Ингибиторы протеиназ типа Кунитца из картофеля: молекулярное клонирование и экспрессия генов

Сперанская, Анна Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ингибиторы протеиназ типа Кунитца из картофеля: молекулярное клонирование и экспрессия генов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ингибиторы протеиназ типа Кунитца из картофеля: молекулярное клонирование и экспрессия генов"

На пплиах РУКОПИСИ

ии^4В302

Сперанская Анна Сергеевна

ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ ТИПА КУНИТЦА ИЗ КАРТОФЕЛЯ: МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ

Специальность 03.00.04 - «Биохимия»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 О ИТ 2008

МОСКВА 2008

003448302

Работа выполнена в лаборатории биохимии протеолиза Института биохимии им А.Н. Баха РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор ВАЛУЕВА Татьяна Александровна Официальные оппоненты:

доктор химических наук РОТАНОВА Татьяна Васильевна

доктор биологических наук КОРОЛЕВА Ольга Владимировна

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-

химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «_»_2008 г. в «_» часов на

заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Институте биохимии им А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.ЗЗ стр. 1.

Автореферат разослан «_»_2008 г.

кандидат биологических наук

Ученый секретарь диссертационного совета,

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Ингибиторы протеолитических ферментов представляют собой большую группу белков, способных образовывать комплексы с протеиназами, в составе которых ферменты утрачивают свою активность. Белковые ингибиторы протеиназ, обнаруженные у представителей всех доменов живых организмов, на основании особенностей строения их молекул разделяют на структурные семейства, число которых различается в зависимости от принятой системы классификации [Laskovsky&Kato, 1980; Rawlings et al., 2004]. Ингибиторы, принадлежащие к семейству соевого ингибитора трипсина Кунитца (SKTI, soybean Kunitz trypsin inhibitor), широко распространены среди растений различных систематических групп, как однодольных, так и двудольных. Белки этого семейства могут подавлять активность сериновых, цистеиновых или аспартатных протеиназ, помимо этого некоторые из них проявляют активность по отношению к непротеолитическим ферментам, таким, как растительные инвертазы и а-амилазы [Rodenburg et al., 1995; Heibges et al., 2003]. Белки семейства SKTI в большом количестве присутствуют в семенах и запасающих органах растений, а также в механически поврежденных или пораженных фитопатогенами органах растений.

Физиологические функции белков семейства SKTI в организме растений окончательно не установлены, тем не менее, очевидно, что они участвуют в защите растений от патогенных микроорганизмов и насекомых-вредителей. Показано, что белки SKTI могут действовать как на экстрацеллюлярные протеиназы, секретируемые фитопатогенами, так и протеиназы желудочно-кишечного тракта насекомых, которые повреждают растительную ткань [Мосолов, Валуева, 2005]. В связи с новейшими достижениями биотехнологии по созданию растений, обладающих повышенной устойчивостью к вредителям и болезням, изучение белков данного семейства имеет не только теоретическое, но также важное практическое значение.

К настоящему времени накоплено значительное количество сведений о структуре и свойствах белков-ингибиторов семейства SKTI из картофеля {Solanum tuberosum L.), являющегося одной из важнейших сельскохозяйственных культур. Эти белки выделяют в отдельное подсемейство и обозначают PKPI (potato Kunitz proteinase inhibitors). Установлено, что в картофеле белки PKPI представлены многочисленными изоформами, среди которых на основании сходства N- и С-концевых аминокислотных последовательностей выделяют, по крайней мере, пять различных структурных групп, три из которых — PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C — относительно хорошо изучены [Ishikawa et al., 1994; Heibges et al., 2003; Bauw et al., 2006]. Однако структурные особенности белков PKPI, определяющие специфичность взаимодействия с различными протеиназами, остаются малоисследованными. Несмотря на то, что изучены биохимические свойства целого ряда белков PKPI, выделенных из клубней картофеля, их полная первичная структура, как правило, неизвестна. С другой стороны, значительное количество полных аминокислотных последовательностей белков PKPI восстановлено по кодирующим их нуклеотидным последовательностям, но практически отсутствуют данные о биохимических свойствах этих белков. Таким образом, исследование взаимосвязи структуры и свойств новых белков PKPI, является актуальной задачей современной биохимии.

В настоящее время известно около сотни нуклеотидных последовательностей (в основном кДНК), кодирующих белки PKPI из различных сортов картофеля таких, как Provita, Saturna, Bintje, Pentland squire, Superior, Desire; Danshaku, Ulsten Sceptre [Heibges et al., 2003, Gruden et al., 1997; Strukej et al., 1992; Hannapel, 1993; Herbers at al., 1994; Ishikawa et al., 1994; Stiekema et al., 1988]. Показано, что гены ингибиторов PKPI в геноме картофеля, представленные множественными копиями, отличаются высоким уровнем полиморфизма, при этом нуклеотидные последовательностями, относящиеся к трем наиболее изученным группам,

различаются на 88-99 % (PKPI-A), 85-99% (PKPI-B) и 54-99% (PKPI-C). В то же время и последовательности кДНК (или генов) PKPI, обнаруженные в различных сортах картофеля, отличаются друг от друга. Это позволило высказать предположение, что каждый сорт картофеля содержит свой уникальный набор генов PKPI, а различия между ними обусловлены высокой скоростью их эволюции [Heibges et al., 2003]. Информация о структуре ранее не изученных генов PKPI картофеля, а также растений близких видов, представляет значительный интерес, поскольку позволяет судить о процессах их формирования и образования новых форм in vivo.

Цели и задачи работы. Целью работы являлось выделение генов PKPI из генома картофеля сорта Истринский и неклубненосного дикого вида Solanum brevidens Phill. (синоним S. palustre Poepp. ex Schltdl.), их сравнительный структурно-функциональный анализ, а также исследование взаимосвязи между структурой и специфичностью продуктов клонированных генов. Были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

1. Разработать метод полногеномного ПЦР-анализа генов PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C растений рода Solanum, включая установление их числа и структуры. Синтезировать универсальные олигонуклеотидные праймеры, специфичные к высоко консервативным фланговым последовательностям генов, кодирующих белки PKPI, и на их основе создать схему клонирования и реконструкции нуклеотидных последовательностей из набора геномных генов PKPI картофеля сорта Истринский и неклубненосного S brevidens.

2. Провести сравнительный анализ последовательностей реконструированных генов картофеля сорта Истринский и S. brevidens, а также известных по данным литературы последовательностей PKPI других сортов картофеля и видов растений рода Solanum. На основании полученных данных оценить скорость эволюции генов PKPI, а также перспективность поиска новых форм ингибиторов этого подсемейства в других видах растений рода Solanum.

3. Идентифицировать вариабельные и консервативные области в последовательностях генов PKPI, а также «горячие точки» рекомбинации. Усовершенствовать классификацию последовательностей в пределах групп.

Разработать метод ускоренной гетерологичной экспрессии клонированных генов PKPI в Escherichia coli. Получить ряд рекомбинантных белков, кодируемых новыми, ранее не изученными генами PKPI, и охарактеризовать специфичность их действия на протеиназы: трипсин, химотрипсин, субтилизин Карлсберг, протеиназу К, эластазу из лейкоцитов человека (HLE) и папаин.

Научная новизна и практическая значимость работы: Впервые предложен и успешно апробирован метод полногеномного ПЦР-анализа последовательностей генов семейств PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C. Показана возможность его применения для растительных изолятов рода Solanum, включая представителей различных секций, в частности Petota.

Установлены последовательности ряда новых генов PKPI трех структурных групп PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C, кодирующих ингибиторы протеиназ типа Кунитца в геноме картофеля сорта Истринский.

Впервые установлены последовательности генов, кодирующих в геноме неклубненосного S. brevidens (Phill.) белки-ингибиторы протеиназ типа Кунитца, гомологичные белкам PKPI-A и PKPI-B из культурного картофеля. Эти гены обозначены Spls-KPI. Путем сравнительного анализа выделенных нуклеотидных последовательностей генов, а также известных по данным литературы, показано, что различия между последовательностями генов PKPI S. brevidens и S. tuberosum незначительны, а последовательности некоторых генов Spls-KPI и PKPI практически идентичны и кодируют полностью идентичные по структуре белки. Установлено, что нуклеотидные последовательности генов PKPI состоят из мозаично расположенных блоков, характер локализации которых позволяет предположить, что в растениях семейства пасленовых (Solanaceae) гены PKPI подвергаются рекомбинации,

которая и обусловливает природную вариабельность структуры генов, кодирующих белки PKPI в картофеле.

В нуклеотидных последовательностях генов PKPI выявлены консервативные и вариабельные области. На основании анализа доступных в литературе и определенных в настоящей работе последовательностей генов предложена модель блочной организации генов PKPI, согласно которой новые гены возникают в результате рекомбинации и обмена блоками, что сочетается со случайным мутагенезом в районе вариабельных зон. Предложенная модель позволяет объяснить факт природной вариабельности структуры генов PKPI в картофеле и других растениях семейства Solanaceae.

Разработаны методы экспрессии генов PKPI в Е. coli и очистки рекомбинантных продуктов. Выделены, очищены и охарактеризованы рекомбинантные белки PKPI-B10 и PKPI-C2, кодируемые в геноме картофеля сорта Истринский генами PKPI-B10 и PKPI-C2, а также белки Spls-KPI-Bl, Spls-KPI-B2, Spls-KPI-B3, Spls-KPI-B4 и Spls-KPI-B5, кодируемые соответствующими генами в геноме S. brevidens. Показано, что рекомбинантные белки не действовали на протеиназу К, HLE и папаин, но были способны с разной степенью эффективности подавлять активность трипсина, химотрипсина и субтилизина Карлсберг. Показано, что рекомбинантный белок PKPI-B10 способен подавлять рост и развитие фитопатогенного гриба Fusarium culmorum. Сделано заключение о возможности использования выделенных генов, кодирующих исследованные белки, для создания трансгенных растений, устойчивых к действию фитопатогенным микроорганизмов.

Апробация работы и публикации: Основные результаты работы были представлены на III, IV и V Международных конференциях «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Белоруссия, Минск, 2003, 2005, 2007); Международной конференции "Молекулярная генетика, геномика и биотехнология" (Белоруссия, Минск, 2004); Конгрессе общества SISV-SIGA (Италия, Лечче, 2004); XVI и XVII Зимних молодежных научных

школах "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2004, 2005); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы защиты картофеля, плодовых и овощных культур от болезней, вредителей и сорняков» (Белоруссия, Минск, 2005), 1-ом и 2-ом Международном симпозиуме по геному пасленовых (Нидерланды, Вагенинген, 2004; Италия, Искья, 2005); VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007). По материалам диссертации опубликовано 18 работ, из которых— 6 статей и 12 тезисов докладов.

Структура и объем работы: Диссертация изложена на 190 страницах; содержит 39 рисунков и 7 таблиц; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 284 наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Характеристика генов, кодирующих ингибиторы РКР1 в геноме картофеля сорта Истринский

В клубнях картофеля сорта Истринский присутствует изоформы белков РКР1, из которых два белка, Р8Р1-21-5.2 и РБР1-21-6.3 (м. м. 21 кДа), были выделены и подробно охарактеризованы, а два других Р8Р1-22 и РСР1-23 (м. м. 22 и 23 кДа, соответственно) - лишь частично. В настоящей работе проведено клонирование генов РКР1 из генома этого сорта картофеля. Для этого были синтезированы праймеры для независимой амплификации генов, относящихся к трем группам РКР1-А, РКР1-Б и РКР1-С. Праймеры фланкировали области генов, кодирующие полноразмерные зрелые белки, несущие дополнительно в качестве Ы-концевого остаток -Авп, С-концевой остаток сигнального пептида. Кроме того, был синтезирован дополнительный праймер, с помощью которого осуществляли амплификацию фрагментов генов РКР1-С (около 450 п.н. при кодирующей области гена 650 п.н.).

Методом ПЦР-клонирования геномных генов PKPI с использованием праймеров и выделенного из проростков картофеля сорта Истринский тотального генома был создан мини-банк из 79 независимых последовательностей. Их секвенирование и последующий анализ показали, что они являются амплифицированными копиями 18 генов, из которых шесть были отнесены к структурной группе А (PKPI-A1 - PKPI-A6); четыре - к группе В (PKPI-B1, PKPI-B2, PKPI-B9 и PKPI-B10) и восемь — к группе С (PKPI-C1 - PKPI-C8). Для большинства из перечисленных генов, за исключением двух генов (PKPI-C7 и PKPI-C8), были реконструированы последовательности, соответствующие областям, кодирующим полноразмерные зрелые белки. Последовательности PKPI-C7 и PKPI-C8 установлены частично. Кроме того, было показано, что клон С12-9 на >54% отличался от других известных последовательностей PKPI, но на 98% совпадал с уникальной последовательностью кДНК S9C11 [AF460237] из картофеля сорта Saturna, условно отнесенной авторами к группе PKPI-C. Можно предположить, что в геноме картофеля присутствуют гены еще одной группы PKPI-D, кодирующие белки с неизвестными свойствами.

Анализ аминокислотной последовательности, восстановленной по нуклеотидной последовательности гена PKPI-B9, позволил определить, что он кодирует одну из изоформ двухцепочечного белка PSPI-21-6.3, выделенного ранее из клубней картофеля сорта Истринский. Аминокислотные последовательности А- и В-цепей этого белка с 1 по 178 и с 185 по 202 а.о., соответственно, и белка, кодируемого геном PKPI-B9, идентичны. Эти данные позволили заключить, что наличие в структуре белка PSPI-21-6.3 двух полипептидных цепей является результатом посттрансляционного протеолиза по пептидным связям Serl78-Thrl79 и Phel84-Serl85.

Сравнение последовательностей выделенных нами генов и других PKPI, представленных в базе данных NCBI, показало, что большинство генов группы А и все гены группы В из картофеля сорта Истринский либо

полностью совпадали с генами из других сортов картофеля {PKPI-A1, РКР1-АЗ, PKPI-A4, PKPI-A6 и PKPI-B9) либо различались единичными заменами (PKPI-A2, PKPI-Bl, PKPI-B2, PKPI-B10). При этом оказалось, что единственный ген PKPI-A5, имеющий меньшее сходство (95%) с генами из других сортов картофеля, отличался только по одному нуклеотиду от последовательности кДНК Cdi [AF283464], выделенной из паслена черного (S nigrum L.), растения другого вида того же рода. Проведенный сравнительный анализ последовательностей PKPI-A и -В из различных сортов картофеля показал, что большинство из них высоко гомологичны.

Последовательности генов PKPI-C из картофеля сорта Истринский значительно отличались от известных последовательностей той же группы, выделенной из других сортов. Было показано, что последовательности трех генов (PKPI-C5, PKPI-C6, PKPI-CS) и ряда генов из других сортов различались лишь единичными заменами, гены PKPI-Cl, PKPI-C2, PKPI-C3, PKPI-C4 и PKPI-C7 имели существенно меньшее сходство (89-95%) с известными последовательностями PKPI-C.

Таким образом, можно предположить, что скорость эволюции генов PKPI не столь высока, как это предполагалось ранее. Возможно, существующее их многообразие создано ограниченным числом предковых форм, общих для рода Solanum. При этом, разнообразие сочетаний этих генов в геномах картофеля современных сортов можно объяснить сложным происхождением культурного картофеля в результате скрещивания нескольких южноамериканских видов и форм картофеля с привлечением в процессе селекции различных диких видов.

