Индукция ATM/ATR сигнального каскада в ответ на ДНК - повреждающее действие Helicobacter pylori

Аникеенок, Марина Олеговна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Индукция ATM/ATR сигнального каскада в ответ на ДНК - повреждающее действие Helicobacter pylori
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Индукция ATM/ATR сигнального каскада в ответ на ДНК - повреждающее действие Helicobacter pylori"

На правах рукописи

UU3474911

Аникеенок Марина Олеговна

ИНДУКЦИЯ ATM/ATR СИГНАЛЬНОГО КАСКАДА В ОТВЕТ НА ДНК - ПОВРЕЖДАЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ HELICOBACTER PYLORI

03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2009

003474911

Работа выполнена на кафедре микробиологии биолого-почвенного факультета Казанского государственного университета им. В.И.Ульянова-Ленина.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ильинская Ольга Николаевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Гатауллин Ильгиз Габдуллович

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Коксин Владимир-Петрович

Ведущая организация: Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь.

Защита состоится «18» июня 2009 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете им. В.И.Ульянова-Ленина по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 2//.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И.Лобачевского Казанского государственного университета.

Автореферат разослан «18» мая 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Абрамова З.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Онкологические заболевания являются одной из основных причин смерти во всем мире, и их частота неуклонно растет. XXI век ознаменовался бурным прогрессом в познании природы злокачественных новообразований, их причин и способов предотвращения. Аденокарцинома желудка - один из наиболее распространенных типов рака в мире. Это определяет актуальность поиска причин образования предраковых патологий желудка.

Известны три основные этиологические группы агентов, вызывающих развитие рака: канцерогенные вещества, физические и биологические факторы. Роль канцерогенов химической природы, а также различного вида облучений в повреждении ДНК, мутациях и развитии злокачественных новообразований неоспорима. В месте с тем, в этиологии злокачественных опухолей важную роль играют такие факторы, как инфекционные агенты различной природы. Пятая часть раковых заболеваний во всем мире возникает в результате хронических инфекций, основными возбудителями которых являются вирусы гепатита В (рак печени), вирусы папилломы человека (рак шейки матки), Helicobacter pylori (рак желудка), шистосомы (рак мочевого пузыря), печеночные двуустки (рак желчных протоков) и вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) (саркома Калоши и лимфомы). По классификации ВОЗ, все эти агенты относятся к биологическим канцерогенам [Баженов, Баженова, 2006]. Достаточно изучена природа вирусного канцерогенеза, в то время как механизм развития рака в результате бактериальной инфекции до конца не ясен.

Существует убедительные доказательства того, что бактериальные инфекции ассоциируются с развитием различных типов рака. Например, Salmonella typhi ассоциируется с раком желчного пузыря [Vaishnavi et al, 2005; Lax, Thomas 2002; Dutta, 2002; Shukla, 2000], Streptococcus bovis - с раком толстой кишки [Biarc et al., 2004; Gold et al., 2004; Ellmerich et al., 2000; Zarkin et al., 1990], и Chlamydia pneumoniae - с раком легких [Littman et al., 2004; Koyi et al., 2001; Anttila et al., 2003]. Важные механизмы, с помощью которых бактериальные агенты могут вызывать канцерогенез, включают хроническую инфекцию и иммунную реакцию [Kuper et al., 2000]. Было показано, что некоторые бактерии выделяют токсины, нарушающие клеточный цикл, в результате чего изменяется характер роста клеток [Littman et al., 2004; Koyi et al., 2001]. В результате повреждений ДНК, аналогичных тем, которые вызывают канцерогенные вещества, нарушается контроль нормального клеточного деления и апоптоза [Nougayrede et al., 2005; Lara-Tejero et al., 2000].

д. Понимание тонких молекулярных механизмов атаки Н. pylori на эукариотические клетки, повреждения клеточного материала, в том числе и ДНК, а также влияния на сигнальные каскады клетки позволит правомерно говорить о данной бактерии как об опасном канцерогене. Актуальность таких исследований несомненна, а установление факта генотоксичности инфекции Н. pylori обосновывает необходимость в информировании населения и проведении масштабной эрадикации данного патогена.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось установление генотоксического потенциала Н. pylori, связанного с активацией ATM протеинкиназы и ее субстратов в ответ на инфекцию, вызванную данным патогенам в культуре клеток аденокарциномы желудка и карциномы эндометрия человека.

В связи с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Оценить генотоксический потенциал штаммов Helicobacter pylori дикого типа и дефектного по островку патогенности AP AI прямым методом ДНК-комет.

2. Установить возможность активации ключевых киназ: атаксия-телеангизктазия, мутантная (ATM), и относящаяся к атаксии-телеангизктазии (ATR) клеточного ответа в ответ на двунитевые разрывы ДНК в клетках HeLa и AGS после инфекции Helicobacter pylori.

3. Охарактеризовать спектр известных субстратов ATM/ATR киназ, активированных инфекцией Helicobacter pylori.

4. Идентифицировать белки, фосфорилированные ATM киназой после инфекции Helicobacter pylori; проанализировать степень активации ее известных субстратов и новых белков, впервые идентифицированных как субстраты ATM киназы.

5. Выявить возможное участие киназ ATM и ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-ПК) в активации митоген активированных (МА) белков стрессового ответа и формировании фенотипа «колибри».

Научная новизна. Впервые получены данные об активации ATM/ATR сигнального каскада, ключевого в ответе на появление двунитевых разрывов ДНК, после инфекции штаммами H.pyori Р12 дикого типа и мутанта Н. pylori APAI, дефектного по островку патогенности, в культуре клеток аденокарциномы желудка (AGS) и карциномы эндометрия человека (HeLa). Впервые приведены результаты, указывающие на активацию целого ряда субстратов ATM киназы в ответ на инфицирование хеликобактером. С помощью молекулярных методов и методов биоинформатики впервые проведен системный анализ белков, фосфорилированных после инфицирования Н. pylori. В ходе работы идентифицированы новые, неизвестные субстраты ATM киназы, фосфорилированные после инфицирования Н. pylori. Впервые с помощью прямого метода ДНК-комет получены свидетельства наличия ДНК-повреждающего действия штамма Н. pylori APAI, что позволило показать наличие генотоксического потенциала бактерии вне зависимости от присутствия островка патогенности. Установлено, что ATM киназа принимает участие в формировании фенотипа «колибри», а также взаимодействует с внеклеточной сигнал-регулируемой киназой (ERK) - белком стрессового ответа клетки.

Представленные результаты вносят вклад в понимание роли инфекции Н. pylori в молекулярном ответе атакованной клетки и ее последующей неопластической трансформации на пути развития аденокарциномы желудка.

Практическая значимость. Проведенные исследования намечают новое направление в предотвращении развития онкологических патологий эпителиальной этиологии, связанных с инфекцией Н. pylori. Особое значение имеет обнаруженный факт наличия генотоксических изменений ДНК эпителиальных клеток при инфицировании штаммом Н. pylori АР AI, дефектным по островку патогенности и свидетельствующий об отсутствии связи повреждений ДНК эпителия человека и генетических детерминант патогенности, известных на сегодняшний день для хеликобактера. В ходе экспериментальной работы разработана и опробована оригинальная методика цитометрического определения фосфорилированной формы ATM киназы, позволяющая оценить уровень активации киназ после инфицирования.

Полученные результаты вносят вклад в понимание молекулярных механизмов клеточного ответа на инфекцию Н. pylori и впервые демонстрируют наличие фосфорилирования субстратов ATM, среди которых обнаружены не только известные белки клеточного цикла, но и новый сплайсинг-фактор. Данные результаты имеют фундаментальное значение для развития молекулярно-биологических методов анализа и борьбы с инфекцией Н. pylori. Возможность идентификации активированных белков с помощью MALDI-анализа после двухмерного электрофореза позволяет упростить и удешевить процедуру идентификации, исключив использование широкого спектра дорогостоящих антител.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводилась в соответствии с тематическим планом НИР КГУ 1.15.06 «Механизмы регуляции функциональной активности клетки». Исследования автора по тематике работы поддержаны аналитической федеральной программой «Развитие научного потенциала высшей школы», гранты № 2.1.1.1005, 2.1.1.3222, 2.1.1./920 и РФФИ 07-04-01051. Авторские исследования получили персональную поддержку фонда Палаты депутатов г. Берлина (2006-2007гг.), что позволило на базе Института Инфекционной Биологии Макса Планка, (Берлин, Германия) провести цитометрические исследования, MALDI-анализ и иммунологический анализ, а также детекцию повреждений ДНК методом ДНК-комет. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференциях НОЦ КГУ Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2003, 2004), Междисциплинарной конференции с международным участием «Новые биокибернетические и телемедицинские технологии XXI века для диагностики и лечения заболеваний человека» (Петрозаводск, 2003), IX Всероссийской научно-практическая конференции «Молодые ученые в медицине», (Казань, 2004), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов

(Новосибирск, 2008), международной конференции "Modem biology Bionews" (Казань, 2008), а также на итоговых конференциях КГУ (2008-2009).

Положения, выносимые на защиту:

1. Длительное инфицирование клеток AGS мутантным штаммом Н. pylori ДРА1, дефектным по островку патогенности, приводит к появлению двойных разрывов ДНК атакованной клетки.

2. Инфицирование Я. pylori Р12 культуры клеток AGS и HeLa приводит к активации ATM протеинкиназы и не приводит к фосфорилированию ATR протеинкиназы.

3. В результате запуска ATM сигнального каскада инфекцией Н. pylori активируются субстраты ATM киназы - белки чекпоинт 1 (Chkl), чекпоинт2 (Chk2), репликационный белок 32А (RPA32A) и гетерогенный ядерный рибонукпеопротеин F (hnRNP F).

4. В качестве субстрата ATM киназы, активированной в ответ на инфицирование Я pylori, впервые идентифицирован новый белок - сплайсинг-фактор аргинин/серин 3.

5. ATM протеинкиназа вносит вклад в формирование фенотипа «колибри» -характерного морфологического изменения клеток эпителия человека при инфицировании их Я. pylori Р12.

6. Ингибирование фосфорилирования ATM протеинкиназы приводит к снижению, или к полному отсутствию активации белка стрессового ответа клетки ERK.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 113 страницах, содержит 3 таблицы и 27 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 235 источников, из них 210 на иностранном языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Бактериальные штаммы и клеточные культуры. Клетки инфицировали штаммом Я. pyori PI2 cag+, vac+, дикого типа, выделенного из биоптата пациента с язвой двенадцатиперстной кишки [Schmitt, Haas, 1994], и мутантом Я. pylori ДРА1, дефектным по наличию островка патогенности [Odenbreit et al., 2001]. В работе были использованы две линии опухолевых клеток человека: HeLa (карцинома эндометрия) и AGS (АТСС CRL 1739 аденокарцинома желудка) (коллекция Института Инфекционной Биологии Макса Планка, Берлин, Германия).

Разделение белков клеточных лизатов для определения наличия фосфорилированных форм ATM и ATR киназ проводили в градиентном геле, так как молекулярная масса исследуемых киназ составляет 370 кДа, что затруднило

разделение даже в 8% акриламидном геле. Остальные белки разделяли в 10% ПААГ в модификации Лаемли [Laemmli, 1970]. Также проводили двумерный электрофорез для лучшего разделения белков и дальнейшей идентификации с помощью масс-спектрометрии. Белки в геле визуализировали окрашиванием Кумасси-0250 (Serva).

Иммуноблотинг клеточных лизатов проводили с использованием антител к ATM киназе pS1981, фосфо-ATR киназе (Ser428), фосфо-(8ег/ТЬг) ATM/ATR субстратам, фосфо-чекпоинт 2 (Thr68), фосфо-чекпоинт 1 (Ser345), фосфо-р53 (Serl5) (16G8), репликационному белку А 32 kDa субъединице (МА34): sc-53496, фосфо-SAPK/JNK (Thrl83/Tyr 185), фосфо-р38 МАРК (Thrl80/Tyrl82), фосфо-ERK 1,2, фосфо-тирозину, белку Cag А, ß-актину. Иммунодетекцию осуществляли с помощью конъюгированных с пероксидазой хрена антител против иммуноглобулинов мыши и кролика и набора ECL (Amersham, Великобритания).

Методом проточной цитометрии определяли изменение уровня фосфорилированной формы ATM в клетках HeLa на проточном цитометре FACS Calibur (США), используя антитело против фосфорилированной формы ATM р1981 (Sigma). Для иммунодетекции использовали флюорохром коньюгированое анти-мышиное антитело, полученное из сыворотки осла IgG-Alexa488 с длинами волн возбуждения и регистрации соответственно, 495нм/519нм (Invitrogen). Анализ цитометрических данных проводили в специализированной компьютерной программе обработки Cell Quest Pro.

Генотоксический эффект Н. pylori определяли с помощью прямого метода гель-электрофореза изолированных клеток или ДНК-комет, используя Comet Assay Kit (Trevigen). Генотоксичность определяли по одному из наиболее используемых информативных параметров — момент хвоста кометы (Tail Moment, TM), который рассчитывали как произведение процентного содержания ДНК в "хвосте" на длину "хвоста", в условных единицах [Olive et al., 1990; Olive et al., 1992].

Масс-спектрометрический анализ проводили в лаборатории Института Инфекционной Биологии Макса Планка (Берлин, Германия) с помощью MALDI-TOFTOF масс спектрометра. Полученные результаты обрабатывали с помощью программы Mascot в базе данных NCBI.

