Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ингибирование свободно-радикальных реакций и точечные мутации при радиационном повреждении сахарного фрагмента ДНК: компьютерное моделирование

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Ингибирование свободно-радикальных реакций и точечные мутации при радиационном повреждении сахарного фрагмента ДНК: компьютерное моделирование"

I I

На правах рукописи

ЙГБ ОД

О 4 дек

Кузурман Петр Андреевич

ПНГИБИРОВАНИЕ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ И ТОЧЕЧНЫЕ МУТАЦИИ ПРИ РАДИАЦИОННОМ ПОВРЕЖДЕНИИ САХАРНОГО ФРАГМЕНТА ДНК. КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ.

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 2000

Работа выполнена в Институте оиохимичи,*«*. Российской Академии Наук

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор В.А.Шарпатый Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор В.Г. Туманян, доктор химических наук И.И. Сапежинский.

Ведущая организация - Институт химической физики им. Н.Н.Семенова РАН

Зашита состоится -А- 2000 г. в ¿-¿-часов на заседании диссертационного совета Д 200.53.01 в Институте биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН. Адрес: 117977 Москва, ул.Косыгина, д. 4, ИБХФ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им. Н.Н.Семенова РАН по адресу: ул. Косыгина, 4.

рг ОД

Автореферат разослан _ 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д.200.53.01 кандидат химических наук М.А.Смотряева

Е ОЧ1 -щ, О

ръЬ%, О

0

I I

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Радиозащита ДНК на первичных, физико-химических стадиях ее лучевого поражения в клетке по свободнорадикальному механизму, как принято считать, связана с реализацией двух процессов: а) конкуренции за радикалы - продукты радиолиза воды между веществом-радиопротектором и биополимером; б) ингибирова-ния свободнорадикальных реакций, по Н.М.Эмануэлю, 1957. Реализация этих процессов при облучении живых организмов вызывает радиозащитный эффект(Эмануэль Н.М.,Бур-лакова Е.Б., Круглякова К.Е., Сапежинский И.И., 1966), а на молекулярном уровне - снижение выхода модификации оснований и различных процессов изменения сахарофосфат-ного остова ДНК.

Анализ данных по радиолизу растворов ДНК в присутствии веществ-радиопротекторов показывает, что восстановление исходной структуры в полимере возможно лишь в том случае, если неспаренный электрон в первичном макрорадикале локализован на 2- дезок-сирибозильном звене. Как известно,при радиолизе углеводов в водных растворах образуются стереоизомеры (эпимеры) исходных соединений: в результате реакций восстановления радикалов сахара, в частности, первичных радикалов дезоксирибозы (Кочетков Н.К., Кудряшов Л.И. и др., 1970-78). Если предположить, что такого типа процесс возможен и при облучении ДНК (образование эпимеров 2-дезоксирибозы), то тезис о восстановлении исходной(первоначальной) структуры 2-дезоксирибозы в реакциях ее радикалов с веществом - ингибитором нуждается в корректировке, а именно: поскольку асимметрическими атомами в 2-дезоксирибозе являются Сь Сз и С4, следует ожидать образования продуктов радиолиза - эпимеров именно по этим атомам. Отсюда можно было бы прийти к выводу, что и по реакции ингибитора 1пН с первичными макрорадикалами С'ь С'з и С4, имеющими планарные связи С-С и С-О,наряду с восстановлением исходной конфигурации связей - структуры фуранозного цикла(истинного восстановления повреждений ДНК) возможно образование и стереоизомеров(по крайней мере,с 50%-й вероятностью,учитывая возможный подход молекулы 1пН с двух сторон к "сахарному"радикалу с пленарной конфигурацией химических связей). Поскольку появление таких стереоизомеров должно изменить ориентацию оснований в пространстве, то модифицированные т.о. нуклеотиды (радиация + действие 1пН) могли бы стать в ДНК потенциальными сайтами точечных (транзиций и трансверсий) мутаций. Отсюда можно сделать вывод, что одна из возможных причин точечных мутаций- пред-мутационные изменения, вызванные образованием эпимеров остатка 2-дезоксирибозы, а другая - согласно общепринятой точке зрения - модификация азотистых оснований. Ряд экспериментальных данных по химической защите генетических систем биообъектов (Моссэ И.Б., 1974,1990; Померанцева М.Д. и др.,1981) косвенно подтверждает вышепри-

веденную точку зрения о "сахарной" природе точечных мутаций.

Представляется, что методом, позволяющим решить эту проблему, является метод компьютерного моделирования (МКМ), которому присущи: а) возможность моделирования пространственных молекулярных структур и их фрагментов, б) возможность оперативных изменений в структурах биомакромолекул под воздействием различных факторов, в) возможность моделирования биохимического процесса по соответствующим элементарным актам. Поэтому МКМ в сочетании с разработанной компьютерной технологией получения количественных параметров взаимодействующих молекулярных структур был избран для решения поставленной задачи. Этот метод позволяет, основываясь на результатах исследований (эксперименты лаборатории физической химии ДНК и других биополимеров ИБХФ РАН и литературные данные ) по радиолизу ДНК и соединений, моделирующих ее фрагменты, проанализировать механизмы превращений каждого из 5 типов первичных радикалов 2-дезоксирибозы во всех 4-х дезоксинуклеотидах вплоть до образования конечных молекулярных продуктов деструкции сахарного фрагментам том числе и в присутствии вещества-ингибитора. В отличие от существующих методик моделирования например, рассматривающих взаимодействие поверхностей молекулярных структур по динамическому механизму (Woodcock et al., 1995), используемая оперирует с функциональными группами (активными центрами) реагентов и их промежуточным комплексом (в статическом режиме).

К радиационным процессам модификации ДНК относят образование однонитевых разрывов (ОР), щелочно-лабильных связей (ЩЛС), выделение свободных азотистых оснований (CAO), образование 5',8-циклических производных пуринов и т.п. (Амирагова и др., 1964; Рябченко, 1979; Fuciarelli et al., 1985; S warts, 1995). Все эти повреждения можно связать с превращениями первичных 2-дезоксирибозильных радикалов C'i- C'j. Представлялось интересным определить, с превращениями какого именно радикала связано то или иное повреждение сахарофосфатного остова, количественно оценить вклад каждого из 2-дезоксирибозильных радикалов в эти повреждения ДНК и, наконец,оценить (прогнозировать) максимальный эффект влияния на процессы превращений радикалов в облучаемой клетке вещества-ингибитора (InH) свободнорадикальных реакций (СРР).

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Цель данного исследования состояла в том,чтобы,разработав компьтерную методику моделирования процесса взаимодействия макрорадикалов и молекул веществ-ингибитора СРР, определить стерическую вероятность взаимодействия молекул ингибиторов с макрорадикалами 2-дезоксирибозила по двум альтернативным направлениям: радиозащита (восстановление исходной структуры биополимера) и процесс образования стереоизомеров 2-дезоксирибозы в составе ДНК (потенциальных сайтов точечных мутаций).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

1. Предложен метод количественной оценки стерической вероятности взаимодействия любых двух молекул, фрагмента биополимера и молекулы, основанный на компьютерном моделировании(метод окна доступа). Этим методом определена вероятность взаимодействия различных ингибиторов со всеми радикалами сахарного фрагмента ДНК.

2. Этим методом впервые оценена эффективность радиозащиты по повреждениям сахарного фрагмента ДНК и вероятность образования стереоизомеров, исходя из превращений каждого из радикалов 2-дезоксирибозила в присутствии веществ-ингибиторов.

3. Представлена схема образования однонитевых разрывов и выделения свободных оснований, связывающая оба этих процесса с последовательностью превращений одного и того же типа радикалов.

4. Оценена (в первом приближении) принципиальная возможность образования водородных связей между основанием в канонических нуклеотидах и основанием в эпимере-про-дукте радиационной модификации 2-дезоксирибозы в составе ДНК; оценена вероятность максимального выхода потенциальных точечных мутаций при образовании стереоизомеров 2-дезоксирибозы.

ПРАКТИЧЕСКОЕ И ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Разработан метод количественной оценки вероятности взаимодействия любых двух молекул или фрагмента биополимера и молекулы, основанный на стерическом моделировании (метод окна доступа). Для использования метода необходимы сведения о структуре взаимодействующих молекул и хотя бы приблизительное знание механизма взаимодействия. Показана возможность применения метода окна доступа для оценки вероятности взаимодействия всех радикалов 2-дезоксирибозила с различными ингибиторами для определения относительного выхода повреждений ДНК. ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Метод моделирования реакции замещения + 1пН, оценка вероятности взаимодействия двух молекул (метод окна доступа).

2. Конструирование 3-мерных моделей исходных нуклеотидов, их радикалов и стереоизомеров 2-дезоксирибозы.

3. Результаты оценки эффективности радиозащиты от повреждений сахарного фрагмента нуклеотида в ДНК, исходя из превращений каждого из радикалов 2-дезоксирибозила при взаимодействии с различными ингибиторами.

4. Оценка выхода потенциальных предмутационных повреждений при образовании эпи-меров 2-дезоксирибозы в реакциях Яск с различными ингибиторами.

5. Сведение материального баланса по промежуточным (радикалы С'„, п=1-5) и основным конечным продуктам радиолиза сахарного фрагмента в В-ДНК.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследований доложены на: 3-м Съезде по радиа-диационньм исследованиям,14-17 октября 1997, Москва; Международном симпозиуме в рамках международной выставки "Медицина и охрана здоровья. Медтехника и Аптека" (16-19 сентября 1997), Тюмень; Всероссийской конференции с международным участием 16-17 ноября, 1998 г., Москва; У-ой Международной конференции "Биоантиоксидант", 18-20 ноября 1998 г., Москва; И-ом Съезде биофизиков России, 23-27 августа 1999 г., Москва; Ш-й Баховской конференции по радиационной химии, 5-7 июня 2000 г., Москва. ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ. СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация включает введение, 6 глав, выводы, список литературы, рисунков, 4 таблицы, в списке литературы наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ В первой главе("Ингибирование превращений 2-дезоксирибозильных радикалов: радиозащита и точечные мутации")содержится обзор научных работ по теме диссертации. Рассмотрены существующие в радиационной генетике представления о молекулярной природе точечных мутаций, инициируемых действием ионизирующих излучений на клетку, организм.

