Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Индукция эпигенетической гетерогенности в популяции клеток , содержащих искусственные циклические системы генов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Индукция эпигенетической гетерогенности в популяции клеток , содержащих искусственные циклические системы генов"

На правах рукописи

Ступак Евгения Эдуардовна

ИНДУКЦИЯ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЙ ГЕТЕРОГЕННОСТИ В ПОПУЛЯЦИИ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI, СОДЕРЖАЩИХ ИСКУССТВЕННЫЕ ЦИКЛИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ ГЕНОВ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

УФА-2006

Работа выполнена в лаборатории математической и молекулярной генетики Института биологии Уфимского научного центра РАН

Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор

Чураев Рустэм Нурович

Официальные оппоненты Доктор биологических наук, профессор

Чемерис Алексей Викторович

Кандидат биологических наук, доцент Бабынин Эдуард Викторович

Ведущая организация Федеральное государственное

учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"

Защита состоится «21» ноября 2006 г., в_часов на заседании Регионального

диссертационного совета КМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики

Уфимского научного центра РАН.

Адрес: 450054, г. Уфа, проспект Октября, 71.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН.

Автореферат разослан «_» октября 2006 г.

Ученый секретарь Регионального диссертационного совета, к.б.н. иг Бикбулатова С.М.

ХОШЬ АЯ-ЧЪ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Паттерн экспрессии генов определяет фенотип клетки. Наследуемые изменения уровней экспрессии генов в клетках лежат в основе таких процессов как: выбор между литическим и лизогенным путями развития у умеренных бактериофагов (Johnson et al., 1981); фазовые вариации у прокариот (van der Woude, Baumler, 2004; van der Woude, 2005); клеточная дифференцировка эукариот (Latham, 1999; Kepes, 2005). Исследование механизмов возникновения дифференциальной активности генов в индивидуальных клетках клональной популяции - одно из наиболее актуальных направлений современной биологии. В большинстве случаев наследуемые в клеточных поколениях, но обратимые изменения генной активности являются результатом взаимосвязанных генетических (транспозиции, инверсии) и эпигенетических факторов (структура хроматина, модификации ДНК и ДНК-ассоциированных белков, переключение уровня синтеза транскрипционных факторов в циклических системах генов). Причем обратимые перестройки последовательности ДНК контролируются регуляторными белками (van der Woude, Baumler, 2004).

Как было показано в ряде работ (Gardner et al., 2000; Tchuraev et al., 2000) циклические дигенные системы с отрицательными обратными связями (ДДС^) могут поддерживать два альтернативных уровня экспрессии генов и, соответственно, два фенотипа клетки. В этом случае ЦДСН является динамическим эпигеном, в котором часть наследственной информации хранится, кодируется и передается потомству вне первичной структуры молекул ДНК генома (Чураев, 1975). Использование при конструировании хорошо охарактеризованных генетических элементов, простая структура и наличие обратных связей, стабилизирующих систему, делают искусственные ЦДС^ удобным объектом для изучения основных закономерностей возникновения фенотипической гетерогенности в популяции генетически однородных клеток.

Цель работы - исследовать возможность индукции наследуемой эпигенетической гетерогенности в клональной популяции клеток Escherichia coli, содержащих искусственные циклические системы генов.

Задачи исследования:

1. Исследовать стабильность наследования каждого из альтернативных фенотипов клеток, содержащих циклические дигенные системы с отрицательными обратными связями в процессе роста периодической культуры.

2. Исследовать фенотипический состав популяции клеток, содержащих ЦДС^ и циклическую моногенную систему с отрицательной обратной связью в процессе роста периодической культуры.

3. Проверить возможность расщепления клональной популяции клеток E.coli, содержащих ЦЦСН, на две фенотипически различающихся субпопуляции в отсутствие специфических индуцирующих факторов.

4. Поставить эксперимент по одновременному воздействию двух индуцирующих факторов на клетки, содержащие ЦДСГ"\ для проверки гипотезы о существовании метастабильного состояния.

5. Исследовать влияние метаболизма клетки в момент воздействия индукторов на соотношение альтернативных субпопуляций клеток в дальнейшем.

Научная новизна исследования. Обнаружена возможность переключения функциональных состояний ЦДСН изменением скорости роста культуры. Впервые установлено, что клетка, содержащая динамический эпиген, может при делении образовать дочерние клетки, детерминированные к альтернативному фенотипу. Экспериментально показано новое свойство динамического эпигена: возможность перехода в метастабильное состояние под воздействием внешних факторов. Впервые получена экспериментальная модель одного из молекулярных механизмов детерминации клеток к самодифференцировке.

Научно-практическая значимость работы. Исследование эпигенетических механизмов возникновения фенотипической гетерогенности в изначально гомогенной популяции создает основу для разработки систем управления клеточными процессами. В биотехнологии управление структурой популяции, т.е.

поддержание необходимых фенотипических разновидностей клеток в необходимых пропорциях, позволит контролировать скорость процесса и варьировать на разных этапах соотношение синтезируемых продуктов. Поскольку многие мультифакторные признаки с изменчивой пенетрантностыо (частотой проявления признака), возможно, имеют эпигенетическую основу, понимание причин разного уровня экспрессии генов в генетически однородных клетках необходимо для достоверной интерпретации результатов генетического анализа.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на III съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2004), международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, 2005), 9 и 10 Путинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005,2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объём диссертации. Работа изложена на ПО страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 200 источников. Диссертация иллюстрирована 2 схемами, 24 графиками и 28 фотографиями.

Благодарности. Считаю своей приятной обязанностью выразить признательность моему научному руководителю д.б.н. проф Чураеву Р.Н., сотрудникам института биологии н.с. Ступак И.В., к.б.н. Галимзянову A.B., к.б.н. Галимзяновой Н.Ф., к.б.н. Миграновой И.Г., м.н.с. Тропыниной Т.С.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Исследования проводились на клетках E.coli штамма JC158 (Hfr Р01, thil, serAó, Ш22, relAl) (Murphy, Pembroke, 1995), трансформированных плазмидами рС1КЗ и/или pLACI. Плазмида рС1КЗ (предоставлена Дж. Коллинзом (J.J. Collins, Boston University, USA)) содержит ЦДСН (рис. 1А), плазмида pLACI - ЦМСН (рис. 1Б).

Методы исследования. Клетки культивировали в богатой среде LB или в минимальной среде М9 с казаминовыми кислотами и 40мМ источником

5

углерода (глюкоза, ацетат натрия) с добавлением необходимых для поддержания плазмид антибиотиков, при 30°С или 42°С (Миллер, 1976). Логарифмическую фазу роста поддерживали периодическими разведениями свежей средой, оптическая плотность культуры составляла 0.04-0.4 ед. при длине волны бООнм (О6оо). Рост клеток в периодической культуре исследовали на протяжении 24 часов, начиная с Б«» = 0,04-0,08. Для индукции экспрессии с Р|ас-промотора использовали изопропил-р-Б-тиогалакгозид (ИПТГ) в концентрации 1мМ. Бактериальные клетки синтезирующие р-галактозидазу выявляли на чашках Петри со средой ЬВ, содержащей 40 мкг/мл хромогенного субстрата Х-Оа1 (Миллер, 1976). Активность (3-галактозидазы оценивали при помощи хромогенного субстрата о-нитрофенил-Р-О-галактозида (ОИФГ) и вычисляли в условных единицах по следующей формуле: 1000*04о</(1*у*Б(;оо), где Бдоо - измеренные значения для реакционной смеси, 0«ю отражает плотность клеточной суспензии перед определением, I - время реакции в мин и V - объем пробы культуры, взятой для определения, в мл (Миллер, 1976). Полученная величина пропорциональна увеличению количества о-нитрофенола в минуту на одну бактериальную клетку. Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса (Харди, 1990). Трансформацию проводили по оригинальной методике, основанной на прописях, предложенных в работах Ханаана (1988) и РегЬа! (1988).

1асГ\ рСТКЗ

ИПТГ

I

Р|пс >1 Ш I рЬАС!

1асг

зфз

ХРОМОСОМ!)

Рис. 1. Схемы искусственных генных сетей, используемых в работе. А. Сеть, состоящая из циклической дигенной системы с отрицательными обратными связями, локализованной на плазмиде рС1КЗ и маркерного гена 1ас2 на хромосоме. Б. Циклическая моногенная система с отрицательной обратной связью, локализованная на плазмиде рЬАС1.

Статистический анализ. Статистическую обработку проводили в программе Microsoft Exel. На графиках приведены средние данные из серии однотипных экспериментов (не менее трех повторностей). Принадлежность данных, полученных в экспериментах серии, к одной генеральной совокупности проверяли по критерию %2.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Циклическая дигенная система с отрицательными обратными связями (ЦЦС^), локализованная на плазмиде рС1КЗ (рис. 1 А), содержит ген lacl E.coli под контролем модифицированного промотора PL фага X (Gardner et al., 2000) и ген cls$7 термочувствительного репрессора бактериофага X под контролем промотора Ptro, являющегося синтетическим аналогом Р|ас. Эти гены кодируют регуляторные белки Lacl и CI. Так как CI репрессирует PL промотор, a Lacl репрессирует Ptre промотор, ЦЦСМ может находиться в двух стабильных функциональных состояниях: в одном высокий уровень экспрессии гена cl и низкий уровень экспрессии гена lacl (эпигенотип lacfcl'), в другом высокий уровень экспрессии гена lacl и низкий - гена cl (эпигенотип lacj'cf). Система переключается между устойчивыми эпигенотипами внешними метаболическим (ИПТГ) и температурным (42°С) индукторами.

Клетки Е. coli штамма JC158, синтезируют функционально неактивный репрессор лактозного оперона (Lacl), поэтому в клетках JC158(pCIK3) репрессия гена LacZ происходит только за счет Lac-penpeccopa, синтезируемого с плазмиды: клетки с эпигенотипом lacfcl1 образуют синие колонии, lacfcf -белые. Рассевом клеток, находившихся под действием одного из индуцирующих факторов, на чашки с X-Gal без ИПТГ с последующей инкубацией при 30°С было показано: 1) приобретенный под действием индуцирующих факторов эпигенотип поддерживается в процессе роста колонии; 2) при экспоненциальном росте культуры в жидкой среде в отсутствие

7 РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ

БИБЛИОТЕКА С.-Петербург ОЭ 260 акт

индуцирующих факторов, клетки стабильно поддерживают эпигенотип, приобретенный ранее.

Наследование эпигснотипов клетками >1С158(рС1КЗ) в периодической культуре в отсутствие индуцирующих факторов

При периодическом культивировании бактериальных клеток (культивирование в закрытой системе) скорость роста культуры после окончания экспоненциального роста постепенно уменьшается, снижаясь до нуля к стационарной фазе. Замедление скорости роста культуры приводит к увеличению в клетке концентрации как циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), так и белка-активатора катабодитных опероиов (БАК). Комплекс БАК-цАМФ активирует транскрипцию с 1ас-промотора дикого типа. Следовательно, при периодическом культивировании активность р-гапактозидазы будет постепенно возрастать. Присутствие в среде культивирования глюкозы снижает концентрацию цАМФ в клетке, что приводит к падению уровня транскрипции с лактозного промотора.

Был поставлен следующий эксперимент. Культура 1С 158 или Л1Л58(рС1КЗ) росла 14-16 часов на одной из сред: ЬВ, М9 с глюкозой или М9 с ацетатом натрия. Штамм .ГС158(рС1КЗ) культивировался или при 42°С, или в присутствии ИПТГ при 30°С, для перевода клеток в соответствующий эпигенотип. Затем клетками засевали свежую среду (50 мл) до В6оо = 0,002, Культура росла при 30°С. Образцы для измерения оптической плотности и активности р-галактозидазы забирали каждый час, начиная с Б «м-0,04-0,08, на протяжении 7 часов и через 24 часа после первой пробы. Клетки культуры .1С158(рС1КЗ) высевали каждый час на чашки Петри с Х-Оа1 с последующей инкубацией при 30°С. Результаты показали, что активность Р-галактозидазы за исследованный период роста культуры в среде ЬВ возрастает от 500±50 до 6400+500 ед. (рис. 2), в минимальной среде с глюкозой от 6001100 до 1800±300 ед. (рис. 3). В минимальной среде с ацетатом натрия от 3000±100 до 7100±300 ед. (рис. 4). В культуре ЛС158(рС1КЗ), предварительно индуцированной к

эпигенотипу lacfcf, на средах LB и М9 с глюкозой в экспоненциальной фазе роста в промежутке Deco 0,04 — 0,12 активность ß-галактозидазы практически совпадает со значениями для культуры JC158. В последующем скорость накопления фермента уменьшается и максимальные значения активности ß-галактозидазы в среде LB - 4300±500 ед., в среде М9 с глюкозой - 800+200 ед. При росте культуры JC158(pClK3) в среде М9 с ацетатом натрия активность ß-галактозидазы изменяется от 1000+100 до 2500±200 ед. Как показали рассевы клеток на чашки, эпигенотип lacfcl1 стабильно поддерживается клетками на всем протяжении роста культуры. В культуре JC158(pCIK3), предварительно индуцированной к эпигенотипу lacl'cf, активность ß-галактозидазы увеличивалась за время культивирования от 1 до 10±2 ед. на LB (рис. 2), до 6±1 ед. - на М9 с глюкозой (рис. 3) и до 170±30 ед. (рис. 4) - на среде М9 с ацетатом натрия.

время, часы

Рис. 2. Периодическая культура клеток КЛ58 и клеток ГС158(рС1КЗ), с эпигснотапом в среде ЬВ.

Кривые роста - тонкая линия, изменение активности Р-галактозидазы - жирная линия.

При рассеве первых шести проб клеток (0 часов - 5 часов эксперимента), культивировавшихся в среде ЬВ, появляются только белые колонии, при рассеве клеток пробы "6 часов" - 1% секторных колоний (состоящих из синих и

белых секторов), пробы "24 часа" - 30±5% белых, 35±5% синих и 35±5% секторных колоний.

8000 | 7000

Я 6000 • £

£ 5000

Л 4000 ё зоооН

о

| 2000 -а юоо -о

ЛС158 — ,1С158(рСЖЗ)--

' •21пО600 --1 0 -1 •• -2

-4

01234567 24

время, часы

Рнс. 3. Периодическая культура клеток .1С 158 и клеток ЛС158(рС1КЗ), с эпигенотипом 1ас1'сР в среде М9 с глюкозой.

Кривые роста - тонкая линия, изменение активности р-галактозидазы - жирная линия.

8000 т

§ 7000

1

| 6000 ■

| 5000-

Р 4000 • со.

$ 3000

0

§ 2000

1 1000

о

ГС158 — ЛС158(рС1КЗ) -

Т- 2 ЬРооо

и 1

-■ о -• -1 2 .- -3 -4

01234567 24

время, часы

Рис. 4. Периодическая культура клеток ЛС158 и клеток Ю158(рС1КЗ), с эпигенотипом

в среде М9 о ацетатом натрия. Кривые роста - тонкая линия, изменение активности р-галактозидазы - жирная линия.

При периодическом культивировании на среде М9 с глюкозой клетки проб "0 — 5 часов" также дают начало белым колониям в 100%, а при рассеве пробы "б часов" появляется 1% секторных колоний. Через 24 часа после начала эксперимента клетки периодической культуры образуют на чашках 95% белых и 5% синих и секторных колоний. В периодической культуре на среде М9 с ацетатом натрия уже через 2 часа после начала эксперимента появляются клетки, образующие на чашках синие (1%) и секторные колонии (5%). Через семь часов после начала эксперимента при посеве образуется 50±10% синих, 10±5% секторных и 40±10% белых колоний; через 24 часа - 70±10% синих, 5+2% секторных и 25±10% белых колоний.

Более низкие значения активности ß-галактозидазы в клетках штамма JC158(pCIK3) с эпигенотипом lacfcl1, вероятнее всего, объясняются наличием в клетках некоторого количества репрессора Lacl, причем, как следует из графиков изменения активности, при замедлении скорости роста культуры его содержание в клетке увеличивается. Однако, как показывают рассевы, содержание репрессора в клетке не достигает значений, достаточных для изменения эпигенотипа. Изменения активности в клетках JC158(pCIK3) с эпигенотипом lacl'cf при росте на средах LB и М9 с глюкозой, в общем, соответствуют накоплению ß-галактозидазы в клетках за счет активации транскрипции комплексом БАК-цАМФ. Поэтому можно предположить, что в жидкой культуре практически все клетки фенотипически однородны. С другой стороны, при рассеве на чашки проб 6ч и 24ч появляются секторные и синие колонии. Следовательно, к этому времени, несмотря на фенотипическую однородность, в части клеток периодической культуры изменилось соотношение молекул белков-репрессоров. Поскольку даже в клетках с эпигенотипом lacfcl' количество репрессора Lacl в процессе роста периодической культуры увеличивается, то в данном случае соотношение белков изменяется за счет увеличения концентрации репрессора CI. При периодическом культивировании клеток JC158(pClK3) на среде М9 с ацетатом натрия к стационарной фазе активность ß-гапактозидазы возрастает в 170 раз по сравнению с экспоненциальной фазой роста, что в 17 раз превышает

И

ожидаемое значение. Объяснить данные результаты можно только тем, что медленный рост в среде М9 с ацетатом натрия приводит к появлению клеток с альтернативным фенотипом в процессе роста культуры.

Рассев клеток на чашки позволяет непосредственно увидеть процессы, происходящие в бактериальной популяции. Очень интересны в этом отношении секторные колонии. Фенотипически различающиеся сектора соответствуют разным субпопуляциям в потомстве одной клетки (Олескин и др., 2000). В наших экспериментах сектора колоний образованы клетками с разными эпигенотипами: синие участки колоний - lacl°cl\ белые участки - lacllcf. Следовательно, к моменту посева на агаризованную среду в клетке установилось такое соотношение репрессоров, что в результате случайного распределения молекул и флуктуаций в концентрации белков при последующих делениях появились дочерние клетки, детерминированные к альтернативным эпигенотипам, т.е. клетка находилась в метастабильном состоянии (Tchuraev, 2006).

Наследование эпигенотинов клетками JC158(pCIK3/pLACI) в периодической культуре в отсутствие индуцирующих факторов

В экспериментах была использована циклическая моногенная система с отрицательной обратной связью (ЦМСН), состоящая из гена lacl, помещенного под промотор лактозного оперона дикого типа (Р|ас)> т.е. белок Lad негативно регулирует транскрипцию своего гена (рис. 1Б). По литературным данным известно, что ЦМС(_) образует авторегуляторную систему, предотвращающую сверхэкспрессию гена (Rosenfeld et al., 2002). В штамме JC158(pLACI) изменение скорости роста должно приводить к изменению скорости транскрипции как в лактозном опероне на хромосоме, так в ЦМСН на плазмиде. Однако авторегуляция синтеза Lacl в ЦМС(-), должна стабилизировать содержание репрессора в клетке. Для проведения последующих экспериментов в штамм JC158(pCIK) котрансформировали плазмиду pLACI. При этом в клетке образуется искусственная генетическая сеть, состоящая из циклической дигенной системы с отрицательной обратной связью и ЦМСЧ

Для клеток штаммов JC158(pLACI) и JC158(pCIK3/pLACI) был поставлен описанный выше эксперимент с использованием сред LB и М9 с глюкозой. Было показано, что в штамме JC158(pLACI) уровень активности ß-гапактозидазы в процессе роста периодической культуры на этих средах увеличивается в линейной фазе роста в 3 раза по сравнению с экспоненциальной и вновь опускается в стационарной фазе. Следовательно, в данном случае репрессор, негативно регулирующий собственный синтез, стабилизирует содержание в клетке продукта, регулируемого им гена, даже в присутствии активатора транскрипции. В культуре JC158(pClK3/pI.ACI), предварительно индуцированной к эпигенотипу lacfcl' активность ß-галактозидазы колеблется около 170 ед. на среде LB и около 140 ед.на среде М9 с глюкозой. В культуре, предварительно индуцированной к эпигенотипу lacl'cf активность ß-галактозидазы возрастает от 2 до 15±5 ед. на среде LB и от 10±1 до 30±5 ед., с последующим снижением в стационарной фазе до 10 ед., на среде М9 с глюкозой. При рассеве клеток периодической культуры, ранее индуцированных к эпигенотипу lacfcl' на всех фазах роста на чашках наряду с синими колониями образовывалось 10±5% белых. При рассеве клеток периодической культуры, ранее индуцированных к эпигенотипу lacl'cf на всех фазах роста, на чашках образовывалось 45±20% синих, столько же белых и 10±5% секторных колоний.

Таким образом, в культуре JC158(pCIK3)(pLACI) при периодическом культивировании на всех фазах роста присутствуют клетки, детерминированные к альтернативным фенотипам. Вероятнее всего, последнее связано с увеличением частоты спонтанных переключений между эпигенотипами.

Изменение эпигенетического состава популяции клеток JC158(pCIK3) под действием индуцирующих факторов

Можно предположить, что в результате флуктуации в концентрации регуляторных белков, клетки будут переключаться под действием индуцирующих факторов из одного стабильного эпигенотипа в другой не одновременно. И,

13

следовательно, при ограниченном времени воздействия индуцирующего фактора, популяция разделится на две субпопуляции.

Культуру подращивали 14-16 ч в условиях, необходимых для перевода клеток в эпигенотип 1асРс? или в эпигенотип 1ас1хсР. Далее часть культуры переводили в экспоненциальную фазу, пересевом в свежую среду при тех же условиях на 2 часа. Затем клетки с эпигенотипом ¡асРсР пересевались в среду без ИПТГ и росли при 42°С, а клетки с эпигенотипом /ас/1 сР пересевались в среду с ИПТГ и росли при 30°С. После пересева культуру поддерживали в экспоненциальной фазе. Клетки высевали на чашки из ночной культуры (чашка 0) и через 2, 4, 6 часов экспоненциального роста после пересева в свежую среду. На чашках колонии росли при 30°С без ИПТГ на протяжении 24 ч.

Были получены следующие результаты. При высеве на чашки клеток, находившихся в процессе переключения из 1асРс1х в 1ас1хсР, динамика изменения соотношения фенотипов колоний практически не зависела от фазы роста культуры, используемой для переключения (рис. 5).

30°С с ИПТГ Стационарная фаза

42°С без ИПТГ Экспоненциальный рост

30°СсИПТГ Экспоненциалу ный рост

42°С без ИПТГ Экспоненциальный рост

Б

Время (ч)

Рис. 5. Соотношение фенотипов колоний на чашке при переходе из эпигенотипа \acfct в эпигенотип 1ас1хсР.

Клетки Ю158 (рС1КЗ) были посеяны на чашки после указанного периода роста в жидкой культуре при 42°С без ИПТГ. Для переключения была использована культура в стационарной (А) или экспоненциальной фазе роста (Б), сз - синие, Еа - секторные, □ - белые колонии.

Через два часа экспоненциального роста при 42°С без ИПТГ при посеве на чашки клетки образуют белые и секторные колонии (секторных 30±10%, при использовании для переключения культуры \acfci' в стационарной фазе роста; 20±5% при использовании культуры в экспоненциальной фазе). Через четыре часа все колонии белые.

Динамика переключения клеток с эпигенотипом /ас/1 с/ в 1асРсР (рис. б) зависела от фазы роста культуры, используемой для переключения. Если клетки были инокулированы в свежую среду (30°С с ИПТГ) непосредственно из 16 часовой культуры (42°С без ИПТГ), то через два часа экспоненциального роста при посеве на чашке образуются синие (20±5%), секторные (40±10%) и белые (40+10%) колонии; через четыре часа - секторные (5+2%) и синие (95+2%); через 6 часов роста - все колонии синие.

42°С без ИПТГ Стационарная фаза 1—р^

30°СсИПТГ Экспоненциальный рост

Ч2°С без ИПТГ Экспоненциаль ный рост г~

30°С с ИПТГ Экспоненциальный рост

Время (ч)

Рис. 6. Соотношение фенотипов колоний на чашке при переходе из эпигенотипа 1ас1'с1° в эпигенотип

Клетки культуры 1С158 (рС1КЗ) были посеяны на чашки после указанного периода роста в жидкой культуре при 30°С с ИПТГ. Для переключения была использована культура в стационарной (А) или экспоненциальной фазе роста (Б), по - синие, ш1 - секторные, со - белые колонии.

Если клетки 16 часовой культуры (42°С без ИПТГ) разводили свежей средой и инкубировали 2 часа в тех же условиях (культура переходила в

экспоненциальную фазу роста), а затем пересевали в среду с ИПТГ и инкубировали при 30°С, то уже через два часа роста в измененных условиях 99,5100% клеток при высеве на чашки образуют синие колонии.

Формирование на чашках, засеянных клетками JC158(pCIK3), культивировавшимися в присутствии индуцирующих факторов, колоний с разными фенотипами подтвердило предположение, что при переключении под действием индукторов существует период эпигенетической гетерогенности популяции клеток, содержащих ЦЦСН. Появление секторных колоний при высеве культуры в процессе переключения свидетельствует о том, что клетки при смене эпигенотипа проходят через метастабильное состояние. Кроме того, было выявлено, что динамика изменения численности субпопуляций и влияние на нее фазы роста культуры, зависит от направления переключения эпигенотипа.

Для того, чтобы после устранения действия ИПТГ на клетки с первоначальным эпигенотипом lacllcf. ген с/ продолжал экспрессироваться, концентрация связанного с ИПТГ Lac-penpeccopa к этому моменту должна разбавиться в ряду клеточных делений до значений ниже пороговых. То, что на переключение всех клеток популяции из эпигенотипа 1ас1хсР в lacfcl1 требуется больше времени при использовании культуры в стационарной фазе роста, свидетельствует о более высоком содержании репрессора Lacl в части клеток, по сравнению с' экспоненциальной фазой роста. Наряду с этим, 20% клеток стационарной фазы переключаются так же, как клетки экспоненциальной фазы роста. Полученные нами результату свидетельствуют о том, что в клетках стационарной фазы содержание Lac-penpeccopa существенно варьирует от клетки к клетке, что в свою очередь приводит к различиям в скорости переключения динамического эпигена в разных, клетках. Исходя из этого можно отметить, что результаты данного эксперимента не только показали динамику изменения соотношения субпопуляций с разными эпигенотипами в процессе переключения, но и обнаружили, что ЦДС^ может использоваться для тестирования изменений клеточного метаболизма. То, что на изменение эпигенотипа lacfcl на lacl1 сf под действием температуры 42°С практически не влияет фаза роста культуры (рис. 5),

вероятно связано с механизмом данного переключения. Эпимутация в этом случае происходит в результате распада димеров температ-урочувствителыгого репрессора CI до мономеров и поэтому не зависит от концентрации белка CI в клетке. Таким образом, если время действия индуцирующего фактора недостаточно для полного переключения культуры, то популяция разделяется на две фенотипически различающихся субпопуляции, соответствующих эпигснотипам lacM и 1ас1хсР. Длительность периода эпигенетической гетерогенности популяции в процессе переключения из одного устойчивого эпигенотипа в другой, при воздействии индуцирующего фактора, определяется не только 9тохастичсскими процессами, но и характером индукюра.

Динамика перехода клеток, содержащих иДС*"' из метастабильного состояния в стабильные

Для перевода клеток в метастабильное состояние выращивали культуру в среде с ИП'ГГ при 42°С 14-16 ч. При этом в клетке синтезируется как репрессор CI, так и репрессор Lacl. Далее клетки экспоненциально росли в среде без ИПТГ при 30°С. Клетки высевали на чашки из 16 часовой культуры (чашка 0 ч) и затем каждые 2 часа после устранения индукторов (чашки 2ч, 4ч, 6ч). Были получены следующие результаты. Клетки 16 часовой культуры при посеве на чашки (Оч) дали начало секторным (15±5%) и белым (85+5%) колониям. Клетки, пересеянные в свежую среду без ИПТГ при 30°С, через два часа экспоненциального роста при посеве на чашки образовали 70±Ю% белых, 25±10% секторных и 5±2% синих колоний, через четыре часа 75±10% белых, 5+2% секторных и 20±10% синих, через 6 часов - 85±10% белых и 15±10% синих (рис. 7А). Этот же эксперимент был поставлен и в другом варианте. Культуру, с эпигенотипом lactct сначала переводили в экспоненциальную фазу роста, пересевая 16 часовую культуру в свежую среду и 2 часа подращивая в тех же условиях и, лишь затем, пересевали клетки в среду без ИПТГ при 30°С. Эксперимент продолжали, как описано выше. При посеве на чашки клеток культуры, экспоненциально растущей при 42°С в присутствии ИПТГ, образуются белые (70+10%), секторные (20±10%) и синие (10±5%) колонии. После пересева культуры в среду без индукгоров через 2 часа

17

роста при посеве на чашки 98±1% колоний синие, 1±0,5% белые, 1±0,5% секторные, через 4 часа и через 6 часов 99,5-100% колоний синие (рис. 7Б).

42°С с ИПТГ Стационарная фаза

30°С без ИПТГ Экспоненциальный рост

А

2

4

6

>

42°С с ИПТГ

30°С без ИПТГ Экспоненциальный рост

Б

Экспоненциаль г ный рост «=j=>

>

о

2

4

Время (ч)

Рнс. 7. Соотношение фенотипов колоний на чашке при переходе из неустойчивого эпигенотипа lacfcj\ через метастабильный эпигенотип lacficfi, в стабильные состояния.

Клетки JC158 (рСЛКЗ) были посеяны на чашки после указанного периода роста в жидкой культуре при 30°С без ИПТГ. Для переключения была использована культура в стационарной (А) или экспоненциальной фазе роста (Б), ил - синие колонии, га - секторные колонии, □ -белые колонии.

Эксперименты выявили влияние фазы роста культуры на соотношение субпопуляций фенотипически различающихся клеток после устранения индуцирующих факторов. Если культура в момент устранения индуцирующих факторов находилась в стационарной фазе роста, то на всех чашках при посеве присутствовали как белые, так и синие клетки (синие клетки на чашке ,0ч находятся в секторных колониях). Клетки, способные давать начало секторным колониям, исчезают из популяции лишь спустя б часов роста в жидкой среде в отсутствие индукторов, значит, все это время в популяции присутствуют клетки с неустойчивым эпигенотипом. Если культура в момент устранения индуцирующих факторов находилась в экспоненциальной фазе роста, то синие колонии появляются наряду с секторными и белыми уже на чашке 0ч. В результате

дальнейшего роста в жидкой среде без индукторов, до 100% клеток приобретает эпигенотип lac f clЭти данные показывают, что на соотношение субпопуляций после устранения действия индукторов влияет не только фаза роста культуры, но и последующие условия роста. Рост в жидкой среде после устранения воздействия температуры 42°С и ИПТГ на культуру, находящуюся в экспоненциальной фазе роста, приводит к тому, что через 4 часа клетки переходят в практически однородную популяцию с эпигенотипом lac f cf. А при высеве клегок, той же культуры на агаризованную среду без индукторов образуется две субпопуляции клеток: lacfcf lac fe Iх,

Зависимость соотношения фенотипов клеток от фазы роста культуры на момент устранения действия индукторов

Было исследовано, как время экспоненциального роста в присутствии ИПТГ при 42°С, после пересева клеток из 16 часовой культуры с теми же условиями, влияет на соотношение эпигенотипов клеток в популяции при последующем росте в жидкой культуре в отсутствие индуцирующих факторов, Клетки 16 часовой культуры (42°С, ИПТГ) отмывали и разводили свежей средой с ИПТГ. Далее культура росла экспоненциально 35, 70, 105 или 140 мин при температуре 42°С. Клетки каждого варианта переносили в среду без ИПТГ и 6 часов поддерживали экспоненциальный рост при 30°С. Через 6 часов клетки высевали на чашки (ИПТГ, 30°С). Результаты представлены на рис. 8. Эксперименты показали, что чем больше делений проходит после пересева клеток из 16 часовой культуры в свежую среду в присутствии двух индуцирующих факторов, тем больше клеток с эпигенотипом lacfcf окажется в популяции через 6 часов роста в жидкой среде после устранения индукторов.

При псрсссвс клеток стационарной фазы в свежую среду, метаболизм клетки активизируется и после непродолжительной лаг-фазы начинается экспоненциальный рост. При этом клетка претерпевает столь разнообразные изменения, что синхронность процессов в разных клетках невозможна и, в результате, концентрации белков существенно варьируют от клетки к клетке. Это приводит к различному соотношению регуляторных белков CI и LacI в каждой

отдельной клетке. Полученные нами результаты позволяют предположить, что эпигенетические системы (в частности ЦДСН) могут обеспечивать фенотипическое разнообразие в генетически однородной популяции, закрепляя флуктуации в количестве регуляторных белков, вызванные изменениями условий существования клетки.

42°С с ИПТГ стационарная фаза

42°С с ИПТГ Экспоненциальный рост

35

70

105

140

Время (мин)

30°С без ИПТГ Экспоненциальный рост

Рис. 8. Зависимость менаду соотношением белых и синих колоний ГС158 (рСПСЗ) и временем культивирования в свежей среде с ИПТГ при 42°С.

Клетки 16 часовой культуры (42 °С, ИПТГ) пересевали в свежую среду с ИПТГ и культивировали при 42 °С от 0 до 140 мин. Затем метки были пересеяны в свежую среду без ИПТГ (30°С) и спустя 6 часов посеяны на чашки. □ - синие колонии, ПЗ - белые колонии.

Заключение

В присутствии двух индуцирующих факторов (42°С и ИПТГ) циклическая дигенная система с отрицательными обратными связями (ЦДС^), состоящая из блоков PL lacl и Рцс с/, обеспечивает одновременный синтез репрессоров Lacl и CI. Устранение индуцирующих факторов приводит к появлению в культуре двух субпопуляций клеток с разным уровнем синтеза Р-галактозидазы, что свидетельствует о прохождении ЦДСН метастабильного состояния, из которого циклическая система может перейти в каждый из двух устойчивых эпигенотипов -1ас1хсР и !acfclx. Существование метастабильного состояния наглядно демонстрируется секторными колониями, являющимися результатом появления

20

дочерних клеток, детерминированных к разным фенотипам за счет флуктуаций количества регуляторных белков при делении клетки. Секторные колонии можно наблюдать не только при посеве культуры, подвергшейся одновременному воздействию двух индуцирующих факторов, но и при посеве культуры, индуцированной к переключению в альтернативный эпигенотип. Следовательно, клетка, содержащая ЦДС(_), в процессе переключения из одного эпигенотипа в другой проходит метастабильное состояние. Перевести клетки в метастабильное состояние можно и без воздействия специфических индуцирующих факторов -изменением скорости роста культуры, что также приводит к изменению соотношения белков-репрессоров, кодируемых ЦДС(-). В результате фенотипически однородные клетки при последующем пересеве в свежую среду образуют фенотипически различающиеся дочерние клетки.

Таким образом, во всех случаях возникновение гетерогенности популяции связано со стохастическими процессами, приводящими к несколько различающимся концентрациям белков-репрессоров в отдельных клетках, и с флуктуациями в распределении белков при делении клетки, находящейся в метастабильном состоянии. Соотношение численности субпопуляций клеток определяется условиями роста культуры в момент перехода из мстастабильного состояния в устойчивые эпигенотипы. Так, проведенные эксперименты показали, что при росте на агаризованной среде и при росте в жидкой культуре устанавливается разное соотношение субпопуляций, кроме того, соотношение зависит от фазы роста культуры в момент устранения индукторов.

Введение в клетку, содержащую ЦДСН, циклической моногенной системы с отрицательной обратной связью приводит к изменению как базального, так и максимального уровня репрессоров Lacl и CI в клетке, что поддерживает фенотипическую гетерогенность, увеличивая частоту спонтанных переключений.

Выводы

1. Расщепление популяции клеток E.coli, содержащих циклическую дигенную систему с отрицательными обратными связями (ЦДСН), на две фенотипически различающихся субпопуляции индуцируете^ одновременным воздействием двух специфических индуцирующих факторов или непродолжительным воздействием одного, а также изменением скорости роста культуры.

2. Возникновение двух субпопуляций в потомстве одной клетки E.coli, содержащей ЦДСН, является результатом перехода циклической системы в метастабильное состояние в присутствии двух репрессоров.

3. На соотношение субпопуляций влияют фаза роста культуры Ecoli в момент перехода клеток в метастабильное состояние и последующие условия роста.

4. Так как две субпопуляции появляются в отсутствии внешнего воздействия, то этот процесс является экспериментальной моделью одного из возможных молекулярных механизмов детерминации клеток к самодифференцировке.

5. Введение в клетку E.coli, содержащую циклическую дигенную систему, циклической моногенной системы, обеспечивающей стабильный уровень одного из белков-репрессоров, изменяет соотношение репрессоров, во всех эпигенотипах и поддерживает фенотипическую гетерогенность культуры.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ступак И.В., Ступак Е.Э., Чураев Р.Н. Анализ функциональных состояний векторной эпигенной конструкции. // Материалы 3 съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. - Москва, 2004. - С. 411.

2. Ступак Е.Э., Ступак И.В. Влияние особенностей синтеза реирессора на уровень экспрессии контролируемого им гена в периодической культуре Е. coli И Биология - наука XXI века. 9 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Сб. тезисов. - Пущино, 2005. - С. 55.

3. Ступак Е.Э., Ступак И.В. Искусственные генетические триггеры // Материалы международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология». Т.1. - Минск, 2005. - С. 114.

4. Чураев Р.Н., Ступак Е.Э., Ступак И.В., Галимзянов А.В. Новое свойство эпигенов: метастабильные эпигенотипы // ДАН.-2006.-Т. 406, № 4.-С. 570-573.

5. Stupak Е.Е., Stupak I.V. Inheritance and state switching of genetic toggle switch in different culture growth phases // FEMS Microbiol Lett.- 2006 - V. 258.- P. 37-42.

6. Ступак Е.Э., Ступак И.В. Управление соотношением численности субпопуляций клеток E.coii, содержащих циклическую дигенную систему // Биология - наука XXI века. 10 Пущинская школа-конференция молодых ученых. Сб. тезисов. - Пущино, 2006.

Отпечатано с готовых диапозитивов в ООО «Принт+», заказ № 83 , тираж 100 шт, 450054, пр. Октября, 71

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ступак, Евгения Эдуардовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

Обзор литературы)

1.1 Эпигенетическая изменчивость прокариот

1 2. Эпигенетические механизмы клеточной дифференцировки эукариот.19 1.3. Наследование функциональных состояний генных сетей.

1.3.1 Эпигенные системы.

1 3 2. Стохастические флуктуации содержания белков в клетке

1 3 3 Искусственные циклические системы

ГЛАВА 2 ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2 1. Объект исследования

2 2 Среда культивирования и условия роста

2 3 Выявление клеток, синтезирующих Р-галактозидазу

2 4 Определение активности Р-галактозидазы

2 5 Выделение и очистка плазмидной ДНК.

2 6 Трансформация клеток Е. coli

210 Статистический анализ

2 11 Штаммы Е coll и плазмиды.

2 13 Реактивы

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Наследование эпигенотипов клетками JC158(pCIK3) в периодической культуре в отсутствие индуцирующих факторов

3.2. Наследование эпигенотипов клетками JC158(pClK3/pLacI) в периодической культуре в отсутствие индуцирующих факторов

3 3 Изменение эпигенетического состава популяции клеток

JC158(pClK3) под действием индуцирующих факторов . .67 3 4 Динамика перехода клеток, содержащих ЦДС(") из метастабильного состояния в стабильные.

3.5 Зависимость соотношения фенотипов клеток от фазы роста культуры на момент устранения действия индукторов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Индукция эпигенетической гетерогенности в популяции клеток , содержащих искусственные циклические системы генов"

Актуальность проблемы

Паттерн экспрессии генов определяет фенотип клетки Наследуемые изменения уровней экспрессии генов в клетках лежит в основе таких процессов как выбор между литическим и лизогенным путями развития у умеренных бактериофагов (Johnson et al, 1981), фазовые вариации у прокариот (van der Woude, Baumler, 2004, van der Woude, 2006), клеточная дифференцировка эукариот (Latham, 1999, Kepes, 2005) Исследование механизмов возникновения дифференциальной активности генов в индивидуальных клетках клональной популяции - одно из наиболее актуальных направлений современной биологии В большинстве случаев наследуемые в клеточных поколениях, но обратимые изменения генной активности являются результатом взаимосвязанных генетических (транспозиции, инверсии) и эпигенетических факторов (структура хроматина, модификации ДНК и ДНК-ассоциированных белков, переключение уровня синтеза транскрипционных факторов в циклических системах генов). Причем обратимые перестройки последовательности ДНК контролируются регуляторными белками (van der Woude, Baumler, 2004)

Как было показано в ряде работ (Gardner et al., 2000, Tchuraev et al, 2000, Kobayashi et al, 2004) циклические дигенные системы с отрицательными обратными связями (ЦДС()) могут поддерживать два альтернативных уровня экспрессии генов и, соответственно, два фенотипа клетки. В этом случае ЦДС() является динамическим эпигеном, в котором часть наследственной информации хранится, кодируется и передается потомству вне первичной структуры молекул ДНК генома (Чураев, 1975)

Использование при конструировании хорошо охарактеризованных генетических элементов, простая структура и наличие обратных связей, стабилизирующих систему, делают искусственные ЦДС() удобным объектом для изучения основных закономерностей возникновения фенотипической гетерогенности в популяции генетически однородных клеток.

Цель и задачи исследования

Цель работы - исследовать возможность индукции наследуемой эпигенетической гетерогенности в клональной популяции клеток Escherichia coli, содержащих искусственные циклические системы генов

Задачи исследования.

1 Исследовать стабильность наследования каждого из альтернативных фенотипов клеток, содержащих циклические дигенные системы с отрицательными обратными связями в процессе роста периодической культуры

2 Исследовать фенотипический состав популяции клеток, содержащих ЦДС() и циклическую моногенную систему с отрицательной обратной связью в процессе роста периодической культуры

3 Проверить возможность расщепления клональной популяции клеток Е coli, содержащих ЦДС(), на две фенотипически различающихся субпопуляции в отсутствие специфических индуцирующих факторов

4. Поставить эксперимент по одновременному воздействию двух индуцирующих факторов на клетки, содержащие ЦДС(), для проверки гипотезы о существовании метастабильного состояния

5. Исследовать влияние метаболизма клетки в момент воздействия индукторов на соотношение альтернативных субпопуляций клеток в дальнейшем

Научная новизна исследования

Обнаружена возможность переключения функциональных состояний ЦДС() изменением скорости роста культуры.

Впервые установлено, что клетка, содержащая динамический эпиген, может при делении образовать дочерние клетки, детерминированные к альтернативному фенотипу

Экспериментально показано новое свойство динамического эпигена возможность перехода в метастабильное состояние под воздействием внешних факторов

Впервые получена экспериментальная модель одного из молекулярных механизмов детерминации клеток к самодифференцировке.

Научно-практическая значимость работы

Исследование эпигенетических механизмов возникновения фенотипической гетерогенности в изначально гомогенной популяции создает основу для разработки систем управления клеточными процессами В биотехнологии управление структурой популяции, т.е. поддержание необходимых фенотипических разновидностей клеток в необходимых пропорциях, позволит контролировать скорость процесса и варьировать на разных этапах соотношение синтезируемых продуктов

Поскольку многие мупьтифакторные признаки с изменчивой пенетрантностью (частотой проявления признака), возможно, имеют эпигенетическую основу, понимание причин разного уровня экспрессии генов в генетически однородных клетках необходимо для достоверной интерпретации результатов генетического анализа

Апробация работы

Результаты исследования были представлены на III съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2004), международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, 2005), 9 и 10 Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005, 2006)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объём диссертации

Работа изложена на 110 страницах машинописного текста Состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы Список литературы включает 200 источников. Диссертация иллюстрирована 2 схемами, 14 графиками и 28 фотографиями.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Ступак, Евгения Эдуардовна

ВЫВОДЫ

1. Расщепление популяции клеток Е coli, содержащих циклическую дигенную систему с отрицательными обратными связями (ЦДС^), на две фенотипически различающихся субпопуляции индуцируется одновременным воздействием двух специфических индуцирующих факторов или непродолжительным воздействием одного, а также изменением скорости роста культуры

2 Возникновение двух субпопуляций в потомстве одной клетки Е coli, содержащей ЦДС("), является результатом перехода циклической системы в метастабильное состояние в присутствии двух репрессоров.

3. На соотношение субпопуляций влияют фаза роста культуры E.coli в момент перехода клеток в метастабильное состояние и последующие условия роста.

4. Так как две субпопуляции появляются в отсутствии внешнего воздействия, то этот процесс является экспериментальной моделью одного из возможных молекулярных механизмов детерминации клеток к самодифференцировке

5. Введение в клетку E.coli, содержащую циклическую дигенную систему, циклической моногенной системы, обеспечивающей стабильный уровень одного из белков-репрессоров, изменяет соотношение репрессоров, во всех эпигенотипах и поддерживает фенотипическую гетерогенность культуры.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В присутствии двух индуцирующих факторов (42°С и ИПТГ) циклическая дигенная система с отрицательными обратными связями (ЦДС()), состоящая из блоков Pl lacl и Ptrc cl, обеспечивает одновременный синтез репрессоров Lacl и CI. Устранение индуцирующих факторов приводит к появлению в культуре двух субпопуляций клеток с разным уровнем синтеза Р-галактозидазы, что свидетельствует о прохождении ЦДС^ метастабильного состояния, из которого циклическая система может перейти в каждый из двух устойчивых эпигенотипов - lacl1 сf и lacfcl]. Существование метастабильного состояния наглядно демонстрируется секторными колониями, являющимися результатом появления дочерних клеток, детерминированных к разным фенотипам за счет флуктуаций количества регуляторных белков при делении клетки Секторные колонии можно наблюдать не только при посеве культуры, подвергшейся одновременному воздействию двух индуцирующих факторов, но и при посеве культуры, индуцированной к переключению в альтернативный эпигенотип. Следовательно, клетка, содержащая ЦДС^, в процессе переключения из одного эпигенотипа в другой проходит метастабильное состояние. Перевести клетки в метастабильное состояние можно и без воздействия специфических индуцирующих факторов - изменением скорости роста культуры, что также приводит к изменению соотношения белков-репрессоров, кодируемых ЦДСН. В результате фенотипически однородные клетки при последующем пересеве в свежую среду образуют фенотипически различающиеся дочерние клетки.

Таким образом, во всех случаях возникновение гетерогенности популяции связано со стохастическими процессами, приводящими к несколько различающимся концентрациям белков-репрессоров в отдельных клетках, и с флуктуациями в распределении белков при делении клетки, находящейся в метастабильном состоянии. Соотношение численности субпопуляций клеток определяется условиями роста культуры в момент перехода из метастабильного состояния в устойчивые эпигенотипы. Так, проведенные эксперименты показали, что при росте на агаризованной среде и при росте в жидкой культуре устанавливается разное соотношение субпопуляций, кроме того, соотношение зависит от фазы роста культуры в момент устранения индукторов

Введение в клетку, содержащую ЦДС(), циклической моногенной системы с отрицательной обратной связью приводит к изменению как базального, так и максимального уровня репрессоров LacI и CI в клетке, что поддерживает фенотипическую гетерогенность, увеличивая частоту спонтанных переключений.

91

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ступак, Евгения Эдуардовна, Уфа

1. Antequera F., Bird A Number of CpG islands and genes in human and mouse //Proc Natl. Acad. Sci. USA 1993.-V. 90 -P 11995-11999

2. Ashapkin V V , Antoniv T T , Vanyushin В F Methylation-dependent binding of wheat nuclear proteins to the promoter region of nbosomal RNA genes //Gene.- 1995 -V. 157 -P 273-277.

3. Atkinson M. R , Savageau M A , Myers J. T , Ninfa A J Development of genetic circuitry exhibiting toggle switch or oscillatory behavior in Escherichia coli II Cell. 2003. - V 113 - P. 597-607.

4. Attwood J.T, Yung R.L., Richardson В С. DNA methylation and the regulation of gene transcription // Cell. Mol. Life Sci. 2002 - V. 59. - P. 241257.

5. Aufsatz W, Mette MF., van der Winden et al RNA-directed DNA methylation in Arabidopsis // Proc Natl Acad Sci. USA 2002. - V. 99 - P. 16499-16506.

6. Azam A.T, Iwata A., Nishimura A et al Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid // J. Bacteriol -1999 -V. 181 -P. 6361-6370

7. Babu M.M, Teichmann S A Evolution of transcription factors and the gene regulatory network in Escherichia coli II Nucleic Acids Research 2003. -V. 31,№4. - P. 1234-1244.

8. Barras F., Marinus M G. The great GATC. DNA methylation in E. coli II TrendsGenet 1989 -V 5. - P. 139-143.

9. Bateman E. Autoregulation of eukaryotic transcription factors // Prog Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1998. - V. 60. - P. 133-168.

10. Baylin S.B., Herman J G., Graff JR. et al Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia // Adv Cancer Res. 1998. - V 72 - P. 141-196.

11. Becskei A, Seraphin В , Serrano L. Postttve feedback in eukaryotic gene networks' cell differentiation by graded to binary response conversion // EMBO J. 2001.-V. 20 -P 2528-2535

12. Becskei A, Serrano L Engineering stability in gene networks by autoregulation //Nature. 2000 - V. 405 - P. 590-593

13. Blake W. J , Kaern M , Cantor С R , Collins J. J Noise in eukaryotic gene expression // Nature. 2003. - V. 422. - P. 633-637.

14. Blomfield I.C The regulation of pap and type 1 fimbnation in Escherichia coliII Adv Microb. Physiol -2001.-V 45 -P. 1-49.

15. Bomfer C. Developmental regulation of eukaryotic gene locr which cis-regulatory information is required? // Trends Genet. 2000. - V 16. - P 310-315

16. Bonifield HR, Hughes K.T. Flagellar phase variation in Salmonella enterica is mediated by a posttranscriptional control mechanism // J Bacterid. -2003 -V. 185 P. 3567-3574

17. Boyes J , Bird A. Repression of genes by DNA methylation depends on CpG density and promoter strength' evidence for involvement of a methyl-CpG binding protein//EMBO J.- 1992.-V. 11.-P 327-333.

18. Braaten B.A., Nou X., Kaltenbach L.S , Low D.A. Methylation patterns in pap regulatory DNA control pyelonephritis-associated pili phase variation in E. coli II Cell 1994. - V 76. - P. 577-588.

19. Cerdeno-Tarraga A.M, Patrick S., Crossman L C. et al. Extensive DNA inversions in the B.fragilis genome control variable gene expression // Science -2005.-V. 307.-P. 1463-1465.

20. Chen L., Wang R., Kobayashi T.J, Aihara К Dynamics of gene regulatory networks with cell division cycle // Physical Review E 2004. - V. 70: 011909.

21. Chubb J.R., Boyle S., Perry P., Bickinore W A Chromatin motion is constrained by association with nuclear compartments in human cell // Curr. Biol 2002 V 12. P 439-445

22. Clark S J, Harrison J., Molloy P.L Spl binding is inhibited by mCpmCpG methylation // Gene 1997 -V 195. - P. 67-71.

23. Cockell M., Gasser S M Nuclear compartments and gene regulation // Curr. Opin Genet Develop. 1999 - V. 9. - P. 199-205

24. Danese P.N, Pratt L.A., Dove S., Kolter R„ The outer-membrane protein, Ag43, mediates cell-to-cell interactions within E coli biofilms // Mol Microbiol. 2000. - V 37. - P. 424-432

25. Dobrin R, Beg Q.K., Barabasi A.-L, Oltvai Z N Aggregation of topological motifs in the Escherichia coli transcriptional regulatory network // BMC Bioinformatics. 2004. - V. 5.10.

26. Doerfler W DNA methylation and gene activity // .Ann. Rev Biochem 1983. - V. 52.-P. 93-124

27. Doerfler W., Hohlweg U., Muller K. et al. Foreign DNA integration-perturbations of the genome-oncogenesis // Ann New York Acad Sci. 2001 V. 945. - P. 276-288.

28. Dybvig K., Sitaraman R, French С Т. A family of phase-variable restriction enzymes with differing specificities generated by high-frequency gene rearrangements // Proc. Natl. Acad Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 13923-13928.

29. Ehrlich M. DNA methylation in cancer, too much, but also too little // Oncogene. -2002. V 21. - P. 5400-5413

30. Elowitz M.B., Leibler S A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. // Nature 2000. - V. 403. - P. 335-338.

31. Elowitz M.B., Levine A J., Siggia E.D., Swain P S. Stochastic gene expression in a single cell//Science 2002 -V 297 - P. 1183-1186.

32. Enos-Berlage J L , McCarter L L . Relation of capsular polysaccharide production and colonial cell organization to colony morphology in Vibrio parahemolyticus II J. Bacterid -2000 -V. 182 -P. 5513-5520

33. Feinberg A.P, Gehrke С W., Kuo K.C , Ehrlich M. Reduced genomic 5-methylcytosine content in human colonic neoplasia // Cancer Res. 1988. - V 48 -P. 1159-1161.

34. Finkel S.E., Kolter R. DNA as a nutrient: novel role for bacterial competence genehomologs// J. Bacterid -2001.-V 183.-P. 6288-6293

35. Fraser H В, Hirsh A E, Giaever G et al, Noise minimization in eukaryotic gene expression // PLoS Biology. 2004 - V. 2 - P 834-838

36. Freeman M. Feedback control of intercellular control signaling in development //Nature 2000. - V. 408. - P.313-319.

37. Gaily D.L., Leathart J., Blomfield I.C. Interaction of FimB and FimE with the fim switch that controls the phase variation of type 1 fimbriae in Escherichia coli K-12 // Mol Microbiol 1996. - V. 21. - P 725-738

38. Gaily D.L., Rucker T.J, Blomfield IС The Ieucine-responsive regulatory protein binds to the fim switch to control phase variation of type 1 fimbrial expression in Escherichia coli K-12 // J. Bacterid. 1994 - V 176. - P. 5665-5672.

39. Garcia-Ojalvo J., Elowitz M.B, Strogatz S.H. Modeling a synthetic multicellular clock: Repressilators coupled by quorum sensing // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2004. - V. 101, № 30. - P. 10955-10960

40. Gardner T.S , Cantor C.R, Collins J.J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli II Nature. 2000. - V. 403. - P 339-342

41. Garrick D., Fiering S., Martin D.I K., Whitelaw E. Repeat-induced gene silencing in mammals // Nat Genet. 1998. - V. 18. - P. 56-59.

42. Gasser S.M. Visualizing chromatin dynamics in interphase nuclei // Science -2002.-V 296 -P. 1412-1416.

43. Gonze D., Halloy J , Goldbeter A Robustness of circadian rhythms with respect to molecular noise // Proc Natl Acad Sci. USA 2002 - V 99 - P. 673-678.

44. Gribnau J., Hochedlinger К, Hata К et al Asynchronous replication timing of imprinted loci is independent of DNA methylation, but consistent with differential subnuclear localization // Genes Dev. 2003 - V 17 - P. 759-773.

45. Grunstein M. Yeast heterochromatin: regulation of its assembly and inheritance by histones // Cell. 1998. - V. 93. - P. 325-328

46. Gurdon J.B. Genetic reprogramming following nuclear transplantation in Amphibia//Semin CellDev Biol 1999 -V 10.-P 239-243

47. Guss К A., Nelson С E , Hudson A et al Control of a genetic regulatory network by a selector gene // Science 2001 - V. 292. - P. 1164-1167.

48. Haagmans W, van der Woude M. Phase variation of Ag43 in Escherichia coli: Dam-dependent methylation abrogates OxyR binding and OxyR-mediated repression of transcription // Mol Microbiol. 2000. - V. 35 - P 877887.

49. Harshey R.M Bees aren't the only ones: swarming in Gram-negative bacteria // Mol. Microbiol 1994. - V.16. - P 389-394

50. Hartwell L H, Hopfield J J., Leibler S , Murray A.W. From molecular to modular cell biology // Nature. 1999. - V.402 - P 47-51.

51. Hendrich В., Bird A. Identification and characterization of a family of mammalian methyl-CpG binding proteins // Mol. Cell Biol 1998 - V. 18. - P. 6538-6547

52. Hernday A, Krabbe M., Braaten В., Low D. Self-perpetuating epigenetic pili switches in bacteria // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002. - V. 99. - 16470-16476

53. Holmes S.G, Braunstein M, Broad J. Transcriptionalsilencing of the yeast inating-type genes // Epigeneticmechanism of gene regulation / Eds Russo V.E A., Martienssen R A , Riggs A G. N. Y.: Cold Spring Harbor Lab Press, 1996. -P. 467-487.

54. Hood D W., Deadman M E , Jennings M P et al. DNA repeats identify novel virulence genes in Haemophilus influenzae II Proc Natl. Acad Sci. USA -1996.-V. 93.-P. 11121-11125.

55. Isaacs F J., Hasty J., Cantor С R Collins J.J. Prediction and measurement of an autoregulatory genetic module // Proc Natl. Acad Sci USA -2003.-V. 100.-P. 7714-7719.

56. Jablonka E, Lachmann M, Lamb M J. Evidence, Mechanisms and Models forthe Inheritance of Acquired Characters // Journal of Theoretical Biology 1992 -V 158.-P. 245-268.

57. Jenuwein Т., AIlis C.D. Translating the histone code// Science. 2001 -V. 293.-P. 1074-1180.

58. Johnson A. D, Poteete A R, Lauer G et al X Repressor and cro— components of an efficient molecular switch // Nature 1981. - V 294 - P 217-223.

59. Jones G.W., Clewell D.B., Charles L.G, Vickerman MM Multiple phase variation in haemolytic, adhesive and antigenic properties of Streptococcus gordonuII Microbiology. 1996. - V. 142. -P. 181-189.

60. Kawasaki H., Taira K. Induction of DNA methylation and gene silencing by short interfering RNAs in human cells // Nature 2004. - V. 431. - P 211-217

61. Kepes F. Epigenetics as an aspect of post-genomics // Med Sci (Paris). -2005.- V. 4.-P. 371-376.

62. Kikyo N, Wolffe A P. Reprogramming nuclei: insights from cloning, nuclear transfer and heterokaryons // J Cell Sci 2000. - V. 113 - P 11 -20.

63. Kleinjan D-J., Heyningen V. Position effect in human genetic disease // Hum. Mol Genet.- 1998.-V. 7 -P 1611-1618.

64. Kobayashi H., Kaern M., Araki M et al. Programmable cells: Interfacing natural and engineered gene networks // Proc. Natl. Acad. Sci U S A 2004. - V 101.-P. 8414-8419.

65. Kolpakov F A., Ananko E.A.,Kolesov G.B., Kolchanov N.A GeneNet a database for gene networks and its automated visualization // Bioinformatics -1998.-V. 14.-P. 529-537

66. Kuo J-T., Chang Y-J., Tseng C-P. Growth rate regulation of lac operon expression in Escherichia coli is cyclic AMP dependent // FEBS Letters. 2003 -V. 553 -P. 397-402

67. Lachner M., O'Carroll D., Rea S et al Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins // Nature 2001. - V 410. - P. 116-120.

68. Latham KE, Mechanisms and control of embryonic genome activation in mammalian embryos // Int. Rev. Cytol. 1999 - V. 193. - P 71-124

69. Lee Т. I., Rinaldi N. J., Robert F et al. Transcriptional regulatory networks in Saccharomyces cerevisiae // Science. 2002. - V. 298. - P. 799-804.

70. Lindroth A.M., Shultis D., Jasencakova Z. et al Dual histone H3 methylation marks at lysines 9 and 27 required for interaction with chromomethylase 3 // EMBO J. 2004 - V. 23. - P 4286-4296.

71. Little J., Shepley D. P., Wert D.W. Robustness of a gene regulatory circuit//EMBO J 1999.-V. 18 -P. 4299-4307

72. Low D.A., Weyand NJ., Mahan M.J. Roles of DNA Adenine methylation in regulating bacterial gene expression and virulence // Infect. Immun. -2001. V. 69.-P. 7197-7204.

73. Lutz R., Bujard H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/II-I2 regulatory elements//NucI Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 1203-1210.

74. Lyko F., Paro R Chromosomal elements conferring epigenetic inheritance // BioEssays. 1999. - V 21. - P 824-832.

75. Mahan J., Low D.A. DNA methylation regulates bacterial gene expression and virulence// ASM News. 2001. - V. 67 - P. 356-361.

76. McAdams H H., Arkin A. Stochastic mechanisms in gene expression // Proc Natl Acad Sci. USA. 1997 - V. 94. - P. 814-819.

77. McLandsborough L. A, Cleary PP Insertional inactivation of virR in Streptococcus pyogenes M49 demonstrates that VirR functions as a positive regulator of ScpA, FcRA, OF, and M protein // FEMS Microbiol Lett 1995 -V. 128 -P. 45-51.

78. McMillen D, Kopell N., Hasty J., Collins J J. Synchronizing genetic relaxation oscillators by intercell signaling // Proc Natl Acad. Sci USA. -2002 -V. 99. P. 679-684.

79. Meyerowitz E M. Plants compared to animals' the broadest comparative study of development // Science. 2002. - V. 295. - P. 1482-1485

80. Misteli T. Proteins dynamics: implication for nuclear architecture and gene expression // Science. 2001. - V. 291. - P. 843-847

81. Miyashita N, Shiga К, Tonai M et al Remarkable differences in telomere lengths among cloned cattle derived from different cell types // Biol. Reprod -2002 -V.66 P. 1649-1655.

82. Moxon E. R, Gewurz B.E., Richards J.C et al. Phenotypic switching of Haemophilus influenzae II Mol. Microbiol. 1996. - V. 19. - P. 1149-1150.

83. Munnes M., Schetter C., Holker I., Doerfler W. A fully 5'-CG-3' but not a 5-CCGG-3' methylated late frog virus 3 promoter retains activity // J. Virol -1995 -V. 69.-P. 2240-2247.

84. Murphy D.B., Pembroke J.T. Transfer of the IncJ plasmid R391 to recombination deficient Escherichia coli K12: evidence that R391 behaves as a conjugal transposon //FEMS Microbiol. Lett. 1995 - V. 134. - P. 153-158.

85. Nasser W., Schneider R., Travers. A, Muskhelishvili G. CRP modulates fis transcription by alternate formation of activating and repressing nucleoprotein complexes//J. Biol. Chem.-2001 -V.276.-P. 17878-17886.

86. Nou X., Braaten В., Kaltenbach L., Low D.A. Differential binding of Lrp to two sets of pap DNA binding sites mediated by Pap I regulates Pap phase variation in Escherichia coli И EMBO J. 1995 - V 14 - P. 5785-5797

87. Novick KL., Nimmrich L., Gene B. et al Epigenomics: genome-wide study of methylation phenomena // Curr. Issues Mol. Biol. 2002. - V. 4. - P. 111-128.

88. Ogura A., Inoue К, Ogonuki N. et al Production of male cloned mice from fresh, cultured, and cryopreserved nnma-ture Sertoli cells // Biol Reprod. -2000. -V. 62. P. 1579-1584.

89. Okano M., Xie S., Li E. Cloning and characterization of a family of novel mammalian DNA (cytosine-5) methyltransferases // Nat. Genet. 1998. - V 19 -P 219-220

90. Olsen P. В., Schembri M A., Gaily D.L, Klemm P. Differential temperature modulation by H-NS of the fimB and fimE recombinase genes which control the orientation of the type 1 fimbrial phase switch // FEMS Microbiol Lett 1998.-V. 162.-P. 17-23

91. Owen P., Meehan M., de Loughry-Doherty H., Henderson I. Phase-variable outer membrane proteins in Escherichia coli 11 FEMS Immunol. Med. Microbiol.- 1996.-V 16 P. 63-76

92. Parada LA., Misteli T. Chromosome positioning in the interphase nucleus // Trends in Cell Biol. 2002. - V. 12. - P. 425-432.

93. Park S F., Purdy D , Leach S Localized reversible frameshift mutation in the JlhA gene confers phase variability to flagellin gene expression in Campylobacter coli II J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 207-210.

94. Pastan I., Adhya S. Cyclic adenosine 5'-monophosphate in Escherichia coli II Bacteriological Reviews. 1976. - V. 40. - P. 527-551

95. Pedraza J M, Oudenaarden A Noise propagation in gene networks // Science. 2005. - V. 307. - P 1965-1969.

96. Perbal В V A practical guide to molecular cloning NY A Wiley -Interscience publication, 1988. - 811 p.

97. Petronis A Human morbid genetics revisited relevance of epigenetics //Trends Genet.-2001.-V. 17.-P. 142-146.

98. Plath K, Mlynarczyk-Evans S, Nusinow DA, Panning В XIST RNA and the mechanism of X chromosome inactivation // Annu. Rev Genet -2002.-V. 36.-P. 233-278

99. Pradhan S., Bacolla A., Wells R D., Roberts R J. Recombinant human DNA (cytosine-5) methyltransferase. I. Expression, purification, and comparison of de novo and maintenance methylation // J. Biol Chem 1999 - V 274. - P 33002-33010.

100. Prasadarao N.V., Lysenko E, Wass С A et al Opacity-associated protein A contributes to the binding of Haemophilus influenzae to chang epithelial cells//Infect Immun 1999. -V.67 -P. 4153-4160.

101. Ptashne M, Jeffrey A., Johnso A. D et al. How the A repressor and cro work // Cell. 1980. - V. 19. - P. 1 -11.

102. Rauprich O., Matsushita M., Weijer С J. et al. Periodic phenomena in Proteus mirabihs swarm colony development // J. Bacteriol 1996. - V 178 -P.6525-6538.

103. Razin A, Shemer R. DNA methylation in early development // Hum. Mol. Genetics 1995. - V. 4. - P. 1751-1755

104. Restrepo, В I., Carter CJ, Barbour A.G. Activation of a vmp pseudogene in Borreha hermsu. an alternate mechanism of antigenic variation during relapsing fever// Mol. Microbiol. 1994. - V 13. - P 287-299

105. Rideout W.M , Eggan W., Jaemsch R. Nuclear cloning and epigenetic reprogrammmg of the genome//Science -2001 -V 293 -P 1093-1098

106. Ring, A., J N. Weiser, and E I. Tuomanen Pneumococcal trafficking across the blood-brain barrier Molecular analysis of a novel bidirectional pathway //J.Clin Investig 1998. -V 102.-P 347-360.

107. Robertson К D., Jones PA. DNA methylation: past, present and future directions // Carcinogenesis 2000. - V 21. - P. 461-467.

108. Robison К, McGuire A.M., Church G.M. A comprehensive library of DNA-binding site matrices for 55 proteins applied to the complete Escherichia coli K-12 genome//J. Mol. Biol.- 1998.-V. 284 -P 241-254.

109. Rosenfeld N, Elowitz M.B., Alon U J. Negative autoregulation speeds the response times of transcription networks // J Mol. Biol. 2002 - V. 323. - P. 785-793

110. Rosenfeld N , Young J. W, Alon U, Swain P S , Elowitz M В Gene regulation at the single-cell level//Science -2005 -V 307. P. 1962-1965.

111. Rozanov D V., D'Ari R , Sineoky S.P., RecA-independent pathways of lambdoid prophage induction in Escherichia coli И J. Bacteriol 1998. - V. 180 -P. 6306-6315

112. Schembn M.A., Hjernld L., Gjermansen M, Klemm P. Differential expression of the Escherichia coli autoaggregation factor antigen 43 // J Bacteriol. -2003,- V. 185.-P. 2236-2242.

113. Scott T.N., Simon M.I. Genetic analysis of the mechanism of the Salmonella phase variation site specific recombination system // Mol Gen. Genet 1982.- V. 188.-P. 313-321.

114. Selker E.U. Gene silencing: repeats that count // Cell 1999. - V. 97. -P. 157-160.

115. Serkin C.D, Seifert H.S Iron availability regulates DNA recombination in Neisseria gonorrhoeae // Mol Microbiol. 2000 - V 37 - P 1075-1086.

116. Shapiro J A Pattern and control in bacterial colonies // Sci Progr -1994.-V.76.-P 399-424

117. Shapiro J A The significances of bacterial colony patterns // BioEssays 1995. - V. 17. - P. 597-607

118. Shea M.A., Ackers GK. The Or control system of bacteriophage lambda: A physical-chemical model for gene regulation// J Mol Biol 1985. -V. 181. -P. 211-230.

119. Shen-Orr S S., Milo R , Mangan S., Alon, U Network motifs in the transcriptional regulation network of Escherichia coli 11 Nat Genet 2002 - V 31. - P.64-68.

120. Shi W., Zakhartchenko V., Wolf E Epigenetic reprogramming in mammalian nuclear transfer// Differentiation. 2003. - V. 71 - P. 91-113

121. Silva A. J, Ward К , White R. Mosaic methylation in clonal tissue // Dev. Biol. 1993. - V. 156. - P. 391-398

122. Silverman M, Zieg J, Hilmen M, Simon M Phase variation in Salmonella: genetic analysis of a recombinational switch // Proc Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V. 76. - P. 391-395.

123. Soppe W.J J., Jasencakova Z., Houben A et al. DNA methylation controls histone H3 lysine 9 methylation and heterochromatin assembly in Arabidopsis // EMBO J. 2002. - V. 21 - P. 6549-6559

124. Spencer ТЕ, Jenster G, Bucin M.M et al. Steroid receptor coactivator-1 is a histone acetyltransferase // Nature. 1997 - V. 389 - P. 194198.

125. SuraniMA Reprogramming of genome function through epigenetic inheritance // Nature. 2001. V. 414. - P 122-128

126. Takagi N. Imprinted X-chromosome inactivation: enlightenment from embryos in vivo // Semin. Cell Dev Biol 2003. - V. 14. - P. 319-329.

127. Tamaru H., Zhang X., McMillen D et al. Trimethylated lysine 9 of histone H3 is a mark for DNA methylation in Neurospora crassa // Nat Genet -2003.-V. 34.-P. 75-79.

128. Tamaru H., Selker E U. A histone H3 methyltransferase controls DNA methylation in Neurospora crassa // Nature. 2001- V 414. P 277-283.

129. Thattai M., van Oudenaarden A. Intrinsic noise in gene regulatory networks//Proc. Natl. Acad. Sci. USA -2000 V 98 - P. 8614-8619.

130. Tchuraev R. N. On a stochastic model of a molecular genetic system capable of differentiation and reproduction of the initial state // Biom J. 1980. -V. 22.-P. 189-194.

131. Tchuraev R.N On storing, coding, passing and processing the hereditary information in living system // Computational Technologies 2000. -V. 5.-P. 100-111.

132. Tchuraev R.N. General principles of organization and laws of functioning in governing gene networks. Bioinformatics of genome regulation and structure II (Kolchanov N & Hofestaedt R eds), Springer Science Media Inc New York 2006.-P. 367-377.

133. Tchuraev RN , Stupak I.V , Tropynina T S , Stupak E.E Epigenes: design and construction of new hereditary units // FEBS Lett 2000 - V. 486 -P. 200-202.

134. Thieffry D., Huerta A.M., Perez-Rueda E. et al. From specific gene regulation to genomic networks: a global analysis of transcriptional regulation in Escherichia coli // Bioessays. 1998. - V. 20, № 5. - P. 433-440.

135. Vilar J.M.G, Kueh H.Y., Barkai N., Leibler S. Mechanisms of noise-resistance in genetic oscillators // Proc Natl. Acad. Sci U.S A 2002 - V. 99 -P. 5988-5992.

136. Volpert L, Beddington R, Brockes J. et al Principles of Development Oxford: Oxford Umv Press. 1998. 484 p

137. Wakayama Т., Yanagimachi R. Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type // Mol. Reprod. Dev. 2001. - V. 58 - P. 376-383.

138. Wallecha A, Correnti J., Munster V., van der Woude M. Phase variation of Ag43 is independent of the oxidation state of OxyR // J Bacteriol. -2003.-V. 185.-P. 2203-2209.

139. Walsh C.P, Chaillet J.R., Bestor Т.Н. Transcription of IAP endogenous retroviruses is constrained by cytosine methylation // Nature Genet. -1998.-V. 20. P. 116-117

140. Wang G., Rasko D.A., Sherburne R., Taylor D.E. Molecular genetic basis for the variable expression of Lewis Y antigen in Helicobacter pylori* analysis of the alpha-(l,2)-fucosyltransferase gene // Mol Microbiol 1999 - V. 31.-P 1265-1274.

141. Weiler К S , Wakimoto В Т. Heterochromatin and gene expression in Drosophila // Ann. Rev. Genet. 1995 - V. 29. - P. 577-605.

142. Weyand, N. J., and D. A Low. Regulation of Pap phase variation Lrp is sufficient for the establishment of the phase off pap DNA methylation pattern and repression of pap transcription in vitro // J. Biol. Chem 2000. - V. 275. - P. 3192-3200.

143. White-Ziegler C.A., Angus Hill ML., Braaten В A. et al. Thermoregulation of E coli pap transcription H-NS is a temperature-dependent DNA methylation blocking factor//Mol Microbiol 1998. - V 28 -P 11211138.

144. Wilmut 1, Schnieke AE, McWhir J, Kind A J., Campbell KH Viable of spring derived from fetal and adult mammaliancells // Nature. 1997. -V. 385.-P. 810-813

145. Winston F, Allis C.D. The bromodomain: a chromatin-targeting module? // Nature Struct Biol. 1999. - V. 6 - P. 601-604.

146. Xia Y., Gaily D , Forsman-Semb К , Uhlin В E. Regulatory cross-talk between adhesion operons in Escherichia coir, inhibition of type 1 fimbriae expression by the PapB protein // EMBO J 2000. - V 19. - P. 1450-1457.

147. Yamazaki Y., Makino H., Hamaguchi-Hamada K. et al. Assessment of the developmental totipotency of neural cells in the cerebral cortex of mouse embryo by nuclear transfer // Proc. Natl Acad. Sci USA 2001. - V 98. - P. 14022-14026.

148. Zhimulev 1 F. Polytene chromosomes, heterochromatin and position effect variegation // Advances in Genetics 1998. - V. 37. - P. 1-566.

149. Ziebuhr W, Heilmann С , Gotz F. et al Detection of the intercellular adhesion gene cluster (ica) and phase variation in Staphylococcus epidermiclis blood culture strains and mucosal isolates // Infect. Immun. -1997. V 65 - P 890-896.

150. Zink D., Cremer T. Chromosome dynamics in nuclei of living ceils // Curr. Biol. 1998. - V. 8 - P. R321-R324.

151. Zink D, Cremer Т., Saffrich R. et al. Structure and dynamics of human interphase chromosome territories // Hum. Genet. 1998 - V. 102. - P. 241-251.

152. Бурцева H.H , Романов Г.A, Гимадутдинов О.A , Ванюшин Б Ф Увеличение степени метилирования палиндромных последовательностей

153. ДНК коров при хроническом лифмолейкозе // ДАН СССР. 1983. - Т 268, № 5.-С 1251-1255.

154. Ванюшин БФ Энзиматическое метилирование ДНК -эпигенетический контроль за генетическими функциями клетки // Биохимия -2005. -Т 70,№5.-С 598-611

155. Ванюшин Б.Ф., Романенко Е Б Изменение метилирования ДНК крыс в онтогенезе и под влиянием гидрокортизона // Биохимия 1979. - Т 44, № 1. - С. 78-85.

156. Ванюшин Б.Ф., Тушмапова Н А, Гуськова Л.В и др. Изменение уровня метилирования ДНК головного мозга крыс при выработке условного рефлекса//Молекулярная биология 1977. - Т. 11, № 1. - С 181-187.

157. Гвоздев В А. Регуляция активности генов, обусловленная химической модификацией (метелированием) ДНК // Соросовский образовательный журнал. 1999. - Т.5, № 10 - С. 11-17.

158. Глазер В М. Запрограммированные перестройки генетического материала в онтогенезе // Соросовский образовательный журнал. 1998 -Т.4, № 8. - С 22-29.

159. Головлев EJT Метастабильность фенотипа у бактерий // Микробиология. 1998 Т. 67, № 2. С. 149-155.

160. Дерфлер В. О биологическом значении метилирования ДНК // Биохимия. 2005. - Т 70, № 5. - С. 618-640.

161. Жаворонкова Е.Н., Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК и взаимодействие с глюкокортикоид-рецепторными комплексами печени крысы // Биохимия. 1987. - Т. 52, № 5. с. 870-877.

162. Колчанов Н.А., Ананько Е А., Колпаков Ф А. и др. Генные сети // Мол биология. 2000. - Т. 34, № 4. - С. 533-544.

163. Лихтенштейн А В., Киселева Н.П Метилирование ДНК и канцерогенез // Биохимия. -2001. Т 66, № 3. - С. 293-317.

164. ЛьюинБ.М. Гены -М.: Мир, 1987.-544 с

165. Мартынкина Л П., Милько Е.С. Ультраструктурные особенности диссоциантов Rhodococcus rubropertinctus и Streptococcus lactis П Микробиология. 1991 - Т 60, № 2. - С 334-338

166. Миллер Дж Эксперименты в молекулярной генетике. М . Мир, 1976.-436 с.

167. Милько Е С, Егоров Н.С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации. М/ Изд-во МГУ, 1991. 144с

168. Могильная О.А., Милько Е.С., Медведева СЕ Сравнительное электронно-микроскопическое изучение колоний и клеток диссоциантов родококка // Прикладная биохимия и микробиология 1994. - Т. 30, № 6. -С. 877-883.

169. Озолинь О.Н, Пуртов Ю.А., Брок-Волчанский АС. и др Особенности ДНК-белковых взаимодействий в транскрипционных комплексах Escherichia coli II Молекулярная биология. 2004. - Т. 38, № 5. -С. 786-797.

170. Олескин А В., Ботвинко И.В., Цавкелова Е. А Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов // Микробиология. 2000. - Т.69, № 3 - С 309-327

171. Олескин А.В. Экологически важные свойства популяций микроорганизмов // Соросовский образовательный журнал. 2001. - Т.7, № 8. - С.7-12.

172. Патрушев Л.И. Экспрессия генов М • Наука. - 2000. - 526 с.

173. Прохорчук А В., Рузов А .С. Метилирование генома и его роль в функционировании эукариотического организма // Генетика. 2000 - Т.36, №11.- С.1475-1486.

174. Ратнер В А., Чураев Р.Н. Существует ли двухоперонная система управления (триггер)? Некоторые факты и эвристическое значение триггера //Генетика.-1971 -Т.7,№9.-С. 175-179.

175. Саложин С.В., Прохорчук Е.Б., Георгиев Г.П Метилирование ДНК как один из основных эпигенетических маркеров // Биохимия 2005 -Т. 70,№5.-С 641-650

176. Секерина OA, Чемерилова В И Об адаптивности процесса диссоциации у Bacillus thuringiensis // Микробиология. 2003 - Т 72, № 5 -С. 689-694.

177. Серов О Л Генный и хромосомный уровни контроля развития // Вестник ВОГиС. 2003. - № 24-25: 1.

178. Скороходова А.Ю., Каташкина Ж.И., Зименков ДВ и др Создание и исследование свойств авторегулируемого и плавнорегулируемого генетического элемента Os/P^uvs/CW-Wac/ // Биотехнология 2004 - № 5. -С 3-21.

179. Ханаан Дж. Методы трансформации Е. coli // Клонирование ДНК. Методы /Ред Д. Гловер -М. Мир, 1988 С 140-173

180. Харди КДж Выделение бактериальных плазмид // Плазмиды. Методы / Ред К Дж. Харди. -М.: Мир, 1990. С 11-18.

181. Хаттман С. Метилирование ДНК по адениновым остаткам у низших эукариот // Биохимия 2005 - Т 70, № 5. - С 670-679.

182. Хмель И А. Регуляция экспрессии бактериальных генов в отсутствие активного роста клеток // Генетика. 2005. - Т. 41, № 9 - С. 1183-1202.

183. Холлидей Р. Метилирование ДНК и эпигенотипы // Биохимия. -2005. -Т 70,№5.-С 612-617.

184. Чемерис Н А., Барышникова Л.М., Акименко Л В и др. О фазах экспоненциального роста культуры Rhodococcus minimus // Микробиология. -1989.-Т. 58,№4.-С. 689-694.

185. Чураев Р.Н. Гипотеза об эпигене // Исследования по математической генетике / Ред. В А. Ратнер Новосибирск: ИЦиГ СО АН СССР, 1975.-С. 77-94.

186. Чураев Р.Н Прикладные аспекты концепции эпигенов // Журн общ. биологии. 1982 - Т. 43, № 1. - С. 79-87.

187. Чураев Р.Н. Контуры неканонической теории наследственности' от генов к эпигенам//Журн общ биологии. 2005 - Т 66, № 2 - С. 99-122

188. Чураев Р Н., Ступак И В , Ступак Е Э , Галимзянов А В. Новое свойство эпигенов метастабильные эпигенотипы // Доклады Академии наук -2006. -Т. 406,№4.-С 1-4.

189. Чураев РН, Ступак И.В., Тропынина Т.С, Ступак Е.Э. Сконструирован двухкомпонентный эпиген с наперед заданными свойствами // Доклады Академии наук 2001. - Т. 378, № 6. - С 837-840.

190. Чураев Р.Н, Федотов AM. Об одной математической модели молекулярно-генетической системы, способной к дифференцировке и воспроизведению исходного состояния // Вопросы теории молекулярно-генетических систем. Новосибирск- ИЦиГ СО АН СССР, 1977 - С. 5-17

191. Шиф М Метилирование и деметилирование ДНК как мишени для противораковой терапии // Биохимия 2005. - Т. 70, № 5. - С 651-669.