Информативность методов диагностики урогенитального трихомониаза и обоснование показаний к применению ПЦР в реальном времени

Мустафина, Гульгена Раисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Информативность методов диагностики урогенитального трихомониаза и обоснование показаний к применению ПЦР в реальном времени
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Информативность методов диагностики урогенитального трихомониаза и обоснование показаний к применению ПЦР в реальном времени"

На правах рукописи

МУСТАФИНА ГУЛЬГЕНА РАИСОВНА

ИНФОРМАТИВНОСТЬ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ

УРОГЕНИТАЛЬНОГО ТРИХОМОНИАЗА И ОБОСНОВАНИЕ ПОКАЗАНИЙ К ПРИМЕНЕНИЮ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

03.02.03 - микробиология 14.01.10 - кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Уфа-2010

003493181

Работа выполнена на кафедре лабораторной диагностики Института последипломного образования и кафедре дерматовенерологии в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научные руководнтели:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Мавзютов Айрат Радикович Хисматуллина Зарема Римовна

Ворошилова Наталья Николаевна Чеботарев Вячеслав Владимирович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «_»_-______2010 г. в «_»часов на

заседании Объединенного диссертационного Совета ДМ 208.006.05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Росз-драва» по адресу: 450000, г.Уфа, ул.Ленина 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава» по адресу: 450000, г.Уфа, ул.Ленина 3.

/Г

Автореферат разослан« » 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

К.А.Лукманова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Урогенитальный трихомониаз широко распространен в мире и повсеместно занимает одно из первых мест в структуре инфекций, передаваемых половым путем (ИППП) (Дмитриев Г.А., 2005, Теличко И.Н., 2007, Schwe-bke J.R. et al., 2006, Shafir S.C. et al., 2009]. В последние годы отмечаются определенные позитивные тенденции в динамике заболеваемости манифестными формами трихомониаза. Указанное, однако, сопровождается увеличением количества своевременно не выявленных субманифестных и, в особенности, бессимптомных вариантов этой патологии. По некоторым данным их удельный вес достигает 40-50% от общего числа больных трихомониазом [Рюмин Д.В., 2009 и др.]. В этой связи, очевидно, что истинная ситуация, учитывающая все формы урогенитального трихомониаза, может характеризоваться и негативной направленностью.

Социальным последствием указанного является существенное ухудшение репродуктивного здоровья населения, что в последние годы рассматривается в качестве угрозы национальной безопасности России и послужило в соответствии с Постановлением Правительства РФ №715 от 01.12.2004г. основанием для отнесения трихомониаза к разряду социально значимых заболеваний. Всемирная организация здравоохранения 18 мая 2006г. на 59-ой сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения в отношении ИППП утвердила глобальную стратегию на 2005-2015гг. «Предотвращение и контроль инфекций, передаваемых половым путем», в связи с чем совершенствование диагностики урогенитального трихомониаза было обозначено в качестве одной из первостепенных задач дерматовенерологии. Вместе с тем клиническая дифференцировка указанного заболевания достаточно проблематична, поскольку симптоматика лишена специфики и может иметь место и при других инфекций передаваемых половым путем [Рюмин Д.В., 2009 и др.]. Диагностика трихомониаза существенно осложнилась в последние годы в связи распространенностью атипичных вариантов Trichomonas vaginalis [Дмитриев

Г.А., 2003, Schwebke J.R. et al., 2006], наиболее часто выявляемых у мужчин [Иванов AM., 2005 и др.], учет которых в соответствии с приказом МЗ СССР №1570 от 04.12.1986г. не осуществляется должным образом.

Все вышеперечисленное в значительной степени снижает информативность, особенно у мужчин, традиционно применяемых методов микроскопии и культурального исследования [Марданлы С.Г. и др., 2007] и предполагает разработку новых, более совершенных методов лабораторной диагностики трихомониаза. Среди последних в качестве наиболее перспективных, как было показано на модели других инфекций урогенитального тракта, рассматриваются амплификационные методы, в частности, полимеразная цепная реакция (ПЦР) [Caliendo A.M. et al., 2005]. Однако имеющиеся литературные данные относительно диагностики урогенитального трихомониаза этим методом крайне противоречивы [Дмитриев Г.А., 2003, Теличко И.Н. и др., 2006, Марданлы С.Г. и др., 2007, Caliendo A.M. et al., 2005, Mckechnie M.L. et al., 2009]. Указанное предопределило необходимость систематизации имеющихся данных и разработку четких клинико-лабораторных критериев для применения ПЦР в диагностике трихомониаза с учетом специфики преаналитиче-ского, аналитического и, безусловно, постаналитического этапов.

Цель исследования

Провести сравнительную оценку эффективности методов лабораторной диагностики трихомониаза у мужчин, установить информативность современных молекулярно-генетических диагностических технологий и обосновать показания к их практическому применению.

Задачи исследования 1 На основе клинико-эпидемиологических и социально-гигиенических признаков обосновать выделение группы обследуемых пациентов с урогени-тальным трихомониазом, адекватной для оценки эффективности диагностических лабораторных тестов.

2 Провести сравнительный анализ информативности используемых в настоящее время методов лабораторной диагностики трихомонадной инфекции.

3 Оптимизировать культуральный метод для сокращения сроков идентификации Trichomonas vaginalis.

4 На основе анализа банка генов подобрать и апробировать праймеры для детекции Trichomonas vaginalis методом классической полимеразной цепной реакции и полимеразной цепной реакции в реальном времени.

5 Обосновать применение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени при диагностике урогенитального трихомониаза.

Научная новизна исследования

В результате проведенных исследований создана модификация питательной среды, позволяющая сократить сроки детекции Trichomonas vaginalis культуральным методом до 2 суток. Впервые в отечественных тест-системах подобраны и апробированы праймеры к гену 18S рРНК T.vaginalis. Данные праймеры могут быть использованы как для ПЦР в классическом варианте, так и ПЦР в реальном времени. Праймеры к гену 18S рРНК позволили повысить вероятность обнаружения Trichomonas vaginalis методом полимеразной цепной реакции. Показаны преимущества применение ПЦР в режиме реального времени для диагностики урогенитального трихомониаза, обусловленные высокой чувствительностью, возможностью количественного определения специфических фрагментов ДНК Trichomonas vaginalis в исследуемом материале.

Научно-практическая значимость работы

Разработан алгоритм лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза, включающий полимеразную цепную реакцию у мужчин. Предложена модификация состава питательной среды для культурального исследования клинического материала и сконструированы праймеры для полимеразной цепной реакции, что позволило повысить эффективность лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза у больных.

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Для оценки эффективности диагностических тестов по клинико-эпидемиологическим проявлениям адекватной является группа больных с урогенитальным трихомониазом являются мужского пола в возрасте 20-29 лет, имеющих высокую частоту случайных половых связей (70,0%), злоупотребляющих алкоголем (82,7%), часто пользующихся практикой незащищенного секса (55,5%).

2 Включение комплекса железа [III] гидроксид полиизомальтозат в состав питательной среды для культивирования Trichomonas vaginalis позволяет сократить сроки диагностики урогенитального трихомониаза культурапь-ным методом.

3 Преимуществом классической полимеразной цепной реакции в сравнении с микроскопическим и культуапьным методами диагностики урогени-тально.го трихомониаза является выявление различных форм заболевания вне зависимости от выраженности у обследуемых пациентов воспалительного процесса, характера течения и длительности заболевания.

4 Использование полимеразной цепной реакции по конечной точке с праймерами TrVa 22 (5'ТСС АСА GTA CCA AAA GGC АСС ААТ G3'), TrVa 11 (5ТСА ТСА GAG GCA CGC CAT TCG A3') к гену 18S рибосомальной РНК Trichomonas vaginalis является высокоспецифичным тестом в диагностике урогенитального трихомониаза. Применение количественного варианта ПЦР в реальном времени с праймерами TrVa 22 (5'ТСС АСА GTA ССА AAA GGC АСС ААТ G3'), TrVa 11 (5ТСА ТСА GAG GCA CGC CAT TCG A31) к гену 18S рибосомальной РНК Trichomonas vaginalis позволяет определить минимальное количество возбудителя в клиническом материале.

Апробация

Материалы диссертации представлены на международных, всероссийских, региональных научно-практических конференциях (всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых

«Полевые и экспериментальные исследования биологических систем» (Ишим, 2009); IV международном конгрессе, посвященном современным аспектам вспомогательных репродуктивных технологий «Актуальные вопросы вспомогательных репродуктивных технологий (проблемы и решения)» (Москва, 2007); I региональном научном форуме «Мать и дитя» (Казань, 2007); IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); IX всероссийской конференции дерматовенерологов (Екатеринбург, 2006).

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической и клинико-микробиологической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику.

Внедрение результатов исследования в практику

Полученные в настоящем исследовании результаты внедрены и используются в научно-педагогической и лечебно-диагностической работе кафедры дерматовенерологии ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», инфекционных болезней с курсом дерматовенерологии ИПО и лабораторной диагностики ИПО ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», ГУЗ «Республиканский кожно-венерологический диспансер» Республики Башкортостан.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, гла-

вы «Материалы и методы исследования», 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, приложения. Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 35 таблиц, 25 рисунков, 1 приложение. Список литературы включает 177 источников (64 отечественных и 113 зарубежных авторов).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Динамика заболеваемости урогенитальным трихомониазом за 19912008 гг. оценивалась нами по данным Государственного учреждения здравоохранения «Республиканский кожно-венерологический диспансер» Республики Башкортостан.

Социально-гигиеническая характеристика 466 больных урогенитальным трихомониазом (225 женщин и 241 мужчина) осуществлялась через анонимное анкетирование с использованием разработанной нами анкетой.

Объектом исследования явился 361 пациент, из которых 253 больных урогенитальным трихомониазом составили основную группу, а 108 мужчин-группу контроля. Набор больных в группы сравнения проводился в соответствии с целью исследования. Включение в группы наблюдения обеспечивалось информированным согласием больных на проведение лечебно-диагностических процедур, выполнением пациентами указаний врача относительно назначенного обследования и терапии, а также воздержанием от незащищенных половых контактов на время исследования. Обязательными условиями исключения из групп наблюдения были тяжелые сопутствующие заболевания (онкологические болезни, системные заболевания), сифилис. Обнаружение N.gonorrhoeae, C.trachomatis, М.hominis, U.urealyticum, Candida не являлось основанием для исключения из групп наблюдения. Регистрировали общие сведения о больных, жалобы на момент поступления, данные урологического анамнеза, объективного осмотра, результаты клинико-лабораторных исследований. Все исследования проводили в соответствии с

действующей нормативной документацией: приказами Минздрава России №

1570 от 04.12.1986 г., № 286 от 07.12.1993 г., № 64 от 21.02.2000 г., № 173 от 28.02.2005 г., протоколом ведения больных «Урогенитальный трихомониаз» (утв. МИНЗДРАВСОЦРАЗВИТИЯ РФ 14.01.2005).