Обработка агентами. Активацию и ингибирование определенных киназ производили различными агентами с предварительным установлением оптимальных концентраций. ATM/ATR киназы активировали доксорубицином (1 мкМ, 4 ч) в среде RPMI [Kurz et al., 2004] и гидроксимочевиной (2 млМ, 2 ч) [Stiff et al., 2006]. Для ингибирования киназ использовали ATM/ATR ингибитор (Calbiochem), обрабатывая клетки HeLa (2.5 мкг/мл) и AGS (0.7 мкг/мл) за 18 ч до инфицирования (Won et al., 2006]. Для ингибирования ДНК-ПК применяли DNK-PK III и DNK-PKI ингибиторы (Calbiochem) (25 мкМ), обрабатывая клетки

в среде 2 ч с последующей заменой среды и инфицированием [Kashishian et al., 2004].

Статистическую обработку результатов проводили в программе Statistica 5.11 с использованием непараметрического критерия Колмогорова - Смирнова в качестве критерия достоверности. При этом р < 0.05 принимали за достоверный уровень значимости.

Результаты исследования

Активация ключевых киназ ATM и ATR в клетках HeLa и AGS, инфицированных Я pylori

При появлении двунитевых разрывов происходит автофосфорилирование ATM киназы, а также сходной по строению и функциям, но менее изученной ATR киназы. Таким образом, по обнаружению фосфорилированной формы той или иной киназы можно судить о возможных повреждениях ДНК в эукариотической клетке, инфицированной бактерией Я pylori.

На первом этапе нашей работы мы провели электрофоретическое разделение лизата неинфицированных и инфицированных клеток, а также обработанных различными агентами образцов с последующем иммуноблотингом, используя специфические антитела против фосфорилированной формы ATM (р-АТМ) и фосфорилированной формы ATR (p-ATR). Было показано, что при инфицировании клеток HeLa и AGS (рисунок 1) после 6 часов инкубирования с Я pylori Р12 происходило фосфорилирование ATM киназы. В то же время ни в контроле, ни при инфицировании в течение меньшего времени р-АТМ не была обнаружена. Также при обработке клеток после шестичасовой инфекции ATM/ATR ингибитором активация ATM не была зафиксирована.

о-АТМ | ' "*-.' ' T'i | А

и-АТМ I' '. - - ■fPn'^l Б

к к* 1 1* 2 2* 3 3*

Рисунок 1 - Содержание фосфорилированной формы ATM в клетках HeLa (А) и AGS (Б) после инфицирования Я pylori Р12 в концентрации 200 бактерий на клетку. Дорожки: к -клетки без обработки- бактериями; 1-3 - клетки через 90 мин, 3 ч и 6ч инфицирования соответственно;* - обработка ATM/ATR ингибитором.

При длительном инфицировании (24 ч) обеих клеточных линий активная форма ATM киназы обнаружена не была что, возможно, связано с дефосфорилированием этого белка. Иммуноблотинг с антителом против p-ATR показал, что активная форма данной киназы присутствует как в инфицированных, так и в интактных клетках HeLa.

Вестерн-блот анализ позволил нам обнаружить активную ATM киназу, однако он не дает четкого представления о количественном увеличении активации в опыте по сравнению с неинфицированными клетками. Проточная

цитометрия является более точным и чувствительным методом. Помимо дикого типа Н. pylori Р12, клетки инфицировали и мутантным штаммом Я. pylori ДРА1. Также проводили инфицирование различным количеством бактерий на клетку, отличающимся более чем в 2 раза. В результате пятичасовой инфекции диким типом штамма мы зафиксировали повышение уровня р-АТМ по сравнению с контрольным, при этом увеличение концентрации бактерий на клетку привело к заметному росту количества р-АТМ (рисунок 2, А). Также увеличение происходило и при инфицировании мутантным штаммом, причем уровень р-АТМ был приблизительно одинаков как при концентрации 200 бактерий на клетку, так и при 500, составляя более 50% от контрольного (рисунок 2, Б). Превышение уровня р-АТМ в 3 раза в позитивном контроле говорит об оптимальных условиях эксперимента.

Рисунок 2 — Цитометрический анализ содержания фосфорилированной ATM в клетках HeLa после инфекции Н. pylori Р12 (А) и Н. pylori ДРА1 (Б) 5ч; к - клетки без обработки бактериями; 1-2 - 200 и 500 бактерий на клетку соответственно, д - обработка доксорубицином.

Активация субстратов ATM/ATR каскада: Chkl. Chk2. и р53 Следующим этапом работы явился поиск субстратов, активированных киназой ATM после инфицирования хеликобактером. Известно, что ATM киназа способна фосфорилировать множество субстратов по одному сайту. Основываясь на этом, мы провели иммуноблотинг с антителом против спектра известных субстратов. Прежде всего, мы показали, что при инфекции AGS клеток бактериями дикого типа Я pylori Р12 и мутантными бактериями Я pylori APAI происходит фосфорилирование белков, совпадающих по своим молекулярным массам с известными ATM/ATR субстратами Chkl и Chk2 (62 и 56 kDa), соответственно (рисунок 3). Кроме этих двух белков, инфекция Я pylori особенно индуцирует фосфорилирование белка с молекулярной массой 32 kDa. Аналогичное фосфорилирование трех упомянутых белков происходит и в HeLa клетках, инфицированных Я pylori (рисунок 4, дорожки 2, 3, и 4). Необходимо отметить, что фосфорилирование всех трех субстратов происходит как при инфекции клеток хозяина диким типом Я. pylori Р12, так и мутантом Я. pylori ДРА1 (рисунок 3). Таким образом, фосфорилирование субстратов ATM/ATR киназ не зависит от типа инфицированной клеточной линии (AGS или HeLa) и от наличия cagPAI.

Рисунок 3 - Содержание фосфоршгированных субстратен ATM в клетках AGS после инфицирования И. pylori FI2 (А) и И. pylori ДРА1 (Б) в концентрации 100 бактерий на -к-четку. Дорожки: к - клетки беч обработки бактериями; 1-4 -клетки через 30 мин, 90 мни, 3 ч и 6 ч инфицирования.

Чтобы доказать, что фосфорилирование белков в клетках хозяина осуществляют ATM/ATR киназы, мы провели иммуноблотинг лизатов клеток хозяина, инфицированных И. pylori, в присутствии специфичного ингибитора этих киназ с тем же антителом. Результаты экспериментов показали, что Г ингибитор подавляет фосфорилирование белка, соответствующего по молекулярной массе киназе Chkl, В то же время снижения уровня фосфорилирования Chk2 не происходит (рисунок 4, дорожки 2*, 3*, 4*). При обработке клеток хозяина доке ору бици ном, активатором ATM/ATR, в присутствие ингибитора оба белка не фосфорилировапись (рисунок 4, дорожка д*). Таким образом, фосфорилирование Chk2 при Н. pylori инфекции может происходить при участии другой, отличной от ATM или ATR киназы.

Рисунок 4 - Содержание фосфорилнрованных субстратов ATM в клетках Hel.a после инфицирования И. pylori в концентрации 200 бактерий на клетку. Дорожки: к — клетки без обработки бактериями; д - обработка — доксорубицином; * - обработка ATM/ATR ингибитором; 1-4 клетки через 30 мин, 90 мин, 3 ч и 6 ч инфицирования соответственно.

белков мы провели иммуноблотинг с антителами против фосфоршшрованной формы Chk2 и р53 (р-сыа и р-р53 соответственно). Было обнаружено фосфорилирование белка Chk2 сразу после 90 мин инфицирования клеток AGS (рисунок 5, А), которое увеличивалось после 3 ч и б ч инфекции. Дополнительно клетки обработали ингибитором ATM в варианте с шестичасовой инфекцией. Однако, мнгибирование фосфорилирования не произошло, более того, появилась новая

1 f

к к • / I* 2 2г 3 3* А 4* д £>*

Для установления активации конкретных

полоса в непосредственной близости от маркера с молекулярной массой 62 кДа, что свидетельствует об участии другой киназы помимо ATM, в активации Chk2. При этом обработка доксорубицином, классическим активатором ATM, приводила к высокому уровню фосфорилирования Chk2. Это еще раз подтверждает, что активация Chk2, субстрата ATM, осуществляется иной киназой, отличной от ATM и ATR. Аналогичная динамика активации происходила и в клетках HeLa (рисунок 5, Б) в тех же условиях.

А Б

p-Chk2 I ' г w .— j^tfü I ' л ) »лЛ i§|É WWil

к I 2 3 3* д к I 2 3 3* д

Рисунок 5 - Содержание фосфорилированной формы Chk 2 в клетках AGS (а) и HeLa (б) после инфицирования II. pylori Р12 в концентрации 100 бактерий на клетку. Дорожки: к -клетки без обработки бактериями; д - обработка доксорубицином; * - обработка ATM/ATR ингибитором; 1-3 клетки через 30 мин, 90 мин, 3 ч и 6 ч инфицирования соответственно.

При длительном инфицировании обеих клеточных линий наблюдается активация Chk2 после 24 ч в клетках AGS и HeLa. Проверка активации белка р53, как одного из субстратов АТМ-киназы, показала, что Я. pylori не вызывает изменений в уровне фосфорилирования р53, что оказалось достаточно необычным, так как р53 является субстратом Chk2, как непосредственно, так и через ATM.

Выявление новых активированных субстратов ATM/ATR киназ после инфекции Я pylori

Для лучшего разделения белков нами был проведен двумерный электрофорез, позволяющий получить более подробную картину активации субстратов ATM/ATR киназ. Также проводили разделение и лизата неинфицированных клеток.

Чтобы идентифицировать белки, фосфорилируемые ATM/ATR киназами, мы инфицировали AGS клетки Я pylori Р12 в течение 90 мин. Белки неинфицированных и инфицированных AGS клеток были разделены с использованием двумерного гель-электрофореза, перенесены на мембрану и проанализированы, используя антитело против фосфо-{8ег/ТЬг) ATM/ATR субстратов (рисунок 6). Антитело реагировало с целым рядом белков в неинфицированных клетках, что свидетельствует о важной роли, которую играют субстраты ATM/ATR киназ в нормальном функционировании клеток хозяина. После инфекции мы наблюдали увеличение уровня фосфорилирования уже модифицированных белков (рисунок 6, А). Кроме того, в результате инфекции появились 9 новых сигналов (рисунок 6, А*), что свидетельствует о повышении активности ATM/ATR киназ в результате инфекции. Необходимо отметить, что происходило не только фосфорилирование, но и дефосфорилирование ряда белков в результате инфекции (рисунок 6, А*, стрелки). Таким образом, использование двумерного гель-электрофореза, имеющего более высокую, чем одномерный гель-электрофорез, разрешающую способность, позволяет выявить большее количество различных в уровне фосфорилирования субстратов ATM/ATR киназ.

без инфицирования инфицирование И. pylori*

Рисунок 6 - Дьумерное электрофоретическое разделение белков клеток AGS без Инфицирований (слева), и после 90 мин инфицирования Н, pylori Р12 В концентрации 100 бактерий на клетку - Н. pylori* (справа). А - иммуноблотиаг с антителами против фософо-(Ser/Thr) ATM/ATR субстратов, стрелками отмечены белки, содержание которых изменяется; Ь - окраска геля CBB-R2S0, стрелками и номером отмечены йежн. дня идектификащ(и MALDI.

Идентификация активированных белков методом масс-спектрометр и и в leiK-'x AGS после инфицирования Н. pylori

Один из наиболее точных способов идентификации белков является MALD1 ■.¡асс-спектрометрия, позволяющая с высокой долей вероятности определить тот г Li к иной белок. Мы выделили (рисунок 6, Б, стрелки) наиболее измененные ::;фскцией по уровню фосфорилирования белки и идентифировали их с помощью MALD1 масс-спектрометрии. Результаты масс-спектрометрии белков мумифицированных клеток представлены в таблице 1. Среди них не были i онаружены белки, имеющие сайт фосфорилирования ATMMTR киназами, Мы !роанаЗшзйровали также белки AGS клеток после инфекции (рисунок 6, Б*, ¡аблица 2) и обнаружили 2 белка, №1 и №3, которые являются субстратами ATM/ATR, а именно гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин F (hnRNP F) и репликационЯЫЙ белок А2 (RPA32A). Более изученный RPA32A представляет для нас интерес, гак как именно гиперфосфорилирование белка с молекулярной массой 32 kDa в AGS клетках после инфицирования Н. pylori было детектировано в Вестерн-блот анализе (рисунок 4, дорожки 2, 3).

Таблица 1

Результаты MALDI масс-спектрометрического анализа белков клеточного

Номер белка, № Результат идентификации

1 предшественник ретикулокальбина 1

2 подобный 40S рибосомальному протеину SA (р 40)

3 TXNDC5 белок

4 пируват киназа мускул человека, цепь A (Pkm2)

5 р - субъединица юпирующего F-акгин белока (CapZ beta)

6 Не определен

7 ассоциированный со старением белок гена 9

8 Гетерогенный нуклеорибонуклеопротеин А2/В1 изоформа В1

9 Гетерогенный нуклеорибонуклеопротеин А2/В1 изоформа В1

10 сплайсинг фактор аргинин/серин 3, изоформа CRAc.

