Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Инженерия каталитических свойств и термостабильности оксидазы D-аминокислот

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Инженерия каталитических свойств и термостабильности оксидазы D-аминокислот"

005049027

На правах рукописи

КОМАРОВА Наталья Владимировна

ИНЖЕНЕРИЯ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТИ ОКСИДАЗЫ Р-АМИНОКИСЛОТ

03.01.04 - биохимия

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2012

005049027

Работа выполнена в лаборатории молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Тишков Владимир Иванович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор зав. лабораторией физиологически активных биополимеров Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт элементорганических соединений им. В.Н. Несмеянова РАН Ямсков Игорь Александрович

доктор химических наук, профессор главный научный сотрудник

НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова Готтих Марина Борисовна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков * М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится " 25~ " декабря 2012 года в 15 часов на заседании Совета Д 501.001.59 по защите докторских и кандидатских диссертаций по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.11, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 23 ноября 2012 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 501.001.59,

кандидат химических наук

Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Оксидаза D-аминокислот относится к классу FAD-содержащих оксидоредуктаз и катализирует окислительное дезаминирование D-аминокислот в соответствующие а-кетокислоты (КФ 1.4.3.3, DAAO). Фермент играет исключительно важную роль в метаболизме микроорганизмов. В организме животных и человека DAAO отвечает за поддержание определенного уровня D-аминокислот в клетке. Например, в тканях мозга фермент контролирует содержание D-серина, который участвует в регуляции деятельности нервной системы. В настоящее время установлено, что повышенная активность DAAO в мозге служит одной из причин возникновения шизофрении. У пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, наблюдается снижение активности фермента, в результате чего в тканях мозга значительно возрастает содержание D-аланина. Пониженная активность DAAO характерна также для некоторых почечных заболеваний. Кроме того, оксидаза D-аминокислот принимает участие в регуляции процессов старения.

На практике этот фермент используется главным образом в биокаталитическом процессе окисления цефалоспорина С в 7-аминоцефало-спорановую кислоту (7-АЦК) - исходное соединение для производства полусинтетических цефалоспоринов различных поколений (доля бета-лактамных антибиотиков составляет 10% от стоимости всех производимых в мире фармацевтических препаратов). Помимо этого, DAAO активно применяется в аналитической биотехнологии, хиральном синтезе, получении неприродных L-аминокислот и а-кетокислот и имеет большое потенциальное значение для создания систем диагностики и мониторинга ряда психосоматических (шизофрения, амиотрофический боковой склероз, болезни Альцгеймера и Паркинсона и др.) и онкологических заболеваний.

Несмотря на высокую теоретическую и практическую значимость, оксидаза D-аминокислот до недавнего времени была малоизученным ферментом. Фактически в настоящее время накоплен достаточно большой объем экспериментальных данных для DAAO из почки свиньи (pkDAAO) и из дрожжей Rhodotorula gracilis (RgDAAO). Трехмерные структуры этих ферментов были определены в 1996 и 2000 годах соответственно. Для pkDAAO и RgDAAO в литературе имеются данные по детальному изучению механизма действия этих ферментов методом направленного мутагенеза. В 2006 году была опубликована структура еще одной DAAO - фермента из человека (hDAAO). Интерес ученых к этому ферменту активно растет в последние годы в связи с открытием новых аспектов, связанных с физиологической ролью hDAAO в организме человека.

Среди всех известных оксидаз D-аминокислот наиболее широкое применение на практике находит фермент из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO), поскольку по сравнению с известными ферментами из других источников TvDAAO обладает самой высокой температурной стабильностью и активностью с цефалоспорином С. Создание высокоэффективных биокатализаторов на основе TvDAAO невозможно без проведения фундаментальных исследований по изучению взаимосвязи структуры и

функции этого фермента и направленной инженерии его свойств, в частности, температурной стабильности и субстратной специфичности. Другой очень важной задачей по инженерии "Г\ЮААО является повышение активности фермента в реакции окисления цефалоспорина С.

Одним из самых эффективных методов как для фундаментального исследования структуры и функции ферментов, так и для направленного изменения их каталитических свойств и стабильности является метод рационального дизайна. Этот метод сочетает анализ трехмерной структуры фермента с последующим введением выбранных на основе анализа аминокислотных замен с помощью направленного мутагенеза. В настоящее время в литературе имеется небольшое количество публикаций по белковой инженерии Т\ЮААО. Это связано с отсутствием у исследователей данных по трехмерной структуре фермента, хотя эксперименты по кристаллизации Т\ЮААО проводились во многих лабораториях более 20 лет. В 2007 году в нашей лаборатории была решена первая структура мутантной Т\/ОААО, которая остается единственной до настоящего времени. Наличие трехмерной структуры Т\ЮААО создает основу для проведения экспериментов по белковой инженерии этого фермента с помощью рационального дизайна.

Цели исследования. Основной целью работы было изучение взаимосвязи структура-функция в оксидазе О-аминокислот из дрожжей Т.уапаЫЧз методами белковой инженерии. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- исследование роли водородных связей в области межсубъединичного контакта Т\ЮААО;

- оптимизация структуры ЯАО-связывающего домена;

- повышение температурной стабильности ТуОААО;

- улучшение каталитических параметров Т\ЮААО в реакции окисления цефалоспорина С.

Научная новизна. В ходе выполнения данной работы проведен анализ структуры оксидазы Р-аминокислот из дрожжей ТмапаЫНБ, и выбраны перспективные положения для введения аминокислотных замен. Методом направленного мутагенеза получены 27 мутантных ферментов с аминокислотными заменами в области субстрат- и кофактор-связывающих доменов, а также в области межсубъединичного контакта. Кроме этого, к Ъ/ОААО для повышения термостабильности впервые применен подход гидрофобизации а-спиралей. Введение точечных аминокислотных замен позволило увеличить каталитическую эффективность с рядом О-аминокислот в 2-16 раз. Показано, что введение различных аминокислотных замен в одно и то же положение приводит к получению мутантных форм фермента с различным профилем субстратной специфичности. Методом рационального дизайна получены мутантные ТуОААО с улучшенной эффективностью в реакции окисления цефалоспорина С. Ряд замен привел к повышению температурной стабильности фермента.

Практическая значимость работы. Получение мутантных ТуОААО с измененным узким спектром субстратной специфичности открывает перспективы для

создания селективных биосенсоров на D-аминокислоты для целей медицинской диагностики и аналитической биотехнологии. Мутантные ферменты с повышенной термостабильностью и улучшенной эффективностью в реакции окисления цефалоспорина С могут быть успешно использованы в биферментом биокаталитическом процессе получения 7-АЦК из цефалоспорина С.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных конгрессах, конференциях и школах: International Conference "Biocatalysis: Fundamentals & Applications" (Arkhangelsk, 2009), Пятый, Шестой и Седьмой Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2009, 2011, 2012), XI Международная конференция молодых ученых «Леса Евразии - Брянский лес» (Брянск, Россия, 2011), 14th International Biotechnology Symposium. (Rimini, Italy, 2010), Международный молодежный форум «Ломоносов-2011» (Москва), 2-я международная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина» (Пансионат «Заря», Московская область, Россия, 2011), Международная конференция «Ломоносов и Гумбольдт: научное сотрудничество России и Германии - от истоков до наших дней» (2011), XIX Молодежная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2012), The 20th INPEC Conference "Engineering Protein - Systems, Functions and Applications", (Taipei, Taiwan, 2012), 9th International Conference on Protein Stabilization - ProStab2012 "From Molecular Level to market applications" (Lisbon, Portugal, 2012), V International Meeting "Early events in Human Pathologies" (Llstvyanka, Baikal, Russia, 2012).

По результатам выполненных исследований автор в 2012 г. был удостоен почетного звания «Лауреат стипендии имени ВЛ.Кретовича».

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 статей в ведущих международном и российских журналах (все журналы входят в Перечень рецензируемых научных журналов ВАК РФ), 14 тезисов докладов конференций и подана одна заявка на патент РФ на изобретение.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 166 страницах и содержит 41 рисунок, 31 таблицу и 164 ссылки.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Инженерия в области межсубъединичного контакта

Оксидазы D-аминокислот из разных источников в нативном состоянии существуют в различном олигомерном состоянии. Как правило, DAAO из микроорганизмов существуют в димерной форме. Ферменты, выделенные из человека и почек свиньи, напротив, являются мономерами. В литературе известен пример изменения олигомерного состояния RgDAAO с помощью направленного мутагенеза. В случае TvDAAO такого рода эксперименты не проводились.

Для исследования влияния межсубъединичных взаимодействий на стабильность и каталитические свойства, а также изучения возможности получения мономерных форм этого фермента нами был выполнен анализ структуры ТуОААО для идентификации аминокислотных остатков, принимающих участие в образовании димера. Затем были проведены эксперименты по замене некоторых из этих остатков на другие аминокислоты. Анализ структуры ТуЭААО свидетельствует, что в области межсубъединичного контакта имеется 12 водородных связей, которые участвуют в образовании димера. Данные об остатках, образующих эти связи, приведены в таблице 1. Поскольку ~Г\ЮААО состоит из двух идентичных субъединиц, то количество уникальных водородных связей составляет половину от общего числа. Наибольший вклад в стабилизацию димерной структуры вносят два остатка аргинина - Агд169 и Агд220. Они участвуют в образовании 8 водородных связей (67% от общего числа). Для выяснения влияния этих остатков на олигомеризацию фермента было решено заменить остаток Агд220 на остаток глутаминовой кислоты, а также оба остатка аргинина - Агд169 и Агд220, на остатки аланина.

Таблица 1.

Водородные связи в межсубъединичном контакте димера ТУРААО.

Мономер А Мономер В Расстояние, А

атом остаток атом остаток

О Е32 МЕ Я220 2,86

О Е32 1ЧН2 14220 3,06

О Е80 СЮ Б157 2,86

N К168 О 0249 2,92

|\1Н2 тбэ О в 250 3,11

МН1 Я169 О С250 3,10

МЕ Я220 О Е32 2,86

Ь1Н2 Я220 О Е32 3,06

СЮ Э157 О Е80 2,86

О 0249 N К168 2,92

О в250 1ЧН2 Р?169 3,11

О 6250 МН1 РЛ69 3,10

Пробное культивирование штаммов Е.соН - продуцентов мутантных ферментов, показало, что мутанты ТуРДАО В220Е и ТЧЮААО К169А/Я220А синтезируются полностью в нерастворимой форме, сохраняя при этом ферментативную активность. Нами были проведены эксперименты по оптимизации условий культивирования и по солюбилизации с помощью детергентов, однако перевести мутантные ферменты в растворимую форму не удалось.

Поскольку осадок суспензии клеток проявлял активность, было решено измерить кинетические параметры фермента, связанного с мембранами клеток. Введение аминокислотных замен Я169А/Р220А и Р!220Е в молекулу ТуОААО приводит к резкому изменению профиля субстратной специфичности (табл. 2). В

частности, фермент потерял активность с D-Leu, D-Thr, D-Tyr и D-Ala. Кроме того, мутант TvDAAO R220E также не проявляет активности с D-Ser и D-Phe. Наибольшие изменения кинетических параметров оказались для мутанта TvDAAO R220E, у которого значительно возросли константы Михаэлиса с большинством изученных D-аминокислот (табл. 2). С некоторыми из субстратов наблюдалась практически линейная зависимость скорости реакции от концентрации D-аминокислоты вплоть до максимальной растворимости последней. Поэтому было возможно определить только отношение Vm/KM, но не сами параметры в отдельности.

Таблица 2.

Кинетические параметры TvDAAO R169A/R220A и R220E._

Аминокислота Форма фермента

TvDAAO R169A/R220A TvDAAO R220E0 wt-TvDAAO

KM, MM VJ Vj**. % ' VJKu/ (l/m/KM)Met, % Км. мМ VJ у Met % ' VJKM/ (Kn !Kuf\ % Ku, мМ VJ ^ Met % VJK«! %

D-Met 3,0±0,9 100 100 0,7±0,5 100 100 0,46±0,03 100 100

D-Ser 105±33 62 2 нет реакции 36,6±3,3 25 0,3

D-Val 4,3±0,9 69 48 >100 Н.Д. Н.Д. 14,4±1,2 106 3,4

D-Phe 38 ±5 100 8 нет реакции 0,37+0,04 34 42

D-Asn 5,6+0,7 85 42 30±4 74 2 22,6±1,5 78 1,6

D-Lys 27 ±7 25 3 >100 н.д. HJJ. 29,3±3,4 4 0,1

D-Trp >50 н.д. Н.Д. >50 н.Д. Н.Д. 0,49+0,04 53 49

D-Leu нет реакции нет реакции 0,78±0,02 36 21

D-Thr нет реакции нет реакции 11,1 ±0,8 2 0,1

D-Tyr нет реакции нет реакции 0,45±0,06 28 29

D-Ala нет реакции нет реакции 16,7±0,7 135 3,7

* - Полужирным шрифтом на сером фоне выделены кинетические параметры мутантных ТуОААО, лучшие по сравнению с таковыми для \лг1-Т\ЛЭААО.

В случае двойного мутанта ТуОААО R169A/R220A с некоторыми О-амино-кислотами наблюдалось улучшение значений константы Михаэлиса, в частности, с ОЛ/а1, О-Аэп и О-Цуэ (табл. 2).

Температурная стабильность ТуРААО R220E была измерена в интервале температур 32-40°С, ТуОААО R169A/R220A - в интервале 20-28 °С. Это было связано с тем, что данные мутантные ТуИААО обладали гораздо меньшей стабильностью, чем фермент дикого типа. Значения Т1/2 (температура, при которой за 30 минут теряется 50% активности фермента) для ТуРААО R220E, ТуОААО И169АЯ200А и ^-ТуЭААО составили 28, 20 и 54°С, соответственно. Ранее было показано, что термоинактивация фермента дикого типа протекает по двухстадийному диссоциативному механизму: на первой стадии происходит диссоциация димера на мономеры, а на второй - необратимая инактивация мономера, а зависимость остаточной активности от времени описывается суммой двух экспонент. Наблюдаемые зависимости для мутантных ТуРААО с заменами R169A/R220A и

TvDAAO R220E также описываются суммой двух экспонент, однако, выяснить, протекает ли их инактивация по диссоциативному механизму, не представлялось возможным, т.к. для этого было необходимо изучение кинетики термоинактивации при различных концентрациях фермента, что, как уже отмечалось выше, невозможно из-за связывания фермента с клеточной мембраной.

Данные по направленному мутагенезу в TvDAAO остатков Arg169 и Arg220 свидетельствуют о том, что связи, образованные этими остатками, играют очень важную роль в общей стабильности фермента. Их разрушение приводит к сильной дестабилизации TvDAAO и не позволяет получить мономерную форму фермента в растворимой форме.

Инженерия кофермент-связывающего домена

Каждая субъединица DAAO содержит одну молекулу FAD, который необходим для осуществления каталитической функции. В DAAO FAD связан с ферментом нековалентно. Константа диссоциации FAD-DAAO меняется в зависимости от источника фермента. Считается, что температурная стабильность фермента, помимо многих других факторов, зависит от прочности связывания FAD. Поэтому введение аминокислотных замен, улучшающих связывание FAD, может привести к повышению термостабильности TvDAAO. Нами был выполнен анализ структуры TvDAAO в области FAD-связывающего домена, который показал, что в связывании кофактора принимают участие 14 аминокислотных остатков: Ala9, Ala12, Ser31, Glu32, Phe33, Thr43, Ser44, Asn50, Va!171, Ala329, Gly330, Gly332, ТугЗЗЗ, Gln334. Для введения мутаций в качестве наиболее перспективных были выбраны аминокислотные остатки Glu32 и Phe33, которые образуют три водородные связи с молекулой FAD: азот амидной группы пептидной связи остатка Glu32 образует связь с азотом N3 аденина в молекуле FAD, кислород карбонила пептидной связи остатка РИеЗЗ - с З'-ОН-группой рибозы, и азот амидной группы остатка Phe33 - с 2'-ОН-группой рибозы. Эти связи изображены на рис. 1.

Рис. 1. Положение остатков в1и32 и РГгеЗЗ в структуре ТуРААО и водородные связи, образованные различными аминокислотными остатками в положении 32 и 33

По результатам компьютерного моделирования мутаций этих остатков было решено получить 8 мутантых форм со следующими аминокислотными заменами:

- 6 точечных мутантов М1, М2, МЗ, М4, М5, Мб, и

- 2 двойных мутанта М7 и М8.

Во всех этих мутантах сохраняются водородные связи, изначально существующие в ферменте дикого типа. Кроме того, в случае введения аминокислотных замен М4 и М5 возможно образование дополнительных водородных связей. В случае двойной замены М7 возможно образование нескольких новых водородных связей между вводимым остатком и молекулой РАО. Таким образом, в случае последнего мутанта можно было ожидать повышения стабильности фермента.

Все мутантные ТуОААО за исключением ТуОААО Мб синтезировались в активной и растворимой формах. В случае мутанта ТуОААО Мб активность отсутствовала в бесклеточных экстрактах и в культуральной жидкости, но присутствовала в клеточном дебрисе, получаемого после разрушения клеток. Это свидетельствует о том, что этот мутантный фермент синтезируется в активной форме в виде телец включения. Перевести в раствор этот фермент не удалось. Введение замены М5 привело к существенной потере стабильности фермента - уже на стадии разрушения клеток ТуОААО М5 полностью теряла активность. Остальные мутантные ТуОААО с заменами М1, М2, МЗ, М4, М7 и М8 были получены в высокоочищенном состоянии и для них были изучены температурная стабильность и субстратная специфичность.

Рис. 2. Относительная каталитическая эффективность мутантных форм ТуОААО с заменами М1, М2, МЗ, М4, М7 и М8. Каталитическая эффективность фермента дикого типа принята за 100%.

О'

Изучение субстратной специфичности показало, что все мутанты не проявляли активность с D-Lys, и только два из них (с двойными заменами М7 и М8) сохранили способность окислять D-Thr (рис. 2). Для всех мутантов происходит существенное улучшение каталитической эффективности с D-Leu, а для обоих двойных мутантов и точечного мутанта TvDAAO МЗ - с D-Phe (рис. 2). У нерастворимого мутанта TvDAAO Мб наблюдается улучшение величины Ки практически со всеми изученными субстратами. Наиболее важным результатом этой части работы является увеличение по сравнению с ферментом дикого типа каталитической эффективности двойного мутанта TvDAAO М7 практически со всеми исследованными D-аминокислотами.

Как и в случае фермента дикого типа, для всех шести изученных мутантов наблюдается диссоциативный механизм температурной инактивации, так как:

- кривая термоинактивации описывается суммой двух экспонент (рис. 3);

- зависимости остаточной активности от времени инактивации при различных температурах представляются собой кривые с изломов в полулогарифмических координатах (рис. 4 А);

- при различных концентрациях фермента и одной температуре кривые инактивации в полулогарифмических координатах имеют одинаковый наклон начального прямолинейного участка до точки излома, а наклон второго прямолинейного участка увеличивается с уменьшением начальной концентрации фермента (рис. 4 Б).

0,1 -

0,0 4-,-1-.-1-.-,-.-1-.-1-.-г-

0 20 40 60 80 100 120

Время, мин

Рис. 3. Зависимость остаточной активности ТуОААО М7 от времени при концентрации фермента 6,9 мкг/мл. 0,1 М КФБ, рН 8,0, 56 °С. Аппроксимация экспериментальных данных моноэкспоненциальной (- -) и биэкспоненциальной (—) функциями.

Рис. 4. Кривые инактивации ТуОААО М7 в полулогарифмических координатах: А - при одной концентрации фермента (10 мкг/мл) и различных температурах; Б - при одной температуре (56 °С) и различных концентрациях фермента.

Время, мин

А

бремя, I.

Б

О 6.9 мкг/мп v 10,0 мкг/мп А 20,0 мкг/мл

О 30.0 мкг/мл

Время, мин

Рис. 5. Зависимость остаточной активности от времени инактивации для ТуОААО с заменами М1, М2, М7 и М8. [Е0]=10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0, 54°С.

В случае большинства введенных замен произошло ухудшение стабильности ферментов, однако в случае двойной замены М7 удалось добиться существенного повышения стабильности (рис. 5). Отметим, что такое повышение термостабильности ТуЭААО М7 было предсказано по результатам компьютерного моделирования структуры этого мутанта (см. выше). Кроме того, полученные результаты свидетельствует, что введение аминокислотных замен даже вдали от активного центра Т\ЮААО может привести к улучшению каталитических свойств фермента.

Повышение стабильности TvDAAO гидрофобизацией а спиралей

Для повышения стабильности белковой глобулы кроме рационального дизайна широко используются и универсальные подходы. Одним из таких подходов является гидрофобизация a-спиралей, например, за счет замены остатков Ser на остатки Ala. Анализ белковой глобулы TvDAAO показал, что в a-спиралях находится 12 остатков Ser, которые можно разделить на две группы: находящиеся внутри белковой глобулы (положения 67, 105, 44, 334 и 335) и на ее поверхности (77, 78, 270, 277, 128, 157, 161). Остаток Ser44 является высококонсервативным, поэтому заменять его на другие аминокислоты нецелесообразно. Из остальных 11 остатков Ser для замены были выбраны восемь: четыре внутри белковой глобулы - Ser67, Ser105, Ser335 и Ser336, и четыре - на ее поверхности, Ser77, Ser78, Ser270 и Ser277.