Материал для микроскопического, культурального, молекулярно-генетического исследования получали из уретры мужчин с урогенитальным трихомониазом. Перед забором биологического материала пациент воздерживался от мочеиспускания в течение 4-6 часов. У мужчин непосредственно перед взятием материала наружное отверстие уретры обрабатывали марлевым тампоном. При отсутствии выделений проводили массаж уретры с помощью зонда для взятия материала. Затем универсальный зонд вводили в уретру на 3-4см и делали соскоб. Для метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) отделяемое из мочеиспускательного канала переносили в пробирку («ЕРРЕКДОКТ», Германия) с транспортной средой, содержащей фосфатный буфер, для микроскопии - на предметные стекла и культурального исследования - в пробирки с питательной средой (приказ Минздрава СССР № 936 от 12.07.85 г).

Визуально T.vaginalis обнаруживали бактериоскопическим методом при исследовании окрашенных по Граму микропрепаратов отделяемого из уретры.

Ультраструктурные особенности T.vaginalis исследовали с использованием электронной микроскопии (на базе ЦНИКВИ, г.Москва). Для этого готовили фиксированные в 4% растворе глютаральдегида на 0,1 М кокадилат-ном буфере (рН 7,2 - 7,4) препараты T.vaginalis [Абдумаликов Р.А., 1985], выделенных от больных с хронической формой заболевания. Накопление культур осуществляли инкубированием полученных клеток простейших в течение 3-х суток. Исследование ультраструктуры T.vaginalis проводили методом ультратонких срезов с последующим изучением на электронном микроскопе (JEM100S, Япония).

Для культурального исследования T.vaginalis применяли жидкую питательную среду (ООО НПФ «Диагност-мед», г.Омск). Инкубацию посевов

проводили при температуре 37°С в течение 3-6 дней. Подсчет клеток Т.vaginalis проводили с использованием камеры Горяева. ПЦР использовали для верификации результатов микроскопии и культурального исследования при выявлении T.vaginalis с применением сертифицированного комплекта реагентов для ПЦР с детекцией методом электрофореза («ДНК-Технология», Россия). Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей, подбор праймеров проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene (DNASTAR Inc., CILIA), Oligo 4.1 (National Biosciences Inc., США).

Для детекции грибов Candida в отделяемом из уретры использовали микроскопию (окраска по Граму), культуральный метод (среда Сабуро). Для лабораторной детекции Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum использовали ПЦР («ДНК-Технология», Россия), имму-ноферментный метод (ЗАО «Вектор-Бест», Россия), Neisseria gonorrhoeae -бактериоскопический, культуральный метод, ПЦР («ДНК-Технология», Россия). Иммуноферментные исследования проводились для оценки этиологической значимости M.hominis, U.urealyticum с помощью тест-системы (ЗАО «Вектор-Бест», Россия).

Статистический анализ полученных данных проводили с помощью пакета прикладных программ, а также формул А.Е. Платонова (2000), О.Ю. Ребровой (2003). Статистические гипотезы считались подтвержденными при уровне значимости р<0,05. В случае нормального распределения данных вычисляли среднюю арифметическую (М), стандартное отклонение (о, Sd). Для сравнения долевых показателей (%) использовали критерий — угловое преобразование Фишера (tcp). При малочисленности групп и неясности закона распределения величин вычисляли медиану (Me) и интерквартильный размах (агаз), для сравнения двух независимых групп использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (U). Использовался также метод двухфакторно-го дисперсионного анализа. Для сравнения качественных признаков (п>20) применяли метод X2. Для проверки гипотез использовали показатели, выдаваемые расчетными модулями программы. Чувствительность, специфич-

ность, диагностическая эффективность, прогностическая ценность отрицательного и положительного результатов, разность рисков, коэффициент асимметрии результатов используемых лабораторных методов диагностики урогенитального трихомониаза рассчитывали с помощью четырехпольной таблицы Фишера [Платонов А.Е., 2000].

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Динамика заболеваемости урогенитальным трихомониазом среди мужского населения г.Уфы за наблюдаемые годы (1991-2008) характеризовалась различной направленностью линии тренда. С 1991 по 1999гг она имела выраженную неблагоприятную тенденцию. Указанное, очевидно, во многом было связано с началом существенных преобразований в обществе, значимой составляющей которых являлись поведенческие реакции среди сексуально-активной части населения. С 1999 года в динамике заболеваемости урогенитальным трихомониазом наметилась тенденция к снижению, что, по-видимому, было связано с обращением часта больных в частнопрактикующие учреждения, самолечением в связи с широкой доступностью лекарственных средств и с одновременным увеличением частоты атипичных трудно - диагностируемых форм Тл^таПз. За наблюдаемые годы наиболее высокие уровни урогенитального трихомониаза отмечались у молодых мужчин 20-29 лет (рис.1). Уровень заболеваемости среди них статистически значимо превосходил значения в возрастных группах 18-19 и 30-39 лет. В период максимальной заболеваемости в 1999-2000гг (2425,2 ±36,5%ооо) ее интенсивность в этой группе более, чем в 3 раза, превосходила показатели 1991-1992 и 20052008 (728,7±21,7) и (670,1±13,7)%ооо, соответственно. В структуре заболевших на данную возрастную группу во все годы наблюдения приходилось около 60% от общего числа случаев заболевания урогенитальным трихомониазом.

По результатам проведенных нами социально-гигиенических исследований, среди опрашиваемых мужчин с урогенитальным трихомониазом доля

молодых в возрасте 20-29 лет составила 45,6 процентов.

1991-1992ГГ

1998-2000гг

2005-2008гг

аП-Ы'кт

Рис. 1. Возрастная структура заболевших урогенитальным трихомониазом среди мужского населения г.Уфы по различным периодам наблюдений

При такой распространенности заболевания, согласно эпидемиологическим данным, диагностический тест с чувствительностью и специфичностью, равной 95% будет выявлять большинство инфицированных лиц [Флетчер Р., 1998]. Исследования данных анкетирования показали, что мужчин в возрасте 20-29 лет, больные урогенитальным трихомониазом в большинстве случаев имели высокую частоту случайных половых связей (70,0%), злоупотребляли алкоголем (82,7%), часто пользовались практикой незащищенного секса

На эффективность диагностических тестов в существенной мере влияет стадия и степень тяжести процесса. Исследования особенностей клинических проявлений урогенитального трихомониаза у мужчин выявило, что воспалительный процесс и тяжесть течения заболевания были выражены у больных 20-29 лет как при свежей, так и при хронической форме. При свежей трихо-монадой инфекции в этой группе больных чаще были выражены такие клинические проявления, как выделения из половых путей (98,1%) и дискомфорт в уретре (66,1%). При хронической инфекции кроме вышеперечисленных признаков также часто отмечались дизурические расстройства (76,2%), ощущение жжения, зуда в области гениталий (23,8%), боли характерные для простатита (57,1%). Эти результаты позволили обосновать выделение в соответствии с принципами доказательной медицины группу пациентов с урогени-

(55,5%).

тальным трихомониазом в возрасте 20-29 лет как адекватную для оценки эффективности диагностических тестов по чувствительности, специфичности и их прогностической ценности.

Следовательно, группа мужчин, больных урогенитапьным трихомониазом в возрасте 20-29 лет является наиболее адекватной с эпидемиологической точки зрения моделью для оценки эффективности диагностических тестов по показателям чувствительности, специфичности и их прогностической ценности.

Далее нами проводилось сравнение информативности используемых в практической медицине прямых методов лабораторной диагностики уроге-нитального трихомониаза у мужчин - световой микроскопии, культуралыюго метода и полимеразной цепной реакции. При этом учитывались топика (уретрит и/или уретропростатит), длительность заболевания (до 2 месяцев -свежая форма, более 2 месяцев - хроническая), степень воспалительного процесса (количество лейкоцитов в отделяемом) мочеполовых органов. При оценке степени выраженности воспалительного процесса в мочеполовых органах все обследуемые мужчины в зависимости от количества лейкоцитов в отделяемом из уретры были распределены на три группы. В первой группе (45 мужчин) - с содержанием лейкоцитов в отделяемом из уретры до 20 единиц в поле зрения включительно, во второй (43 мужчин) - от 21 до 50 единиц в поле зрения включительно, в третьей (19 мужчин) - более 50 единиц в поле зрения. В случае обнаружения атипичных форм трихомониаза проводили повторные исследования с использованием культурального метода. Отсутствие типичных форм трихомонад в цитологических препаратах и в культуральных исследованиях являлось основанием для исключения диагноза урогенитальный трихомониаз [Иванов А.М., 2004].

По полученным данным, при различной локализации процесса, форме, выраженности воспалительного процесса наибольшей диагностической эффективностью в отношении T.vaginalis у мужчин обладала полимеразная цепная реакция, характеризующаяся достаточно высокой чувствительностью

(81,9%) и специфичностью (88,6%), прогностической ценностью положительного (93,6%) и отрицательного результатов (70,5%) по сравнению с микроскопическим и культуральным методами (табл.1).

Однако статистически достоверными отличия полимеразной цепной реакции по чувствительности, специфичности, прогностической ценности положительного и отрицательного результатов при урогенитальном трихо-мониазе были только относительно микроскопии (р<0,01). Высокий показатель «разности риска» (64,1%) полимеразной цепной реакции свидетельствовал о высокой прогностической значимости результата данного метода, а высокий коэффициент асимметрии (35) - о значительной связи между прогнозом и исходом (наличием Т.уа£'ша118 у больного) исследования больного с урогенитальным трихомониазом.

Таблица 1 - Сравнительная характеристика методов лабораторной дн-агностики урогенитального трихомониаза ______

Метод 4-х польная таблица дэ, % Чувствительность, % Спе-ци-фич- ность, % ПЦ+ % ПЦ-, % РР, % К А

Ре-зуль -тат Больные (п=72) Контр, группа (п=35)

Куль-тураль-ный + 54 (ИПр) 7 (ЛП) 76,6 »« 75 и 80 ♦ 88,5 ♦« 60,9 ♦♦ 49,4 12

- 18 (ЛО) 28 (ИО)

Микроскопия + 28 (ИПр) 19 (ЛП) 41,1 38,9 45,7 59,6 26,7 13,7 0,5

- 44 (ЛО) 16 (ИО)

ПЦР + 59 (ИПр) 4 (ЛП) 84,1 81,9 88,6 И 93,6 70,5 64,1 35

- 13 (ЛО) 31 (ИО)

Примечание:

* Различие с данными микроскопического метода статистически значимо (р<0,01). " Различие с данными микроскопического метода статистически значимо (р<0,001) ДЭ - диагностическая эффективность, ПЦ "-" - прогностическая ценность отрицательного результата, ПЦ"+" - прогностическая ценность положительного результата, РР - разность рисков, КА - коэффициент асимметрии.

Наличие ложноотрицательных (18,1%) результатов при проведении полимеразной цепной реакции, возможно, было связано с недостаточным количеством Т.vaginalis в биоматериале, а ложноположительных (11,4%) - контаминацией отрицательных образцов при проведении исследования.

Чувствительность и прогностическая ценность отрицательного результата у культурального и микроскопического методов увеличивались с увели-

чением количества лейкоцитов в отделяемом из уретры, а специфичность и прогностическая ценность положительного результата - уменьшалась (р>0,05).