11 сплайсинг фактор аргинин/серин 3, изоформа CRA c

Таблица 2

Результаты MALDI масс-спектрометрического анализа белков клеточного лизата AGS после 90 мин инфицирования Н. pylori Р12 в концентрации 100

Номер белка, К» Результат идентификации

1 гетерогенно ядерный рибонуклеопротеин Р *

2 тиоредоксин редуктаза (йхВ)**

3 репликационный белок А2,32Ша *

4 сплайсинг фактор аргинин/серин 3, изоформа СЯА_с*

5 ' сплайсинг фактор аргинин/серин 3, изоформа СЯА с*

Исключение влияния ДНК-ПК на активацию RPA 32А Известно, что RPA, 32А является субстратом как ATM киназы, так и другой ДНК-ПК, входящей в то же семейство киназ. Поскольку нами уже показано, что ATM киназа активируется в ответ на хеликобактерную инфекцию, необходимо было исключить возможность того, что фосфорилирование данного белка с молекулярной массой 32 kDa осуществляется ДНК-ПК, которая также активируется после появления двойных разрывов ДНК [Niu el al., 1997]. Мы инфицировали HeLa и AGS клетки в присутствие ингибитора данной киназы. Вестерн-блот анализ лизатов инфицированных клеток показал, что

ингибирование ДНК-ПК не снижает уровень фосфорилирования белка с молекулярной массой 32 Ша в обоих типах клеток (рисунок 7). Это означает, что этот белок является непосредственным субстратом ATMM.TR. А Б

P-RPA32A I-— ' ■ —> <—» WW — «И»—Ч

RPA32A

к к* 1 1* 2 2* 3 3* к к* 1 1* 2 2* 3 3*

Рисунок 7 - Содержание фосфорилированной формы RPA32A в клетках AGS (А) и HeLa (Б) после инфицирования Н. pylori Р12 в концентрации 200 бактерий на клетку. Дорожки: к -клетки без обработки бактериями; * - обработка DNK-PK Ш ингибитором; 1-3 клетки через 30 мин, 90 мин и 6 ч инфицирования соответственно.

Активации каскада митоген активированных киназ СМА киназ) и бактериального белка CagA в присутствии ATM/ATR и DNK-PK I. III ингибиторов

Инфицирование клеток штаммами Н. pylori, несущими островок патогенности PAI, приводит к активации МА киназ стрессового ответа атакованной клетки: JNK, р38, и ERK [Naumann et al., 1999; Keates et al., 1999; Wessler et al., 2000; Pomorski et al., 2000]. До сих по неизвестно, что инициирует запуск МА киназного каскада при инфицировании эукариотических клеток штаммами Н. pylori [Ding et al., 2008]. В ходе исследования нами было показано, что инфекция Н. pylori приводит к активации ATM киназы, способной фосфорилировать большое количество субстратов. Необходимым этапом работы явилось установление участия данной киназы в запуске МА киназного каскада. Кроме этого, мы провели анализ уровня фосфорилирования тирозина бактериального белка CagA и его количества в атакованной клетке. При классическом течении инфекции тирозин фосфорилируется семейством Src киназ клетки хозяина. Хотя большинство работ по исследованию активации МА киназного каскада проводится на клеточной культуре AGS, нами были инфицированы и клетки HeLa, так как важные результаты об активации ATM с использованием цитометрического анализа были получены именно на данной клеточной линии.

Клетки AGS и HeLa были инфицированы диким типом Н. pylori Р12 и обработаны тремя ингибиторами: DNK-PK I, DNK-PK III и ATM/ATR. Затем последовательно было проанализировано содержание активированных форм белков JTNK, ERK 1 2, и р38 методом иммуноблотинга.

Обработка клеток ингибиторами DNK-PK I и DNK-PK III не повлияла на активацию белка JNK в обеих клеточных линиях. При обработке ATM/ATR ингибитором мы наблюдали снижение фосфорилирования JNK в начале инфицирования после 30 мин, а при трехчасовой инфекции в клетках AGS, и клетках HeLa изменение содержания p-JNK при ингибировании ATM и ATR киназ не наблюдалось. Анализ активации белка р38 показал, что в клетках AGS и HeLa не происходило снижения количества активированной формы р38 при

обработке ингибиторами DNK-PKI и DNK-PK III. ATM/ATR ингибитор повлиял на фосфорилирование р38 как в HeLa, так и в AGS клетках при трехчасовой инфекции. В клетках AGS мы наблюдали лишь небольшое снижение, в то время как в HeLa активная форма практически отсутствовала. Сходная ситуация наблюдалась и с белком p-ERK 1,2, активация которого не зависела от ДНК-ПК киназы.

Наиболее интересным было обнаружение ингибирования активации ERK 1,2 в клетках HeLa после ингибирования ATM и ATR киназ, которое было наиболее заметным при 30 мин инкубирования с бактериями (рисунок 8, А, дорожка 1 *).

А Б

p-ERK 1Д [ w w, j—i ^^ ^ - ^¡^ | ¡»ас gag, щ?-mm ЖЖ ШЯ 'Eljg I

ß-актин I '?**** »""" '111 —» тят,-mm- ».тот-1 ¡^««Hl^—ними —..■«. >,к».»Ц<цЦ к К* 1 1* 2 2* 3 3* к к* 1 1* 2 2* 3 3*

Рисунок 8 - Содержание фосфоршшрованной формы ERK 1,2 в клетках HeLa (А) и AGS (Б) после инфицирования Н. pylori Р12 в концентрации 200 бактерий на клетку. Дорожки: к -клетки без обработки бактериями; * - ATM/ATR ингибитором; 1-3 клетки через 30 мин, 90 мин и 3 ч инфицирования соответственно.

Помимо активации белков МА киназного каскада, нами был отслежен широко изученный процесс проникновения в клетку хозяина белка CagA с последующем фосфорилированием тирозина, входящего в его состав при обработке ингибиторами. Ни один из ингибиторов не помешал внедрению CagA белка в клетки AGS, а также фосфорилированию тирозина.

Выявление повреждений ДНК в клетках HeLa и AGS методом ДНК-комет после инфекции Н. pylori

Одним из современных прямых методов определения генотоксичности является метод гель-электрофореза изолированных клеток или ДНК-комет (Comet Assay). Выбор метода не являлся случайным, данная методика чувствительна к повреждениям ДНК, относящимся к двунитевым разрывам, которые, как известно, вызывают активацию ATM киназы, что показано в нашей работе. Инфицирование проводили как диким типом Н. pylori Р12, так и менее агрессивным мутантом Я. pylori APAI, так как оба штамма активировали ATM при цитометрическом анализе. Мы установили, что в течение инфекции, длящейся 6 ч, не наблюдается гибели клеток и повреждений ДНК, о чем свидетельствуют одинаковые значения ТМ в опытном варианте, где клетки инкубировались с Я pylori Р12 и Я. pylori APAI, и контрольном без инкубации с бактериями (рисунок 9, рисунок 10, А). При этом схожие данные получены как на клетках AGS, так и на HeLa. После 12 ч инфицирования не наблюдали превышения гибели клеток в опытных вариантах с обоими штаммами по сравнению с неинфицированными клетками. Также не возросли значения ТМ, что говорит об отсутствии генотоксического эффекта патогена в данных условиях инкубации (рисунок 10, Б). Известно, что бактерия, несущая cagPM, индуцирует более высокий уровень внутриклеточных АФК в клетках эпителия

желудка, чем АР AI штамм. Однако именно инфицирование клеток с Н. pylori AP AI в течение 24 ч неожиданно выявило увеличение значений ТМ клеток по сравнению с Н. pylori Р12 (рисунок 10, С). Наши данные свидетельствуют, что после инфицирования Я pylori АР AI в течение 24 ч выявляется резкое увеличение значений ТМ в AGS клетках (рисунок 0.

gfei-

nh *

■О Н202

• 200 600 t 200 МО H202

Рисунок 9 - Значение момента «хвоста кометы» ТМ после инфицирования клеток HeLa двумя штаммами К pylori Р12 и ДРА1. А -инфекция 1 ч, Б - инфекция 3 ч, С -инфекция 6ч. *-р< 0.001

О » SO Н202

Рисунок 10 - Значение момента «хвоста кометы» ТМ после инфицирования клеток AGS двумя штаммами Н. pylori Р12 и ДРА1. А -инфекция 6 ч, Б - инфекция 12 ч, С - инфекция 24 ч. * -р < 0.001

Отсутствие индукции «колибри» - фенотипа клеток AGS при инфицировании Я. pylori в присутствии ATM/ATR и DNK-PKI. П1 ингибиторов

In vitro инфицирование cag PAI-позитивными штаммами AGS клеток приводит к характерным изменениям в клеточной морфологии, приводящим к так называемому "колибри" - фенотипу, характеризующемуся элонгацией и уплощением клеток [Segal et al., 1996]. На рисунке 11 представлены фотографии неокрашенных клеток AGS без инфекции и инфицированных Я. pylori Р12 при

обработке ATM/ATR, DNK-PK I и DNK-PK III ингибиторами. Видно, что ингибирование ДНК-ПК киназы не повлияло на формирование фенотипа «колибри» (рисунок. 11, Д, Е): клетки также удлинялись и изменяли форму, как и при инфицировании Я. pylori Р12 (рисунок 11, Б). При обработке ATM/ATR ингибитором инфицирование клеток диким типом не привело к формированию фенотипу «колибри» (рисунок 11, С). В клетках происходила вакуолизация цитоплазмы, характерная для активного инфицирования.

Рисунок 11 - Формирование фенотипа «колибри» клеток AGS инфицированных Я pylori Р12 при обработке ингибиторами. А - интактные клетки; Б - инфицированные Я pylori Р12; С- инфицированные Я pylori Р12 и обработанные ATM/ATR ингибитором; fl -инфицированные Я pylori Р12 и обработанные DNK-PK I ингибитором; £- инфицированные Я pylori Р12 и обработанные DNK-PK Ш ингибитором.

Обсуждение результатов

Инфекция Н. pylori как возможный генотоксический агент

В последние годы была выявлена исключительно важная этиологическая роль Я pylori в заболевании раком желудка. Инфицируя желудок, эта бактерия во многих случаях постепенно вызывает формирование начальных предопухолевых изменений слизистой оболочки желудка — метаплазии тонкокишечного типа [Аруин с соавт., 1993; Correa, 1992; Crepsi et al., 1996; Hill,

1994; IARC, 1994; Koster et al., 1994; Reed, 1996] и резко повышает риск заболевания раком желудка.

Ряд исследований подтверждает связь инфекции с повреждением ДНК in vitro [Sugiyama et al., 1998; Honda et al., 1998; Watanabe et al., 1998]. Однако доказательств наличия прямого генотоксического действия in vivo не только хеликобактерной, но и вообще бактериальной инфекции, достаточно немного. Результаты проведенных нами экспериментов позволили установить, что после инфицирования Н. pylori APAI в течение 24 ч выявляется резкое увеличение значений хвоста кометы (основного показателя двойных разрывов ДНК) в эпителиальных клетках желудка (рисунок 10), что не наблюдалось при инфицировании диким, более агрессивным типом бактерии при тех же условиях. В месте с тем нельзя не учитывать, что культивирование клеток с бактериями, синтезирующими весь набор факторов вирулентности, в течение 24 ч привело к гибели около половины клеток. Поскольку нами был выявлен генотоксический эффект инфекции хеликобактера, у которого отсутствует островок патогенности, участвующий в усилении воспалительного процесса, можно предполагать, что при атаке диким типом наиболее поврежденные клетки погибали, и детекция повреждений ДНК не представлялась возможной. Мы не исключаем наличие повреждений генома клетки хозяина «полноценным» штаммом хеликобактера, тем более что подавляющие большинство исследований говорят о крайне важной роли данных генов патогенности в индукции не только воспалительного процесса, но и повреждений ДНК. Предположительно, механизм повреждения ДНК, с бактерией, не синтезирующей каких-либо канцерогенных веществ, связан с образованием АФК в слизистой оболочке посредством проникновения бактериального белка CagA в эпителиальные клетки желудка. В то же время нами установлено, что бактерии, не способные к синтезу белка CagA, также индуцируют дву- и одноцепочечные разрывы ДНК. Результаты нашей работы свидетельствуют об особой опасности хронических инфекций маловирулентными штаммами Н. pylori.

Молекулярно-биохимические изменения статуса клетки-хозяина после инфицирования хеликобактером

Мы предположили, что, проследив активацию того или иного молекулярного каскада в инфицированной хеликобактером клетке, можно судить о нарушении геномного материала. Учитывая наши предыдущие данные о наличие поврежденной ДНК в эпителиальных клетках желудка после инфекции Н. pylori, детекция активации ATM/ATR-сигнального пути, активирующегося в ответ на двунитевые разрывы ДНК, восстановит этапность процесса реакции клетки на атаку патогена. Иммунологическими методами было показано, что инфицирование Н. pylori Р12 клеточных линий эпителия желудка и эндометрия привело к активации ATM киназы после 6 ч инкубирования с бактериями (рисунок 1). Обработка клеток специфическим ATM/ATR ингибитором привела к полной отмене эффекта, что подтверждает фосфорилирование именно ATM киназы. Мы установили, что активация ATM киназы происходит не только в результате инфицирования диким типом хеликобактера, но и мутантным. С помощью цитометрического анализа было

показано присутствие р-АТМ в клетках HeLa после инфицирования Я. pylori ДРА1, а также увеличение ее уровня при повышении концентрации бактерий при инкубировании (рисунок 2, Б). Действительно, появление двунитевых разрывов при инфицировании не зависит от наличия островка патогенности, что говорит об альтернативном пути воздействия на ДНК клетки хозяина, помимо предположительной роли проникновения CagA белка.

Активация ключевой ATM киназы в сигнальном каскаде приводит к различным процессам: репарации, апоптозу, остановке клеточного цикла и другим последствиям. Исход зависит от того, какой из субстратов будет активирован в дальнейшем. Нами установлено, что инфицирование хеликобактером приводит к активации одного из компонентов чекпоинт контроля-киназы Chk2. При возникновении повреждений ДНК p-Chk2 фосфорилирует различные мишени, среди которых опухолевые супрессоры р53 и BRCA1, а также фосфатаза Cdc25C, играющая важную роль в регуляции Gl и С2-чекпойнтов. Обнаруженное в ходе работы отсутствие активации р53 говорит о том, что, вероятно, остановка происходит именно в G2 фазе, которая регулируется самой Chk2, в то время как в Gl-чекпойнт является р53-опосредованным. Можно сделать вывод, что эта остановка приводит к возможности осуществления репарационных процессов, а не апоптозу, что подтверждено нами в дальнейшем. Одной из реакций клетки на атаку патогена является остановка клеточного цикла в этих фазах. Интересным является тот факт, что ингибирование ATM и ATR киназы не приводило к угнетению фосфорилирования Chk2 белка при инфицировании хеликобактером (рисунки 4, 5), что позволяет делать вывод, что в его активации принимает участие другая киназа, отличная от ATM или ATR.

Наши результаты полностью подтверждают данные литературы о ATR-Chkl взаимодействии. Нами было показано, что фосфорилированная форма ATR протеинкиназы присутствует в интактных клетках HeLa конститутивно, и ее активация ингибируется ATM/ATR ингибитором. При этом ее субстрат, Chkl, также был обнаружен нами в активированной форме в неинфицированных клетках (рисунки 3, 4). Однако мы наблюдали небольшое увеличение количества p-Chkl после 90мин и Зч инфицирования, что не могло быть связано с ATR киназой, так как ее уровень в ходе инфицирования оставался постоянным. Эти результаты дают возможность предположить участие ATM киназы в фосфорилировании Chkl при инфекции хеликобактером.

Для понимания того, какие же процессы инициируются в ходе активации AMT/ATR сигнального каскада, необходимо установить конкретные субстраты, фосфорилируемые после инфицирования хеликобактером. Большое число субстратов, ограниченное количество методов, а также дорогостоящие антитела при использовании наиболее распространенных иммунологических способов идентификации осложняют задачу поиска этих субстратов.

В начале нашей работы мы использовали антитело, узнающее специфический мотив, по которому ATM фосфорилирует свои субстраты. Однако Вестерн-блот анализ при одномерном электрофорезе выявил белки с большой степенью фосфорилирования после инфекции Н. pylori, не описанные в

протоколе данного антитела (рисунки 3,4). Это привело нас к следующей схеме эксперимента: выделение всех белков эпителиальных клеток желудка до и после инфицирования —► проведение двумерного электрофореза в большом геле —> Вестерн-блот анализ с использованием антитела против субстратов ATM —> сравнение уровня фосфорилирования белков —► окраска гелей кумасси R250 —► выбор пятен на геле —» идентификация их MALDI масс-спектрометрией. Таким образом, мы исключили перебор всех субстратов специфическими и довольно дорогостоящими антителами, а также значительно увеличили точность анализа белков. Данный способ поиска активированных белков позволил нам полностью подтвердить наше предположение о том, что гиперфосфорилированный субстрат ATM (на рисунке 4, с примерной молекулярной массой 32 кДа) является репликационным белком A (RPA32A) (таблица 2). В литературе встречаются данные, что RPA32A является одним из субстратов не только ATM, но и другой ДНК-ПК, входящей в то же семейство киназ. Параллельно нами была исключена роль ДНК-ПК в фосфорилировании RPA32A (рисунок 8). В обычной фосфорилированной форме этот белок конститутивно функционирует в клетке, связываясь с одноцепочечными концами ДНК при репликации. Его гиперфосфорилирование является результатом активирования ATM киназы в ходе генотоксического стресса клетки различными агентами, а в нашем случае -инфекцией Я pylori. Помимо RPA32A, были идентифицированы еще два новых белка: гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин F (hnRNP F) и сплайсинг фактор аргинин/серин 3. HnRNP F играет позитивную роль в производстве проапоптотсческого регулятора Bcl-xS в ходе альтернативного сплайсинга в клетках HeLa. Можно сделать предположение о том, что фосфорилирование ATM киназой hnRNP F и сплайсинг фактора аргинин/серин 3 приводит к изменению их функционирования в процессах альтернативного сплайсинга в клетках, атакованных хеликобактером. В результате этого синтез нехарактерных проапоптотических белков может являться одной из причин формирования необратимых изменения в тканях, приводящих к раку желудка. Сравнительный анализ результатов иммуноблотинга демонстрирует целую сеть белковых взаимодействий, вовлеченных в клеточный ответ при инфицировании хеликобактером. Эта сеть включает как процессы фосфорилирования, так и дефосфорилирования, а ее многокомпонентность вызывает растущий интерес исследователей.

Участие ATM киназы в инициации митоген активированных (МА) киназ ответа клетки на стресс и формировании фенотипа «колибри»

Инфицирование клеток штаммами дикого типа Я. pylori приводит к инициации ERK, JNK и р38 киназ, что было показано во многих исследованиях [Naumann et al., 1999; Pomorski et al., 2000]. Проведенный иммунохимический анализ наличия активированных форм JNK и р38 белков данного семейства в присутствии специфических ингибиторов ATM/ATR и ДНК-ПК киназ, используемых ранее в нашей работе, показал классический ответ клетки на инфекцию. Ингибирование ATM киназы также не повлияло на проникновение в клетку и фосфорилирование бактериального белка CagA при инфицировании Я pylori Р12. Однако при ингибировании ATM киназы мы наблюдали снижение

уровня p-ERK 1,2 (рисунок 8), особенно заметного в первые 30 мин инфицирования клеточной культуры эндометрия. Если ATM киназа принимает участие в фосфорилировани белка ERK 1,2, то остается неясным факт отсутствия активации ATM в первые 30 мин инфекции не зафиксирована (рисунок 1). Его можно объяснить тем, что для активации одной молекулы субстрата не требуется именно одна молекула ATM киназы. Одна молекула р-АТМ способна фосфорилировать множество молекул своего субстрата. Таким образом, ATM киназа, вероятно, действительно активируется в первые полчаса инфицирования, но ее количество мало для детекции с помощью использованных антител, хотя и достаточно для фосфорилирования субстратов, одним из которых является белок ERK 1,2.

Интересной оказалась фенотипическая реакция, а точнее ее отсутствие, на инфицирование Н. pylori Р12 эпителиальных клеток желудка в присутствии ATM/ATR ингибитора. Классическим ответом клетки на инфицирование являются морфологические изменения, характеризующиеся элонгацией и уплощением клеток [Segal et al., 1996]. Однако при ингибировании ATM и ATR киназ эти изменения не были обнаружены. Данные результаты подтверждают возможное участие ATM киназы в стрессовом ответе клетки путем взаимодействия с белком ERK 1,2, который принимает участие в передаче сигнала, приводящего к формированию фенотипа «колибри». Нами было проверено влияние ДНК-ПК ингибитора на формирование данного фенотипа. В присутствии данного агента клетки реагировали на инфекцию также, как и в контроле, без каких-либо дополнительных воздействий. Это свидетельствует о том, что участие ATM киназы в данном процессе достаточно специфично.

Результаты ряда последовательных экспериментов, проведенных в данной работе, позволили нам схематично изобразить поэтапный каскад реакций, происходящих в клетке, атакованной бактерией Н. pylori (рисунок 12). На первом этапе индуцируются повреждения ДНК, вызванные атакой Н. pylori. Механизм возникновения повреждений, а конкретнее, двунитевых разрывов, остается не ясным. Наши данные не подтверждают предположение некоторых ученых об участие CagA белка в генотоксическом эффекте. Штамм, дефектный по островку патогенности также вызывал повреждения ДНК. Второй этап: двунитевые разрывы ДНК являются сигналом для активации ATM киназы, что происходит при инфицировании как диким типом, так и мутантным штаммом бактерии. Фосфорилированные гомодимерные формы этой киназы на третьем этапе активируют ряд своих субстратов, 4 из которых были идентифицировании. Белок Chk2 фосфорилируется, активируя тем самым чекпоинт (остановку клеточного цикла) в G2 фазе, что дает возможность клетке репарировать поврежденную ДНК при участии гиперфосфорилированного белка RPA32A. Отсутствие р~р53 говорит о том, что клетка не идет далее по пути апоптоза. Кроме классических субстратов, а также последствий, вызванных генотоксическим стрессом, нами были идентифицированы еще два белка, фосфорилированные ATM киназой в ответ на инфекцию. Это гетерогенно ядерный рибонуклеопротеин F и сплайсинг фактор аргинин/серин 3. На

четвертом этапе клетка запускает такие процессы сохранения геномного материала и выживания, как остановка клеточного цикла и репарация.

в G2 фазе

Рисунок 12 - Этапы клеточного ответа на инфекцию Я pylori

ВЫВОДЫ

1. Штамм хеликобактера, дефектный по островку патогенности, обладает генотоксическим эффектом.

2. Установлено, что инфекция Я. pylori активирует ключевую ATM киназу клеточного ответа на двунитевые разрывы ДНК в эпителиальных клетках желудка и эндометрия, независимо от наличия белка CagA.

3. Активированная ATM киназа фосфорилирует белок Chk2, регулирующий остановку клеточного цикла и RPA32A, участвующий в репарации ДНК.

4. Идентифицированы новые субстраты ATM киназы, фосфорилируемые ею в ответ на инфицирование хеликобактером: гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин F и сплайсинг фактор аргинин/серин 3.

5. ATM киназа взаимодействует белком ERK 1,2, который принимает участие в формировании фенотипа «колибри», классического морфологического ответа на инфицирование хеликобактером.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Аникеенок М.О. Обнаружение генотоксичности Helicobacter pylori ДРА1 методом ДНК-комет / М.О. Аникеенок, О.Н.Ильинская // Цитология. -2008. - Т.50 (11). - С. 1005-1008.

2.Аникеенок М.О. Вклад инфекции Helicobacter pylori в остановку клеточного цикла эукариот / М.О. Аникеенок, О.Н. Ильинская // Ученые записки Казанского государственного университета. Сер. Естественные науки. - 2009. - Т. 151, Кн. 3. - С. 56-59.

3.Anikeenok М.О. Helicobacter pylori infection induces phosphorylation of ATM/ATR substrates in host cells / M.O. Anikeenok, Y.N. Churin, T.F. Meyer, O.N. Uinskaya// World Applied Sciences Journal.- 2009. - V. 6, Supplement 2. - P. 158-161.

4.Апикеенок M.O. Характеристика токсических и генотоксических эффектов новых производных карановой и ментановой структур по отношению к бактериям / М.О. Аникеенок, JI.E. Никитина, О.Н. Ильинская // Вестник татарского отделения российской экологической академии. - 2006. -1.-С. 23-26.

5.Аникеенок М.О., Ильинская О.Н. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на генетический материал и ферментные системы микроорганизмов // Материалы междисциплинарной конференции с международным участием «Новые биокибернетические и телемедицинские технологии 21 века для диагностики и лечения заболеваний человека», -Петрозаводск, 2003. - С. 93.

6.Евтюгин В.Г., Аникеенок М.О., Ильинская О.Н. Токсические и генотоксические свойства ряда новых препаратов производных - азулена, борнана и пинена // IX Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине», - Казань, 2004.- С. 125.

7.Аникеенок М.О., Евтюгин В.Г., Ильинская О.Н. Токсические и генотоксические свойства синтезированных циклических соединений различных классов // IV Научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI века», - Казань, 2004. - С. 8.

8.Аникеенок М.О., Ильинская О.Н. Генотоксические свойства штаммов Helicobacter pylori, различающиеся по степень патогенности // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, -Новосибирск, 2008, - С. 381.

9.Anikeenok М.О., Ilinskaya O.N. Phosphorylation of ATM/ATR substrates in eukaryotic cells after infection with Helicobacter pylori II Abstr. I Conference on modern biology "Bionews", Kazan. - 2008, - P.18.

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю проф. О.Н.Ильинской за поддержку и внимательное отношение к работе; проф. Т.Ф.Майеру и доктору Ю.Н. Чурину (Институт Инфекционной Биологии Макса Планка, Берлин, Германия) за возможность проведения ряда экспериментов на базе Института; д.мл. Г.В. Черепневу (Республиканская клиническая больниц) за помощь в проведении цитометрических анализов; Монике Шмит за помощь в проведении масс-спектрометрического анализа (Институт Инфекционной Биологии Макса Планка, Берлин, Германия).

Отзывы просим направлять по факсу: (843) 238-76-Р1 (отд. аспирантуры КГУ, дис. совет Д 212.081.08).

Подписано в печать 13.05.2009 г. Бумага офсетная. Формат 60 х 84 1/16 Усл. печ. л. 1,5 Печать ризографическая. Заказ № 882. Тираж 100 экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии "GulaPrint" 420073, Казань, ул. Аделя Кугуя, 88

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Аникеенок, Марина Олеговна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Н. pylori.

1.1.1 История открытия Н. pylori.

1.1.2 Характеристика Н. pylori.

1.1.3 Распространение Н. pylori.

1.1.5 Основные гены, определяющие патогенность Н. pylori.

1.1.5 Воспалительный процесс вызванный Н. pylori.

1.2 Сигнальные пути, активируемые в клетке инфекцией Н. pylori.

1.2.1 Митоген активируемые (МА) протеинкиназы.