Все мутантные ферменты экспрессировались в растворимой и активной форме. TvDAAO Ser78Ala инактивировался в ходе разрушения клеток. Остальные препараты после очистки имели чистоту не менее 99%. TvDAAO Ser270Ala после заморозки и разморозки полностью теряла активность. Для остальных шести мутантных TvDAAO с заменами остатков Ser67, Ser77, Ser105, Ser277, Ser335 и S336 на остаток Ala были изучены кинетические свойства и термостабильность.

Рис. 6. Относительная каталитическая эффективность мутантных форм TvDAAO с заменами Ser/Ala в положениях 67, 77, 105, 277, 335, 336. Каталитическая эффективность фермента дикого типа принята за 100%.

Результаты измерения кинетических параметров мутантных ферментов показали, что произошло изменение спектра субстратной специфичности мутантных форм TvDAAO по сравнению с таковым у фермента дикого типа. Из всех мутантных форм активность с D-Thr сохранил только мутеин TvDAAO Ser335Ala, с D-Lys - только TvDAAO Ser77Ala (рис. 6). Практически для всех мутантных TvDAAO наблюдается повышение активности с D-Leu. Мутанты TvDAAO с заменами Ser277Ala, Ser336Ala не обладают активностью с D-Ser, но способны при этом окислять D-Ala (рис. 6).

Ферменты с такой субстратной специфичностью могут быть использованы для определения уровня 0-А1а в нервных тканях в присутствии высоких концентраций О-Бег, например, для диагностики и мониторинга болезни Альцгеймера.

Анализ кинетики потери активности от времени свидетельствует, что механизм термоинактивации мутантных ТуОААО с заменами Зег67А1а, Зег77А1а, Зег105А1а, Зег335А1а, Эег336А1а и Зег277А1а не отличается от такового для фермента дикого типа: инактивация протекает в две стадии через диссоциацию димера на мономеры с последующей денатурацией мономеров.

Зависимости остаточной активности полученных мутантов от времени представлены на двух рисунках. Четыре мутанта были сравнимы по стабильности в ферментом дикого типа. Для них данные приведены при температуре 56 °С (рис. 7). Для двух менее стабильных мутантов данные по инактивации приведены при более низкой температуре - 52 "С (рис. 8). Как видно из рис. 7, увеличение стабильности

Время, мин

Рис. 7. Зависимость остаточной активности от времени для ^ОААО Э77А, Э67А ЭЮБА и ТуРААО дикого типа при 56 "С. 0,1 М КФБ, рН 8,0, концентрация ферментов -15 мкг/мл.

Время, мин

Рис. 8. Зависимость остаточной активности от времени для ТуйААО Э277А и ТуйААО дикого типа при 52 °С. 0,1 М КФБ, рН 8,0, концентрация ферментов -10 мкг/мл.

Таким образом, методом гидрофобизации а-спиралей повысить стабильность ТуЭААО удалось только при введении замены 5ег105А1а. Невысокая эффективность мутагенеза при применении данного подхода объясняется его статистическим характером - добиться повышения стабильности с помощью этого метода удается лишь в случае введения большого числа замен. В нашей работе эффект дала одна из восьми введенных аминокислотных замен, что является типичным результатом при применении метода гидрофобизации а-спиралей для повышения стабильности белковой глобулы, однако даже одна замена позволила повысить термостабильность фермента в два раза.

Повышение активности ТуОААО с цефалоспорином С

Инженерия субстратной специфичности ТуЭДАО наряду с повышением стабильности является одной из наиболее практически важных задач. Наиболее актуальным с этой точки зрения является повышение активности фермента в реакции окисления цефалоспорина С.

Оксидазы й-аминокислот из различных источников имеют ряд консервативных участков, однако в области субстрат-связывающего домена высокой гомологии в первичной структуре ЭААО не наблюдается. Это может быть связано с тем, что субстратная специфичность фермента из различных источников варьируется в широком диапазоне. Особенностью Т\ЮААО является большая протяженность аминокислотной последовательности участка, отвечающего за связывание субстрата, благодаря чему формируется объемный субстрат-свяэывающий участок активного центра и ТуОААО проявляет высокую активность с О-аминокислотам с большой боковой группой, в том числе и с цефалоспорином С.

Рис. 9. Наложение структур TvDAAO до и после докинга молекулы цефалоспорина С. Серым цветом выделено положение остатков Phe54 и Phe258 (два возможных положения по данным РСА) до докинга, малиновым - после; зеленым цветом показана молекула FAD, голубым - молекула цефалоспорина С.

Phe258

Выбор положений для введения аминокислотных замен был выполнен на основе компьютерного анализа трехмерной структуры TvDAAO. Результаты этого анализа показали, что в области субстрат-связывающего домена находятся два остатка фенилаланина - Phe54 и Phe258 (рис. 9). Эти остатки расположены на входе в активный центр и не участвуют непосредственно в катализе, однако их замена может повлиять на связывание субстратов. Особенностью остатка Phe258 является его высокая подвижность: данные рентгеноструктурного анализа показывают для него две возможных конформации (рис. 9).

Для оценки роли остатков Phe54 и Phe258 в связывании цефалоспорина С было выполнено встраивание молекулы субстрата в активный центр фермента (докинг) с помощью пакета молекулярной графики Insight II (Accelrys Inc., San Diego, CA, USA). На рис. 9 приведено наложение структур TvDAAO до и после докинга. Из рис. 9 хорошо видно, что при встраивании молекулы цефалоспорина С в активный центр фермента происходит значительное отклонение боковых групп остатков Phe54 и Phe258 от своего первоначального положения, открывая путь молекуле цефалоспорина С к активному центру TvDAAO. Для увеличения размера входа в субстрат-связывающий участок активного центра остатки Phe54 и Phe258 заменили на остатки Ala и Ser. Кроме того в эти положения был введен наиболее близкий структурный аналог остатка Phe - остаток Туг. Таким образом было получено шесть мутантных TvDAAO с точечными заменами Phe54Ala, Phe54Ser, Phe54Tyr, Phe258Ala, Phe258Ser и Phe258Tyr. Результаты экспериментов показали, что большой положительный эффект наблюдался в случае замен остатка Phe54 (см. ниже). Поскольку компьютерное моделирование структур мутантных ферментов проводили на основе трехмерной структуры мутантной TvDAAO Cys108Phe, которая сама по себе обладает улучшенной активностью с цефалоспорином С, поэтому также были получены мутантные формы с двойными заменами Phe54Tyr/Cys108Phe, Phe54Ala/Cys108Phe и Phe54Ser/Cys108Phe.

При культивировании полученных шести точечных мутантов в случае TvDAAO Phe54Ala наблюдался самый низкий выход по активности, что, по-видимому, было связана с его низкой стабильностью, так как после разрушения клеток этот мутант полностью инактивировался. Остальные мутантные TvDAAO были получены в высокоочищенном виде и были изучены их свойства.

Введение всех замен привело к резкому сужению спектра субстратной специфичности фермента (рис. 10). Все полученные мутанты были неактивны с D-Ser и D-Thr. Активность с D-Lys сохранилась только у TvDAAO Phe54Ser. TvDAAO с заменами Phe258Ala, Phe258Ser, Phe258Tyr и Phe54Ser, потеряли активность с D-аланином. Кроме того, мутант TvDAAO Phe258Tyr был также неактивен с D-Val и D-Tyr. Отсутствие активности с D-Val наблюдается также для TvDAAO Phe54Ser, а с D-Tyr — для TvDAAO Phe54Tyr. Каталитическая эффективность мутантов с рядом других D-аминокислот упала более, чем в 10 раз. При этом в случае мутеинов TvDAAO Phe258Ala и TvDAAO Phe258Ser существенно возросла активность с D-Tyr D-Leu и особенно с D-Phe. Мутантная TvDAAO Phe54Ser в дополнение к D-Ser и D-Thr

была неактивна и с D-Ala и D-Val (отметим, что D-Ala и D-Val наряду с D-Met являются наиболее "хорошими" субстратами TVDAAO дикого типа). Кроме того, сужение спектра субстратной специфичности TvDAAO Phe54Ser сопровождалось значительным улучшением каталитических параметров с D-аминокислотами, имеющими объемный боковой радикал. Наиболее сильный эффект наблюдался для D-Lys и D-Leu - каталитическая эффективность возросла в 7,3 и 7 раз соответственно. В случае двойных мутантов также происходило сужение спектра субстратной специфичности, при этом введение замен Phe54Ala и Phe54Ser в комбинации с Cys108Phe также приводило к улучшению каталитической эффективности с D-аминокислотами с большим гидрофобным радикалом, а замена Phe54Tyr по-прежнему вызывала существенное ухудшене кинетических констант со всеми изученными субстратами (рис. 10).

1800

1600

о 1400

^•1200

1000

800

F258A TvDAAO F258S □TvDAAO F258Y

---ETyDAAO F54S

В TvDAAO F54Y ÜTvDAAO F54A/C108F

------GEbFvDAAO F54S/C108F

□ TvDAAO F54Y/C108F ■ wt-TvDA АО

wt-TvDAAO TvDAAO f54y/C108F TvDAAO F54S/C108F TvDAAO F54A/C108F TvDAAO F54Y TvDAAO F54S TvDAAO F258Y TvDAAO F258S TvDAAO F258A

Рис. 10. Относительная каталитическая эффективность мутантных форм ТуОААО с заменами Р11е258А1а, РГ|е2583ег, РЬе258Туг, РЬе54Эег, РИе54Туг, РЬе54А1а/Суэ 108РИе, РИе545ег/Су8108РЬе, РЬе54Туг/Су5108Р11е. Каталитическая эффективность фермента дикого типа принята за 100%.

Изучение температурной стабильности полученных мутантов показало, что, как и в случае фермента дикого типа, их инактивация также протекает по диссоциативному механизму. Исключение составила только ТуОААО РИе258А1а, для которой наблюдался первый порядок кинетики инактивации, однако величина константы скорости инактивации первого порядка зависела от концентрации фермента. В случае трех мутантов (один с точечной заменой РИе54Туг и два с двойными заменами РЬе54А1а/Суэ108РЬе и РИе545ег/Су8108Р1пе) был достигнуто повышение температурной стабильности (рис. 11).

TvDAAO Phe54Ala/Cys108Phe TvDAAO Phe54SerfCys108Phe TvDAAO Phe54Tyr TvDAAO Phe54Tyr/Cys108Phe wt-TvDAAO TvDAAO Phe54Ser TvDAAO Phe258Tyr TvDAAO Phe258Ala TvDAAO Phe258Ser

160

Время, мин

Рис. 11. Зависимость остаточной активности от времени инактивации для мутантных форм и фермента дикого типа в одинаковых условиях. 0,1 М КФБ, рН 8,0, 56 °С, концентрация ферментов -15 мкг/мл.

Для фермента дикого типа и мутантных ТуРААО с заменами Р1пе258А1а, Р1пе2583ег, Р1пе258Туг, РГ1е543ег, РГ1е54Туг, СуэЮ8РЬе, РИе54А1а/Су5108Р11е, РЬе543ег/СуБ108РМе и РЬе54Туг/Суз108Р11е были определены кинетические параметры в реакции окисления цефалоспорина С. Расходование субстрата и накопление промежуточного и конечного продуктов реакции регистрировали с помощью ВЭЖХ. На рис. 12 представлена хроматограмма с результатами анализа реакционной смеси в случае двойного мутанта ТуйААО РЬе54Туг/Суз108РЬ|е.

=> <

Е

ш 3" о с

1400

1200-

1000-

800-

600-

400-

Цефапоспорин С

-0 min

--9 min

----15 min

------21 min

.....30 min + HO,

КА-7-АЦК

200 - _

ГЛ-7-АЦК

______- ■

8

10

"t" 12

14

16

Время, мин

Рис. 12. Хроматограмма продуктов окисления цефалоспорина С, катализируемого оксидазой D-аминокислот для различных времен протекания реакции. Условия протекания реакции: 10 мкг/мл фермента TvDAAO Phe54Tyr/Cys108Phe, 20 мМ цефалоспорин С, 0,1 М КФБ, рН 8,0, 30 "С. Элюция в 20 мМ CH3COONH4, 2% CH3CN, рН 4,9. ВЭЖХ детекция: 125x4,0 мм Silasorb С18, 4 мкм.

При окислении цефалослорина С с помощью ТуРААО продуктами являются Н202 и а-кетоадипил-7-АЦК (КА-7-АЦК), которая затем неферментативно окисляется пероксидом водорода до глутарил-7-АЦК (ГЛ-7-АЦК). Из рис. 12 видно, что по мере расходования исходного субстрата наблюдается образование промежуточного продукта КА-7-АЦК и конечного ПП-7-АЦК, причем, полного превращения промежуточного КА-7-АЦК в целевой ГЛ-7-АЦК из-за разложения части образующего пероксида водорода не происходит. Однако, при добавлении в реакционную смесь 0,05 мас% экзогенного Н202 происходит полная конверсия КА-7-АЦК в ГЛ-7-АЦК (рис. 12).

Аналогичные хроматограммы были получены для всех остальных мутантных ТуОААО и фермента дикого типа. Кинетика окисления цефалослорина С представлена на рис. 13. Из рисунка видно, что мутантные ТуОААО с заменами Р1те258Туг, РЬ1е543ег, РЬе54Туг, РМе54А1а/Суз108РИе, РИе54Эег/Су8108РЬе, Р1те54Туг/Суз108Р1те, СуэЮвРЬе имеют более высокую активность, чем фермент дикого типа. Наилучшими каталитическими свойствами (в порядке убывания) обладали ферменты с заменами РЬе543ег/Суз108Р1те, РЬе54Туг/СузЮ8РГ|е и РИе543ег.

-□- ТуОААО РЬе258А|а -О- ТуОААО РИе2585ег -Д-*Л-Ту0ААО

20 -| -у- ТуОААО РЬе258Туг

-О- ТуОААО СуыЮвРИе -<-ТуОААО РИе54А]а/Суз108РЬе -£>- ТуОААО РЬеИТуг -О-ТуОААО Р(1е545ег

15-| п ТуОААО РИе543ег/Суз108РИа

п -О- ТуОААО РИе54Туг/Суз108РЬе

и 10-

О-

о

5-

10

т 20

30

—г-40

Время, мин

Рис. 13. Кинетика окисления цефалослорина С, катализируемого мутантными ТуОААО и ферментом дикого типа. 20 мМ цефалоспорин С, 10мкг/мл ТуЭААО, 0 1 М КФБ, рН 8,0, 30 °С.

Расчет кинетических параметров проводили на основе анализа интегральной кинетики изменения концентрации исходного субстрата от времени методом Уокера-Шмидта. На рис. 14 представлены результаты обработки экспериментальных данных окисления цефалоспорина С для двойного мутанта ТуОААО РЬе54Туг/Суз108РИе. Максимальную скорость определяли из величины отсекаемого на оси ординат отрезка, а константу Михаэлиса - из тангенса угла наклона прямой (рис. 14). Каталитическая константа была получена делением максимальной скорости

на концентрацию активного фермента, которую рассчитывали по поглощению связанного FAD на 455 нм. Полученные значения каталитических констант, констант Михаэлиса и каталитической эффективности (отношение fccal/KM) представлены в таблице 3.

1,4н

1,2

1,0

0,8

0,6

Equation Weight

Residual Sum of Squares Pearson's r Adj. R-Square

Value Standard Errer

1.97961 0.0295 ■7.4906_0.24217

0,08

0,10

0,16

0,12 0,14

1/Нп(30/3), мин"1

Рис. 14. Линеаризация экспериментальных данных реакции окисления цефалоспорина С в координатах Уокера-Шмидта. 20 мМ цефалоспорин С, 10 мкг/мл ТуОААО РИе54Туг/Суз108РМе, 0,1 М КФБ, рН 8,0, 30 °С.

Таблица 3.

Форма фермента V km. mm "ca/km. мМ -c

wt-TvDAAO 32,0 ± 1,1 4,6 ±0,5 7,02

TvDAAO Cys108Phe 10719 12 ± 3 8,92

TvDAAO Phe258Tyr 73 ±3 18,4 ± 1,4 3,97

TvDAAO Phe258Ala 21,2 ±0,5 7,4 ± 0,6 2,87

TvDAAO Phe258Ser 28,4 ± 0,7 8,7 ± 0,7 3,26

TvDAAO Phe54Tyr 93 ±3 6,4 ± 0,6 14,5

TvDAAO Phe54Ser 92 ±3 3,4 ± 0,4 26,7

TvDAAO Phe54Tyr/Cys108Phe 130 ±2 6,0 ±0,3 21,7

TvDAAO Phe54Ala/Cys108Phe 76 ±2 4,5 ±0,5 17,0

TvDAAO Phe54Ser/Cys108Phe 118 + 5 6,3 ±0,7 18,7

* Полужирным шрифтом на сером фоне отмечены кинетические параметры мутантных ТуОААО, лучшие по сравнению с таковыми для «Д-ТуОААО.

Анализ данных, приведенных в таблице 3, показывает, что в большинстве случаев улучшение каталитической эффективности произошло за счет повышения каталитической константы, и только в одном случае, ТуОААО РЬе543ег, было улучшено значение константы Михаэлиса. Однако, несмотря на то, что среди полученных мутантных ТуОААО фермент с заменой РЬе54Эег обладает самой высокой каталитической эффективностью, в наших экспериментах мутанты с

заменами РЬе54Туг/Су5108РИе и РИе54Туг/Суз108РЬе демонстрировали более высокую скорость окисления цефалоспорина С (рис. 13). Это связано с тем, что при проведении процесса стараются использовать максимально возможные концентрации субстрата, которые являются для фермента «насыщающими» (т.е. [Б] » Км). В этом случае при одинаковой концентрации фермента скорость процесса зависит от величины каталитической константы к^, а не каталитической эффективности ксИменно такой случай и наблюдается для рассматриваемых мутантов - чем больше величина кся, тем быстрее идет реакция. Вторым очень важным результатом является аддитивность (суммирование положительного эффекта) улучшения каталитических свойств при объединении замен в 54 и 108 положениях. Третьим важным результатом данного раздела является то, что большинство полученных мутантных ТуЭААО, обладающих улучшенными каталитическими свойствами с цефалоспорином С, одновременно имеют более высокую термостабильность, чем фермент дикого типа.

Таким образом, подход рационального дизайна продемонстрировал эффективные результаты для улучшения каталитических свойств ТуЭААО. В результате тщательного анализа трехмерной структуры фермента и экспериментов по компьютерному моделированию были получены мутантные формы, перспективные для применения в промышленном процессе окисления цефалоспорина С.

ВЫВОДЫ

1. Изучена роль водородных связей в стабильности димера ТуЭААО. Показано, что остатки Агд169 и Агд220 играют важную роль в поддержании димерной структуры фермента. Разрушение водородных связей, образованных этими остатками, приводит к получению активного, но нерастворимого фермента, и при этом происходит резкое снижение термостабильности.

2. Проведена оптимизация структуры кофактор-связывающего домена за счет замены остатков в 32-м и 32-м положениях. Получены мутантные ТуОААО, которые обладают как улучшенными каталитическими свойствами, так и повышенной температурной стабильностью.

3. Проведены эксперименты по стабилизации ТуОААО с помощью гидрофобизации а-спиралей. Получено 8 мутантных форм фермента. Показано, что замена 5ег105А1а приводит к повышению стабильности фермента.

4. Изучена роль остатков РЬе54 и РЬе258, расположенных на входе в активный центр фермента. Показана важная роль этих остатков как в проявлении каталитических свойств, так и в термостабильности ТуОААО. Их замена на другие остатки позволяет резко сузить спектр субстратной специфичности. Кроме того, введение замен в 54 и 258 положении позволяет получить фермент с повышенной температурной стабильностью.

5. Показано, что остаток РИе в 54 положении играет важную роль в реакции окисления цефалоспорина С. Получены мутантные ТуЭААО, обладающие более высокими каталитической активностью и каталитической эффективностью.

Объединение замен в 54 и 108 положении привело к дальнейшему улучшению каталитических свойств TvDAAO в ходе окисления цефалоспорина С.

6. Изучена кинетика термоинактивации для всех полученных мутантных форм TvDAAO. Показано, что за исключением одного фермента, термоинактивация мутантных TvDAAO протекает по двухстадийному диссоциативному механизму.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Черскова Н.В. (Комарова Н.В.), Хороненкова C.B., Тишков В.И. Роль остатков Arg169 и Arg220 в межсубъединичном контакте дрожжевой оксидазы D-аминокислот. Известия Академии наук. Серия Химическая, 2010, т.59, №1, с.262-268.

2. Тишков В.И., Хороненкова C.B., Черскова Н.В., Савин С.С., Упоров И.В. Моделирование трехмерной структуры дрожжевой оксидазы D-аминокислот. Вестник Московского Университета, Серия 2: Химия, 2010, т.51, №3, с. 149-155.

3. Комарова Н.В., Голубев И.В., Хороненкова C.B., Тишков В.И Мутантная оксидаза D-аминокислот с улучшенной каталитической эффективностью к D-аминокислотам с объемными боковыми заместителями. Известия Академии наук. Серия Химическая, 2012, т.61, №7, с.1472-1479.

4. Комарова Н.В., Голубев И.В., Чубарь Т.А., Хороненкова C.B., Тишков В.И Инженерия субстратной специфичности оксидазы D-аминокислот Trigonopsis variabilis: направленный мутагенез остатка Phe258. Биохимия, 2012, т.77, №10, с.1424-1433.

5. Cherskova N.V. (Komarova N.V.), Khoronenkova S.V., Panteleev M.A., Tishkov V.l. Site-directed mutagenesis of D-amino acid oxidase from yeast Trigonopsis variabilis. J. Biotechnol. 2010, v.150, N S1, p.442.

6. Тишков В.И., Комарова H.B., Савин C.C., Савина Л.И., Балдин С.M. Мутантная оксидаза D-аминокислот (варианты). Заявление о выдаче патента Российской Федерации на изобретение № 2012140816 от 25.09.2012.

7. Ясная A.C., Хороненкова C.B., Черскова Н.В. (Комарова Н.В.), Федорчук В.В., Федорчук Е.А., Панин Н.В., Швядас В., Тишков В.И. Новые биокатализаторы для синтеза антибиотиков. Материалы Пятого Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", Март 16-20, 2009, Москва, 4.2, с.286-287.

8. Tishkov V.l., Cherskova N.V. (Komarova N.V.), Savin S.S., Khoronenkova S.V. Mutant D-Amino Acid Oxidases for Diagnostics. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2009. Fundamentals & Applications", Arkhangelsk, June 19-24, 2009, p.41.

9. Cherskova N.V. (Komarova N.V.), Khoronenkova S.V., Tishkov V.l. Role of Arg 169 and Arg220 in Dimer Stability of D-Amino Acid Oxidase. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2009. Fundamentals & Applications", Arkhangelsk, June 1924, 2009, p.65.

10. Комарова H.B., Голубев И.В., Хороненкова C.B., Тишков В.И. Направленный мутагенез остатка Phe54 в оксидазе D-аминокислот из Trigonopsis variabilis: влияние на каталитические свойства и стабильность. Материалы международного молодежного форума «Ломоносов-2011 », секция «Химия», Москва, 2011, с.409.

11. Тишков В.И., Хороненкова C.B., Алексеева A.A., Гончаренко К.В., Серенко A.A., Комарова Н.В., Голубев И.В., Рыженкова К.В., Газарян И.Г., Хушпульян Д.М.,

Березин А.И., Степашкина А.В., Федорчук В.В., Федорчук Е.А., Чубарь Т.А., Савина Л.И., Савин С.С.. Генно-инженерные ферменты для медицинской диагностики и фарамацевтики. Материалы Шестого Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", Март 21-25, 2011, Москва, ч. 1, с.37-38.

12. Комарова Н.В., Голубев И.В., Хороненкова С.В., Тишков В.И. Генно-инженерные формы оксидазы D-аминокислот с улучшенными свойствами. Международная школа-конференция молодых ученых по молекулярной биологии и биотехнологии леса: материалы конференции, г. Брянск, Россия, 12-18 сент. 2011 г. - М.: изд. МГУ Леса, 2011. с.262-263.

13. Березин А.И., Комарова Н.В., Голубев И.В., Хороненкова С.В., Савин С.С., Тишков В.И. Температурная стабильность оксидазы D-аминокислот. Международная школа-конференция молодых ученых по молекулярной биологии и биотехнологии леса: материалы конференции, г. Брянск, Россия, 12-18 сент. 2011 г. - М.: изд. МГУ Леса, 2011, с.257-258.

14. Комарова Н.В., Голубев И.В., Хороненкова С.В., Тишков В.И. Новые мутантные оксидазы D-аминокислот с улучшенными свойствами. 2-я международная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина»: материалы конференции, Пансионат «Заря», Московская обл., Россия, 19-24 сент. 2011 г. - М., 2011, с.79.

15. Комарова Н., Голубев И., Тишков В.И. Белковая инженерия оксидазы D-аминокислот для повышения эффективности в реакции окисления цефалоспорина С. Ломоносов и Гумбольдт: научное сотрудничество России и Германии - от истоков до наших дней: материалы международной конференции, г. Москва, Россия, 14-17 нояб. 2011 г. - М.: Институт энергии знаний 2011, с.217-218.

16. Рыженкова К.В., Комарова Н.В. Стабилизация оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis гидрофобизацией а-спиралей методом направленного мутагенеза. Материалы Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии», Март 20-22, 2012, Москва, ч.1, с.143-144.

17. Голубев И.В., Комарова Н.В., Тишков В.И. Белковая инженерия оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis. Материалы XIX Молодежной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2012»), Москва, 9-13 апреля 2012 г. - М.: МАКС Пресс, 2012, ISBN 978-5-317-04041-3, с.516.

18. Savin S., Komarova N.. Golubev I., Ryzhenkova К., Savina L., Khoronenkova S., Tishkov V. Engineering of substrate specificity of yeast D-amino acid oxidase. Abstracts of The 20th INPEC Conference "Engineering Protein - Systems, Functions and Applications", April 18-20, 2012, Taipei, Taiwan, P6, p. 39.

19. Komarova N.V., Golubev I.V., Ryzhenkova K.V., Tishkov V.I. Improvement of stability of D-amino acid oxidase using rational mutagenesis approach. 9th International Conference on Protein Stabilization. Book of Abstracts. May 2-4, 2012, Lisbon, Portugal, P24.

20. Tishkov V.I., Komarova N.V., Golubev I.V., Baldin S.M., Savin S.S. Engineered D-amino acid oxidase for medicine diagnostics. Programme & Abstracts of V International Meeting "Early events in Human Pathologies", Listvyanka, Baikal, Russia, July 9-12, 2012, p.37.

Подписано в печать 21.11.2012 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1271 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Комарова, Наталья Владимировна

I. ВВЕДЕНИЕ.

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Общие сведения об оксидазе Б-аминокислот.

2.2. Первичная структура оксидазы О-аминокислот.

2.3. Трехмерная структура оксидазы О-аминокислот.

2.4. Основные свойства оксидазы О-аминокислот.

2.4.1. Субстратная специфичность оксидазы О-аминокислот.

2.4.2. Стабильность оксидазы О-аминокислот.

2.5. Строение активного центра БААО и механизм катализируемой реакции

2.6. Клонирование и экспрессия генов йаао.

2.7. Химическая модификация оксидазы О-аминокислот.

2.8. Иммобилизация оксидазы О-аминокислот.

2.9. Белковая инженерия оксидазы О-аминокислот.

2.10. Практическое применение оксидазы О-аминокислот.

2.10.1. Определение О-аминокислот.

2.10.2. Получение физиологически активных соединений.

2.10.3. Биокаталитическое получение 7-АЦК из цефалоспорина С.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.2. Методы исследования.

3.2.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.2.2. Рестрикция ДНК.

3.2.3. Выделение ДНК-фрагментов из агарозного геля.

3.2.4. Лигирование фрагментов ДНК.

3.2.5. Трансформация клетокЕ. соИ.

3.2.6. Выделение плазмидной ДНК.

3.2.7. Направленный мутагенез.

3.2.8. Секвенирование ДНК.

3.2.9. Экспрессия TVDAAO и ее мутантов в клетках Е. coli.

3.2.10. Очистка фермента.

3.2.11. Белковый электрофорез в денатурирующих условиях.

3.2.12. Определение концентрации белков.

3.2.13. Определение активности TvDAAO.

3.2.14. Определение кинетических параметров.

3.2.15. Изучение стабильности при различных температурах.

3.2.16. Определение констант скорости термоинактивации.

3.2.17. Определение кинетических параметров TvDAAO в реакции с цефалоспорином С.

3.2.18. Анализ структуры и компьютерное моделирование.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Инженерия в области межсубъединичного контакта.

4.1.1. Анализ межсубъединичных контактов в димере TvDAAO.

4.1.2. Получение мутантных TvDAAO R220E и R169A/R220A.

4.1.3. Субстратная специфичность TvDAAO R220E и R169A/R220A.

4.1.4. Температурная стабильность TvDAAO R220E и

TvDAAO R169A/R220A.

4.2. Инженерия кофермент-связывающего домена.

4.2.1. Анализ связывания FAD в активном центре TvDAAO.

4.2.2. Получение мутантных TvDAAO с заменами в 32 и 33 положениях.

4.2.3. Субстратная специфичность мутантных TvDAAO с заменами в FAD-связывающем домене.

4.2.4. Температурная стабильность мутантных TvDAAO с заменами в FAD-связывающем домене.

4.3. Гидрофобизация a-спиралей TvDAAO.

4.3.1. Анализ структуры TvDAAO и выбор остатков Ser для гидрофобизации а-спиралей.

4.3.2. Получение мутантных TvDAAO с заменами S67A, S77A, S78A,

S105A, S270A, S277, S335A, S336A.

4.3.3. Субстратная специфичность TvDAAO с заменами S67A, S77A,

S105A, S335A, S336A, S277.

4.3.4. Изучение температурной стабильности мутантных TvDAAO.

4.4. Повышение эффективности TvDAAO в реакции окисления цефалоспорина С.

4.4.1. Анализ строения субстрат-связывающего домена.

4.4.2. Получение мутантных TvDAAO с заменами F258Y, F258A, F258S, F54Y, F54A, F54S, F54Y/C108F, F54A/C108F и F54S/C108F.

4.4.3. Субстратная специфичность TvDAAO с заменами F258Y, F258A, F258S, F54Y, F54S, F54Y/C108F, F54A/C108F, F54S/C108F.

4.4.4. Температурная стабильность TvDAAO с заменами F258Y, F258A, F258S, F54Y, F54S, F54Y/C108F, F54A/C108F, F54S/C108F.

4.4.5. Каталитические свойства мутантных ферментов в реакции с цефалоспорином С.

V. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Инженерия каталитических свойств и термостабильности оксидазы D-аминокислот"

Оксидаза О-аминокислот относится к классу БАО-содержащих оксидоредуктаз и катализирует окислительное дезаминирование О-аминокислот в соответствующие а-кетокислоты (КФ 1.4.3.3, ОААО). В микроорганизмах этот фермент окисляет экзогенные Б-аминокислоты, обеспечивая клетки легко утилизируемыми а-кетокислотами. В животных и человеке ОААО выполняет гораздо более важную роль - она отвечает за поддержание определенного уровня О-аминокислот, которые являются регуляторами важнейших процессов как в отдельных частях, так и во всем организме. Например, в тканях мозга фермент контролирует содержание О-серина, который участвует в регуляции деятельности нервной системы. В настоящее время установлено, что повышенная активность ОААО в мозге служит одной из причин возникновения шизофрении. У пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, наблюдается снижение активности фермента, в результате чего в тканях мозга значительно возрастает содержание О-аланина. Пониженная активность ОААО характерна также для некоторых почечных заболеваний. Кроме того, оксидаза О-аминокислот принимает участие в регуляции процессов старения.

На практике этот фермент используется главным образом в биокаталитическом процессе окисления цефалоспорина С в 7-аминоцефало-спорановую кислоту (7-АЦК) - исходное соединение для производства полусинтетических цефалоспоринов различных поколений (доля бета-лактамных антибиотиков составляет 10% от стоимости всех производимых в мире фармацевтических препаратов). Помимо этого, ОААО активно применяется в аналитической биотехнологии, хиральном синтезе, получении неприродных Ь-аминокислот и а-кетокислот и имеет большое потенциальное значение для создания систем диагностики и мониторинга ряда психосоматических (шизофрения, амиотрофический боковой склероз, болезни Альцгеймера и Паркинсона и др.) и онкологических заболеваний.

Несмотря на высокую теоретическую и практическую значимость, оксидаза D-аминокислот до недавнего времени была малоизученным ферментом. Фактически к настоящему времени накоплен достаточно большой объем экспериментальных данных для DAAO из почки свиньи (pkDAAO) и из дрожжей Rhodotorula gracilis (RgDAAO). Трехмерные структуры этих ферментов были определены в 1996 и 2000 годах соответственно. Для pkDAAO и RgDAAO в литературе имеются данные по изучению механизма действия этих ферментов методом направленного мутагенеза. В 2006 году была опубликована структура еще одной DAAO - фермента из человека (hDAAO). Интерес ученых к этому ферменту активно растет в последние годы в связи с открытием новых аспектов, связанных с физиологической ролью hDAAO в организме человека.

Среди всех известных оксидаз D-аминокислот наиболее широкое применение на практике находит фермент из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO), поскольку по сравнению с известными аналогичными ферментами из других источников TvDAAO обладает самой высокой температурной стабильностью и активностью с цефалоспорином С. Создание высокоэффективных биокатализаторов на основе TvDAAO невозможно без проведения фундаментальных исследований по изучению взаимосвязи структуры и функции этого фермента и направленной инженерии его свойств, в частности, температурной стабильности и субстратной специфичности. Другой очень важной задачей по инженерии TvDAAO является повышение активности фермента в реакции окисления цефалоспорина С.

Одним из самых эффективных методов как для фундаментального исследования структуры и функции ферментов, так и для направленного изменения их каталитических свойств и стабильности, является метод рационального дизайна. Этот метод сочетает анализ трехмерной структуры фермента с последующим введением выбранных на основе анализа аминокислотных замен с помощью направленного мутагенеза. В настоящее время в литературе имеется небольшое количество публикаций по белковой инженерии TvDAAO. Это связано с отсутствием у исследователей данных по трехмерной структуре фермента, хотя эксперименты по кристаллизации TvDAAO проводились во многих лабораториях более 20 лет. В 2007 году в нашей лаборатории была решена первая структура мутантной TvDAAO, которая остается единственной до настоящего времени. Наличие трехмерной структуры TvDAAO создает основу для проведения экспериментов по белковой инженерии этого фермента с помощью рационального дизайна.

Основной целью данной работы было изучение взаимосвязи структура-функция в оксидазе D-аминокислот из дрожжей Т. variabilis методами белковой инженерии и получение мутантных TvDAAO с измененными свойствами, а именно, температурной стабильностью и субстратной специфичностью.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Комарова, Наталья Владимировна

V. выводы

1. Изучена роль водородных связей в стабильности димера TvDAAO. Показано, что остатки Arg 169 и Arg220 играют важную роль в поддержании димерной структуры фермента. Разрушение водородных связей, образованных этими остатками, приводит к получению активного, но нерастворимого фермента, и при этом происходит резкое снижение термостабильности.

2. Проведена оптимизация структуры кофактор-связывающего домена за счет замены остатков в 32-м и 33-м положениях. Получены мутантные TvDAAO, которые обладают как улучшенными каталитическими свойствами, так и повышенной температурной стабильностью.

3. Проведены эксперименты по стабилизации TvDAAO с помощью гидрофобизации a-спиралей. Получено 8 мутантных форм фермента. Показано, что замена Serl05Ala приводит к повышению стабильности фермента.

4. Изучена роль остатков Phe54 и Phe258, расположенных на входе в активный центр фермента. Показана важная роль этих остатков как в проявлении каталитических свойств, так и в термостабильности TvDAAO. Их замена на другие остатки позволяет резко сузить спектр субстратной специфичности. Кроме того, введение замен в 54 и 258 положении позволяет получить фермент с повышенной температурной стабильностью.

5. Показано, что остаток Phe в 54 положении играет важную роль в реакции окисления цефалоспорина С. Получены мутантные TvDAAO, обладающие более высокими каталитической активностью и каталитической эффективностью. Объединение замен в 54 и 108 положении привело к дальнейшему улучшению каталитических свойств TvDAAO в ходе окисления цефалоспорина С.

6. Изучена кинетика термоинактивации для всех полученных мутантных форм TvDAAO. Показано, что за исключением одного фермента, термоинактивация мутантных TvDAAO протекает по двухстадийному диссоциативному механизму.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Комарова, Наталья Владимировна, Москва

1. Krebs, Н. A. Metabolism of amino-acids: Deamination of amino-acids. Biochem. J. 1935, v.29, N 7, p.1620-1644.

2. Pilone, M. S. D-Amino acid oxidase: new findings. Cell Mol. Life Sci. 2000, v.57, N 12, p.1732-1747.

3. Momoi, K., Fukui, K., Watanabe, F., and Miyake, Y. Molecular cloning and sequence analysis of cDNA encoding human kidney D-amino acid oxidase.' FEBS Lett. 1988, v.238, N 1, p.180-184.

4. Pollegioni, L., Piubelli, L., Sacchi, S., Pilone, M. S., and Molla, G. Physiological functions of D-amino acid oxidases: from yeast to humans. Cell Mol. Life Sci. -2007, v.64, N 11, p.1373-1394.

5. Nishikawa, T. Metabolism and functional roles of endogenous D-serine in mammalian brains. Biol. Pharm. Bull. 2005, v.28, N 9, p. 1561-1565.

6. Corvin, A., Donohoe, G., McGhee, K., Murphy, K., Kenny, N., Schwaiger, S., Nangle, J. M., Morris, D., and Gill, M. D-amino acid oxidase (DAO) genotype and mood symptomatology in schizophrenia. Neurosci. Lett. 2007, v.426, N 2, p.97-100.

7. Chung, S., Jung, J., Chung, H. Y., Yoo, H. K., Kim, C. Y., Joo, Y. H., Choi, S. E., and Hong, J. P. No association between polymorphisms of DAO and DAOA genes and homicidal behaviors in Korean schizophrenia. Psychiatr. Genet. 2007, v. 17, N 5, p.313.

8. Paul, P. and de, Belleroche J. The role of D-amino acids in amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: a review. Amino. Acids 2012, v.43, N 5, p.1823-1831.

9. Fisher, G., Lorenzo, N., Abe, H., Fujita, E., Frey, W. H., Emory, C., Di Fiore, M. M., and D' Aniello, A. Free D- and L-amino acids in ventricular cerebrospinal fluid from Alzheimer and normal subjects. Amino Acids 1998, v. 15, N 3, p.263-269.

10. Huang, J. L., Chen, X. L., Guo, C., and Wang, Y. X. Contributions of spinal D-amino acid oxidase to bone cancer pain. Amino Acids 2012, v.43, N 5, p.1905-1918.

11. Khoronenkova, S. V. and Tishkov, V. I. D-amino acid oxidase: physiological role and applications. Biochemistry (Mosc.) 2008, v.73, N 13, p.1511-1518.

12. Pilone, M. S. D-amino acid oxidase as an industrial biocatalyst. Biocatal.Biotransform. 2002, v.20, N 145-159.

13. He, J., Baldini, R. L., Deziel, E., Saucier, M., Zhang, Q., Liberati, N. T., Lee, D., Urbach, J., Goodman, H. M., and Rahme, L. G. The broad host range pathogen

14. Pseudomonas aeruginosa strain PA14 carries two pathogenicity islands harboring plant and animal virulence genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2004, v.101, N 8, p.2530-2535.

15. Subramani, S. Protein import into peroxisomes and biogenesis of the organelle. Annu. Rev. Cell Biol. 1993, v.9, N 445-478.

16. Mizutani, H., Miyahara, I., Hirotsu, K., Nishina, Y., Shiga, K., Setoyama, C., and Miura, R. Three-dimensional structure of porcine kidney D-amino acid oxidase at 3.0 A resolution. J. Biochem. 1996, v.120, N 1, p.14-17.

17. Mizutani, H., Miyahara, I., Hirotsu, K., Nishina, Y., Shiga, K., Setoyama, C., and Miura, R. Three-dimensional structure of porcine kidney D-amino acid oxidase at 3.0 A resolution. J. Biochem. 1996, v.120, N 1, p.14-17.

18. Todone, F., Vanoni, M. A., Mozzarelli, A., Bolognesi, M., Coda, A., Curti, B., and Mattevi, A. Active site plasticity in D-amino acid oxidase: a crystallographic analysis. Biochemistry 1997, v.36, N 19, p.5853-5860.

19. Pollegioni, L., Diederichs, K., Molla, G., Umhau, S., Welte, W., Ghisla, S., and Pilone, M. S. Yeast D-amino acid oxidase: structural basis of its catalytic properties. J. Mol. Biol. 2002, v.324, N 3, p.535-546.

20. Kawazoe, T., Tsuge, H., Imagawa, T., Aki, K., Kuramitsu, S., and Fukui, K. Structural basis of D-DOPA oxidation by D-amino acid oxidase: alternative pathway for dopamine biosynthesis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007, v.355, N 2, p.385-391.

21. Dib, I., Slavica, A., Riethorst, W., and Nidetzky, B. Thermal inactivation of D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis occurs via three parallel paths of irreversible denaturation. Biotechnol. Bioeng. 2006, v.94, N 4, p.645-654.

22. Хороненкова, С. В. Рекомбинантная оксидаза D-аминокислот: получение и структрурно-функциональные исследования. Дис.канд.хим.наук.М.-МГУ. -2008, 162 с.

23. Piubelli, L., Caldinelli, L., Molla, G., Pilone, M. S., and Pollegioni, L. Conversion of the dimeric D-amino acid oxidase from Rhodotorula gracilis to a monomeric form. A rational mutagenesis approach. FEBSLett. 2002, v.526, N 1-3, p.43-48.

24. Pilone, M. S. D-Amino acid oxidase: new findings. Cell Mol. Life Sci. 2000, v.57, N 12, p.1732-1747.

25. Schrader, T. and Andreesen, J. R. Studies on the inactivation of the flavoprotein D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis. Appl. Microbiol. Biotechnol. -1996, v.45, N 4, p.458-464.

26. Schrader, T. and Andreesen, J. R. Properties and chemical modification of D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis. Arch. Microbiol. 1996, v. 165, N 41-47.

27. Molla, G., Sacchi, S., Bernasconi, M., Pilone, M. S., Fukui, K., and Polegioni, L. Characterization of human D-amino acid oxidase. FEBS Lett. 2006, v.580, N 9, p.2358-2364.

28. Pollegioni, L., Ghisla, S., and Pilone, M. S. Studies on the active centre of Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase and comparison with pig kidney enzyme. Biochem. J. 1992, v.286 ( Pt 2), N 389-394.

29. Pollegioni, L., Buto, S., Tischer, W., Ghisla, S., and Pilone, M. S. Characterization of D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis. Biochem. Mol. Biol. Int. -1993, v.31, N 4, p.709-717.

30. Gabler, M., Hensel, M., and Fischer, L. Detection and substrate selectivity of new microbial D-amino acid oxidases. Enzyme Microb. Technol. 2000, v.27, N 8, p.605-611.

31. Sarower, M. G., Okada, S., and Abe, H. Catalytic and structural characteristics of carp hepatopancreas D-amino acid oxidase expressed in Escherichia coli. Comp Biochem. Physiol B Biochem. Mol. Biol. 2005, v.140, N 3, p.417-425.

32. Geueke, B., Weckbecker, A., and Hummel, W. Overproduction and characterization of a recombinant D-amino acid oxidase from Arthrobacter protophormiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, v.74, N 6, p. 1240-1247.

33. Pollegioni, L., Caldinelli, L., Molla, G., Sacchi, S., and Pilone, M. S. Catalytic properties of D-amino acid oxidase in cephalosporin C bioconversion: a comparison between proteins from different sources. Biotechnol. Prog. 2004, v.20, N 2, p.467-473.

34. Pollegioni, L., Sacchi, S., Caldinelli, L., Boselli, A., Pilone, M. S., Piubelli, L., and Molla, G. Engineering the properties of D-amino acid oxidases by a rational and a directed evolution approach. Curr. Protein Pept. Sci. 2007, v.8, N 6, p.600-618.

35. Harris, C. M., Pollegioni, L., and Ghisla, S. pH and kinetic isotope effects in D-amino acid oxidase catalysis. Eur. J. Biochem. 2001, v.268, N 21, p.5504-5520.

36. Caligiuri, A., D'Arrigo, P., Rosini, E., Tessaro, D., Molla, G., Servi, S., and Pollegioni, L. Enzymatic conversion of unnatural amino acids by yeast D-amino acid oxidase. Adv. Synth. Catal. 2006, v.348, N 2183-2190.

37. Sacchi, S., Lorenzi, S., Molla, G., Pilone, M. S., Rossetti, C., and Pollegioni, L. Engineering the substrate specificity of D-amino-acid oxidase. J. Biol. Chem. -2002, v.277, N 30, p.27510-27516.

38. Rosini, E., Molla, G., Ghisla, S., and Pollegioni, L. On the reaction of D-amino acid oxidase with dioxygen: 02 diffusion pathways and enhancement of reactivity. FEBSJ. 2011, v.278, N 3, p.482-492.

39. Pollegioni, L., Molla, G., Sacchi, S., Rosini, E., Verga, R., and Pilone, M. S. Properties and applications of microbial D-amino acid oxidases: current state and perspectives. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008, v.78, N 1, p. 1-16.

40. Fukui, K. and Miyake, Y. Molecular cloning and chromosomal localization of a human gene encoding D-amino-acid oxidase. J. Biol. Chem. 1992, v.261, N 26, p.18631-18638.

41. Momoi, K., Fukui, K., Watanabe, F., and Miyake, Y. Molecular cloning and sequence analysis of cDNA encoding human kidney D-amino acid oxidase. FEBS Lett. 1988, v.238, N 1, p.180-184.

42. Fukui, K., Watanabe, F., Shibata, T., and Miyake, Y. Molecular cloning and sequence analysis of cDNAs encoding porcine kidney D-amino acid oxidase. Biochemistry 1987, v.26, N 12, p.3612-3618.

43. Momoi, K., Fukui, K., Tada, M., and Miyake, Y. Gene expression of D-amino acid oxidase in rabbit kidney. J. Biochem. 1990, v. 108, N 3, p.406-413. .

44. Tada, M., Fukui, K., Momoi, K., and Miyake, Y. Cloning and expression of a cDNA encoding mouse kidney D-amino acid oxidase. Gene 1990, v.90, N 2, p.293-297.

45. Konno, R. Rat D-amino-acid oxidase cDNA: rat D-amino-acid oxidase as an intermediate form between mouse and other mammalian D-amino-acid oxidases. Biochim. Biophys. Acta 1998, v. 1395, N 2, p. 165-170.

46. Konno, R., Kurabayashi, A., Tsuchiya, M., and Niwa, A. Guinea pig D-amino-acid oxidase cDNA and phylogenetic position. DNA Seq. 1999, v. 10, N 2, p.85-91.

47. Tsuchiya, M., Kurabayashi, A., and Konno, R. Hamster D-amino-acid oxidase cDNA: rodents lack the 27th amino acid residue in D-amino-acid oxidase. Amino Acids 2003, v.24, N 1-2, p.223-226.

48. Sarower, M. G., Okada, S., and Abe, H. Molecular characterization of D-amino acid oxidase from common carp Cyprinus carpio and its induction with exogenous free D-alanine. Arch. Biochem. Biophys. 2003, v.420, N 1, p. 121-129.

49. Gholizadeh, A. and Kohnehrouz, B. B. Molecular cloning and expression in Escherichia coli of an active fused Zea mays L. D-amino acid oxidase. Biochemistry (Mosc.) 2009, v.74, N 2, p.137-144.

50. Chen, Y.-H., Chen, W.-L., Wang, Y.-H., Huang, M.-Y., and Chern, M.-K. Spatiotemporal expression of zebrafish D-amino acid oxidase during early embryogenesis. Fish Physiology and Biochemistry 2007, v.33, N 1, p.73-80.

51. Isogai, T., Ono, H., Ishitani, Y., Kojo, H., Ueda, Y., and Kohsaka, M. Structure and expression of cDNA for D-amino acid oxidase active against cephalosporin C from Fusarium solani. J. Biochem. 1990, v.108, N 6, p.1063-1069.

52. Liao, G. J., Lee, Y. J., Lee, Y. H., Chen, L. L., and Chu, W. S. Structure and expression of the D-amino-acid oxidase gene from the yeast Rhodosporidium toruloides. Biotechnol. Appl. Biochem. 1998, v.27 ( Pt 1), N 55-61.

53. Yurimoto, H., Hasegawa, T., Sakai, Y., and Kato, N. Characterization and highlevel production of D-amino acid oxidase in Candida boidinii. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001, v.65, N 3, p.627-633.

54. Horner, R., Wagner, F., and Fischer, L. Induction of the d-Amino Acid Oxidase from Trigonopsis variabilis. Appl. Environ. Microbiol. 1996, v.62, N 6, p.2106-2110.

55. Kubicek-Pranz, E. M. and Rohr, M. D-amino acid oxidase from the yeast Trigonopsis variabilis. J. Appl. Biochem. 1985, v.7, N 2, p.104-113.

56. Wei, C. J., Huang, J. C., and Tsai, Y. P. Study on the synthesis of D-amino acid oxidase in Trigonopsis variabilis in continuous culture. Biotechnol. Bioeng. 1989, v.34, N 4, p.570-574.

57. Gabler, M. and Fischer, L. Production of a new D-amino acid oxidase from the fungus Fusarium oxysporum. Appl. Environ. Microbiol. 1999, v.65, N 8, p.3750-3753.

58. Molla, G., Motteran, L., Piubelli, L., Pilone, M. S., and Pollegioni, L. Regulation of D-amino acid oxidase expression in the yeast Rhodotorula gracilis. Yeast 2003, v.20, N 12, p.1061-1069.

59. Abad, S., Nahalka, J., Bergler, G., Arnold, S. A., Speight, R., Fotheringham, I., Nidetzky, B., and Glieder, A. Stepwise engineering of a Pichia pastoris D-amino acid oxidase whole cell catalyst. Microb. Cell Fact. 2010, v.9, N 24.

60. Abad, S., Nahalka, J., Winkler, M., Bergler, G., Speight, R., Glieder, A., and Nidetzky, B. High-level expression of Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase in Pichia pastoris. Biotechnol Lett. 2011, v.33, N 3, p.557-563.

61. Lin, S.-Y., Wang, J.-D., and Lin, J. S. Expression of Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase in transgenic rice for cephalosporin production. Botanical Studies 2008, v.50, N 2, p. 181-192.

62. Lin, L., Chien, H. R., Wang, W., Hwang, T., Fu, H., and Hsu, W. Expression of Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase gene in Escherichia coli and characterization of its inactive mutants. Enzyme Microb. Technol. 2000, v.27, N 7, p.482-491.

63. Molla, G., Vegezzi, C., Pilone, M. S., and Pollegioni, L. Overexpression in Escherichia coli of a recombinant chimeric Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase. Protein Expr. Purif. 1998, v. 14, N 2, p.289-294.

64. Dib, I., Stanzer, D., and Nidetzky, B. Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase: control of protein quality and opportunities for biocatalysis through production in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 2007, v.73, N 1, p.331-333.

65. Gupta, N., Gundampati, R. K., and Debnath, M. Optimization of media composition for D-amino acid oxidase production by Trigonopsis variabilis using biostatistical analysis. Indian J. Biochem. Biophys. 2012, v.49, N 4, p.272-278.

66. Takahashi, S., Okada, H., Abe, K., and Kera, Y. D-Amino Acid-Induced Expression of D-Amino Acid Oxidase in the Yeast Schizosaccharomyces pombe. Curr. Microbiol. 2012, v.65, N 6, p.764-769.

67. Konno, R. Assignment of D-amino-acid oxidase gene to a human and a mouse chromosome. Amino. Acids 2001, v.20, N 4, p.401-408.

68. Alonso, J., Barredo, J. L., Diez, B., Mellado, E., Salto, F., Garcia, J. L., and Cortes, E. D-amino-acid oxidase gene from Rhodotorula gracilis {Rhodosporidium toruloides) ATCC 26217. Microbiology 1998, v.144 ( Pt 4), N 1095-1101.

69. Kim, S.-J., Kim, N. J., Chen, J.-H., and Kim, C.-W. Optimization of culture condition for the production of D-amino acid oxidase in a recombinant Escherichia coli. Biotechnology and Bioprocess Engineering 2008, v.13, N 2, p.144-149.

70. Liu, Y., Li, Q., Zhu, H., and Yang, J. High Soluble Expression of D-Amino Acid Oxidase in Escherichia coli Regulated by a Native Promoter. Appl Biochem Biotechnol 2009, v.158, N 2, p.313-322.

71. Romano, D., Molla, G., Pollegioni, L., and Marinelli, F. Optimization of human D-amino acid oxidase expression in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 2009, v.68, N 1, p.72-78.

72. Cereghino, J. L. and Cregg, J. M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiol. Rev. 2000, v.24, N 1, p.45-66.

73. Gisby, M. F., Mudd, E. A., and Day, A. Growth of transplastomic cells expressing D-amino acid oxidase in chloroplasts is tolerant to D-alanine and inhibited by D-valine. Plant Physiol 2012 Epub ahead of print.

74. Vanoni, M. A., Pilone, Simonetta M., Curti, B., Negri, A., and Ronchi, S. Phenylglyoxal modification of arginines in mammalian D-amino-acid oxidase. Eur. J. Biochem. 1987, v.167, N 2, p.261-267.

75. Gadda, G., Negri, A., and Pilone, M. S. Reaction of phenylglyoxal with arginine groups in D-amino-acid oxidase from Rhodotorula gracilis. J. Biol. Chem. 1994, v.269, N 27, p.17809-17814.

76. Fitzpatrick, P. F. and Massey, V. The reaction of 8-mercaptoflavins and flavoproteins with sulfite. Evidence for the role of an active site arginine in D-amino acid oxidase. J. Biol. Chem. 1983, v.258, N 16, p.9700-9705.

77. D'Silva, C., Williams, C. H., Jr., and Massey, V. Electrophilic amination of a single methionine residue located at the active site of D-amino acid oxidase by 0-(2,4-dinitrophenyl)hydroxylamine. Biochemistry 1986, v.25, N 19, p.5602-5608.

78. Ramon, F., de, la Mata, I, Iannacone, S., Pilar, Castillon M., and Acebal, C. Chemical modification of histidyl residues in D-amino acid oxidase from Rhodotorula gracilis. J. Biochem. 1995, v.118, N 5, p.911-916.

79. Gadda, G., Beretta, G. L., and Pilone, M. S. Chemical modification of lysyl residues of Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase. Biochem. Mol. Biol. Int. 1994, v.33, N 5, p.947-955.

80. Marcotte, P. and Walsh, C. Properties of D-amino acid oxidase covalently modified upon its oxidation of D-propargylglycine. Biochemistry 1978, v. 17, N 14, p.2864-2868.

81. Horiike, K., Nishina, Y., Miyake, Y., and Yamano, T. Affinity labeling of D-amino acid oxidase with an acetylenic substrate. J. Biochem. 1975, v.78, N 1, p.57-63.

82. Schrader, T. and Andreesen, J. R. Evidence for the functional importance of Cys298 in D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis. Eur. J. Biochem. 1993, v.218, N 2, p.735-744.

83. Bakke, M. and Kajiyama, N. Improvement in thermal stability and substrate binding of pig kidney D-amino acid oxidase by chemical modification. Appl. Biochem. Biotechnol. 2004, v.l 12, N 3, p.123-131.

84. Hsieh, H. C., Kuan, I. C., Lee, S. L., Tien, G. Y., Wang, Y. J., and Yu, C. Y. Stabilization of D-amino acid oxidase from Rhodosporidium toruloides by immobilization onto magnetic nanoparticles. Biotechnol. Lett. 2009, v.31, N 4, p.557-563.

85. Kuan, I., Liao, R., Hsieh, H., Chen, K., and Yu, C. Properties of Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase immobilized on magnetic beads through his-tag. J. Biosci. Bioeng. 2008, v.105, N 2, p.l 10-115.

86. Chien, L. J. and Lee, C. K. Biosilicification of dual-fusion enzyme immobilized on magnetic nanoparticle. Biotechnol Bioeng. 2008, v.100, N 2, p.223-230.

87. Nahalka, J., Dib, I., and Nidetzky, B. Encapsulation of Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase and fast comparison of the operational stabilities of free and immobilized preparations of the enzyme. Biotechnol. Bioeng. 2008, v.99, N 2, p.251-260.

88. Dib, I. and Nidetzky, B. The stabilizing effects of immobilization in D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis. BMC. Biotechnol. 2008, v.8, N 72.

89. Dsouza, S. F. and Deshpande, A. Simultaneous purification and reversible immobilization of D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis on a hydrophobic support. Appl. Biochem. Biotechnol. 2001, v.95, N 2, p.83-92.

90. Lemainque, A., Braun, J., and Le, Goffic F. Influence of polymerization of D-amino acid oxidase on the behavior of the enzyme immobilized on chitosan by covalent fixation., Eur. J. Biochem. 1988, v. 174, N 1, p. 171-176.

91. Parkin, K. and Hultin, H. O. Immobilization and characterization of D-amino acid oxidase. Biotechnol Bioeng. 1979, v.21, N 6, p.939-953.

92. Vikartovska-Welwardova, A., Michalkova, E., Gemeiner, P., and Wei ward, L. Stabilization of D-amino-acid oxidase from Trigonopsis variabilis by manganese dioxide. Folia Microbiol. (Praha) 1999, v.44, N 4, p.380-384.

93. Tanaka, A., Yasuhara, S., Osumi, M., and Fukui, S. Immobilization of yeast microbodies by inclusion with photo-crosslinkable resins. Eur. J. Biochem. 1977, v.80, N 1, p.193-197.

94. Johansson, E., Marko-Varga, G., and Gorton, L. Study of a reagent- and mediator-less biosensor for D-amino acids based on co-immobilized D-amino acid oxidase and peroxidase in carbon paste electrodes. J. Biomater. Appl. 1993, v.8, N 2, p.146-173.

95. Sacchi, S., Lorenzi, S., Molla, G., Pilone, M. S., Rossetti, C., and Pollegioni, L. Engineering the substrate specificity of D-amino-acid oxidase. J. Biol. Chem. -2002, v.277, N 30, p.27510-27516.

96. Caligiuri, A., D'Arrigo, P., Rosini, E., Tessaro, D., Molla, G., Servi, S., and Pollegioni, L. Enzymatic conversion of unnatural amino acids by yeast D-amino acid oxidase. Advanced Synthesis & Catalysis 2006, v.348, N 15, p.2183-2190.

97. Boselli, A., Piubelli, L., Molla, G., Pilone, M. S., Pollegioni, L., and Sacchi, S. Investigating the role of active site residues of Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase on its substrate specificity. Biochimie 2007, v.89, N 3, p.360-368.

98. Boselli, A., Sacchi, S., Job, V., Pilone, M. S., and Pollegioni, L. Role of tyrosine 238 in the active site of Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase. A site-directed mutagenesis study. Eur. J. Biochem. 2002, v.269, N 19, p.4762-4771.

99. Pollegioni, L., Harris, C. M., Molla, G., Pilone, M. S., and Ghisla, S. Identification and role of ionizing functional groups at the active center of Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase. FEBSLett. 2001, v.507, N 3, p.323-326.

100. Boselli, A., Piubelli, L., Molla, G., Sacchi, S., Pilone, M. S., Ghisla, S., and Pollegioni, L. On the mechanism of Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase: role of the active site serine 335. Biochim. Biophys. Acta 2004, v. 1702, N 1, p.19-32.

101. Caldinelli, L., Molla, G., Pilone, M. S., and Pollegioni, L. Tryptophan 243 affects interprotein contacts, cofactor binding and stability in D-amino acid oxidase from Rhodotorula gracilis. FEBS J. 2006, v.273, N 3, p.504-512.

102. Campaner, S., Pollegioni, L., Ross, B. D., and Pilone, M. S. Limited proteolysis and site-directed mutagenesis reveal the origin of microheterogeneity in Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase. Biochem. J. 1998, v.330 (Pt 2), p.615-621.

103. Bakke, M., Setoyama, C., Miura, R., and Kajiyama, N. Thermostabilization of porcine kidney D-amino acid oxidase by a single amino acid substitution. Biotechnol. Bioeng. 2006, v.93, N 5, p. 1023-1027.

104. Pollegioni, L., Fukui, K., and Massey, V. Studies on the kinetic mechanism of pig kidney D-amino acid oxidase by site-directed mutagenesis of tyrosine 224 and tyrosine 228. J. Biol. Chem. 1994, v.269, N 50, p.31666-31673.

105. Raibekas, A. A., Fukui, K., and Massey, V. Design and properties of human D-amino acid oxidase with covalently attached flavin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA -2000, v.97, N 7, p.3089-3093.

106. Ju, S. S., Lin, L. L., Wang, W. C., and Hsu, W. H. A conserved aspartate is essential for FAD binding and catalysis in the D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis. FEBSLett. 1998, v.436, N 1, p.l 19-122.

107. Lin, L. L., Wang, W. C., Ju, S. S., Chien, H. R., and Hsu, W. H. The role of a conserved histidine residue, His324, in Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase. FEMS Microbiol. Lett. 1999, v.176, N 2, p.443-448.

108. Frattini, L., Rosini, E., Pollegioni, L., and Pilone, M. S. Analyzing the D-amino acid content in biological samples by engineered enzymes. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2011, v.879, N 29, p.3235-3239.

109. Wang, S. J., Yu, C. Y., Lee, C. K., Chern, M. K., and Kuan, I. C. Subunit fusion of two yeast D-amino acid oxidases enhances their thermostability and resistance to H202. Biotechnol. Lett. 2008, v.30, N 8, p.1415-1422.

110. Nishikawa, T. Metabolism and functional roles of endogenous D-serine in mammalian brains. Biol. Pharm. Bull. 2005, v.28, N 9, p.1561-1565.

111. Sacchi, S., Rosini, E., Caldinelli, L., and Pollegioni, L. Biosensors for D-amino acid detection. Methods Mol. Biol. 2012, v.794, N 313-324.

112. Mohd, Zain Z., Ab, Ghani S., and O'Neill, R. D. Amperometric microbiosensor as an alternative tool for investigation of D-serine in brain. Amino. Acids 2012, v.43, N 5, p.1887-1894.

113. Maddess, M. L., Tackett, M. N., and Ley, S. V. Total synthesis studies on macrocyclic pipecolic acid natural products: FK506, the antascomicins and rapamycin. Prog. Drug Res. 2008, v.66, N 13, 15-13,186.

114. Findrik, Z. and Vasic-Racki, D. Biotransformation of D-methionine into L-methionine in the cascade of four enzymes. Biotechnol. Bioeng. 2007, v.98, N 5, p.956-967.

115. Tan, Q., Song, Q., Zhang, Y., and Wei, D. Characterization and application of D-amino acid oxidase and catalase within permeabilized Pichia pastoris cells in bioconversions. Appl. Biochem. Biotechnol. 2007, v. 136, N 3, p.279-289.

116. Seo, Y. M., Mathew, S., Bea, H. S., Khang, Y. H., Lee, S. H., Kim, B. G., and Yun, H. Deracemization of unnatural amino acid: homoalanine using D-amino acid oxidase and omega-transaminase. Org. Biomol. Chem. 2012, v. 10, N 12, p.2482-2485.

117. Patel, R. N. Enzymatic synthesis of chiral intermediates for Omapatrilat, an antihypertensive drug. Biomol. Eng 2001, v. 17, N 6, p. 167-182.

118. Таранцева, К. P. and Яхкинд, M. И. Анализ технологий синтеза 7-аминоцефалосиорановой кислоты и выбор оптимальной безопасной промышленной технологии. М: Научный мир, 2009, 216 с.

119. Barber, М. S., Giesecke, U., Reichert, A., and Minas, W. Industrial enzymatic production of cephalosporin-based beta-lactams. Adv. Biochem Eng Biotechnol -2004, v.88, N 179-215.

120. Sonawane, V. C. Enzymatic modifications of cephalosporins by cephalosporin acylase and other enzymes. Crit Rev. Biotechnol. 2006, v.26, N 2, p.95-120.

121. Полторак, O.M., Чухрай, E.C. Диссоциативная термоинактивация катализаторов. Итоги науки и техники. Биотехнология. 1986, v.5, р.50-86