2. Характеристика генов, кодирующих ингибиторы PKPI в геноме Solanum brevidens

Для проверки гипотезы, согласно которой в геноме диких некультивируемых видах Solanum, филогенетически близких к культурному картофелю, содержатся гены идентичные или близкие по структуре генам

PKPI, были клонированы гены, кодирующие белки того же подсемейства из генома неклубненосного вида S. brevidens. Клонирование проводили с помощью праймеров, разработанных для амплификации генов PKPI-A и РКР1-В из культурного картофеля.

Был создан мини-банк из 66 индивидуальных клонов. Определенные путем секвенирования нуклеотидные последовательности полученных клонов были проанализированы. При этом были реконструированы последовательности 11 оригинальных генов, соответствующие областям, кодирующим полноразмерные зрелые белки PKPI. Гены обозначены как Spls-KPI Из этих генов шесть относятся к структурной группе А (Spls-KPI-Al -Spls-KPI-Аб) и пять - к группе В (Spls-KPI-Bl - Spls-KPI-B5).

Сравнение последовательностей генов Spls-KPI и PKPI, выделенных в настоящей работе, а также представленных в базе данных NCBI, показало, что только два гена группы А (Spls-KPI-Al и Spls-KPI-АЗ) и два гена группы В (Spls-KPI-Bl и Spls-KPI-ВЗ) характеризовались относительно невысоким (96-97% идентичных нуклеотидов) сходством с известными последовательностями PKPI-A и PKPI-B из картофеля. Такой же уровень межсортовой вариабельности можно было наблюдать при сравнении последовательностей PKPI-A и -В из разных сортов картофеля.

В то же время, последовательность гена Spls-KPI-A4 была идентичной некоторым последовательностям PKPI-A из картофеля сортов Истринский и Kuras, а гены Spls-KPI-A2, Spls-KPI-A5, Spls-KPI-A6, Spls-KPI-Bl, Spls-KPI-ВЗ и Spls-KPI-B5 отличались от PKPI-A и PKPI-B лишь отдельными нуклеотидными заменами, по характеру и локализации совпадавшими с заменами, отмеченными при сравнении последовательностей PKPI из разных сортов картофеля.

Наличие практически идентичных генов в растениях sect. Petota ser. Potatoe (S. tuberosum), sect. Petota ser. Etuberosa (S. brevidens) и sect. Solanum (S. nigrum), относящихся как к различным сериям Potatoe и Etuberosa секции Petota, так и к разным секциям Petota и Solanum [согласно классификации

рода Solanum, приведенной в базе данных GRIN: http: //www.ars-grin.gov] свидетельствует, скорее, об относительной консервативности генов PKPI в геномах растений рода Solanum.

Эти наблюдения подтверждаются и филогенетическим анализом полноразмерных последовательностей генов, кодирующих белки PKPI из картофеля разных сортов, который проводили стандартными методами молекулярно-генетического анализа (максимальной парсимонии, UPGMA). Оказалось, что последовательности генов и кДНК, обнаруженные в разных сортах картофеля и S. brevidens, распределялись по кластерам случайным образом и не образовывали видо- или сортоспецифичных кластеров.

3. Рекомбинация генов, кодирующих ингибиторы PKPI в растениях рода Solanum

Анализ расположения несинонимичных нуклеотидных замен, которыми отличаются между собой гены PKPI, входящие в состав какой-либо группы, показал, что они часто возникают в одних и тех же позициях и имеют неслучайный характер. Был проведен детальный анализ последовательностей генов PKPI-B и кодируемых ими аминокислотных последовательностей. Характер расположения замен аминокислотных остатков позволил выделить в последовательностях белков PKPI-B консервативные и вариабельные участки (рис. 1). Дальнейший анализ восстановленной структуры белков показал, что некоторые из выделенных вариабельных участков соответствуют областям, включающим реактивные центры. При этом остатки, функциональная значимость которых была ранее показана экспериментально, за редкими исключениями остаются строго консервативными.

U 13 31 49 56 68 98 116 127 147 164

Cons Vaг Cons Var Cons Var Cons Var Var Cons

II II П III III IV IV V V

Рис. 1. Схема распределения консервативных (Cons, обозначены белым цветом) и вариабельных (Var, обозначены серым или темно-серым цветом, в зависимости от числа аминокислотных замен) участков в молекулах белков PKPI-B.

Числами отмечены положения аминокислотных остатков в последовательности белков; R и М - остатки, входящие в состав реактивных центров (Arg68, Metí 16, Met]53); дисульфидные связи Cys49-Cys98 и Cysl47-Cysl64 обозначены одной и двумя звездочками соответственно.

Анализ фрагментов нуклеотидных последовательностей PKPI-B, соответствующих вариабельным участкам, показал, что для каждого участка существует ограниченное число возможных вариантов несинонимичных замен. На дендрограммах сравнения, построенных отдельно для каждого из этих участков, выделялись четкие кластеры, число которых соответствовало количеству возможных вариантов нуклеотидных замен. В то же время наблюдалось очевидное несоответствие результатов распределения по кластерам фрагментов последовательностей PKPI, соответствующих разным вариабельным участкам. Это дало основание предположить, что особенности структуры генов РКР1 могут объясняться их происхождением в результате рекомбинации предковых форм генов.

С помощью программного обеспечения DnaSP 4.0, TOPALi v0.28 и TOPALi v2.19 был проведен поиск в нуклеотидных последовательностях PKPI-B областей, содержащих сайты рекомбинации. Полученные результаты позволили определить в последовательностях PKPI-B области, по которым, вероятно, происходила рекомбинация генов: 1) область 135 н.п. (соответствует положению 45 а.о в белках PKPI); 2) область 170 н.п. (соответствует положению 57 а.о.); 3) область 230 н.п. (соответствует

положению77 а.о.); 4) область 355 н.п. (соответствует положению 118 а.о.) и 5) область 415 н.п. (соответствует положению 139 а.о.).

Проведенный повторный анализ нуклеотидных и кодируемых генами PKPI-B аминокислотных последовательностей с учетом полученных данных о локализации сайтов рекомбинации, позволил определить сходство фрагментов, ограниченных положением установленных точек рекомбинации (рис. 2).

45 57 77 118 139

PKPI-B10 PKPI-B1 PKPI-B2 РКР1-В9

Sbi-KPI-Bl

Sbr-KPI-B2

Sbr-KPl-B3

ar-KPi-B4

P1D4

P4B1

P1G7

P1H5 [ P2F10 i P2G2 P4D11 [ S1C1 рАМбб X64370 [

i i -

Рис. 2. Схема распределения гомологичных участков в аминокислотных последовательностях, кодируемых генами PKPI-B из картофеля сорта Истринский и Provita [Heibges et al., 2003] и генами Spls-KPI-B из S. brevidens

PKPI-B1, PKPI-B2, PKPI-B9 и PKPI-B10 из картофеля сорта Истринский; P1D4, P1G7, Р1Н5, P2F10, P2G2, P4D11, Р4В1 из картофеля сорта Provita [Heibges et al., 2003]: Spls-KPI-B 1, Sp/s-KPI-B2, Spls-KPI-B 3, Spls-KPI-B4 из 5. brevidens. Гомологичные участки последовательностей обозначены серым цветом различной интенсивности. Цифрами указано положение точек рекомбинации. Пунктирной линией обозначены участки последовательностей, анализ которых не проводили.

4. Свойства белков, кодируемых генами PKPI-B10 и PKPI-C2 из Solanum tuberosum сорта Истринский и генами Spls-KPI группы В из Solanum brevidens

Для проверки функциональной активности белков, кодируемых некоторыми из клонированных генов, была осуществлена их экспрессия в культуре клеток Е. coli (штамм BL21(DE3)).

4.1. Гетерологичная экспрессия, очистка и характеристика белка РКР1-В10

Рекомбинантная плазмида для осуществления гетерологичной экспрессии белка PKPI-B10, была создана на основе экспрессионного вектора рЕТ23.

Продукт экспрессии, представляющий собой рекомбинантный белок PKPI-B10, был обнаружен в основном в тельцах включения и в меньшем количестве — в растворимой фракции клеточных белков Е. coli. М. м. полученного белка имела значение около 22 кДа и совпадала с расчетной величиной, составлявшей 21,7 кДа. В клетках контрольных бактерий, трансформированных вектором рЕТ23, не содержащим вставки, белковый продукт с такой м. м. отсутствовал.

Нерастворимая фракция с тельцами включения Е. coli была солюбилизирована в денатурирующем буфере. Проведенные эксперименты показали, что ренатурация белка PKPI-B10 из полученного раствора, содержащего небелковые примеси, приводит к крайне низкому выходу целевого продукта. В связи с этим денатурированные тельца включения были очищены от белковых и небелковых примесей на колонке (2,5x30 см) с Mono Q, уравновешенным 0,05 М трис-НС1-буфером, pH 8,0, содержащем 7 М мочевину. Связавшийся с сорбентом материал элюировали линейным градиентом повышающейся концентрации NaCl от 0 до 1 М в стартовом буфере. Полученный белок был практически отделен от примесей, содержавшихся в клеточном лизате Е. coli.

Было установлено, что фолдинг PKPI-B10 протекает с высокой эффективностью, как при быстром разбавлении денатурирующего раствора, так и при диализе. Основная масса белка была ренатурирована путем диализа против 0,05 М трис-НС1-буфера, pH 8,0. Методом анионообменной FPLC-хроматографии на DEAE-ToyoPearl ренатурированный PKPI-B10 дополнительно очищали до гомогенности. Связавшийся с ионообменником белок элюировали линейным градиентом повышающейся концентрации NaCl от 0 до 1 М. Полученный белок PKPI-B10 по данным DS-Na-ПААГ электрофореза был гомогенным (рис. 3 А).

Активность очищенного белка оценивали по степени подавления активности ферментов (трипсина, химотрипсина, HLE, субтилизина Карлсберг, протеиназы К и папаина) и по влиянию на рост и развитие фитопатогенного гриба Fusarium culmorum.

Было показано, что рекомбинантный белок PKPI-B10 не действовал на HLE, субтилизин Карлсберг и протеиназу К, но эффективно подавлял активность трипсина и в меньшей степени химотрипсина (рис. ЗБ): 1 моль PKPI-B10 реагировал стехиометрически с 1 молем трипсина. В то же время зависимость степени ингибирования химотрипсина от количества добавленного белка PKPI-B10 имела нестехиометрический характер: для достижения 50%-ного ингибирования требовался более чем трехкратный избыток ингибитора.

Белок PKPI-B10 не только подавлял прорастание гиф, но и ускорял разрушение макроконидий гриба F. culmorum, являющегося возбудителем фузариозного увядания картофеля [Попкова и др., 1980] (рис. 4). При добавлении к суспензии макроконидий гриба 160 мкг белка PKPI-B10 длина прорастающих гиф уменьшалась на 50% по сравнению с контролем, а при добавлении 500 мкг обнаруживалось практически полное подавление прорастания макроконидий (кривая 1), которые при этом полностью разрушались (кривая 2).

— 116 — 66.2

— 45

— 35

— 25

— 18.8

2 3

мольУмоль

кДа

Рис. 3. 0$-№а-ПААГ-электрофорез очищенного рекомбинантного белка РКР1-В10 (А) и его влияние на активность трипсина и химотрипсина (Б)

А: I - Белок РКР1-В10, 2 - белки-маркеры (сверху вниз): (3-галактозидаза, БСА, яичный альбумин, лактатдегидрогеназа, эндонуклеаза В8Р981, р-лактоглобулин Б: 1 - химотрипсин, 2 - трипсин. В качестве субстратов для определения ферментативной активности использовали 5ис-С1у-01у-РЬе-рЫа (1) и БАПА (2)

100 =

80 °

3 2 I & 60 5 ¥

20 §

100 200 300 400 500 PKPI-B10, мкг

Рис. 4. Влияние рекомбинантного белка PKPI-B10 на прорастание гиф и лизис макроконидий гриба Fusarium culmorum

1 - размер гиф (% от контроля),

2 - количество лизированных конидий (% поврежденных); представлены средние значения трех независимых экспериментов со стандартной ошибкой от 2 до 10%.

4.2. Гетерологичная экспрессия, очистка и характеристика белка РКР1-С2

Рекомбинантная плазмида для осуществления гетерологичной экспрессии белка РКР1-С2 была создана на основе экспрессионного вектора р<ЗЕ30, содержащего бхШэ-таг на 5'-конце полилинкера.

Ожидаемый продукт экспрессии с м.м. около 22 кДа, близкой к расчетной величине 21,2 кДа для белка РКР1-С2, был обнаружен в тельцах включения, но в основном в растворимой фракции клеточных белков Е. соИ.

В клетках контрольных бактерий, трансформированных вектором pQE30, не содержащим вставки, белковый продукт аналогичный PKPI-C2 отсутствовал.

Очистку нативно фолдировавшегося рекомбинантного белка PKPI-C2, содержащегося в растворимой клеточной фракции, проводили методом металло-хелатной аффинной хроматографии на колонке с Ni-NTA-агарозой. Полученные препараты анализировали с помощью DS-Na-ПААГ-электрофореза (рис. 5А). Активность рекомбинантного белка оценивали по подавлению активности субтилизина Карлсберг, трипсина, химотрипсина и папаина.

Было показано, что рекомбинантный белок PKPI-C2 не действовал на трипсин, химотрипсин и папаин, но подавлял активность субтилизина (рис. 5Б). Однако зависимость степени ингибирования фермента от количества добавленного белка имела нестехиометрический характер: для достижения 50%-ного ингибирования требовался двухкратный избыток ингибитора.

Из клубней картофеля сорта Истринский был выделен и очищен до гомогенного состояния белок PKSI, м. м. которого имела значение около 21 кДа (рис. 5 В). Было показано, что белок PKSI не действовал на трипсин, химотрипсин и папаин, однако эффективно подавлял активность субтилизина Карлсберг (К,=1,67±0,2 нМ). Белок PKSI взаимодействовал с ферментом стехиометрически в соотношении 1:1 (моль/моль) (рис. 5 Г). Методом деградации по Эдману была определена N-концевая последовательность белка, состоящая из 19 аминокислотных остатков, которая совпала с фрагментом последовательности, кодируемой одним из изученных генов группы С.

Ранее в работах нашей лаборатории было показано, что патогенный оомицет Phytophtora infestons (Mont.) de Вагу при выращивании на среде, содержащей белки из клубней картофеля, продуцирует комплекс сериновых протеиназ с субтилизиноподобной активностью [Гвоздева и др., 2004]. Кроме того, было установлено, что в клубнях картофеля в ответ на поражение P. infestons накапливались белки с м.м. около 20-24 кДа [Valueva et al., 1998;

Валуева и др., 2003]. Можно предположить, что белки, кодируемые генами РКР1-С, принимают активное участие в защите картофеля от патогена.

гДз не

9467-

30-

о го

[1]'[Е]. моль/мель

П]'[Е]. моль/моль

Рис. 5. Ds-Na-ПААГ-электрофорез рекомбинантного белка PKPI-C2 (А) и выделенного из клубней белка PKSI (В) и их влияние на активность субтилизина Карлсберг (Б и Г, соответственно).

А: 1 - белки-маркеры, 2 - белки, не связавшиеся с Ni-NTA-агарозой, после нанесения на колонку растворимой клеточной фракции Е. coli, 3 - элюат, содержащий рекомбинантный белок PKPI-C2. Б: влияние на активность субтилизина белка PKPI-C2. В: 1 - белки-маркеры, 2 - белок PKSI. Г": влияние на активность субтилизина белка PKSI. В качестве субстрата для определения ферментативной активности использовали Z-Ala-Ala-Leu-pNa.