1.2.2 Белок CagA.

1.2.3 Фенотип «колибри».

1.3 Н. pylori как индуктор развития аденокарциномы.

1.3.1 Cag - индуцированное образование АФК и повреждение ДНК в клетках хозяина.

1.4 Активация ATM/ATR - каскада как индикатор повреждения ДНК.

1.4.1 ATM киназа.

1.4.2 Субстраты ATM.

1.4.3 ATR и ДНК-ПК.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Индукция ATM/ATR сигнального каскада в ответ на ДНК - повреждающее действие Helicobacter pylori"

Актуальность проблемы. Онкологические заболевания являются одной из основных причин смерти во всем мире, и их частота неуклонно растет. XXI век ознаменовался бурным прогрессом в познании природы злокачественных новообразований, их причин и способов предотвращения. Аденокарцинома желудка — один из наиболее распространенных типов рака в мире. Это определяет актуальность поиска причин образования предраковых патологий желудка.

Известны три основные этиологические группы агентов, вызывающие развитие рака: канцерогенные вещества, физические и биологические факторы. Роль канцерогенов химической природы, а также различного вида облучений в повреждении ДНК, мутациях и развитии злокачественных новообразований неоспорима. В месте с тем, в этиологии злокачественных опухолей важную роль играют такие факторы, как инфекционные агенты различной природы. Пятая часть раковых заболеваний во всем мире возникает в результате хронических инфекций, основными возбудителями которых являются вирусы гепатита В (рак печени), вирусы папилломы человека (рак шейки матки), Helicobacter pylori (рак желудка), шистосомы (рак мочевого пузыря), печеночные двуустки (рак желчных протоков) и вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) (саркома Капоши и лимфомы). По классификации ВОЗ, все эти агенты относятся к биологическим канцерогенам [Баженов, Баженова, 2006]. Достаточно изучена природа вирусного канцерогенеза, в то время как механизм развития рака в результате бактериальной инфекции до конца не ясен.

Существует убедительные доказательства того, что бактериальные инфекции ассоциируются с развитием различных типов рака. Например, Salmonella typhi ассоциируется с раком желчного пузыря [Vaishnavi et al., 2005; Lax, Thomas 2002; Dutta, 2002; Shukla, 2000], Streptococcus bovis - с раком толстой кишки [Biarc et al., 2004; Gold et al., 2004; Ellmerich et al., 2000; Zarkin et al., 1990], и Chlamydia pneumoniae — с раком легких [Littman et al., 2004; Koyi et al., 2001; Anttila et al., 2003]. Важные механизмы, с помощью которых бактериальные агенты могут вызывать канцерогенез, включают хроническую инфекцию и иммунную реакцию [Kuper et al., 2000]. Было показано, что некоторые бактерии выделяют токсины, нарушающие клеточный цикл, в результате чего изменяется характер роста клеток [Liftman et al., 2004; Koyi et al., 2001]. В результате повреждений ДНК, аналогичных тем, которые вызывают канцерогенные вещества, нарушается контроль нормального клеточного деления и апоптоза [Nougayrede et al., 2005; Lara-Tejero et al., 2000].

В настоящее время доказана роль Н. pylori в патогенезе гастрита, дуоденита, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, лимфомы желудка и рака желудка [Григорьев, 1999]. В то же время вопрос об абсолютной роли Н. pylori в возникновении рака желудка остается спорным, и многие специалисты не согласны с ведущей ролью этой бактерии в инициации канцерогенеза. Такие противоречия объясняются тем, что практически не изучено действие патогена непосредственно на ДНК хозяина и молекулярный статус клетки в отсутствии иммунных реакций, влияния другой микрофлоры и т. д. Понимание тонких молекулярных механизмов атаки Н. pylori на эукариотические клетки, повреждения клеточного материала, в том числе и ДНК, а также влияния на сигнальные каскады клетки позволит правомерно говорить о данной бактерии как об опасном канцерогене. Актуальность таких исследований несомненна, а установление факта генотоксичности инфекции Н. pylori обосновывает необходимость в информировании населения и проведении масштабной эрадикации данного патогена.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось установление генотоксического потенциала Н. pyloriсвязанного с активацией ATM протеинкиназы и ее субстратов в ответ на инфекцию, вызванную данным патогеном в культуре клеток аденокарциномы желудка и карциномы эндометрия человека.

В связи с поставленной целью решались следующие задачи:

2. Установить возможность активации ключевых киназ: атаксия-телеангиэктазия, мутантная (ATM), и относящаяся к атаксии-телеангиэктазии (ATR) клеточного ответа в ответ на двунитевые разрывы ДНК в клетках HeLa и AGS после инфекции Helicobacter pylori.

3. Охарактеризовать спектр известных субстратов ATM/ATR киназ, активированных инфекцией Helicobacter pylori.

Научная новизна. Впервые получены данные об активации ATM/ATR сигнального каскада, ключевого в ответе на появление двунитевых разрывов ДНК, после инфекции штаммами Н. pyori Р12 дикого типа и мутанта Н. pylori APAI, дефектного по островку патогенности, в культуре клеток аденокарциномы желудка (AGS) и карциномы эндометрия человека (HeLa). Впервые приведены результаты, указывающие на активацию целого ряда субстратов ATM киназы в ответ на инфицирование хеликобактером. С помощью молекулярных методов и методов биоинформатики впервые проведен системный анализ белков, фосфорилированных после инфицирования Н. pylori. В ходе работы идентифицированы новые, неизвестные субстраты ATM киназы, фосфорилированные после инфицирования Н. pylori. Впервые с помощью прямого метода ДНК-комет получены свидетельства наличия ДНК-повреждающего действия штамма

H. pylori APAI, что позволило показать наличие генотоксического потенциала бактерии вне зависимости от присутствия островка патогенности. Установлено, что ATM киназа принимает участие в формировании фенотипа «колибри», а также взаимодействует с внеклеточной сигнал-регулируемой киназой (ERK) - белком стрессового ответа клетки. Представленные результаты вносят вклад в понимание роли инфекции Н. pylori в молекулярном ответе атакованной клетки и ее последующей неопластической трансформации на пути развития аденокарциномы желудка.

Практическая значимость. Проведенные исследования намечают новое направление в предотвращении развития онкологических патологий эпителиальной этиологии, связанных с инфекцией Н. pylori. Особое значение имеет обнаруженный факт наличия генотоксических изменений ДНК эпителиальных клеток при инфицировании штаммом Н. pylori APAI, дефектным по островку патогенности и свидетельствующий об отсутствии связи повреждений ДНК эпителия человека и генетических детерминант патогенности, известных на сегодняшний день для хеликобактера. В ходе экспериментальной работы разработана и опробована оригинальная методика цитометрического определения фосфорилированной формы ATM киназы, позволяющая оценить уровень активации киназ после инфицирования.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводилась в соответствии с тематическим планом НИР КГУ 1.15.06 «Механизмы регуляции функциональной активности клетки». Исследования автора по тематике работы поддержаны аналитической федеральной программой «Развитие научного потенциала высшей школы», гранты № 2.1.1.1005, 2.1.1.3222, 2.1.1./920 и РФФИ 07-0401051. Авторские исследования получили персональную поддержку фонда Палаты депутатов г. Берлина (2006-2007гг.), что позволило на базе Института Инфекционной Биологии Макса Планка, (Берлин, Германия) провести цитометрические исследования, MALDI-анализ и иммунологический анализ, а также детекцию повреждений ДНК методом ДНК-комет. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.

Положения, выносимые на защиту: 1. Длительное инфицирование клеток AGS мутантным штаммом Н. pylori APAI, дефектным по островку патогенности, приводит к появлению двойных разрывов ДНК атакованной клетки.

2. Инфицирование Н. pylori Р12 культуры клеток AGS и HeLa приводит к активации ATM протеинкиназы и не приводит к фосфорилированию ATR протеинкиназы.

3. В результате запуска ATM сигнального каскада инфекцией Н. pylori активируются субстраты ATM киназы — белки чекпоинт 1 (Chkl), чекпоинт 2 (Chk2), репликационный белок 32А (RPA32A) и гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин F (hnRNP F).

4. В качестве субстрата ATM киназы, активированной в ответ на инфицирование Н. pylori, впервые идентифицирован новый белок -сплайсинг-фактор аргинин/серин 3.

5. ATM протеинкиназа вносит вклад в формирование фенотипа «колибри» — характерного морфологического изменения клеток эпителия человека при инфицировании их Н. pylori Р12.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Аникеенок, Марина Олеговна

выводы

1. Штамм хеликобактера, дефектный по островку патогенности, обладает генотоксическим эффектом.

2. Установлено, что инфекция Н. pylori активирует ключевую ATM киназу клеточного ответа на двунитевые разрывы ДНК в эпителиальных клетках желудка и эндометрия, независимо от наличия белка CagA.

Заключение

В 2003 г. исполнилось 20 лет с тех пор, когда впервые удалось выделить культуру бактерий Н. pylori. С того времени установлено, что Н. pylori является причиной развития хронического гастрита, важнейшим фактором патогенеза язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и желудка [Webb et al., 1996; Ивашкин, 2000; Goldblum et al., 2002]. Гиперплазия и метаплазия желудочного эпителия, как последствия Н. pylori инфекции, значительно увеличивают риск развития рака желудка и MALT-лимфомы [Kuipers, 1998].

Многочисленные эпидемиологические исследования выявили широкое распространение Н. pylori-инфекции - ей подвержено около 60% населения планеты, а ряд исследователей называет ее наиболее частой инфекцией человека наряду со Strepococcus mutans, вызывающим кариес [Graham, 1997].

Вместе с тем, как оказалось, лишь у небольшой части инфицированных носителей Н. pylori возникают язвы и опухоли верхних отделов желудочно-кишечного тракта. Данное обстоятельство стало причиной многочисленных споров и дискуссий о хеликобакторе, как причине злокачественных новообразований.

Исследования последних лет, направленные на изучение патогенеза Н. pylori, определили, что степень риска заболевания определяют специфические взаимодействия между самим патогеном и организмом-носителем. Эти взаимодействия, в свою очередь, напрямую зависят от штамм—специфических бактериальных факторов и эффекторов, непосредственно индуцированных у носителя. В настоящее время к главным факторам патогенности Н. pylori относят как свойства самих бактерий (колонизация слизистой оболочки желудка, адгезивность к желудочному эпителию, внутриклеточную пенетрацию, цитотоксины, островок патогенности, специфическую реакцию на стресс), так и ответную реакцию макроорганизма на инфицирование (иммунный ответ, процессы апоптоза и пролиферации в слизистой оболочке гастродуоденальной зоны, изменение моторной функции желудка) [Voland, 2003].

Более 40 генов вирулентности Н. pylori собраны в одном из сегментов хромосомы бактерии, вследствие чего данный участок получил название островка патогенности. Его маркером считается иммунодоминантный белок с молекулярной массой 120-140 кД, кодируемый цитотокин-ассоциированным геном A—cagA. Кроме того, островок патогенности содержит гены IV типа системы секреции — обязательного атрибута вирулентности. Островок патогенности присутствует у 60-70% штаммов Н. pylori. Именно с CagA ассоциируется развитие аденокарциномы желудка. CagA транслоцируется в эпителиальные клетки организма-носителя, где подвергается Src-зависимому фосфорилированию и активизирует эукариотическую фосфотазу (SHP-2), приводя к дефосфорилированию протеинов эпителиальных клеток хозяина с их последующими морфологическими изменениями — формированию фенотипа «колибри».

Воспаление, индуцированное Н. pylori, может приводить к различным формам повреждений и разрушению эпителиальных клеток. Вместе с тем, активированные воспалительным процессом нейтрофилы генерируют активные формы кислорода и азота, которые могут вызывать окислительное повреждение ДНК, или разрушение самих клеток. Однако, эти реактивные радикалы повреждают ткани организма-носителя, не имея разрушительного потенциала для инфицирующих бактерий.

Накоплено большое количество эпидемиологических данных о связи бактериальной инфекции с развитием злокачественных новообразований, но, процессы, происходящие на молекулярном уровне и повреждающие ДНК в клетке, атакованной патогеном, практически не изучены.

Непосредственная причинно-следственная связь между Н. pylori инфекцией и аденокарциномой желудка была продемонстрирована в различных исследованиях in vivo [Honda et al., 1998; Sugiyama et al., 1998; Watanabe et al, 1998].

Необходимо учитывать, что бактерия Н. pylori является не единственным фактором, влияющим на состояние слизистой оболочки желудка. Поэтому представляется более корректным изучение возможности индукции повреждений ДНК эукариотических клеток при Н. pylori инфекции в модельных системах in vitro.

Детекция активации компонентов механизма ответа клетки на повреждения ДНК, позволяет сделать вывод о генотоксичности исследуемого объекта. Ключевыми белками клетки, активирующимися в ответ на двойные разрывы ДНК, являются ATM и ATR киназы, которые, в свою очередь, активируют множество различных каскадов, приводящих к апоптозу, репарации и остановке клеточного цикла.

Инициация ATM/ATR сигнальных каскадов изучена достаточно хорошо. Однако, в литературе отсутствуют данные о запуске данных сигнальных путей в ответ на инфекцию Н. pylori. В то же время по образованию активных форм данных киназ и их субстратов можно судить о произошедшем повреждении геномного материала при инфицировании Н. pylori.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Бактериальные штаммы и клеточные культуры

Клетки инфицировали штаммом Н. pyori Р12 cag+, vac+, дикого типа, выделенные из биоптата пациента с язвой двенадцатиперстной кишки [Schmitt, Haas, 1994], и мутантом Н. pylori APAI, дефектным по наличию островка патогенности [Odenbreit et al., 2001]. В работе были использованы две линии опухолевых клеток человека: HeLa (карцинома эндометрия) и AGS (АТСС CRL 1739 аденокарцинома желудка) (коллекция Института инфекционной биологии Макса Планка, Берлин, Германия).

2.2 Питательные среды и условия культивирования

Бактерии выращивали при 37 °С на GC-arape, содержащим 10 мкг/мл ванкомицин, в микроаэрофильных условиях.

Клетки культивировали в 6 - луночных плашках со средой RPMI 1640 (Invitrogen, Германия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки о

FCS) (Biochrom, Германия), в атмосфере 5% СОг при 37 С. За 18 ч до инфицирования среду меняли среду на новую, не содержащую сыворотку.

2.3 Используемые антитела

Основные сведения об антителах, использованных в работе, представлены в таблице 1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Аникеенок, Марина Олеговна, Казань

1. Аруин, Л. И. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника Текст. / Л. И. Аруин, Л. Л. Каппулер, В. А. Исаков. — Хабаровск: Триада, 1998.- 187с.

2. Аруин, Л. И. Рак желудка Текст. / Л. И. Аруин, В. В. Власов // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол. и колопроктол. 1999. - Т.5. - С.23-25.

3. Аруин, Л. И. Хронический гастрит Текст. / Л. И. Аруин, П. Я. Григорьев, В. А. Исаков, Э. П. Яковенко. — Амстердам: Академический медицинский центр Амстердама, 1993. 362с.

4. Баженов, Л. Г. Регрессия злокачественных опухолей с помощью микроорганизмов и перспективы использования этого феномена в медицинской практике Текст. / Л. Г. Баженов, Т. Л. Баженова // Новые технологии в медицине. — СПб.: 2005. С. 111-113.

5. Баранская, Е. К. Язвенная болезнь и инфекция Helicobacter pylori Текст./ Е. К. Баранская // БОП. 2000. - Т.1. - С. 8-14.

6. Григорьев, П. Я. Показания и методы исследования больных на Helicobacter pylori Текст. / П. Я. Григорьев, В. Г. Жуховицкий, Э. П. Яковенко, Е. В. Таланова // Российский Гастроэнтерологический журнал. -1999. Т.1. - С.53-57.

7. Ивашкин, В. Т. Гастроэнтерология XXI века Текст. / В.Т. Ивашкин, Т. Л. Лапина // РМЖ. 2000. - Т. 8. - С. 697-703.

8. Комарова, Е. А. Супрессия р53: новый подход к преодолению побочных эффектов противоопухолевой терапии Текст. / Е. А. Комарова, А. В. Гудков // Биохимия. 2000.- Т. 65. - С. 48-56.

9. Кононов, А. В. Местный иммунный ответ на инфекцию Helicobacter pylori Текст./ А. В. Кононов // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол. и колопроктол. 1999. - Т. 2. -С.715-722.

10. Минушкин, О. Н. Некоторые аспекты взаимосвязи геликобактерной инфекции, полипоза и рака желудка Текст. / О. Н. Минушкин, С. Г. Бурков, Е. Г. Бурдина, А. М.Сербов // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол. и колопроктол. -2001. Т.З. - С.7-10.

11. Михельсон, В. М. Дефекты репарации ДНК и хромосом при наследственных заболеваниях человека Текст. / В. М. Михельсон // Успехи соврем, генет. 1979. - Т.8. - С.51-83.

12. Новикова, Л. Д. Экологические аспекты формирования хронического гастрита у детей Текст./ Л. Д. Новикова, Г. А. Метальникова, П. Г. Мальков // Материалы V сессии по изучению Helicobacter pylori, Омск, 1997. — С. 44— 45.

13. Окороков, А. Н. Диагностика болезней внутренних органов Текст. / А. Н. Окороков; Т. 1. Москва: Мед. лит, 1999. - 576с.

14. Островский, И. М. Роль хеликобактериоза в поражении желудка и двенадцатиперстной кишки Текст./ И. М. Островский // Терап. архив. —1998. Т.2. - С.73-76.

15. Пиманов, С. И. Эзофагит, гастрит и язвенная болезнь Текст. / С. И. Пиманов. Москва: Мед кн., 2000. — 377с.

16. Решетников, О. В. Серодиагностика хеликобактериоза в семьях Новосибирска Текст. / О. В Решетников, С. JI. Курилович // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол. и колопроктол. 1997. - Т.5. - С. 233-234.

17. Сиппонен, П. Гастрит-атрофический гастрит-кишечная метаплазия: обратима ли эта последовательность Текст. / П. Сиппонен, К. Сеппала // Рос. журн. гатроэнтерол., гепатол. и колопроктол. 1999. - Т.2. - С.30-35.

18. Чумаков, П. М. Функция р53: выбор между жизнью и смертью Текст. / П. М. Чумаков // Биохимия. 2000. -Т. 65. - С. 34-47.

19. Щербаков, П. JI. Эпидемиология инфекции Н. pylori. Текст. / Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии / В. Т. Ивашкин, Ф. Мегро, Т. Л. Лапина.- Москва: Триада X, 1999. - С.14-20.

20. Abraham, R. T. Cell cycle checkpoint signaling through the ATM and ATR kinases/ R.T. Abraham // Genes Dev. 2001. - V.l5. - P.2177-2196.

21. Abraham, R. T. Mammalian target of rapamycin: immunosuppressive drugs uncover a novel pathway of cytokine receptor signaling Text. / R. T. Abraham // Curr. Opin. Immunol. 1998. - V. 10. - P. 330-336.

22. Agami, R. Distinct initiation and maintenance mechanisms cooperate to induce G1 cell cycle arrest in response to DNA damage Text. / R. Agami, R. Bernards // Cell. 2000. - V. 102. - P. 55-66.

23. Arlett, C. F. As assessment of the radiosensitivity of ataxia-telangiectasia heterozygotes Text. / C. F. Arlett, A. Priestly // Kroc Found Ser. 1985. - V. 19. P.101-109.

24. Armstrong, J. A. Response of Campylobacter pylori to antibiotics, bismuth and an acid-reducing agent in vitro an ultrastructural study Text. / J. A. Armstrong, S. H. Wee, C. S. Goodwin, D. H. Wilson // J Med Microbiol. - 1987. -V. 24.-P. 343-350.

25. Atherton, J. С. H. pylori virulence factors Text. / J. C. Atherton // Br Med Bull. 1998. - V.54. - P. 105-120.

26. Bakkenist, C. J. DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation Text. / C. J. Bakkenist, M. B. Kastan // Nature. 2003. - V.421. - P.499-506.

27. Bartek, J. Mammalian Gl- and S-phase checkpoints in response to DNA damage Text. / J. Bartek, J. Lukas // Curr. Opin. Cell Biol. 2001. - V. 13. - P. 738-747.

28. Binz, S. K. Replication protein A phosphorylation and the cellular response to DNA damage. Text. / S. K. Binz, A. M. Sheehan, S. M. Wold // DNA Repair. 2004.-V.3.-P. 1015-1024.

29. Bizzozero, G. Uber die schlauchformigen Drusen den Magen-Darms Kanals und die Besichungen ehres Epithelis zu dem oberflachenepitel der Scheimhcuit Text. / G. Bizzozero // Arch. Mikr. Anat. 1893. - V.42. - P.83-96.

30. Bjorkholm, B. Helicobacter pylori entry into human gastric epithelial cells: a potential determinant of virulence, persistence, and treatment failures

31. Text. / В. Bjorkholm, V. Zhukhovitsky, С. Lofman, К. Hulten, H. Enroth, M. Block, R. Rigo, P. Falk, L. Engstrand // Helicobacter. 2000. - V.5. - P. 148-154.

32. Blaser, M. J. Parasitism by the "slow" bacterium Helicobacter pylori leads to altered gastric homeostasis and neoplasia Text. / M. J. Blaser, J. Parsonnet //J Clin Invest. 1994. - V.94. - P.4-8.

33. Bode, G. The coccoid forms of Helicobacter pylori. Criteria for their viability Text. / G. Bode, F. Mauh, P. Malfertheiner // Epidemiol Infect. 1993. -V.lll.-P. 483-490.

34. Bomgarden, R. D. A novel protein activity mediates DNA binding of an ATR-ATRIP complex Text. / R. D. Bomgarden, D. Yean, M. C. Yee, K. A. Cimprich // J. Biol. Chem. 2004. - V. 279. - P. 13346-13353.

35. Brown, E. J. ATR disruption leads to chromosomal fragmentation and early embryonic lethality Text. / E. J. Brown, D. Baltimore // Genes Dev. 2000. - V.14. - P.397-402.

36. Brown, K. D. The mismatch repair system isrequired for S-phase checkpoint activation Text. / K. D. Brown, A. Rathi, R. Kamath, D. I. Beardsley, Q. Zhan, J. L. Mannino, R. Bacekaran // Nat. Genet. 2003. - V.33. - P. 80-84.

37. Christmann, M. Mechanisms of human DNA repair: an update Text. / M. Christmann, M. T. Tomicic, W. P. Roos, B. Kaina // Toxicology. — 2003. -V.193. — P.31-34.

38. Churin, Y. The Helicobacter pylori CagA protein targets the c-Met receptor and enhances the motogenic response Text. / Y. Churin, L. Al-Ghoul, O. Kepp, T. F. Meyer, W. Birchmeier, M. Naumann // J. Cell Biol. 2003. - V.161. -P. 249-255.

39. Concannon, P. ATM heterozigosity and cancer risk Text. / P. Concannon // Nat. Genet. 2002. - V.32. - P. 89-90.

40. Correa, P. Carcinogenesis, apoptosis and cell proliferation Text. / P. Correa, M. J. S. Miller// Brit Med Bull. 1998. - V.54. - P. 151-162.

41. Correa, P. Human gastric carcinogenesis: a multistep and multifactorial process-First American Cancer Society Award Lecture on Cancer Epidemiology and Prevention Text. / P. Correa // Cancer Res. 1992. - V.52. - P.6735-6740.

42. Correa, P. Human gastric carcinogenesis: A multistep and multifactorial process Text. / P. Correa II Cancer Res. 1992. - V.52. - P. 6735-6740.

43. Correa, P. Phenotypic and genotypic events in gastric carcinogenesis Text. / P. Correa, Y. Shiao//Cancer Res. 1994.-V.4.-P.1941-1943.

44. Correa, P. The new era of cancer epidemiology Text. / P. Correa // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1991. - V. 1. - P. 5-11

45. Court, M. The effect of gender on Helicobacter felis mediated gastritis, epithelial cell proliferation and apoptosis in the mouse model Text. / M. Court,

46. P. A. Robinson, M. F. Dixon, A. H. T. Jeremy, J. E. Crabtree // J. Pathol. 2003. -V.211.-P. 303-313.

47. Covacci, A. Helicobacter pylori virulence and genetic geography Text. / A. Covacci, J. L. Telford, G. Giudice, J. Parsonnet, R. Rappuoli // Science. 1999. - V.284. - P.1328-1333.

48. Crabtree, J. E. Epithelial cell signalling in Helicobacter pylori infection Text. / J. E. Crabtree, M. Naumann // Curr. Signal Transduction Ther. —2006. — V.l.-P. 53-65.

49. Crespi, M. Helicobacter pylori and gastric cancer: an overrated risk? Text. / M. Crespi, F. Citarda // Scand. J. Gastroenterol. 1996. - V.3. - P. 10411046.

50. Delgado, J. D. Optical and electronic fin dings in Helicobacter pylori infection of antral mucosa Text. / J. D. Delgado, R. Rivera, J. Rios // Rev. exp. Enferm. 1990. - V.78. - P.84-85.

51. Ding, S. Z. Helicobacter pylori and mitogen-activated protein kinases regulate the cell cycle, proliferation and apoptosis in gastric epithelial cells Text. /

52. S. Z. Ding, M. F. Smith, J. B. Goldberg // J Gastroenterol Hepatol. 2008. - V.23. — P.67-78.

53. Donahue, J. P. Analysis of iceAl transcription in Helicobacter pylori Text. / J. P. Donahue, R. M. Peek, L.-J. van Doom, S. A. Thompson, Q. Xu, M. J. Blaser, G. G. Miller // Helicobacter. 2000. - V.5. - P. 1-12.

54. Dunn, В. E. Helicobacter pylori Text. / В. E. Dunn, H. Cohen, M. J. Blaser// Clin Microbiol Rev. 1997. - V.l 0. - P.720-741.

55. Dutta, U. Typhoid carriers among patients with gallstones are at increased risk for carcinoma of the gallbladder Text. / U. Dutta, P. K. Garg, R. Kumar, R. K. Tandon // Am J Gastroenterol. 2000. - V.95. - P.784-787.

56. Ellmerich, S. Promotion of intestinal carcinogenesis by Streptococcus bovis Text. / S. Ellmerich, M. Scholler, B. Duranton, F. Gosse, M. Galluser, J. P. Klein, F. Raul // Carcinogenesis. 2000. - V.21. - P.753-756.

57. Farinati, F. Oxidative DNA damage accumulation in gastric carcinogenesis Text. / F. Farinati, R. Cardin, P. Degan, M. Rugge, F. D. Mario, P. Bonvicini, R. Naccarato // Gut. 1998. - V.42. - P.351-356.

58. Fei, P. P53 and radiation responses Text. / P. Fei, W. S. El-Deiry // Oncogene. 2003. - V.22. - P.5774—5783.

59. Figura, N. Are Helicobacter pylori differences important in the development of Helicobacter /ту/оп-related diseases? Text. / N. Figura // Ital J Gastroenterol Hepatol. 1997. - V.29. - P.367-374.

60. Figura, N. Determinants of pathogenicity of Helicobacter pylori Text. / N. Figura // J Chemother. 1999. - V. 11. - P.22.

61. Figura, N. Helicobacter pylori exotoxins and gastroduodenal diseases associated with cytotoxic strain infection Text. / N. Figura // Aliment Pharmacol Ther. 1996. - V. 10. - P.79-96.

62. Fontham, E. Т. H. Preventive Nutrition Text. / Eds. A. Bendich, R. J. Deckelbaum. Totowa, New Jersey: Humana Press. 1997. - P.33-55.

63. Freston, J. N. Helicobacter pylori, acid, gastritis, atrophy and progression to cancer: a critical view Text. / J. N. Freston // Helicobacter pylori. Basic Mechanisms to Clinical Cure. London: Kluwer Acad. Publishers. 1996. - P.245-246.

64. Fung, W. P. Endoscopic, histological and ultrasrtructural correlations in chronic gastritis Text. / W. P. Fung, J. M. Papadimitriou, L. R. Matz // Am. J. Gastroenterol. 1979. - V.71. - P.269-279.

65. Garneau, D. Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein F/H Proteins Modulate the Alternative Splicing of the Apoptotic Mediator Bcl-x Text. / D. Garneau, T. Revil, J. Fisette, B. Chabot // J. Biol. Chem.- 2005. V.280. -P.22641-22650.

66. Gately, D. P. Characterization of ATM expression, localization, and associated DNA-dependent protein kinase activity Text. / D. P. Gately, J. C. Hittle, G. K. Chan, T. J. Yen // Mol. Biol. Cell. 1998. - V.9. - P. 2361-2374.

67. Genta, R. M. Helicobacter pylori as promoter intestinal metaplasia and gastric cancer: an alluring hypothesis in search of evidence Text. / R. M. Genta // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 1995. - V.l. - P. 25-30.

68. Gold, J. S. Association of Streptococcus bovis bacteremia with colonic neoplasia and extracolonic malignancy Text. / J. S. Gold, S. Bayar, R. R. Salem // Arch Surg. 2004. - V.139. - P.760-765.

69. Graham, D. Y. Can therapy even be denied for Helicobacter pylori infection? Text. / D. Y. Graham // Gastroenterology. 1997. - V.113. - P.113-117.

70. Han, J. A MAP kinase targeted byendotoxin and hyperosmolarity in mammalian cells Text. / J. Han, J. D. Lee, L. Bibbs, R. J. Ulevitch // Science. -1994. V.265. -P.808-811.

71. Handa, O. CagA protein of Helicobacter pylori: A hijacker of gastricepithelial cell signaling Text. / O. Handa, Y. Naito, T. Yoshikawa // Biochemical pharmacology. -2007. -V.73. P. 1697- 1702.

72. Handa, О. Cytotoxin-associated gene product A of Helicobacter pylori induced cellular response in rat gastric epithelial cell Text. / O. Handa, Y. Naito, T. Ishii, H. Tsuboi, S. Adachi, T. Takagi // Digestion. 2006. - V.73. - P.69-75.

73. Handa, O. Helicobacter pylori Cag A induces mitochondria dependent production of reactive oxygen species in gastric epithelial cell Text. / O. Handa, Y. Naito, T. Ishii, H. Tsuboi, S. Adachi, T. Takagi // Gastroenterology. -2006.-V.130.-P.523.

74. Hatakeyama, M. Helicobacter pylori CagA a bacterial intruder conspiring gastric carcinogenesis Text. / M. Hatakeyama // Int. J. Cancer. - 2006. - V.119. -P.1217-1223.

75. Hatakeyama, M. Oncogenic mechanisms of the Helicobacter pylori CagA protein Text. / M. Hatakeyama // Nat Rev. 2004. - V.4. - P.688-694.

76. Higashi, H. SHP-2 tyrosine phosphatase as an intracellular target of Helicobacter pylori CagA protein Text. / H. Higashi, R. Tsutsumi, S. Muto, T. Sugiyama, T. Azuma, M. Asaka, M. Hatakeyama. // Science. 2002. - V.295. — P.683-686.

77. Hill, M. J. Mechanisms of gastric carcinogenesis Text. / M. J. Hill // Europ. J. Cancer Prev. 1994. - V.3 - P.25-29.

78. Hirao, A. DNA-damage induced phosphorylation of p53 by the checkpoint kinase Chk2 Text. / A. Hirao, Y. Y. Kong, S. Matsuoka, A. Wakeham,

79. J. Ruland, H. Yoshida, D. Liu, S. J. Elledge, T. W. Мак // Science. 2000. -V.287. -P.1824-1827.

80. Holton, J. Helicobacter pylori therapy advances and opportunities Text. / J. Holton, D. Vaira, M. Menegatti, M. Miglioli. - Milano: Mosby-Wolfe, 1998. -P.53-67.

81. Honda, S. Development of Helicobacter pylori-induced gastric carcinoma in Mongolian gerbils Text. / S. Honda, T. Fujioka, M. Tokieda, R. Satoh, A. Nishizone, M. Nasu // Cancer Res. 1998. - V.58. - P.4255-4259.

82. Huang, L. Radiation-induced genomic instability and its implications for radiation carcinogenesis Text. / L. Huang, A. R. Shyder, W. F. Morgan // Oncogene. 2003. - V.22. - P.5848-5854.

83. Hunter, T. When is a lipid kinase not a lipid kinase? When it is a protein kinase Text. / T. Hunter // Cell. 1995. - V.83. - P. 1-4.

84. IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Humans. Text. // Schistosomes, Liver Flukesand Helicobacter pylori. Lyon, France. - 1994. - V.61. - P. 177-240.

85. Iftode, C. Replication protein A (RPA): the eukaryotic SSB Text. / C. Iftode, Y. Daniely, J. A. Borowiec // CRC Crit. Rev. Biochem. 1999. - V.34. -P. 141-180.

86. Iliakis, G. DNA damage checkpoint control in cells exposed to ionizing radiation Text. / G. Iliakis, Y. Wang, J. Guan, H. Wang // Oncogene. -2003. V.22. - P.5834-5847.

87. Iliakis, G. DNA damagecheckpoint control in cells exposed to ionizing radiation Text. / G. Iliakis, Y. Wang, J. Guan, H. Wang // Oncogene. -2003. V.22. - P.5834-5847.

88. Kaufmann, W. К. Cell cycle checkpoints and DNA repairpreserve the stability of the human genome Text. / W. K. Kaufmann // Cancer Metastasis Rev. 1995.- V.14. - P.31-41.

89. Kim, S. T. Involvment of the cohesin protein Smsl in ATM-dependent and independent response to DNA damage Text. / S. T. Kim, M. B. Kastan //Genes Develop. 2002. - V.16. - P.560-570.

90. Kimura, S. H. Cyclin G1 associates with MDM2 and regulates accumulation and degradation of p53 protein Text. / S. H. Kimura, H. Nojima // Genes Cell. 2007. - V.7. - P. 869-880.

91. Kolman, A. Propylene oxide and epichlorohydrin induce DNA strand bre-aks in human diploid fibroblasts Text. / A. Kolman, I. Spivak M. Naslund, M. Dusinska, B. Cedervall // Environ. Mol. Mutagen. 1997. - V.30. - P.40-46.

92. Koster, E. De. Helicobacter pylori: the link with gastric cancer Text. / E. De. Koster, M. Buset, E. Fernandes, M. Deltenre // Europ. J. Cancer Prev. — 1994.-V.3.-P.247-257.

93. Koyi, H. An association between chronic infection with Chlamydia pneumoniae and lung cancer. A prospective 2-year study Text. / H. Koyi, E. Branden, J. Gnarpe, H. Gnarpe, B. Steen // APMIS. 2001. - V.109. - P.572-580.

94. Krienitz, W. Uber das Auftreten von spirocheten vershiedener form im Mageninhalt bei Carcinoma Ventriculi Text. / W. Krienitz // Dtsch. Med. Wschr. 1906. - V.22. - P.872-882.

95. Kuchino, Y. Misreading of 8-hydroxydeoxyguanosine-containing DNA in vitro DNA replication Text. / Y. Kuchino, F. Mori, H. Kasai, S. Nishimura, H. Inoue, S. Iwai, E. Ohtsuka // In: Proceedings of the Nucleic Acids Symposium Series. 1986. - P. 157-158.

96. Kuipers, E. J. Review article: Relationship between Helicobacter pylori, atrophic gastritis and gastric cancer Text. / E. J. Kuipers // Aliment. Pharmacol. Ther. 1998. - V.12. - P.25-36.

97. Kuper, H. Trichopoulos D: Infections as a major preventable cause of human cancer Text. / H. Kuper, H. O. Adami // J Intern Med. 2000. - V.248. -P.171-83.

98. Kurz, E. U. Doxorubicin activates ATM-dependent phosphorylation of multiple downstream targets in part through the generation of reactive oxygen species Text. / E. U. Kurz, P. Douglas, L. Miller // J Biol Chem. 2004. - V.279. -P. 53272-53281.

99. Kyriakis, J. M. Mammalian mitogen-activated protein kinase signal transduction pathways activated by stress and inflammation Text. / J. M. Kyriakis, J. Avruch // Physiol. Rev. 2001. - V.81. - P.807—869.

100. Kyriakis, J. M. The stress-activated protein kinase subfamily of c-Jun kinases Text. / J. M. Kyriakis, P. Banerjee, E. Nikolakaki, T. Dai, E. A. Rubie, M. F. Ahmad, J. Avruch, J. R. Woodgett //Nature. 1994. - V. 369. - P.l56.

101. Ladeira, M. S. DNA damage in patients infected by Helicobacter pylori Text. / M. S. Ladeira, M. A. Rodrigues, D. M. Salvadori, D. M. Queiroz, D. V. Freire-Maia // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2004 - V. 13. - P.631-637.

102. Laemmli, K. U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Text. / K. U. Laemmli // Nature. 1970. - V.227. -P.680 - 685.

103. Lara-Tejero, M. A bacterial toxin that controls cell cycle progression as a deoxyribonuclease I-like protein Text. / M. Lara-Tejero, J. E. Galan // Science. 2000. - V.290. - P.354-357.

104. Lavin, M. F. The genetic defect in ataxia-telangiectasia Text. / M. F. Lavin, Y. Shiloh // Annu. Rev. Immunol. 1997. - V.l5. - P. 177-202.

105. Lax, A. J. How bacteria could cause cancer: one step at a time Text. / A. J. Lax, W. Thomas // Trends Microbiol. 2002. - V.l0. - P.293-299.

106. Lee, В. M. Benzoa.pyrene diol-epoxide-I-DNA and oxidative DNA adducts associated with gastric adenocarcinoma [Text] / В. M. Lee, J. J. Jang, H. S. Kim // Cancer Lett. 1998. - V.125. - P.61-68.

107. Lee, J. S. hCdsl-mediated phosphorylation of BRCA1 regulates the DNA damage response Text. / J. S. Lee, К. M. Collins, A. L. Brown, С. H. Lee, J. H. Chung //Nature. 2000. - V.404. - P.201-204.

108. Lee, S. H. The role of the 34-kDa subunit of human replication protein A in simian virus 40 DNA replication in vitro Text. / S. H. Lee, D. K. Kim,//J. Biol. Chem. — 1995. — V.270. P.12801-12807.

109. Lehmann, A. R. Replication of damaged DNA in mamalian cells: new solutions to the old problem Text. / A. R. Lehmann // Mutat. Res. — 2002. — V.59. -P.23-34.

110. Leunk, R. D. Cytotoxic activity in broth-culture filtrates of Campylobacter pylori Text. / R. D. Leunk, P. T. Johnson, В. C. David, W. G. Kraft, D. R. Morgan // J Med Microbiol. 1988. - V.26. - P.93-99.

111. Li, C. Mechanical stress-activated PKC delta regulates smooth muscle cell migration Text. / C. Li, F. Wernig, M. Leitges, Y. Hu, Q. Xu // FASEB J.2003. V.17. - P.2106-2108.

112. Liftman, A. J. Chlamydia pneumoniae infection and risk of lung cancer Text. / A. J. Littman, E. White, L. A. Jackson, M. D. Thornquist, C. A. Gaydos, G. E. Goodman, T. L. Vaughan // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. —2004. V.13. - P. 1624-1630.

113. Liu, Q. Chkl is an essential kinase that is regulated by Atr and required for the G2/M DNA damage checkpoint Text. / Q. Liu, S. Guntuku, X. S. Cui, S. Matsuoka, D. Cortez, K. Tamai, G. Luo, S. Carattini-Rivera, F. DeMayo,

114. A. Bradley, L. A. Donehower, S. J. Elledge // Genes Dev. 2000. - V.14. -P.1448-1459.

115. Lukas, J. Mammalian cell cycle checkpoints: signalling pathways and their organization in space and time Text. / J. Lukas, C. Lukas, J. Bartek // DNA Repair (Amst.). 2004. - V.3. - P.997-1007.

116. Lydall, D. Yeast checkpoint genes in DNA damage processing: implications for repair and arrest Text. / D. Lydall, T. Weinert // Science. 1995. — V.270. -P.1488-1491.