На основе анализа литературных данных сделаны следующие выводы:

1. Общепринятая точка зрения на происхождение точечных мутаций - модификация (или замена) азотистых оснований в ДНК.

2. Ряд экспериментальных данных(облучение в присутствии ингибитора СРР, Ог-эффект, эффект мощности дозы облучения) противоречат распространенной точке зрения на природу точечных мутаций. Так, в присутствии ингибитора СРР вместо ожидаемого уменьшения частоты мутаций за счет снижения выхода поврежденных оснований наблюдается ее увеличение.

3. В радиационной генетике природа точечных мутаций не конкретизируется,не рассматриваются первичные молекулярные механизмы их возниковения.

4. Из радиационной химии ДНК и ее растворов следует существование двух равнозначных каналов деструкции полимера: повреждение оснований (под влиянием ОН и ещдр.) и разрушение сахарофосфатного остова (радикалы ОН) - через образование алкильных радикалов 2-дезоксирибозила.

5. В реакциях взамодействия алкильных радикалов с ингибиторами СРР возможно образование стереоизомеров остатка 2-дезоксирибозы.

6. Появление стереоизомеров 2-дезоксирибозы в составе ДНК позволяет снять противоречия экспериментальных данных в радиационной генетике,приняв стереоизомеры в качестве потенциальных сайтов точечных мутаций.

Представляется интересным определить,имеет ли право на существование сформулиро-

а •

ванное положение о роли первичного повреждения сахарного фрагмента ДНК как потенциального источника предмутационных повреждений, ведущих к точечным мутациям. Единственным методом в настоящее время, позволяющим решить эту проблему, по нашему мнению, является метод компьютерного моделирования. В конце главы 1 сформулированы конкретные цели исследования. В главе 2("Компьютерное моделирование взаимодействия радикалов 2-дезоксирибозила с 1пН") изложены основы метода (метод окна доступа, схема эксперимента) моделирования реакции ингибирования превращений радикалов сахара.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В третьей главе ("Разработка количественного метода оценки вероятности взаимодействия двух молекул") излагаются принципы метода окна доступа, позволяющего количественно оценивать параметры промежуточного комплекса реагентов при протекании реакции замещения. В основе метода следующие положения: 1) выделение активной части атакующей молекулы (1пН), 2) замена активной части молекулы 1пН ее образом(маской), 3) моделирование процесса ^„-ЯпН осуществляется между молекулой-мишенью(макро-радикал) и маской, 4) вероятность (эффективность) взаимодействия реагентов рассчитывается по формуле:

ЕГК = ^^(1-со8а/2),

(г

где г - расстояние реализации химической связи между реагентами; а -величина плоского угла при вершине конуса, вписанного в телесный угол подхода - эффективная площадь маски атакующей молекулы.

Этот метод дополняет метод компьютерного моделирования возможностью количественной оценки вероятности взаимодействия молекул-критерием,определяемым исключительно стерическнми соображениями(только конфигурацией промежуточного комплекса реагентов). Универсальность этого метода позволяет решать две принципиальные задачи: прямая задача - определение вероятности взаимодействия молекул при известных пространственных структурах молекул и механизме их взаимодействия; обратная задача - уточнение (определение) 3-мерных структур реагирующих молекул и (или) конкретизация механизма их взаимодействия при наличии экспериментальных данных о вероятности (даже суммарной) их взаимодействия. Метод окна доступа позволяет производить отбор перспективных средств, специфических по данному типу повреждения (превращения именно этого типа радикала) ДНК, с целью достижения радиозащиты или возможного мутагенного эффекта. В отличие от существующих подходов для достижения подобных эффектов, метод позволяет, варьируя размеры эффективной маски вещества-ингибитора, добиваться селективного воздействия

на превращения тех или иных радикалов 2-дезоксирибозила для получения прогнозируемого результата- по сути управлять указанными процессами: радиозащиты и потенциального мутагенеза. Технологии отбора лекарств, стимуляторов роста растений и т.п., основанные на данном методе, не требуют предварительного проведения дорогостоящих экспериментов на биологических объектах.

В 4-ой главе ("Изменение положения азотистых оснований в макрорадикалах 2-дезокси-рибозила относительно исходного нуклеотида") излагаются результаты моделирования структур исходных нуклеотидов и радикалов 2-дезоксирибозила в составе нуклеотида и полинуклеотидных цепочек. В качестве исходной была взята структура 2-дезоксирибозы в С'2-эндо-конформации(что соответствует максимально обводненной ДНК или В- ДНК), расстояние между соседними фосфатными группами принималось равным - 7А. Длины связей и углы в сахарном фрагменте отличались от литературных данных не более чем на 2%. Все нуклеотиды рассматривались в анти-ориентации относительно М-гликозид-ной связи (Рис. 1).

При построении структур алкильных радикалов постулировалось, что в акте образования радикала происходит перегибридизация Бр-орбиталей (ер3 —» ер2). Радикалы 2-дезоксирибозила обладают планарной конфигурацией (Рис. 2) оставшихся у атома углерода с неспаренным электроном трех химических связей с атомами С и О. Отсюда следует, что акт образования любого 2-дезоксирибозильного радикала в этом поврежденном нуклеоти де сопровождается изменением ориентации основания в пространстве (Рис. 1). Изменение расположения в пространстве сохранившихся фрагментов этого нуклеотида при локализации неспаренного электрона на том или ином атоме углерода в 2-дезоксирибозиле может означать и неравновероятный доступ молекулы 1пН к этим пяти радикалам.

При моделировании принималось: 1. За время радиационного воздействия на В-ДНК и протекания реакций превращения первичных ион-радикальных и радикальных продуктов радиолиза, включая реакции замещения типа Л' + 1пН = ЯН + 1п', (1), структура ДНК в целом сохраняется; 2. Вероятность образования радикалов отрыва атома Н от атомов углерода в фуранозном цикле ДНК одинаковая величина выхода радикала С'„ определяется числом связей С-Н у п-го углеродного атома; 3. Возникновение любого из пяти типов радикалов (через элементарные акты ионизации с последующей депротонизацией возникающих катион-радикалов или при атаке связей С-Н радикалами ОН) изменяет конфор-мацию 2-дезоксирибозила,что может приводить к разрыву водородных связей между комплементарными основаниями; 4. В фуранозном цикле ¡-го радикала стерические изменения. вносимые перегибридизацией связей С', в структуру сахара, минимизировались.

Сборка исходных моделей велась по следующей принципиальной схеме: 1) Построение модели 2-дезоксирибозы в соответствии с экспериментальными данными

(Рис. 2); 2) Присоединение к модели 2-дезоксирибозы необходимого основания по валентным связям (Рис. 2); 3) Поворот основания вокруг И-гликозидной связи на угол, соответствующий анти-ориентации (Рис. 2). Исходная модель нуклеотида представлена на Рис. 1. При конструировании моделей радикалов учитывалось следующее: 1) Замена связей эр3—>5р2(Рис. 2) для соответствующего атома С; 2) Максимально возможная сохранность конфигурации атомов остальной части сахарного фрагмента; 3) Присоединение необходимого основания к модели свободного радикала(радикал по £'| - Рис. I).

Из построенных моделей макрорадикалов 2-дезоксирибозила (Рис. 3), как для отдельно взятых нуклеотидов, так и в составе полинуклеотидных цепочек, видно: во всех случаях наблюдаются смещения азотистых оснований по сравнению с исходным нуклеотидом (Рис. 1). Величина смещения варьирует в пределах от 49° и до 0° . При этом максимальная величина - 49° в случае радикала С'], минимальное - в случае С'5 (Табл.1).

Помимо реакции замещения, моделировался процесс превращений радикалов в отсутствии 1пН - передача повреждения с сахара на основание в пределах одного нуклеотида с образованием ЩЛС и реакция С'5 + Се пурина с образованием С'5,С8-ЦПП. В первом случае возможны два варианта передачи такого повреждения(Глава 1): переброс неспаренно-го электрона с протонированием образующегося при этом е-аддукта основания и передача непосредственно Н на основание.

Моделирование первого процесса показало возможность переброса неспаренного электрона за счет изомеризации радикала 2-дезоксирибозила. В фуранозном кольце моделировался процесс отщепления Н от каждого атома С, за исключением атома с неспаренным электроном, с учетом планарной конфигурации химических связей при этом атоме. Вращением основания вокруг С-М-связи определялось минимальное расстояние, необходимое для потенциального перехода Н от радикала сахара на основание. Анализ показал, что эти расстояния в случае радикала С'2 от С*1 до Сб для тимина равно 2,4 А, а в радикалах аденозина- от С'1 до С8 в радикале С'"2 - 2,6 А и от С'г до Се в радикале С'1 - 2,7 А. Отсюда можно было заключить, что 2-ой вариант передачи повреждения с сахара на основание вряд ли реализуется.

Моделирование образования ЦПП показало возможность реализации химической связи С'"5 - Се из имидазольного цикла пурина (в промежуточном комплексе расстояние между атомами С'5 и С8 - 1-1,2 А) в том случае, если конформация 2-дезоксирибозила: О'4-экзо или С'гЭНДО.

В 5-ой главе ("Исследование методом окна доступа процесса взаимодействия радикалов 2-дезоксирибозила в ДНК с веществами-ингибиторами - реакции замещения") сформулированы основные результаты моделирования реакции замещения для радикалов 2-дезок-сирибозила и ряда ингибиторов СРР. Описана технология построения 3-мерных структур

молекул исследовавшихся ингибиторов с различными Н-донаторскими группами - гидро-ксильными и сульфгидрильными(Рис. 3 ). Методом окна доступа изучена эффективность процессов радиозащиты при образовании однонитевых разрывов, ОР (в результате превращений алкильных радикалов С'з, С'з и С'4 - в присутствии Ог), щелочно-лабильных сайтов, ЩЛС (превращения радикалов С'ь С: и С'4 - без 02), 5',8 - циклопроизводных пуринов, ЦПП (присоединение радикала С'5 к атому углерода Се в имидазольном цикле) при взаимодействии всех радикалов 2-дезоксирибозила с различными 1пН (Рис. 3). Построены 3-мерные модели С1!-,С'з- и С'4-стереоизомеров 2-дезоксирибозы по аналогии с моделями исходных нуклеотидов. Соединение сахара с основанием проводилось по связям,зеркальным относительно плоскости, образуемой планарными связями соответствующего радикала (Рис. 1). Модели стереоизомеров позволили количественно оценить угол отклонения №гликозидной связи и смещения атомов(Табл.2),образующих Н-связи.Изме-нение ориентации основания определялось путем совмещения атомов моделей стереоизомеров с атомами "неповрежденного" нуклеотида. Моделируя процесс образования водородных связей, исходили из следующего: 1) Рассматривался упрощенный случай конфигурации 2-х цепочек ДНК - квазилинейная структура сахарофосфатного остова с планарным расположением оснований; 2) цепочки нуклеотидов собирались из исходных составляющих (Глава 4) при сохранении всех начальных условий; 3) Н-связи считались реализованными, если расстояния между атомами амино- и кето-групп оснований в нуклеотидах(в парах и N...0) попадают в интервал 2.74-3.15 А для 3-х пар соседних оснований; 4) в одну из цепочек включался стерео-изомер 2-дезоксирибозы(Рис. 4); 5) пары оснований в обеих цепочках подбирались в соответствии с принципом Уотсона - Крика. В заключительной части главы отмечается следующее:

1. При появлении стереоизомера 2-дезоксирибозы в ДНК реализуется принципиальная возможность образования Н-связей между основаниями.

2. При сохранении системы водородных связей в паре Т-А в тимине (эпимер по С'|) происходит замена О4 на 02.

3. Для эпимера по С*1 смоделирована транзиция (Т-А)—>(Т-0); система водородных связей в паре Т-в не сохраняется. Вместо связей и И-Н.-.О реализуются две водородные Ы-Н...О - связи.

4. Для эпимеров по С'з и С'4 реальны транзиции и трансверсии с учетом малых, по сравнению с С'ь смещений основания.

В шестой главе ("Принципы управления процессами радиозащиты ДНК и радиационного мутагенеза, основанные на методе окна доступа") анализируется эффект радиозащиты, РЗ,по различным типам деструкции ДНК(образование ОР, ЩЛС и ЦПП),а также рассмат-

ривается возможность реализации потенциальных точечных мутаций по сайтам образования стереоизомеров 2-дезоксирибозы в нуклеотиде.

На основе литературных данных и результатов экспериментов, полученных в лаборатории физической химии ДНК и других биополимеров ИБХФ РАН, в первом приближении сведен материальный баланс по свободнорадикальным и основным молекулярным продуктам (процессам) радиолиза сахарного фрагмента ДНК. Был сделан вывод, что при образовании одного "конечного" молекулярного продукта деструкции сахарного звена расходуется один первичный радикал.

Анализ данных по выходам основных процессов деструкции сахарофосфатного остова ДНК в клетке (Ward J.F., 1988, 1995) позволил, принимая за 100% суммарный выход первичных алкильных радикалов 2-дезоксирибозила, определить величины парциальных G (выходов) перечисленных выше процессов деструкции ДНК в клетке, обусловленных превращениями радикалов сахарного фрагмента.

Методом окна доступа была оценена эффективность взаимодействия исследовавшихся InH с радикалами 2-дезоксирибозила (Табл. 3). Максимальный эффект радиозащиты (фе-нол)по образованию ОР с восстановлением исходной структуры сахара достигает величи-ны~43%. Если учесть, что выход ОР подавляется и вследствие образования С'з-, C'4-сте-реоизомеров(при этом исходная структура макромолекулы не восстанавливается, но дальнейшие превращения радикалов С'з и С'д блокируются), то эффект радиозащиты увеличивается еще на 23% и достигает~65%. Величина суммарного эффекта радиозащиты сопоставлена с результатами исследований (Roots R., Okada S.,1972) процесса образования ОР в ДНК облучаемых суспензий клеток L5178 Y в присутствии меркаптоэтанола (МЭТ) в широком диапазоне концентраций: максимальный эффект радиозащиты- 86%. При оценке эффективности МЭТ методом окна доступа получили величину ~78%. Оценка по этой же методике максимального эффекта радиозащиты для L-цистеина также дала хорошее совпадение с экспериментом (91% и 80%, соответственно), учитывая, что моделирование проводилось только для В-формы ДНК.

Сопоставляя расчетные данные по фенолу и обсуждаемые литературные, можно было прийти к выводу,что с увеличением компактности структуры молекулы радиопротектора (уменьшение эффективной площади маски молекулы) следует ожидать возрастание эффективности радиозащиты. Кроме того, метод окна доступа, очевидно, был бы полезен в качестве компьютерной тест-системы для предварительного отбора соединений-потенци-альных радиопротекторов. Для окончательного решения этого вопроса необходима проверка метода окна доступа на большем количестве экспериментальных данных.

Величина выхода радиозащиты ДНК (ОР) при облучении клеток в присутствии ингибиторов СРР в случае реализации в "чистом виде" механизма ингибирования СРР - зависит

от типа(размера маски и расстояния Н-донорской группы от основного скелета 1пН) ингибитора, и,например, в случае использовавшегося экранированного фенола (8е(г=16,71 А2) этот эффект не может превысить 40-45 %, в случае же меркаптоэтанола (5сп= 6,59 А2)он достигает -55%.

При образовании ЩЛС максимальное снижение выхода за счет эффекта радиозашиты (Табл. 3) в присутствии экранированного фенола достигает -38%, а с учетом образования эпимеров выход ЩЛС доходит до -60%.

Образование С'5,С8-ЦПП в составе ДНК,регистрируемых при радиолизе растворов ДНК и при облучении клеток, вызвано взаимодействием радикалов С'5 с С8=И7 имидазольного цикла пуринов по С8. Стерическое моделирование позволило оценить максимальную эффективность радиозащиты по радикалу С'5 (-20%, Табл. 3). Для достижения более высокой эффективности радиозащиты необходим 1пН с площадью маски Бегг, в 5-6 раз меньшей, чем у рассматриваемого. Это подтверждают данные по радиозащите по С'5 для меркаптоэтанола и Ь-цистеина: эффективность РЗ доходит до -30-35 %.

Максимальный эффект радиозащиты при использовании фенола(восстановление исходной структуры) не может превысить 2/3 общего эффекта поражения сахарного фрагмента ДНК. При этом 30% "поглощаемой" 2-дезоксирибозилом энергии реализуется в виде образования стереоизомеров с суммарной величиной выхода, превышающей фоновую (при восстановлении этих радикалов сахара в отсутствие 1пН, например, ионами металлов переменной валентности) максимум на треть. Отсюда можно было бы ожидать максимального увеличения на 1/3 и частоты точечных мутаций по сравнению с фоновой (облучение организма в отсутствие 1пН).

По степени доступа молекулы 1пН(4-окси-3,5-ди-трет.-бутил-а-метилбензиламин)) к С'„ и последующего взаимодействия по реакции (1) все радикалы (Табл. 1) можно расположить в виде последовательного ряда (эффект "чистой" радиозащиты): С'2: С'5: С'4 : С'з = 2,5:2,0:1,3:1

Это означает, что, например, при заданных условиях эксперимента предотвратить образование ОР ДНК(радикалы С'з, С'5, С4+ О2) в облучаемой клетке по радикалу С'5 в 2,0 раза более вероятно, чем по С'з; снижение выхода ЩЛС(радикалы С'1, С'2, С'4 без Ог) по радикалу С'г в 1,9 раза более существенно, чем по С'4. В рассматриваемых процессах РЗ должен проявляться кислородный эффект как по ОР, так и по ЩЛС, поскольку ОР образуются из С'4 в присутствии 02, а ЩЛС - из С'4 в отсутствие О2.

Если подразумевать под радиозащитой лишь "ликвидацию" радикалов с помощью ингибиторов СРР, то в таком случае речь может идти о суммарном эффекте радиозащиты ("чистая" РЗ+образование стереоизомеров), который представлен вкладом каждого из радикалов в виде ряда: С'г: С'4 : С'з : С'5: С'| = 2,4 : 2,2 : 2,1 : 1,8 : 1. В этом случае(в отли-

чие от "чистой"РЗ) эффект РЗ по ОР не превышает 35-40%,а максимальный парциальный выход ЩЛС отличается в -2,5 раза. Все рассмотренные процессы деструкции ДНК,облучаемой в присутствии экранированного фенола по эффекту РЗ представлены последовательностью: ОР > ЩЛС > ЦПП. Ряд по выходам образования стереоизомеров в присутствии фенола: С'з: С'ьС'4 =1,1 : 1. Значит, при тех же условиях эксперимента изменить парциальный выход стереоизомеров можно не более, чем на 10%, т.е. вариации парциальных выходов точечных мутаций по "сахару" не могут превышать этой величины.

Изложенное демонстрирует принципиальную возможность управления процессами образования стереоизомеров по различным атомам углерода 2-дезоксирибозы при использовании набора 1пН(подбирая эффективную площадь маски), т.е. управления процессом радиационного мутагенеза по свободнорадикальному механизму. Эти данные можно также рассматривать в качестве основы для прогноза радиационного генетического эффекта, обусловленного не модификацией оснований, а изменением кон-формации 2-дезоксирибозила. Подчеркнем, что выход точечных мутаций,как сказано выше, должен возрастать в присутствии 1пН(максимально на 1/3), а не уменьшаться,если бы он был вызван, согласно традиционной точке зрения, только модификацией оснований. В заключение отметим следующее:

1. Выход образования стереоизомеров по радикалам сахарного фрагмента для исследовавшихся ингибиторов (в зависимости от размера маски) варьирует по С'] в пределах: от

11,0% (фенол) до 3,6 % (Ь-цистеин).

2. При образовании радикалов в структуре нуклеотида происходит смещение азотистого основания,ведущее к разрыву водородных связей между комплементарными основаниями в парах нуклеотидов.

3. Конформационные изменения в структуре нуклеотида,связанные с образованием стере-оизомера, при актах репликации ДНК могут приводить к возникновению водородных связей между основаниями в канонических нуклеотидах и неканоническими (по Уотсо-ну-Крику) основаниями - потенциальным точечным мутациям.

Таблица 1.

Смещения атомов (А, ± 0,02 А), участвующих в образовании Н- связей между комплементарными основаниями, и углы поворота (град., ± 0,05°) N - гликозидной

связи в радикалах.

Радикал Аденин Тимин Гуанин Цитозин

С'| 4,93 4,40 4,53 4,18

4,03 2,77 3,65 2,72

3,81 2,06

48,72° 47,57° 46,98° 46,52°

С-2 0,97 0,84 0,86 0,65

0,80 0,60 0,77 0,55

0,72 0,45

9,23° 8,45° 6,78° 6,67°

С'з 0,93 0,10 0,05 0,10

0,83 0,04 0,04 0,04

0,04 0,05

8,58° 1,09° 0,55° 1,09°

С-4 0,87 0,06 0,05 0,07

0,76 0,07 0,03 0,03

0,04 0,02

7,96° 0,67° 0,67° 0,66°

с, 0 0 0 0

0 0 0 0

0 0

0° 0° 0° 0°

Таблица 2.

Смещения атомов (А, ± 0,02 А), участвующих в образовании Н- связей между комплементарными основаниями, и углы поворота (град., ± 0,05°) Ы- гликозидной связи в стереоизомерах 2-дезоксирибозила.

Стерео Аденин Тимин Гуанин Цитозин

С'| 5,55 5,04 5,53 5,05

4,63 3,38 4,68 3,40

4,85 2,45

55,10° 55,10° 55,09° 55,10°

С'з 0,27 0,36 0,37 0,49

0,22 0,26 0,33 0,33

0,37 0,24

2,62° 4,14° 3,67° 5,36°

С4 0,55 0,28 0,34 0,27

0,66 0,30 0,42 0,31

0,53 0,35

8,22° 6,11° 5,12" 5,47°

Таблица 3.

Вероятности взаимодействия радикалов 2-дезоксирибозила с ингибиторами 1пН.

1пН С, С'2 С'з С'4 ¿3 Эффект*

Фенол" 0 25,1 9,9 13,1 19,4 Я

10,7 0 12,2 10,7 0

МЭТ'" 6,6 16,2 11,1 11,4 31,2 Я

5,4 0 10,8 13,5 0 Б

Ь-цистеин 5,1 16,9 12,0 11,3 30,0 Я

3,6 0 10,0 15,5 0 Б

Серотони н 7,6 20,0 11,0 10,3 21,2 Я

5,0 0 13,0 13,2 0 8

* - Я - процесс радиозащиты; Б - образование стереоизомера;

** - 4-окси-3,5-ди-трет.-бутил-а-метилбензиламин; *** - меркаптоэтанол

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод моделирования реакции замещения (11+1пН=ГЩ+1п, где Я и 1п- радикалы сахарного фрагмента ДНК и ингибитора)- метод окна доступа. Данный метод позволяет количественно оценивать стерическую вероятность(эффективность) взаимодействия любых двух молекул в различных средах и предоставляет возможность решать две основные задачи: прямая - определение вероятности взаимодействия при известных сте-реоструктурах реагентов и механизме реакции, обратная - уточнение или определение стереоструктур и механизма реакции при известной из эксперимента вероятности взаимодействия реагентов.

2. Построены 3-мерные структуры пяти алкильных радикалов, возникающих из канонических дезоксинуклеотидов в результате атаки ОН радикалом атомов углерода в дезок-сирибозном фрагменте молекулы В-ДНК. В качестве исходной использовалась структура 2-дезоксирибозы в С'2-эндо-конформации, нуклеотиды рассматривались в анти-ориен-тации относительно N - гликозидной связи. Установлено, что при образовании алкильных радикалов сахарного звена в составе полинуклеотидной цепи(структурного аналога тяжа В-ДНК) основание отклоняется от первоначального положения в неповрежденном нуклеотиде: угол поворота М-гликозидной связи варьирует в пределах от—49° (С']) до

(С,).

3. Построены 3-мерные структуры канонических нуклеотидов по С'1-, С'з-и С'4-атомам сахарного фрагмента В-ДНК. В образовавшихся стереоизомерах угол поворота И-глико-зидной связи изменяется от ~55° (для С'1) до ~2° (для С'з).

4. На моделях полинуклеотидных цепей показана принципиальная возможность образования водородных связей между одним из канонических нуклеотидов и нуклеотидом с образовавшимся стереоизомером. Предполагается, что образование Н-связей между неканоническими^ Уотсону-Крику) основаниями может служить основой появления точечных мутаций (по сахару).

5. По превращениям всех макрорадикалов 2-дезоксирибозила в присутствии ингибиторов-радиопротекторов (антиоксидантов) в облученной клетке методом окна доступа определены максимально достижимые величины выходов радиозащиты и потенциального мутагенного эффекта. В случае 4-окси-3,5-ди-трет.-бутил-а-метилбензиламина максимальный выход радиозащиты не превышает 13 %(для радикала С4), а минимальный-0% (для радикала С'1); вероятность выхода потенциальных точечных мутаций при образова нии стереоизомеров достигает - 10,7 % (С',), - 12,2 % (С'з), - 10,7 % (С'4).

6. Использование набора ингибиторов с различными размерами масок открывает принци пиальную возможность управления процессами избирательных превращений радикалов для достижения целевого эффекта: радиозащиты ДНК или образования стереоизомеров сахарного фрагмента-потенциальных сайтов точечных мутаций. Например, при переходе от упомянутого экранированного фенола к меркаптоэтанолу в случае С'1-центриро-ванного радикала выход стереоизомера возрастает в - 11 раз, а для С'4 - в - 27 раз.

7. На основе анализа результатов исследований (эксперименты лаборатории физической химии ДНК и других биополимеров ИБХФ РАН и литературные данные) в первом приближении достигнут материальный баланс по свободнорадикальным и основным молекулярным продуктам(процессам) радиолиза сахарного фрагмента ДНК. Представлена схема превращений радикалов 2-дезоксирибозила, включающая элементарные акты гидролиза фосфоэфирных связей в радикалах С'з,С'; и (в присутствии О2) С'4 и образования ал-лильных радикалов, что впервые позволило объяснить возникновение однонитевых разрывов, сопровождающееся выделением свободных оснований при у-облучении биополимера. Максимальные величины выхода процессов образования однонитевых разрывов, свободных азотистых оснований в В-ДНК при облучении клетки в присутствии 1пН, например, 4-окси-3,5-ди-трет-бутил-а-метилбензиламина, согласно оценке методом окна доступа, в результате превращения указанных алкильных радикалов не превышают 40-45% общего выхода образования радикалов сахарного фрагмента, а с учетом образования эпимеров по атомам углерода С'з и С4 в фуранозном цикле этот эффект достигает величины ~ 65%.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кузурман П.А., Шарпатый В.А. Моделирование явления передачи повреждения с сахара на основание в нуклеотиде // Тр. 3-его Съезда по радиационным исследованиям, 1417 октября 1997, М: Тезисы. С. 18.

2. Кузурман П.А., Шарпатый В.А. Биоантиоксидант: Материалы международного симпозиума в рамках международной выставки " Медицина и охрана здоровья. Медтехни-каиАптека" (16-19сентября 1997). Тюмень: Изд-во Тюменского государственного университета, 1997. С. 105-106.

3. Кузурман П.А., Шарпатый В.А. Эффективность радиопротекторов и генные мутации при повреждении 2-дезоксирибозила // Тр. Всероссийской конференции с международным участием, 16-17 ноября 1998 г., М.: С.132-133.

4. Кузурман П.А., Шарпатый В.А. Превращения радикалов 2-дезоксирибозила в ДНК и эффективность ее радиозащиты по механизму ингибирования свободнорадикальных реакций. Стерическое моделирование // Тр. V Международной конференции "Биоантиоксидант", 18-20 ноября 1998 г., М.: С . 267-268.

5. Кузурман П.А., Шарпатый В.А. О взамодействии вещества-ингибитора свободнорадикальных реакций с макрорадикалами 2-дезоксирибозила. II Радиационная биология. Радиоэкология. 1998. В.2. С. 147-155.

6. Кузурман П.А., Шарпатый В.А. Эффективность радиопротекторов и генные мутации при повреждении 2-дезоксирибозила. Компьютерное моделирование. // Радиационная биология. Радиоэкология. 1999 Т. 39. N 2. С. 297-299.

7. Кузурман П.А., Шарпатый В.А. Об эффективности радиозащиты ДНК пространственно-затрудненными фенолами. Компьютерное моделирование. // Химия высоких энергий. 1999. Т. 33. N/TC. 347-353.

8. Кузурман П.А., Шарпатый В.А. Об оценке эффективности радиозащиты ДНК веществами-ингибиторами при изменениях ее структуры. Компьютерное моделирование// Тр. II съезда биофизиков России, 23-27 августа 1999 г., М.: Тезисы докладов, Т. 3. С. 807-808.

9. Кузурман П.А., Шарпатый В.А. Моделирование реакции замещения радикалов. // Научный вестник Тюменского госуниверситета. Биология, 1999. Т. N 4. С. 84-87.

10. Кузурман П.А., Шарпатый В.А. Моделирование Н-связей между основаниями при образовании стереоизомеров 2-дезоксирибозила. // Там же. С. 84-87.

11. Кузурман П.А., Шарпатый В.А. Ингибирование свободнорадикальных реакций и то чечные мутации при радиационном повреждении 2-дезоксирибозила в ДНК. Компьютерное моделирование. И Тр. Ill Баховской конференции по радиационной химии, 5-7 июня 2000 г., М.: Тезисы. С. 44.

2-ДЕ30КСИАДЕН03ИН-3 ,5 -ДИФОСФАТ В 2-эвдо-, анти-конформации

л

1

Рис. I. 3-мерные модели скелетные и молекулярные : а - исходного нуклеотида, 6 - радикала о[ , в - С^ - стереоизомера. Иллюстрация изменения положения Д - гликозидной связи углы оС и |3 относительно условной плоскости фуранозного кольца.

6 - присоединение аденина и юттозина к сахарофосфатному остову;

в - поворот аденина вокруг Я-гликозидной связи для образования анти-конформаши основания.

У ]

сх

Г*4

О ^

Г

/ч г л,

А",

■ / •

•V— ¿Г

• ♦

Ч-

Рис. 3. а-Молекулярные модели радикалов С11 - С'5 £вверху)и степеоизо меров С'1, С13 и С14 (внизу)тиминового нуклеотида.

Рис. 4. Моделирование образования Н-связей (пунктир) на примере полинукле-отидных цепей с включением С'З-стереоизомера (^средняя пара) в щ-тидиле. I - скелетная и II - молекулярная модели.

к.