4.3. Гетерологичная экспрессия, очистка и характеристика белков, кодируемых генами Spls-KPI-B из S. brevidens

Для проведения гетерологичной экспрессии белков Spls-KPI-Bl, Spls-KPI-B2, Spls-KPI-B3, Spls-KPI-B4 и Spls-KPI-B5, кодируемых соответствующими генами из 5". brevidens, были созданы экспрессионные плазмиды на основе вектора pQE30.

Использованные для этой цели клоны двух генов Spls-KPI-Bl и Spls-KPI-B3 содержали несинонимичные замены по сравнению с последовательностями оригинальных генов. В результате рекомбинантный белок Spls-KPI-Bl содержал одну замену Thrl3—>А1а13, а белок Spls-KPI-ВЗ— две замены: Ser4—>Gly4 и Lysl33—>Argl33. Аминокислотные

последовательности белков Spls-KPI-B2, Spls-KPI-B4 и Spls-KPI-B5 полностью соответствовали белкам, кодируемым оригинальными генами.

После экспрессии в клетки Е. coli белковые продукты с м.м. около 26 кДа, отсутствовавшие у контрольных бактерий, трансформированных вектором pQE30, не содержащим вставки, были обнаружены и в растворимой фракции клеточных белков, и в тельцах включения. Очистку белков растворимой фракции, проводили методом металло-хелатной аффинной хроматографии на колонке с Ni-NTA-агарозой. Полученные белки анализировали DS-Na-ПААГ-электрофорезом (рис. 6). Как видно на рис. 6А в препаратах Spls-KPI-Bl (2) и Spls-KPI-B4 (5) наряду с целевыми белками присутствовали примеси, поэтому они были дополнительно очищены методом анионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Гомогенность белков Spls-KPI-Bl и Spls-KPI-B4 была подтверждена DS-Na-ПААГ-электрофорезом (рис. 6Б).

А Б

«.2 — 66,2 — 45.о — — бййавШа^^^НШг.'. 45.о—

31.0-

Рис. 6. Ов-Ка-ПААГ-электрофорез рекомбинантных белков 8рЬ-КР1-В после очистки на колонке с №-1ЧТА-агарозой (А) и белков 8р1«-КР1-В1 и 8р1«-КР1-В4 после анионообменной хроматографии (Б).

А: 1 - белки-маркеры; 2 - 8р1з-КР1-В1; 3 - ЭрЬ-ЮРГВг; 4 - 8р1з-КР1-ВЗ; 5 - Зрк-КР1-В4; 6 - 8р1з-КР1-В5

Б: 1 - белки-маркеры; 2 - 8р1з-КР1-В1; 3 - 8рк;-КР1-В4

Активность рекомбинантных белков 8р18-КР1-В оценивали по степени

подавления активности трипсина, химотрипсина, НЬЕ и папаина. Было

установлено, что все пять белков не действовали на НГЕ и папаин, хотя с

разной степенью эффективности ингибировали трипсин (таблица). Два из

пяти рекомбинантных белков, 8р18-КР1-В1 и 8р18-КР1-В4, эффективно

подавляли и активность химотрипсина. При эквимолярном соотношении фермент:ингибитор достигалось подавление 50% активности фермента (рис. 7).

Таблица. Ингибирование трипсипа белками 8р18-КР1-В

Белок Концентрация BAÑA, мМ К, (нМ)

Spls-KPI-Bl 0,125 0,25 345,5

Spls-KPI-B2 0,125 0,25 1310,6

Spls-KPI-B3 0,125 0,25 8370

Spls-KPI-B4 0,125 0,25 84,8

Spls-KPI-B5 0,125 0,25 3883,5

интбитор фермент, могъ ноль

Рис. 7. Влияние белков 8р1х-КР1-В1 и 8рк-КР1-В4 на активность химотрипсина

1 - 8рЬ-КР1-В1, 2 - 8р15-КР1-В4 В качестве субстратов для определения ферментативной активности использовали М-8ис-А1а-А1а-Рго-Р11е-рШ.

Сравнение аминокислотных последовательностей полученных рекомбинантных белков и известных поданным литературы белков РКР1, для которых установлены как аминокислотные последовательности, так и их действие на сериновые протеиназы приведено на (рис. 8). Все представленные белки способны подавлять активность трипсина, но различаются по способности действовать на химотрипсин.

Белки РКР1 являются так называемыми «каноническими» ингибиторами сериновых протеиназ и взаимодействуют с ферментами по субстратоподобному механизму. Молекулы ингибиторов этого типа имеют на поверхности специфическую структуру - «петлю связывания», в которой располагается пептидная связь Р1-Р1', образующая реактивный центр ингибитора. Действительно, как видно из данных представленных на рис. 8, в аминокислотных последовательностях всех ингибиторов РКР1-В присутствует консервативный участок, окружающий пептидную связь А^68-РЬс69, который заключен в пептидную петлю, образованную

остатками Суз49-Суз98. Этот участок молекулы ингибитора представляет собой первый реактивный центр и ответственен за связывание трипсина. Тем не менее, следует обратить внимание на то, что белок 8р1э-КР1-В2 оказался способен связываться с трипсином (табл.), несмотря на то, что в положении Р1 остаток А^68 замещен на Бег68. Кроме того, в этом белке присутствует замена аминокислотного остатка в положении РЗ' и значительная делеция, которая могла бы вызывать нарушение структуры петли связывания. Можно предположить, что ингибирование трипсина белками РКР1 может протекать и по другому не субстратоподобному механизму.

В опубликованной ранее работе [Уа1иеуа е1 а1., 2000] было сделано заключение, что в молекуле двухцепочечного белка Р8Р1-21-6.3 пептидная связь между аминокислотными остатками МеИ16-1_еи117 входит в состав второго реактивного центра, ответственного за связывание химотрипсина. Было предположено, что дисульфидная связь между остатками Суз147-Суз164, соединяющая А- и Б-цепи Р8Р1-21-6.3, формирует «каноническую» петлю связывания, в которой располагается пептидная связь реактивного центра связывания химотрипсина (НЬЕ), МеШ6-Ьеи117.

В то же время у белков 8р1з-КР1-В2 и Бр^-КРЬВЗ, в структуре которых «каноническая петля» могла бы сформироваться между остатками Суз 147 и Суэ164 и содержать второй потенциальный реактивный центр связывания химотрипсина, в положении Р1-РГ которого локализованы остатки Меи53-ТЬг154, не было обнаружено антихимотрипсиновой активности. В отличие от них белок Р1Н5, обладающий такими же структурными особенностями, действует как эффективный ингибитор химотрипсина.

Белок 8р1я-КР1-В5, аминокислотная последовательность которого, за исключением Ы-концевых областей, кодируемых последовательностями нуклеотидов, представляющих фрагменты экспрессионных векторов рЕТ23 и р(ЗЕ30, совпадает с последовательностью рекомбинантного белка РКР1-В10, также не проявлял способности действовать на химотрипсин. В то время как белок РКР1-В10 был способен нестехиометрически взаимодействовать с

этим ферментом. Можно предположить, что белки РКР1-В способны слабо нестехиометрически связывать химотрипсин и по трипсинсвязывающему реактивному центру. Возможность такого рода взаимодействия с протеиназой может легко устраняться либо за счет модификации структуры участков молекулы, не связанных прямо с реактивным центром (как в случае с БрЬ-КРЬВЗ и 8р1з-КР1-В5), либо за счет мутаций в реактивном центре (замена А^68-8ег68 в 8рЬ>-КР1-В2).

Наличие антихимотрипсиновой активности у белка 8р15-КР1-В4, в структуре которого в положении Р1 предполагаемого второго реактивного центра связывания фермента остаток МеП53 заменен на Уа1153, и отсутствие такой активности у белков 8р1з-КР1-В2 и БрЬ-КРЬВЗ, в структуре которых в Р1-Р1' положении локализованы остатки Ме1153-ТЬг154, свидетельствует о том, что этот остаток не может быть локализован в реактивном центре и участвовать во взаимодействии белков РКР1 с химотрипсином.

FFPI-B10

Sor-FFI-Вэ

Sbt-FFI-Bl

scr-гя-вг

Scc-FFI-ВЗ

Sbr-Kfl-B4

FSFI-21-6 3

F1D4

F1K5

F4B1

FKFI-BIO

Sbr-FFI-B5

Sbr-FPI-Bl

SCE-FFI-B2

Sor-FFI-ВЗ

Sbr-KFI-B4

FSFI-21-6 3

F1D4

P1HS

F4B1

- С----\T.PSPATPVLDVT5KELDPRT.SYRTTfiTFyCAT.nsnVYLCKSP\SDAt rlNGVFF.

hFGSHHHHHHGSACELM,.FSPAT PVLDVISKELC'FRISYRI ISTF?<GALGGDVYLGF.3FN3DAE .-O.GVFR KFGSHHHHHHCSACTIALPSPATPVLDVASKEIDSRT.gYRTTSTFWSALGGDVYLCKSPNSDAt ANGVFR KFGSHHHHHHGКАСГТЛТ ЕЗПатРУТ.РУТjFEirPFISYRIISTFWGALGGPVYLGFSEN5DAI ANGVFR KFG£HHHHHHGSACEL\-Pt^PATF\Liy/T5KgLDPRTS^TTSTrw>-A!.RGDVYL5F3g.V5DA? .^.N'GVFR FFGSHHHHHHGSACELMCSPAT PVLDVTSKELDSRLSYRIT5TrWSALGSDVYLGKSF?i3EAF PDGVFR LPSDATPVLDVTSKELDSRLSYRIISTFWGALGGDVYLGKSFNSDAi 4NGVFR ■^^■^^^■■■►■LFSDMEVLPVTGFELPPRLSYRIISIGRSALGGDVYLGRSFXSDAF ^NGVFR ' LPSDATPVLDVToKELPPRLSYRIISTFWGALGGDVYLGRSFiiSEAi FCJGVFF. '"LFSDATPVL0VTGFELDPRLSYRIISIGR3ALGGPVYLGRSFNSDAF ANGVFR

Arg6S-Fhe€3

€5

£5

IDS

K*tU6 -Leyir?

YNSDVGFSGTPVFFIGSSSHFGPHIFEGELLNIQFDISTVKS VSYTIWKVGDYDASLGT LLETGGTIG YXSP'vGFSGIFVPFIGSSSHFGPHIFEGELLXISFDISIVFvS "SYTIWFVGPYPASLG T LLETGGTIG WSDVGFSGTPVFFIGSSSHFGQGIFENELLNI2FAISTSKI

iN'SDVGFSGIFVSFIHSG----GIFEPEL L XI3FA131S KJ:

Y\SDVGFSGTFVFFIGSSSHFG3GIFEDELLM2FAISTSF>: y4sdvgfsgtpvffigsssdfgpgifedellniqfd:staki

YNSDVGPSGTFVFFIGSSSHFGQGIFENELLNIQFAISTSKI YVSDVGFSGTFVFFIGSSSHFGPHIFEPELLN'I QFAISTSKI

VSYTIWKVGDYDASLGT LLETGGTIG ''S YTICKV GD YPASLG T LLETGGTIG "SITIWKVGP^DASLGT LLETGGTIG VSYTIWKVGDYDASLGT LLETGGTIG '•.S1TIWFVGDYPASLGT LLETGGTIG ''SYTIKKVGDYDASLGT LLETGGTIG

YN'SDVGFSGTFVPFIGSSSHFGQGIFEDELLNIQFAISTSFJ" VSYTIWKVGDYDASLGT LLETGGTIG

F.YSPVGFSGTFVFFIGSSSHFGPHIFEGELLNIQFDISTVXI

'S1T:WKVGPYDASL GT LLETGGTIG

PFPI-B10

SOE-K.FI-B5

Sbr-RPI-Bl

Sbr-KFt-E2

Scr-FFI-ВЗ

Sbr-KPI-B4

PSPI-21-6 3

P1P4

P1H5

P4B1

135

QEDSSWFKIVKSSQLGYNLLY OEDSSWFKIVKSSOLGYiiLL^ QAPSSWFKIVKSSQFGYNLL1 QAPSSWFKIVKSSQF3Y4LH 0»XlSSWFRIVKSSQrrY4LL\ QADSSWFKIVKSSQFGY4LL1 QsjDSSWfKr/FSSQLGYNLLY

t153-xxxlE4

155 "165 175 IE 5

FAT-- I*FElsDDEF|LKVGVI4QNGFRRLALVFJI\*FLDVSFKaVQ 'FAT— IIFEJSDDEF LFVGVIH0NGFPICALVKH.\-ELD,/SFK3VQ :FVTST ig?FSSDDQF LKVGWHQNGFRRLALVKDKFLDVSFKQVQ jFVTTT TLEFSSDDQF LFVGVvH^iGFHFUlLVrX'MLDVSFKSVQ ¡PVTTT TT.FFSSDPOF LFVGWHS^GFRRLALVFDMLrVSFMT^a

ipvttfviJfsssddrf ssvgwhqngfrflalvkdxplevsfkovq

______________________PVTS SSDDQF IKVGW4QNGFRRLALVFXIKFLDISFKOVQ

OADSSWFKIVFSSHL---------VPLrVLSISSDDQF LKXGWHCKEroVWLLLRTILLKSFSFOVQ

QADSSKFKIVKSSQFGYNLLl|pVTTT TLFFSSDDQF LKVGWHQSGERICALVrXKFLUVSFKaVQ QADSSWFKIVFSSOLGY4LLY--------JPFSSDDQF^LKVGV/HQNGFRFLALVKDVFLDVSFK^/Q

Рис. 8. Сравнение полных аминокислотных последовательностей зрелых белков PKPI-B-ингибиторов трипсина и химотрипсина

PKPI-B10, Spls-KPI-Bl, Spls-KPI-B2, Spls-KPI-B3, Spls-KPI-B4, Spls-KPI-B5 [в настоящей работе]; PSPI-21-6.3. [Valueva et al, 2000]; P1D4, P1H5, P4B1 [Heibges et al., 2003]. Различающиеся аминокислотные остатки окрашены серым цветом различной интенсивности. Реакционные центры обозначены стрелками. Остатки Cys выделены черным цветом. Дисульфидные связи (Cys49-Cys98 и Cysl47-Cysl64) обозначены * и **, соответственно.

Синим шрифтом показаны последовательности тех белков, которые действуют как ингибиторы химотрипсина. Зеленым цветом обозначена последовательность, кодируемая в белке PKPI-B10 фрагментом полилинкера рЕТ23а. Красным цветом - последовательность, кодируемая в белке Spls-KPI-B5 фрагментом полилинкера pQE30. Оранжевым — последовательность глутатион-З-трансферазного тага (GST) в белках P1D4, Р1Н5 и Р4В1. Последовательность полигистидинового тага (6xHis) подчеркнута одиночной линией; праймера PKPI-B1 - двойной.

выводы

1. Установлены последовательности 16 генов PKPI, кодирующих в геноме картофеля сорта Истринский ингибиторы протеиназ типа Кунитца. Из них 6 генов кодируют белки PKPI-A, 4 - PKPI-B и 6 - PKPI-C. Частично определены последовательности еще двух генов, кодирующих белки PKPI-C.

2. Установлены последовательности 11 генов Spls-KPI, кодирующих ингибиторы протеиназ типа Кунитца в геноме неклубненосного картофеля (Solanum brevidens Phill.), из них 6 — кодируют белки группы А и 5 — белки группы В. Показано значительное сходство некоторых генов Spls-KPI из S. brevidens и PKPI групп А и В из различных сортов картофеля.

3.Получен рекомбинантный белок PKPI-B10, кодируемый геном PKPI-B10 из генома картофеля сорта Истринский. Показано, что белок PKPI-B10 эффективно подавляет активность трипсина и значительно слабее химотрипсина, но не действует на эластазу из лейкоцитов человека, субтилизин Карлсберг, протеиназу К и папаин. Белок PKPI-10 подавлял также рост и развитие фитопатогенноого гриба Fusarium culmorum.

4. Получен рекомбинантный белок PKPI-C2, кодируемый геном PKPI-C2 из генома картофеля сорта Истринский. Установлено, что белок PKPI-C2 является специфическим ингибитором субтилизина Карлсберг. Белок не действует на трипсин, химотрипсин и папаин.

5. Получены рекомбинантные белки Spls-KPI-Bl, Spls-KPI-B2, Spls-KPI-B3, Spls-KPI-B4 и Spls-KPI-B5, кодируемые соответствующими генами из генома S. brevidens. Показано, что все рекомбинантные белки с разной степенью эффективности ингибировали трипсин и не действовали на эластазу из лейкоцитов человека и папаин. Два из них — Spls-KPI-Bl и Spls-KPI-B4 — подавляли активность химотрипсина.

(Solanaceae) подвергаются перестройкам, что приводит к вариабельности их структуры и, как следствие, к изменению функции кодируемых белков.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сперанская A.C.. Дорохин A.B., Новикова С.И., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Клонирование последовательности, кодирующей ингибитор SKTI из картофеля // Генетика. 2003. Т. 39. № 10. С. 1490-1497.

2. Ревина Т.А., Сперанская A.C.. Кладницкая Г.В., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Белок-ингибитор субтилизина из клубней картофеля // Биохимия.

2004. Т. 69 № 10. С. 1345-1352.

3. Сперанская A.C.. Криницына A.A., Полтрониери П., Фазано П., Сантино А., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ типа Кунитца группы В из картофеля: молекулярное клонирование генов // Биохимия.

2005. Т. 70. № 3. С. 360-369.

4. Сперанская A.C., Криницына A.A., Ревина Т.А., Герасимова Н.Г., Керученько Я.С., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Гетерологичная экспрессия, очистка и свойства белка-ингибитора сериновых протеиназ из картофеля. // Биохимия. 2006. Т. 71. № 11. С. 1451-1458.

5. Speransky A.S., Cimaglia F., Krinitsina A.A., Poltronieri P., Fasano P., Bogacheva A.M., Valueva T.A., Halterman D., Shevelev A.B., Santino A. Kunitz-type protease inhibitors group В from Solanum palustre И Biotechnol. J. 2007 V. 2. № 11. P. 1417-1424.

6. Валуева T.A., Сперанская A.C.. Ревина T.A., Шевелев А.Б. Молекулярное клонирование и экспрессия генов ингибиторов протеиназ типа Кунитца группы С из картофеля // Биоорганическая химия. 2008. Т. 34. № 3. С. 344-359.

7. Сперанская A.C.. Дорохин A.B., Кузнецова Т.В., Хоменков В.Г.,

Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Ингибиторы сериновых протеиназ типа

Кунитца из картофеля сорта Истринский / III Международная

конференция «Регуляция роста, развития и продуктивности растений».

Республика Беларусь. Минск. 2003.С. 265

8. Сперанская А.С.. Криницына А.А., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ типа Кунитца из картофеля сорта Истринский / Тез. XVI зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва. 2004. С. 41.

9. Сперанская А.С.. Криницына А.А., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Три группы генов, кодирующих ингибиторы протеиназ Кунитца из картофеля S. tuberosum / Материалы международной конференции "Молекулярная генетика, геномика и биотехнология". Республика Беларусь. Минск. 2004. С. 347-348.

lO.Speransky A.S.. Krinitsina А.А., Fasano P., Poltronieri P., Valueva T.A., Shevelev A.B., Santino A. Class A Kunitz-type proteinase inhibitor genes polymorphism in Solanum genus / SISV-SIGA joint congress. Italy. Lecce. 2004. P. 71-72.

1 l.Speransky A.S., Krinitsina A.A., Poltronieri P., Santino A., Protzenko M.A., Bogacheva A.M, Valueva T.A., Shevelev A.B. Cloning of the Genes encoding for class A and class В Kunitz-type proteinase inhibitor (PKPI) in S. tuberosum cv. Istnnskii, and comparison with related genes cloned in S. brevidens, S. stolomferum and S andigenum / l'st Solanaceae Genome Workshop. Netherlands. Wageningen. 2004. P. 93.

12,Speransky A.S.. Krinitsina A.A., Revina T.A., Poltronieri P., Santino A., Shevelev А.В., Valueva T.A. Cloning the genes encoding for Kunitz-type proteinase inhibitors group С from potato. // FEBS Journal 2005 V. 272. S. 1. P. 176-176

13.Сперанская A.C.. Криницына А А., Стеганова OA., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Гены ингибитора протеиназ типа Кунитца группы С из картофеля // Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы защиты картофеля, плодовых и овощных культур от болезней, вредителей и сорняков» Республика Беларусь. Минск. 2005. С. 248-253.

H.Speransky A. Krinitsina A, Shevelev A, Domogatsky S, Valueva T, Poltronieri P, Cimaglia F, Santino A Characterization of genes coding for class A, class В and class С Kunitz-type proteinase inhibitors (PKP1) and their protein products in S. tuberosum and in S brevidens / 2-d Solanaceae Genome Workshop. Italy. Ischia. 2005. P. 183.

15.Сперанская A.C.. Криницына A.A., Полтрониери П., Сантино А., Шевелев Б.И., Ольшанский А.Я., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Дифференциальная детекция экспрессии генов ингибиторов протеиназ типа Кунитца в различных структурных группах у растений рода Solanum / IV международная конференция «Регуляция роста, развития и продуктивности растений». Республика Беларусь. Минск. 2005. С. 219.

16.Сперанская A.C.. Криницына A.A., Стеганова O.A., Полтрониери П., Сантино А., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Гены ингибиторов протеиназ типа Кунитца из Solanum brevidens и Solanum tuberosum / Тез. XVII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва. 2005. С. 63.

17.Валуева Т.А., Ревина Т. А., Кудрявцева H.H., Сперанская A.C. Молекулярное клонирование и экспрессия генов ингибиторов протеиназ типа Кунитца из картофеля / V международная научная конференция «Регуляция роста, развития и продуктивности растений». Белоруссия. Минск. 2007. С. 2.

18.Ревина Т. А., Кладницкая Г.В., Сперанская A.C.. Валуева Т.А. Специфический ингибитор субтилизина типа Кунитца из клубней картофеля / VI Симпозиум «Химия протеолитических ферментов». Москва. 2007. С. 111.

Подписано в печать 29.09.2008 г.

Печать лазерная цифровая Тираж 120 экз

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д 42 Тел.. (495) 785-00-38 www.autoref.webstolica ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сперанская, Анна Сергеевна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ: СТРУКТУРА, ФУНКЦИИ И КОДИРУЮЩИЕ ИХ ГЕНЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

2.1. Ингибиторы протеиназ, общая характеристика.

2.1.1. Классификация и распространение.

2.1.2. Структура молекул ингибиторов.

2.1.3. Механизмы ингибирования.

2.2. Геномная организация генов, кодирующих ингибиторы протеиназ

2.2.1. Множественность генов, кодирующих ингибиторы протеиназ.

2.2.2. Локализация генов ингибиторов в геноме.

2.2.3. Образование дуплицированных повоторов генов ингибиторов.

2.3. Дифференциальная экспрессия генов, кодирующих ингибиторы протеиназ.

2.4. Эволюция генов, кодирующих ингибиторы протеиназ.

2.5. Семейство соевого ингибитора трипсина Кунитца (SKTI).

2.6. Функции ингибиторов протеиназ в растениях.

2.6.1. Участие в защитной системе.

2.6.2. Контроль in vivo эндогенных ферментов.

2.6.3. Запасные белки растений.

2.7. Ингибиторы протеиназ типа Кунитца из картофеля.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ингибиторы протеиназ типа Кунитца из картофеля: молекулярное клонирование и экспрессия генов"

Ингибиторы протеолитических ферментов представляют собой большую группу белков, способных образовывать комплексы с протеиназами, в составе которых ферменты утрачивают свою активность. Белковые ингибиторы протеиназ обнаружены у представителей всех доменов живых организмов. Эти белки на основании особенностей строения их молекул разделяют на структурные семейства, число которых различается в зависимости от принятой системы классификации [159, 216]. Ингибиторы, принадлежащие к семейству соевого ингибитора трипсина Кунитца (SKTI, soybean Kunitz trypsin inhibitor), широко распространены среди растений различных систематических групп, как однодольных, так и двудольных. Представители этого семейства могут подавлять активность сериновых, цистеиновых или аспартатных протеиназ, помимо этого некоторые белки проявляют активность по отношению к непротеолитическим ферментам, таким, как а-амилазы и инвертазы [98, 99, 223]. Белки семейства SKTI в большом количестве присутствуют в семенах и запасающих органах растений, а также в механически поврежденных или пораженных фитопатогенами органах растений.

Физиологические функции белков семейства SKTI в организме растений окончательно не установлены, тем не менее, очевидно, что они участвуют в защите растений от патогенных микроорганизмов и насекомых-вредителей. Показано, что белки SKTI могут действовать как на экстрацеллюлярные протеиназы, секретируемые фитопатогенами и разрушающие растительную ткань, так и на протеиназы желудочно-кишечного тракта насекомых [2, 9, 11, 120, 252 ,272]. В связи с новейшими достижениями биотехнологии по созданию растений, обладающих повышенной устойчивостью к вредителям и болезням, изучение белков данного семейства имеет не только теоретическое, но также важное практическое значение.

К настоящему времени накоплено значительное количество сведений о структуре и свойствах белков-ингибиторов семейства SKTI из картофеля

Solarium tuberosum (L.), который является важнейшей сельскохозяйственной культурой. Эти белки выделяют в отдельное подсемейство и обозначают PKPI (potato Kunitz proteinase inhibitors). Установлено, что белки PKPI представлены многочисленными изоформами, которые на основании сходства N- и С-концевых аминокислотных последовательностей разделяют, по крайней мере, на пять различных структурных групп, из которых три (PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C) относительно хорошо изучены [28, 98, 120]. Однако структурные особенности белков PKPI, определяющие специфичность взаимодействия с различными протеиназами остаются малоисследованными. Несмотря на то, что изучены биохимические свойства целого ряда белков PKPI, выделенных из клубней картофеля, их полная первичная структура, как правило, остается неизвестной. С другой стороны, значительное количество полных аминокислотных последовательностей белков PKPI восстановлено по кодирующим их нуклеотидным последовательностям, но практически нет данных о свойствах этих белков. Таким образом, исследование взаимосвязи структуры и функции новых белков PKPI, остается актуальной задачей современной биохимии.

В настоящее время установлено около сотни нуклетидных последовательностей (в основном кДНК), кодирующих белки PKPI в различных сортах картофеля, например, Provita, Saturna, Bintje, Pentland squire, Superior, Desire, Danshaku, Ulsten Sceptre [80, 98, 91, 102, 120, 247, 249]. Показано, что гены ингибиторов PKPI в геноме картофеля представлены множественными копиями и отличаются высоким уровнем полиморфизма. Действительно, различия между нуклеотидными последовательностями, относящимися к трем наиболее изученным группам, достигают 88 - 99% {PKPI-А), 85 - 99% {PKPI-B) и 54 - 99% (PKPI-C). При этом последовательности кДНК (или генов) PKPI, найденные в разных сортах картофеля, отличаются друг от друга. Это позволило высказать предположение о том, что каждый сорт картофеля содержит свой уникальный набор генов PKPI, а различия между генами обусловлены высокой скоростью их эволюции [98]. Информация о структуре ранее не изученных генов PKPI картофеля, а также растений близких видов, представляет значительный интерес, поскольку позволяет судить о процессах их формирования и образования новых форм in vivo.

В настоящей работе были поставлены цели: выделить гены PKPI из генома картофеля сорта Истринский и неклубненосного дикого вида Solanum brevidens Phill. (синоним S. palustre Poepp. ex Schltdl.), провести их сравнительный структурно-функциональный анализ, а также исследование связи между структурой и специфичностью продуктов клонированных генов. При этом были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

1. Разработать метод полногеномного ПНР-анализа генов PKPI-А, PKPI-B и PKPI-C из растений рода Solanum, включая установление их числа и структуры. Для этого синтезировать универсальные олигонуклеотидные праймеры, специфичные к высоко консервативным фланговым последовательностям генов, кодирующих белки PKPI, и на их основе создать схему клонирования и реконструкции нуклеотидных последовательностей из набора геномных генов PKPI картофеля сорта Истринский и неклубненосного S. brevidens.

2. Провести сравнительный анализ последовательностей реконструированных генов картофеля сорта Истринский и S. brevidens, а также известных по данным литературы последовательностей PKPI из других сортов картофеля и других видов растений рода Solanum. На основании полученных данных оценить скорость эволюции генов PKPI, а также перспективность поиска новых форм ингибиторов этого подсемейства в других видах растений рода Solanum.

4. Разработать метод ускоренной гетерологичной экспрессии клонированных генов PKPI в клетках Escherichia coli. Получить ряд рекомбинантных белков, кодируемых новыми, ранее не изученными генами PKPI, и охарактеризовать специфичность их действия на протеиназы: трипсин, химотрипсин, субтилизин Карлсберг, протеиназу К, эластазу из лейкоцитов человека (HLE) и папаин.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Сперанская, Анна Сергеевна

6. ВЫВОДЫ:

1. Установлены последовательности 16 генов PKPI, кодирующих в геноме картофеля сорта Истринский ингибиторы протеиназ типа Кунитца. Из них 6 генов кодируют белки PKPI-A, 4 гена - PKPI-B и 6 генов - PKPI-C. Частично определены последовательности еще двух генов, кодирующих белки PKPI-C.

2. Установлены последовательности 11 генов Spls-KPI, кодирующих ингибиторы протеиназ типа Кунитца в геноме неклубненосного картофеля (Solanum brevidens Phill.), из них 6 генов кодируют белки группы А и 5 генов — белки группы В. Показано значительное сходство некоторых генов Spls-KPI из S. brevidens и PKPI групп А и В из различных сортов картофеля.

3. Получен рекомбинантный белок PKPI-B10, кодируемый геном PKPI-B10 из генома картофеля сорта Истринский. Показано, что белок PKPI-B10 эффективно подавляет активность трипсина и значительно слабее химотрипсина, но не действует на эластазу из лейкоцитов человека, субтилизин Карлсберг, протеиназу К и папаин. Белок PKPI-10 подавлял также рост и развитие фитопатогенноого гриба Fusarium culmorum.

5. Получены рекомбинантные белки Spls-KPI-Bl, Spls-KPI-B2, Spls-KPI-B3, Spls-KPI-B4 и Spls-KPI-B5, кодируемые соответствующими генами из генома

5. brevidens. Показано, что все рекомбинантные белки с разной степенью эффективности ингибировали трипсин и не действовали на эластазу из лейкоцитов человека и папаин. Два из них - Spls-KPI-Bl и Spls-KPI-B4, подавляли активность химотрипсина.