Следовательно, с увеличением количества лейкоцитов в отделяемом из уретры у мужчин больных урогенитальным трихомониазом вероятность получения ложноположительных результатов культуральным и микроскопическим методами увеличивается. Комбинированное использование культурапь-ного и микроскопического методов диагностики также не исключает возможности завышения и занижения частоты выявляемое™ T.vaginalis за счет методических особенностей данных лабораторных исследований.

Комплексное применение прямых лабораторных методов обнаружения T.vaginalis позволило существенно увеличить вероятность обоснованности заключений о наличии или отсутствии возбудителя в организме.

Высокая диагностическая эффективность, специфичность, чувствительность, прогностическая ценность отрицательного и положительного результатов позволяют рекомендовать использование ПЦР для лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза у мужчин. На основании этих результатов нами были разработаны алгоритмы диагностики урогенитального трихомониаза, включающие молекулярно-генетические методы (ПЦР).

На следующем этапе нами были проведены электронно-микроскопические исследования клинических штаммов T.vaginalis от больных с хроническим трихомониазом, позволившие оценить степень поли-морфности возбудителя. По нашим данным, клинические штаммы T.vaginalis при хроническом трихомониазе электронно-микроскопически характеризовались выраженной вакуолизацией, преобладанием электронно-прозрачных, лишенных содержимого везикул неправильной формы. Гидрогеносомы T.vaginalis значительно варьировали по размерам, форме и плотности содержимого, располагались хаотично по всему объему клетки. Эти данные указывают на формирование выраженных морфо-функциональных изменений у T.vaginalis при хронизации процесса, что осложняет традиционную лабора-

торную диагностику заболевания. В связи с этим представилось необходимым усовершенствование референтного метода диагностики урогенитально-го трихомониаза, которым является культуральный.

Культуральная диагностика урогенитального трихомониаза с использованием стандартных питательных сред отличается необходимостью продолжительной инкубации T.vaginalis (в среднем до 3-4 суток), существенно зависящей от величины посевной дозы. В связи с этим для сокращения сроков идентификации T.vaginalis культуральным методом нами была разработана собственная модификация состава питательной среды для кутивирования возбудителя. С этой целью в 5 мл жидкой питательной среды для выделения T.vaginalis (ООО НПФ «Диагност^мед», Россия) нами был добавлен комплекс железа [III] гидроксида полиизомальтозата (0,03 г) в виде жидкого лекарственного средства Феррум лек (LEK Pharmaceuticals, Словения). Применение данного состава питательной среды приводило на вторые сутки культивирования при температуре 37°С к накоплению клеток в культуре до (6,5±2,1)х103кл/мл, тогда как на контрольной среде в этот срок содержание T.vaginalis составило только (4,3±1,2)х103кл/мл (р<0,01, рис.2).

Рис. 2. Сравнительная характеристика накопления T.vaginalis при их культивировании на модифицированной и контрольной среде. Ось ординат - количество клеток Тл^паПз (хЮ3 кл/мл), ось абсцисс - сроки инкубации (сутки).

На контрольной среде (ООО НПФ «Диагност-мед», Россия) максимальное накопление культуры T.vaginalis отмечалось на 3-й сутки в среднем до (5,3±1,4)х103 кл/мл. При этом на 4-е сутки культивирования отмечалось снижение количества клеток до (5,0±1,2)х103 кл/мл.

Применение модифицированной среды для культивирования T.vaginalis способствовало максимальному накоплению клеток на 4-е сутки в среднем до (9,0±2,7)х103кл/мл, а снижение их количества отмечалось - на 5-е сутки культивирования в среднем до (8,0±2,6)х103кл/мл.

Таким образом, культивирование клеток на модифицированной среде позволило идентифицировать T.vaginalis уже на 2-е сутки наблюдения (р>0,01), что приводило к сокращению сроков диагностики урогенитального трихомониаза.

Чувствительность и специфичность другого прямого метода идентификации T.vaginalis — ПЦР - во многом обусловлена правильным выбором мишеней для амплификации [Ryu J.S., 1999]. Известно, что наиболее исследованным локусами в геномах простейших являются гены рибосомальных РНК, отличающихся мультикопийностыо (254 копий 18S рРНК/на клетку T.vaginalis) [Carlton J.M., 2007]. Учитывая наличие данного локуса в геноме T.vaginalis, представился целесообразным подбор для «классической» ПЦР и ПЦР «в реальном времени» высокочувствительных праймеров, не обладающих перекрестным реагированием с человеческой ДНК.

С использованием данных банка-генов нами были сопоставлены последовательности генов 18SpPHK Dientamoeba fragilis, Pentatrichomonas hominis (abdominalis), T.tenax (elongata), T.vaginalis для конструирования специфичных праймеров, применимых при детекции T.vaginalis методом ПЦР в мазках и другом клиническом материале. В результате проведенных исследований и серий испытаний была определена соответствующая пара праймеров, специфичных к гену 18S рРНК T.vaginalis: TrVa 22 (5'ТСС АСА GTA ССА ААА GGC АСС ААТ G3'), TrVa 11 (5'ТСА ТСА GAG GCA CGC САТ TCG A3').

Наряду с геном 18S рРНК, наиболее исследованным, по данным литературы, является ген бета-тубулина Т.vaginalis [Hardick J. et al, 2003]. Согласно данным литерагуры, ПЦР с праймерами BTUB9 и BTUB2 обеспечивает чувствительность равную 98%, в сравнении с культуральным методом системы InPouch, имеющую чувствительность равную 70% [Hardick J. et al, 2003]. В этой связи для оценки информативности нашей разработки нами наряду с праймерами к гену 18S рРНК были синтезированы и использованы праймеры к гену бета-тубулина T.vaginalis - BTUB9 (5'СА TTG ATA ACG AAG СТС ТТТ ACG АТЗ') и BTUB2 (5'GC ATG TTG TGC CGG АСА TAA ССАТЗ') (фирма SYNTOL, г. Москва).

Сравнительное исследование диагностических возможностей ПЦР по выявлению T.vaginalis показало, что чувствительность «классической» ПЦР была выше для праймеров TrVall и TrVa22 (к гену 18S рРИк T.vaginalis) (100%), чем для В TUB 9 и BTUÔ2 (к гену бета-тубулина T.vaginalis) (83,9%) (р=0,023).

Параллельно с ПЦР, основанной на электрофоретической детекции, нами была осуществлена адаптация ПЦР для варианта "real-time" с праймерами BTUB9 х BTUB2 и TrVall х TrVa22 и применением интеркалирующего агента SYBR Green I.

При проведении ПЦР в реальном времени с праймерами BTUB9xBTUB2 кривые плавления ампликонов характеризовались наличием двух пиков (рис.3). Принадлежность каждого из пиков к определенной группе (T.vaginalis и неспецифическим продуктам) была установлена путем сравнения пиков плавления, при этом основной продукт амплификации плавился при температуре 85°С, а неспецифический продукт (димеры) - 78,5°С. По-стамплификационный анализ кривых плавления ПЦР - фрагментов позволил провести дифференциацию полученных ампликонов за счет различий в температурах плавления.

При проведении ПЦР в реальном времени с праймерами TrVall и TrVa22 кривые плавления ампликонов характеризовались наличием одного

пика, что свидетельствовало о высокой степени их гомологии, при этом в контроле и в образце с человеческой ДНК соответствующие пики не наблюдались, что доказывает высокую специфичность праймеров.

BTUB9 х BTUB2. Ось ординат - флюоресценция (нм), ось абсцисс - температура плавления (°С).

Количественный анализ содержания T.vaginalis в образце был проведен нами посредством метода ПЦР в реальном времени с праймерами BTUB9 и BTUB2, TrVal 1 и TrVa22. Полученные данные позволили получить более достоверную информацию об исходной концентрации клеток T.vaginalis в образцах, полученных от больных. После 45 циклов ПЦР по конечной точке с праймерами BTUB9 и BTUB2, TrVa 11 и TrVa22 при анализе результатов электрофоретического фракционирования по выраженности свечения обеспечивались лишь полуколичественные данные. ПЦР в реальном времени с праймерами BTUB9 и BTUB2, TrVall H.TrVa22 позволила определить более четкие количественные различия в концентрации исходной матрицы в Образцах. По индивидуальным для каждого образца графикам амплификации мы определяли количественные различия по содержанию исходной матрицы (генов 18S рРНК и бета-тубулина). Концентрации матрицы гена 18S рРНК в образцах отличались почти на один - три порядка (каждые 3.3 цикла различия в выходе кривой на логарифмическую стадию характеризовались 10 -кратной разницей концентрации матриц), а для некоторых образцов вход в логарифмическую фазу происходил на 19 и 32 циклах соответственно, при

этом разница в 13 циклов давала различия в исходных концентрациях матриц почти на 4 порядка, то есть в 10 ООО раз. Согласно нашим исследованиям, количественные различия между образцами с T.vaginalis по содержанию исходной матрицы гена бета-тубулина были незначительными. Так, разница количеств амплифицированных ДНК генов бета-тубулина T.vaginalis между образцами при выходе в логарифмическую фазу составила всего 6 циклов (27 и 33), то есть менее чем на два порядка (Ю2). Указанные различия количеств амплифицированной ДНК, возможно, объяснялись невысокой эффективностью ПЦР с праймерами к гену бета-тубулина при низких исходных концентрациях матрицы, что свойственно тест-системам, предназначенным для детекции уникальных или слабоповторенных генов, присутствующих в единичных копиях в геномах выявляемых патогенов.

Чувствительность ПЦР в реальном времени с использованием прайме-ров TrVal 1 и TrVa22 (100%) была сопоставима с чувствительностью классического варианта ПЦР с указанными праймерами. При использовании прай-меров BTUB9 и BTUB2 чувствительность ПЦР в реальном времени составляла 90,3%, что было выше, чем у «классической» ПЦР с этими же праймерами (83,9%) (р>0,05). Вместе с тем, ПЦР в реальном времени с использованием праймеров TrVal 1 и TrVa22 была более чувствительной, нежели с праймерами BTUB9 и BTUB2, в связи с большим содержанием копий гена 18S рРНК в T.vaginalis и меньшим исходным количеством копий гена бета-тубулина.

Таким образом, в связи большей копийностью гена 18S рРНК в клетках T.vaginalis, вероятность обнаружения возбудителя при использовании праймеров к данному гену, существенно возрастает. Использование праймеров TrVal 1 и TrVa22 позволяет проводить детекцию T.vaginalis в течение одного рабочего дня не только в «классическом» варианте, но и при проведении ПЦР в реальном времени. При ПЦР в реальном времени использование праймеров TrVal 1 и TrVa22 позволяет сократить время проведения анализа, а также проводить количественное определение T.vaginalis в биоматериале,

полученном от больного. Применение ПЦР в режиме реального времени с праймерами к гену 18S рибосомальной РНК Trichomonas vaginalis позволяет определить минимальное количество возбудителя в клиническом материале. Данная методика практически полностью исключает загрязнение амплико-нами рабочих помещений, таким образом, снижает риск получения ложнопо-зитивных результатов к абсолютному минимуму, что при использовании «классической» ПЦР удается не всегда.

Выводы

1 Наиболее адекватную группу пациентов с урогенитальным трихомо-ниазом для оценки эффективности диагностических тестов по клинико-эпидемиологическим проявлениям в моно- и микствариантах составляют мужчины в возрасте 20-29 лет, имеющие высокую частоту случайных половых связей (70,0%), злоупотребляющие алкоголем (82,7%), часто пользующиеся практикой незащищенного секса (55,5%).

2 Сокращение сроков культуральной детекции и идентификации Trichomonas vaginalis до 2 суток достигается внесением к 5 мл питательной среды 0,03г (0,06 мл) комплекса железа [III] гидроксид полиизомальтозат в виде жидкого лекарственного средства Феррум лек (LEK Pharmaceuticals, Словения).

3 Классическая полимеразная цепная реакция при диагностике урогени-тального трихомониаза отличается высокой чувствительностью и специфичностью не зависимо от выраженности и локализации воспалительного процесса, длительности течения заболевания.

4 Сконструированные праймеры TrVa 22 (5'ТСС АСА GTA ССА ААА GGC АСС ААТ G3'), TrVa 11 (5ТСА ТСА GAG GCA CGC САТ TCG A3') к 18S рРНК обеспечивают высокоспецифичную детекцию Trichomonas vaginalis в клиническом материале без образования димеров и перекрестных реакций с человеческой ДНК как в качественном варианте полимеразной цепной реакции, так и при проведении ее в режиме реального времени.

5 Real-time ПЦР с праймерами TrVa 22/TrVa 11 к консервативному ви-доспецифичному фрагменту 18S рибосомальной РНК Trichomonas vaginalis обеспечивает высокую чувствительность и специфичность исследования, возможность получения количественных данных и их автоматическую регистрацию, что существенно оптимизирует лабораторную диагностику уроге-нитального трихомониаза.

Практические рекомендации

1 При диагностике урогенитального трихомониаза у мужчин культу-ральным методом рекомендуется использовать модифицированную среду, содержащую в 5мл 0,03г комплекса железа [111] гидроксид полиизомальтозат (0,06 мл жидкого лекарственного средства Феррум лек, LEK Pharmaceuticals, Словения).

2 Для повышения качества лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза рекомендуется использовать полимеразную цепную реакцию с праймерами TrVa 22 (5 ТСС АСА GTA CCA AAA GGC АС С ААТ G3'), TrVa 11 (5ТСА ТСА GAG GCA CGC CAT TCG A3') к гену 18S рибосомальной РНК Trichomonas vaginalis.

3 При диагностике различных форм урогенитального трихомониаза у мужчин рекомендуется использование полимеразной цепной реакции для исследования отделяемого из уретры, обладающей высокой чувствительностью и специфичностью не зависимо от локализации, длительности и выраженности воспалительного процесса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Мустафина Г.Р., Мавзютов А.Р., Хисматуллина З.Р., Ибраева P.A. Ретроспективный анализ распространенности урогенитального трихомониаза среди женщин// Мать и дитя: матер, всероссийского форума. - М., 2006. - С. 649.

2 Мустафина Г.Р., Мавзютов А.Р., Хисматуллина З.Р. Социально-гигиеническая характеристика больных урогенитальным трихомониазом// Вестник перинаталогии, акушерства и гинекологии. - Красноярск, 2006. -№13,- С. 428-430.

3 Мустафина Г.Р., Ибраева P.A. Актуальность выявления анаэробной микрофлоры, ассоциированной с урогенитальным трихомониазом /Актуальные

вопросы инфекционной патологии в клинической практике. - Уфа, 2006.-С.173-174.

4 Мустафина Г.Р., Мавзютов А.Р., Хисматуллина З.Р., Ибраева Р.А. Анализ ошибок в диагностике хронического урогенитального трихомониаза// Фундаментальные исследования в биологии и медицине: сборник научных трудов. - Вып. 1 .-Ставрополь: Изд-во СГУ, 2006,- С.148-150.

5 Мустафина Г.Р., Мавзютов А.Р., Ибраева Р.А. Социально-гигиенические особенности урогенитальной трихомонадной инфекции на современном этапе// Актуальные вопросы инфекционной патологии в клинической практике. -Уфа,2006.-С. 177-178.

6 Мустафина Г.Р., Никоноров Ю.М., Чемерис А.В., Мавзютов А.Р. Разработка и испытание «ПЦР в реальном времени» для детекции Trichomonas vaginalis в клиническом материале// Матер. IX съезда всероссиско-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. -Москва, 2007. - Т. 3. - С. 67-68.

7 Мустафина Г.Р., Никоноров Ю.М., Зиганшина С.Р., Чемерис А.В., Мавзютов А.Р. Использование полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) для детекции Trichomonas vaginalis в клиническом материале// Биомика - наука XXI века. Матер, школы-семинара молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии. - Уфа, 2007. - С.99-100.

8 Мустафина Г.Р., Никоноров Ю.М., Чемерис А.В., Мавзютов А.Р., Хисматуллина З.Р. Возможности и перспективы метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике урогенитального трихомоноза// Клиническая лабораторная диагностика. - 2008. - №9. - С. 45.

9 Мустафина Г.Р., Хисматуллина З.Р., Мавзютов А.Р., Шакирова Г.Р. Способ выделения Trichomonas vaginalis// Пермский медицинский журнал. -2008. - Т.25. - №5. - С. 61-64.

10 Мустафина Г.Р., Хисматуллина З.Р., Мавзютов А.Р., Шакирова Г.Р. Современные аспекты гипердиагностики урогенитального трихомониаза// Сибирский журнал дерматологии и венерологии. - 2009. - Т. II. - №.10 - С.134-135.

11 Бслоусова Н., Мустафина Г.Р., Никоноров Ю.М. Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) для мониторинга трихомониазной инфекции/ Полевые и экспериментальные исследования биологических систем: матер, всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. - Ишим, 2009. - C.116.

12 Hismatullina Z.R., Sigajev N.I., Mustafina G.R., Sakirova G.R. Eraroj en di-agnozado de urogenitala trihomoniaso. Medicina internacia revuo. - Junio 2009,-Vol. 23a. -№3 (92).-P. 86-87.

На правах рукописи

МУСТАФИНА ГУЛЬГЕНА РАИСОВНА

ИНФОРМАТИВНОСТЬ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ

УРОГЕНИТАЛЬНОГО ТРИХОМОНИАЗА И ОБОСНОВАНИЕ ПОКАЗАНИЙ К ПРИМЕНЕНИЮ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

03.02.03 - микробиология 14.01.10 - кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Отпечатано с готовых диапозитивов в ООО «Принт+», заказ №229, тираж 100. 450054, пр. Октября, 71.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Мустафина, Гульгена Раисовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Клинико-эпидемиологические особенности и лабораторная диагностика урогенитального трихомониаза

1.1. Клинико-эпидемиологические особенности урогенитального трихомониаза

1.2. Микробиология и ультраструктура T.vaginalis на современном этапе

1.3. Лабораторная диагностика урогенитального трихомониаза 17 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Характеристика обследованных больных

2.2. Особенности преаналитического этапа при инфекции, вызванной T.vaginalis

2.3. Характеристика методов, использованных для специфической детекции T.vaginalis

2.4. Методы статистической обработки полученных данных

Глава 3. КЛИНИКО - ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ И СОЦИАЛЬНО - ГИГИЕНИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ВЫДЕЛЕНИЯ ГРУППЫ ОБСЛЕДУЕМЫХ ПАЦИЕНТОВ С УРОГЕНИТАЛЬНЫМ ТРИХО-МОНИАЗОМ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТОВ

3.1. Эпидемиологические особенности заболеваемости урогениталь-ным трихомониазом

3.2. Социально-гигиеническая характеристика больных

3.3. Клинические особенности урогенитального трихомониаза

Глава 4. ОЦЕНКА ИНФОРМАТИВНОСТИ МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ УРОГЕНИТАЛЬНОГО

ТРИХОМОНИАЗА

4.1. Ультраструктурные особенности Т.vaginalis

4.2. Сравнительная оценка информативности лабораторных методов, применяемых для обнаружения T.vaginalis

4.3. Модифицированная питательная среда для выделения

T.vaginalis

4.4. Детекция T.vaginalis методом полимеразной цепной реакцией

4.4.1. Подбор праймеров и их сравнительная оценка

4.4.2. Лабораторная оценка информативности ПЦР с использованием праймеров к различным мишеням

4.4.3. Оценка информативности ПЦР в реальном времени с прайме-рами к различным фрагментам ДНК T.vaginalis

Введение Диссертация по биологии, на тему "Информативность методов диагностики урогенитального трихомониаза и обоснование показаний к применению ПЦР в реальном времени"

Актуальность проблемы

Урогенитальный трихомониаз широко распространен в мире и повсеместно занимает одно из первых мест в структуре инфекций, передаваемых половым путем (ИГГПП) [15, 25, 57, 153]. В последние годы отмечаются определенные позитивные тенденции в динамике заболеваемости манифестными формами трихомониаза. Указанное, однако, сопровождается увеличением количества своевременно не выявленных субманифестных и, в особенности, бессимптомных вариантов этой патологии. По некоторым данным их удельный вес достигает 40-50% от общего числа больных трихомониазом [49, 50]. В этой связи, очевидно, что истинная ситуация, учитывающая все формы урогенитального трихомониаза, может характеризоваться и негативной направленностью.

Социальным последствием указанного является существенное ухудшение репродуктивного здоровья населения, что в последние годы рассматривается в качестве угрозы национальной безопасности России и послужило в соответствии с Постановлением Правительства РФ от 01.12.2004 г. №715 основанием для отнесения трихомониаза к разряду социально значимых заболеваний. Всемирная организация здравоохранения 18 мая 2006 г. на 59-ой сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения в отношении ИППП утвердила глобальную стратегию на 2005-2015гг. «Предотвращение и контроль инфекций, передаваемых половым путем», в связи с чем совершенствование диагностики урогенитального трихомониаза было обозначено в качестве одной из первостепенных задач дерматовенерологии. Вместе с тем клиническая дифференцировка указанного заболевания достаточно проблематична, поскольку симптоматика лишена специфики и может иметь место и при других инфекциях передаваемых половым путем [49, 50]. Диагностика трихомониаза существенно осложнилась в последние годы в связи распространенностью атипичных вариантов Trichomonas vaginalis [15, 153], наиболее часто выявляемых у мужчин, учет 5 которых в соответствии с приказом МЗ СССР от 04.12.1986 г. №1570 не осуществляется должным образом.

Все вышеперечисленное в значительной степени снижает информативность, особенно у мужчин, традиционно применяемых методов микроскопии и культурального исследования [28] и предполагает разработку новых, более совершенных методов лабораторной диагностики трихомониа-за. Среди последних в качестве наиболее перспективных, как было показано на модели других инфекций урогенитального тракта, рассматриваются амплификационные методы, в частности, полимеразная цепная реакция (ПЦР) [95]. Однако имеющиеся литературные данные относительно диагностики урогенитального трихомониаза этим методом крайне противоречивы [15, 25, 28, 57]. Указанное предопределило необходимость систематизации имеющихся данных и разработку четких клинико-лабораторных критериев для применения ПЦР в диагностике трихомониаза с учетом специфики преаналитического, аналитического и, безусловно, постаналитического этапов.

Цель исследования

Задачи исследования

1. На основе клинико-эпидемиологических и социально-гигиенических признаков обосновать выделение группы обследуемых пациентов с урогенитальным трихомониазом, адекватной для оценки эффективности диагностических лабораторных тестов.

2. Провести сравнительный анализ информативности используемых в настоящее время методов лабораторной диагностики трихомонадной инфекции.

3. Оптимизировать культуральный метод для сокращения сроков идентификации Trichomonas vaginalis.

4. На основе анализа банка генов подобрать и апробировать прай-меры для детекции Trichomonas vaginalis методом классической полиме-разной цепной реакции и полимеразной цепной реакции в реальном времени.

5. Обосновать применение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени при диагностике урогенитального трихомониаза.

Научная новизна исследования

В результате проведенных исследований создана модификация питательной среды, позволяющая сократить сроки детекции Trichomonas vaginalis культуральным методом до 2 суток. Впервые в отечественных тест-системах подобраны и апробированы праймеры к гену 18S рРНК T.vaginalis. Данные праймеры могут быть использованы как для ПЦР в классическом варианте, так и ПЦР в реальном времени. Праймеры к гену 18S рРНК позволили повысить вероятность обнаружения Trichomonas vaginalis методом полимеразной цепной реакции. Показаны преимущества применения ПЦР в режиме реального времени для диагностики урогенитального трихомониаза, обусловленные высокой чувствительностью, возможностью количественного определения специфических фрагментов ДНК Trichomonas vaginalis в исследуемом материале.

Научно-практическая значимость работы

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Для оценки эффективности диагностических тестов по клини-ко-эпидемиологическим проявлениям адекватной является группа больных мужского пола с урогенитальным трихомониазом в возрасте 20-29 лет, имеющих высокую частоту случайных половых связей (70,0%), злоупотребляющих алкоголем (82,7%), часто пользующихся практикой незащищенного секса (55,5%).

2. Включение комплекса железа [III] гидроксид полиизомальто-зат в состав питательной среды для культивирования Trichomonas vaginalis позволяет сократить сроки диагностики урогенитального трихомониаза культуральным методом.

3. Преимуществом классической полимеразной цепной реакции в сравнении с микроскопическим и культуральным методами диагностики урогенитального трихомониаза является выявление различных форм заболевания вне зависимости от выраженности у обследуемых пациентов воспалительного процесса, характера течения и длительности заболевания.

4. Использование полимеразной цепной реакции с праймерами TrVa 22 (5'ТСС АСА GTA CCA AAA GGC АСС ААТ G3'), TrVa 11 (5'ТСА ТСА GAG GCA CGC CAT TCG A3') к гену 18S рибосомальной РНК Trichomonas vaginalis является высокоспецифичным тестом в диагностике урогенитального трихомониаза. Применение количественного варианта ПЦР в реальном времени с праймерами TrVa 22 (5'ТСС АСА GTA ССА AAA GGC АСС ААТ G3'), TrVa 11 (5'ТСА ТСА GAG GCA CGC CAT TCG A3') к гену 18S рибосомальной РНК Trichomonas vaginalis позволяет определить минимальное количество возбудителя в клиническом материале.

Апробация

Материалы диссертации представлены на международных, всероссийских, региональных научно-практических конференциях: IX Всероссийской конференции дерматовенерологов (Екатеринбург, 2006); IV международном конгрессе, посвященном современным аспектам вспомога8 тельных репродуктивных технологий «Актуальные вопросы вспомогательных репродуктивных технологий (проблемы и решения)» (Москва, 2007); I региональном научном форуме «Мать и дитя» (Казань, 2007); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007).

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической и клинико-микробиологичес-кой реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику.

Внедрение результатов исследования в практику

Полученные в настоящем исследовании результаты внедрены и используются в научно-педагогической и лечебно-диагностической работе кафедр дерматовенерологии ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», инфекционных болезней с курсом дерматовенерологии ИПО и лабораторной диагностики ИПО ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», ГУЗ «Республиканский кожно-венерологический диспансер» Республики Башкортостан.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 2 в журналах, включенных в перечень рецензируемых журналов и изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 152 страницах, содержит 36 таблиц, 25 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы (одна глава), собственных исследований (3 главы), заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения. Список литературы содержит 177 источников (64 отечественных и 113 зарубежных авторов).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Мустафина, Гульгена Раисовна

Выводы

1. Наиболее адекватную группу пациентов с урогенитальным трихомониазом для оценки эффективности диагностических тестов по клинико-эпидемиологическим проявлениям в моно- и микствариантах составляют мужчины в возрасте 20-29 лет, имеющие высокую частоту случайных половых связей (70,0%), злоупотребляющие алкоголем (82,7%), часто пользующиеся практикой незащищенного секса (55,5%).

2. Сокращение сроков культуральной детекции и идентификации Trichomonas vaginalis до 2 суток достигается внесением к 5 мл питательной среды 0,03г (0,6 мл) комплекса железа [III] гидроксид полиизомальтозат в виде жидкого лекарственного средства Феррум лек (LEK Pharmaceuticals, Словения).

3. Классическая полимеразная цепная реакция при диагностике урогенитального трихомониаза отличается высокой чувствительностью и специфичностью независимо от выраженности и локализации воспалительного процесса, длительности течения заболевания.

4. Сконструированные праймеры TrVa 22 (5'ТСС АСА GTA ССА AAA GGC АСС ААТ G3'), TrVa 11 (5'ТСА ТСА GAG GCA CGC CAT TCG A3') к 18S рРНК обеспечивают высокоспецифичную детекцию Trichomonas vaginalis в клиническом материале без образования димеров и перекрестных реакций с человеческой ДНК как в качественном варианте полимеразной цепной реакции, так и при проведении ее в режиме реального времени.

5. Real-time ПЦР с праймерами TrVa 22/TrVa 11 к консервативному видоспецифичному фрагменту 18S рибосомальной РНК Trichomonas vaginalis обеспечивает высокую чувствительность и специфичность исследования, возможность получения количественных данных и их автоматическую регистрацию, что существенно оптимизирует лабораторную диагностику урогенитального трихомониаза.

Практические рекомендации

1. При диагностике урогенитального трихомониаза у мужчин культуральным методом рекомендуется использовать модифицированную среду, содержащую в 5мл 0,03 г комплекса железа [III] гидроксид полиизо-мальтозат (0,6 мл жидкого лекарственного средства Феррум лек, LEK Pharmaceuticals, Словения).

2. Для повышения качества лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза рекомендуется использовать полимеразную цепную реакцию с праймерами TrVa 22 (5'ТСС АСА GTA CCA AAA GGC АСС ААТ G3'), TrVa 11 (5 ТС А ТСА GAG GCA CGC CAT TCG A3') к гену 18S рибосомальной РНК Trichomonas vaginalis.

3. При диагностике различных форм урогенитального трихомониаза у мужчин рекомендуется использование полимеразной цепной реакции для исследования отделяемого из уретры, обладающей высокой чувствительностью и специфичностью независимо от локализации, длительности и выраженности воспалительного процесса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Мустафина, Гульгена Раисовна, Уфа

1. Актуальные вопросы диагностики урогенитального трихомониаза / Е.Г. Бочкарев, Ю.В. Сергеев, В.М. Копылов, Д.В. Рюмин // Иммунопатология, аллергология, инфектология. — 2000. - № 4. — С. 77-87.

2. Актуальные проблемы диагностики урогенитального трихомониаза/ A.M. Иванов, И.Н. Теличко, Р.А. Раводин и др.// Журн. дерматовенерологии и косметологии. — 2004. №1. — С. 17-22.

3. Амозов, M.JI. Тиберал в терапии свежего (острого) урогенитального трихомониаза / М.Л. Амозов, Д.С. Коссобудская // Заболевания, передаваемые половым путем. 1996. - № 4. - С. 79-80.

4. Антоньев, А.А., Проституция и заболевания, передаваемые половым путем / А.А. Антоньев, Г.Ф. Романенко, B.C. Мыскин // Вестн. дерматологии и венерологии. 1997. - № 6. - С. 20-22.

5. Барышова, М.В. Хронический трихомониаз и результаты парентерального лечения метронидазолом / М.В. Барышова, Л.А. Бульвахтер // Вестн. дерматологии и венерологии. 2001. - № 2. - С. 72-74.

6. Баткаев, Э. А. Современные проблемы венерологии /Э. А Бат-каев, Д.В. Рюмин // Российский журнал кожных и венерических болезней. -2009.-№3.-С.45.

7. Баткаев, Э.А. Урогенитальный трихомониаз /Э.А. Баткаев// Лечащий врач. 2002. -№12. - С. 1-7.

8. Баткаев, Э.А. Эффективность использования вакцины "Сол-коТриховак" в лечении урогенитального трихомониаза у женщин и мужчин (клинико-лабораторное исследование) / Э.А. Баткаев, Д.В. Рюмин // Рус. мед. журнал. 2002. - Т. 10, № 2. - С. 68-72.

9. Боуден, Ф.Дж. Эпидемиология трихомониаза: параметры и анализ модели лечебных вмешательств / Ф.Дж. Боуден, Дж.П. Гарнет // Инфекции, передаваемые половым путем. 2001. - № 6. - С. 5-11.

10. Бутов, Ю.С. Эффективность секнидазола при лечении трихомониаза / Ю.С. Бутов, Ю.С. Горина // Инфекции, передаваемые половым путем. -2001. -№ 4.-С. 331-333.

11. Васильев, М.М. Современные проблемы диагностики и лечения гонорейной и трихомонадной инфекции / М.М. Васильев // Вестн. дерматологии и венерологии. 1998. - № 4. - С. 39.

12. Выявление влагалищной трихомонады в прямой кишке больных мочеполовым трихомониазом / В.Н. Беднова, В.Н. Мордовцев, Е.Е. Драгина и др. // Вестн. дерматологии и венерологии. 1990. - № 3. - С. 12-15.

13. Гинцбург, A.JL Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее применение в бактериологии /А.Л. Гинцбург, Ю.М. Романовой // Учебно-методическое пособие для врачей-бактериологов М, 2006. - 142 с.

14. Дмитриев, Г.А. Лабораторная диагностика бактериальных уро-генитальных инфекций. — М.: Медицинская книга; Н. Новгород: изд-во НГМА, 2003.-336 с.

15. Дмитриев, Г. А. Мочеполовой трихомониаз (клинико-лабораторное обследование и ведение пациентов) / Г.А. Дмитриев, Н.И. Сюч. М.: Медицинская книга, 2005. - 128 с.

16. Довжанский, С.И. Болезни, передаваемые половым путем: группы и факторы риска / С.И. Довжанский // Вестн. дерматологии и венерологии. 1998. -№ 4. - С. 25 - 26.

17. Изучение ультраструктурной организации вирулентных форм Trichomonas vaginalis / Раздольская Н.В., Гаврилова О.В., Теличко И.Н. и др. // Микробиология. 2007. - Т. 8, С. 283 - 291.

18. Ильин, И.И. Негонококковые уретриты у мужчин. М.: Медицина, 1991.-287 с.

19. Итоги деятельности дерматовенерологической службы Республики Башкортостан 2008 году / Латыпов В.Ф., Хисматуллина З.Р., Курбатов С.С. и др.// Информационное письмо для врачей. — 2008. — 25с.

20. Кисина, В.И. Клинические аспекты и лечение урогенитального трихомониаза препаратами группы 5-нитроимидазолов / В.И. Кисина // Consilium-medium. 2003. - Т. 5, № 3. - С. 162-164.

21. Кисина, В.И. Современные подходы к лечению бактериального вагиноза. Клинико-экономический анализ / В.И. Кисина, С.Г. Горохова, Г.Л. Колиева // Клин, дерматология и венерология. 2004. - № 3. - С. 7679.

22. Кисицина, В. Урогенитальный трихомониаз: терминология, классификация, лечение /В. Кисицина// Врач: Научно-практический и публицистический журнал. 2006. - №2. - СЛ6.

23. Клиника, диагностика и лечение хламидийной инфекции (пособие для врачей) / Кудрявцева Л.В., Мисюрина О.Ю., Генерозов Э.В. и др.// М., «Литех», 2001.- 61 с.

24. Клинико-иммуно логические особенности урогенитального трихомоноза / Теличко И.Н., Иванов A.M., Раздольская Н.В. и др.// Микробиология. 2007.- Т. 8, - С. 637-646.

25. Козлюк, А.С. Цитоморфологическая диагностика урогенитального трихомониаза / А.С. Козлюк, В.А. Козлюк // Инфекции, передаваемые половым путем. 2001. - № 6. - С. 26-28.

26. Лесовой, В. Н. Молекулярные факторы хронизации простатита трихомонадной этиологии и медикаментозные способы ее коррекции /В.Н.

27. Лесовой, А.В. Аркатов, А.В. Книгавко// Здоровье мужчины. 2007. - N 2. -С. 135-138.

28. Марри, П.Р. Клиническая микробиология. Краткое руководство /П.Р. Марри, И.Р. Шей. 2006. - 432 с.

29. Межевитинова, Е.А. Трихомонадная инфекция: клиническое течение, диагностика и лечение / Е.А. Межевитинова, О.И. Михайлова // Рус. мед. журнал. 1998. - Т. 6, № 5. - С. 288-294.

30. Межевитинова, Е.А. Трихомонадный вульвовагинит: клиника, диагностика и лечение / Е.А. Межевитинова // Гинекология. 1999. - № 1. -С. 17-22.

31. Методические материалы по диагностике и лечению наиболее распространенных инфекций, передаваемых половым путем (ИППП), и заболеваний кожи. Протоколы ведения больных, лекарственные средства / под ред. А.А. Кубановой. М.: ГЭОТАР МЕД, 2003. - 448 с.

32. Молочков, В.А. Урогенитальный трихомониаз и ассоциированные уретрогенные инфекции (эпидемиология, клиника, диагностика, лечение, профилактика) / В.А. Молочков // Рос. журн. кожных и венерических болезней. 2001. - № 3. - С. 48-55.

33. Морфофункциональные особенности устойчивого к метрони-дазолу штамма Trichomonas vaginalis / Г.А. Дмитриев, Е.Е. Брагина, В.И. Кисина и др. // Вестн. дерматологии. 1994. -№ 4. - С. 12-15.

34. Мыскин, B.C. К вопросу об источнике инфекции венерической болезни. / B.C. Мыскин // Вестн. дерматологии и венерологии. 1958. -№ 1.-С. 61-62.

35. Об улучшении выявления больных гонореей и трихомониазом в стационарах и гинекологических отделениях (палатах, кабинетах), женских консультациях и урологических кабинетах поликлиник: приказ МЗ СССР № 1570 от 4.12.86.

36. Об унификации лабораторных методов исследования в диагностике гонореи и трихомониаза: приказ МЗ СССР № 936 от 12.06.85.

37. Обухов, И.Л. Лабораторная диагностика инфекционных болезней методом ДНК-амплификации при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР)/ И.Л. Обухов, К.Н. Груздев // Сб. науч. тр. ВГНКИ 1995. -Т. 57 - С.36-45.

38. Овчинников, Н.М. Ультраструктура возбудителей венерических заболеваний и ее клиническое значение / Н.М. Овчинников, В.В. Де-лекторский. М.: Медицина, 1986. - 224 с.

39. Ослопов, В.Н. Клиническая лабораторная диагностика / В.Н. Ослопов, А.Р. Садыкова, Р.А. Абдулхаков. 3-е изд. - М.: МЕДпрессин-форм, 2005. - 64 с.

40. Особенности диагностики мочеполового трихомониаза /И.Н. Теличко, A.M. Иванов, Н.В. Раздольская, Р.А. Раводин // Клиническая дерматология и венерология: Научно-практический журнал. 2006. - N3. -С. 17.

41. Платонов, А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы. — М.: Изд.РАМН, 2000. 52 с.

42. Правила взятия и доставки биологического материала для лабораторных исследований в НПФ «Литех» / Л.В. Кудрявцева, Т.Н. Конаре-ва, Е.В. Горбатенко и др.// Метод, пособие для врачей-клиницистов. -2-е изд., стереотип. М., 2002. - 49 с.

43. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии / под ред. Л.С. Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова. М., 2002. - 376 с.

44. Рахматулина, М.Р. Современные принципы диагностики и лечения урогенитального трихомониаза / М.Р. Рахматулина, Н.В. Фриго // Венеролог: Научно-практический журнал. 2007. - N1. - С. 16.

45. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. -М.: Медиа Сфера, 2003.-312 с.

46. Роль ПЦР-анализа в комплексных бактериологических исследованиях во фтизиатрии / Л.Н.Черноусова, Е.Е.Ларионова, Э.В.Севастьянова, В.И.Голышевская // Проблемы туберкулеза. 2001. - №3. - С.58-60.

47. Рыбалкин, С.Б. Альтернативные подходы к терапии урогени-тальных заболеваний с целью сохранения репродуктивного здоровья: ме-тодич. рекомендации для врачей клиницистов / С.Б. Рыбалкин, А.К. Мир-зобаева. СПб., 2000. - 45 с.

48. Рюмин, Д.В. Проблемы этиологии и патогенеза смешанной (сочетанной) урогенитальной инфекции /Д.В. Рюмин// Российский журнал кожных и венерических болезней. — 2009. №2. - С.63.

49. Рюмин, Д.В. Современные аспекты диагностики мочеполового трихомониаза /Д.В. Рюмин// Российский журнал кожных и венерических заболеваний. 2009. - N 1. - С. 31-39.

50. Скрипкин, Ю.К. Кожные и венерические болезни: учебник /10. К. Скрипкин, А. А. Кубанова, В. Г. Акимов// М.: ГЭОТАР Медиа, 2007. -544 с.

51. Современный взгляд на микроскопический метод диагностики мочеполового трихомониаза /A.M. Иванов, И.Н. Теличко, Н.В. Раздоль-ская, А.Б. Криворучко// Клиническая дерматология и венерология: Научно-практический журнал. 2007. - N2. - С. 28.

52. Соколова, Ю. Я. Аппарат Гольджи паразитических простейших (обзор литературы) / Ю. Я. Соколова, Е. С. Снигиревская, Я. Ю. Ко-миссарчик// Цитология .- 2007. Т. 49, № 3. - С. 163 - 181.

53. Сюч, Н.И. Актуальные вопросы лабораторной диагностики мочеполового трихомониаза / Н.И. Сюч // Вестн. дерматологии и венерологии. 2000. - № 3. - С. 4 - 6.

54. Сюч, Н.И. Серологическая диагностика: место в комплексе исследований при мочеполовом трихомониазе / Н.И. Сюч // Вестн. дерматологии и венерологии. — 2001. № 4. — С. 6 - 8.

55. Теличко, И.Н. Диагностика и лечение трихомоноза: микробиологические и иммунологические аспекты: автореф. дис. . д-ра мед. наук.-СПб., 2007. 47 с.

56. Тихомиров, A.JI. Урогенитальный трихомониаз / A.JI. Тихомиров, Ч.Г. Олейник // Лечащий врач. 2003. - № 7. - С. 10-14.

57. Трихомониаз мужчин, женщин и детей / Б.В. Клименко, Э.Р. Авазов, В.Б. Барановская, М.С. Степанова. СПб.: СЮЖЕТ, 2001. - 192 с.

58. Урогенитальный трихомониаз: актуальные вопросы диагностики и лечения (пособие для врачей) / В.М. Копылов, Е.Г. Бочкарев, В.М. Говорун и др.. М., 2001. - 40 с.

59. Флетчер, Р. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины / Р.Флетчер, С.Флетчер, Э.Вагнер //Пер. с англ.- М.:Изд-во Медиа Сфера, 1998.- 352 с.

60. Фриго, Н.В. Актуальные задачи диагностики и терапии инфекций, передаваемых половым путем /Н.В. Фриго, С.В. Сидоренко// Венеролог: Научно-практический журнал. 2007. - № 3. - С. 16.

61. Хаммершлаг, М.Р. Заболевания передаваемые половым путём у детей / М.Р. Хаммершлаг // Инфекции, передаваемые половым путем. -1999. -№3.- С. 4-11.

62. Херрингтон, С. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: пер. с англ. / С. Херрингтон, Д. Макги М.: Мир, 1999. - 558 с.

63. A comparison of the sensitivity of the Inpouch Diamond's and Tri-chosel media for the detection of Trichomonas vaginalis / K. Borchardt, M. Zhang, H. Shing, K. Flink // Genitourin Med. 1997. - Vol. 73, № 4. - P. 297 -298.

64. A comparison of wet mount, culture and enzyme linked immunosorbent assay for the diagnosis of trichomoniasis in women / P. Sharma, N. Mal-la, I. Gupta et al. // Trop. Geogr. Med. 1991. - Vol. 43. - P. 257 - 260.

65. Abonyi, A. Examination of nonflagellate and flagellate round forms of Trichomonas vaginalis by transmission electron microscopy/ A. Abonyi I I Appl. Parasitol. 1995. - Vol. 36. - P. 303-310.

66. Alderete, J.F. Alternating phenotypic expression of two classes of Trichomonas vaginalis surface markers / J.F. Alderete // Rev. Infect. Dis. 1988. -Vol. 10. - Suppl. 2. - P. S408 - S412.

67. Alternative Pathway of Metronidazole Activation in Trichomonas vaginalis Hydrogenosomes / I.Hrdy, R.Cammack, P.Stopka et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 2005. - Vol.49. - P.5033 - 5036.

68. An overview of selected curable sexually transmitted diseases // Global program on AIDS. Geneva: WHO, 1995. - P. 2 - 27.

69. Arroyo, R. Molecular basis of host epithelial cell recognition by Trichomonas vaginalis / R. Arroyo, J. Engbring, J.F. Alderete // Mol. Microbiol. 1992.-Vol. 6.-P. 853 -862.

70. Arroyo, R. Trichomonas vaginalis surface proteinase activity is necessary for parasite adherence to epithelial cells / R. Arroyo, J.F. Alderete // Infect. Immun. 1989. - Vol. 57. - P. 2991-2997.

71. Bataillard, I.F. Le Trichomonas vaginalis dit a formie ronde. Mythe ou tealite / I.F. Bataillard // J. Inform. Malad. Veneros. 1982. - Vol. 54. -P. 58-60.

72. Benchimol, M. The fine structure of the axostyle and its associations with organelles in Trichomonads / M. Benchimol, J.A.P. Diniz, K. Ribeiro // Tissue Cell. 2000. - Vol. 32. - P. 178-187.

73. Benchimol, M. Trichomonads under microscopy /M.Benchimol// Microsc. Microanal. 2004. - №10. - P. 528-550.

74. Borchardt, K.A. An evaluation of an InPoucht TV culture method for diagnosing Trichomonas vaginalis infection / K.A. Borchardt, R.F. Smith // Genitourin. Med. 1991. - Vol. 67. - P. 149-152.

75. Borchardt, K.A. Trichomoniasis: its clinical significance and diagnostic challenges / K.A. Borchardt // Am. Clin. Lab. 1994. - Vol. 13. - P. 2021.

76. Bowden, F.J. Trichomonas vaginalis epidemiology: parameterizing and analyzing a model of treatment interventions / F.J. Bowden, G.P. Garnett // Sex. Transm. Infect. 2000. - Vol. 76. - P. 248-256.

77. Briselden, A.M. Evaluation of Affirm VP Microbal Identification Test for Gardnerella vaginalis and Trichomonas vaginalis / A.M. Briselden, S.L.Hillier // J.Clin.Microbiol. 1994. - Vol.32. - P. 148-152.

78. Carlton, J.M. Draft Genome Sequence of the Sexually Transmitted Pathogen Trichomonas vaginalis /J. M. Carlton, R.P. Hirt, J.C. Silva et al. // Science 12. 2007. - Vol. 315, № 5809. - P. 207 - 212.

79. Clinical and micribiological aspects of Trichomonas vaginalis / D. Petrin, K. Delgaty, R. Bhatt, G. Garber // Clin. Microb. Reviews. 1998. -Vol. 11, №2.-P. 300-317.

80. Clinical manifestations of vaginal trichomoniasis / P.J Wolner-Hansen, F.N. Krieger, C.E. Stevens et al. // JAMA. 1989. - Vol. 261. -P. 571-576.

81. Comparison of culture and different PCR assays for detection of Trichomonas vaginalis in self collected vaginal swab specimens / T. Crucitti, E.V. Dyck, A. Tehe et al. // Sex Transm. Infect. 2003. - Vol. 79. - P. 393398.

82. Comparison of the InPouch TV culture system and Diamond's modified medium for detection of Trichomonas vaginalis / M.H. Levi, J. Torres, C. Pina, R.S. Klein//J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35, № 12. - P. 3308-3310.

83. Contamination and Sensitivity Issues with a Real-Time Universal 16S rRNA PCR /С. E. Corless, M. Guiver, R. Borrow et al. // J. Clinical Microbiol, 2000. Vol. 38, № 5. - P. 1747-1752.

84. Cotch, M.F. Demographic and behavioral predictors of Trichomonas vaginalis infection among pregnant women. The Vaginal Infections and Prematurity Study Group / M.F. Cotch // Obstet. Gynecol. 1991. - Vol. 78. -P. 1087-1092.

85. Craig, W.A. Killing and regrowth of bacteria in vitro / W.A. Craig, S.C. Ebert // Scand. J. Infect. Dis. 1991. - Vol. 74. - P. 63-70.

86. Danesh, I.S. Neonatal Trichomonas vaginalis infection / I.S. Da-nesh, J.M. Stephen, J. Gorbach // J. Emerg. Med. 1995. - Vol. 13. - P. 51-54.

87. Development of a polymerase chain reaction based on diagnosis of Trichomonas vaginalis / D. E. Riley, M. C. Roberts, T. Takayama, J. N. Krieg-er//. J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol.30. - P. 465-472.

88. Diagnosis of Trichomonas vaginalis infection by PCR using vaginal swab samples / G. Madico, T.C. Quinn, A. Rompalo et al. // J. Clin. Microbiol. 1998.-Vol. 36.-P. 3205-3210.

89. Diagnosis of Trichomonas vaginalis Infection in Adolescent Women / L.Pattullo, S.Griffeth, L.Ding et al. // J. Clin. Microbiol. 2009. - Vol.47. -P.59- 63.

90. Diagnosis of trichomoniasis by polymerase chain reaction / J.S. Ryu, H.L. Chung, D.Y. Min et al. // Yonsei Med. J. 1999. - Vol. 40, № 1. -P. 56-60.

91. Diamond, L.S. Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903: from xenic to axenic cultivation / L.S. Diamond // J. Protozool. 1986. - Vol. 33, № 1. -P.l-5.

92. Dolichyl-Phosphate-Glucose Is Used To Make O-Glycans on Glycoproteins of Trichomonas vaginalis / K.A.Grabinska, S.K.Ghosh, Z.Guan et al. // Eukaryot. Cell. 2008. - Vol. 7. - P. 1344 - 1351.

93. Drummond, A.S. Trichomonas infection of prostan gland /A.S. Drummond// Am. J. Surg. 1936. - Vol.31, №1. - P. 98-103.

94. Etiology of genital ulcers and prevalence of human immunodeficiency virus coinfection in 10 US cities. The Genital Ulcer Disease Surveillance Group / K.J. Mertz, D. Trees, W.C. et al. // J. Infect. Dis. 1998. - Vol. 178, №6.-P. 1795 - 1798.

95. Fe-Hydrogenase Maturases in the Hydrogenosomes of Trichomonas vaginalis / S.Piitz, P.Dolezal, G.Gelius-Dietrich et al. // Eukaryot. Cell. 2006.- Vol.5. P.579 - 586.

96. Garber, G.E. Effect of beta-estradiol on production of the cell-detaching factor of Trichomonas vaginalis / G. E.Garber, L. T. Lemchuk-Favel, G. Rousseau // J. Clin. Microbiol. 1991. - Vol. 29, № 9. - P. 1847-1849.

97. Garcia, A. F. Trichomonas vaginalis Polyamine Metabolism Is Linked to Host Cell Adherence and Cytotoxicity/ A.F.Garcia, M. Benchimol, J.F.Alderete // Infect. Immun. 2005. - Vol.73. - P.2602 - 2610.

98. Gardner, W.A. Patology of urogenitai trichomoniasis in men / W.A. Gardner// Trichomonas parasitic in humans / Ed. By B.M. Honigberg New York - Springer-Veriag, 1990. - P. 292-296.

99. Gerbase, A.C. Global epidemiology of sexually transmitted diseases / A.C. Gerbase, J.T. Rowley, Т.Е. Mertens// Lancet. -1998. Vol. 351. Suppl.3.- P. 2-4.

100. Giardia, Entamoeba, and Trichomonas Enzymes Activate Metronidazole (Nitroreductases) and Inactivate Metronidazole (Nitroimidazole Reductases) / D.Pal, S.Banerjee, J.Cui et al. //Antimicrob. Agents Chemother. -2009.-Vol. 53.-P.458-464.

101. Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase Is a Surface-Associated, Fibronectin-Binding Protein of Trichomonas vaginalis / A.Lama, A.Kucknoor, V.Mundodi, J.F.Alderete // Infect. Immun. 2009. - Vol.77. -P.2703 -2711.

102. Golgi biogenesis in Toxoplasma gondii. /L. Pelletier, C. A. Stern,

103. M. Pypaert et al. //Nature. 2002. -Vol. 418. - P.548-552.135

104. Heid, С.A. Real-time quantitative PCR / C.A. Heid // Genome Res. 1996.-№ 6.-P. 986-994.

105. Heine, P. Trichomonas vaginalis: a reemerging pathogen / P. Heine, J.A. McGregor // Clin. Obstet. Gynecol. 1993. - Vol. 36. - P. 137-144.

106. Higuchi, R. Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions / R.Higuchi // Biotechnology. 1993. -№ 11. - РД026-1030.

107. Honigberg, B.M. Strukture of Trichomonas vaginalis Donne / B.M. Honigberg, V. King // J. Parasitol. 1964. - Vol. 50, № 4. - P. 345-364.

108. Hydrogen Production by Termite Gut Protists: Characterization of Iron Hydrogenases of Parabasalian Symbionts of the Termite Coptotermes for-mosanus / J.Inoue, K.Saita, T.Kudo et al. // Eukaryot. Cell. — 2007. Vol.6. -P.1925-1932.

109. Kent, H.L. Epidemiology of vaginitis / H.L. Kent // Am. J. Obstet. Gynecol. 1991.-Vol. 165.-P. 1168-1176.

110. Krieger, J.N. Trichomonas vaginalis and trichomoniasis / J.N. Krieger, J.F. Alderete// Sexually transmitted diseases/ K.K. S.P. Holmes, P.A. Mardh, S.A. Lemon. New York.: McGraw-Hill, 1999. - P. 589-591.

111. Krieger, J.N. Trichomoniasis in men: old issues and new data / J.N. Krieger // Sex. Transm. Dis. 1995. - Vol. 22. - P. 83-96.

112. Kucknoor, A.S. Adherence to Human Vaginal Epithelial Cells Signals for Increased Expression of Trichomonas vaginalis Genes / A.S.Kucknoor, V.Mundodi, J.F.Alderete // Infect. Immun. 2005. - Vol.73. - P.6472 - 6478.

113. Lawing, L.F. Detection of Trichomonosis in Vaginal and Urine

114. Specimens from Women by Culture and PCR / L.F. Lawing, S.R. Hedges,

115. J.R. Schwebke // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38, № 10. - P. 3585-3588.136

116. Lehker, M.W. Biology of trichomonosis / M.W. Lehker, J.F. Alderete // Curr. Opin. Infect. Dis. 2000. - Vol. 13. - P. 37-45.

117. Lopes, L.C. Immunolocalization of tubulin isoforms and post-translational modifications in the protist Trichomonas foetus and Trichomonas vaginalis / L.C. Lopes, M. Benchimol, K.C. Ribeiro // Histochem. Cell. 2001. -Vol. 116.-P. 17-29.

118. Methods for Detection of Trichomonas vaginalis in the Male Partners of Infected Women: Implications for Control of Trichomoniasis / M.M.Hobbs, D.M. Lapple, L.F.Lawing et al. // J. Clin. Microbiol. 2006. -Vol. 44. - P. 3994 - 3999.

119. Molecular analysis of Trichomonas vaginalis surface protein repertoires / J.F. Alderete, R. Arroyo, D.C. Dailey et al. // Mol. Cell Biol. Hum. Dis. Ser. 1992. -Vol. l.-P. 173-202.

120. Molecular Characterization of a New Tetratrichomonas Species in a Patient with Empyema / C.Mantini, L.Souppart, C.Noel et al. // J. Clin. Microbiol. 2009. - Vol.47. - P. 2336 - 2339.

121. Molecular diagnosis of bacterial endocarditis by broad-range PCR amplification and direct sequencing /D. Goldenberger, A. Kunzli, P. Vogt et al. //- J. Clinical Microbiol., 1997. Vol. 35 - P. 2733-2739.

122. Molecular Identification of Tritrichomonas foetus-Like Organisms as Coinfecting Agents of Human Pneumocystis Pneumonia / C.Duboucher, S. Caby, F.Dufernez et al. // J. Clin. Microbiol. 2006. - Vol.44. - P.1165-1168.

123. Muresu, R. New method for identification of Trichomonas vaginalis by fluorescent DNA in situ hybridization /R. Muresu, S.Rubino, P.Rizzu// J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol.32. - P.1018-1022.

124. Natural history of urogenital trichomoniasis in men / J.N. Krieger, M. Verdon, N. Siegel, K.K. Holmes // J. Urol. 1993. - Vol. 149. - P. 14551458.

125. Non-ulcerative sexually transmitted diseases as risk factors for HIV-l transmission in women: results from a cohort study / M. Laga, A. Mano-ka, M. Kivuvu et al. // AIDS. 1993. - № 7. - P. 10195-10210.

126. Pillay, A. Evaluation of Xenostrip-Tv, a Rapid Diagnostic Test for Trichomonas vaginalis Infection / A. Pillay, J. Lewis, R.C. Ballard // J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol. 42, № 8. - P. 3853-3856.

127. Pindak, F.F. Growth and cytopathogenicity of Trichomonas vaginalis in tissue cultures / F.F. Pindak, W.A. Gardner Jr., M.M. Pindak // J. Clin. Microbiol. 1986. - Vol. 23. - P. 672-678.

128. Polymerase chain reaction amplyfication of Trichomonas vaginalis DNA from Papanicolau strain smeas / T. Okayama, R. Takahashi, M. Mori et al. // Diagn. Cytopathol. 1998. - Vol. 19, № 6. - P. 437-440.

129. Polymerase chain reaction analysis of distal vaginal specimens: a less invasive strategy for detection of Trichomonas vaginalis / R.P. Heine, И.С. Wiesenfeld, R.L. Sweet, S.S. Witkin // Clin. Infect. Dis. 1997. - Vol. 24. -P. 985-987.

130. Protein from Trichomonas vaginalis Hydrogenosomes: the Terminal Oxygen Reductase / T.Smutna, V.L.Gon9alves, L.M.Saraiva et al. // Euka-ryot. Cell. 2009. - Vol.8. - P.47 - 55.

131. Protein Import into Hydrogenosomes of Trichomonas vaginalis Involves both N-Terminal and Internal Targeting Signals: a Case Study of Thiore-doxin Reductases / M.Mentel, V.Zimorski, P.Haferkamp et al. // Eukaryot. Cell. 2008. - Vol. 7. - P.1750 - 1757.

132. Proteins of the Glycine Decarboxylase Complex in the Hydrogeno-some of Trichomonas vaginalis / M.Mukherjee, M.T.Brown, A.G. McArthur et al. // Eukaryot. Cell. 2006. - Vol.5. - P.2062-2071.

133. Provenzano, D. Analysis of human immunoglobulin-degrading cysteine proteinases of Trichomonas vaginalis / D. Provenzano, J.F. Alderete // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63. - P. 3388-3395.

134. Real-time PCR improves detection of Trichomonas vaginalis infection compared with culture using self-collected vaginal swabs / A.M. Caliendo, J.A. Jordan, A.M. Green et al. // Infect. Dis. Obstetr. Gynecol. 2005. -Vol. 13, №3.-P. 145-150.

135. Real-Time PCR in Clinical Microbiology: Applications for Routine Laboratory Testing / M.J.Espy, J.R.Uhl, L.M.Sloan et al. // Clin. Microbiol. -2006.-Vol. 19.-P.165 -256.

136. Rein, M.F. Trichomonas vaginalis and trichomoniasis / M.F. Rein, M. Muller // Sexually Transmitted Diseases / ed. K.K. Holmes. N. Y.: McGraw Hill, 1990. - P. 481-492.

137. Risk assessment and laboratory diagnosis of trichomoniasis in men / J.N. Krieger, M. Verdon, N. Siegel et al. // J. Infect. Dis. 1992. - Vol. 166. -P. 1362-1366.

138. Rivers, C.A. Viability of Trichomonas vaginalis in Copan Universal Transport Medium and eSwab Transport Medium / C.A.Rivers, J.R.Schwebke //J. Clin. Microbiol. 2008. - Vol.46. - P.3134 - 3135.

139. S.C. Shafir. Current Issues and Considerations Regarding Trichomoniasis and Human Immunodeficiency Virus in African-Americans / S.C.Shafir, F.J.Sorvillo, L.Smith // Clin. Microbiol. 2009. - Vol.22. - P.37 -45.

140. Schwarts, D.E. Comparative pharmacokinetic studies of tinidazole and metronidazole in man / D.E. Schwarts, F. Jeunet // J. Chemotherapy. 1976. -Vol. 22.-P. 19-29.

141. Schwebke, J.R. Improved Detection by DNA Amplification of Trichomonas vaginalis in Males / J.R. Schwebke, L.F. Lawing // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol. 40, № 10. - P. 3681-3683.

142. Schwebke, J.R. Prevalence of Trichomonas vaginalis Isolates with Resistance to Metronidazole and Tinidazole / J.R. Schwebke, F.J. Barrientes // Antimicrob. Agents Chemother. 2006. - Vol. 50. - P.4209 - 4210.

143. Schwebke, J.R. Trichomoniasis / J.R. Schwebke, D. Burgess // Clin. Microbiol. Rev. 2004. - Vol. 17, № 4. - P. 794-803.

144. Shafir, S.C. Current Issues and Considerations Regarding Trichomoniasis and Human Immunodeficiency Virus in African-Americans /S.C.Shafir, F.J.Sorvillo, L.Smith// Clin. Microbiol. 2009. - Vol.22. - P.37 -45.

145. Shafir, S.C. Viability of Trichomonas vaginalis in Urine: Epidemiologic and Clinical Implications / S.C.Shafir, F.J.Sorvillo // J. Clin. Microbiol. -2006. Vol.44. - P.3787 - 3789.

146. Shaio, M.F. Colorimetric one-tube nested PCR for detection of Trichomonas vaginalis in vaginal discharge / M.F. Shaio, P.R. Lin, J.Y. Liu // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35. - P. 132-138.

147. Signalling of Trichomonas vaginalis for amoeboid transformation and adhesion synthesis follows cytoadherence / R. Arroyo, A. Gonzalez-Robles, A. Martinez-Palomo, J.F. Alderete. // Mol. Microbiol. 1993. - Vol. 7. - P. 299309.

148. Simultaneous Identification of 14 Genital Microorganisms in Urine by Use of a Multiplex PCR-Based Reverse Line Blot Assay / M.L.Mckechnie, R.Hillman, D.Couldwell et al. // J. Clin. Microbiol. 2009. - Vol.47. - P.1871 - 1877.

149. Specific erythrocyte binding is an additional nutrient acquisition system for Trichomonas vaginalis / M.W. Lehker, Т.Н. Chang, D.C. Dailey, J.F. Alderete // J. Exp. Med. 1990. - Vol. 171. - P. 2165.

150. Stability of Trichomonas vaginalis DNA in Urine SpecimensJ. / J.Ingersoll, T.Bythwood, D.Abdul-Ali et al. // Clin. Microbiol. 2008. -Vol.46. -P.1628-1630.

151. Structure and division of the Golgi complex in Trichomonas vaginalis and Trichomonas foetus / M.Benchimol, K.Ribeiro, R. M.Mariante, J. F.Alderete// Eur. J. Cell Biol. 2001.- №80 P.593-607.

152. The plastic envelope method, a simplified technique for culture diagnosis of trichomoniasis / C. Beal, R. Goldsmith, M. Kotby et al. // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. - P. 2265-2268.

153. Thomason, J.L. Trichomonas vaginalis / J.L. Thomason, S.M. Gel-bert // Obstet Gynecol. 1989. - Vol. 74. - P. 536-541.

154. Trichomonas vaginalis associated with low birth weight and preterm delivery / M.F.Cotch, J.G. Pastorek, R.P. Nugent et al. // Sex. Transm. Dis. 1997. - Vol. 24. - P. 353-360.

155. Trichomonas vaginalis Lipophosphoglycan Triggers a Selective Upregulation of Cytokines by Human Female Reproductive Tract Epithelial Cells / R.N. Fichorova, R.T.Trifonova, R.O.Gilbert et al. // Infect. Immun. -2006. Vol.74. - P.5773 - 5779.

156. Trichomonas vaginalis weakens human amniochorion in an in vitro model of premature membrane rupture / D. Draper, W. Jones, R.P. Heine et al. // Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 1995. - № 2. - P. 267-274.

157. Trichomonas vaginalis: repeated DNA target for highly sensitive and specific polymerase chain reaction diagnosis / P. Kengne, F. Veas, N. Vidal et al. // Cell. Mol. Biol. 1994. - Vol. 40. - P. 819-831.

158. Tsai, C. Characterization of an iron-responsive promoter in the protozoan pathogen Trichomonas vaginalis / C. Tsai, H.W. Liu, J.H. Tai // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277.-P. 5153-5162.

159. Two Unusual Occurrences of Trichomoniasis: Rapid Species Identification by PCR / P.Bellanger, O.Cabaret, J.M.Costa et al. // J. Clin. Microbiol. -2008. Vol.46. - P. 3159 - 3161.

160. Urethral infection in a workplace population of East African men: evaluation of strategies for screening and management / D.J. Jackson, J.P. Rak-war, B. Chohan et al. // J. Infect. Dis. 1997. - Vol. 175. - P. 833-838.

161. Use of an Immunochromatographic Assay for Rapid Detection of Trichomonas vaginalis in Vaginal Specimens / J.S.Huppert, B.E. Batteiger, P.Braslins et al. //J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol.43. - P.684 - 687.

162. Use of the Roche LightCycler Instrument in a Real-Time PCR for Trichomonas vaginalis in Urine Samples from Females and Males / J. Hardick,

163. S. Yang, Sh. Lin et al. // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41, № 12. - P. 56195622.

164. Yuh, Y.S. Chromosome number of Trichomonas vaginalis / Y.S. Yuh, J.Y. Liu, M.F. Shaio // J. Parasitol. 1997. - Vol. 83, № 3. - P. 551553.

Информация о работе

Мустафина, Гульгена Раисовна
кандидата медицинских наук
Уфа, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Информативность методов диагностики урогенитального трихомониаза и обоснование показаний к применению ПЦР в реальном времени - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Информативность методов диагностики урогенитального трихомониаза и обоснование показаний к применению ПЦР в реальном времени - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы