Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование физико-химических и биологических свойств нативной, иммобилизованной и конъюгированной L-лизин- α-оксидазы из Trichoderma harzianum Rifai

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Лукашева, Елена Васильевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Часть 1. Оксидазы L-аминокислот: источники, свойства, применение

1.1 Введение.

1.2. Субстратная специфичность оксидаз L-аминокислот.

1.3. Очистка и определение активности оксидаз L-аминокислот.

1.3.1. Способы очистки.

1.3.2. Способы определения активности.

1.4. Физико-химические свойства оксидаз L-аминокислот.

1.4.1. Строение молекулы (молярная масса, наличие коферментов 28 и изоэлектрическая точка).

1.4.2. Спектры оптического поглощения.

1.4.3. Зависимость скорости ферментативных реакций от рН.

1.4.4. Стабильность оксидаз L-аминокислот.

1.4.5. Ингибиторы оксидаз L-аминокислот.

1.5. Кинетические свойства оксидаз L-аминокислот.

1.5.1. Стехиометрия реакции.

1.5.2. Кинетический механизм ферментативной реакции.

1.6. Применение оксидаз L-аминокислот в аналитических целях.

1.7. Биологические свойства оксидаз L-аминокислот.

1.7.1. Оксидазы L-аминокислот, как фактор, вызывающий апоптоз и агрегацию тромбоцитов.

1.7.2. Изучение биологического действия ЛО in vitro.

1.7.2. Изучение биологического действия ЛО in vivo.

Часть 2. Химические методы иммобилизации ферментов.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

2.1. Методы определения активности.

2.1.1. Определение активности по скорости накопления перекиси водорода в реакционной среде.

2.1.2. Определение активности Л О по убыли кислорода в реакционной среде.

2.1.3. Определение активности по скорости накопления аммиака в реакционной среде.

2.1.4. Определение скорости ферментативной реакции по образованию а-кето-8-аминокапроновой кислоты.

2.1.5. Определение активности по накоплению А'-пиперидин-2- 75 карбоксилата.

2.1.6. Определение активности иммобилизованной ПХ.

2.1.7. Определение активности иммобилизованной на мембранах

2.1.8. Определение активности совместно иммобилизованных ЛО и ПХ.

2.2. Методы очистки ЛО.

2.3. Методы изучения физико-химических свойств.

2.3.1. Определение концентрации белка.

2.3.2. Определение гомогенности препарата, молекулярной массы и субъединичного состава фермента

2.3.3. Определение изоэлектрической точки.

2.3.4. Исследование термостабильности ЛО.

2.3.5. Исследование рН-зависимости.

2.3.6. Изучение спектральных характеристик Л О.

2.3.7. Определение числа аминогрупп на поверхности молекулы фермента.

2.3.8. Установление кофактора Л О.

2.3.9. Определение наличия углеводных компонентов в молекуле

2.4. Методы изучения каталитических свойств.

2.4.1. Стехиометрия реакции.

2.4.2. Определение Км по отношению к Ь-лизину и кислороду.

2.4.3. Исследование субстратной специфичности и влияния ингибиторов и активаторов на скорость ферментативной реакции.

2.4.4. Изучение влияния модификации некоторых аминокислотных остатков на ферментативную активность

2.5. Иммобилизация JIO.

2.5.1. Иммобилизация JIO на силикагеле.

2.5.2. Совместная иммобилизация на пористых мембранных носителях JIO и пероксидазы из.

2.6. Использование растворимой и иммобилизованной JIO для определения концентраций L-лизина.

2.6.1. Определение концентрации L-лизина с помощью растворимой ЛО.

2.6.2. Использование иммобилизованной на силикагеле ЛО.

2.6.3. Использование иммобилизованных на мембранных носителях ЛО и ПХ и субстрата АБТС для определения концентрации L-лизина.

2.7. Получение растворимых конъюгатов ЛО.

2.7.1. Получение неспецифических антител.

2.7.2. Исследование активности антител, входящих в состав конъюгатов с ферментами.

2.7.3. Получение конъюгатов Л О с антителами путем окисления углеводного остатка, входящего в молекулу ЛО.

2.7.4. Получение конъюгатов ЛО и антител с помощью глутарового альдегида.

2.7.5. Совместная иммобилизация ЛО с ПХ и антителами.

2.7.6. Получение конъюгатов L-лизин-а-оксидазы с моноклональными антителами.

2.7.7. Изучение физико-химических свойств конъюгатов Л О с антителами, полученных различными способами.

2.8. Исследование биологических свойств ЛО и ее конъюгатов.

2.8.1. Сравнительное изучение влияния нативной ЛО и L- 97 аспарагиназы на рост опухолей.

2.8.2. Исследование цитотоксической активности конъюгатов Л О с моноклональными антителами ICO-80.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.Ю

3.1. Очистка ЛО.^

3.2. Изучение физико-химических свойств фермента.^

3.2.1. Определение молекулярной массы L-лизин-а-оксидазы.

3.2.2. Определение изоэлектрической точки.Ш

3.2.3. Исследование pH-зависимости ферментативной активности

3.2.4. Изучение спектральных характеристик J10.

3.2.5. Установление кофермента JIO.

3.2.6. Определение наличия углеводных компонентов в молекуле

3.2.7. Определение числа свободных аминогрупп на поверхности молекулы Л О.

3.2.8. Исследование стабильности ЛО.

3.2.9. Зависимость термостабильности ЛО от условий инкубации и стабильность при хранении.

3.2.10. Температурные изменения конформации ЛО и их роль в регуляции функциональной активности.

3.3. Изучение каталитических свойств.

3.3.1. Изучение стехиометрии реакции.

3.3.2. Исследование субстратной специфичности и влияния ингибиторов и активаторов на скорость ферментативной реакции.

3.3.3. Изучение кинетики ферментативной реакции.

3.3.4. Изучение влияния модификации некоторых аминокислотных остатков на ферментативную активность

3.4. Иммобилизация ЛО на носителях различного типа.

3.5. Использование растворимой ЛО и ее иммобилизованных препаратов для определения концентрации L-лизина.

3.6. Изучение влияния нативной ЛО на рост опухолей in vivo.

3.7. Получение конъюгатов ЛО с антителами и изучение их физико-химических и биологических свойств.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование физико-химических и биологических свойств нативной, иммобилизованной и конъюгированной L-лизин- α-оксидазы из Trichoderma harzianum Rifai"

Актуальность проблемы. Частота онкологических заболеваний в большинстве стран мира неуклонно возрастает. В процессе совершенствования методов лечения злокачественных новообразований человека на передний план в проблеме современной химиотерапии выдвигается поиск новых высокоэффективных противоопухолевых агентов, а также разработка методов направленного транспорта этих агентов к пораженным органам. Вопросы медицинской энзимологии занимают одно из центральных мест в биохимии и терапии опухолевых заболеваний. Ферменты выгодно отличаются от традиционных цитостатических агентов, применяемых в онкологии, специфичностью действия по отношению к субстрату. Это свойство ферментов обеспечивает высокую селективность их противоопухолевого воздействия. Следует отметить, что внедрение ферментов в онкологическую практику происходит крайне медленно.

Коммерческий рынок ферментов противоопухолевого назначения остается до сих пор очень узким. Убедительным доказательством возможности эффективного использования ферментных препаратов в онкологии является многолетняя практика применения бактериального фермента Ь-аспарагиназы из различных источников при комбинированной химиотерапии лейкозов. Опыт использования этого фермента показал, что он не лишен ряда недостатков. Кроме того, спектр противоопухолевого действия Ь-аспарагиназы крайне ограничен.

Поскольку некоторые опухолевые клетки особенно чувствительны к недостатку незаменимых аминокислот, именно аминокислоты представлялись перспективной мишенью для их исключения из метаболизма. В силу того, что ферменты избирательно действуют на свои субстраты, за счет их действия, как экзогенных факторов, принципиально может быть достигнуто снижение до критического уровня определенных эссенциальных аминокислот. В основу поиска противоопухолевых ферментов были положены требования к ферментам медицинского назначения, сформулированные в работах (Березов Т.Т., 1971, 1984, 1989; НоЬепЬе^ 1.8., 1977,1982).

Снижение уровня Ь-лизина приводит к гибели клеток. Эта аминокислота не синтезируется в организме, поскольку она не вступает в реакции трансаминирования, ведущие к синтезу заменимых аминокислот. Деградирующий Ь-лизин фермент из Тпскос1егта утс1е У 244-2 был впервые получен в Японии (КизакаЬе Н. е1 а1., 1980).

На кафедре биохимии Российского университета дружбы народов с 1980 года были начаты поиски отечественного продуцента этого фермента, был получен в гомогенном состоянии фермент Ь-лизин-а-оксидаза, а затем велись его систематические исследования.

Для практического применения какого-либо вещества, как в терапевтических, так и в аналитических целях важно располагать как можно более широкой информацией о его свойствах и возможных областях и формах использования. Именно это и определило широкий спектр направлений, по которым велись исследования Ь-лизин-а-оксидазы в данной диссертационной работе.

К недостаткам традиционных терапевтических препаратов можно отнести то, что они циркулируют по организму без преимущественного накопления в пораженном органе. Из-за распределения лекарства по всему организму приходится использовать более высокие дозы. Результатом применения повышенных доз и неспецифических превращений, в которые вступают лекарства, являются различные нежелательные побочные эффекты. Известно, что связывание молекул лекарственных препаратов с векторными молекулами, направляющими их транспорт в организме к какому-либо одному органу позволяет значительно увеличить эффективность терапевтического действия при снижении используемых доз. Поэтому представлялось актуальным создать конъюгаты Ь-лизин-а-оксидазы с векторными молекулами.

Ь-Лизин, будучи незаменимой аминокислотой, является одним из важных компонентов в кормовых добавках, наборах для парентерального питания, питательных средах культуры клеток и т. д. Его обширное промышленное производство делает актуальной задачу быстрого и специфического определения концентрации Ь-лизина в культуральной жидкости и готовой продукции. Поскольку Ь-лизин-а-оксидаза весьма эффективно действует только на Ь-лизин и почти не оказывает влияния на скорость окислительного дезаминирования других природных аминокислот -структурных аналогов Ь-лизина, представлялось перспективным использовать ее для определения концентрации этой незаменимой аминокислоты.

Цель и задачи работы. Цель работы состояла в изучении ряда физико-химических и биологических свойств противоопухолевого фермента Ь-лизин-а-оксидазы и в разработке путей его эффективного использования. В задачи исследования входило:

1. Изучение таких свойств фермента, как зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстратов и ингибиторов, рН, температуры, термостабильность фермента и стабильность при хранении, которые важно знать для эффективного использования фермента на практике.

2. Создание нерастворимых иммобилизованных препаратов Ь-лизин-а-оксидазы и исследование возможности их использования в аналитических целях для определения концентрации важной для полноценного питания человека и животных аминокислоты - Ь-лизина.

3. Изучение противоопухолевых свойств Ь-лизин-а-оксидазы и определение основных характеристик ее противоопухолевого действия.

4. Разработка оптимальных методов конъюгации Ь-лизин-а-оксидазы с антителами. Получение конъюгата фермента с моноклональными антителами и изучение его цитотоксических свойств.

Решение поставленных задач осуществлялось в исследованиях, которые проводились в сотрудничестве с рядом научно-исследовательских центров в России и за рубежом: НИИ Прикладной энзимологии (г.Вильнюс), ОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, кафедрой химической энзимологии МГУ им. М.В.Ломоносова, кафедрой биохимии университета г.Турку (Финляндия), кафедрой биофизики С.-Петербургского государственного университета.

Научная новизна. Получены данные о стехиометрии реакции, катализируемой Ь-лизин-а-оксидазой из ТпсНойегта каггшпит Ш/т, субстратной специфичности, каталитических свойствах этого фермента.

Впервые показано, что аминокислотные остатки лизина, аргинина, а также карбонильные группы молекулы фермента не играют существенной роли в проявлении Ь-лизин-а-оксидазой ферментативной активности.

Исследована кинетика термической инактивации Ь-лизин-а-оксидазы. Обоснована схема термической инактивации фермента, включающая обратимую денатурацию димерных молекул и их дальнейшую необратимую агрегацию, причем диссоциация молекул Ь-лизин-а-оксидазы на отдельные субъединицы является стабилизирующим фактором, существенно замедляющим процесс инактивации.

Разработаны методы связывания Ь-лизин-а-оксидазы с фотоактивируемыми пористыми мембранами. С целью обеспечения направленного транспорта Ь-лизин-а-оксидазы в организме созданы оригинальные методы получения водорастворимых конъюгатов фермента с антителами, которые обеспечивают сохранение каталитической активности, иммунологических и цитотоксических свойств.

Получены приоритетные данные о противоопухолевом действии Ь-лизин-а-оксидазы на перевивные опухоли мышей.

Научная ценность некоторых решенных в работе проблем имеет общетеоретическое значение. В частности, исследование механизма термоинактивации Ь-лизин-а-оксидазы и обнаружение немонотонного роста ферментативной активности с повышением температуры представляют интерес для теории энзимологии.

Практическая ценность работы. При сравнительном изучении физико-химических свойств гомогенных препаратов ЛО, полученных как из глубинно, так и из поверхностно выращенной культуры гриба Тпскойегта катапит Ш/т, показано, что эти свойства идентичны; следовательно, более экономичный и удобный в полупромышленных условиях способ глубинного выращивания гриба может быть использован и рекомендован для продуцирования фермента.

Результаты изучения физико-химических свойств ЛО из Тпско(1егта катапит Ш/т легли в основу разработки более экономичных, чем первоначальный, методов очистки фермента, а также различных способов иммобилизации ЛО на нерастворимых носителях и конъюгации фермента с моноклональными антителами.

Экспериментально показано, что ЛО может быть практически использована для определения концентраций незаменимой для человека и животных аминокислоты Ь-лизина. Получены иммобилизованные препараты фермента и доказана их эффективность при использовании в составе биосенсоров, проточного ферментного анализатора, а также для неинструментальной оценки содержания Ь-лизина.

Приоритетные данные о наличии у ЛО антипролиферативной и антиметастазной активности (Авторское свидетельство №1660387) легли в основу программы дальнейшего детального изучения противоопухолевой активности ЛО.

В экспериментах in vivo, проведенных в ОНЦ РАМН, впервые получены данные о наличии у JIO более широкого спектра антиопухолевого действия и отличного от спектра действия L-аспарагиназы; эти результаты могут служить основой для разработки терапевтических средств на основе JIO.

Внедрение в практику. По материалам диссертации получено 4 авторских свидетельства, 2 акта об использовании изобретений и 5 актов об испытании L-лизин-а-оксидазы. L-Лизин-а-оксидаза использована для серийного изготовления универсальных ферментных биосенсоров "ПЛАГ-Г' (НПО Фермент, Вильнюс) и Арфа (Ереванский гос. университет).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Физико-химические и каталитические свойства L-лизин-а-оксидазы, могут служить базисом для дальнейшего эффективного использования этого фермента в терапевтических целях.

2. Разработка методов иммобилизации L-лизин-а-оксидазы и путей использования иммобилизованных препаратов для определения концентраций незаменимой аминокислоты L-лизина.

3. Сравнительная оценка противоопухолевого действия двух ферментов L-лизин-а-оксидазы и L-аспарагиназы.

4. Методы получения водорастворимых конъюгатов L-лизин-а-оксидазы с моноклональными антителами. Данные о цитотоксической активности этих конъюгатов.

Связь исследований с научной программой.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований следующих научных программ. Программа ГКНТ "Каталитические и биологические свойства ферментов катаболизма аминокислот (лизин, орнитин, метионин, глутамин, аспарагин) как основа для разработки противоопухолевых агентов", № 305008. Программа "Университеты России": "Исследование физико-химических и биологических свойств противоопухолевых ферментов L-лизин-а-оксидазы и глутамин(аспарагин)азы", №305006. Программа "Университеты России": "Проведение фундаментальных исследований в области молекулярных основ развития высших организмов в норме и патологии, исследование основных механизмов регуляции клеточного метаболизма и дифференцировки клеток", №901611. Научная программа Министерства образования Российской Федерации и Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова «Фундаментальные исследования высшей школы в области естественных и гуманитарных наук. Университеты России»: "Поиск путей создания новых лекарственных средств, наделенных свойствами высокой специфичности и направленного транспорта в организме", №304823; № гос.регистрации 030502-1-075.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на III Всесоюзном совещании по аминокислотам (Ереван, 1984), Всесоюзной конференции по применению ферментов в биохимических анализах (Паланга, Литовская Республика, 1984), III Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР "Проблемы современной биохимии" (Берлин, 1985), V Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии (Кобулети, 1985), 14 International Cancer Congress (Будапешт, Венгрия, 1986), 17 FEBS Meeting (Берлин, 1986), Всесоюзной конференции "Методы получения, анализа и применения ферментов" (Рига, 1989), Всесоюзной конференции "Химические сенсоры" (Ленинград, 1989), V Конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (Ташкент, 1991), 9th Vitamin В6 and Carbonyl Catalysis Meeting (Капри, Италия, 1994), V Международном симпозиуме по аналитической химии (Москва, 1995), International workshop on Peroxidase: Biotechnology and Application (Пущино, 1995), International workshop on Peroxidase: Biotechnology and Application (С.Петербург, 1996), Международном симпозиуме "Биокатализ-98", (Москва, 1998), Международном симпозиуме Protein structure, stability and folding.

14

Fundamental and medical aspects» (Москва, 1998), VI Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1999), Международном симпозиуме "Биокатализ-2000", (Москва, 2000), 18 International Congress of Biochemistry and Molecular Biology (Бирмингем, Великобритания, 2000), 1-й Всероссийской конференции "Развитие научных исследований на медицинских факультетах университетов России (Москва, 2001), 27-м Конгрессе FEBS (Лиссабон, Португалия, 2001).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 47 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения полученных материалов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 226 страницах машинописного текста, содержание иллюстрировано 31 таблицей и 45 рисунками. Список цитированной литературы составляет 188 источников.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Лукашева, Елена Васильевна

ВЫВОДЫ

1. При изучении физико-химических свойств показано, что молекула Ь-лизин-а-оксидазы из ТпсНос1егта Натапит Ш/ш представляет собой димер, состоящий из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой 56000 Да, каждая из которых содержит одну молекулу ФАД. Изоэлектрическая точка фермента 4,25. На одну молекулу фермента приходится 3-4 углеводных остатка.

2. Определена стехиометрия ферментативной реакции: при действии Ь-лизин-а-оксидазы на Ь-лизин поглощается эквимолярное количество кислорода и образуются эквимолярные количества аммиака, а-кето-в-аминокапроата и перекиси водорода, поэтому Ь-лизин-а-оксидазу можно считать типичной оксидазой Ь-аминокислот. Способность избирательно понижать концентрацию Ь-лизина и образовывать перекись водорода указывает на перспективы его практического применения в онкологии, поскольку некоторые опухолевые клетки особенно чувствительны к понижению уровня отдельных аминокислот, а перекись водорода является известным цитотоксическим агентом.

3. Ь-лизин-а-оксидаза обладает высокой специфичностью действия по отношению к незаменимой аминокислоте Ь-лизину и практически не действует на другие аминокислоты. Низкое значение Км (0,014 мМ) по отношению к Ь-лизину доказывает способность фермента эффективно расщеплять эту аминокислоту даже при ее низких концентрациях.

4. Кинетическая схема, удовлетворяющая полученным в работе экспериментальным данным, предполагает независимое связывание двух субстратов (лизина и кислорода) с различными участками активного центра Ь-лизин-а-оксидазы с образованием тройного фермент-субстратного комплекса. Аминокислотные остатки аргинина и лизина не играют существенной роли в проявлении Ь-лизин-а-оксидазой каталитической активности.

5. Ь-Лизин-а-оксидаза характеризуется высокой термостабильностью. В основе механизма термической инактивации Ь-лизин-а-оксидазы, лежат процессы агрегации димерных молекул фермента. Диссоциация димерной молекулы фермента на отдельные субъединицы является стабилизирующим фермент фактором.

214

6. Разработаны методы совместной иммобилизации L-лизин-а-оксидазы и пероксидазы хрена на пористых мембранных носителях а) фотоактивацией матрицы, б) путем адсорбции фермента на противоположно заряженной матрице. Показано, что оптимальным методом совместной иммобилизации двух ферментов является связывание с положительно заряженной найлоновой мембраной L-лизин-а-оксидазы и модифицированной иммуноглобулином пероксидазы хрена.

7. Нативная L-лизин-а-оксидаза из Trichoderma harzianum Rifai, а также ее иммобилизованные препараты могут быть эффективны при определении концентраций L-лизина. Наиболее чувствительным является хемилюминисцентный метод с их использованием.

8. Найден оптимальный метод связывания L-лизин-а-оксидазы с антителами, приводящий к получению конъюгатов с максимальной ферментативной активностью.

9. Получены конъюгаты L-лизин-а-оксидазы и моноклональных антител к рецепторам оухолевых клеток с сохранением 65% ферментативной активности и практически полным сохранением иммунологической активности. Показано в опытах in vitro, что связывание фермента с антителами не приводит к исчезновению цитотоксической активности.

10. L-Лизин-а-оксидаза наделена более широким спектром противоопухолевой активности, отличным от спектра действия единственного фермента, используемого в настоящее время в онкологии, -L-аспарагиназы. Наиболее чувствительными являются следующие опухоли: асцитная гепатома 22, аденокарцинома молочной железы Са-755, меланома В-16, рак шейки матки РШМ-5, аденокарцинома толстой кишки АКАТОЛ.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые ЛО была получена в Японии из штамма Trichoderma viride Y244-2. Были изучены свойства фермента и продемонстрирована его антипролиферативная активность в отношении клеточных линий L5178Y и противоопухолевая активность в отношении лейкемии мышей L1210 (Kusakabe Н с соавт., 1979а, 19796). Отсутствие возможности производить ЛО в нашей стране явилось основанием для поиска отечественного штамма-продуцента, который был найден на нашей кафедре в 1981 г.

Настоящая диссертационная работа представляет обобщение (начиная с 1982 г.) экспериментальных результатов по исследованию нового противоопухолевого фермента L-лизин-а-оксидазы штамма Trichoderma harzianum Rifai.

Первоначально мы получали ЛО из водного экстракта поверхностно выращенной в нашей лаборатории культуры гриба Trichoderma harzianum Rifai по разработанной нами методике, которая была значительно проще, чем способ, предложенный японскими исследователями (шесть стадий и выход 8%) и позволяла за счет четырехстадийной очистки получать гомогенный фермент с удельной активностью 29 Е/мг и выходом 22,4%. Мы установили, что молекула ЛО состоит из двух субъединиц с молекулярной массой 60000 Да, каждая из субъединиц содержит прочно, но не ковалентно, связанный ФАД в качестве кофермента. Прочное связывание кофермента положительно характеризует фермент в плане его практического применения, так как при его введении в организм не будет происходить диссоциация с образованием свободного кофермента и холофермента. На поверхности молекулы ЛО определяются всего три аминогруппы из 43 аминогрупп аминокислотных остатков лизина, входящих в молекулу фермента. Экранирование свободных аминогрупп, вероятно, сохраняет молекулу фермента от модификации наделенным карбонильной группой продуктом реакции.

Для широких предклинических исследований требовалось располагать большими количествами гомогенного фермента. Поэтому на нашей кафедре был разработан регламент выращивания культуры гриба в ферментере, а позже нами совместно с НПО "Фермент" был создан значительно более простой метод очистки фермента, состоящий из 3 стадий, позволивший повысить выход до 56 %.

Существовали опасения, что фермент из глубинно выращенной культуры гриба отличается от препарата из поверхностно выращенной культуры и не может использоваться для продолжения начатых испытаний противоопухолевой активности. Нами было проведено сравнительное исследование двух препаратов ЛО и показано, что по молекулярной массе, изоэлектрической точке и субстратной специфичности они идентичны, и поэтому далее исследования проводили с ферментом из глубинно выращенной культуры гриба Тг1скос1егта НаЫапит Ш/са.

В природе существует немало ферментов, которые действуют на Ь-лизин. В связи с этим, изучение стехиометрии реакции, катализируемой гомогенным ферментом, являлось важным этапом в его изучении. Полученные данные указывали на то, что ЛО является типичной оксидазой Ь-аминокислот. В ходе реакции на 1 моль расщепленной аминокислоты и поглощенного кислорода образуются эквимолярные количества а-кето-в-аминокапроата, аммиака и перекиси водорода.

Исследование субстратной специфичности ЛО показало, что в основном, ЛО катализирует окислительное дезаминирование Ь-лизина с весьма низкой Км= 0,014 мМ и высоким значением молекулярной активности (число оборотов 3600 мин"1). В незначительной степени, фермент действует на Ь-аргинин и Ь-орнитин. Узкая субстратная специфичность положительно характеризует ЛО как в плане практического применения в аналитических целях, так и в плане его перспективности в онкологии, где избирательное снижение концентраций эссенциальных факторов может являться причиной гибели быстро растущих клеток опухоли. Накопление перекиси водорода в ходе реакции также является положительным фактором, так как перекись водорода является известным цитотоксическим агентом.

Для практического использования ферментов важно, чтобы они были стабильны. Исследование показало, что ЛО наделена высокой термостабильностью, например, остаточная активность после инкубации в плазме человеческой крови при 60°С в течение 2-х часов составляет более 75%. Изучение механизма термоинактивации позволило сделать вывод, что решающую роль в процессе инактивации играет ассоциация денатурированных димерных молекул белка. Стабилизирующим фактором является диссоциация молекул ЛО на отдельные субъединицы, поэтому в разбавленных растворах ЛО существенно стабильнее.

При хранении в лиофилизированном виде или в замороженном растворе ЛО сохраняется в течение года без заметного изменения активности, чем она выгодно отличается от многих белковых препаратов.

Полученные в работе данные о свойствах ЛО могли служить базисом не только для ее дальнейшего использования в онкологических целях, но также и для разработки методов определения концентраций Ь-лизина с ее применением.

Ь-Лизин является незаменимой аминокислотой, выполняет ряд уникальных функций в организме человека и представляет важный компонент пищевых добавок для человека, животных, компонент питательных сред и наборов для парентерального питания, поэтому в мире развито крупнотоннажное производство этой аминокислоты. Нами было разработано несколько способов определения концентраций Ь-лизина с использованием нативной ЛО, но, как известно, недостатком таких методов является невозможность многократного использования фермента. Поэтому мы создали методы иммобилизации ДО на стандартных пористых мембранных носителях и подобрали условия их использования в аналитических целях. Разработанные методы определения (в зависимости от системы) позволяют быстро (2-20 мин) детектировать концентрации Ь-лизина, начиная от 3 мкМ и являются значительно более чувствительными, чем методы на основе других ферментов (например с использованием другого фермента - Ь-лизинмонооксигеназы можно достичь чувствительности 1000 - 10000 мкМ).

Данные о физико-химических и каталитических свойствах ДО указывали на перспективность возможного применения ДО в онкологии:

Исследование действия ДО на рост опухолей мышей и крыс позволило из двенадцати тестированных опухолей выявить пять наиболее чувствительных: асцитную гепатому 22А, аденокарциному молочной железы Са-755, меланому В-16, рак шейки матки РШМ-5, аденокарциному толстой кишки АКАТОЛ. Эффективность ДО подтверждена четырьмя актами об испытаниях противоопухолевой активности, выданными РОНЦ им.

Н.Н.Блохина, НИИ проблем онкологии им. P.E. Кавецкого (Киев), НИИ онкологии МЗ ЛитССР (Вильнюс).

Сравнение с противоопухолевой активностью единственного фермента, используемого в онкологии показало, что L-аспарагиназа была высокоэффективна только при лечении лимфаденоза L-5178Y. На других гемобластозах и асцитных опухолях ее эффект был незначительным или отсутствовал. Поэтому можно сделать вывод, что в отношении перевиваемых опухолей мышей и крыс ЛО при применении относительно низких терапевтических доз, имеет оригинальный и более широкий спектр противоопухолевого действия. В основе этих различий скорее всего лежат совершенно разные биохимические процессы, который каждый из этих ферментов затрагивает при введении в организм.

Анализ токсического действия (характер и сроки гибели) ЛО на мышах с опухолью при ежедневном парентеральном введении в большом диапазоне доз дает основание считать, что ЛО является малотоксичным веществом.

Стратегия создания современных терапевтических средств предполагает, во-первых, отбор веществ, которые действуют в организме с максимальной избирательностью, а во-вторых, реализацию целенаправленного транспорта лекарства к пораженным тканям. В настоящей диссертационной работе показано, что нативная ЛО действует специфично на свой субстрат, поэтому в организме исключено ее воздействие на какие-либо другие вещества, кроме свободного L-лизина; что касается возможности направленного транспорта в организме, то, естественно, свободный фермент не наделен этим свойством. Общим путем придания лекарственному препарату сродства к какому-либо органу является его конъюгация с определенной молекулой-вектором. Наилучшими константами связывания с лигандами клеток-мишеней наделены антитела, которые и были выбраны для конъюгации с ферментами. Для создания противоопухолевых препаратов направленного действия нами были предварительно на неспецифических

212 антителах разработаны способы их конъюгирования с ДО. После этого были получены конъюгаты ДО с моноклональными антитителами ICO-80 к рецепторам CD-10 клеток линии Yurkat. Нам удалось получить конъюгаты, которые сохраняли ферментативную, иммунологическую и большую часть цитотоксической активности.

Следует отметить, что опыты по изучению цитотоксической активности конъюгатов с антителами были проведены на культуре тканей, а in vivo эффективность конъюгатов со специфическими антителами возможно будет возрастать благодаря сродству к определенным типам клеток.

Результаты проведенных исследований убеждают в целесообразности дальнейших углубленных исследований нового противоопухолевого фермента L-лизин-а-оксидазы Trichoderma harzianum Rifai с целью возможного внедрения в онкологическую практику.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Лукашева, Елена Васильевна, Москва

1. Алексеев С.Б., Смирнова И.П., Березов Т.Т. // Вопр.мед.химии Т.43. - С.112-115.

2. Березин И.В., Антонов В.К., Мартинек К. // Иммобилизованные ферменты. -М.: изд-во МГУ, 1976. Т.1. - Ш"С.

3. Березин И.В., Мартинек К. // Введение в прикладную энзимологию. М., 1982. - 382С.

4. Березов Т.Т. Проблема энзимотерапии опухолей // Вестн. АМН СССР. -1971. -№11. -С. 35-46.

5. Березов Т.Т. Ферментная терапия опухолей // Вестн. АМН СССР. 1984. - №8. - С.13.

6. Березов Т.Т. Биохимические основы энзимотерапии опухолей // Актовые речи ученых Университета. М.: УДН, 1989. - С. 3-15.

7. Березов Т.Т., Зверев В.В., Зайцев И.З., Алексеев С.Б. // Бюлл.экспер. биол. мед. 1997 - Т.123.-С.36-38.

8. Дикова Е.Г., Гаврилова Е.М., Егоров A.M. // Биоорганическая химия. -1990. Т.16. - С.476-481.

9. Добриков М.И., Тенетова Е.Д., Шишкин Г.В. // Биотехнология, 1991, №1, с.80-83.

10. Ю.Жуковский А.П., Ровнов Н.В., Халоимов А.И. // Биофизика. 1984. - Т.29. -С.586-589.

11. Жуковский А.П., Халоимов А.И., Ровнов Н.В., Раев А.Н. // Биофизика. -1987.-Т.32. С.583-587.

12. Краева Н.К., Кинощук A.M., Лужков A.M., Березов Т.Т., Чугуев И.И., Роговер B.C., Смирнова И.П., A.C. 1398448,1990 МКИ С12 N 9/04.

13. Лаугалене Н.Ф., Веса B.C., Янкявичене Р.П., Пуоджюте С.П., Суджювене О., Песлякос И.И., Хадуев С.Х. //Вопр. мед. химии. -1990. Т.36. - С. 88-90.

14. Лукашева E.B. Микросферические формы иммобилизованного химотрипсина получение, свойства, применение: диссертация канд.хим.наук. -М.,1980. -194. Михалина Т.В. // Известия СО АН СССР. 1988. - №9. - С.92-95.

15. И.Николаева Т.Г., Тимофеев И.В., Добрынин Я.В. // Эксперим. онкология.1984. -Т.6. -С. 52-55.

16. Потапова О.Л., Смирнова И.П., Веса B.C. и др. // Вопр.мед.химии. 1992. -Т.З. -С.9-13.

17. Смирнова И.П., Березов Т.Т., Чекунова Л.Н. Штамм Trichoderma harzianum Rifai продуцент L -лизин-сс-оксидазы // A.C. № 3425640/13, 1982, МКИ C12N 15/00.

18. Смирнова И.П., Хадуев С.Х. // Микробиология. 1984. - Т.53. - С. 163-164.

19. Смирнова И.П., Березов Т.Т., Лукашева Е.В., Хадуев С.Х. Способ получения экстракта оксидазы L-аминокислот // A.C. № 3730413/13, 1985, МКИ C12N 9/00.

20. Смирнова И.П., Луцак Н.О. . // Энзимология опухолей. М. : изд-во УДН,1985. С. 67-73.

21. Смирнова И.П., Хадуев С.Х. // Энзимология опухолей. М. : изд-во УДН, 1985. - С. 73-77.

22. Смирнова И.П., Березов Т.Т. // Микробиология. 1987. - №4. - С.708-710.

23. Смирнова И.П., Потапова О.Л. // Биотехнология. -1991. №2 - С. 25-26.

24. Смирнова И.П., Алексеев С.Б., Березов Т.Т. // Вопр. мед. химии. 1996. -Т.42.-С.211-216.

25. Смирнова И.П., Диордитца C.B., Алексеев С.Б., Зайцев И.З. // Вопр. мед. химии, 1998, т.44, с.384-387.

26. Смирнова И.П., Алексеев С.Б., Диордитца C.B., Веса B.C., Зайцев И.З. // Бюлл.экспер. биол. мед. 1999. - Т.128. - С.654-656.

27. Хадуев С.Х. Структура, состав и свойства L-лизин-а-оксидазы гриба Trichoderma sp.: Диссертация докт.мед.наук. М, 1991,148 с.

28. Хадуев С.Х., Глазкова Т.Ю., Веса B.C., Лаугалене Н.Ф., Пуоджюте С.П., Денис Г.И., Юрченко Н.Я., Березов Т.Т. // Бюлл.экспер.биол.мед. 1989. -№10. - С.476-477.

29. Хадуев С.Х., Уманский В.Ю., Залеток С.П., Балицкий К.П., Берлинских Н.К., Березов Т.Т. // Бюлл.экспер.биол.мед. 1990. - №5. - С.458-459.

30. Хадуев С.Х., Уманский В.Ю., Веса B.C., Синкаи К., Акедо X., Березов Т.Т. //Бюлл. экспер. биол.мед. -1991 №10. - С.419-422.

31. Хадуев С.Х., Жукова О.С., Добрынин Я.В., Сода К., Березов Т.Т. // Бюлл.экспер.биол.мед. 1986. - №5 - С.603-604.

32. Хадуев С.Х., Жукова О.С., Добрынин Я.В., Сода К., Березов Т.Т. // Бюлл.экспер.биол.мед. 1987 - №4 - С.458-460.

33. Янкевич Н.Б., Пуоджюте С.П., Лаугалене Н.Ф., Веса B.C. Хадуев С.Х. Березов Т.Т. Способ получения L-лизин-а-оксидазы // A.c. 1454846 (СССР), 1988.-МКИ С 12 1/4, 9/06.

34. Хачатрян Г.Э., Симонян А.Л. // Биохимия. 1988. - т.53. - С. 1256-1264.

35. Andrews P. // Biochem.J. 1964. - V.91. - P.222-233.

36. Aretz W., Sauber К. // III Eur. Congr. Biotechnol., München, 1984. V.l, P. 445-450.

37. Barlogie В., Spitzer G., Hart I.S. et al. // Blood. 1976. - V.48. - P. 245-258.

38. Bernheim F., Bernheim M.L.C., Webster M.D. // J.Biol.Chem. 1935. - V.l 10. -P.165.

39. Blanchard M., Green D.E., Nocito V., Ratner S. // J. Biol. Chem. 1944. -V.155.-P.421.

40. Blanchard M., Green D.E., Nocito V., Ratner S. // J. Biol. Chem. 1945. -V.161 . -P.583-597.

41. Blanchard M., Green D.E., Nocito V., Ratner S. // J. Biol. Chem. 1946 - V.163. - P.137-144.

42. Blashko H„ Hope D.B. // Biochem. J. 1956 - V.62. - P.335-339.

43. Boulanger P., Bertrand J., Osteux R. // Biochim. Biophys. Acta. 1957. - V.26. -P.143-145.

44. Boulanger P., Osteux R. // Biochim.Biophys.Acta. 1956. - V. 21. - P.552-561.

45. Braganca B.M., Quastel J.H. // Arch. Biochim. Biophys. 1952. - V.40. - P. 130.

46. Bright H.J., Porter D.J.T. // in: The Enzymes (ed.Boyer P.D.), 3-rd edn. N.Y, S.-Francisco, London: Academic Press, 1975. - V.12. - part B. - P.421-505.

47. Burton K. //Biochem. J. 1952. - V.50. - P.258-268.

48. Christman M.F., Cardenas J.M. // Experientia.- 1982. V.38. - P.537-538.

49. Coles C.J., Edmondson D.E., Singer T.P. // J. Biol. Chem. 1977 - V.252. -P.8035-8039.

50. Combs S.H., Morgan C.D., Everse J. // Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 1993. -V.204. - P.306-311.

51. Davrill M.D., JungM.-L., Duportail G., Lohez M., Han K.K., Bieth J.G. //J.Biol.Chem. 1984. - V.259, p.3851-3857.

52. De Kok A., Ravitch A.B. // Biochemistry. 1969. - V.8. - P.1405-1411.

53. De Kok A., Veeger C. // Biochim. Biophys. Acta. 1967. - V.131. - P.589-592.

54. De Kok A., Veeger C. // Biochim. Biophys. Acta. 1968. - V.l 17. - P.35-47.

55. DeSa R.J., Gibson Q.Y. // in: Flavins and Flavoproteins (ed. Slater E.C.). N.Y: Elsevier Publ., 1966. - BBA Library. - V.8. - P.236.

56. Deeman F.J., Riordan J.F. // Biochemistry. 1974. - V.13. - P.2865-2871.

57. Di Paolantonia C.L., Arnold M.A., Rechnitz G.A. // Anal. Chim. Acta. 1981 -V.128.-P. 121.

58. Dubois M., Yilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. // Analyt.Chem. -1956 V.28. - P.350-356.

59. Duerre J.A., Chakrabarty S. // J. Bacteriol. 1975. - V.121. - P.656-663.

60. O.Engelsma J.W., Meulen J.D., Slump P., Haagsma N. // Lebensmitt.-Wiss.+Technol. 1979. - V.12. - P.203-207.l.Eyzaguirre J.(Ed.) Chemical Modification of Enzymes. // New-York: J. Willey, 1987.

61. Fields R. // Biochem.J. -1971. V.124 - P.581-590.

62. Fields R., Dixon H.B.F. //Biochem.J. -1971 V.121. - P.587.

63. Foster M., Harrison J.H. //Biochem.Biophys.Res.Communs. 1974. - M.58. -P.263-267.

64. Fujisawa S., Hori K., Miyazawa K., Ito K. // Bull. Jap. Soc. Sci.Fisheries. -1982.-V.48.-P. 97-103.

65. Fung K.W., Kuan S.S., Sung H.G., Guilbault G.G. // Anal.Chem. 1979 - V.51. -P. 2319.

66. Gewitz H.-S., Piefke J., Landovska K., Vennesland B. // Biochim. Biophys. Acta. 1980. - V.611.P.ll-26.

67. Goldfarb A.R. //Biochemistry. -1966. V.5. - P.2570-2574.

68. Gorton L. // Electroanalysis . 1995. - V.7. - P. 23-45.

69. Gorton L., Johansson-Pettersson G., Csoregi E., Johansson K., Domingues E., Marko-Vagra G. // Analyst. 1992. - V.l 17,. - P.1235.

70. Greenstein J.P., Birnbaum S.M., Otey M.C. // J. Biol. Chem. 1953 - V.204 -P.307.

71. Guilbault G.G., Lubrano G.J. // Analyt. Chim. Acta,. -1974. V. 69. - P.183-188.

72. Guilbault G.G., Nagi G. // Anal. Lett. 1973. - V.6 - P.301-312.

73. HafiierE.W., WellnerD. //Proc. Nat. Acad. Sei. USA. -1971. V. 68. - P. 987991.

74. Hale P.D., Boguslavski L.I., Skotheim T.A. Liu L.F., Lee H.S., Karan H.I., Lan H.L., Okamoto Y. // in: Biosensors and Chemical Sensors (Eds. P.G. Edelman, J.Wang), ACS Symp.Ser.No.487, 1992. P.l 11-124.

75. Holland V.R., Saunders B.C., Rose F.L., Walpole A.L. // Tetrahedron. 1974. -V.30. - P.3299-3302.

76. Holsenberg J.S. Enzymes as drugs // Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1977. -V.17. - P. 97-116.

77. Holsenberg J.S. Enzyme therapy: problems and solutions // Ann. Rev. Biochem.- 1982.-V.51.-P.795-809.

78. Ito Keiji, Hori Kanji, Miyazawa Keisuke // Hydrobiologia. 1987. - V.151-152.- P.563-569.

79. Jeffrey B.M., Collis G.R. // Comp. Biochem. Physiol. 1980. - V.B65. - P.739-742.

80. Johansson G., Edstrom K., Ogren L. // Analyt. Chim. Acta. 1976. - V.85. -P.55-60.

81. Johansson K.,Kacaniklis V., Marko-Vagra G., Gorton L., Johansson-Pettersson G., Csoregi E. // in: Biosensors-92. Amsterdam: Elsevier, 1992. P.l 19-126.

82. Kacaniklis V., Johansson K., Marko-Vagra G., Gorton L., Johansson-Pettersson G., Csoregi E. // Electroanalysis 1994. - V.6. - P.381.

83. Kagan H.M., Soucy D.M., Zoski C., Resnick D.J. // Arch.Biochem.Biophys. -1983. V.221. - P.158-167.

84. Kearney E.B., Singer T.P. // Arch. Biochem. 1949. - V.21. - P.242-245.

85. Kearney E.B., Singer T.P. // Arch.Biochim.Biophys. 1949 - V. 21. - P. 242, 397.

86. Kelly S., Curulli A., O'Sullivan C., Guilbault G.G., Palleschi G. // Biosens.Bioelectron. 1998. - V.13. - P.1245-1250.

87. Kermasha S., Alii I., Metche M. // Biotechnol. and Appl. Biochem. 1988. -V.10, P.305-313.

88. Khaduev S.Kh., Soda K., Berezov T.T., Ohishi N., Yagi K. // in: Abstrfct Book 42-nd Ann. Meeting of Jap. Soc. of Vitaminology, 1990, Nagoya, Japan.

89. Knight S.G. // J. Bacterid. 1948. - V.55. - P.401-407.

90. Koster J.F., Veeger C. // Biochim. Biophys. Acta. 1968 - V. 167. - P.48-63.

91. Kotaka S. // J. Gen. Physiol. 1962-6. - V.46 - P.1087-1094.

92. Koyama H. // J. Biochem. 1982 - V.92. - P.1235-1240.

93. Koyama H. // J. Biochem. 1983. - V.93. - P.1313-1319.

94. Koyama H. // J. Biochem. 1984a. - V.96. - P.421-427.

95. Koyama H. // Scand. Chimia Acta. 1984b. - V.136. - P. 131-136.

96. Krebs H.A. // Biochem.J., 1935,p.l620.

97. Kusakabe et al. US Pat 4,224,407 . 26.02.1979a

98. Kusakabe H., Kodama K., Machida H., Kuninaka A. // Agrie. Biol. Chem. -19796.-V. 43,-P.337-343.

99. Kusakabe H., Sugi M., Kodama K., Kuninaka A., Yoshino H., Soda K. // Agrie. Biol. Chem. 1979 - V. 43. - P. 1371-1373.

100. Kusakabe H., Kodama K., Kuninaka A., Yoshino H., Soda K. // Agrie. Biol. Chem. 1979r. - V. 43. - P. 1749-1752.

101. Kusakabe H., Kodama K., Kuninaka A., Yoshino H., Soda K. // Agrie. Biol. Chem. 1979s. - V. 43. - P. 2531-2535.

102. Kusakabe H., Kodama K., Kuninaka A., Yoshino H., Soda K. // J. Biol. Chem. 1980a. - V.255. - P. 976-981.

103. Kusakabe H., Kodama K., Kuninaka A., Yoshino H., Soda K. // Agrie. Biol. Chem., 19806. V. 44. - P. 387-392.

104. Kusakabe H., Midorikawa Y., Kuninaka A., Yoshino H. // Agrie. Biol. Chem. 1983a. - V.47. - P.179-182.

105. Kusakabe H., Midorikawa Y., Fujishima T., Kuninaka A., Yoshino H. // Agrie. Biol. Chem. 19836. - V.47. - P.1323-1328.

106. Kusakabe H., Midorikawa Y., Fujishima T. // Agric.Biol.Chem. 1984. - V. 48.-P. 181-184.

107. La Du B.N., Michael P.J. // J. Lab. Clin. Med. 1960. - V.55. - P.491-496.

108. Laber B., Amrhein N. // Analyt. Biochem. 1989 V.181. - P.297-301.

109. Laboure A.V., Manson C., Jouve H., Pelnont J. // J. Bacterid. 1979. -V.137. - P.161-168.

110. Le K.H.D., Villanueva V.R. // Biochim. Biophys. Acta 1978. - V.524. -P.288-296.

111. Leonhardt A., Szwajcer E., Mosbach K. // Appl.Microbiol.Biotechnol. -1985. V.21.- P.162-166.

112. Li Z.Y., Lian E.C. // Toxicon. 1994. - V.32. - P.1349-1358.

113. Lowry O.H., Rosebrough N.I., Farr A.L. et al. // J.Biol.Chem. -1951. V. 193. -P.265-275.

114. Malmstadt H.V., Hadjiioannou T.P. // Anal. Chem. 1963. - V.35. - P.14.

115. Marcus A., Feeley J. // Biochim. Biophys. Acta. -1961. V.46 - P. 600-603.

116. Marcus A., Feeley J. // Biochim. Biophys. Acta. 1962. - V.59. - P. 398-407.

117. Marko-Vagra G., Gorton L., Domingues E., Barcelo D. // Chromatographia. 1993.-V.36.-P.381.

118. Markus A., Feeley J. // Biochim. Biophys. Acta. -1961. V.46. - P.600-603.

119. Markus A., Feeley J. // Biochim. Biophys. Acta 1962. - V.59. - P.398-407.

120. Massey V., Curti B. // J. Biol. Chem. 1967. - V. 242. - P. 1259-1264.

121. Massey V., Ganther H., Brumby P.E., Curti B. // in: Oxidases and Related systems, (ed. King T.E.). N.-Y: Wiley, 1965. - P. 335-357.

122. Massey V., Gibson Q.H. // Fed.Proc. 1964,. - V.23. - P.18.

123. Massey V., Palmer G. //Biochemistry . 1966. - V.5. - P.3181-3189.

124. Massey V.B., Curti F., Muller F., Mayhew S.G. // J. Biol. Chem. 1968. -V.243. - P. 1329-1332.

125. Meger R., Pistorius E.K. // Biochim. Biophys. Acta. 1987. - V.B83. -P.425-433.

126. Meister A.// J. Biol. Chem. 1951 - V.190. - P.269.

127. Meister A. // Methods in Enzymology. 1957. - V.l 11. - P.404.

128. Meister A. // J. Biol. Chem. 1952. - V.195. - P.813.

129. Meister A., Wellner D., Scott S.J. // J. Natl. Cancer Inst. 1960. - V.24. -P.31-49.

130. Meister A., Welner D. // in: The Enzymes (ed. Boyer P.D.). N.-Y: Acad.Press, 1963. - P.609-648.

131. Mosbach R., Koch-Shmidt A.-C., Mosbach K. Immobilization of the enzymes to various acrilic copolimers // Methods in Enzymology (ed. Mosbach K.), N.-Y: Acad.Press, 1976. V.44. - P.383-393.

132. Misono H., Soda K. // Agric. Biol. Chem. 1979/ - V. 43. - P. 337-343.

133. Misono Haruo, Nagasaki Susumi // J.Bacteriol. 1982 - V.150. - P.398-401.

134. Mosmann T. // J. of Immunological Methods. 1983. - V.65 - P.55-63.

135. Muller F.V., Massey V., Heizmann C., Hemmerich P., Lhoste J.-M., Gould D.C. // Eur. J. Biochem. 1969. - V.9. - P.392.

136. Murthy S.N., Janardanasarma M.K. //Mol.Cell Biochem. 1999 - V.197. -P.13-23.

137. Nakane P.K, Kanaoi A. // J. Histochem. Citochem. 1974 - V.22. - P.1084-1091.

138. Nakano M., Danowski T.S. H J. Biol. Chem. 1966. - V.241 - P.2075-2083.

139. Neubecker T.A., Rechnitz G.A. // Anal. Lett. 1972 - V.5 - P. 653.

140. Nishino T., Williams C.H., Massey V. // in: Proc. XI Internat.Congr. Biochem., 1979, Toronto, P.295.

141. Nomura Tsuyoshi, Hikifhi Yasuo, Nakagawa Genkichi // EyrcsKH Karaicy. -1989 T.38. - C.596-600.

142. Otani T.T., Meister A. // J. Biol. Chem. 1956 - V.224 - P.137.

143. Paik W.K., Kim S. // Biochim. Biophys. Acta. 1965 - V.96. - P.66-74.

144. Pelmount J., Arlaund G., Rossat A.V. // Biochimie. 1972. - V.54. - P. 13591374.

145. Pistorius E.K., Kertsch K., Faby S. // Z.Naturforsch.C. 1989. - V.44. -P.370-377.

146. Pistorius E.K., Voss H. // Biochim. Biophys. Acta. 1980. - V. 611. - P.227-240.

147. Ponnudurai G., Chung M.C., Tan N.H. // Arch. Biochem. Biophys. 1994. -V.3132. - P.373-378.

148. Porter D.J.T., Bright H.J. // Biochem. Biophys. Res. Communications. -1972. V.46-P. 564-570.

149. PradaR.A. //Medicina. 1990 - V.23 - P.39-41.

150. Ratner S. // Methods in Enzymology. N.Y.: Acad.Press, 1955 V.2. - P.204-211.

151. Reiken S.R., Bredis D. // Biotechnol. Bioeng. 1990. - V.35. - P. 260-267.

152. Robinson P., Dunnill P., Lilly M. // Biochem.Biophys.Acta. -1971. V.242.- P.659-661.

153. Romette J.L., Yang J.S., Kusakabe H., Thomas D. // Biotechnol. Bioeng. -1983 V.25.-P. 2557-2566.

154. Roshe J., Glahn P.-E., Manchon P., Van Thoai N. // Biochim. Biophys. Acta.- 1959.-V. 35. -P.lll-122.

155. Sakai Y., Yoshida N., Isogai A.,Tani Y., Kato N. // Biosci.Biotechnol. Biochem. -1995. V.59. - P.487-491.

156. Sakai Y., Yoshida N., Tani Y., Kato N. // Biosci.Biotechnol. Biochem. -1996 V.60. - P.150-151.

157. Saurina J., Hernandez-Cassou S., Alegret S., Fabregas E. // Biosens. Bioelectron. 1999. - V.14. - P. 67-75.

158. Saurina J., Hernandez-Cassou S., Alegret S., Fabregas E. // Biosens. Bioelectron. 1999. - V.14. - P. 211-220.

159. Schmid R. D. // Adv. in Biochem. Eng. 1979. - V. 12. - P. 42-109.

160. Shannon P., Curson B. // J. Reprod.Fertility. 1982 - V.64. - P.463-473.

161. Shinishi Torii, Vikikiko Naito, Takashi Tsuruo // J. Biol. Chem. 1997. -V.272. - P.9539-9542.

162. Singer T.P., Kearney E.B. // Arch. Biochim. Biophys. 1950,- V. 29. -P. 190-209.

163. Singer T.P., Kearney E.B. // Arch.Biochim.Biophys. 1951a - V. 33. - P.377-397.

164. Singer T.P., Kearney E.B. // Arch.Biochim.Biophys. 19516. - V. 33. -P.414.

165. Smith A.T., Sanders S.A., Sampson C., Bray R.S., Burke F., Thonneley R.N.F. //In: Plant Peroxidases: Biochemistry and Physiology (ed. Welinder K.G.). Geneve Univ., 1993. - P. 153-168.

166. Soda K., Hirasava T., Fukumura T. // Analyt. Biochem. 1978. - V.87. -P.283-286.

167. Stumpf P.K., Green D.E. // J. Biol. Chem. 1944. - V.153. - P.387.

168. TakedaH., Hagaishi O. //J.Biol.Chem. 1966 - V.241. - P. 2733-2736.

169. Takeda H., Yamamoto S., Kojima Y., Hayaishi O. // J.Biol.Chem. -1969. -V.24. P.2935-2941.

170. Takeo Moriya // Ph.D.Thesis, 1989, Japan.

171. Tan Nget Hong, Saifuddin M. Nomanbhay // Biochemistry International -1989. V.19-P.937-944.

172. Tong S.L., Rechnitz G.A. // Anal. Lett. 1976. - V.9. - P.l.

173. Torii S., Mikihiko N., Tsuruo T. // J. Biol. Chem. 1997 - V. 272. - P. 95399542.

174. Tran N.D., Romette J.L. // Biotech.and Bioeng. 1983. - V.25 - P. 329-340.

175. Uri O., Dany K., Avner B. // Exp.Cell Res. 1982 - V.140. - P.383-388.

176. Volkin D. B., Klibanov A. M. // Protein Function. Oxford: IRL Press, 1989. P.l-24.

177. Weber K., Pringle J„ Osborn M. // Methods Enzymol. 1972. - V.26. - P.3-28.

178. Weissbach H., Robertson A.V., Witkop B., Udenfriend S., // Anal. Biochem. 1960.-V. l.-P. 286.

179. Wellner D., Meister A. // J. Biol. Chem. 1960. - V. 235. - P. 2013-2018.

180. Wellner D., Meister A. // J.Biol.Chem., 1961. V. 236. - P. 2357.

181. Westerberg O., Swenson H. // Acta Chem.Scand.B., 1966. - V.200. -P.820-834.

182. Westerberg O., Wadstrom T. et al. // Biochim.Biophys.Acta. 1967. - V. 133 . p.435-445.

183. Yankeelov J.A. // Methods Enzymol. 1972. - V.25. - P.566-579.

184. Yatsimirskaya E.A., Gavrilova E.M., Egorov A.M. // Anal. Biochemistry. 1993. V.211. - P.274-278.

185. Zeller E.A., Iselin B., Maritz A. // Helv. Physiol. Acta. 1946. - V. 4. -P.233.

186. Zeller E.A., Maritz A. // Helv.Chim.Acta. 1944. - V.27. - P.1888 -1903.

187. Zeller E.A., Maritz A„ Iselin B. // Helv.Chim.Acta. 1945. - V. 28. - P.365-378.