6. Установлено, что нуклеотидные последовательности генов PKPI содержат мозаично расположенные блоки. Полученные данные позволяют предположить, что в процессе эволюции вследствие рекомбинации кодирующие области генов PKPI растений семейства пасленовых (Solanaceae) подвергаются перестройкам, что приводит к вариабельности их структуры и, как следствие, к изменению функции кодируемых белков.

7. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сперанская А.С., Дорохин А.В., Кузнецова Т.В., Хоменков В.Г., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Ингибиторы сериновых протеиназ типа Кунитца из картофеля сорта Истринский / III Международная конференция «Регуляция роста, развития и продуктивности растений». Республика Беларусь. Минск. 2003.С. 265.

2. Сперанская А.С., Дорохин А.В., Новикова С.И., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Клонирование последовательности, кодирующей ингибитор SKTI из картофеля//Генетика. 2003. Т. 39. № 10. С. 1490-1497.

3. Сперанская А.С., Криницына А. А., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ типа Кунитца из картофеля сорта Истринский / Тез. XVI зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва. 2004. С. 41.

4. Сперанская А.С., Криницына А.А., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Три группы генов, кодирующих ингибиторы протеиназ Кунитца из картофеля S. tuberosum / Материалы международной конференции "Молекулярная генетика, геномика и биотехнология". Республика Беларусь. Минск. 2004. С. 347-348.

5. Speransky A.S., Krinitsina А.А., Fasano P., Poltronieri P., Valueva T.A., Shevelev A.B., Santino A. Class A Kunitz-type proteinase inhibitor genes polymorphism in Solanum genus / SISV-SIGA joint congress. Italy. Lecce. 2004. P. 71-72.

6. Speransky A.S., Krinitsina A.A., Poltronieri P., Santino A., Protzenko M.A., Bogacheva A.M., Valueva T.A., Shevelev A.B. Cloning of the Genes encoding for class A and class В Kunitz-type proteinase inhibitor (PICPI) in S. tuberosum cv. Istrinskii, and comparison with related genes cloned in S. brevidens, S. stoloniferum and S. andigenum / l'st Solanaceae Genome Workshop. Netherlands. Wageningen. 2004. P. 93.

7. Ревина Т.А., Сперанская А.С., Кладницкая Г.В., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Белок-ингибитор субтилизина из клубней картофеля // Биохимия.

2004. Т. 69 № 10. С. 1345-1352.

8. Speransky A.S., Krinitsina А.А., Revina Т.А., Poltronieri P., Santino A., Shevelev A.B., Valueva T.A. Cloning the genes encoding for Kunitz-type proteinase inhibitors group С from potato. // FEBS Journal. 2005 V. 272. S. 1. P. 176-176

9. Сперанская A.C., Криницына A.A., Стеганова O.A., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Гены ингибитора протеиназ типа Кунитца группы С из картофеля // Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы защиты картофеля, плодовых и овощных культур от болезней, вредителей и сорняков» Республика Беларусь. Минск. 2005. С. 248-253.

10. Сперанская А.С., Криницына А.А., Полтрониери П., Фазано П., Сантино А., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ типа Кунитца группы В из картофеля: молекулярное клонирование генов // Биохимия.

2005. Т. 70. № з. с. 360-369.

11. Speransky A, Krinitsina A, Shevelev A, Domogatsky S, Valueva Т, Poltronieri Р, Cimaglia F, Santino A Characterization of genes coding for class A, class В and class С Kunitz-type proteinase inhibitors (PKPI) and their protein products in S. tuberosum and in S. brevidens / 2-d Solanaceae Genome Workshop. Italy. Ischia. 2005. P. 183.

12. Сперанская A.C., Криницына А.А., Полтрониери П., Сантино А., Шевелев Б.И., Ольшанский А .Я., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Дифференциальная детекция экспрессии генов ингибиторов протеиназ типа Кунитца в различных структурных группах у растений рода Solanum / IV международная конференция «Регуляция роста, развития и продуктивности растений». Республика Беларусь. Минск. 2005. С. 219.

13. Сперанская А.С., Криницына А.А., Стеганова О.А., Полтрониери П., Сантино А., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Гены ингибиторов протеиназ типа Кунитца из Solanum brevidens и Solanum tuberosum / Тез. XVII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва. 2005. С. 63.

14. Сперанская А.С., Криницына А.А., Ревина Т.А., Герасимова Н.Г., Керученько Я.С., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Гетерологичная экспрессия, очистка и свойства белка-ингибитора сериновых протеиназ из картофеля. //Биохимия. 2006. Т. 71. № 11. С. 1451-1458.

15. Валуева Т.А., Ревина Т. А., Кудрявцева Н.Н., Сперанская А.С. Молекулярное клонирование и экспрессия генов ингибиторов протеиназ типа Кунитца из картофеля / V международная научная конференция «Регуляция роста, развития и продуктивности растений». Белоруссия. Минск. 2007. С. 2.

16. Ревина Т.А., Кладницкая Г.В., Сперанская А.С., Валуева Т.А. Специфический ингибитор субтилизина типа Кунитца из клубней картофеля / VI Симпозиум «Химия протеолитических ферментов». Москва. 2007. С. 111.

17. Speransky A.S., Cimaglia F., Krinitsina A.A., Poltronieri P., Fasano P., Bogacheva A.M., Valueva T.A., Halterman D., Shevelev A.B., Santino A. Kunitz-type protease inhibitors group В from Solanum palustre II Biotechnol. J. 2007 V. 2. № 11. P. 1417-1424.

18. Валуева T.A., Сперанская A.C., Ревина T.A., Шевелев А.Б. Молекулярное клонирование и экспрессия генов ингибиторов протеиназ типа Кунитца группы С из картофеля // Биоорганическая химия. 2008. Т. 34. № 3. С. 310-317.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Поскольку содержащиеся в растениях белки PKPI взаимодействуют с рядом протеиназ различных классов, то можно предположить, что они принимают активное участие в защите картофеля от патогенов. Такое предположение было сделано и многими исследователями, изучавшими свойства белков данного семейства и регуляцию in vivo экспрессии кодирующих их генов [80, 99, 120, 127].

В действительности косвенные доказательства того, что белки PKPI участвуют в защитной реакции растений, были получены в экспериментах ряда лаборатории. Было показано, что, хотя во взрослых листьях, стеблях и корнях картофеля отсутствует экспрессия генов PKPI-A и PKPI-B, поранение и воздействие раневыми гормонами (например, МЖК) приводит к индукции в листьях и побегах их мРНК [120, 148]. Сходные результаты были получены и в экспериментах по определению транскриптов PKPI группы С в растениях, подвергшихся воздействию жасмоновой кислоты [80].

В работах нашей лаборатории было показано, что патогенный оомицет Р. infestans (Mont.) de Вагу при выращивании на среде, содержащей белки из клубней картофеля, продуцирует комплекс сериновых протеиназ с субтилизиноподобной активностью [7]. В то же время в клубнях картофеля в ответ на поражение P. infestans накапливались белки с м.м. около 20-24 кДа [4, 266].

Было показано, что несколько рекомбинантных белков PKPI, полученных в результате экспрессии в S. pombe, оказывают подавляющее действие на рост мицелия F. moniliforme (хотя и не влияют на рост ряда других патогенных грибов) [98].

Токсичность рекомбинантного белка PKPI-10, исследованного в настоящей работе, по отношению к фитопатогенному грибу F. culmorum также свидетельствует в пользу предположения об участии белков данного семейства в защите картофеля от вредителей.

Исследование свойств ранее не изученных белков PKPI представляет значительный практический интерес, поскольку открывает дополнительные возможности для создания трансгенных растений с заданной устойчивостью по отношению к определенным патогенным организмам. Поливариантность и множественность белков данного семейства, а также достаточно сложная процедура по очистке индивидуальных белков из растений, дающая низкий количественный выход конечного продукта, позволяют заключить, что исследование свойств на примере рекомбинантных белков более продуктивно.

В настоящем исследовании предложен метод гетерологичной экспрессии генов PKPI в Е. coli с последующей очисткой рекомбинантных белков до гомогенного состояния, который позволяет получать активные ингибиторы протеиназ. Следует отметить, что в работе [98] была изучена возможность получения в эукариотической дрожжевой системе рекомбинантных белков PKPI, соединеных с посторонним белком GST, что приводит к снижению или даже отсутствию биологической активности. Таким образом, метод, предложенный в настоящем исследовании, следует считать более удачным, поскольку он позволяет получать белки с высокой биологической активностью.

Сравнительное исследование последовательностей генов PKPI позволяет предположить, что эволюция белков PKPI, происходящей в процессе адаптации растений к появлению новых форм патогенных организмов, важную роль играет межгенная рекомбинация. При этом, наряду с обменом участками между генами PKPI, относящимися к одной структурной группе, вероятно, существует также обмен участками между генами различных групп. Это предположение согласуется с мнением, высказанным в обзоре [47], в котором рассматриваются эволюционные механизмы, приводящие к формированию новых форм ингибиторов. В ней также предполагается, что множественные гены, кодирующие ингибиторы протеиназ, подвержены быстрым адаптационным изменениям, хотя рекомбинация и не рассматривается в качестве основного механизма эволюции. Однако следует отметить, что вариабельность множественных дуплицированных генов, кодирующих белки защитных систем растений (например, белки, содержащие NBS-LRR-домены), объясняют именно межгенной рекомбинацией с последующей конверсией генов, сопровождаемой постепенно накапливающимися мутациями [186].

Множественность генов PKPI в геноме пасленовых, наряду с высокой скоростью их модификации последовательностей в процессе эволюции и гибридным происхождением разных сортов картофеля, создававшихся с привлечением различных диких видов, обусловливают уникальность и полиморфность кодируемых ими белков.

Примененный в настоящей - работе метод полногеномного анализа позволил быстро и достаточно эффективно исследовать гены PKPI в геномах не изученных сортов и видов картофелей. В то же время анализ, осуществленный с помощью специализированного программного обеспечения, позволил локализовать расположение «горячих» точек рекомбинации, что открывает возможности создания искусственных генов PKPI, кодирующих белки с новыми, заданными свойствами. Поскольку имеются основания предполагать, что по крайней мере некоторые из выделенных участков, между которыми располагаются точки рекомбинации, соответствуют областям, включающим функционально значимые детерминанты, то конструированию искусственных генов, вероятно, должны предшествовать работы по детальному исследованию взаимосвязи структуры таких участков и свойств белка.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сперанская, Анна Сергеевна, Москва

1. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Белки-ингбиторы протеиназ в семенах. 1. Классификация, распространение, структура и свойства // Физиология растений. 1999. Т. 46. № 3. С. 362-387.

2. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Роль ингибиторов протеолитических ферментов в защите растений // Успехи биологической химии. 2002. Т. 42. С. 193-216.

3. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Роль ингибиторов протеолитических ферментов в защите растений от патогенных микроорганизмов // Биохимия. 2004. Т. 69. № 11. С. 1600-1606.

4. Валуева Т.А., Ревина Т.А., Гвоздева Е.Л., Герасимова Н.Г., Ильинская Л.И., Озерецковская O.JI. Влияние элиситоров на накопление ингибиторов протеиназ в пораненных клубнях картофеля // Прикл. биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. № 5. С. 601-606.

5. Валуева Т.А., Ревина Т.А., Кладницкая Г.В., Мосолов В.В., Ментеле Р. Первичная структура 21кДа-белка из клубней картофеля // Биохимия. 1999. V. 64. № 11. Р. 1489-1498.

6. Валуева Т.А., Ревина Т.А., Кладницкая Г.В., Мосолов В.В. Реактивные центры 21кДа-белка-ингибитора сериновых протеиназ из клубней картофеля // Биохимия. 1999. V. 64. № 9. Р. 1274-1279.

7. Гвоздева E.JL, Иевлева Е.В., Герасимова Н.Г., Озерецковская О.Л., Валуева Т.А. Экзопротеиназы оомицета Phytohpthora infestans II Прикладная биохимия и микробиология. 2004, 40. № 2, 194-200.

8. Ежова Т.А., Солдатова О.П., Пенин А.А., Шестаков С.В. Молекулярно-генетическое картирование генома растений. М.: МАКС Пресс. 2002. С. 70.

9. Кладницкая Г.В., Валуева Т.А., Ермолова Н.В., Ильинская Л.И., Герасимова Н.Г., Мосолов В.В. Накопление ингибиторов протеиназ в диффузатах клубней картофеля при инфицировании возбудителем фитофтороза// Физиология растений. 1996. Т. 43. № 5. С. 701-706.

10. Люблинская Л.А., Якушева Л.Д., Степанов В.М. Синтез пептидных субстратов субтилизина и их аналогов // Биоорган, химия. 1977. Т. 3. № 2. С. 273-279.

11. И. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ и их функции у растений // Прикл. биох. микробиол. 2005. Т. 41. № 3. С. 261-282.

12. Попкова К.В., Шнейдер Ю.И., Воловик А.С., Шмыгля В.А. Болезни картофеля. М.: «Колос». 1980 С. 74.

13. Симаков Е.А., Анисимов Б.В., Склярова Н.П., Яшина И.М., Еланский С.Н. Сорта картофеля, возделываемые в России: Каталог РАСХН ВНИИКХ. М.: Ежегодное приложение к газете «Картофелевод». 2005. С. 348.

14. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений. М.: Наука. 2002. С.294.

15. Appenroth K.J., Augsten H. An improvement of the protein determination in plant tissues with the dye-binding method according to BRADFORD // Biochim. Physiol Pflanzen. 1987. V. 182. P. 85-89.

16. Arnon R., Shapira E. Antibodies to papain. A selective fractionation according to inhibitory capacity//Biochemistry. 1967. V. 6 № 12. P. 3942-3950.

17. Arnone M.I., Davidson E.H. The hardwiring of development: organization and function of genomic regulatory systems // Development. 1997. V. 124'. № 10. P. 1851-1864.

18. Ashida Y., Matsushima A., Tsuru Y., Hirota Т., Hirata T. Isolation and sequencing of a cDNA clone encoding a 20-kDa protein with trypsin inhibitory activity // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000. V. 64. № 6. P. 1305-1309.

19. Azarkan M., Dibiani R., Goormaghtigh E., Raussens V., Вaeyens-Volant D. The papaya Kunitz-type trypsin inhibitor is a highly stable beta-sheet glycoprotein // Biochim. Biophys. Acta. 2006. V. 1764. № 6. P. 1063-1072.

20. Banfalvi Z., Molnar A., Molnar G., Lakatos L., Szabo L. Starch synthesis, and tuber storage protein genes are differently expressed in Solanum tuberosum and in Solanum brevidens // FEBS Lett. 1996.- V. 383 № 3. P. 159-164.

21. Barbour K.W., Wei F., Brannan C., Flotte T.R., Baumann H., Berger F.G.- The murine alpha(l)-proteinase inhibitor gene family: polymorphism, chromosomal location, and structure // Genomics. 2002. V. 80. № 5. P. 515522.

22. Barta E., Pintar A., Pongor S. Repeats with variations: accelerated evolution ofthe Pin2 family of proteinase inhibitors // Trends. Genet. 2002. V. 18. № 12. P. 600-603.

23. Baumgarten A., Cannon S., Spangler R., May G. Genome-level evolution of resistance genes in Arabidopsis thaliana II Genetics. 2003 V. 165 № 1. P. 309319.

24. Bauw G., Nielsen H.V., Emmersen J., Nielsen K.L., Jorgensen M., Welinder K.G. Patatins, Kunitz protease inhibitors and other major proteins in tuber of potato cv. Kuras //FEBS J. 2006. V. 73. № 15. P. 3569-3584.

25. Benarafa C., Remold-O'Donnell E. The ovalbumin serpins revisited: perspective from the chicken genome of clade В serpin evolution in vertebrates // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005. V. 102. № 32. P. 11367-11372.

26. Betz A., Hofsteenge J., Stone S.R. Ionic interactions in the formation of the thrombin-hirudin complex // Biochem. J. 1991. V. 275. № 3. P. 801-803.

27. Beuning L.L., Spriggs T.W., Christeller J.T. Evolution of the proteinase inhibitor I family and apparent lack of hypervariability in the proteinase contact loop // J. Mol. Evol. 1994. V. 39. № 6. P. 644-654.

28. Bhattacharyya A., Mazumdar S., Leighton S.M., Babu C.R. A Kunitzproteinase inhibitor from Archidendron ellipticum seeds: purification, characterization, and kinetic properties // Phytochemistry. 2006. V. 67. № 3. V. 232-241.

29. Bieth J., Wermuth C.G. The action of elastase on p-nitroanilide substrates // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1973. 53(2):383-90.

30. Bradshaw H.DJr., Hollick J.B., Parsons T.J., Clark H.R.G., Gordon M.P. Systemically wound-responsive genes in poplar tree encode proteins similar to sweet potato sporamins and legume Kunitz trypsin inhibitors // Plant Mol. Biol. 1990. V. 14. P. 51-59.

31. Brenner E.D., Lambert K.N., Kaloshian I., Willamson V.M. Characterization of LeMir, a Root-Knot Nematode-Induced gene in tomato with an encoded product secreted from the root // Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 237-247.

32. Brillard-Bourdet M., Nguyen V., Ferrer-di Martino M., Gauthier F., Moreau T. Purification and characterization of a new cystatin inhibitor from Taiwan cobra (Naja naja atra) venom // Biochem. J. 1998. V. 331. № 1. P. 239-244.

33. Broadway R.M. Dietary regulation of serine proteinases that are resistant to serine proteinase inhibitors // J. Insect. Physiol. 1997. V. 43. № 9. P. 855-874.

34. Bronsoms S., Villanueva J., Canals F., Querol E., Aviles F.X. Analysis of the effect of potato carboxypeptidase inhibitor pro-sequence on the folding of the mature protein // Eur. J. Biochem. 2003. V. 270. № 17. P. 3641-3650.

35. Brown W.M., Dziegielewska K.M. Friends and relations of the cystatin superfamily—new members and their evolution // Protein Sci. 1997. V. 6. № 1. P. 5-12.

36. Brzin J., Popovic Т., Drobnic-Kosorok M., Kotnik M., Turk V. Inhibitors of cysteine proteinases from potato // Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1988. V. 369 P. 233-238.

37. Cannon S.B. and Young N.D. OrthoParaMap: Distinguishing orthologs from paralogs by integrating comparative genome data and gene phylogenies // BMC Bioinformatics. 2003. V. 4. № 35. 15 p.

38. Cannon S.B., Mitra A., Baumgarten A., Yang N.D., May G. The roles of segmental and tandem gene duplication in the evolution of> large gene families in Arabidopsis thaliana И PMC Plant Biology. 2004. V. 4. № 10. 21 p.

39. Chase T.Jr., Shaw E. p-Nitrophenyl-p'-guanidinobenzoate HC1: a new active site titrant for trypsin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1967. V. 29. № 4. P. 508-514.

40. Christeller J.T. Evolutionary mechanisms acting on proteinase inhibitor variability // FEBS J. 2005. V. 272. № 22. P: 5710-5722.

41. Clemente A., MacKenzie D.A., Jeenes D.J., Domoney C. The effect of variation within inhibitory domains on the activity of pea protease inhibitors from the Bowman-Birk class // Protein Expr. Purif. 2004. V. 36. № 1. P. 106114.

42. Cornwall G.A, Hsia N. A new subgroup of the family 2 cystatins // Mol. Cell Endocrinol. 2003. V. 200. № 1-2. P. 1-8.

43. Cornwall G.A., Cameron A., Lindberg I., Hardy D.M., Cormier N., Hsia N. The cystatin-related epididymal spermatogenic protein inhibits the serine protease prohormone convertase 2 // Endocrinology. 2003. V. 144. P. 901-908.

44. Dasgupta J., Sen U., Dattagupta J.K. In silico mutations and molecular dynamics studies on a winged bean chymotrypsin inhibitor protein // Protein Eng. 2003. V. 16. № 7. P. 489-496.

45. Dattagupta J.K., Podder A., Chakrabarti C., Sen U., Dutta S.K., Singh M. Structure of a Kunitz-type chymotrypsin from winged bean seeds at 2.95 A resolution // Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 1996. V. 52. № 3. P. 521528.

46. Deshimaru M., Hanamoto R., Kusano C., Yoshimi S., Terada S. Purification and characterization of proteinase inhibitors from wild soja (Glycine soja) seeds // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002. V. 66. № 9. P. 1897-1903.

47. Deshimaru M., Yoshimi S., Shioi S., Terada S. Multigene family for Bowman-Birk type proteinase inhibitors of wild soja and soybean: the presence of two

48. BBI-A genes and pseudogenes // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2004. V. 68. № 6. P. 1279-1286.

49. Domoney C., Welham Т., Ellis N., Mozzanega P., Turner L. Three classes of proteinase inhibitor gene have distinct but overlapping patterns of expression in Pisum sativum plants // Plant Mol. Biol. 2002. V. 48. №3. P. 319-329.

50. Domoney C., Welham Т., Sidebottom C., Firmin J.L. Multiple isoforms of Pisum trypsin inhibitors result from modification of two primary gene products //FEBS Lett. 1995. V. 360. № 1. P. 15-20.

51. Duranti M., Barbiroli A., Scarafoni A., Tedeschi G., Morazzoni P. One-step purification of Kunitz soybean trypsin inhibitor // Protein Expr. Purif. 2003. V. 30. №2. P. 167-170.

52. Falco M.C., Silva-Filho M.C. Expression of soybean proteinase inhibitors in transgenic sugarcane plants: effects on natural defense against Diatraea saccharalis П Plant Physiol. Biochem. 2003. V. 41. P. 761-766

53. Fernie A.R., Willmitzer L. Molecular and biochemical triggers of potato tuber development//Plant Physiol. 2001. V. 127. P. 1459-1465.

54. Force A., Lynch M., Pickett F.B., Amores A., Yan Y., Postlethwait J. Preservation of duplicate genes by complementary, degenerative mutations // Genetics. 1999. V. 151. P. 1531-1545.

55. Forsyth S., Horvath A., Coughlin P. A review and comparison of the murine alpha 1-antitrypsin and alphal-antichymotrypsin multigene clusters with the human clade A serpins // Genomics. 2003. V. 81. № 3. P. 336-345.

56. Franco O.L., Rigden D.J., Melo F.R., Grossi-de-Sa M.F. Plant a-amylase inhibitors and their interaction with insect a-amylases. Structure, function and potential for crop protection // Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P. 397-412.

57. Fujinaga M., Cherney M.M., Oyama H., Oda K., James M.N.G. The molecular structure and catalytic mechanism of a novel carboxyl peptidase from Scytalidium lignicolum IIPNAS. 2004. V. 101. № 10. P. 3364-3369.

58. Garcia V.A., Freire M.G., Novello J.C., Marangoni S., Macedo M.L. Trypsin inhibitor from Poecilanthe parviflora seeds: purification, characterization, and activity against pest proteases // Protein J. 2004. V. 23. № 5. P. 343-350.

59. Gebhardt C., Valkonen J.P.T. Organisation of genes controlling disease resistant in the Potato genome // Annu. Rev. Phytopathol. 2001. V. 39. P. 79102.

60. Glaczinski H., Heibges A., Salamini F., Gebhardt K. Members of the Kunitz-type protease inhibitor gene family of potato inhibit soluble tuber invertase in vitro I I Potato Res. 2002. V. 45. P. 163-176.

61. Gomes C.E., Barbosa A.E., Macedo L.L., Pitanga J.C., Moura F.T., Oliveira

62. Goodwin R.L., Baumann H., Berger F.G. Patterns of divergence during evolution of alpha-1-proteinase inhibitors in mammals // Mol. Biol. Evol. 1996. V. 13. №2. P. 346-358.

63. Goodwin R.L., Barbour K.W., Berger F.G. Expression of the alpha 1-proteinase inhibitor gene family during evolution of the genus Mus // Mol. Biol. Evol. 1997. V. 14. № 4. P. 420-427.

64. Graham J.S., Pearce G., Merryweatherg J., Titanili K., Ericssonli L.H., Ryan C.A. Wound-induced proteinase inhibitors from tomato leaves // J. Biol. Chem. 1985. V. 260. № 11. P. 6555-6560.

65. Graham M.Y., Weidner J., Wheeler K., Pelow M.J., Graham T.L. Induced expression of pathogenesis-related protein genes in soybean by wounding and the Phytophthora sojae cell wall glucan elicitor // Physiol. Mol. Plant Pathol. 2003. V. 63. P. 141-149.

66. Groover A., Jones A.M. Tracheary element differentiation uses a novel mechanism coordinating programmed cell death and secondary cell wall synthesis // Plant Physiol. 1999. V. 119. № 2. P. 375-384.

67. Grube R.C., Radwanski E.R., Jahn M. Comparative genetics of desease resistance within the Solanaceae // Genetics. 2000. V. 155. P. 873-887.

68. Gruen L.C., Tao Z.J., Kortt A.A. Stability and physicochemical properties of a trypsin inhibitor from winged bean seed (Psophocarpus tetragonolobus (L)DC) // Biochim. Biophys. Acta. 1984. V. 791. № 3. P. 285-293.

69. Grutter M.G., Priestle J.P., Rahuel J., Grossenbacher H., Bode W., Hofsteenge J., Stone S.R. Crystal structure of the thrombin-hirudin complex: a novel mode of serine protease inhibition // EMBO J. 1990. V. 9. № 8. P. 2361-2365.

70. Habu Y., Peyachoknagul S., Umemoto K., Sakata Y., Ohno T. Structure and regulated expression of Kunitz chymotrypsin inhibitor genes in winged bean {Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC.) // J. Biochem. 1992. V. 111. P. 249258

71. Habu Y., Fukushima H., Sakata Y., Abe H., Funada R. A gene encoding a major Kunitz proteinase inhibitor of storage organ of winged bean is also expressed in the phloem of steams // Plant Mol. Biol. 1996. V. 32. P. 1209

72. Hall T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucl. Acids. Symp. Ser. 1999. V. 41. P. 95-98.

73. Hannapel DJ. Differential expression of potato tuber protein genes // Plant Physiol. 1990. V. 94. № 3. P. 919-925.

74. Hannapel D.J. Nucleotide and deduced amino acid sequence of the 22-kilodalton cathepsin D inhibitor protein of potato (Solanum tuberosum L.). // Plant Physiol. 1993. V. 101. № 2. P. 703-704.

75. Hansen D., Macedo-Ribeiro S., Verissimo P., Yoo Im.S., Sampaio M.U., Oliva

76. M.L. Crystal structure of a novel cysteinless plant Kunitz-type proteaseinhibitor // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. V. 360. № 4. P. 735-740.

77. Hatano K., Sawano Y., Tanokura M. Structure-function relationship of bromelain isoinhibitors from pineapple stem // Biol. Chem. 2002 V. 383. № 78. P. 1151-1156.

78. Hawkes J.G. Evolutionary relationships of wild and cultivated potatoes // www.genres.de/infos/pdfs/bd04/0406.pdf

79. Не X., Zhang J. Rapid subfiinctionalisation accompanied by prolonged and substantial neofunctionalisation in duplicate genome evolution // Genetics. 2005. V. 169. P. 1157-1164.

80. Heibges A., Glaczinski H., Ballvora A., Salamini F., Gebhardt C. Structural diversity and organization of three gene families for Kunitz-type enzyme inhibitors from potato tubers (Solarium tuberosum L.) // Mol. Gen. Genomics. 2003. V. 269. P. 526-534.

81. Heibges A., Glaczinski H., Ballvora A., Salamini F., Gebhardt C. Functional comparison of homologous members of three groups of Kunitz-type enzyme inhibitors from potato tubers (Solarium tuberosum L.) // Mol. Gen. Genomics. 2003. V. 269. P. 535-541.

82. Heitz A., Hernandez J.F., Gagnon J., Hong T.T., Pham T.T., Nguyen T.M., Le-Nguyen D., Chiche L. Solution structure of the squash trypsin inhibitor MCoTI-II. A new family for cyclic knottins // Biochemistry. 2001. V. 40. № 27. P. 7973-7983.

83. Hendriks Т., Vreugdenhil D., Stiekema W.J. Patatin and four serine proteinase inhibitor genes are differentially expressed during potato tuber development // Plant Mol. Biol. 1991. V. 17. № 3. P. 385-394.

84. Herbers K., Prat S., Willmitzer L. Cloning and characterization of a cathepsin D inhibitor gene from Solarium tuberosum LII Plant Mol. Biol. 1994. V. 26. № l.P. 73-83.

85. Heussler V.T., Dobbelaere D.A. Cloning of a protease gene family of Fasciola hepatica by the polymerase chain reaction // Mol. Biochem. Parasitol. 1994. V. 64. № l.P. 11-23.

86. Hijmans R.J., Spooner D.M. Geographic distribution of wild potato species // Arner. J. Bot. 2001. V. 88. № 11. P. 2101-2112

87. Hildmann Т., Ebneth M., Pena-Cortes H., Sanchez-Serrano J.J., Willmitzer L., Prat S. General roles of abscisic and jasmonic acids in gene activation as a result of mechanical wounding // Plant Cell. 1992. V. 4. № 9. P. 1157-1170.

88. Hill R.M., Brennan S.O., Birch N.P. Expression, purification, and functional characterization of the serine protease inhibitor neuroserpin expressed in Drosophila S2 cells // Protein Expr. Purif. 2001. V. 22. № 3. P. 406-413.

89. Hiraga K., Suzuki Т., Oda K. A novel double-headed proteinaceous inhibitor for metalloproteinase and serine proteinase // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 33. P. 25173-25179.

90. Holcik M., Korneluk R.G. XIAP, the guardian angel // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2001. V.2. № 7. P. 550-556.

91. Hollik J.B., Gordon M.P. Transgenic Analysis of a Hybrid Poplar Wound-lnducible Promoter Reveals Developmental Patterns of Expression Similar to That of-Storage Protein Cenes // Plant Physiol. 1995. V. 109. P. 73-85.

92. Hsia N., Cornwall G.A. Cres2 and Cres3: new members of the cystatin-related epididymal spermatogenic subgroup of family 2 cystatins // Endocrinology.2003. V. 144. № з. P. 909-915.

93. Huaman Z., Spooner D.M. Reclassification of landrace populations of cultivated potatoes (Solarium sect. Petota) // Am. J. Bot. 2002. V. 89 № 6. P. 947-965.

94. Hung C.H., Lee M.C., Lin J.Y. Inactivation of Acacia confusa trypsin inhibitor by site-specific mutagenesis // FEBS Lett. 1994. V. 353. № 3. P. 312-314.

95. Huntington J.A., Read R.J., Carrell R.W. Structure of a serpin-protease complex shows inhibition by deformation // Nature. 2000. V. 407. № 6806. P. 923-926.

96. Husmeier D, Wright F, Milne I. Detecting interspecific recombination with a pruned probabilistic divergence measure // Bioinformatics. 2005. V. 21. № 9. P. 1797-1806.

97. Ichikawa K., Vailes L.D., Pomes A., Chapman M.D. Molecular cloning, expression and modelling of cat allergen, cystatin (Fel d 3), a cysteine protease inhibitor // Clin. Exp. Allergy. 2001. V. 31. № 8. P. 1279-1286.

98. Igeta H, Tamura Y, Nakaya K, Nakamura Y, Kurihara Y. Determination of disulfide array and subunit structure of taste-modifying protein, miraculin // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1079 № 3 P. 303-307.

99. Innan H. The coalescent and infinite-site model of a small multigene family // Genetics. 2003. V. 163. № 2. P. 803-810.

100. Innan H., Kim Y. Pattern of polymorphism after strong artificial selection in a domestication event // Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004. V. 101. № 29. P. 1066710672.

101. Ishikawa A., Ohta S., Matsuoka K., Hattori Т., Nakamura K. A family of potato genes that encode Kunitz-type proteinase inhibitors: structuralcomparisons and differential expression // Plant Cell Physiol. 1994. V. 35. P. 303-312.

102. Iwanaga S., Yamasaki N., Kimura M., Kouzuma Y. Contribution of conserved Asn residues to the inhibitory activities of Kunitz-type protease inhibitors from plants // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2005. V. 69. № 1. P. 220-223.

103. Jackson S.A., Hanneman R.E. Potential gene flow between cultivated potato and its wild tuber-bearing relatives: implications for risk assessment of transgenic potatoes //http://www.isb.vt.edu/brarg/brasym96/jackson96.htm

104. Jackson S.A., Hanneman R.E., Jr. An analysis of crossability between the culitvated potato and its wild relatives. Proceedings of the Biotechnology Risk Assessment Program. (Ed. M. Levin) Ottowa. Canada. 1996.

105. Jackson S.A., Hanneman R.E., Jr. Crossability among cultivated and wild tuber and non-tuber-bearing Solanums // Euphytica. 1999. V. 109. P. 51-67.

106. Jofuku K.D, Goldberg R.B. Kunitz trypsin inhibitor genes are differentially expressed during the soybean life cycle and in transformed tobacco plants // Plant Cell. 1989. V. 1 № 11 P. 1079-1093.

107. Jorgensen M., Bauw G., Welinder K.G. Molecular properties and activities of tuber proteins from starch potato Cv. Kuras // J. Agr. Food Chem. 2006. V. 54. P. 9389-9397.

108. Kaiserman D., Bird P.I. Analysis of vertebrate genomes suggests a new model for clade В serpin evolution // BMC Genomics. 2005. V. 6. № 167.

109. Kakade M.L., Rackis J.J., McGhee J.E., Puski G. Determination of trypsin inhibitor activity of soy products; a collaborative analysis of an improved procedure // Cereal Chem. 1974. V. 51. P. 376-382.

110. Kant R. Sweet proteins-potential replacement for artificial low calorie sweeteners //NutrJ. 2005. V. 9. P. 4-5.

111. Karrer E.E., Beachy R.N., Holt C.A. Cloning of tobacco genes that elicit the hypersensitive response // Plant Mol. Biol. 1998. V. 36. P. 681-690.

112. Keil M., Sanchez-Serrano J.J., Willmitzer L. Both wound-inducible and tuber-specific expression are mediated by the promoter of a single member of the potato proteinase inhibitor II gene family // EMBO J. 1989. V. 8. № 5. P. 1323-1330.

113. Keil M., Sanchez-Serrano J., Schell J., Willmitzer L. Localization of elements important for the wound-inducible expression of a chimeric potato proteinase inhibitor II-CAT gene in transgenic tobacco plants // Plant Cell. 1990. V. 2. № LP. 61-70.

114. Khamrui S., Dasgupta J., Dattagupta J.K., Sen U. Single mutation at PI of a chymotrypsin inhibitor changes it to a trypsin inhibitor: X-ray structural (2.15 A) and biochemical basis // Biochim. Biophys. Acta. 2005. V. 1752. № LP. 65-72.

115. Kim S., Hong Y.-N., An C.S., Lee K.-W. Expression characteristics of serine proteinase inhibitor II under variable environmental stresses in hot pepper (Capsicum annuum L.) // Plant Sci. 2001. V. 161. P. 27-33.

116. Kirchhamer C.V., Bogarad L.D., Davidson E.H. Developmental expression of synthetic cis-regulatory systems composed of spatial control elements from two different genes // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996. V. 93. № 24. P. 13849-13854.

117. Knapp S., Bohs L., Nee M., Spooner D.M. Solanaceae-a model for linking genomics with biodiversity // Сотр. Funct Genomics. 2004. V. 5 № 3. P. 285291.

118. Koiwa H., Bressan R.A., Hasegawa P.M. Regulation of protease inhibitors and plant defense // Trends Plant Science. 1997. V. 2. № 10. P. 379-384.

119. Kojima S., Kumagai I., Miura K. Effect of inhibitory activity of mutation at reaction site P4 of the Streptomyces subtilisin inhibitor, SSI // Protein Eng. 1990. V. 3. № 6. P. 527-530.

120. Kojima S., Kumagai I., Miura K. Requirement for a disulfide bridge near the reactive site of protease inhibitor SSI (Streptomyces subtilisin inhibitor) for its inhibitory action // J. Mol. Biol. 1993. V. 230. № 2. P. 395-399.

121. Kojima S., Fujimura K., Kumagai I., Miura K. Contribution of salt bridge in the protease inhibitor SSI (Streptomyces subtilisin inhibitor) to its inhibitory action // FEBS Lett. 1994. V. 337. № 2. P. 195-199.

122. Kojima S, Furukubo S, Kumagai I, Miura K. Effects of deletion in the flexible loop of the protease inhibitor SSI (Streptomyces subtilisin inhibitor) on interactions with proteases // Protein Eng. 1993 V. 6 № 3. P. 297-303.

123. Kouzuma Y., Suetake M., Kimura M., Yamasaki N. Isolation and primary structure of proteinase inhibitors from Erythrina variegata (Linn.) var. Orientalis seeds // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992. V. 56. № 11. P. 18191824.

124. Kreft S., Ravnikar M., Mesko P., Pungercar J., Umek A., Kregar I., Strukelj B. Jasmonic acid inducible aspartic proteinase inhibitors from potato // Phytochemistry. 1997. V. 44. № 6. P. 1001-1006.

125. Krizaj I., Drobnic-Kosorok M., Brzin J., Jerala R., Turk V. The primary structure of inhibitor of cysteine proteinases from potato // FEBS Lett. 1993. V. 333. P. 15-20.

126. Krowarsch D., Cierpicki Т., Jelen F., Otlewski J. Canonical protein inhibitors of serine protease CMLS // Cell. Mol. Life Sci. 2003. V. 60. P. 2427-2444.

127. Ku H-M., Vision Т., Liu J., Tanksley S.D. Comparing sequiensing segments of the tomato and Arabidopsis genomes: Large scale duplication followed by selective gene loss creates a network of synteny // PNAS. 2000. V. 97. № 16. P. 9121-9126.

128. Kumar S., Tamura K., Jakobsen I.B., Nei N. MEGA2: Molecular Evolutionary Genetics Analysis software. USA: Arizona State University. Tempe. 2001.

129. Kumar S., Tamura K., Nei N. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment // Brief Bioinform. 2004. V. 5 №2. P. 150-163.

130. Kunitz M. Crystalline soybean inhibitor // J. Gen. Physiol. 1946. V. 29. № 3. P. 149-154.

131. Kunitz M. Crystalline soybean trypsine inhibitor: II. General Properties // J. Gen. Physiol. 1947. V. 30. № 4. P. 291-310.

132. Kunitz M. Crystallization of a trypsin inhibitor from soybean // Science. 1945. V. 101. №3. P. 668-669.

133. Kutas J., Kondrak M., Szenthe В., Patthy A., Banfalvi Z., Nadasy M., Graf L., Asboth B. Colorado potato beetle larvae on potato plants expressing a locust proteinase inhibitor // Commun. Agric. Appl. Biol. Sci. 2004. V. 69. № 3. P. 281-287.

134. Lambert K.N., Ferrie B.J., Nombela G., Brenner E.D., Williamson V.M. Identification of genes whose transcripts accumulate rapidly in tomato // Physiol. Mol. Plant Pathol. 1999. V. 55. P. 341-348.

135. Laskowski M. Jr., Kato I. Protein inhibitors of proteinases // Ann. Rev. Biochem. 1980. V. 49. P. 593-626.

136. Lawrence P.K., Koundal K.R. Plant protease inhibitors in controls of phytophagos insects // EJB. 2002. V. 5. № 1. P. 93-109.

137. Lehle K., Wrba A., Jaenicke R. Erythrina caffra trypsin inhibitor retains itsnative structure and function after reducing its disulfide bonds // J. Mol. Biol. 1994. 239. №2. P. 276-284.

138. Lehmann P. Structure and evolution of plant disease resistance genes // J. Appl. Genet. 2002. V. 43. № 4. P. 403-414.

139. Leon J., Rojo E., Sanchez-Serrano J.J. Wound signalling in plants // J. Exp. Bot. 2001. V. 52. № 354. P. 1-9.

140. Li M., Phylip L.H., Lees W.E., Winther J.R., Dunn B.M., Wlodawer A., Kay J., Gustchina A. The aspartic proteinase from Saccharomyces cerevisiae folds its own inhibitor into a helix // Nat. Struct. Biol. 2000. V. 7. № 2. P. 113-117.

141. Lievens S., Goormachtig S., Holsters M. Nodule-enhanced protease inhibitor gene: emerging patterns of gene expression in nodule development on Sesbania rostrata II J. Exp. Bot. 2004. V. 55. № 394. P. 89-97.

142. Lynch M., Force A. The propability of duplicate gene preservation by subfunctionalisation // Genetics. 2000. V. 154. P. 459-473.

143. Lynch M., O'Hely M., Walsh В., Force A. The propability of preservation of a newly arisen gene duplicate // Genetics. 2001. V. 159. P. 1789-1804.

144. Macedo M.L., de Matos D.G., Machado O.L., Marangoni S., Novello J.C. Trypsin inhibitor from Dimorphandra mollis seeds: purification and properties //Phytochemistry. 2000. V. 54. № 6. P. 553-558.

145. Martin D.P., Williamson C., Posada D. RDP2: recombination detection and analysis from sequence alignments // Bioinformatics. 2005. V. 21. № 2. P. 260-262.

146. Martinez M., Abraham Z., Carbonero P., Diaz I. Comparative phylogenetic analysis of cystatin gene families from arabidopsis, rice and barley // Mol. Genet. Genomics. 2005. V. 273. № 5. P. 423-432.

147. Maslov S., Sneppen K., Eriksen K.A., Yan K.K. Upstream plasticity and downstream robustness in evolution of molecular networks // BMC Evol. Biol. 2004 V. 4 №9. 12 p.

148. Mazumdar-Leighton S., Broadway R.M. Identification of six chymotrypsin cDNAs from larval midguts of Helicoverpa zea and Agrotis ipsilon feeding onthe soybean (Kunitz) trypsin inhibitor // Insect. Biochem. Mol. Biol. 2001. V. 31. №6-7. P. 633-644.

149. McGuire G., Wright F. TOPAL: recombination detection in DNA and protein sequences // Bioinformatics. 1998. V. 14 № 2. P. 219-220.

150. McGuire G., Wright F. TOPAL 2.0: improved detection of mosaic sequences within multiple alignments // Bioinformatics. 2000. V. 16 № 2. P. 130-134.

151. Mello M.O., Tanaka A.S., Silva-Filho M.C. Molecular evolution of Bowman-Birk type proteinase inhibitors in flowering plants // Mol. Phylogenet. Evol. 2003. V. 27. № i.p. 103-112.

152. Mengwasser K.E., Bush L.A., Shih P., Cantwell A.M., Di Cera E. Hirudin binding reveals key determinants of thrombin allostery // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. № 29. P. 26997-27003.

153. Mezei L.M., Storts D.S. Purification of PCR products. In: PCR Technology: Current Innovations. Boston: CRC Press. 1994.

154. Michelmore R.W., Meyers B.C. Clusters of resistance genes in plants evolve by divergent selection and a Birth-and-Death process // Genome Res. 1998. V. 8. P. 1113-1130.

155. Miller E.A., Lee M.C.S., Atkinson A.H.O., Anderson M.A. Identification of a novel four-domain member of the proteinase inhibitor II family from the stigmas of Nicotiana alata II Plant Mol. Biol. 2000. V. 42. P. 329-333.

156. Mitsumori C., Yamagishi K., Fujino K., Kikuta Y. Detection of immunologically related Kunitz and Bowman-Birk proteinase inhibitors expressed during potato tuber development // Plant Mol. Biol. 1994. V. 26. № 3.P. 961-969.

157. Molnar A, Lovas A, Banfalvi Z, Lakatos L, Polgar Z, Horvath S. Tissue-specific signal(s) activate the promoter of a metallocarboxypeptidase inhibitor gene family in potato tuber and berry // Plant Mol. Biol. 2001. V. 46. № 3. P. 301-311.

158. Moura D.S., Ryan C.A. Wound-inducible proteinase inhibitors in pepper. Differential regulation upon wounding, systemin, and methyl jasmonate // Plant Phys. 2001. V. 126. P. 289-298.

159. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15 № 3 P. 473-497.

160. Nakamura K, Matsuota K, Mukumoto F, Watanabe N: Processing and transport to the vacuole of a precursor to sweet potato sporamin in transformed tobacco cell line BY-2 // J. Exp. Bot. 1993. V. 44 P. 331-338.

161. Nakane E., Kawakita K., Doke N., Yoshioka H. Elicitation of primary and secondary metabolism during defense in the potato // J. Gen. Plant Pathol. 2003. V. 69. P. 378-384.

162. Negreiros A.N., Carvalho M.M., Xavier Filho J., Blanco-Labra A., Shewry P.R., Richardson M. The complete amino acid sequence of the major Kunitz trypsin inhibitor from the seeds of Prosopsis juliflora I I Phytochemistry. 1991. V. 30. №9. P. 2829-2833.

163. Nei M. and Kumar S. Molecular evolution and phylogenetics. New York: Oxford University Press. 2000. P. 87

164. Otlewski J., Jelen F., Zakrzewska M., Oleksy A. The many faces of protease-protein inhibitor interaction // EMBO J. 2005. V. 24. № 7. P. 1303-1310.

165. Pando S.C., Oliva M.L.V., Sampaio C.A.V., Di Ciero L., Novello J.C., Marangoni S. Primary sequence determination of a Kunitz inhibitor isolated from Delonix regia seed // Phytochemistry. 2001. V. 57. P. 625-631.

166. Park K.-S., Cheong J.-J., Lee S.-J., Suh M.-Ch., Choi D. A novel proteinase inhibitor gene transiently induced by tobacco mosaic virus infection // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1492. P. 509-512.

167. Piatigorsky J., Wistow G. The recruitment of crystallins: new functions precede gene duplication // Science. 1991. V. 252 № 5009. P. 1078-1079.

168. Pompe-Novak M., Polsak-Prijatelj M., Popovic Т., Strucelj В., Ravnikar M. Impact of potato cysteine proteinases in plant growth and development // Phys. Mol. Plant Pathol. 2002. V. 60. P. 71-78.

169. Pouvreau L., Gruppen H., Piersma S.R., Van Den Broek L.A., Van Koningsveld G.A., Voragen A.G. Relative abundance and inhibitory distribution of protease inhibitors in potato juice from cv. Elkana // J. Agric. Food Chem. 2001. V. 49. P. 2864-2874.

170. Priestle J.P., Rahuel J., Rink H., Tones M., Grutter M.G. Changes in interactions in complexes of hirudin derivatives and human alpha-thrombin due to different crystal forms // Protein Sci. 1993. V. 2. № 10. P. 1630-1642.

171. Pulliam D.A., Williams D.L., Broadway D.M., Stewart S.N. Isolation and characterization of a serine proteinase inhibitor cDNA from cabbage and itsantibiosis in transgenic tobacco plants // Plant Cell Biotechnol. Mol. Biol. 2001. V. 2. № 1-2. P. 19-32.

172. Qi R.-F., Song Z.-W., Chi C.-W. Structural features and molecular evolution of Bowman-Birk protease inhibitors and their potential application //Acta Biochim. Biophys. Sin. 2005. V. 37. № 5. P. 283-292.

173. Quillien L., Ferrasson E., Molle D., Gueguen J. Trypsin inhibitor polymorphism: multigene family expression and posttranslational modification // J. Protein Chem. 1997. V. 16. № 3. P. 195-203.

174. Radisky E.S. and Koshland D.E. A clogged gutter mechanism for protease inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002. V. 99. № 16. P. 1031610321.

175. Raker C.M., Spooner D.M. Chilean tetraploid cultivated potato, Solanum tuberosum, is distinct from the Andean Populations: Microsatellite Data // Crop Sci. 2002. V. 42. P. 1451-1458.

176. Rawlings N.D., Tolle D.P., Barrett A.J. Evolutionary families of peptidase inhibitors //Biochem. J. 2004. V. 378. P. 705-716.

177. Rawlings N.D., Morton F.R., Barrett A.J. MEROPS: the peptidase database //

178. Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 270-272.

179. Rheaume C., Goodwin R.L., Latimer J.J., Baumann H., Berger F.G. Evolution of murine alpha 1-proteinase inhibitors: gene amplification and reactive center divergence//J. Mol. Evol. 1994. V. 38. №2. P. 121-131.

180. Richardson J.L., Kroger В., Hoeffken W., Sadler J.E., Pereira P., Huber R., Bode W., Fuentes-Prior P. Crystal structure of the human alpha-thrombin-haemadin complex: an exosite II-binding inhibitor // EMBO J. 2000. V. 19. № 21. P. 5650-5660.

181. Rick C.M. Hybrids Between Lycopersicon Esculentum Mill. And Solanum Lycopersicoides Dun. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1951. V. 37 № 11. P. 741-744.

182. Rodenburg K.W., Varallyay E., Svendsen lb, Svendson B. Arg-27, Arg-127 and Arg-155 in the p-trefoil protein barley a-amylase/subtilisin inhibitor are interface residues in the complex with barley oc-amylase 2 // Biochem. J. 1995. V. 309. P. 969-976.

183. Rowan A.D., Brzin J., Buttle D.J., Barrett A.J. Inhibition of cysteine proteinases by a protein inhibitor from potato // FEBS Lett. 1990. V. 269. № 2. P. 328-330.

184. Roychaudhuri R., Sarath G., Zeece M., Markwell J. Reversible denaturation of the soybean Kunitz trypsin inhibitor // Arch. Biochem. Biophys. 2003. V. 412. № l.p. 20-26.

185. Roychaudhuri R., Sarath G., Zeece M., Markwell J. Stability of the allergenic soybean Kunitz trypsin inhibitor // Biochim. Biophys. Acta. 2004. V. 1699. № 1-2. P. 207-212.

186. Rozas J., Sanchez-DelBarrio J.C., Messeguer X., Rozas R. DnaSP, DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods // Bioinformatics. 2003. V. 19 №> 18. P. 2496-2497.

187. Rudolph R, Lilie H. In vitro folding of inclusion body proteins // FASEB J. 1996. V. 10№ LP. 49-56.

188. Saarikoski P., Clapham D., von Arnold S. A wound-inducible gene from Salix viminalis coding for a trypsin inhibitor // Plant Mol. Biol. 1996. V. 31. № 3. P. 465-478.

189. Sahin-Toth M. Human mesotrypsin defies natural trypsin inhibitors: from passive resistance to active destruction // Protein Pept. Lett. 2005. V. 12. № 5.p. 457-464.

190. Sambrook J., Fritch E., Maniatis T. Molecular Cloning: A laboratory manual. /j

191. Ed. 2 . Cold Spring Harbor, New-York.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1981. V. 3.

192. Sanchez-Serrano J.J., Pena-Cortes H., Willmitzer L., Prat S. Identification of potato nuclear proteins binding to the distal promoter region of the proteinase inhibitor II gene // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1990. V. 87. № 18. P. 72057209.

193. Schaller M., Borelli C., Korting H.C., Hube B. Hydrolytic enzymes as virulence factors of Candida albicans II Mycoses. 2005 V. 48. № 6. P. 365377.

194. Scott F.L., Denault J.B., Riedl S.J., Shin H., Renatus M., Salvesen G.S. XIAP inhibits caspase-3 and -7 using two binding sites: evolutionarily conserved mechanism of IAPs // EMBO J. 2005. V. 24. № 3. P. 645-655.

195. Shewry P.R. Tuber storage proteins // Ann. Bot. 2003. V. 91. P. 755-769.

196. Shoemaker K., Holloway J.L., Whitmore Т.Е., Maurer M., Feldhaus A.L. Molecular cloning, chromosome mapping and characterization of a testis-specific cystatin-like cDNA, cystatin T // Gene. 2000. V. 245. № 1. P. 103108.

197. Schonbaum G.R., Zerner В., Bender M.L. The spectrophotometric determination of the operational normality of an alpha-chymotrypsin solution //J Biol Chem. 1961. V. 236. P. 2930-2935.

198. Simillion С., Vandepoele К., Van Montagu M.C.E., Zabeau M., Van de Peer Y. The hidden duplication past of Arabidopsis thaliana II PNAS. 2002. V. 99. №21. P. 13627-13632.

199. Sims A.H., Dunn-Coleman N.S., Robson G.D., Oliver S.G. Glutamic protease distribution is limited to filamentous fungi // FEMS Microbiol. Lett. 2004. V. 239. № i.p. 95-101.

200. Song H.K., Kim Y.S., Yang J.K., Moon J., Lee J.Y., Suh S.W. Crystal structure of a 16 kDa double-headed Bowman-Birk trypsin inhibitor from barley seeds at 1.9 A resolution // J. Mol. Biol. 1999. V. 293. № 5. V. 11331144.

201. Sonnante G., Paolis A.D., Pignone D. Bowman-Birk inhibitors in Lens: identification and characterization of two paralogous gene classes in cultivated lentil and wild relatives // Theor. Appl. Genet. 2005. V. 110. № 3. P. 596-604.

202. Spooner D.M., Anderson G.J., JANSEN R.K. Chloroplast DNA evidence for the interrelationships of tomatoes, potatoes, and pepinos // Am. J. Bot. 1993. V. 80. P. 676-688.

203. Stiekema W.J., Heidekamp F., Dirkse W.G., van Beckum J., Haan P., ten Bosch C., Louwerse J.D. Molecular cloning and analysis of four potato tuber mRNAs // Plant Mol. Biol. 1988. V. 11. P. 255-269.

204. Strukelj В., Pungercar J., Ritonja A., Krizaj I., Gubensek F., Kregar I., Turk V. Nucleotide and deduced amino acid sequence of an aspartic proteinase inhibitor homologue from potato tubers {Solanum tuberosum L.) // Nucleic

205. Acids Res. 1990. V. 18. № 15. p. 4605.

206. Strukelj В., Pungercar J., Mesko P., Barlic-Maganja D., Gubensek F., Kregar I., Turk V. Characterization of aspartic proteinase inhibitors from potato at the gene, cDNA and protein levels // Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1992. V. 373. № 7. P. 477-482.

207. Sturm A. Invertases. Primary structures, functions, and roles in plant development and sucrose partitioning // Plant Physiol. 1999. V. 121. № 1. P. 18.

208. Suh S.G., Peterson J.E., Stiekema W.J., Hannapel DJ. Purification and characterization of the 22-kilodalton potato tuber proteins // Plant Physiol. 1990. V. 94. № l.P. 40-45.

209. Sumikawa J.T., Nakahata A.M., Fritz H., Mentele R., Sampaio M.U., Oliva M.L. A Kunitz-type glycosylated elastase inhibitor with one disulfide bridge // Planta Med. 2006. V. 72. № 5. p. 393-397.

210. Sukhotu Т., Kamijima O., Hosaka K. Nuclear and chloroplast DNA differentiation in Andean potatoes // Genome. 2004. V. 47 № 1. P. 46-56.

211. Sweet R.M., Wright H.T., Janin J., Chothia C.H., Blow D.M. Crystal structure of the complex of porcine trypsin with soybean trypsin inhibitor (Kunitz) at 2.6-A resolution // Biochemistry. 1974. V. 13. № 20. P. 4212-4228.

212. Takahashi N., Hitotsuya H., Hanzawa H., Arata Y., Kurihara Y. Structural study of asparagine-linked oligosaccharide moiety of taste-modifying protein, miraculin//J. Biol. Chemistry. 1990. V. 265. № 14. P. 7793-7798.

213. Teichmann S.A., Babu M.M. Gene regulatory network growth by duplication //Nat. Genet. 2004. V. 36. № 5. P. 492-496.

214. Theerasilp S., Kurihara Y. Complete purification and characterization of the taste-modifying protein, miraculin, from miracle fruit // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. № 23. P. 11536-11539.

215. Theerasilp S., Hitotsuya H., Nakajo S., Nakaya K., Nakamura Y., Kurihara Y. Complete amino acid sequence and structure characterization of the taste-modifying protein, miraculin // J. Biol. Chem. 1989 V. 264. № 12. 6655-6659.

216. Thiesse M., Millar S.J., Dickinson D.P. The human type 2 cystatin gene family consists of eight to nine members, with at least seven genes clustered at a single locus on human chromosome 20 // DNA Cell Biol. 1994. V. 13. № 2. P. 97-116.

217. Tiffin P., Gaut B.S. Sequence diversity in the tetraploid Zea perennis and the closely related diploid Z. diploperennis: insights from four nuclear loci // Genetics. 2001. V. 158. P. 401-412.

218. Tohonen V., Osterlund C., Nordqvist K. Testatin: a cystatin-related gene expressed during early testis development // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. V. 95. № 24. P. 14208-14213.

219. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1979. V. 76. P. 4350-4354.

220. Trumper S., Follmann H., Haberlein I. A novel-dehydroascorbate reductase from spinach chloroplasts homologous to plant trypsin inhibitor // FEBS Lett. 1994. V. 352. №2. P. 159-162.

221. Valente R.H., Dragulev В., Perales J., Fox J.W., Domont G.B. BJ46a, a snake venom metalloproteinase inhibitor isolation, characterization, cloning andinsights into its mechanism of action I I Eur. J. Biochem. 2001. V. 268. P. 3042-3052.

222. Valueva T.A., Revina T.A., Kladnitskaya G.V., Mosolov V.V., Mentele P. Kunitz-type proteinase inhibitors from intact and Phytophtora-infected potato tubers // FEBS Letters. 1998. V. 426. P. 131-134.

223. Venhudova G., Canals F., Querol E., Aviles F.X. Mutations in the N- and C-terminal tails of potato carboxypeptidase inhibitor influence its oxidative refolding process at the reshuffling stage // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. № 15. P. 11683-11690.

224. Vieira J., Messin J. New pUC-derived cloning vectors with different selectable markers and DNA replicatin origins // Gene. 1991. V. 100. P. 184-194.

225. Walsh T.A., Strikland J.A. Proteolisys of the 85-kilodalton crystalline cysteine proteinase inhibitor from potato releases functional cystatin domains // Plant Physiol. 1993. V. 103. P. 1227-1234.

226. Walsh T.A., Twitchell W.P. Two Kunitz-Type Proteinase Inhibitors from Potato Tubers // Plant Physiol. 1991. V. 97. № 1. P. 15-18.

227. Wang P., Li G., Kain W. Characterization and cDNA cloning of midgut carboxypeptidases from Trichoplusia ni II Insect Biochem. Mol. Biol. 2004. V. 34. №8. P. 831-843.

228. Wang H.X., Ng T.V. Concurrent isolation of a Kunitz-type trypsin inhibitor with antifungal activity and a novel lectin from Pseudostellaria heterophylla roots //Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. V. 342. № 1. P. 349-353.

229. Xu G., Rich R.L., Steegborn C., Min Т., Huang Y., Myszka D.G., Wu H. Mutational analyses of the p35-caspase interaction. A bowstring kinetic model of caspase inhibition by p35 // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. № 7. P. 54555461.

230. Yabuki Y., Kubota K., Kojima M., Inoue H., Takahashi K. Identification of a glutamine residue essential for catalytic activity of aspergilloglutamic peptidase by site-directed mutagenesis // FEBS Lett. 2004. V. 569. № 1-3. 161-164.

231. Yamagishi K., Mitsumori C., Kikuta Y. Nucleotide sequence of a cDNA encoding the putative trypsin inhibitor in potato tuber // Plant Mol. Biol. 1991. V. 17. №2. P. 287-288.

232. Yamashita H., Theerasilp S., Aiuchi Т., Nakaya K., Nakamura Y., Kurihara Y. Purification and complete amino acid sequence of a new type of sweet protein taste-modifying activity, curculin // J. Biol. Chemistry. 1990. V. 265. № 26. P. 15770-15775.

233. Yao P.L., Hwang M.J., Chen Y.M., Yeh K.W. Site-directed mutagenesis evidence for a negatively charged trypsin inhibitory loop in sweet potato sporamin //FEBS Lett. 2001. V. 496. № 2-3. P. 134-138.

234. Ye S., Cech A.L., Belmares R., Bergstrom R.C., Tong Y., Corey D.R., Kanost M.R., Goldsmith E.J. The structure of a Michaelis serpin-protease complex // Nat. Struct. Biol. 2001. V. 8. № 11. P. 979-983.

235. Yeh K.W., Chen J.C., Lin M.I., Chen Y.M., Lin C.Y. Functional activity of sporamin from sweet potato (Ipomoea batatas Lam.): a tuber storage proteinwith trypsin inhibitory activity // Plant Mol. Biol. 1997. V. 33. № 3. P. 565570.

236. Zavala J.A., Patankar A.G., Gase K., Hui D., Baldwin J.T. Manipulation of endogenous trypsin proteinase inhibitor production in Nicotiana attenuata demonstrates their function as antiherbivore defense // Plant Physiol. 2004. V. 134. P. 1181-1190.

237. Zoog S.J., Bertin J., Friesen P.D. Caspase inhibition by baculovirus P35 requires interaction between the reactive site loop and the beta-sheet core // J. Biol. Chem. 1999 V. 274. № 37. P. 25995-26002.

238. Werner R., Guitton M.C., Muhlbach H.P. Nucleotide sequence of a cathepsin D inhibitor protein from tomato // Plant Physiol. 1993. V. 103 № 4. P. 14731473.

Информация о работе

Сперанская, Анна Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Ингибиторы протеиназ типа Кунитца из картофеля: молекулярное клонирование и экспрессия генов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы