Инактивация вирусов искусственными рибонуклеазами

Федорова, Антонина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Инактивация вирусов искусственными рибонуклеазами
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Инактивация вирусов искусственными рибонуклеазами"

005055685

На правах рукописи

ФЕДОРОВА АНТОНИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ИНАКТИВАЦИЯ ВИРУСОВ ИСКУССТВЕННЫМИ РИБОНУКЛЕАЗАМИ

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2012

005055685

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель:

д.б.н., профессор Зенкова Марина Аркадьевна

Научный консультант:

к.б.н. Гончарова Елена Павловна

Официальные оппоненты:

Волчо Константин Петрович, д.х.н. Новосибирский институт органической химии им. Н. Н. Ворожцова СО РАН, в.н.с.

Булыгин Константин Николаевич, к.х.н. Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, с.н.с.

Ведущая организация:

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Защита состоится «12» октября 2012 г. в 1022 часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090 Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждении науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан «16» августа 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время проблема поиска новых высокоэффективных препаратов, обладающих широким спектром противовирусной активности, приобретает особую актуальность в связи с развитием у многих вирусов устойчивости к действию применяемых в медицинской практике лекарственных средств, а также их высокой токсичностью. Химические реагенты, обладающие противовирусной активностью, можно разделить на 2 типа: специфические реагенты, оказывающие влияние на какой-либо этап жизнедеятельности вируса и/или избирательно действующие на определенный вирусный компонент (ингибиторы вирусных ферментов и др.), и химические агенты, взаимодействующие с широким спектром типовых компонентов вирусной частицы и вызывающие инактивацию вируса (например, взаимодействие с липидной мембраной или поверхностными белками/гликопротеидами). Реагенты первого типа являются основой современной противовирусной терапии, а их неоспоримым преимуществом является высокий уровень специфичности, проявляемой по отношению к целевым вирусам. Однако их применение часто ограничено вследствие развития у вируса устойчивости к действию данного специфического реагента, что является результатом мутаций, характерных для вирусов некоторых семейств (вирусы гриппа и иммунодефицита человека и др.). Несмотря на успехи современной науки к настоящему моменту эффективные противовирусные средства найдены только против небольшого числа вирусов.

В связи с этим, искусственные рибонуклеазы (низкомолекулярные соединения, способные расщеплять фосфодиэфирные связи в РНК) представляют особый интерес, поскольку, наряду с высокой рибонуклеазной активностью in vitro, они обладают рядом уникальных свойств: а) проявляют высокую противовирусную активность по отношению к вирусу гриппа; б) не токсичны для человека, работают в водных условиях; в) являются низкомолекулярными соединениями и, следовательно, могут обладать возможностью проникать в капсиды вирусов.

Целью настоящей работы являлось исследование механизма противовирусной активности искусственных рибонуклеаз по отношению к вирусам с различной структурой. В ходе исследования решались следующие задачи:

- исследовать противовирусную активность аРНКаз по отношению к безоболочечным РНК-вирусам энцефаломиокардита мышей (EMCV) и острого паралича пчел (ABPV);

-изучить механизм противовирусной активности аРНКаз по отношению к оболочечному РНК-вирусу гриппа, а также EMCV и ABPV;

-исследовать способность аРНКаз взаимодействовать с липидными мембранами и белками;

- оценить вклад рибонуклеазной активности в противовирусную активность аРНКаз.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые установлено, что аРНКазы обладают способностью инактивировать

безоболочечные РНК-вирусы ABPV и EMCV. Установлено, что механизм инактивации вирусов заключается в расщеплении их РНК-генома после проникновения аРНКаз в вирусные частицы, при этом морфология капсида безоболочечных вирусов после их инактивации остается неизменной.

Впервые установлено, что аРНКазы инактивируют ДНК-содержащий вирус осповакцины. Показано, что аРНКазы обладают способностью дестабилизировать структуру белковых молекул (хаотропная активность), что обеспечивает проникновение этих соединений в плотные рибонуклеопротеидные комплексы вирусов. Установлено, что аРНКазы обладают способностью взаимодействовать с липидными мембранами, что обеспечивает как их проникновение в вирусные частицы, содержащие мембраны, так и разрушение мембран, приводящее к инактивации вирусов.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты работы представлены на конференциях: «Antivirals Congress» (Амстердам, Нидерланды 2010); «8th RNase Congress» (Неаполь, Италия 2010); «Молекулярные основы инфекционных заболеваний» (Новосибирск, Россия 2011); «Influenza 2011. Zoonotic influenza and human health» (Оксфорд, Англия 2011); «IUBMB&FEBS Congress» (Севилья, Испания 2012).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 150 страницах, содержит 41 рисунок и 8 таблиц. Библиография содержит 219 литературных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Искусственные рибонукпеазы, использованные в работе

Искусственные рибонуклеазы (аРНКазы) являются синтетическими молекулами (700 - 1300 Да), которые обладают следующими свойствами: а) способны расщеплять фосфодиэфирные связи в РНК in vitro, а геном многих патогенных для человека и животных вирусов (вирусы гриппа, иммунодефицита человека, ящура и др.) представлен в виде РНК; б) не чувствительны к точечным изменениям последовательности РНК; в) расщепляют РНК в физиологических условиях.

В данной работе противовирусную активность исследовали для аРНКаз, проявляющих наибольшую рибонуклеазную активность (синтезированы ранее в лаборатории органического синтеза ИХБФМ СО РАН). Функционально аРНКазы имитируют РНКазу А: с наибольшей скоростью расщепляют РНК по фосфодиэфирным связям в Руг-А мотивах (5'-С-А-3' и 5'-U-A-3'), расположенным в одноцепочечных участках и в районах с лабильной вторичной структурой. По структуре исследованные аРНКазы относятся к трем сериям (Рис. 1):

1) соединения ABL3C3, ABL3C1, R-D-2 и K-D-1 содержат N-замещенный гидрофобным фрагментом остаток 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана (DABCO), обладающий сродством к межнуклеотидным фосфатам РНК, и функциональные

группы, способные катализировать расщепление фосфодиэфирных связей в РНК (гистидин в АВЬЗСЗ и АВ13С1; аргинин и глутаминовая кислота в Я-О-2; лизин и глутаминовая кислота в К-О-1);

2) соединения серии Бхп (Ои-12, Ор12, ВЗ-12 и Ор12Р6) содержат два остатка Ы-замещенного гидрофобным фрагментом ОАВСО, соединенные линкерами различной степени жесткости; не содержат функциональных групп, способных катализировать реакцию трансэтерификации;

3) пептидоподобные соединения Ь2-3 и К-2, состоящие из аминокислот и гидрофобных фрагментов.

2сг 2вг

ИгС„Н„

n^o.c10h2, но

н U

м^о-с10нг,

Рис. 1. Структура аРНКаз, использованных в работе (названия указаны в рамочках).

Ранее установлено, что инкубации вируса гриппа с ABL3C3 приводит к его инактивации, а в липидной оболочке вируса происходит образование небольших разрывов, но целостность вирусной частицы сохраняется. В отличие от вируса гриппа, частицы безоболочечных вирусов, не содержащие липидной оболочки, представляют собой плотный рибонуклеопротеидный комплекс, поэтому возможность проникновения химических веществ в них ограничена. Изучение способности аРНКаз инактивировать безоболочечные РНК-вирусы проводили с использованием вирусов острого паралича пчел (ABPV, семейство Dicistroviridaé) и энцефаломиокардита мышей (EMCV, семейство Picornaviridaé).

2. Противовирусная активность аРНКаз по отношению kABPV

2.1 In vivo скрининг на модели ABPV/личинки пчел Apis Mellifera

Клеточная модель для работы с ABPV отсутствует. Но ранее была разработана методика культивирования личинок пчел in vitro, с использованием которой в настоящей работе оценивали противовирусную активность аРНКаз in vivo\ после обработки ABPV аРНКазами проводили инъекции этих препаратов выращенным in vitro личинкам пчел, после чего наблюдали за изменением фенотипа модельных животных.

В течение первых 7 дней жизни личинки пчел увеличивают свой вес с 0.1 до 150 мг, а наиболее быстрое увеличение веса происходит в период с 4 по 7 день (Рис. 2А). Личинки с наименьшей массой собирали из сот и выращивали в течение 4 дней на питательной среде в инкубаторе при 35°С (Рис. 2А) до достижения ими массы 40-60 мг, при которой особи способны переносить инъекции (1 мкл), производимые в их спинную область с использованием микрокапилляра (Рис. 2Б). После инъекций PBS личинки развивались нормально (Рис. 2В) и внешне не отличались от личинок без инъекции (Рис. 2А). Введение ABPV вызывало гибель особей в течение 24 ч, а цвет их кутикулы менялся на коричнево-черный или молочно-белый (Рис. 2Г).

Рис. 2. Культивирование личинок пчел in vitro. А. Динамика изменения размера личинок. Б. При массе 4060 мг личинки легко переносят инъекции,

производимые микро-

капилляром. Личинки через 24 ч п.и. PBS (В) и ABPV (Г).

2.2 Токсичность аРНКаз

На первом этапе исследовали токсичность аРНКаз для личинок пчел. Для этого личинкам (8-10 особей в группе) вводили раствор аРНКазы в PBS (1 мкл). Контрольную группу оставляли без инъекций (б.и.), другая группа получала инъекции PBS. Через 24 ч п.и. оценивали фенотип, уровень выживаемости и набор экспрессируемых в гемолимфе личинок белков. Как видно из Таблицы 1, аРНКазы малотоксичны для личинок: уровень их выживаемости после инъекций 0.4 мМ Dpl2F6 составил 88±3% и был сопоставим с выживаемостью личинок п.и. PBS (95±7%), а также личинок без инъекции (б.и., 100%). Сходные данные получены для K-D-l, D3-12 и L2-3 (100, 82±6 и 94±4, соответственно).

Таблица 1. Выживаемость личинок через 24 ч п.и. растворов аРНКаз.

аРНКаза [аРНКаза], мМ Уровень выживаемости, %

Dpl2F6 0.4 88±3

D3-12 0.4 82±6

K-D-l 1 100

L2-3 1 94±4

PBS - 95±7

б.и. - 100

2.3 Противовирусная активность аРНКаз по отношению к ABPV

ABPV в концентрации 100 Ь05г/мкл инкубировали in vitro в присутствии одной из аРНКаз (18 ч, 37°С) или в отсутствие соединений (контроль), вирусную суспензию разводили в PBS 1:10, и проводили инъекции личинкам (10LD50, 103 вирусных частиц). Выживаемость особей через 24 ч п.и. PBS составила 95±7%, а после инъекций контрольного ABPV все личинки погибали (Таблица 2).

Три из пяти аРНКаз обладают противовирусным действием (Таблица 2). Уровень выживаемости личинок через 24 ч п.и. 10 LD50 ABPV, инкубированного с 10 мкМ D3-12 или 4 мкМ Dpl2F6, составил 95±4 и 89±19%, соответственно. Уровень выживаемости личинок через 24 ч п.и. ABPV, предварительно инкубированного с 1 мМ К-D-l, составил 77±25%. L2-3 и ABL3C3 не проявляют противовирусную активность по отношению к ABPV (Таблица 2).

Таблица 2. Противовирусная активность аРНКаз по отношению к ABPV.

аРНКаза Инактивация ABPV

[аРНКаза], мМ Уровень выживаемости личинок, %

Dpl2F6 0.004 89 ± 19

D3-12 0.01 95 ±4

К-D-l 1 77 ±25

L2-3 1 0

ABL3C3 0.5 0

Контроль ABPV - 0

PBS - 95 ±7

В дальнейших экспериментах наряду с личинками использовали молодых пчел. Зависимость выживаемости личинок (10 особей в группе) и пчел (20 особей в группе) от концентрации аРНКаз D3-12 и Dpl2F6, использованных для инактивации вируса, показана на Рис. 3. Через 24 ч п.и. инкубированного с D3-12 (>40 мкМ) вируса личинкам (10 LD50) уровень выживаемости особей составил более 90%. При концентрации 1 мкМ D3-12 не обладает противовирусной активностью. Соединение Dpl2F6 проявляет противовирусную активность в более широком диапазоне концентраций (Рис. 3): высокий уровень выживаемости наблюдали через 24 ч п.и. 10 LD50 ABPV, инкубированного с 4 мкМ Dpl2F6. Сходные результаты получены на пчелах, которым проводили инъекции 100 LD50 ABPV, инкубированного в указанных условиях (Рис. 3).

Фенотип особей после инъекций инактивированного вируса (Рис. 4А, лунки в) совпадал с фенотипом личинок б.и. и п.и. PBS (Рис. 4А, лунки а, б). Инъекции не полностью инактивированного вируса приводили к проявлению фенотипа у части личинок (Рис. 4А, лунки г), сходного с фенотипом инфицированных особей (Рис. 4А, лунки д-ж), а у других личинок фенотип совпадал с личинками б.и.

Анализ белков, экспрессируемых в гемолимфе личинок, подтвердил отсутствие инфекции в группах, где наблюдали наибольший уровень выживаемости особей (Рис. 4Б, личинки 1, 2). Но набор белков значительно менялся для личинок, которые погибали после инъекции не полностью инактивированного вируса (Рис. 4А, личинки 3, 4): в личинках индуцируется

синтез личинки

белков, характерных для зараженных ABPV особей (Рис. 4А, 4-10).

Рис. 3. Противовирусная активность Dpl2F6 и D3-12 по отношению к ABPV. Личинок (белые столбики) и пчел (серые столбики) оставляли без инъекций (б.и.), проводили инъекции PBS, ABPV нативного, ABPV, инкубированного без аРНКаз (Контроль ABPV), ABPV, инкубированного с D3-12 или Dpl2F6 (18 ч, 37°С); • - Р, <0.01; О -Р, > 0.05; ▲ - Яг<0.01; А -Р2> 0.05, ■ - Л <0.01, о -Р3 > 0.05.

б.и. ABPV Контроль натив ABPV

Dp12F6. мкМ

ABPV * Dp12F6, мкМ

OJ_„_0.04 нативный

6 " 7 В Т ЯГ ABPV

VP1 VP2 VP3

Рис.4. Эффективность инактивации ABPV аРНКазой Dpl2F6. А. Фенотип личинок (группы обозначены буквами) через 24 ч п.и. PBS или ABPV, инкубированного с Dpl2F6 (концентрация указана слева) или в отсутствие Dpl2F6 (Контроль ABPV) и личинок без инъекции (б.и.). Б. Анализ набора белков, экспрессируемых в гемолимфе личинок (указаны цифрами в А) п.и. ABPV, инкубированного с аРНКазами. ABPV - положение белков капсида. Положение белков капсида, синтезируемых в инфицированных ABPV личинках показано стрелками. Молекулярные массы референтных белков стандартного размера указаны слева.

3. Противовирусная активность аРНКаз по отношению к EMCV

Аналогичные исследования эффективности инактивации безоболочечного РНК-вируса проводили с использованием EMCV. Противовирусное действия

аРНКаз оценивали на клеточной модели in vitro: после инкубации EMCV (105-108 БОЕ/мл) в присутствии или в отсутствие аРНКаз (37°С, 0^48 ч) титр вируса определяли методом подсчета количества бляшкообразующих единиц. Полученные результаты (Таблица 3) хорошо согласуются с данными по инактивации ABPV. Наибольшую активность проявляла аРНКаза Dtrl2 (аналог Dpl2F6 и D3-12): полную инактивацию наблюдали после инкубации вируса (-10 БОЕ/мл) с 0.05 мМ Dtrl2 в течение 48 ч. Другие соединения серии Dxn были менее активны: инкубация EMCV в присутствии Dpl2, Dpl2F6, D3-12 хотя и приводила к снижению его инфекционное™, однако полной инактивации вируса не наблюдали. Инкубация EMCV с 0.5 мМ ABL3C3 не только не приводила к инактивации вируса, но и способствовала сохранению его инфекционности: титр вируса значительно не менялся в течение 96 ч инкубации, в то время, как в контроле происходило его снижение не менее, чем на 3 log,0. Пептидоподобные аРНКазы L2-3 и К-2 показали отсутствие противовирусной активности.

Таблица 3. Противовирусная активность аРНКаз по отношению к EMCV._

Инактивация EMCV

аРНКаза IC50, мМ Эффективная Титр вирусной суспензии,

концентрация, мМ ^ю(БОЕ/мл )

ABL3C3 0.08 0.5 6±0.1

ABL3C1 0.125 0.5 6±0.1

L2-3 > 1 1 5±0.2

К-2 > 1 0.5 6±0.15

Dtrl2 0.025 0.05 <1

Dpl2F6 0.1 0.05 3.4±0.2

D3-12 0.013 0.5 3.5±0.2

Dpl2 0.02 0.5 4±0.5

R-D-2 0.1 0.1 5±0.2

KD-1 0.1 0.1 5±0.3

Контроль 5±0.3

Было установлено, что с увеличением концентрации Dtrl2 происходит увеличение эффективности и скорости инактивации вируса (Рис. 5): через 72 ч инкубации в присутствии 0.02 мМ Dtrl2 титр EMCV снижался с ~ 106 БОЕ/мл до ~ 10 БОЕ/мл, однако при концентрации 0.05 мМ уже через 24 ч титр вируса составлял ~102 БОЕ/мл, а полная инактивация достигалась через 48 ч. Важно отметить, что концентрация, при которой наблюдали полную инактивацию вируса (0.05 мМ), превышает концентрацию, при которой Dtrl2 с наибольшей эффективностью расщепляет РНК in vitro (0.01 мМ). Поскольку в основе предполагаемого механизма инактивации вируса лежит проникновение аРНКазы в вирусную частицу и расщепление геномной РНК, то такая разница концентраций может быть обусловлена ограничениями, налагаемыми на молекулу при проникновении в вирус: ограниченная доступность генома вируса для действия аРНКаз препятствует достижению необходимой для расщепления концентрации аРНКазы в вирусной частице, а увеличение концентрации Dtrl2

могло обеспечить достижение эффективной концентрации аРНКазы вблизи вирусной РНК.

Рис. 5. Зависимость кинетики инактивации ЕМСУ от концентрации ЕМСУ

инкубировали в присутствии 01x12 (черные столбики) или в отсутствие соединения (белые столбики) в течение 0-72 ч, 37°С.

[Dtr12l. мМ 0 02 0.05

4. Противовирусная активность аРНКаз по отношению к вирусу гриппа Ранее было показано, что аРНКаза ABL3C3 обладает способностью инактивировать вирус гриппа А WSN ЗЗ/HINI (семейство Orthomyxoviridae). В настоящей работе мы изучили эффективность инактивации вируса под действием аРНКаз Dtrl2 и L2-3, а в качестве положительного контроля использовали инактивацию вируса аРНКазой ABL3C3 (Таблица 4).

аРНКаза Рибонуклеазная активность in vitro, [аРНКаза], мМ Инактивация вируса гриппа А »м йяга

ABL3C3 0.1 0.4 <1

Dtrl 2 0.01 0.02 <1

L2-3 1 1 <1

Контроль - - 5.2

Инкубация вируса гриппа (Ю6ФОЕ/мл) с ABL3C3, Dtrl2 и L2-3 в концентрации 0.4, 1 и 0.02 мМ (18 ч, 37°С), соответственно, приводила к его полной инактивации (Таблица 4).

Для исследования влияния рибонуклеазной активности ABL3C3 на ее противовирусную активность мы изучили зависимость эффективности инактивации вируса гриппа от концентрации соединения и сравнили ее с профилем рибонуклеазной активности соединения. Так, ABL3C3 обладает колоколообразным профилем рибонуклеазной активности in vitro: наибольшая эффективность расщепления модельной РНК (90% за 18 ч) достигается при концентрации 0.1 мМ, но при ее снижении или повышении наблюдается снижение эффективности расщепления РНК (Рис. 6А). Снижение рибонуклеазной активности ABL3C3 при концентрации выше 0.1 мМ объясняется образованием мицеллярных комплексов, однако при концентрации 0.1 мМ соединение не инактивирует вирус гриппа (Рис. 6Б), и его полная инактивация достигается только при концентрации 0.4 мМ. По всей видимости, ABL3C3 обладает ограниченной возможностью проникновения в вирусную частицу, и при необходимой для расщепления фосфодиэфирных связей

концентрации (0.1 мМ), оптимальная концентрация аРНКазы вблизи РНК вируса не достигается.

5. Механизм инактивации вирусов аРНКазами

Поскольку аРНКазы АВЬЗСЗ и Ь2-3 не обладают противовирусной активностью в отношении безоболочечных АВРУ и ЕМСУ, однако обладают высокой противовирусной активностью по отношению к вирусу гриппа, то можно предположить, что данные соединения либо являются высокоспецифичными по отношению к этому вирусу, либо структурные особенности строения вирусных частиц гриппа (наличие липидной мембраны) вносят главный вклад в их противовирусную активность. С другой стороны, Б1г12 инактивирует как безоболочечный ЕМСУ, так и оболочечный вирус гриппа, следовательно, наличие липидной мембраны не является лимитирующим фактором для проявления данным соединением противовирусной активности.

Для установления механизма инактивации вирусов аРНКазам необходимо было определить: 1) происходит ли проникновение аРНКаз в вирусные частицы;

2) происходит ли расщепление вирусной РНК в процессе инактивации вирусов;

3) нарушается ли морфология капсида безоболочечных вирусов; 4) какое значение имеют разрывы, ранее детектированные в мембране оболочечного вируса гриппа после обработки аРНКазами.

Исследование сохранности генома РНК-вирусов, инактивированных аРНКазами, проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР); исследование морфологии вирусных частиц проводили методом электронной микроскопии (ЭМ).

5.1 ОТ-ПЦР анализ вирусной РНК

Амплификацию фрагментов геномов вирусов проводили для РНК, выделенных из образцов вирусных суспензий, которые предварительно инкубировали в присутствии Ор12Р6 в случае АВРУ, 01г12, Ь2-3 и АВЬЗСЗ в случае ЕМСУ и вируса гриппа, а также вирусов, инкубированных в отсутствие

В случае ЕМСУ и АВРУ отсутствие потерь на этапах выделения РНК, проведения ОТ и ПЦР контролировали с помощью внутреннего стандарта -мРНК гена МОЮ человека, не имеющей гомологии с последовательностью геномов АВРУ и ЕМСУ (РНК МОЯ1 добавляли к вирусу непосредственно перед выделением вирусной РНК).

Поскольку достоверные данные о структурной организации вирусных РНК АВРУ и ЕМСУ внутри капсидов вирусов отсутствуют, и невозможно предсказать

Рис. 6. А Зависимость эффективности расщепления РНК in vitro от концентрации ABL3C3. Б Зависимость эффективности инактивации вируса гриппа от концентрации ABL3C3 (18 ч, 37°С).

от

аРНКаз.

какие участки будут наиболее чувствительны к действию аРНКазы, проводили амплификацию различных фрагментов вирусных РНК (Рис. 7 А, Д). В отличие от EMCV и ABPV, геном вируса гриппа А представлен восемью молекулами РНК, поэтому при анализе РНК вируса гриппа проводили амплификацию полноразмерных фрагментов вирусных РНК.

Инкубация ABPV в присутствии Dpl2F6 приводила к значительному снижению эффективности амплификации продуктов длиной 779 и 773 нт (Рис. 7В, Г) по сравнению с контролем, но не продукта длиной 516 нт (Рис. 7Б). Поэтому снижение инфекционности вируса, наблюдаемое после обработки ABPV аРНКазой Dpl2F6, является результатом разрушения вирусной РНК, что предотвращает репликацию вируса. Инкубация EMCV в присутствии 0.1 мМ Dtrl2 приводила к полному исчезновению продукта длиной 999 п.о. (Рис. 4Ж), но не продуктов длиной 487 и 286 п.о. (Рис. 7Е, 3). Поскольку инкубация EMCV в этих условиях приводила к полной инактивации вируса, то это подтверждает предложенный механизм инактивации, основанный на расщеплении геномной РНК вируса. Разная доступность определенных районов РНК ABPV и EMCV для действия аРНКаз, по всей видимости, объясняется разной плотностью упаковки РНК внутри вирусных частиц, наличием РНК-белковых взаимодействий, а также влиянием вторичной и третичной структур РНК. Инкубация EMCV в присутствии L2-3 и ABL3C3, не инактивирующих вирус, не влияла на эффективность амплификации продуктов ПЦР (Рис. 7Е-3).

А Д и м

Е Г" __ _

4T0 'iPMeiri^! М L Pw-17 in .

31 Л "И 31' „„ ?W7?« JS ?

«с

Э 3' 33 3' 31 29 3' 31 33

'шйй-.

... .1 iw'3 i W5 27 2? 2i it 2?

я.™

— ' < • >1 !■»# I ltJV* 1 fij* nf. — — - — Ml KVj

Рис. 7. Анализ вирусных РНК, выделенных из инактивированных аРНКазами вирусов. Расположение продуктов амплификации в геномных РНК АВРУ (А) и ЕМСУ (Д). Результаты ОТ-ПЦР анализа РНК АВРУ, инкубированного с Ор12Р6 (Б-Г), и ЕМСУ, инкубированного с 01г12, 12-3, ЛВЬЗСЗ (Е-3), вируса гриппа, инкубированного с АВЬЗСЗ, Шг12, Ь2-3 (И). мРНК МОЮ - внутренний стандарт. Цифры сверху - количество циклов амплификации и концентрация аРНКазы, использованная для инактивации. Контроль - вирус, инкубированный в условиях инактивации, но в отсутствие аРНКаз. "Ь" - молекулярный маркер длин продуктов, указанных сбоку от каждого геля.

Инкубация вируса гриппа в присутствии 1 мМ АВЬЗСЗ приводила к исчезновению продуктов амплификации фрагментов генов ЫА и ЫР, а уровень амплификации продуктов, соответствующих генам М и N8, был понижен (Рис. 7И). После инкубации вируса гриппа в присутствии 0.1 мМ Б1г12 наблюдали сходное снижение уровня амплификации продуктов,

соответствующих генам М, N8, КА и ЫР вируса. Однако инкубация вируса в присутствии 1 мМ Ь2-3 (условия полной инактивации вируса) не приводила к разрушению вирусных РНК: уровень амплификации РНК был сравним с интенсивностью в контроле. Таким образом, для соединений АВЬЗСЗ и Огг12, но не для аРНКазы Ь2-3 подтвержден предложенный механизм инактивации вируса гриппа посредством разрушения его геномной РНК. Инактивация вируса гриппа аРНКазой Ь2-3 протекает по другому, возможно, более специфическому механизму, который требует специального изучения.

5.2 Морфология вирусных частиц после инактивации аРНКазами

ОТ-ПЦР анализ подтвердил, что инактивация АВРУ в присутствии Ор12Р6, ЕМСУ - в присутствии Г)1г12, вируса гриппа - в присутствии Оц-12 или АВЬЗСЗ характеризуется расщеплением геномных РНК вирусов. Ранее показано, что при инкубации вируса гриппа с АВЬЗСЗ происходит возникновение разрывов в мембране вирусных частиц, которые могут играть роль «депо» для молекул аРНКазы, позволяя им проникать в вирусные частицы и расщеплять РНК. Факт разрушения РНК безоболочечных вирусов позволяет предположить, что молекулы аРНКазы способны взаимодействовать с белками капсида, покрывающими РНК. Поэтому методом электронной микроскопии (ЭМ) исследовали морфологию частиц АВРУ в процессе инактивации аРНКазой Ор12Р6.

Исследование образцов АВРУ, инкубированного с Эр12Р6 в течение 5, 8, 12 и 18 ч при 37°С, показало, что вирусные частицы сохраняют свой размер (диаметр 20-30 нм), сферическую симметрию (Рис. 8Д, Ж, И, Л), не обнаруживается видимых нарушений морфологии капсида в сравнении с нативным вирусом (Рис. 8А) и вирусом, инкубированным в отсутствие аРНКаз (Рис. 8Б, Г, Е, 3, К). Были обнаружены вирусные частицы плотно прилегающие к

виде нитевидных сгустков и

Рис. 8. Электронные

микрофотографии суспензий интактного АВРУ и инактивированного Ор12Р6 вируса. А. Нативный вирус. Б. Контрольный вирус,

инкубированный в отсутствие Ор12Р6 (18 ч). В. аРНКаза Ор12Р6. Г-Л. Морфология частиц АВРУ после инкубации в отсутствие (Г, Е, 3, К) и в присутствии Ор12Р6 (Д, Ж, И, Л) в течение 5, 8, 12, 18 ч, соответственно. Бар 50 нм.

аРНКазе Ор12Р6, которая визуализируется в агрегатов размером до 1 мкм (Рис. 8В).

Для того чтобы установить, происходит ли разрушение вирусных частиц во время их инкубации в присутствии Dpl2F6, а фрагменты разрушенного вируса являются неразличимыми в негативно окрашенных образцах, мы оценили динамику изменения концентрации частиц ABPV в процессе инкубации в присутствии и в отсутствие Dpl2F6 в течение 0, 8 и 24 ч с использованием латексных частиц с известной концентрацией. Концентрация частиц ABPV в контроле после инкубации в течение 0, 8 и 24 ч составила ~107 частиц/мл, а инкубация ABPV с Dpl2F6 в течение 8 и 24 ч приводила к небольшому снижению концентрации вируса, которая составила -5-7x10 частиц/мл (в пределах экспериментальной ошибки метода). То есть после инкубации ABPV в присутствии Dpl2F6 не происходит заметного изменения его концентрации. Таким образом, можно заключить, что Dpl2F6 «разрыхляет» белки капсида и проникает в вирусную частицу, где взаимодействует с РНК и вызывает ее расщепление, что приводит к инактивации вируса.

6. Хаотропная и мембранолитическая активности аРНКаз Все исследованные соединения обладают высокой рибонуклеазной активностью in vitro, а для взаимодействия с вирусной РНК аРНКазы должны преодолеть физический барьер - плотную белковую оболочку капсидов или липидные мембраны. Можно предположить, что противовирусная активность аРНКаз по отношению к вирусам с различным строением (содержащим и не содержащим липидную мембрану) зависит от трех типов активностей:

а) рибонуклеазной активности, обеспечивающей расщепление геномной РНК;

б) хаотропной активности, которая нарушает взаимодействие белков капсида и обеспечивает доступ аРНКазы к генетическому материалу вируса;

в) мембранолитической активности, которая обеспечивает локальное разрушение мембран оболочечных вирусов, что способствует проникновению аРНКаз в вирусные частицы. Для подтверждения наличия этих активностей и оценки вклада каждой из них в противовирусную активность аРНКаз использовали следующие модельные системы:

-оценку хаотропной активности проводили с использованием системы, позволяющей изучить способность аРНКаз изменять третичную структуру и снижать каталитическую активность флэп-эндонуклеазы hFEN-1;

- оценку мембранолитической активности проводили путем определения эффективности лизиса мембран эритроцитов барана в присутствии аРНКаз. 6.1 Определение хаотропной активности аРНКаз 6.1.1 Описание модельной системы

Хаотропные агенты обладают способностью разрушать внутримолекулярные нековалентные взаимодействия (водородные связи, ван-дер-ваальсовы и гидрофобные взаимодействия), приводя к потере молекулами белков их пространственной структуры. В настоящей работе для оценки способности аРНКаз вызывать изменение пространственной структуры (далее - хаотропная активность) мы использовали систему, разработанную к.х.н. П.Е.Воробьевым (Лаборатория бионанотехнологий, ИХБФМ СО РАН): олигонуклеотид h2 образует стабильную в стандартных условиях шпильку, а олигонуклеотид ONT26

5'[ Р]

частично комплементарен одноцепочечному фрагменту этой шпильки и на своем 5'-конце содержит [32Р]-метку, а ЬРЕКМ (11рЕЫ-1 любезно предоставлена д.б.н. С.Н. Ходыревой, лаборатория БХФ, ИХБФМ СО РАН) за счет 5'-флэп эндонуклеазной активности вносит разрыв в ОЫТ26, что приводит к отщеплению ON52 (Рис. 9). За хаотропную активность принимали снижение эффективности расщепления ОЫТ26 ферментом после его инкубации в присутствии аРНКаз по сравнению с контролем - ферментом, инкубированным в тех же условиях, но в отсутствие аРНКаз.

Рис. 9. Модельная система для оценки хаотропной активности аРНКаз. Расщепление 5'-[32Р]-ОЫТ26 флэп-эндонуклеазой ЬРЕТЧ-1 приводит к образованию ОК52, сайт расщепления указан красной стрелкой.

Было установлено, что после инкубации ЬРЕ1Ч-1 в течение 60 мин при 37°С эффективность расщепления ОЫТ26 этим фермента снижается с 45 до 31%, в то время как инкубация ЬРЕК-1 при 4°С не приводит к потере активности фермента (Рис. 10). В связи с этим эффективность расщепления ОЫТ26 контрольным ферментом, инкубированным в отсутствие аРНКаз при 37°С, принимали за 100%.

Рис. 10. Кинетические зависимости эффективности расщепления 5'-[32Р]-ОЫТ26 флэп-эндонуклеазой ЬРЕМ-1 после ее инкубации при 4°С (•) или 37°С (П).

->12

0 5 15 30 45

Время, мим.

6.1.2 Инактивация Ы'ЕЫ-1 аРНКазами и мочевиной

После инкубации ЬРЕМ-1 в присутствии аРНКазы (ОЦ-12, АВЬЗСЗ, АВЬЗС1, Эр12, Шг12, Ор12Р6, 03-12, Ь2-3 или К-2) или мочевины (положительный контроль) фермент добавляли к реакционной смеси, содержащей комплекс Ъ2 / 05^Т26, до концентрации 50 нМ и снимали кинетику расщепления 0МТ26.

6 М мочевина является типичным хаотропным агентом, разрушающим нековалентные взаимодействия в молекулах. Инкубация фермента в 6 М мочевине уже в течение 1 мин приводит к его полной инактивации (Рис. 11). 2 М мочевина не оказывает столь быстрого эффекта, но инкубация в течение 60 мин приводит к полной потере каталитической активности ЬРЕМ-1.

Все аРНКазы можно разделить на три группы: 1) ОАВСО-содержащие аРНКазы, проявляющие высокую хаотропную активность; 2) пептидоподобная аРНКаза К-2, проявляющая умеренную хаотропную активность; 3) пептидоподобная аРНКаза Ь2-3, не проявляющая хаотропную активность.

Степень инактивации фермента в присутствии аРНКаз серии Эхп (0№12, Ор12, Ор12Р6, ЭЗ-12) возрастала с увеличением их концентрации, а также при увеличении времени экспозиции с 1 до 60 мин, когда достигалось плато. Инкубация 11РЕ>Ы в присутствии 0.01 мМ ПИН 2 в течение 60 мин приводила

лишь к незначительному снижению активности фермента (Рис. 11), но при увеличении концентрации ОЙ 2 до 0.05 мМ инкубация в течение 60 мин приводила к значительному снижению эффективности расщепления ОМт26, которая составляла 60%. Дальнейшее увеличение концентрации аРНКазы до 0.1 мМ приводило к снижению активности фермента уже после 1 мин инкубации (эффективность расщепления составила около 57%), а фермент, инкубированный в данных условиях в течение 60 мин, полностью терял свою активность. Сходные результаты были получены для аРНКаз Эр12Р6, Бр12 и 03-12: данные соединения проявляли концентрационно-зависимую хаотропную активность, которая была максимальна при концентрации 0.5, 0.1 и 0.5 мМ, соответственно (Рис. 11).

100

■& -а

СП

■ ? * : : ■

I <

• *

■

■ ■ ф

■ ¡г

♦ •

' . • . 1 • • 1

аРНКаза К37 АВ|.ЗСЗ АВ!_ЗС1 01г12 Ор12 Ор12Р6 03-12 1-2-3 К-2 Мочевина Рис. 11. Эффективность расщепления ОМТ26 ЬРЕМ-1 (50 нМ,) инкубированной в присутствии аРНКаз, мочевины или в отсутствие соединений (1 мин -60 мин-в, 37°С).

Хаотропная активность соединений серии АВЬкСш (АВЬЗСЗ, АВЬЗС1) также возрастала при увеличении их концентрации, однако характерной особенностью этих соединений является высокая степень инактивации ИРЕТ^М, наблюдаемая в первую минуту добавления к ферменту, которая практически не менялась через 60 мин инкубации (Рис.11). Однозначно дискриминировать способность аРНКаз изменять третичную структуру фермента или действовать в качестве ингибитора невозможно, поэтому полученные данные о сходной эффективности расщепления 01МТ26 ферментом после 1 и 60 мин инкубации в присутствии АВЬЗСЗ и АВЬЗС1 не позволяют сделать однозначного вывода о характере их взаимодействия с ферментом.

В свою очередь, пептидоподобная аРНКаза Ь2-3 не проявляла хаотропной активности (Рис. 11), что согласуется с отсутствием противовирусной активности в отношении безоболочечных вирусов. Пептидоподобная аРНКаза К-2 проявляла лишь незначительную хаотропную активность (Рис.11), однако инактивация ЕМСУ в присутствии 1 мМ К-2 не наблюдалась.

Ранее, с использованием метода иммуноферментного анализа к.б.н. Е.П. Гончаровой (ЛБНК, ИХБФМ СО РАН) было установлено, что сродство моноклональных антител к инактивированному аРНКазами вирусу гриппа снижалось в порядке: контроль=Ь2-3>Б1г-

12=АВЬЗСЗ~формальдегид»Ор12. Эти данные согласуются с полученными в настоящей работе результатами: соединение L2-3 характеризуется наименьшей хаотропной активностью, хаотропная активность Dtr-12 и ABL3C3 примерно одинакова, а соединение Dpl2 дестабилизирует третичную структуру белковых молекул с наибольшей эффективностью. На основании проведенных исследований можно заключить, что хаотропная активность аРНКаз убывает в ряду: 6 М мочевина>Ор 12>Dtr-l2« Dpl2F6> ABL3C1> ABL3C3> D3-12»K-2.

Данные о хаотропной активности соединений хорошо коррелируют с противовирусной активностью аРНКаз по отношению к EMCV: Dtrl2 в концентрации 0.01 мМ не проявляет хаотропной активности (Рис.11) и не приводит к снижению титра EMCV. При увеличении концентрации Dtrl2 до 0.05 мМ хаотропная активность возрастает, и наблюдается полная инактивация вируса. По-видимому, наличие у аРНКаз хаотропной активности является необходимым условием для их проникновения в вирусную частицу и последующего расщепления вирусной РНК и обуславливает их противовирусную активность. С другой стороны, инкубация EMCV и ABPV в присутствии любых концентраций ABL3C3 не приводила к инактивации вирусов, несмотря на высокую хаотропную активность аРНКазы. Возможно, ABL3C3 способствует образованию агрегатов, состоящих из вирусных частиц и молекул аРНКаз, что подтверждается стабилизацией вируса в процессе его инкубации с 0.5 мМ ABL3C3.

6.2 Мембранолитическая активность аРНКаз

Для того чтобы оценить какую роль способность аРНКаз разрушать липидные мембраны играет в инактивации вирусов, исследовали мембранолитическую активность соединений: эритроциты барана (15Т06шт) инкубировали (37°С, 2 ч) в 100 мМ фосфатном буфере, рН 7.4, в присутствии одной из аРНКаз (ABL3C3, ABL3C1, K-D-l, Dpl2, Dpl2F6, D3-12, Dtrl2, L2-3, К-2) и анализировали эффективность лизиса эритроцитов по изменению окрашивания раствора (550 нм). Положительным контролем являлся лизис эритроцитов в присутствии дистиллированной воды - 100%, а отрицательным контролем - инкубация в 100 мМ фосфатном буфере, рН 7.4.

Как видно из представленных в Таблице 5 данных, 6 из 9 аРНКаз обладают мембранолитической активностью: инкубация эритроцитов с 0.5 мМ ABL3C3 или ABL3C1 приводила к их полному лизису. В свою очередь, полный лизис эритроцитов наблюдали при концентрации 0.1 мМ в случае Dtrl2, а также при концентрации 0.05 мМ в случае Dp 12 и D3-12.

L2-3 в концентрации 1 мМ не обладает ни мембранолитической (Таблица 5), ни хаотропной активностями, однако при этой концентрации наблюдается полная инактивация вируса гриппа в отсутствие расщепления геномной РНК. Следовательно, в основе противовирусной активности соединения лежит более специфичный тип взаимодействия с вирусом гриппа. К-2 также не обладает

мембранолитической активностью, но инактивирует вирус гриппа при концентрации 0.2 мМ. Эта аРНКаза проявляет невысокую хаотропную активность только при высокой концентрации (1 мМ), но инактивации EMCV в ее присутствии не наблюдается. По-видимому, этому соединению также характерен более специфичный тип взаимодействия с частицами вируса гриппа, приводящий к его полной инактивации. На основании проведенных исследований можно заключить, что мембранолитическая активность аРНКаз убывает в ряду: Dpi 2>D3-12=Dtr-12>ABL3C 1 >K-D-l=ABL3C3.

Таблица 5. Мембранолитическая активность аРНКаз.

аРНКаза Концентрация аРНКазы, при которой наблюдали максимальную мембранолитическую активность, мМ Концентрация аРНКазы, при которой наблюдали полную инактивацию вируса гриппа, мМ

ABL3C3 0.5 0.4

ABL3C1 0.5 не определяли

K-D-1 0.5 0.06

Dtrl2 0.1 0.02

Dpl2 0.05 0.5

D3-12 0.05 0.02

К-2 - 0.2

L2-3 - 1

Поскольку в концентрации 0.1 мМ АВЬЗСЗ не инактивирует вирус гриппа (Рис. 6Б), можно заключить, что это связано с его низкой мембранолитической активностью в данных условиях, поскольку при увеличении концентрации соединения до 0.5 мМ наблюдали как полный лизис эритроцитов, так и полную инактивацию вируса.

7. Инактивация ДНК-вируса осповащины

Для того чтобы установить какой вклад в способность аРНКаз инактивировать вирусы вносит рибонуклеазная активность, мы использовали модель, позволяющую элиминировать вклад рибонуклеазной активности в противовирусную активность аРНКаз: изучали способность соединений инактивировать вирус осповакцины (ВОВ, семейство РохчШаё), геном которого представлен двуцепочечной молекулой ДНК, а капсид вируса покрыт липидной мембраной, на поверхности которой находятся плотно-расположенные друг к другу белковые комплексы (белковые колбочки).

7.1. Скрининг соединений, проявляющих анти-ВОВ активность

Оценку противовирусной активности аРНКаз по отношению к ВОВ проводили путем инкубации вируса (-5-105 БОЕ/мл) в присутствии одной из аРНКаз (АВЬЗСЗ, АВЬЗС1, КЕ>-1, 01г12, ЭЗ-12, Ор12, К-2, 1,2-3) или в отсутствие соединений (0-72 ч, 37°С), а концентрацию инфекционного вируса определяли подсчетом количества бляшкообразующих единиц.

Шесть из восьми исследованных аРНКаз, содержащих остаток ОАВСО и проявляющих высокую мебранолитическую и хаотропную активности (АВЬЗСЗ, АВЬЗС1, Шг12, РЗ-12, Эр12 и КБ-1), инактивируют ВОВ, а пептидоподобные

Ь2-3 и К-2 не проявляют противовирусную активность по отношению к этому вирусу (Таблица 6).

Таблица 6. Противовирусная активность аРНКаз по отношению к ВОВ и вирусу гриппа._______

Вирус осповакцины_Вирус гриппа

аРНКаза Эффективная концентрация, мМ Титр вируса, logl0(bOE/M.rr) Эффективная концентрация, мМ Титр вируса, log|0(®OE/Mfl)

ABL3C3 0.4 <1 0.4 <1

ABL3C1 0.3 <1 н.о.

K-D-1 0.5 <1 0.06 <1

Dtrl2 0.1 <1 0.02 <1

D3-12 0.06 <1 0.02 <1

Dpl2 0.5 <1 0.5 <1

К-2 2 5 0.2 <1

L2-3 2 5 1 <1

Контроль_5__6

В зависимости от вклада рибонуклеазной активности в противовирусную активность аРНКаз исследованные соединения можно разделить на 3 группы:

а) соединения, у которых рибонуклеазная активность вносит менее значительный вклад в противовирусную активность, чем мембранолитическая и хаотропная активности (ABL3C3, ABL3C1, Dpi2 - инактивация вируса гриппа и ВОВ наблюдается при одинаковой концентрации, но геном вирусов представлен в виде РНК и ДНК, соответственно, Таблица 6);

б) соединения, рибонуклеазная активность которых вносит значительный вклад в их противовирусную активность (Dtrl2, D3-12, K-D-1 - для полной инактивация вируса гриппа необходима концентрация значительно ниже концентрации, необходимой для полной инактивации ВОВ, следовательно, рибонуклеазная активность соединений обуславливает их противовирусную активность, в то время как хаотропная и мембранолитическая активности обеспечивают доступ аРНКаз к геному РНК-вирусов).

в)соединения, противовирусное действие которых не обусловлено ни рибонуклеазной, ни хаотропной, ни мембранолитической активностями (К-2 и L2-3, для которых ранее была показана высокая противовирусная активность по отношению к вирусу гриппа в отсутствие расщепления вирусной РНК, а также отсутствие мембранолитической (для L2-3 и К-2) и хаотропной (для L2-3) активностей).

7.2. Исследование морфологии ВОВ в процессе инактивации аРНКазой

Мы установили, что аРНКазы, обладающие высокой хаотропной и мембранолитической активностями, эффективно инактивируют ВОВ, при этом полная инактивация вируса достигается только при концентрации соединений, совпадающей с концентрацией, при которой они проявляют мембранолитическую и хаотропную активности. Поэтому с использованием метода ЭМ изучали морфологию ВОВ в процессе инактивации.

Рис. 12. Морфология ВОВ после инактивации АВЬЗСЗ. ВОВ инкубировали с 0.1 мМ АВЬЗСЗ или в отсутствие аРНКазы (контроль) в течение 30 мин (Г-И) и | 18 ч (К, Л) при 37°С. А. Интактная частица ВОВ. Б. Вирус в контроле. В-Д.

Нарушение структуры мембраны (указано стрелками). Е-И. Слущивание липидной мембраны и разрыхление внутренней структуры капсида (указано стрелками). К, Л. Полное разрушение вирионов. Бар 100 нм.

Метод негативного контрастирования позволил выявить нативные вирусные частицы, у которых отчетливо визуализирована поверхность вируса, включая поверхностные белковые колбочки (Рис. 12А), а инкубация ВОВ в отсутствие аРНКазы в течение 18 ч не приводила к заметным изменениям морфологии вирусных частиц (Рис. 12Б). Ультраструктурное исследование ВОВ после инкубации с 0.1 мМ АВЬЗСЗ в течение 30 мин выявило отчетливое повреждение вирусных частиц: поверхностные колбочки теряли четкость, на поверхности частиц образовывались «провалы» (отверстия), в которые проникало контрастирующее вещество (Рис. 12 В-Е), нарушалась структура вирусной мембраны, которая набухала и, формируя длинные выросты, отслаивалась от сердцевины вируса (Рис. 12Ж-И). Через 18 ч такие повреждения приводили к полному разрушению морфологии вирусных частиц (Рис. 12К-Л).

I |

выводы

1) Исследована противовирусная активность аРНКаз по отношению к безоболочечным РНК-содержащим вирусам острого паралича пчел (АВРУ) и энцефаломиокардита мышей (ЕМСУ). Показано, что:

- аРНКазы 03-12, Ор12Р6 и К-О-1 инактивируют АВРУ концентрационно-зависимым способом;

- аРНКазы 03-\2, Вгг12, Ор12Г6 и Ор12 инактивируют ЕМСУ концентрационно-зависимым способом;

- пептидоподобные аРНКазы Ь2-3 и К-2, а также соединения серии АВЬкСгп (АВЬЗСЗ, АВЬЗС1) не инактивируют данные вирусы;

-инактивация АВРУ и ЕМСУ аРНКазами Бр12Р6 и 01г12, соответственно, сопровождается разрушением вирусных РНК, однако в процессе инактивации не наблюдается видимых изменений морфологии вирусных частиц и их количества.

2) Исследована противовирусная активность аРНКаз по отношению к оболочечному РНК-содержащему вирусу гриппа А. Показано, что при инактивации вируса аРНКазами 01г12 и АВЬЗСЗ происходит расщепление вирусной РНК, тогда как полная инактивация вируса гриппа аРНКазой Ь2-3 не сопровождается расщеплением вирусной РНК.

3) Исследована противовирусная активность аРНКаз по отношению к ДНК-содержащему вирусу осповакцины. Показано, что:

-аРНКазы серии Бхп (ОЦ-12, Ор12, Ор12Р6, 03-12), а также соединения серии АВЬкСт (АВЬЗСЗ, АВЬЗС1, КЛЭ-1) способны концентрационно-зависимым способом инактивировать вирус, тогда как пептидоподобные аРНКазы Ь2-3 и К-2 вирус не инактивируют;

- инактивация вируса аРНКазой АВЬЗСЗ сопровождается изменениями морфологии вирусной частицы, которые характеризуются потерей пространственной организации поверхностных белковых комплексов, а также появлением разрывов и слущиванием мембран вируса.

4) Исследован спектр активностей аРНКаз. Установлено, что наряду с высокой рибонуклеазной активностью:

-аРНКазы АВЬЗСЗ, АВЬЗС1, Э1г12, 03-12, Эр12, Ор12Е6, К-2 обладают хаотропной активностью, которая убывает в ряду: б М мочевина >0р12>01г-12= Ор12Р6> АВЬЗС1> АВЬЗСЗ> 03-12»К-2;

-аРНКазы АВЬЗСЗ, АВЬЗС1, 0^12, БЗ-12, Ор12, Ор12Р6, К-О-1 обладают мембранолитической активностью, которая убывает в ряду: 0р12>03-12=СНг-12> АВЬЗС1Ж-П-1 = АВ ЬЗ СЗ;

- аРНКаза К-2 не обладает мембранолитической активностью;

- аРНКаза Ь2-3 не обладает ни хаотропной, ни мембранолитической активностями.

5) Исследованы структурно-функциональные особенности инактивации вирусов аРНКазами. Установлено, что:

- сочетание хаотропной и рибонуклеазной активностей аРНКаз, содержащих в своей структуре два остатка 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана (Э1г12, 03-12, Ор12, Ор12Р6), является достаточным для инактивации АВРУ и ЕМСУ;

- наличие в структуре аРНКаз АВЬЗСЗ, АВЬЗС1, Оц-12, ЭЗ-12, Эр 12, Ор12Р6 остатка 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана обеспечивает их мембранолитическую и хаотропную активности, проявление которых является достаточным для инактивации вируса осповакцины, структура которого включает липидную мембрану;

- высокие хаотропная и мембранолитическая активности аРНКаз АВЬЗСЗ, АВЬЗС1 и Эр 12 приводят к быстрой инактивации вируса гриппа, а рибонуклеазная активность соединений вносит незначительный вклад в эффективность инактивации вируса;

-инактивация вируса гриппа аРНКазами Эгг12, 03-12, 1Ш-1 в равной мере зависит от проявления соединениями как рибонуклеазная активности, так и хаотропной и мембранолитической активностей;

- противовирусная активность Ь2-3 и К-2 в отношении вируса гриппа является высокоспецифичной и не обусловлена ни рибонуклеазной, ни хаотропной, ни мембранолитической активностью.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Fedorova, A.A., Azzami, К., Ryabchikova, E.I., Spitsyna, Y.E., Silnikov, V.N., Ritter, W., Gross, H.J., Tautz, J., Vlassov, V.V., Beier, H„ Zenkova, M.A. Inactivation of a nonenveloped RNA virus by artificial ribonucleases: honey bees and acute bee paralysis virus as a new experimental model for in vivo antiviral activity assessment // Antiviral Res. - 2011 - V. 91. - P. 267-277.

2. Fedorova, A.A., Goncharova, E.P., Kovpak, M.P., Vlassov, V.V., Zenkova, M.A. Influenza virus inactivated by artificial ribonucleases as a prospective killed virus vaccine // Vaccine. - 2012 - V. 30. - P. 2973-2980.

3. Fedorova, A.A., Goncharova, E.P., Ryabchikova, E.I., Vlasov, V.V., Zenkova, M.A. Novel amphiphilic compounds effectively inactivate the vaccinia virus // FEBS Letters. - 2012. - V. 586. - P. 1669-1673.

4. Федорова, A.A., Гончарова, Е.П., Королева, Л.С., Сильников, В.Н., Власов, В.В., Зенкова, М.А. Средство для инактивации ДНК-вирусов // Заявка-на Патент РФ RU 2012107748. - Приоритет от 29.02.2012.

5. Федорова, А.А., Гончарова, Е.П., Буракова, Е.А., Сильников, В.Н., Власов, В.В., Зенкова, М.А. Средство, проявляющее противовирусную активность в отношении ДНК-вирусов // Заявка на патент РФ RU 2012107747. - Приоритет от 29.02.2012.

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Федорова, Антонина Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ИНАКТИВАЦИЯ ВИРУСОВ ХИМИЧЕСКИМИ РЕАГЕНТАМИ С ШИРОКИМ СПЕКТРОМ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1 Разнообразие вирусов.

1.2 Особенности строения и жизненного цикла безоболочечных вирусов, влияющие на их инактивацию химическими реагентами.

1.3 Особенности строения и жизненного цикла оболочечных вирусов, влияющие на их инактивацию химическими реагентами.

1.4 Вирусы, использованные в настоящей работе.

1.4.1 Вирус энцефаломиокардита мышей и семейство Ргсогпаутс1ае.

1.4.2 Вирус острого паралича пчел и семейство ^/с/^гсшУ/^ае.

1.4.3 Вирус гриппа и семейство ОпЬотухоу 'тйае.

1.4.4 Вирус осповакцины.

1.5 Химические реагенты, обладающие противовирусной активностью.

1.5.1 Определение количества вирусных частиц.

1.5.2 Геном-направленные реагенты.

1.5.2.1 Алкилирующие агенты.

1.5.2.2 Искусственные рибонуклеазы.

1.5.3 Липиды.

1.5.4 Гидрофобные поликатионы.

1.5.5 Полианионы.

1.5.6 Поверхностно-активные вещества.

1.5.7 Химические реагенты в приготовлении вакцин.

1.5.7.1 Формальдегид.

1.5.7.2 Диметиленимин.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Инактивация вирусов искусственными рибонуклеазами"

В настоящее время проблема поиска новых высокоэффективных препаратов, обладающих широким спектром противовирусной активности, приобретает особую актуальность в связи с развитием устойчивости у многих вирусов к действию применяемых в медицинской практике лекарственных препаратов, а также их высокой токсичностью [1; 2].

Химические реагенты, обладающие противовирусной активностью, можно разделить на 2 типа: специфические реагенты, оказывающие влияние на какой-либо этап жизнедеятельности вирусной частицы и избирательно действующие на определенный вирусный компонент (ингибиторы вирусных ферментов и др.) [3], и химические агенты, взаимодействующие с широким спектром типовых компонентов вирусной частицы и вызывающие ее инактивацию (например, взаимодействие с липидной мембраной [4] или поверхностными белками/гликопротеидами) [5; 6]. Первый тип высокоспецифичных реагентов составляет основу современной противовирусной терапии, а неоспоримым преимуществом таких средств является высокая степень специфичности, проявляемая по отношению к целевым вирусам [7]. Однако их применение часто ограничено вследствие высокой вероятности возникновения мутаций, характерной для вирусов некоторых семейств (вирус гриппа, вирус иммунодефицита человека и др.), что приводит к развитию устойчивости у вируса к действию данного специфического реагента [8; 9]. Так, большим успехом является применение высоко эффективной антиретровирусной терапии (ВЭАРТ) [10]. На сегодняшний день зарегистрировано 25 коммерческих анти-ВИЧ (вирус иммунодефицита человека, семейство Яе^оушйае) препаратов, которые, в зависимости от вирусного компонента, на который они направлены, можно разделить на несколько классов: ингибиторы обратной транскриптазы, РНК-зависимой-ДНК-полимеразы, протеазы, интегразы, а также ингибиторы проникновения вируса в клетку (слияния вирус-клетка и взаимодействия вируса с рецепторами) [10]. С использованием этих препаратов удалось значительно снизить заболеваемость ВИЧ инфекцией и перевести вызываемое вирусом заболевание из смертельных в разяд контролируемых. Однако, высокая частота мутаций, возникающих в геноме ВИЧ, часто приводит к потере чувствительности и возникновению резистентности к данным препаратам [1]; высокая токсичность также является фактором, лимитирующим их применение. Кроме того, было установлено, что прекращение приема препаратов приводит к возобновлению инфекции в организме: данные препараты не позволяют полностью элиминировать вирус из организма [11].

Одним из подходов к поиску противовирусных соединений является проведение широкомасштабного скрининга агентов, способных ингибировать репликацию вируса in vitro [12, 13]. Другой подход предполагает первоначальное изучение вирусных белков, для того чтобы в дальнейшем разработать лекарственный препарат, который будет специфически ингибировать их активность [14]. В частности, знание трехмерной структуры белка позволяет визуализировать его активный центр и предположить/установить механизм его действия, и, как следствие, создать

• / низкомолекулярные ингибиторы этого белка [15].

Несмотря на успехи современных подходов к настоящему моменту эффективные противовирусные средства разработаны только против небольшого числа вирусов [2]. Основной проблемой, сдерживающей развитие исследований в данном направлении, является очень небольшое число возможных мишеней для действия противовирусных агентов [16]. Каждый вирус обладает собственным набором специфичных белков, необходимых для его репликации, и поэтому только небольшое количество противовирусных препаратов, обладающих активностью против одного вируса, активны против других вирусов. Способность некоторых вирусов (например, ВИЧ и вируса герпеса) существовать в латентной форме, приводит к невозможности полного излечения при проведении терапии. Более того, клинические симптомы заболеваний, вызываемых различными вирусами, являются сходными, что делает постановку точного диагноза сложной задачей, а лечение, для того, чтобы быть эффективным, должно начинаться в первые часы заболевания. Все это делает поиск и разработку универсальных противовирусных средств важной задачей современной противовирусной терапии.

Использование универсальных химических реагентов, способных инактивировать вирусы широкого круга, особенно актуально при проведении дезинфекции [17], поскольку известно, например, что риновирусы (семейство Picornaviridae) способны сохранять инфекционность в окружающей среде при температуре от 24 до 37°С от нескольких часов до нескольких дней, а при -70°С - в течение многих лет [18].

Структура вирусных частиц, в общем виде, включает генетический материал (ДНК или РНК), покрытый белковой оболочкой [19]. В простых вирусах этот плотный нуклеопротеидный комплекс непосредственно является самой вирусной частицей (безоболочечные вирусы), в то время как в более сложных по строению вирусах он окружен липидной оболочкой, содержащей поверхностные, трансмембранные и другие белки (оболочечные вирусы). Взаимодействие химических реагентов с поверхностными компонентами вирусных частиц - белками и липидами, может приводить к инактивации вирусов за счет разрушения как антигенов, так и самой структуры вирусной частицы. Особый же интерес представляют реагенты, способные взаимодействовать с генетическим материалом вирусов, не разрушая при этом поверхностные антигены, что позволяет использовать инактивированный таким образом вирус в качестве вакцины [20].

В этой связи, искусственные рибонуклеазы (аРНКазы) являются новым перспективным классом противовирусных соединений, поскольку они обладают рядом уникальных свойств: а) при мягких физиологических условиях расщепляют фосфодиэфирные связи в РНК in vitro [21-24]; б) проявляют высокую противовирусную активность по отношению к вирусу гриппа [25]; в) являются низкомолекулярными соединениями, что позволяет предположить возможность их проникновения в безоболочечные РНК-содержащие вирусы, расщепление их РНК, что может обеспечить инактивацию вирусов.

Целью настоящей работы являлось исследование механизма противовирусной активности искусственных рибонуклеаз по отношению к вирусам с различной структурой. В рамках данной цели были поставлены следующие задачи:

- изучить механизм противовирусной активности аРНКаз по отношению к оболочечному РНК-вирусу гриппа, а также безоболочечным EMCV и ABPV;

- исследовать способность аРНКаз взаимодействовать с липидными мембранами и белками;

- оценить вклад рибонуклеазной активности в противовирусную активность аРНКаз.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Федорова, Антонина Александровна

выводы

- аРНКазы 03-12, Бр12Р6 и К-Б-1 инактивируют АВРУ концентрационно-зависимым способом;

-аРНКазы 03-12, 01:г12, Ор12Р6 и Эр12 инактивируют ЕМСУ концентрационно-зависимым способом;

- пептидоподобные аРНКазы Ь2-3 и К-2, а также соединения серии АВЬкСт (АВЬЗСЗ, АВЬЗС1) не инактивируют данные вирусы;

-инактивация АВРУ и ЕМСУ аРНКазами Ор12Б6 и 01т12, соответственно, сопровождается разрушением вирусных РНК, однако в процессе инактивации не наблюдается видимых изменений морфологии вирусных частиц и их количества.

2) Исследована противовирусная активность аРНКаз по отношению к оболочечному РНК-содержащему вирусу гриппа А. Показано, что при инактивации вируса аРНКазами Б^12 и АВЬЗСЗ происходит расщепление вирусной РНК, тогда как полная инактивация вируса гриппа аРНКазой Ь2-3 не сопровождается расщеплением вирусной РНК.

-аРНКазы серии Охп (01г12, Бр12, Ор12Р6, 03-12), а также соединения серии АВЬкСш (АВЬЗСЗ, АВЬЗС1, К-Б-1) способны концентрационно-зависимым способом инактивировать вирус, тогда как пептидоподобные аРНКазы Ь2-3 и К-2 вирус не инактивируют;

4) Исследован спектр активностей аРНКаз. Установлено, что наряду с высокой рибонуклеазной активностью:

- аРНКазы АВЬЗСЗ, АВЬЗС1, ГНг12, 03-12, Бр12, Ор12Р6, К-2 обладают хаотропной активностью, которая убывает в ряду: 6 М мочевина >Бр12>01г-12~ Ор12Р6> АВЬЗС1> АВЬЗСЗ> 03-12»К-2;

- аРНКазы АВЬЗСЗ, АВЬЗС1, М2, БЗ-12, Е>р12, Ор12Р6, К-0-1 обладают мембранолитической активностью, которая убывает в ряду: Ор12>БЗ-12~В1:г-12>АВЬЗ С1Ж-Э-1 -АВЬЗ СЗ;

- аРНКаза К-2 не обладает мембранолитической активностью;

- аРНКаза Ь2-3 не обладает ни хаотропной, ни мембранолитической активностями.

5) Исследованы структурно.-функциональные особенности инактивации вирусов аРНКазами. Установлено, что:

- сочетание хаотропной и рибонуклеазной активностей аРНКаз, содержащих в своей структуре два остатка 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана (ТНг12, БЗ-12, Эр 12, Бр12Р6), является достаточным для инактивации АВРУ и ЕМСУ;

-наличие в структуре аРНКаз АВЬЗСЗ, АВЬЗС1, 01x12, БЗ-12, Ор12, Бр12Р6 остатка 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана обеспечивает их мембранолитическую и хаотропную активности, проявление которых является достаточным для инактивации вируса осповакцины, структура которого включает липидную мембрану;

-высокие хаотропная и мембранолитическая активности аРНКаз АВЬЗСЗ, АВЬЗС1 и Эр 12 приводят к быстрой инактивации вируса гриппа, а рибонуклеазная активность соединений вносит незначительный вклад в эффективность инактивации вируса;

- инактивация вируса гриппа аРНКазами 01x12, ВЗ-12, КЕ)-1 в равной мере зависит от проявления соединениями как рибонуклеазная активности, так и хаотропной и мембранолитической активностей;

3.5 Заключение

В настоящей работе была исследована противовирусная активность аРНКаз по отношению к вирусам различного строения: оболочечный вирус гриппа и безоболочечные ЕМСУ и АВРУ, геном которых представлен в виде РНК. Кроме того, с использованием модельных систем были исследованы хаотропная и мембранолитическая активности соединений. В результате проведенных исследований было установлено, что противовирусная активность аРНКаз, относящихся к сериям АВЬкСш и Бхп, основана на проявлении двух и более типов активности (рибонуклеазной, хаотропной и мембранолитической), наличие которых определяло способность аРНКаз инактивировать вирусы различной морфологии. В свою очередь противовирусная активность пептидоподобных аРНКаз не была связана с их РНКазной активностью.

Так, аРНКаза Эй" 12 обладает высокой хаотропной активностью, что обеспечивает ее проникновение в вирусную частицу безоболочечного ЕМСУ уже при концентрации 0.05 мМ, а за счет наличия у соединения рибонуклеазной активности происходит расщепление РНК вируса, что приводит к полной потере инфекционности вируса. С другой стороны, за счет наличия мембранолитической активности данное соединение уже при концентрации 0.02 мМ способно взаимодействовать с липидной мембраной вируса гриппа, проникать в вирусную частицу и расщеплять вирусный геном, что приводит к полной потере им инфекционности. Кроме того, при повышении концентрации до 0.1 мМ, происходит увеличение мембранолитической и хаотропной активности соединений до уровня, достаточного, чтобы вызвать полную инактивацию вируса осповакцины, геном которого представлен в виде ДНК. На основании полученных данных можно сделать вывод о высокой перспективности данного соединения, как терапевтического агента, а также как универсального средства для инактивации вирусов.

Аналогичное заключение можно сделать о противовирусной активности соединений 03-12 и КБ-1: наличие рибонуклеазной и хаотропной активностей обеспечило эффективную инактивацию АВРУ при концентрации соединений 0.04 и 1 мМ, соответственно, а сочетание этих активностей с мембранолитической привело к эффективной инактивации вируса гриппа при концентрации 0.02 мМ. В свою очередь инактивация ДНК-содержащего вируса осповакцины была возможна при концентрации, когда соединения проявляют высокую хаотропную и мембран о литическую активности: 0.06 мМ и 0.5 мМ в случае ЭЗ-12 и К-О-1, соответственно.

Взаимодействие с липидными мембранами является определяющим в способности аРНКаз Dpl2, ABL3C3 и ABL3C1 инактивировать вирусы, содержащие липидные мембраны: эффективная инактивация РНК- и ДНК-содержащих вирусов гриппа и осповакцины происходит при одинаковой концентрации - 0.5, 0.4 и 0.3 мМ, соответственно, а неспособность данных соединений проникнуть в вирусные частицы безоболочечных вирусов и расщепить генетический материал вирусов, по всей видимости является следствием образования агрегатов вирусных частиц и молекул аРНКаз. Однако, отсутсвие способности инактивировать безоболочечные вирусы не делает данные соединения менее перспективным с точки зрения эффективных дезинфектантов, поскольку они показали свою способность инактивировать вирусы широкого круга (РНК-и ДНК-содержащие вирусы с липидной мембраной).

К третьей группе можно отнести пептидоподобные соединения К-2 и L2-3. С одной стороны, при концентрации 1 мМ аРНКаза L2-3 проявляет высокую противовирусную активность по отношению к вирусу гриппа, однако, в результате инактивации расщепления РНК не происходит, а поверхностные эпитопы не теряют сродства к антителам [218]. Более того, аРНКаза L2-3 не обладает ни хаотропной, ни мембранолитической активностью, что приводит к неспособности данного соединения инактивировать вирус осповакцины. Следовательно, высокая противовирусная активность по отношению к вирусу гриппа является высокоспецифичной и требует дополнительных исследований.

Соединение К-2 не обладает мембранолитической активностью, но при высокой концентрации 1 мМ проявляет хаотропную активность, которой а) является недостаточно для инактивации вируса осповакцины, б) при концентрации 0.2 мМ является достаточным для инактиваици вируса гриппа. Однако, низкая хаотропная активность соединения в данной концентрации не может быть связана с инактивацией вируса гриппа, по всей видимости, механизм действия данного соединения также основан на более специфичных взаимодействиях с вирусной частицей. Поскольку К-2 не инактивирует безоболочечный вирус EMCV, можно заключить, что его хаотропная активность, хотя и обеспечивает проникновение соединения в вирусную частицу, но слишком высокая концентрация, необходимая для расщепления РНК in vitro (1 мМ) делает невозможным достижение этой концентрации аРНКазы вблизи вирусной РНК, что было бы достаточным для ее эффективного расщепления.

Перспективность дальнейшего использования исследованных соединений обусловлена, во-первых, возможностью их применения в качестве новых реагентов для приготовления вакцин для предотвращения заболеваний, вызываемых РНК-вирусами. Так, было продемонстрировано, что вирус гриппа, инактивированный аРНКазами Ь2-3, 01x12 или АВЬЗСЗ, защищает иммунизированных животных от инфекции, вызванной 3 ЬБ50, а уровень выживаемости животных составляет 100, 50 и 30%, соответственно [218]. С другой стороны, соединения обладают высоким потенциалом для использвоания в качестве дезинфицирующих средств, поскольку они обладают широким спектром активности по отношению к РНК- и ДНК-содержащим вирусам различного строения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Федорова, Антонина Александровна, Новосибирск

1. Hodinka, R.L. What clinicians need to know about antiviral drugs and viral resistance // Infect. Dis. Clin. North. Am. 1997. - V. 11. - P. 945-967.

2. Littler, E., Oberg, B. Achievements and challenges in antiviral drug discovery // Antivir. Chem. Chemother. 2005. - V. 16. - P. 155-168.

3. Balfour, H.H.Jr. Antiviral drugs // N. Engl. J. Med. 1999. - V. 340. - P. 12551268.

4. Song, J.M., Seong, B.L.Viral membranes: an emerging antiviral target for enveloped viruses? // Expert Rev. Anti. Infect. Ther. 2010. - V. 8. - P. 635-638.

5. De Clercq, E. Strategies in the design of antiviral drugs // Nat. Rev. Drug Discov. -2002. V. 1,-P.-13-25.

6. Wojcechowskyj, J.A., Doms, R.W. A potent, broad-spectrum antiviral agent that targets viral membranes // Viruses. 2010. - V. 2. - P. 1106-1109.

7. Razonable, R.R. Antiviral drugs for viruses other than human immunodeficiency virus // Mayo Clin. Proc. 2011. - V. 86. - P. 1009-1026.

8. Griffiths, P.D. A perspective on antiviral resistance // J Clin Virol. 2009. - V. 46.-P. 3-8.

9. Nijhuis, M., van Maarseveen, N.M., Boucher, C.A. Antiviral resistance and impact on viral replication capacity: evolution of viruses under antiviral pressure occurs in three phases // Handb. Exp. Pharmacol. 2009. - V. 189. - P. 299-320.

10. De Clercq, E. Anti-HIV drugs: 25 compounds approved within 25 years after the discovery of HIV // Int. J. Antimicrob. Agents. 2009. -V. 33. - P. 307-320.

11. Lewin, S.R., Evans, V.A., Elliott, J.H., Spire, B., Chomont, N. 2011. Finding a cure for HIV: will it ever be achievable? // J. Int. AIDS Soc. 2011. - V. 14. - P. 4.

12. Davies, W.L., Grunert, R.R., Haff, R.F., Mcgahen, J.W., Neumayer, E.M., Paulshock, M., Watts, J.C., Wood, T.R., Hermann, E.C., Hoffmann, C.E. Antiviral activity of 1-adamantanamine (amantadine) // Science. 1964. - V. 144. - P. 862-863.

13. Malet, H., Massé, N., Selisko, B., Romette, J.L., Alvarez, K., Guillemot, J.C., Tolou, H., Yap, T.L., Vasudevan, S., Lescar, J., Canard, B. The flavivirus polymerase as a target for drug discovery // Antiviral Res. 2008. - V. 80. - P. 23-35.

14. Olszewska, W., Openshaw, P. Emerging drugs for respiratory syncytial virus infection // Expert Opin. Emerg. Drugs. 2009. - V. 14. - P. 207-217.

15. Hendley, J.O., Wenzel, R.P., Gwaltney, J.M.Jr. Transmission of rhinovirus colds by self-inoculation // N. Engl. J. Med. 1973. - V. 288. - P. 1361-1363.

16. Koonin, E.V., Wolf, Y.I., Nagasaki, K., Dolja, V.V. The complexity of the virusworld // Nat. Rev. Microbiol. 2009. - V. 7. - P. 250.

17. Singer, B., Fraenkel-Conrat, H. Chemical modification of viral ribonucleic acid. VIII. The chemical and biological effects of methylating agents and nitrosoguanidine on Tobacco mosaic virus // Biochemistry. 1969. - V. 8. - P. 3266-3269.

18. Tamkovich, N.V., Zenkov, A.N., Vlassov, V.V., Zenkova, M.A., An RNA sequence determines the speed of its splitting by artificial ribonucleases // Bioorg. Khim. 2010. -V. 36.-P. 223-235.

19. Zenkova, M., Beloglazova, N., Sil'nikov, V., Vlassov, V., Giegé, R. RNA cleavage by l,4-diazabicyclo2.2.2.octane-imidazole conjugates // Methods Enzymol. 2001. -V. 341,- P. 468-490.

20. Kuznetsova, I.L., Zenkova, M.A., Gross, H.J., Vlassov, V.V. Enhanced RNA cleavage within bulge-loops by an artificial ribonuclease // Nucleic Acids Res. 2005. - V. 33. -P.1201-1212.

21. Goncharova, E.P., Koroleva, L.S., Silnikov, V.N., Ternovoy, V.A., Vlassov, V.V., Zenkova M.A. Inactivation of tick-borne encephalitis virus by RNA-cleaving compounds // J. Mol. Genet. Med. 2011. - V. 5. - P. 266-270.

22. Plotkin, S.A. Vaccines: past, present and future // Nat. Med. 2005. - V. 11. -P. S5-11.

23. Okwo-Bele, J.M., Cherian, T. The expanded programme on immunization: a lasting legacy of smallpox eradication // Vaccine. 2011. - V. 29. - P. D74-79.

24. Bamford, D.H. Do viruses form lineages across different domains of life? // Res. Microbiol. -2003. -V. 154. P. 231-236.

25. Prangishvili, D., Garrett, R.A., Koonin, E.V. Evolutionary genomics of archaeal viruses: unique viral genomes in the third domain of life // Virus Res. 2006 - V. 117. -P. 52-67.

26. Allan, G.M., Ellis, J.A. Porcine circoviruses: a review // J. Vet. Diagn. Investig. -2000.-V. 12.-P. 3-14.

27. Claverie, J.M., Ogata, H., Audic, S., Abergel, C., Suhre, K., Fournier, P.E. Mimivirus and the emerging concept of "giant" virus // Virus Res. 2006. - V. 117. -P. 133-144.

28. Abrescia, N.G.A., Bamford, D.H., Grimes, J.M., Stuart, D.I. Structure unifies the viral universe // Annu. Rev. Biochem. 2012. - V. 81. - P. 23.1-23.28.

29. Baltimore, D. Expression of animal virus genomes // Bacteriol. Rev. 1971. - V. 35.-P. 235-241.

30. URL: http://ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?version=2009&bhcp=l

31. Cosset, F.L., Lavillette, D. Cell entry of enveloped viruses // Adv. Genet. -2011.-V. 73.-P. 121-183.

32. Poranen, M.M., Daugelavicius, R., Bamford, D.H. Common principles in viral entry // Annu. Rev. Microbiol. 2002. - V. 56. - P. 521-538.

33. Mercer, J., Schelhaas, M., Helenius, A. Virus entry by endocytosis // Annu. Rev. Biochem. -2010. -V. 79. P. 803-833.

34. Banerjee, M., Johnson, J.E. Activation, exposure and penetration of virally encoded, membrane-active polypeptides during non-enveloped virus entry // Curr. Protein Pept. Sci. 2008. - V. 9. - P. 16-27.

35. Billy, T. Penetration of nonenveloped viruses into the cytoplasm // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2007. - V. 23. - P. 23-43.

36. Smith, A.E., Helenius, A. How viruses enter animal cells // Science. 2004. - V. 304-P. 237-242.

37. Dormitzer, P.R., Nason, E.B., Prasad, B.V., Harrison, S.C. Structural rearrangements in the membrane penetration protein of a nonenveloped virus // Nature. 2004. -V. 430.-P. 1053-1058.

38. Chandran, K., Farsetta, D.L., Nibert, M.L. Strategy for nonenveloped virus entry: a hydrophobic conformer of the reovirus membrane penetration protein micro 1 mediates membrane disruption // J. Virol. 2002. - V. 76. - P. 9920-9933.

39. Stanley, W.M. Isolation of a crystalline protein possessing the properties of tobacco-mosaic virus // Science. 1935. - V. 81. - P. 644-645

40. Bawden, F.C., Pirie, N.W. Methods for the purification of tomato bushy stunt and tobacco mosaic viruses // Biochem. J. 1943. - V. 37. - P. 66-70.

41. Bink, H.H.J., Pleij, C.W.A. RNA-protein interactions in spherical viruses // Arch. Virol. -2002. -V. 147. P. 2261-2279.

42. Krupovic, M., Bamford, D.H. Order to the Viral Universe // J. Virol. 2010. - V. 84.-P. 12476-12479.

43. Lavelle, L., Michel, J.P., Gingery, M. The disassembly, reassembly and stability of CCMV protein capsids // J. Virol. Meth. 2007. - V. 146. - P. 311-316.

44. Smith, D.E., Tans, S.J., Smith, S.B., Grimes, S., Anderson, D.L., Bustamante, C. The bacteriophage straight phi29 portal motor can package DNA against a large internal force // Nature. 2001. - V. 413. - P. 748-752.

45. Toropova, K., Basnak, G., Twarock, R., Stockley, P.G., Ranson, N.A. The Three-dimensional Structure of Genomic RNA in Bacteriophage MS2: Implications for Assembly // J. Mol. Biol. 2008. - V. 375. - P. 824-836.

46. Baker, T.S., Olson, N.H., Fuller, S.D. Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. - V. 63. - P. 862-922.

47. Carreira, A., Menendez, M., Reguera, J., Almendral, J.M., Mateu, M.G. In Vitro disassembly of a parvovirus capsid and effect on capsid stability of heterologous peptide insertions in surface loops // J. Biol. Chem.- 2004. V. 279. - P. 6517-6525.

48. Chiu, W., Garcea, R.L., Burnette, R.M. Structural Biology of Viruses // Oxford: Oxford University Press. -1997.

49. Johnson, J.E. Functional implications of protein-protein interactions in icosahedral viruses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93. - P. 27-33.

50. Dokland, T. Freedom and restraint: themes in virus capsid assembly // Struct. Fold. Des. 2000. - V. 8. - P. R157-R162.

51. Speir, J.A., Munshi, S., Wang, G., Baker, T.S., Johnson, J.E. Structures of the native and swollen forms of cowpea chlorotic mottle virus determined by X-ray crystallography and cryo-electron microscopy // Structure. 1995. - V. 3. - P. 63-78.

52. Lewis, J.K., Bendahmane, M., Smith, T.J., Beachy, R.N., Siuzdak, G. Identification of viral mutants by mass spectrometry // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95.-P. 6774-6778.

53. Fisher, A.J., Johnson, J.E. Ordered duplex RNA controls capsid architecture in an icosahedral animal virus // Nature. 1993. - V. 361. - P. 176-179.

54. Bothner, B., Schneemann, A., Marshall, D., Reddy, V., Johnson, J.E., Siuzdak, G. Crystallographically identical virus capsids display different properties in solution // Nat. Struct. Biol. 1999. - V. 6. - P. 114-116.

55. Bothner, B., Dong, X.F., Bibbs, L., Johnson, J.E., Siuzdak, G. Evidence of viral capsid dynamics using limited proteolysis and mass spectrometry // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273.-P. 673-676.

56. Broo, K., Wei, J., Marshall, D., Brown, F., Smith, T.J., Johnson, J.E., Schneemann, A., Siuzdak, G. Viral capsid mobility: a dynamic conduit for inactivation // Proc. Nat. Ac. Sci. USA-2001. -V. 98. P. 2274-2277.

57. Earp, L.J., Delos, S.E., Park, H.E., White, J.M. The many mechanisms of viral membrane fusion proteins // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2005. - V. 285. - P. 25-66.

58. Smith, A.E., Helenius, A. How viruses enter animal cells // Science. 2004. - V. 304.-P. 237-242.

59. Reading, S.A., Dimmock, N.J. Neutralization of animal virus infectivity by antibody // Arch. Virol. 2007. - V. 152. - P. 1047-1059.

60. Mercer, J., Schelhaas, M., Helenius, A. Virus entry by endocytosis // Annu. Rev. Biochem. 2010. - V. 79. - P. 803-833.

61. Harrison, S.C. Viral membrane fusion // Nat. Struct. Mol. Biol. 2008. - V. 15. -P. 690-698.

62. Basanez, G. Membrane fusion: the process and its energy suppliers // Cell. Mol. Life Sci. -2002. -V. 59. P. 1478-1490.

63. Vaney, M.-C., Rey, F.A. Class II enveloped viruses // Cell. Microbiol. 2011. -V. 13.-P. 1451-1459.

64. Huiskonen, J.T., Butcher, S.J. Membranecontaining viruses with icosahedrally symmetric capsids // Curr. Opin. Struct. Biol. 2007. - V. 17. - P. 229-236.

65. Harrison, S.C. Viral membrane fusion // Nat. Struct. Mol. Biol. 2008. - V. 15. -P. 690-698.

66. Colman, P.M., Lawrence, M.C. The structural biology of type I viral membrane fusion // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2003. - V. 4. - P. 309-319.

67. Huiskonen, J.T., Hepojoki, J., Laurinmaki, P., Vaheri, A., Lankinen, H., Butcher, S.J., Griinewald, K. Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses // J. Virol. 2010. - V. 84. - P. 4889^1897.

68. Hawes, P.C., Netherton, C.L., Wileman, T.E., Monaghan, P. The envelope of intracellular African swine fever virus is composed of a single lipid bilayer // J. Virol. 2008. -V. 82.-P. 7905-7912.

69. Butcher, S.J., Manole, V., Karhu, N.J. Lipid-containing viruses: bacteriophage PRD1 assembly // Adv. Exp. Med. Biol. 2012. - V. 726. - P. 365-377.

70. Colman, P.M., Lawrence, M.C. The structural biology of type I viral membrane fusion // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2003. - V. 4. - P. 309-319.

71. Roche, S., Bressanelli, S., Rey, F.A., Gaudin, Y. Crystal structure of the low-pH form of he vesicular stomatitis virus glycoprotein G // Science. 2006. - V. 313. - P. 187-191.

72. Roche, S., Rey, F. A., Gaudin, Y., Bressanelli, S. Structure of the prefusion form of the vesicular stomatitis virus glycoprotein G // Science. 2007. - V. 315. - P. 843-848.

73. Kielian, M. Class II virus membrane fusion proteins // Virology. 2006. - V. 344.-P. 38-47.

74. Huiskonen, J.T., Butcher, S.J. Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids // Curr. Opin. Struct. Biol. 2007. - V. 17. - P. 229-236.

75. Mukhopadhyay, S., Zhang, W., Gabler, S., Chipman, P.R., Strauss, E.G., Strauss, J.H., Baker, T.S., Kuhn, R.J., Rossmann, M.G. Mapping the structure and function of the El and E2 glycoproteins in alphaviruses // Structure. 2006. - V. 14. - P. 63-73.

76. Choi, H.K., Tong, L., Minor, W., Dumas, P., Boege, U., Rossmann, M.G., Wengler, G. Structure of Sindbis virus core protein reveals a chymotrypsin-like serine proteinase and the organization of the virion // Nature. 1991. - V. 354. - P. 37-43.

77. Chernomordik, L.V., Zimmerberg, J., Kozlov, M.M. Membranes of the world unite! // J. Cell. Biol. 2006. - V. 175. - P. 201-207.

78. McMahon, H.T., Gallop, J.L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodeling // Nature. 2005. - V. 438. - P. 590-596.

79. Chernomordik, L.V., Kozlov, M.M. Protein-lipid interplay in fusion and fission of biological membranes // Annu. Rev. Biochem. 2003. - V. 72. - P. 175-207.

80. Giinther-Ausborn, S., Praetor, A., Stegmann, T. Inhibition of influenza-induced membrane fusion by lysophosphatidylcholine // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. -P. 29279-29285.

81. Martin, I., Ruysschaert, J.M. Lysophosphatidylcholine inhibits vesicles fusion induced by the NH2-terminal extremity of SIV/HIV fusogenic proteins // Biochim. Biophys. Acta.- 1995.-V. 1240.-P. 95-100.

82. Harada, S., Yokomizo, K., Monde, K., Maeda, Y., Yusa, K. A broad antiviral neutral glycolipid, fattiviracin FV-8, is a membrane fluidity modulator // Cell Microbiol. -2007.-V. 9.-P. 196-203.

83. URL: http://talk.ictvonline.org/media/13/default.aspx (ICTV 2009 Master Species List, Version 3, 16.11.2009)

84. Nathanson, N., Kew, O.M. From emergence to eradication: the epidemiology of poliomyelitis deconstructed // Am. J. Epidemiol. 2010. - V. 172 - P. 1213-1229.

85. Grubman, M.J., Baxt, B. Foot-and-Mouth Disease // Clin Microbiol Rev. -2004.-V. 17.-P. 465^193.

86. Turner, R.B. The treatment of rhino virus infections: progress and potential // Antiviral Res. -2001. -V. 49. P. 1-14.

87. Brundage, S.C., Fitzpatrick, A.N. Hepatitis A // Am. Fam. Physician. 2006. -V. 73.-P. 2162-2168.

88. Jungeblut, C.S., Dalldorf, G. Epidemiological and experimental observations on the possible significance of rodents in a suburban epidemic of poliomyelitis II Am. J. Public Health. 1943. -V. 33. - P. 169-172.

89. Helwig, F.C., Schmidt, E.C.H., A filter-passing agent producing interstitial myocarditis in anthropoid apes and small animals // Science. 1945. - V. 102. - P. 31-33.

90. Dutter, A.E. Encephalomyocarditis in zoo animals // Ed. Fowler, M.E. Zoo and wild animals medicine. Philadelphia, Pennsylvania: W.B. Saunders Co. 1993. - P. 50-51.

91. Murane, T.G. Encephalomyocarditis // Ed. Beran, G.W. CRC handbook series in zones, section B (2)/ Viral zones. Boca Raton, FL: CRC Press. 1981. - P. 137-147.

92. Lipton, H.L. Human Vilyuisk encephalitis // Rev. Med. Virol. 2008. - V. 18. -P. 347-352.

93. Gajdusek, C. Encephalomyocarditis virus infection in childhood // Pediatrics. -1955.-V. 16.-P. 902-906.

94. Kirkland, P.D., Gleeson, A.B., Hawkes, R.A., Nairn, H.M., Broughton, C.R. Human infection with encephalomyocarditis virus in New South Wales // Med. J. Aust. 1989. -V. 151.-P. 176-177.

95. Wells, S.K., Gutter, A.E. Encephalomyocarditis virus: epizootic in a zoological collection // J. Zoo Wildl. Med. 1989. - V. 20. - P. 291-296.

96. Luo, M., Vriend, G., Kamer, G., Minor, I., Arnold, E., Rossmann, M.G., Boege, U., Scraba, D.G., Duke, G.M., Palmenberg, A.C. The atomic structure of Mengo virus at 3 A resolution // Science. 1987. - V. 235. - P. 182-191.

97. Racaniello, V.R. // Eds. Knipe, D.M., Howley, P.M., Griffin, D.E., Lamb, R.A., Martin, M.A., Roizman, B., Straus, S.E. Fields Virology 4th Ed. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers. 2001. - P. 685-722.

98. Semler, B.L., Wimmer, E. Molecular Biology of Picornaviruses // Washington, D.C.: Am. Soc. Microbiol. 2002.

99. Bedard, K.M., Semler, B.L. Regulation of picornavirus gene expression // Microbes Infect. (Institut Pasteur). 2004. - V. 6. - P. 702-713.

100. Parks, G.D., Duke, G.M., Palmenberg, A.C. Encephalomyocarditis virus 3C protease: efficient cell-free expression from clones which link viral 5' noncoding sequences to the P3 region // J. Virol. 1986. - V. 60. - P. 376-384.

101. Allen, M., Ball, B. The incidence and world distribution of honeybee viruses // Bee World. -1996.-V. 77.-P. 141-162.

102. Genersch, E., Aubert, M. Emerging and re-emerging viruses of the honey bee (Apis mellifera L.) // Vet. Res. 2010. - V. 41. - A. 54.

103. Bailey, L., Gibbs, A.J., Woods, R.D. Two viruses from adult honey bees (Apis mellifera Linnaeus) // Virology. 1963. - V. 21. - P. 390-395.

104. Bowen-Walker, P.L., Martin, S.J., Gunn, A. The transmission of deformed wing virus between honeybees (Apis mellifera L.) by the ectoparasitic mite Varroa jacobsoni Oud // J. Invertebr. Pathol. 1999. -V. 73. - P. 101-106.

105. Ball, B.V., Allen, M.F. The prevalence of pathogens in the honey bee (Apis mellifera) colonies infested with the parasitic mite Varroa jacobsoni // Ann. Appl. Biol. 1988. -V. 113.-P. 237-244.

106. Chen, Y.P., Siede, R. Honey Bee Viruses //Adv. Virus Res. 2007. - V. 70. -P. 33-80.

107. Govan, V.A., Leat, N., Allsopp, M., Davison, S. Analysis of the complete genome sequence of Acute bee paralysis virus shows that it belongs to the novel group of insect-infecting RNA viruses // Virology. 2000. - V. 277. - P. 457^463.

108. Bonning, B.C., Miller, W.A. Dicistroviruses // Annu. Rev. Entomol. 2010. -V. 55.-P. 129-150.

109. Tate, J., Liljas, L., Scotti, P., Christian, P., Lin, T., Johnson, J.E. The crystal structure of cricket paralysis virus: the first view of a new virus family // Nat. Struct. Mol. Biol. -1999.-V. 6.-P. 765-774.

110. Newman, J.F.E., Brown, F., Bailey, L., Gibbs, A.J. Some physico-chemical properties of two honey-bee picornaviruses // J. Gen. Virol. 1973. - V. 19. - P. 405^-09.

111. Liljas, L., Tate, J., Lin, T., Christian, P., Johnson, J.E. Evolutionary and taxonomic implications of conserved structural motifs between picornaviruses and insect picorna-like viruses // Arch. Virol. 2002. - V. 147. - P. 59-84.

112. Palese, P. Orthomyxoviridae // Eds. Knipe, D.M., Howley, P.M., Griffin, D.E., Lamb R.A., Martin, M.A., Roizman B., Straus, S.E. Fields Virology, 5th Edn. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins. 2007. - P. 1647-1689.

113. Noda, T., Sagara, H., Yen, A., Takada, A., Kida, H., Cheng, R.H., Kawaoka, Y. Ahitecture of ribonucleoprotein complexes in influenza A virus particles // Nature. 2006. -V. 439.-P. 490-492.

114. Yasuda, J., Nakada, S., Kato, A., Toyoda, T., Ishihama, A. Molecular assembly of influenza virus: association of the NS2 protein with virion matrix // Virology. 1993. - V. 196. -P. 249-255.

115. Skehel, J.J., Hay, A.J. Nucleotide sequences at the 5' termini of influenza virus RNAs and their transcripts // Nucleic Acids Res. -1978. V. 5. - P. 1207-1219.

116. Noda, T. Native morphology of influenza virions frontiers // Front Microbiol. -2011.-V. 2.-A. 269.

117. Oxford, J.S., Hockley, D.J. Orthomyxoviridae // Amsterdam: Elsevier. Animal virus structure. 1987. — P. 213-232.

118. Compans, R.W., Content, J., Duesberg, P.H Structure of the ribonucleoprotein of influenza virus // J. Virol. 1972. - V. 10. - P. 795-800.

119. Moss, B. // Philadelphia: Lippincott, Williams and Wilkins. Fields Virology.2001.

120. Goebel, S.J., Johnson, G.P., Perkus, M.E., Davis, S.W., Winslow, J.P., Paoletti, E. The complete DNA sequence of vaccinia virus // Virology. 1990. - V. 179. - P. 247-263.

121. Johnson, G.P., Goebel, S.J., Paoletti, E. An update on the vaccinia virus genome // Virology. 1993. -V. 196. - P. 381-401.

122. Cairns, J. The initiation of vaccinia infection // Virology. 1960. - V. 11. -P.603-623.

123. Moss, B. Poxvirus entry and membrane fusion // Virology. 2006. - V. 344. -P. 48-54.

124. Condit, R.C., Moussatche, N., Traktman, P. In a nutshell: structure and assembly of the vaccinia virion // Adv. virus res. 2006. - V. 66. - P. 31-124

125. Cyrklaff, M., Risco, C., Fernández, J.J., Jiménez, M.V., Estéban, M., Baumeister, W., Carrascosa, J.L. Cryo-electron tomography of vaccinia virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2005. V. 102. - P. 2772-2777.

126. Hyun, J.-K., Accurso, C., Hijnen, M., Schult, P., Pettikiriarachchi, A., Mitra, A.K., Coulibaly, F. Membrane remodeling by the double-barrel scaffolding protein of poxvirus // PLoS Pathog. 2011. - V. 7. - el002239.

127. Wilton, S., Mohandas, A.R., Dales, S. Organization of the vaccinia envelope and relationship to the structure of intracellular mature virions // Virology. 1995. - V. 214. -P. 503-511.

128. Chandran, K., Sullivan, N.J., Felbor, U., Whelan, S.P., Cunningham, J.M. Endosomal proteolysis of the Ebola virus glycoprotein is necessary for infection // Science.2005. V. 308. - P. 1643-1645.

129. Simmons, G., Gosalia, D.N., Rennekamp, A.J., Reeves, J.D., Diamond, S.L., Bates, P. Inhibitors of cathepsin L prevent severe acute respiratory syndrome coronavirus entry // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2005.-V. 102.-P. 11876-11881.

130. Sy, C.L., Lee, S.S., Liu, M.T., Tsai, H.C., Chen, Y.S. Rapid emergence of oseltamivir resistance // Emerg. Infect. Dis. 2010. - V. 16. - P. 723-725.

131. Wensing, A.M., van Maarseveen, N.M., Nijhuis, M. Fifteen years of HIV protease inhibitors: raising the barrier to resistance // Antiviral Res. 2010. - V. 85. - P. 59-74.

132. Coen, D.M., Richman, D.D. Antiviral Agents // Eds. Knipe, D.M., Howley, P.M. Fields Virology 5th Edition. 2007. - V. 2. - P. 448^176.

133. Kaufmann, S.H., Kabelitz, D. Immunology of Infection // Meth. Microbiol. -2002. -V. 32.

134. Martin, S.J. The Biochemistry of Viruses // Cambridge University Press. 1978.

135. Flint, S.J., Enquist, W., Racaniello, V.R., Skalka, A.M. Virological Methods // Principles of Virology. ASM Press. 2009.

136. Killian, M.L. Hemagglutination assay for the avian influenza virus // Ed. Spackman, E. Humana Press. Avian Influenza Virus. 2008. - V. 436. - P. 47-52.

137. Kemeny, D.M., Challacombe, S.J. ELISA and Other Solid Phase Immunoassays // New York: John Wiley and Sons. Theoretical and Practical Aspects. 1988.

138. Chen, Y.P., Higgins, J.A., Feldlaufer, M.F. Quantitative real-time reverse transcription-PCR analysis of deformed wing virus infection in the honeybee (Apis mellifera L.) // Appl. Environ. Microbiol. -2005. -V.71. P. 1436-1441.

139. Brussaard, C.P.D., Marie, D., Bratbak, G. Flow cytometric detection of viruses // J. Virol. Meth. -2000. -V. 85. P. 175-182.

140. Roingeard, P. Viral detection by electron microscopy: past, present and future // Biol. Cell.-2008. V. 100. - P. 491-501.

141. Niittymaki, T., Lonnberg, H. Artificial ribonucleases // Org. Biomol. Chem.2006.-V. 4.-P. 15-25.

142. Bergsson, G., Arnfinnsson, J., Karlsson, S.M., Steingrimsson, O., Thormar, H. In vitro inactivation of Chlamydia trachomatis by fatty acids and monoglycerides // Antimicrob. Agents Chemother. 1998. - V. 42. - P. 2290-2294.

143. Thormar, H., Isaacs, C.E., Brown, H.R., Barshatzky, M.R., Pessolano, T. Inactivation of enveloped viruses and killing of cells by fatty acids and monoglycerides // Antimicrob. Agents Chemother. 1987. - V. 31. - P. 27-31.

144. Hsu, B.B., Yinn, W.S., Hammond, P.T., Chen, J., Klibanov, A.M. Mechanism of inactivation of influenza viruses by immobilized hydrophobic polycations // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011. - V. 108. - P. 61-66.

145. Witvrouw,.M., De Clercq, E. Sulfated polysaccharides extracted from sea algae as potential antiviral drugs // Gen. Pharmacol. 1997. - V. 29. - P.497-511.

146. Ghosh, T., Chattopadhyay, K., Marschall, M., Karmakar, P., Mandal, P., Ray, B. Focus on antivirally active sulfated polysaccharides: from structure-activity analysis to clinical evaluation // Glycobiology. 2009. - V. 19. - P. 2-15.

147. Qian, K., Morris-Natschke, S.L., Lee, K.-H. HIV entry inhibitors and their potential in HIV therapy // Med. Res. Rev. -2009. V. 29. - P. 369-393.

148. Zahn, A., Allain, J.P. Hepatitis C virus and hepatitis B virus bind to heparin: purification of largely IgG-free virions from infected plasma by heparin chromatography // J. Gen. Virol. -2005. V. 86. - P. 677-685.

149. Nassar, R.A., Browne, E.P., Chen, J., Klibanov, A.M. Removing human immunodeficiency virus (HIV) from human blood using immobilized heparin // Biotechnol. Lett. -2012. -V. 34. P. 853-856.

150. Zuber, P., Nakano, M.M., Marahiel, M.A. Peptide antibiotics //Eds. Sonenshein, A.L., Hoch, J.A., Losick, R. Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria. American Society for Microbiology. 1993. - P. 897-919.

151. Vollenbroich, D., Ozel, M., Vater, J., Kamp, R.M., Pauli, G. Mechanism of inactivation of enveloped viruses by the biosurfactant surfactin from Bacillus subtilis // Biologicals. 1997. - V. 25. - P. 289-297.

152. Pinto, F., Maillard, J.-Y, Denyer, S.P. Effect of surfactants, temperature, and sonication on the virucidal activity of polyhexamethylene biguanide against the bacteriophage MS2 // Am. J. Infect. Control. 2010. - V. 38. - P. 393-398.

153. Takeda, N., Tanimura, M., Miyamura, K. Molecular evolution of the major capsid protein VP1 of enterovirus 70 // J. Virol. 1994. - V. 68. - P. 854-862.

154. Weaver, S.C., Kang, W.L., Shirako, Y., Rümenapf, T., Strauss, E.G., Strauss, J.H. Recombinational history and molecular evolution of western equine encephalomyelitis complex alphaviruses // J. Virol. 1997. - V. 71. - P. 613-623.

155. Bonnet, M.C., Dutta, A. World wide experience with inactivated poliovirus vaccine // Vaccine. 2008. - V. 26. - P. 4978^1983.

156. Nathanson, N., Kew, O.M. From emergence to eradication: the epidemiology of poliomyelitis deconstructed // Am. J. Epidemiol. 2010. - V. 172. - P. 1213-1229.

157. Ooi, M.H., Wong, S.C., Lewthwaite, P., Cardosa, M.J., Solomon, T. Clinical features, diagnosis, and management of enterovirus 71 // Lancet Neurol. 2010. - V. 9. -P. 1097-1105.

158. URL: http://www.polioeradication.org/

159. Shahzad, A, Köhler, G. Inactivated Polio Vaccine (IPV): a strong candidate vaccine for achieving global polio eradication program // Vaccine. 2009. - V. 27. - P. 52935294.

160. Rodriguez, L.L., Grubman, M.J. Foot and mouth disease virus vaccines // Vaccine. 2009. - V. 27. - P. D90-D94.

161. Murdin, A.D., Barreto, L., Plotkin, S. Inactivated poliovirus vaccine: past and present experience // Vaccine. 1996. - V. 8. - P. 735-746.

162. Wagstaff, A.J., Balfour, J.A. Combination hepatitis a-hepatitis B vaccine // BioDrugs. 1997. - V. 8. - P. 235-239.

163. Van Damme, P., Banatvala, J., Fay, O., Iwarson, S., McMahon, B., Van Herck, K., Shouval, D., Bonanni, P., Connor, B., Cooksley, G. Hepatitis A booster vaccination: is there a need?//Lancet.-2003.-V. 362.-P. 1065-1071.

164. King, A.M., Underwood, B.O., McCahon, D., Newman, J.W., Brown, F. Biochemical identification of viruses causing the 1981 outbreaks of foot and mouth disease in the UK // Nature. 1981. - V. 293. - P. 479^180.

165. Carlson, J.H., Joo, H.S., Encephalomyocardititis virus vaccine // United States Patent № 5213795. 25.05.1993.

166. Bahnemann, H.G. Binary ethylenimine as an inactivant for foot-and-mouth disease virus and its application for vaccine production // Arch. Virol. 1975. - V. 47. -P. 47-56.

167. Huntera, P., Swanepoela, S.P., Esterhuysena, J.J., Raathc, J.P., Bengisd, R.G., van der Lugt, J.J. The efficacy of an experimental oil-adjuvanted encephalomyocarditis vaccine in elephants mice and pigs // Vaccine. 1998. - V. 16. - P. 55-61.

168. Freshney, R. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique // Ed. Alan R. New York: Liss. Inc. 1987. - P. 117.

169. Hoffmann, E., Stech, J., Guan, Y., Webster, R.G., Perez, D.R. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses // Arch. Virol. 2001. - V. 146. -P.2275-2289.

170. Bakonyi, T., Grabensteiner, E., Kolodziejek, J., Rusvai, M., Topolska, G., Ritter W., Nowotny, N. Phylogenetic analysis of Acute bee paralysis virus strains // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V. 68. - P. 6446-6450.

171. Vanderhallen, H., Koenen, F. Identification of encephalomyocarditis virus in clinical aamples by reverse transcription-PCR followed by genetic typing using sequence analysis // J. Clin. Microbiol. 1998. -V. 36. - P. 3463-3467.

172. Kostenko, E.V., Laktionov, P.P., Vlassov, V.V., Zenkova, M.A. Downregulation of PGY/MDR1 mRNA level in human KB cells by antisense oligonucleotide conjugates // Biochem. Biophys. Acta. -2002. -V. 1576. P. 143-147.

173. Peng, Y.-S.C., Mussen, E., Fong, A., Montague, M.A., Tyler, T. Effects of chlortetracycline of honey bee worker larvae reared in vitro // J. Invertebr. Pathol. 1992. -V. 60.-P. 127- 133.

174. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-685.

175. Kotwal, J.G., Abrahams, M.R. Growing poxviruses and determining the virus titer // Methods Mol. Biol. 2004. - V. 269,- P. 101-112.

176. User gide. QIAamp® Viral RNA Mini Handbook, QiaGen, USA.

177. User gide. Genelute mammalian total RNA kit, Sigma, USA.

178. Mittereder, N., March, K.L., Trapnell, B.C. Evaluation of the concentration and bioactivity of adenovirus vectors for gene therapy // J. Virol. 1996. - V. 70. - P. 7498-7509.

179. Creusat, G., Rinaldi, A.-S., Weiss, E., Elbaghdadi, R., Remy, J-S., Mulherkar, R., Zuber, G. Proton sponge trick for pH-sensitive disassembly of polyethylenimine-based siRNA delivery systems // Bioconj. Chem. 2010. - V. 21. - P. 994-1002.

180. Kuznetsova, I., Silnikov, V.N. Small ribonuclease mimics // Ed. Zenkova, M.A. Artificial Nucleases. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg. - 2004. - P. 111-128.

181. Ball, B.V. Acute bee paralysis virus isolates from honeybee colonies infested with Varroa jacobsoni // J. Apic. Res. 1985. - V. 24. - P. 115-119.

182. Peng, Y.-S.C., Mussen, E., Fong, A., Montague, M.A., Tyler, T. Effects of chlortetracycline of honey bee worker larvae reared in vitro // J. Invertebr. Pathol. 1992. -V. 60.-P. 127-133.

183. Aupinel, P., Fortini, D., Dufour, H., Tasei, J.-N., Michaud, B., Odoux, J.-F., Pham-Delegue, M.-H. Improvement of artificial feeding in a standard in vitro method for rearing Apis mellifera larvae // Bull. Insectology. 2005. - V. 58. - P. 107-111.

184. Azzami, К., Ritter, W., Tautz, J., Beier, H. Infection of honey bees with acute bee paralysis virus does not trigger humoral or cellular immune responses // Arch. Virol. 2012. -V. 57.-P. 689-702.

185. Kovalev, N.A., Medvedeva, D.A., Zenkova, M.A., Vlassov, V.V. Cleavage of RNA by an amphiphylic compound lacking traditional catalytic groups // Bioorg. Chem. -2008.-V. 36.-P. 33-45.

186. Duke, G.M., Hoffman, M.A., Palmenberg, A.C. Sequence and structural elements that contribute to efficient encephalomyocarditis virus RNA translation // J. Virol. 1992. -V. 66.-P. 1602-1609.

187. Shen, В., Nolan, J.P., Sklar, L.A., Park, M.S. Essential amino acids for substrate binding and catalysis of human flap endonuclease 1 // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. -P. 9173-9176.

188. Логашенко, Е.Б., Кузнецова, И.Л., Рябчикова, Е.И., Власов, В.В., Зенкова, М.А. Механизм действия искусственных рибонуклеаз на раковые клетки человека // Биомед. хим. 2010. - Т. 56. - С. 230-243.

189. Fedorova, А.А., Goncharova, Е.Р., Kovpak, М.Р., Vlassov, V.V., Zenkova, М.А. Influenza virus inactivated by artificial ribonucleases as a prospective killed virus vaccine // Vaccine. 2012. - V. 30. - P. 2973-2980.

190. Chung, C.S., Chen, C.H., Ho, M.Y., Huang, C.Y., Liao, C.L., Chang, W. Vaccinia virus proteome: identification of proteins in vaccinia virus intracellular mature virion particles // J. Virol. 2006. - V. 80. - P. 2127-2140.

Информация о работе

Федорова, Антонина Александровна
кандидата химических наук
Новосибирск, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Инактивация вирусов искусственными рибонуклеазами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы