціі та реакцію аглютинації.

Одержані дані оброблені статистично. Результати представлені як середнє значення при 95%-му довірному інтервалі.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ АВТОРА

На меті першої серії експеріментів було з'ясування залежності ефективності виділення рухливої фракції сперміїв від вихідних характеристик еякуляту і умов виділення, а також вивчення впливу гіпотермії на зберігання кінетичної активності виділених гамет і можливість підвищення ЇІ за допомогою використання живільного середовища, яке експонували в постійному магнітному полі.

Матеріалом дослідження були 17 еякулятів з нормоспермією, 19 - з олігоспермією, 23 - з астєноспермією та 21 - з олігоастеноспермією. Об’єм еякуляту був 3,5± 0,4 мл. Одержані при цьому результати представлені в таблиці І.

Як видно з матеріалів таблиці, застосування методу “спливання” дозволило одержати суспензію рухливих сперміїв з концентрацією гамет в 1 мл значно вище, ніж вміст такої категорії гамет в еякуляті. Це пов’язано, очевидно

з “відмивкою” сперміїв від окутуючих білків, тяжів слизу, так як концентрація рухливих сперміїв в одержаній після методу “спливання" суспензії вища у порівнянні з вихідним показником в еякуляті при астеносперміі та олігоастеноспермії, тобто, коли в еякулятах більший вміст слизу та його вязкість підвищена.

Беручи до уваги дані (М.Г. Ковальов, 1990) про те, що витримування в ПМП (в “магнітній посудині”) живільного середовища, в якому кріоконсервується або зберігається сперма биків в умовах гіпотермії, сприяє

ібільшенню тривалості збереження рухливості сперміїв, доцільним є іеревірити і-у дані на сперміях людини. Такий підхід до підвищення фертильності сперми дуже привабливий, бо виключає безпосередню дію на амети. В попередніх експериментах на 19 еякулятах чоловіків з нормоспермією 5уло встановлено, що, при виділенні рухливої фракції сперміїв із еякуляту, ікщо застосувати живільнє середовище, яке знаходилось в ПМП на протязі 418 годин, кількість виділених рухливих клітин виявляється на 12,2±2,6% більшою, що достовірно вище, ніж при використанні середовища, що не зкспонувапи в ПМП.

Базуючись на цих даних, з другої половини об’ємів еякулятів, результати виділення з яких рухливої фракції без застосування ПМП представлені в таблиці І, ми одержували популяцію рухливих гамет в середовищі, яке гкспонували в ПМП. При цьому концентрація сперміїв в виділеній фракції була достовірно вищою ніж без застосування ПМП, а саме: при нормоспермії -34,2±3,9 млн/мл, при олігоспермії - 25,2±1,2 млн/мл, при астеноспермії -38,4±2,5 млн/мл (р - в усіх випадках < 0,05). В суспензії рухливих гамет, зиділених з еякуляту при олігоастеноспермії, концентрація була 1б,9±1,5 иллн/мл, а той час як при застосуванні середовища, на яке не діяли ПМП, цей показник був 12,1±1,2 млн/мл. В цьому випадку різниця наближалась до значущого рівня: 0,1>р>0,05.

Виділені суспензії рухливих гамет ми зберігали при 8‘С на протязі трьох діб, перевіряючи щоденно вміст рухливих клітин в зразках. Динаміка збереження рухливості сперміїв в процесі гіпотермічного зберігання без застосування і з застосуванням ПМП наведена в таблиці 2. Як видно з матеріалів таблиці , в тих випадках, коли використовували середовище, на яке не діяли ПМП, вже через 24 години у фракції клітин, виділених із сперми при олігоастеноспермії, частина гамет втратила рухливість (р<0,05), а через 72 години зниження концентрації рухливих сперміїв було статистично значущим у всіх зразках суспензії гамет.

Якщо для виділення і зберігання рухливої фракції гамет використовували живільнє середовище, на яке діяли ПМП, динаміка зниження рухливості була повільнішою. Так, на протязі 48 годин в жодному зразку, за виключенням одержаних при олігоастеноспермії, не спостерігалося достовірного зниження концентрації рухливих гамет. При нормоспермії та олігоспермії і через 72 години вміст рухливих гамет достовірно не знизився.

Ефективність виділення рухливої фракції сперміїв із еякуляту при нормоспермії та при патосперміях

. методом "спливання”

Концентрація сперміїв в еякуляті (млн/мл,М±т),стан сперматогенезу Вміст рухливих сперміїв (%, М+т ) Концентрація сперміїв у виділеній рухливій фракції (млн/мл,М+т) Р при порівнянні концентрації рухливих сперміїв в еякуляті і у виділеній фракції

% млн/мл

52,4±5,1 (нормоспермія) 71,5+6,8 37,5±3,9 72,0+2,7 <0,05

16,8+1,7 (олігоспермія) 60,3+4,9 10,1±1,1 20,1 ±0,9 <0,05

47,3+3,9 (астеноспермія) 28,7±3,1 13,3±2,2 29,5+2,1 <0,05

16,1±1,6 (олігоастеноспермія) 27,2±2,4 4,4+0,9 12,1+1,2 <0,05

Динаміка зміни концентрації рухливих сперміїв у суспензії, виділеної із еякуляту методом “спливання", в процесі зберігання при 8 °С в живільному середовищі Ерла

Стан сперматогенезу у пацієнтів Концентрація (млн/мл, М±т) при застосуванні живільного середовища Ерла без дії ПМП Концентрація (млн/мл, М+т) сперміїв при застосуванні живільного середовища Ерла, на яке діяли ПМП

до поміщення в умови гіпотермІГ збе зігання при 8'С до поміщення в умови гіпотермії зберігання при 8'С

24 год. 48 год. 72 год. 24 год. 48 год, 72 год.

нормоспер- МІЯ 72,0±2,7 68,1+3,9 60,9±5,1 48,7+4,4* 84,2±3,9“ 77,1+5,1 72,7+6,9 69,8+6,5

олігоспер- мія 20,0+0,9 18,2±1,4 16,4+1,3 12,6+1,2* 25,2±1,2м 21,8±2,1 19,8±1,9 18,6+2,3

астено- спермія 29,5±2,1 25,3+2,5 21,1+2,1 16,7+1,5* 38,4±2,5“ 32,7±3,3 29,7±3,1 22,8+2,2*

оліго-асгена-спермія 12,1±1,2 8,0±0,9* 7,1±0,8* 5,9+0,6* 16,9+1,5*** 14,1+1,3 10,2+1,0* 8,1+0,9*

Примітка: * р <0,05 при порівнянні з показником до приміщення в умови гіпотермії ** р <0,05 при порівнянні з показником без застосування ПМП

0,1>р>0,05 при порівнянні з показником без застосування ПМП

Таким чином, в першій серії експериментів були одержані дані про те, що підвищенню фертильності сперми, зокрема підвищенню кількості рухливих гамет, сприяє використання для їх виділення з еякуляту методу "спливання" в живільному середовищі Ерла, витриманого в ПМП. Останнє сприяє також пролонгації гіпотермічного збереження одержаної суспензії рухливих гамет. Збереження рухливості гамет при гіпотермії залежіть також від початковий біологічних характеристик еякуляту - при нормо- та олігосперміі воно довше, ніж при астеноспермії та олігоастеноспермії.

В другій серії експериментів вивчали життєздатність та час переживанні при 37’С гамет рухливої фракції, виділеної із 27 еякулятів з нормоспермією, і: 31 - з олігоспермією, із 22 - з астеноспермією та 19 - з олігоастєксспсрміск при зберіганні їх в умовах гіпотермії. Виявилось, що кількість живих клітин в усі: зразках суспензії на протязі 24 годин достовірно не знизилась. Через 48 годи» перебування при 8’С в суспензії гамет, одержаних при астено- ті олігоастеноспермії, життєздатність достовірно зменшувалась і становилі 68,5+4,2% та 62,1 ±3,7% відповідно, а ще через добу достовірне зниження цьоп показника спостерігалося у всіх випадках. Середовище Ерла, експоноване і ПМП, забезпечило зберігання гамет а життєздатному стані при 8*С до кінц терміну спостереження при нормо- та олігосперміі, у клітин в суспензії одержаної із еякулятів з астено- та олігоастеноспермією, вміст живих кліти через 72 години достовірно знизився і становив відповідно 70,2±6,4% т 60,7+5,3%.

Час переживання сперміїв при 37'С був неоднаковим у клітин рухливе фракції еякуляту при нормоспермії та порушеннях сперматогенезу навіть д того, як їх приміщали в умови гіпотермії. Так, час переживання сперміїв суспензії, одержаної в середовищі Ерла як без обробки ПМП, так і з нею, пр астено- та олігоастеноспермії був достовірно нижчим, ніж при нормоспермії, станова^ відповідно: при астеноспермії 5,9+0,6 та 7,8±0,9 годин, пр

олігоастеноспермії 4,8+0,5 та 6,5+0,8 години, в той час як при нормосперь час переживання гамет в середовищі без дії ПМП становив 10,1 ±1,1 години і 12,2±1,2 з дією на середовище Ерла ПМП, а при олігосперміі 8,4±0,9 і 11,3±1,1 години відповідно. На протязі доби при гіпотермії час переживав клітин достовірно не змінився, через 48 годин зменшився, причок найвиразніше при використанні живільного середовища, не експонованого ПМП. В цьому випадку лише у сперміїв із еякуляту з нормоспермією в

зстовірно не знизився. Якщо ж для виділення і збереження рухливої фракції імет використовували витримане в ПМП середовище Ерла, достовірне іиження часу переживання через 48 годин при 8*С спостерігали тільки при іігоастеносперміі. Через 72 години в умовах гіпотермії в середовищі Ерла, що ї експонували в магнітній “посудині”, у всіх випадках констатували достовірне (иження показників часу переживання клітин при 37'С. Якщо ж застосовували МП, то при нормосперміі і на третю добу цей показник достовірно не низився. Однак не зважаючі на те, що при оліго- та астєноспермїї показник ■іизився достовірно, середня арифметична переживаємості була не менша ніж

4 години. Як відомо, запліднення ооцита сперміями при екстракорпоральному етоді відбувається на протязі двох годин після інсемінаціі сперміями гредовища культивування яйцеклітини.

Отже, зберігання в умовах гіпотермії при 8‘С в атмосфері 5% С02 ібезпечує життєздатність і час переживання при 37*С сперміїв рухливої ракції еякуляту людини на рівні нативних свіжеодержаних клітин на протязі 3-72 годин при нормоспермії і на протязі 24-48 годин при патосперміях. итримування живільного середовища перед використанням в ПМП пролонгує иттєздатність сперміїв та часу переживання їх при 37'С залежно від іраження патоспермії на 24-48 годин, що має суттєве значення при лікуванні гзпліддя в шлюбі методом штучної інсемінаціі сперміями чоловіка, а також етодом екстракорпорального запліднення.

В третій серії експериментів вивчали цілісність акросом у сперміїв /хливої фракції еякуляту в процесі зберігання при гіпотермії. При дослідженні пивної сперми ми виявили, що у чоловіків репродуктивного віку як при зтосперміях, так і при нормосперміі в еякуляті зустрічаються спермії з ушкодженою акросомою. При цьому наші дані (табл.З) суттєво не дрізняються від даних інших дослідників (П.Г.Морозов, 1990). Як видно з атеріалів таблиці 3, у виділеній рухливій фракції гамет також були клітини з сросомальною патологією. Дані інших дослідників про це явище в доступній тературі нами не знайдені. При оліго-, астено- і олїгоастеноспермії вміст іітин з пошкодженою акросомою як в цілому еякуляті, так і в суспензії гамет (гхливої фракції, був достовірно більшим, ніж при нормосперміі.

Результати, одержані при вивчені можливого впливу гіпотермії на Зереження акросом у сперміїв, надані в таблиці 4. Як видно із представлених аних, якщо рухлива фракція гамет була виділена із еякуляту з

Вміст клітин з пошкодженою акросомою в цільному еякуляті і у його рухливій фракції при

нормосперміі і патосперміях

Стан сперматогенезу Цільний еякулят РІ Рухлива фракція сперміїв

середовище Ерла без дії ПМП р1 середовище Ерла з дією ПМП РІ Р2

нормоспермія 16,9±1,9 7,4+0,9 6,4±0,6 >0,05

олігоспермія 25,7±2,1 <0,05 12,5±1,4 <0,05 9,1±1,1 <0,05 >0,05

астеноспермія 29,1 ±3,1 <0,05 15,5±1,5 <0,05 11,9+1,4 <0,05 >0,05

олігоастено- спермія 49,4+3,9 <0,05 20,2±2,4 <0,05 14,3+1,4 <0,05 >0,05

Примітка: р1 -при порівнянні з нормоспермією

р2-при порівнянні із середовищем Ерла без дії ПМП

Таблиця 4

Вплив на зберігання акросом умов виділення із еякуляту рухливої фракції сперміїв

та зберігання її при 8"С

Стан сперматогенезу Вміст клітин з пошкодженою акросомою у фракції рухливих сперміїв, (М±т), %

виділення та зберігання у живільному середовищі Ерла без дії ПМП виділення та зберігання у живільному середовищі Ерла з дією ПМП

24 год. 48 год, 72 год. 24 год. 48 год, 72 год.

нормоспермія 8,1 ±0,9 9,8±1,2 14,1+1,5* 7,7±0,8 8,0±0,6 9,2±1,1

олігоспермія 13,9±1,4 15,0±1,7 23,4+2,3* 11,5+1,2 13,1+1,3 16,3±1,7

астеноспермія 16,111,6 19,1 ±2,1 29,7±3,1* 15,8±1,6 17,2+1,6 19,4±2,0*

олігоастеноспермія 23,7±2,1 29,2+2,0* 34,0±3,2* 23,1+2,4 28,9±3,0* 32,7+2,7*

Примітка: * р<0,05 при порівнянні з показником до дії гіпотермії

олігоастеноспермією, через 48 годин перебування при 8'С акросомальна патологія у її клітин була достовірно частішою, ніж у нативних. Це спостерігали як при використанні ПМП, так і без нього. Акросомальна патологія достовірно зросла у всіх випадках після трьохдобового зберігання суспензії клітин при гіпотермії. Однак якщо використовували живільне середовище, експоноване в ПМП, при нормоспермії та олігоспєрміі достовірної різниці з нативними клітинами не було і через три доби.

Таким чином, акросомальна патологія більш виражена у гамет рухливої фракції еякуляту при порушеннях сперматогенезу. Акросома у сперміїв фракції, одержаної при астено- та олі гоастеноспермії, зберігається гірше при гіпотермії, ніж у клітин із суспензії, виділеної при оліго- та нормоспермії. Застосування живільного середовища, витриманого в ПМП, підвищує стійкість акросом гамет, особливо із еякулятів з нормоспермієго.

Серед ферментів акросоми безпосередній зв’язок з заплідненням мають акрозин та гіалуронидаза. Тому в четвертій серії експериментів ми вивчали активність акрозину у сперміїв рухливої фракції еякуляту з олігоспермією (33 еякуляти) і олігоастеноспермією (29 еякулятів). При цьому було виявлено, що динаміка зміни активності акрозину в процесі гіпотермічного зберігання відповідає в основному динаміці зменшення цілості акросом.

Для діагностики імунологічного безпліддя необхідна наявність в лабораторії сперми з високими кількісними (не менш 40 млн/мл гамет) та якісними (70% рухливих клітин) показниками. Оптимальним є використання одного донорського еякуляту на протязі трьох днів. Тому в останній, п’ятій серії дослідів, ми з’ясували, чи можна використати з цією метою, а саме для зберігання імунобіологічноі активності сперміїв, гіпотермію. При цьому було встановлено, що зберігання суспензії рухливих сперміїв з еякуляту з нормоспермією при 8'С в атмосфері СОг в живільному середовищі Єрла дозволяє використати клітинну суспензію в діагностиці імунологічного безпліддя для постановки тесту контакту сперми з цервікальним слизом і реакції спермоіммобілізації на протязі 48-ми, а реакції аглютинації - 72-х годин. Використання для виділення і зберігання фракції рухливих сперміїв живільногс середовища, витриманого в штучному додатковому магнітному полі, подовжує термін придатності сперміїв для імунологічних методик ще на одну добу.

ВИСНОВКИ

1. Для підвищення ефективності лікування безпліддя все ширше застосовуються допоміжні репродуктивні технології, які потребують виділення із еякуляту фертильних сперміїв. В даній роботі вперше з’ясована залежність ефективності виділення з еякуляту та гіпотермічного зберігання рухливої фракції сперміїв людини від біологічних властивостей еякуляту і дії постійного магнітного поля ( ПМП ) на живільне середовище, в якому виділяли і зберігали фракцію рухливих гамет.

2. Встановлено, що рухливі гамети, виділені з еякуляту при патосперміях, хоча й мають достатню кінетичну активність, менш стійкі при гіпотермії, ніж рухливі спермії з еякулятів із нормоспермією, що, можливо, пов’язано з більшим вмістом при патосперміях у рухливій фракції еякуляту сперміїв з морфо-функціональними порушеннями.

3. Динаміка зміни кінетичної активності сперміїв в процесі гіпотермічного збереження схожа з динамікою зміни таких показників як життєздатність, час переживання, вміст клітин з акросомальною патологією, активність акрозину.

4. Гіпотермія забезпечує при нормо-, оліго- та астеноспєрмії збереження в суспензії початкової концентрації рухливих сперміїв на протязі 48 годин. При використанні живільного середовища, на яке діяли ПМП, концентрація рухливих гамет при нормо- і олігоспермії залишалась на початковому рівні більше трьох діб , при астеноспермії достовірно понизилась лише через 72 години.

5. Акросома рухливих сперміїв, виділених з еякуляту при астено- та олігоастеноспермії, менш стійка при гіпотермії, ніж акросома гамет при нормо- і олігоспермії. Застосування в технології виділення і збереження при 8’С рухливої фракції клітин ПМП підвищує стійкість їх акросом при гіпотермії, особливо гамет еякулятів з нормоспермією.

6. Гіпотермія при застосуванні ПМП забезпечує збереження на протязі 72 годин імунобіологічної активності гамет із еякулятів з нормоспермією, що підтверджується в реакціях визначення антиспермальних антитіл, які використовуються в діагностиці імунологічного безпліддя.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗДОБУВАНА ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Ахмад М.М. Влияние условий выделения подвижной фракции спермиеі из эякулята человека и хранения ее при 8’С на морфо-функциональньн свойства гамет// Проблемы криобиологии,- 1996,- N 4.- С.54-55.

2. Юрченко Г.Г., Ахмад М.М., Крамар М.И. Сохранность акросом ' спермиев подвижной фракции эякулята человека, хранившихся в условия) гипотермии //' Проблемы криобиологии.- 1997,- N 3.- С.57-59.

3. Ахмад М.М., Ковалев М.Г., Пиняев В.И., Чадаев В.Е. Влиянж гипотермии и обработки среды хранения дополнительным постоянныи магнитным полем на кинетические характеристики спермиев человека

// Проблемы криобиологии.- 1997.- N З,- С.48-51.

4. Ахмад М.М., Ковалева З.И. Применение постоянного магнитного пол?

для стимуляции подвижности нативных и хранившихся в условиях гипотермиь спермиев человека // Бесплодие: Вспомогательные репродуктивные

технологии. Сб. научн. трудов симпозиума с международным участием.- Киев.-1995,- С..58-59.

5. Ахмад М.М., Ковалев М..Г., Юрченко Г.Г., Крамар М.И Жизнеспособность и переживаемость активноподвижных спермиев в условия) гилотермического хранения // Бесплодие: Вспомогательные репродуктивньк технологии. Сб. научн. трудов симпозиума с международным участием.- Киев.-1997,- С..143-145.

6. Ахмад М.М., Ковалев М..Г., Юрченко Г.Г. Влияние постоянногс магнитного поля на иммунобиологические свойства спермиев, хранившихся £ условиях гипотермии // Тези доповідей 1 -го з'їзду Українського товаристве кріобіології і кріомедицини.- Харків.- 1995.- С.7-9.

7. Ahmad М.М. Prolongation of Integrity of Spermatozoa Penetrating Ability by Means of Physical Factors for Immunological Infertility Diagnostics // Abstracts International Symposium on Immunology of Reproduction.- Kyiv.- 1996.- P. 107.

Ахмад М.М. Використання фізичних факторів для підвищення біологічної активності рухливої фракції сперміїв еякуляту людини.-Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія і кріомедицина,- Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 1997.

В роботі вивчалась можливість використання гіпотермії і постійного магітного поля ( ПМП ) з метою подовження терміну збереження рухливої фракції сперміїв еякуляту людини. З’ясована залежність результативності гіпотермічного збереження рухливих сперміїв від початкових біологічних характеристик еякуляту. Одержані дані про те, що у фракції рухливих сперміїв при патосперміях вміст клітин з морфофункціонапьними порушеннями вище, ніж при нормоспермії, в зв’язку з чим гіпотермічне збереження рухливих гамет менш ефективне. Показана можливість підвищення ефективності виділення та збереження при 8'С рухливої фракції гамет шляхом використання в методі “спливання” живільного середовища, витриманого в ПМП.

Ключові слова: гіпотермія, середовище виділення, патоспєрмії, нормоспермія, рухлива фракція сперміїв, постійне магнітне поле, безпліддя.

Ахмад М.М. Использование физических факторов для повышения биологической активности подвижной фракции спермиев эякулята человека.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.19 - криобиология и криомедицина. -Институг проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 1997.

В работе изучалась возможность использования гипотермии и постоянного магнитного поля (ПМП) с целью продления срока хранения

подвижной фракции спермиев эякулята человека. Выяснена зависимость результативности гипотермического хранения подвижных спермиев от исходных биологических характеристик эякулята. Получены данные о том, что во фракции подвижных спермиев при патоспермиях содержание клеток с морфофункциональными нарушениями выше, чем при нормоспермии, в связи с чем гипотермическое хранение подвижных гамет при патоспермиях менее эффективно. Показана возможность повышения эффективности выделения и хранения при 8'С подвижной фракции гамет путем использования в методе “всплывания” питательной среды, выдержанной в ПМП.

Ключевые слова: гипотермия, среда выделения, патоспермии, нормоспермия, подвижная фракция спермиев, постоянное магнитное поле, бесплодие.

Ahmad M.M. The use of physical factors for the improvement of biological activity in the motile sperm fraction from a human ejaculate.-Manuscript.

Thesis for a candidate's degree by speciality 03.00.19 - cryobiology and cryomedicine.- Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of National Academy of Science of Ukraine, Kharkov, 1997.

The dissertation is devoted to study the possibility of the use of hypothermia and permanent magnetic field ( PMF) with the purpose of storage term prolongation of the motile sperm fraction from a human ejaculate. Dependence of hypothermic motile sperm storage effect upon initial biologic ejaculate characteristics were elucidated. According to the data obtained the number of cells with morphofunctional disorders was more in cases of pathaspermia than in those of normospermia. So, as the author showed in his work, hypotermial storage of motile garnets in pathospermia less effective. The possibility of more effective motile gamete fractions separation and storage at

8’C by the use of nutrient medium under PMF effect during swim-up were show.

Key Words: hypothermia, medium of selection, pathospermia,

normospermia, motile sperm fraction, permanent magnetic field, infertility.