117. Maeda, S. Structure of cag pathogenicity island in Japanese Helicobacter pylori isolates Text. / S. Maeda, H. Yoshida, T. Ikenoue, K. Ogura, F. Kanai, N. Kato, Y. Shiratori, M. Omata // Gut. 1999. - V.44. - P.336-341.

118. Marshall, B. J. Pyloric Campylobacter infection and gastroduodenal disease Text. / B. J. Marshall, D. B. McGechie, P. A. Rogers, R. J. Glancy // Med J Aust. 1985. - V.142. - P.439-444.

119. Maser, R. S. Connecting chromosomes, crisis, and cancer Text. / R. S. Maser, R. A. DePinho // Science. 2002. - V.297. - P.565—569.

120. Mimuro, H. Grb2 is a key mediator of Helicobacter pylori CagA protein activities Text. / H. Mimuro, T. Suzuki, J. Tanaka, M. Asahi, R. Haas, C. Sasakawa // Mol Cell. 2002. - V.10. - P.745-755.

121. Nakoyma, H. RecQ family helicases: roles as the tumor suppressor proteins Text. / H. Nakoyma // Oncogene. 2002. - V.21. -P.9008-9021.

122. Naumann, M. Helicobacter /ту/on-induced pithelial cellsignalling in gastric carcinogenesis Text. / M. Naumann, J. E. Crabtree // Trends Microbiol. — 2004.-V.12.-P. 29-36.

123. Neel, B. G. SH2 domain containing tyrosine phosphatases in cell signaling Text. / B. G. Neel, H. Gu, L. Pao // Trends Biochem Sci. 2003. — V.28. - P.284-293.

124. Norbury, C. J. DNA damage-induced apoptosis Text. / C. J. Norbury, B. Zhivotovsky // Oncogene. 2004. - V.23. - P.3797-3808.

125. Nougayrede, J. P. Cyclomodulins: bacterial effectors that modulate the eukaryotic cell cycle Text. / J. P. Nougayrede, F. Taieb, J. De Rycke, E. Oswald // Trends Microbiol. 2005. - V.13. - P. 103-110.

126. Oderda, G. Mucus gel layer adherent to gastric mucosa in children with Helicobacter pylori gastritis Text. / G. Oderda, D. Dellollio, O. Form, L. Farina, K. Tavassoli, N. Ansaldi // Eur. J. Gastroenterol. Hepatoe. 1991. — V.3. -P.58-63.

127. Owen, R. F. Helicobacter species classification and identification Text. /R. F. Owen//Br Med Bull. - 1998. - V.54. - P.17-30.

128. Parsonnet, J. Risk for gastric cancer in people with cagA positive or cagA negative Helicobacter pylori infection Text. / J. Parsonnet, G. D. Friedman, N. Orentreich, H. Vogelman // Gut. 1997. - V.40. - P.297-301.

129. Peek, R. M. Helicobacter infection and gastric neoplasia Text. / R. M. Peek, J. E. Crabtree //J. Pathol. 2006. - V.208. - P.233-248.

130. Peek, R. M. Helicobacter pylori and gastrointestinal tract adenocarcinomas Text. / R. M. Peek, M. J. Blaser // Nat. Rev. Cancer. 2002. -V.2. - P.28-37.

131. Periti, P. Managing Helicobacter pylori infection in the new millenium: a review Text. / P. Periti, F. Tonelli, L. Capurso, P. Nicoletti // J. Chemotherapy. 1999. - Vol.11. - P.35-55.

132. Philips, A. V. RNA processing and human disease Text. / A. V. Philips, T. A. Cooper // Cell Mol Life Sci. 2000. - V. 57. - P. 235-249.

133. Pomorski, T. Helicobacter pylori-induced prostaglandin E(2) synthesis involves activation of cytosolic phospholipase A(2) in epithelial cells Text. / T. Pomorski, T. F. Meyer, M. Naumann // J. Biol. Chem. 2001. - V.276. -P.804-810.

134. Poundeyr, R. E. The prevalence of Helicobacter pylori infection in different countries Text. / R. E. Poundeyr, D. Ng // Aliment. Pharmacol. Ther. -1995. — V.9. P.33-39.

135. Pretolani, S. Epidemiology. In: Helicobacter pylori Text. / S. Pretolani, R. Bonvicini, G. Gasbarrini // An atlas. Ed. By London / P. Malrertheiner, P. Michetti, A. Price. 1997. - P.21-22.

136. Prokopcova, J. The role of ATM in breast cancer development Text. / J. Prokopcova, Z. Kleibl, С. M. Banwell, P. Pohlreich // Breast Cancer Res Treat. -2006. V.104. -P.121-128.

137. Pryor, J. L. Immunodetection after complete destaining of coomassie blue-stained proteins on immobilon-PVDF Text. / J. L. Pryor, W. Xu, D. W. Hamilton // Analytical biochemistry. 1992. - V.202. - P. 100-104.

138. Pulverer, B. ATMachine Text. / B. Pulverer // Nature Cell Biol. -2003. V.5. - P.96.

139. Reed, P. I. Helicobacter pylori and gastric cancer Text. / P. I. Reed // Europ. J. Cancer Prev. 1996. - V.5. - P.49-55.

140. Rohde, M. A novel sheathed surface organelle of the Helicobacter pylori cag type IV secretion system Text. / M. Rohde, J. Puis, R. Buhrdorf, W. Fischer, R. Haas // Mol Microbiol. 2003. - V.49. - P.219-234.

141. Sasajima, K. Intestinal metaplasia and adenocarcinoma induced in the stomach of rats by N-propyl-N-nitro-Nitrosoguanidine Text. / K. Sasajima, T. Kawachi, N. Marsukura // Jpn. Cancer Res Clin.Oncol. 1979. - V.94. - P.201-207.

142. Schmitt, W. Genetic analysis of the Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin: structural similarities with the IgA protease type of exported protein Text. / W. Schmitt, R. Haas // Mol. Microbiol. 1994. - V.12. - P.307-319.

143. Scott, D. The life and death of Helicobacter pylori Text. / D. Scott, D. Weeks, K. Melchers, G. Sachs // Gut. 1998. - V.43. - P.56-60.

144. Segal, E.D. Helicobacter pylori attachment to gastric cells induces cytoskeletal rearrangements and tyrosine phosphorylation of host cell proteins Text. / E. D. Segal, S. Falkow, L. S. Tompkins // Proc Natl Acad Sci USA.1996.-V.93.-P.1259-1264.

145. Selbach, M. Src is the kinase of the Helicobacter pylori CagA protein in vitro and in vivo Text. / M. Selbach, S. Moese, C. R. Hauck, T. F. Meyer, S. Backert // J. Biol. Chem.- 2002. V.277. - P.6775-6778.

146. Selbach, M. Src is the kinase of the Helicobacter pylori CagA protein in vitro and in vivo Text. / M. Selbach, S. Moese, C. R. Hauck, T. F. Meyer, S. Backert // J Biol Chem. 2002. - V.277. - P.6775-6778.

147. Selbach, M. The Helicobacter pylori CagA protein induces cortactin dephosphorylationand actin rearrangement by c-Src inactivation Text. / M. Selbach, S. Moese, R. Hurwitz, C. R. Hauck, T. F. Meyer, S. Backert // EMBO J. -2003. V.22. — P.515-528.

148. Shiloh, Y. ATM and related protein kinases: safeguarding genome integrity Text. / Y. Shiloh // Nature Reviews. 2003. - V.3. - P. 155-168.

149. Shimoyama, T. Bacterial factors and immune pathogenesis in Helicobacter pylori infection Text. / T. Shimoyama, J. E. Crabtree // Gut. 1998. -V. 43.-P.2-5.

150. Shukla, V. K. Carcinoma of the gallbladder-is it a sequel of typhoid? Text. / V. K. Shukla, H. Singh, M. Pandey, S. K. Upadhyay, G. Nath // Dig Dis Sci. 2000. - V.45. -P.900-903.

151. Smith, G. C. The DNA-dependent protein kinase Text. / G. C. Smith, S. P. Jackson // Genes Dev. 1999. - V.l3. - P.916-932.

152. Solnick, J. V. Emergence of diverse Helicobacter species in the pathogenesis of gastric and enterohepatic diseases Text. / J. V. Solnick, D. B. Schauer // Clin Microbiol Rev. 2001. - V. 14. - P.59-97.

153. Steer, H. W. Ultrastructure of cell migration through the gastric epithelium and its relationship to bacteria Text. / H. W. Steer // J.Clin.Path. -1975.-V.28.-P.639.

154. Stein, M. c-Src/Lyn kinases activate Helicobacter pylori CagA through tyrosine phosphorylation of the EPIYA motifs Text. / M. Stein, F. Bagnoli, R. Halenbeck, R. Rappuoli, W. J. Fantl, A. Covacci // Mol. Microbiol. -2002.-V.43.-P.971-980.

155. Stiff, T. ATR-dependent phosphorylation and activation of ATM in response to UV treatment or replication fork stalling Text. / T. Stiff, S. Walker, K.

156. Cerosaletti, A. Goodarzi, E. Petermann, P. Concannon, M. Driscoll, P. Jeggo// The EMBO Journal. 2006. - V. 25. - P.5775-5782.

157. Suzuki, H. Oxidative stress in Helicobacter pylori associated gastroduodenal disease Text. / H. Suzuki, T. Hibi // J Clin Biochem Nutrit. -2006. — V.39. — P.56-63.

158. Taylor, A. M. R. Ataxia telangiectasia genes and predisposition to leukemia, lymphoma and breast cancer Text. / A. M. R. Taylor // Br. J. Cancer. -1992.-V.66.-P.5-9.

159. Taylor, A. M. R. Variant forms of ataxia-telangiectasia Text. / A. M. R. Taylor, E. Flude, B. Laher, M. Stacey, E. McKay, J. Watt, S. H. Green, A. E. Harding // J. Med. Genet. 1987. - V.24. - P.669-677.

160. Torres, A. Immunological adhesion molecules on gastric mucosa. Does H. pylori, and specifically cagA+ strains influence its expression? Text. / A. Torres, G. Perez-Perez, В. M. Goreia, J. Pajares // Gut. 1995. - V.37. - P.34.

161. Vaara, M. Polycations as outer membrane-disorganizing agents Text. / M. Vaara, T. Vaara // Antimicrob Agents Chemother. 1983. - V.24. -P.l 14-122.

162. Valerie, K. Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair Text. / K. Valerie, L. Povirk // Oncogene. 2003. - V.22. - P.5792-5812.

163. Warren, J. R. Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis Text. / J. R. Warren, B. J. Marshall //Lancet. 1983. -V.l. — P.1273—1275.

164. Watanabe, Т. Helicobacter pylori infection induced gastric cancer in Mongolian gerbils Text. / T. Watanabe, M. Tada, H. Sasaki // Gastroenterology. -1998. V.l 15. -P.642-648.

165. Webb, P. M. An apparent lack of association between Helicobacter pylori infection and risk of gastric cancer in China Text. / P. M. Webb, M. C. Yu, D. Forman // Int. J. Cancer. 1996. - V.67. - P.603-607.

166. Williams, C. L. Helicobacter pylori: bacteriology and laboratory diagnosis Text. / C. L. Williams // J Infect. 1997. - V.34. - P. 1-5.

167. Wilson, M. Bacterial perturbation of cytokine networks Text. / M. Wilson, R. Seymour, B. Henderson // Infect Immun. 1998. - V.66. - P.2401-2409.

168. Wold, M. S. Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism Text. / M. S. Wold // Annu. Rev. Biochem. 1997. - V.66. - P.61-92.

169. Won, J. Small molecule-based reversible reprogramming of cellular lifespan Text. / J. Won, M. Kim, N. Kim, J. H. Ahn, W.G. Lee, S. S. Kim, K. Y. Chang, Y. W. Yi, Т. K. Kim // Nat. Chem. Biol. 2006. - V.2. - P.369-374.

170. Yoshida, N. Mechanisms involved in Helicobacter pylori-induced inflammation Text. / N. Yoshida, D. Granger, D. Evans, D. G. Evans, D. Y. Graham, D. C. Anderson, R. E. Wolf, P. R. Kvietys // Gastroenterology. 1993. -V.105. -P.1431-1440.

171. Zarkin, В. A. The triad of Streptococcus bovis bacteremia, colonic pathology, and liver disease Text. / B. A. Zarkin, K. D. Lillemoe, J. L. Cameron, P. N. Effron, Т. H. Magnuson, H. A. Pitt // Ann Surg. 1990. - V.211. - P.786-791.

172. Zarrilli, R. Molecular response of gastric epithelial cells to Helicobacter pylori-induced cell damage Text. / R. Zarrilli, V. Ricci, M. Romano // Cellular Microbiology. 1999. - V.l. - P.93-99.

173. Zernik-Kobak, M. Text. / M. Zernik-Kobak, K. Vasunia, M. Connelly, C. W. Anderson, K. Dixon // J. Biol. Chem. 1997. - V.272. -P.23896-23904.

174. Zhou, В. B. S. The DNA damage response: putting checkpoints in perspective Text. / В. B. S. Zhou, S. J. Elledge // Nature. 2000. - V. 408. -P.433-439.

175. Zvalova, D. p38/SAPK2 control gap junction closure in astrocytes Text. / D. Zvalova, J. Cordier, M. Mesnil, M. P. Junier, H. Chneiweiss // Glia. -2004. V.46. - P.323-333.

Информация о работе

Аникеенок, Марина Олеговна
кандидата биологических наук
Казань, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Индукция ATM/ATR сигнального каскада в ответ на ДНК - повреждающее действие Helicobacter pylori - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы