Иммуноцитохимическая характеристика ядрышковых белков в лимфоидных клетках человека и мыши

Малышева, Марина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммуноцитохимическая характеристика ядрышковых белков в лимфоидных клетках человека и мыши
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммуноцитохимическая характеристика ядрышковых белков в лимфоидных клетках человека и мыши"

На правах рукописи

МАЛЫШЕВА МАРИНА ВЛАДИМИРОВНА

ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЯДРЫШКОВЫХ БЕЛКОВ В ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА И МЫШИ

03.01.04. - биохимия 14.01.21. - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

004615396

-2 ЛЕН 2010

Москва 2010

004615396

Работа выполнена в «Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН»

и «Учреждении Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН».

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Т.И. Булычева, доктор биологических наук, профессор О.В. Зацепина

доктор медицинских наук, профессор В.М. Погорелов, доктор биологических наук, профессор A.B. Филатов

ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена Росмедтехнологий», Москва

Защита диссертации состоится « & » заседании диссертационного совета Д

/Lt0^ 2010 года в 1 j часов на

31.042.02 в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН по адресу: 125167, Москва, Новозыковский проезд, дом 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН.

Автореферат разослан « » 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Е.Е. Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Оценка пролиферативной активности лимфоидных клеток при лимфопролиферативных заболеваниях является одним из важных показателей в диагностике варианта заболевания и определении степени злокачественности процесса. Этот показатель используется для прогнозирования скорости опухолевого роста и выбора адекватного курса лечения.

Активация клеток млекопитающих к пролиферации сопровождается увеличением содержания многих ядерных белков. К ним, в частности, относятся факторы репликации, транскрипционные факторы, циклинзависимые киназы, а также белки ядрышка - основного структурного домена клеточного ядра, необходимого для образования рибосом и обеспечивающего белоксинтезирующие функции клеток. Согласно последним данным протеомного анализа, ядрышки клеток человека содержат 700-4500 белков. К ядрышковым белкам относятся, в частности, белки связанные с транскрипцией рДНК (РНК полимераза I, факторы транскрипции рДНК, топоизомеразы), а также белки цитоплазматических рибосом и специфические ядрышковые белки, необходимые для процессинга рРНК, включая фибрилларин, В23/нуклеофозмин/нуматрин/Ы038 (В23) и С23/нуклеолин (нуклеолин). Одним из важнейших свойств ядрышка является его высокая структурная и функциональная изменчивость, которая отражает общий уровень метаболизма и способность клеток к пролиферации. Показано, что размеры ядрышек прямо коррелируют со скоростью пролиферации опухолевых клеток. Изменение функционального состояния ядрышка в ходе клеточного цикла сопровождается также изменением количественного содержания его белков. К таким белкам относятся, в частности, аргентофильные белки. Количественный анализ содержания аргентофильных белков в настоящее время используется для оценки скорости пролиферации клеток, а также в диагностических и прогностических целях. Установлено, что размеры аргентофильных зон в ядрышках варьируют в зависимости от формы острого лейкоза и прямо коррелируют со злокачественностью процесса.

Мажорные белки ядра и ядрышка - В23, РСИА, Кь67, содержание которых возрастает при переходе от состояния пролиферативного покоя к делению, относят к маркерам клеточной пролиферации, а антитела ним используют в клинической диагностике для прогностической оценки скорости роста злокачественного клона. Однако, набор белковых маркеров активации лимфоцитов в настоящее время крайне ограничен, а белки, указывающие на ранние стадии активации лимфоцитов к пролиферации, которые могли бы найти применение в онкогематологии, на сегодняшний день отсутствуют.

Целью работы явилось сравнительное изучение экспрессии ключевых белков ядрышка в лимфоидных клетках человека в различные периоды пролиферативного процесса, а также выявление ранних маркеров активированных лимфоцитов человека и мыши.

Задачи работы.

1. Изучить содержание ключевых белков ядрышка 8(Л1Р-6 и В23 при активации лимфоцитов мыши к пролиферации с помощью конканавалина А (Кон А).

2. Изучить уровень экспрессии БиИР-б в лимфоцитах селезенки мыши, активированных к пролиферации Кон А.

3. Изучить экспрессию белков ядрышка - фибрилларина, В23, нуклеолина и БиКИ-б - при активации лимфоцитов периферической крови человека к пролиферации с помощью фитогемагглютинина (ФГА) методом иммуноцитохимии.

4. Оценить количественное содержание этих же белков в процессе ФГА-стимуляции на иммуноблотах.

5. Проанализировать экспрессию В23, фибрилларина и ЯиМ^-б в лимфоидных клетках ограниченного числа больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями.

6. Сопоставить уровень экспрессии вышеназванных белков с уровнем пролиферации лимфоидных клеток, определяемым маркерными белками К¡-67

и рсяа.

Научная новизна исследования. На модели ФГА-стимулированной культуры лимфоцитов человека показаны изменения в содержании и уровне экспрессии белков ядрышка фибрилларина и нуклеолина. Впервые на этой же модели показано, что белок БиКР-б не выявляется в покоящихся лимфоцитах, а его экспрессия в ФГА-активированных лимфоцитах начинается до экспрессии известных маркеров клеточной пролиферации белков Кл-67 и РСЫА. Выявлена положительная корреляция между экспрессией белка БиЯР-б и белками Ю-67 и РСЫА в лимфоидных клетках больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями. Эти наблюдения впервые показали, что белок ядрышка ЗиИР-б может служить маркером ранней активации лимфоцитов человека к пролиферации, а также иметь прогностическое и, возможно, диагностическое значение. Показано, что, как и в лимфоцитах периферической крови человека, ЭиЯР-б не выявляется в лимфоцитах, выделенных из селезенки мышей. Таким образом, на сегодняшний день белок ЗиЯР-б является единственным белком ядрышка, который, не выявляясь в ядрышках покоящихся лимфоцитов млекопитающих (на примере человека и мыши), начинает экспрессироваться в митоген-стимулированных лимфоцитах раньше известных маркеров клеточной пролиферации (Кь67 и РСЫА).

Теоретическая и практическая ценность работы. Полученные результаты расширяют существующие фундаментальные представления о белках ядрышка как маркерах клеточной пролиферации. Возможность выявления по состоянию ядрышкового белка БиЛТ-б ранней стадии пролиферативной активности лимфоцитов (по-видимому, ранней 01 -фазы), не выявляемой общеизвестным антигеном Кь67, позволяет рекомендовать его анализ для лабораторных исследований в клинической практике с целью

ранней диагностики злокачественной транформации лимфоцитов. Выявленная корреляция экспрессии белков К1-67 и БиКР-б у больных с лимфопролиферативными заболеваниями, с повышением их экспрессии при нарастании злокачественности процесса, позволяет рассчитывать на широкое клиническое применение антител к БиЛТ-б.

Положения, выносимые на защиту.

1. С использованием первичной культуры лимфоцитов селезенки мыши, активированных к пролиферации конканавалином А, показано, что уровень белков БиИТ-б и В23 возрастает при активации клеток к пролиферации, при этом 8иЯР-6 не выявляется в неактивированных лимфоцитах.

2. На модели стимулированной ФГА культуры лимфоцитов здоровых лиц показано, что белок ЗиЯБ-б является надежным маркером последовательных стадий активации лимфоцитов человека к пролиферации. БиКИ-б отсутствует в неактивированных лимфоцитах и начинает выявляться в клетках раньше маркеров клеточной пролиферации - белков Кл-67 и РСЫА.

3. Существует положительная корреляция между экспрессией белка ЗиЯР-б и белков Кл-67 и РСМА в лимфоидных клетках больных различными лимфопролиферативными заболеваниями.

4. Белок ядрышка БШи-б может служить новым маркером активации лимфоцитов млекопитающих к пролиферации и иметь дополнительное диагностическое и прогностическое значение.

Апробация работы состоялась 21 июня 2010 г. на заседании проблемной комиссии «Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология; гемобластозы и депрессии кроветворения» Учреждения Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН и 24 июня 2010 года на заседании межлабораторного научного коллоквиума Учреждения Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Основные положения диссертации были представлены на II Съезде общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007), Научно-практической конференции «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине» (Ростов-на-Дону, 2007), VII Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, 2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), XXI и XXII зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009 и 2010 гг.), XVIII Международной конференции "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" (Украина, Гурзуф, 2010), III Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК и 9 тезисов. Получено положительное заключение о выдаче патента.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных данных, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Библиографический указатель включает 29 отечественных и 218 зарубежных литературных источника. Диссертация иллюстрирована 9 таблицами, 11 рисунками и 17 фотографиями.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали клетки человека и мыши, включая клетки линии Jurkat, полученные из трансформированных клеток Т-лимфобластной лейкемии человека; клетки лимфоидной и миелоидной линий (Ramos и К562); клетки карциномы шейки матки HeLa; фибробласты мыши NIH/3T3. Были использованы также интактные и стимулированные конканавалином А (КонА) лимфоциты селезенки мыши; интактные и стимулированные фитогемагглютининм (ФГА) лимфоциты, выделенные из периферической крови практически здоровых лиц (8 человек), а также лимфоидные клетки, выделенные из периферической крови, селезенки и лимфатических узлов больных с лимфопролиферативными заболеваниями, находящихся на лечении в клинических отделениях ГНЦ РАМН (37 человек). Образцы поступали в лабораторию клинической иммунологии ГНЦ РАМН для иммунодиагностики лимфопролиферативных заболеваний.

Для изучения локализации белков в фиксированных клетках методом непрямой иммунофлуоресценции потребовалось отрабатывать специальный протокол проведения реакций. Было обнаружено, что наиболее удачным фиксатором для иммуноцитохимического мечения клеток антителами является фиксация ацетоном. Этот вывод оказался справедливым для культивируемых клеток человека HeLa, Ramos, К562 и лимфоцитов. Непрямую иммунофлуоресцентную реакцию проводили на клетках монослойных культур, выращенных на стеклах или на клетках суспензионных культур, нанесенных на 8-луночные стекла, предварительно обработанные поли-Ь-лизином. Зафиксированные препараты клеток инкубировали с поликлональными кроличьими антителами к белку SURF-6 (Magoulas et al., 1998, разведение 1:100 в фосфатно-солевом буфере) или фибрилларину (1:100, «Abcam», США); моноклональными мышиными антителами к В23 (1:200, «Sigma», США), Ki-67 (1:50, «Dako», Дания) или нуклеолину (1:100, предоставлены др. Дж. Ольсоном, университет г. Джексона, Миссисипи, США) во влажной камере в течение 1 ч при комнатной температуре. После отмывки в трех сменах фосфатно-солевого буфера (ФСБ; 0.14 M NaCl, 2.7 мМ КС1, 8.1 мМ Na2HP04, 1.5 мМ КН2Р04) по 10 мин клетки метили антителами к иммуноглобулинам кролика или мыши, конъюгированными с TRITC (1:400, «JacksonlmmunoRes Lab.», США) или FITC (1:200, «Sigma»), при комнатной температуре в течении 40 мин. Препараты докрашивали 10 мин красителем 0.1 мкг/мл ДАФИ (DAPI, «Sigma») на хроматин и заключали в Мовиол (Mowiol, «Calbiochem», Швейцария). Препараты изучали в инвертированном эпифлуоресцентном микроскопе

Axiovert 200 («Carl Zeiss», Германия), используя объективы ЮОх Plan-Neofluar/1.3Ph и соответствующие наборы фильтров. Изображения записывали с помощью 13-битной монохромной камеры CoolSnapcf («RoperScientific», США) и обрабатывали с помощью программы AdobePhotoshop CS3, версия 10. Для статистического анализа на каждую экспериментальную точку анализировали не менее 500 клеток, данные обрабатывали с помощью программы Microsoft Excel и сравнивали по критерию Манна-Уитни (U) и по коэффициенту корреляции Спирмена (rs).

Начало активации лимфоцитов определяли путем мечения клеток аналогом тимидина, бромдезоксиуридином (БрдУ). БрдУ в конечной концентрации 20 мкМ добавляли в культуральную среду на 30 мин перед посадкой клеток на стекла и фиксации абсолютным ацетоном. После фиксации отмывали в ФСБ 3 раза по 5 мин и проводили гидролиз ДНК в 4 н HCl в течение 40 мин при комнатной температуре. После отмывки в ФСБ клетки инкубировали с мышиными моноклональными антителами к БрдУ (1:20, «Sigma») 40 мин в темноте во влажной камере при комнатной температуре. Отмывали в трех сменах ФСБ по 10 мин и инкубировали с антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с FITC, в течение 40 мин в тех же условиях. Отмывали в ФСБ три раза по 10 мин, окрашивали 0.1 мкг/мл DAPI 10 мин и заключали в мовиол. Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Axiovert 200, как описано выше.

Анализ распределения активированных лимфоцитов по разным фазам клеточного цикла производили на цитофлуориметре EPICS «ELITE» («Beckman Coulter», США), с помощью сервисной группы ИБХ. Для этого лимфоциты осаждали центрифугированием при 700g 10 мин, дважды промывали ФСБ, фиксировали 70%-ным этанолом при 4° С 15 мин и инкубировали в буфере, содержащем 50 мкг/мл пропидия иодида и 0.5 мг/мл РНКазы А в ФСБ, 1 ч при 37° С. На каждую точку анализировали не менее 104 клеток. Данные обрабатывали с помощью программы MULTIGRAPH («Beckman Coulter», США).

Для того чтобы изучить качественные и количественные изменения ядрышковых белков при переходе клеток от состояния покоя к пролиферации, была использована модель первичной культуры лимфоцитов селезенки мыши, стимулированных КонА, а так же модель первичной культуры лимфоцитов периферической крови здоровых лиц, стимулированных ФГА. Выделенные лимфоциты культивировали в присутствии митогена в течение разных промежутков времени (от 16 до 72 ч), фиксировали и использовали для иммуноцитохимических реакций.

Параллельно проводили количественное определение белков методом иммуноблотов. Для этого клетки лизировали в буфере, содержащем 10 мМ Tris-НС1, pH 6.8, 20% глицерина, 4% SDS, 200 мМ, ß-меркаптоэтанола, 0.1% бромфенолового синего. Лизаты были получены из одинакового количества покоящихся и активированных лимфоцитов (~ 105 клеток). Суммарную концентрацию белка в лизатах определяли на спектрофотометре Spectronic Genesis lOBio («Thermo Electronic Co», США) по методу Лоури в модификации

Петерсона. Электрофоретическое разделение белков проводили в 10%-ном полиакриламидном геле на установке фирмы «Amersham Biosciences» (США) по методу Лэммли (Laemmli, 1970). В работе использовался метод полусухого переноса белков на мембрану в камере для электроблоттинга. Перед переносом гель и нитроцеллюлозную Мембрану Protran (диаметр пор 0.22 мкм, «Schleicher and Schuell», Германия) инкубировали в буфере для переноса, содержащем 48 мМ Трис, 39 мМ глицина, 20% метанола, рН 9.2, в течение 30 мин. Перенос белков из геля на мембрану проводили в небольшом количестве буфера для переноса при постоянном напряжении 25 В в течение 40 мин. Для предотвращения неспецифической сорбции мембрану инкубировали в 5%-ном растворе обезжиренного сухого молока в буфере TBS-T (20 мМ Трис-НС1, 150 мМ NaCl, 0,05% Твин-20, рН 7.6) в течение ночи при +4° С. Мембрану инкубировали с поликлональными кроличьими антителами к белку SURF-6 (разведение 1:1000 в буфере TBS-T, содержащем 5% сухого молока) или фибрилларину (1:1000), моноклональными мышиными антителами к В23 (1:500) или нуклеолину (1:1000) или с поликлональными кроличьими антителами к PCNA (1:500, «Santa Cruz», США) 1 ч при комнатной температуре. Отмывали в буфере TBS-T, содержащем 5% сухого молока 4 раза по 5 мин и инкубировали мембрану с антителами к иммуноглобулинам кролика или мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена (1:10000, «Sigma»), 40 мин при комнатной температуре. Антитела проявляли с помощью набора ECL+Plus Detection Kit («AmershamPharmaciaBiotech», Великобритания) и рентгеновской пленки HyperFilm ECL («AmershamPharmaciaBiotech»), следуя рекомендациям производителя. Для повторного использования мембраны связанные антитела удаляли в буфере, содержащем 100 мМ р-меркаптоэтанола, 2% додецилсульфата натрия, 62.5 мМ Трис-HCl (рН 6.7), 40 мин при 40-50° С. В отдельных экспериментах после переноса гели фиксировали 10%-ной трихлоруксусной кислотой 40 мин и окрашивали 0.08%-ным раствором коллоидного Coomassie blue G-250 («Amresco", США), содержащим 20% этанола, 1,6% ортофосфорной кислоты, 8% сульфата аммония и 70% воды, в течение ночи с интенсивным перемешиванием. В качестве контроля к каждому опыту использовали лимфоциты, которые инкубировали в тех же условиях без ФГА.

Возможность использования антител к белкам В23, фибрилларину и SURF-6 в онкогематологии была изучена нами на клетках больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями. Подобно интактным лимфоцитам, лимфоидные клетки анализировали методом непрямой иммуноцитохимии и наиммуноблотах.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Подбор оптимального метода фиксации клеток мыши

Поскольку одна из задач работы включала одновременное иммуноцитохимическое выявление белков SURF-6 и В23, было необходимо

подобрать универсальный протокол фиксации клеток, позволяющий в оптимальных условиях выявлять оба белка. Для решения этой задачи использовали фибробласты мыши линии ШН/ЗТЗ. Клетки фиксировали одним из следующих фиксаторов:

• абсолютный ацетон (15 мин, 4° С);

• абсолютный этанол (15 мин, 4° С);

• абсолютный метанол (15 мин, 4° С);

• 3%-ный раствор параформальдегида (ПФА) (15 мин, 21° С).

Обнаружено, что лучшие результаты по выявлению обоих белков позволяет получить фиксация клеток ацетоном. Поэтому для одновременного выявления В23 и ЗиКР-б в активированных лимфоцитах селезенки мыши, в первую очередь, был использован этот способ фиксации клеток.

Контроль активации лимфоцитов селезенки мыши к пролиферации Кон А

Анализ активации лимфоцитов производили с помощью проточной цитофлуориметрии и мечения БрдУ в трех независимых сериях экспериментов. В совокупности, наши данные показали, что основная популяция неактивированных лимфоцитов селезенки мыши обладает диплоидным содержанием ДНК, т.е. находится в СО (С0/С1) периоде клеточного цикла. Заметное увеличение доли клеток в Б-периоде (около 10%) наблюдалось через 24 ч, а максимальное количество клеток в Э-фазе клеточного цикла выявлялось через 48 ч после активации (табл. 1)

Таблица 1. Доля клеток, меченых БрдУ (в %), на разных сроках после активации лимфоцитов селезенки мыши КонА.

Время после активации (ч) 0 16 24 48 72

Доля меченых клеток (%) 1,2 3,5 10,1 22,0 18,2

Локализация В23 и БиЯГ-б в лимфоцитах селезенки мыши на разных сроках активации

В ядрышках неактивированных лимфоцитов отчетливо выявлялся белок В23. Как видно на рисунке 1 в ядрышках и ядрах тех же лимфоцитов БШИ^-б не выявлялся (рис. 1). Следует отметить, что отсутствие окраски на БиКР-б в покоящихся лимфоцитах не являлось результатом недоступности антител к антигену, т.к. при двойном иммуномечении (рис. 1а, в) в ядрышках одних и тех же лимфоцитов выявлялся В23 (рис. 1а), а 51ЖР-6 не обнаруживался (рис. 1в).

При активации лимфоцитов КонА наблюдалось значительное укрупнение клеток, увеличение размеров ядрышек и появление в них 81ЖР-6, начиная с 16 ч после добавления митогена (рис. 2). Подобно В23, 81Л1Р-6 сохранялся в ядрышках на всех сроках активации. В активированных лимфоцитах ядрышки окрашивались антителами к обоим белкам ярко и однородно (рис. 2).

В23, 0 ч а БШ^-б, 0 ч в

\ \ \

Ч ч ч

Рис. 1. Двойное иммуномечение интактных лимфоцитов селезенки мыши антителами к В23 и 81ЖР-6. Стрелками указаны ядрышки. Масштабная линия - 10 мкм.

В23, 16 ч I В23, 24 ч * |В23, 72 ч

БШР-б, 16 ч викр-б, 24 ч Э^Р-б, 72 ч /

/ \

Рис. 2. Иммуноцитохимическое выявление белков В23 и ЗиМ-б в лимфоцитах селезенки мыши через 16, 24 и 72 ч после активации к пролиферации КонА. Стрелками указаны ядрышки. Нижний ряд - фазовый контраст для окрашивания антителами к ЭиКР-б. Масштабная линия - 10 мкм.

Количественное содержание белков SURF-6 и В23 в лимфог^итах селезенки мыши на разных сроках после активации

С помощью метода иммуноблоттинга было изучено количественное содержание SURF-6 и В23 в лимфоцитах. В качестве контрольного белка использовали белок PCNA. Как видно на рисунке 3, белок PCNA впервые выявлялся в суммарных лизатах лимфоцитов через 24 ч после активации, т.е. на том сроке когда, по результатам мечения клеток БрдУ и проточной цитофлуориметрии, наступала S-фаза первого клеточного цикла.

Оч 16ч 24ч 48ч 72ч NIH/3T3

Рис. 3. Содержание белков SURF-6, В23 и PCNA, в интактных лимфоцитах мыши и в лимфоцитах на разных сроках после активации пролиферации КонА.

В неактивированных лимфоцитах белок SURF-6 не выявлялся, но его количество прогрессивно увеличивалось при их активации вплоть до 48 ч. Следует отметить, что SURF-6 начинал выявляться в ядрышках активированных лимфоцитов уже через 16 ч после добавления КонА, что свидетельствует о том, что данный белок начинает экспрессироваться на стадиях, предшествующих активной клеточной пролиферации. Через 72 ч наблюдалось некоторое уменьшение содержания SURF-6. Это, вероятнее всего, связано с началом гибели лимфоцитов при длительном культивировании in vitro, сопровождающейся деградацией SURF-6. Содержание В23 также увеличивалось с увеличением доли пролиферирующих лимфоцитов. Однако, в отличие от белка SURF-6, В23 выявлялся в неактивированных лимфоцитах, а его максимальное содержание наблюдалось через 72 ч после активации. Относительно высокий уровень В23, наблюдаемый через 72 ч после активации лимфоцитов, можно объяснить большей устойчивостью этого белка при гибели клеток (Сауткина и др., 2006).

Таким образом, наши исследования показали, что содержание белков SURF-6 и В23 увеличивается при активации пролиферации лимфоцитов селезенки мыши in vitro. Однако, в отличие от В23, SURF-6 не выявлялся в покоящихся лимфоцитах селезенки, появляясь в ядрышках на ранних этапах активации.

Подбор оптимальных условий фиксации клеток человека для выявления анализируемых белков

Для выбора оптимальных условий фиксации лимфоцитов человека для выявления ядрышковых белков использованы антитела к белкам ядрышка

SURF-6 В23 PCNA

фибрилларину, В23 и ЭТЛ^-б и культивируемые клетки человека НеЬа. Были апробированы следующие варианты фиксации клеток:

• абсолютный ацетон (15 мин, 4° С);

• абсолютный этанол (15 мин, 4° С);

• абсолютный метанол (15 мин, 4° С);

• 3%-ный раствор параформальдегида (3% ПФА) (15 мин, 210 С).

Характер окрашивания клеток одними и теми же антителами варьировал в зависимости от использованного фиксатора. Наиболее универсальной фиксацией при работе с данными антителами оказалась фиксация ацетоном - в этом случае флуоресцентные сигналы видны во всех ожидаемых районах клетки, а фоновое свечение - минимально (рис. 4).

Рис. 4. Выявление белков ядрышка: фибрилларина (а-а'"), В23 (б-б'") и SURF-6 (в-в'") в клетках HeLa после различных методов фиксации.

1 - фиксация 3% ПФА,

2 - фиксация ацетоном,

3 - фиксация метанолом,

4 - фиксация этанолом. Масштабная линия - 5 мкм. Пунктирная линия очерчивает ядро.

Этот вывод оказался справедливым также для культивируемых клеток человека Ramos, К562 и лимфоцитов. Было замечено, что фиксация параформальдегидом, используемая в большинстве лабораторий, не дала лучших результатов при выявлении некоторых антигенов (В23, SURF-6), что, вероятно, связано со способностью формалиновых фиксаторов маскировать антигенные детерминанты, снижая, таким образом, их доступность для узнавания антителами (Plenat et al., 2001).

Контроль активации лимфоцитов периферической крови человека к пролиферации

Пролиферативную активность лимфоцитов на разных сроках после активации ФГА оценивали методом цитофлуориметрического анализа (табл. 2). Первые признаки вступления клеток в фазу репликации ДНК наблюдали через 16-24 ч после добавления митогена. Заметное увеличение доли клеток в S-периоде (около 12%) обнаруживалось через 48 ч. Наибольшая доля клеток в S-фазе клеточного цикла (33%) выявлялась через 72 ч после добавления митогена.

Таблица 2. Распределение клеток по разным фазам клеточного цикла в контроле и на разных сроках после активации ФГА (в %) гто данным цитофлуориметрического анализа, полученным в трех независимых сериях экспериментов.__

Фазы клеточного цикла 0 ч 16ч 24 ч 48 ч 72 ч

С0Я31 100 98+1 94+2 84±6 63+3

Э 0 2±1 6±2 12±4 33+2

0 0 <1 4+2 4±1

Локализация белков ядрышка в лимфоцитах периферической крови человека

Изучение локализации белков 81Л1Р-6, фибрилларина, нуклеолина, Кл-67 и В23 в лимфоцитах периферической крови человека в процессе клеточного цикла производили в реакции непрямой флуоресценции. Содержание клеток, в которых выявляются данные белки, на разных сроках активации приведены в таблице 3 и на рисунке 5 по результатам 8 независимых экспериментов.

Рис. 5. Доля клеток (в %), ядрышки которых окрашиваются на белки фибрилларин, нуклеолин, В23, ЗиИР-б и Кл-67 в популяции покоящихся лимфоцитов периферической крови здоровых доноров и на разных сроках после их активации ФГА.

--фибрилларин

-С23 -»- -В23 -щ- - 311(^-6 -♦- - «¡-67

Таблица 3. Доля клеток (в %), ядрышки которых окрашиваются на белки: КГ67, В23, нуклеолин, фибрилларин (фибр.) и 81ЖР-6, в популяции интактных лимфоцитов периферической крови здоровых лиц на разных сроках после активации ФГА.

Время (в ч) Ю-67 В23 нуклеолин фибр. эшр-б

0 0 54±8 70±9 79±6 0

16 <2 60±5 72±4 85±3 12+3

24 18±2 74 ±3 81 ±4 86±2 32±7

48 35+2 84+3 88+1 91 ±1 54±8

72 ^49+5 95±3 97+3 97+3 85±2

Белок Кл-67 иммуноцитохимически не выявлялся в неактивированных лимфоцитах. Клетки, ядрышки которых метятся на Кл-67, впервые появлялись через 24 ч после добавления ФГА, и по мере активации их число увеличивалось. Через 72 ч этот белок присутствовал в ядрышках 49% клеток (табл. 3). Белок В23 отчетливо выявлялся в покоящихся лимфоцитах периферической крови и сохранялся в ядрышках на всех сроках активации.

Белки фибрилларин и нуклеолин в неактивированных лимфоцитах выявлялись в подавляющем большинстве клеток, а их доля превышала содержание В23-позитивных клеток (рис. 5, табл. 3). Число клеток, содержащих данные белки,

0 ч \ 16ч / 24 ч \

/ / /

48 ч 72 ч

\ /

\ \ \ /

Рис. 6

Иммуноцитохимическое выявление белка ЭиЮР-б в интактных лимфоцитах

человека и в лимфоцитах, активированных к

пролиферации ФГА. Нижний ряд - фазовый контраст. Стрелками указаны ядрышки. Масштабная линия - 10 мкм.

увеличивалось при активации лимфоцитов. Через 72 ч после добавления ФГА эти белки присутствовали в ядрышках всех клеток (табл. 3).

В ядрышках и ядрах неактивированных лимфоцитов человека белок 81Л1Р-6 не выявлялся (рис. 6, табл. 3). Как и в лимфоцитах селезенки мыши, в лимфоцитах человека, стимулированных к пролиферации ФГА, 8Ш1Р-6 обнаруживался в ядрышках уже через 16 ч после добавления митогена (рис. 6), т.е. на том сроке, когда не происходило значительного увеличения доли клеток в Б-фазе клеточного цикла (табл. 2). Особенно заметны 81ЖР-6-позитивные клетки были через 48 и 72 ч после активации, когда ядрышки достигали размеров 3-5 мкм (рис. 6). Число клеток, содержащих ЗиЯТ-б, увеличивалось по мере активации лимфоцитов. Через 72 ч после добавления ФГА этот белок присутствовал в ядрышках практически всех клеток (рис. 6, табл. 3).

В23 Б1ЖР-6

- У И

Рис. 7. Двойное иммуномечение интактных лимфоцитов периферической крови человека антителами к В23 и виКТ-б. Стрелками указаны ядрышки. Масштабная линия - 5 мкм.

Методом двойного иммуномечения антителами к ЗиИР-б с антителами к В23 для интактных и Кь67 для активированных лимфоцитов, было показано, что отсутствие окраски на ЗиКР-б в интактных лимфоцитах не связано с недоступностью антител к антигену, поскольку ядрышки тех же клеток отчетливо окрашивались антителом к В23 (рис. 7). Кроме того было обнаружено, что через 48 ч после активации в популяции присутствуют клетки, в которых выявляется 31ЖР-6, но не выявляется Ю-67 (рис. 8).

вШ^-б «¡-67

\ \ \

— / / /

Рис. 8. Двойное иммуномечение лимфоцитов периферической крови человека через 48 ч после активации ФГА антителами к ЭиКР-б и КГ67. Стрелками указаны ядрышки. Масштабная линия - 10 мкм.

Количественное содержание ключевых белков ядрышка в лимфоцитах здоровых лиц на разных сроках после активации ФГА

Для количественной оценки содержания ключевых белков ядрышка в лимфоцитах периферической крови человека, активированных к пролиферации in vitro, использовали метод иммуноблоттинга. Уровень экспрессии белков сравнили с содержанием известного маркера пролиферирующих клеток - белка PCNA, который подобно Ki-67 не выявляется в непролиферирующих клетках, но имеет намного меньшую молекулярную массу. Как видно на рисунке 9, PCNA не обнаруживался в неактивированных лимфоцитах и лимфоцитах, лизированных через 16 и 24 ч после активации, но его количество прогрессивно увеличивалось на последующих сроках и через 72 ч оказывалось сопоставимым с содержанием белка в клеточной линии Jurkat, используемой в качестве контроля.

Оч 16ч 24ч 48ч 72ч Jurkat 0 16 24 48 72 Jurkat

нукл , |Щ . 110кДа |

SURF-6 — —

PCNA фибр.

Рис. 9. Содержание белков SURF-6, фибрилларина (фибр.), нуклеолина (нукл.), В23 и PCNA в неактивированных лимфоцитах, в лимфоцитах на разных сроках после ФГА-активации и в клетках линии Jurkat. Справа - электрофореграмма суммарных белков. Цифрами обозначено время после активации в часах.

Белок фибрилларин отчетливо выявлялся в неактивированных лимфоцитах, и его содержание оставалось практически одинаковым на всех сроках после активации лимфоцитов.

Нуклеолин с электрофоретической подвижностью в районе 110 кДа, отчетливо выявлялся только через 72 ч после активации. Однако в неактивированных лимфоцитах и на всех сроках после активации к пролиферации на иммуноблотах выявлялись белки с меньшей массой - от 97 «Да до 105 кДа. Вероятнее всего это укороченные формы белка, которыми богаты покоящиеся клетки (Chen et al., 1991). В пользу этого говорят литературные данные, согласно которым стабильность молекулы нуклеолина находится в прямой зависимости от клеточной пролиферации (Mehes et al., 1995) и тот факт, что на иммуноцитохимическом уровне нуклеолин отчетливо выявлялся в ядрышках покоящихся лимфоцитов.

Особенно отчетливо активация лимфоцитов сопровождалась увеличением содержания В23. При этом в соответствии с данными

иммуноцитохимического анализа белок выявлялся также в неактивированных лимфоцитах (рис. 9).

Белок БилТ-б не выявлялся в покоящихся лимфоцитах, подобно известному маркеру пролиферации РСЫА. Однако, подобно В23, отчетливое увеличение содержания БШ^-б отмечено уже через 16 ч после активации, т.е. на том сроке, когда не происходит значительного увеличения доли клеток в Б-фазе клеточного цикла и пролиферативный маркер белок РСЫА отсутствует (рис. 9). Затем уровень 81Л1Б-6 прогрессивно повышался вплоть до 72 ч после активации пролиферации.

Содержание ключевых белков ядрышка в лимфоидных клетках больных лимфопролиферативными заболеваниями

Основные результаты анализа локализации и содержания белков ядрышка в лимфоидных клетках 37 больных лимфопролиферативными заболеваниями суммированы в таблице 4, в сравнении с данными исследования лимфоцитов 8 здоровых лиц.

Как видно из таблицы 4, у больных доля клеток с экспрессией Кл-67 варьировала в зависимости от диагноза заболевания. Наименьшие значения Кл-67-положительных клеток отмечены у больных с лимфоцитомой селезенки (от 2 до 12%). При хроническом лимфолейкозе количество Кл-67-положительных клеток варьировало от 1 до 55%, в зависимости от стадии болезни, что согласуется с литературными данными фюр е! а1., 2005; Хи е1 а1., 2006). Наибольшие значения пролиферативной активности по количеству Кл-67-положительных клеток отмечены у больных с лимфомой из клеток мантийной зоны селезенки (от 10 до 32%) и при лимфосаркоме (до 75%). Полученные результаты согласуются с литературными данными (с!е Ме1о ег а1., 1992; Лорие, 2006; Вгоус1е е1 а1„ 2009).

Доля клеток, ядрышки которых окрашивались на фибрилларин, у больных, составляла, в среднем, от 68 до 81%, существенно не отличаясь от числа фибрилларин-положительных лимфоцитов периферической крови здоровых лиц (табл. 4), что свидетельствует о нецелесообразности использования данного белка в качестве диагностического или прогностического маркера.

Содержание лимфоцитов с экспрессией В23 было повышено у четверти больных по сравнению со здоровыми лицами, составляя, в среднем, от 44 до 60%. При этом белок В23 выявлялся также и в интактных лимфоцитах, что снижает его диагностическое значение. Между экспрессией В23 и Кт-67 была обнаружена положительная корреляция (коэффициент ранговой корреляции Спирменаг5=0,3; р<0,05).

При иммуноцитохимическом окрашивании клеток антителом к ЭиЯР-б присутствие белка в ядрышках было выявлено в лимфоидных клетках больных всех нозологических групп, что принципиально отличает их от лимфоцитов периферической крови здоровых лиц. При этом содержание 81ЖР-6-положительных клеток варьировало от 10% до 67% и прямо коррелировало с

уровнем экспрессии Кл-67 (г5=0,5; р<0,01), отражающим агрессивность течения заболевания. Так, у больных с неагрессивной формой лимфоцитомы число 81ЖР-6-положительных клеток не превышало 30%. В то же время, при более злокачественных заболеваниях доля БиКР-б-положительных клеток возрастала (табл. 4), достигая максимальных значений - от 47% до 67% - при лимфосаркомах (рис. 106) и лимфоме из клеток мантийной зоны селезенки, а так же у половины больных с лимфомой маргинальной зоны (рис. 10а).

Таблица 4. Содержание Ю-67-, В23-, фибрилларин- и 51ЖР-6-положительных клеток (в %) в образцах лимфоидных клеток здоровых лиц и больных с лимфопролиферативными заболеваниями.

Группы обследованных лиц Статистические показатели Антигены

К'|-67 Фибр. В23

Здоровые пица (п=8) медиана колебания 0 0 79 70-85 55 45-63

Лимфоцитома селезенки без признаков трансформации (п=8) медиана колебания 2 2-12 26 12-30 68 55-90 56 35-90

Хронический лимфолейкоз: начальная стадия (п=6) прогрессирующая стадия (п=4) медиана колебания 2 1-3 46 21-75 80 74-87 41,5 35-48

медиана колебания 10 7-55 30 18-55 81 78-85 44 40-47

Т-клеточная лимфома (п=6) медиана колебания 10 7-65 48,5 23-55 78,5 75-82 45 32-60

Лимфома маргинальной зоны селезенки (п=6) медиана колебания 12 2-21 41 22-67 74 61-87 56 52-67

Лимфома из клеток мантийной зоны селезенки (п=3) медиана колебания 17 10-32 65 60-67 74 72-85 60 58-92

Лимфосаркома (п=4) медиана колебания 42 9-75 55 47-65 70 55-89 75 45-76

п - число здоровых или больных лиц, клетки которых использовали для анализа.

При анализе экспрессии ЗиЛБ-б по и-критерию Манна-Уитни статистически значимые различия были выявлены между группами «хронический лимфолейкоз» и «лимфоцитома» (р<0,05), «лимфосаркома» и «лимфоцитома» (р<0,01), «лимфома мантийной зоны» и «лимфоцитома» (р<0,01), «Т-клеточная лимфома» и «лимфома мантийной зоны» (р<0,01), «хронический лимфолейкоз» и «лимфома мантийной зоны» (р<0,05). При анализе экспрессии белка В23 статистически значимые различия были выявлены между группами «хронический лимфолейкоз» и «лимфосаркома» (р<0,05). Значимые различия в экспрессии фибрилларина у различных нозологических групп не обнаружены.

лмз а ЛС б хлл в

- (* >) -ч ^ •¡TTw л»* \ t ' V- ■ Л • S чУ/XV л/лЛ -f J* к* -J 9 /Г 4 с< 4 I 0 (УФ J\> -- А |

Рис. 10. Иммуноцитохимическое выявление белка ЗиЯР-б в лимфоидных клетках селезенки больных с диагнозами лимфома маргинальной зоны (ЛМЗ, а), лимфосаркома (ЛС, б) и хронический лимфолейкоз (ХЛЛ, в). Нижний ряд (а'-в') -фазовый контраст. Масштабная линия - 10 мкм.

Результаты одновременного иммуномечения показали, что у некоторых больных присутствуют лимфоциты, которые содержат SURF-6 (рис. 11а), но не содержат Ki-67 (рис. 11 в). В лимфоцитах здоровых лиц, активированных к пролиферации in vitro, такой характер окрашивания клеток проявлялся только в G1 периоде клеточного цикла. Это свидетельствует о возможности выявления с помощью антител к SURF-6 ранних стадий активации клеток к пролиферации, что может иметь как диагностическое, так и прогностическое значение в клинике.

Рис. 11. Двойное иммуномечение лимфоидных клеток селезенки больного Т-клеточной лимфомой антителами к ЭТЛ^-б (а) и Ю-67 (в). Стрелками указаны ядрышки. Масштабная линия - 10 мкм.

У двух больных (с лимфомой из клеток мантийной зоны селезенки и хроническим лимфолейкозом) было проанализировано содержание ЭиИР-б, фибрилларина и В23 не только в лимфоцитах периферической крови, но и селезенки. У обоих больных количество 81ЖР-б-позитивных лимфоцитов в селезенке несколько превышало число ЗиКР-б-положительных лимфоцитов в периферической крови.

Для того чтобы получить дополнительную информацию об экспрессии изучаемых белков у больных лимфопролиферативными заболеваниями, на иммуноблотах было исследовано содержание белков БШ^-б и В23 в лимфоидных клетках в сравнении с экспрессией белка РСЫА. Белки БиШ^-б и В23 методом иммуноблоттинга отчетливо выявлялись в лимфоидных клетках больных лимфопролиферативными заболеваниями (рис. 12). При этом уровень экспрессии в^ЖР-б был сходным с содержанием РСЫА, но отличался от уровня экспрессии В23: повышенная экспрессия 81ЖР-6 при Т-клеточной лимфоме сопровождалась относительно низким уровнем экспрессии В23.

,1игка1

81^-6 В23 РСЫА

Рис. 12. Содержание белков ЗиИР-б, В23 и РСЫА в лимфоидных клетках больных лимфопролиферативными заболеваниями и клетках линии .Гигка!. Справа - электрофореграмма суммарных белков. 1 - В-ХЛЛ, 2 - Т-клеточная лимфома, 3 - лимфома маргинальной зоны.

В тех же образцах была оценена доля Кл-67-, ЗРЛЗР-б- и В23-позитивных клеток в реакции непрямой иммунофлуоресценции (табл. 5).

Таблица 5. Содержание К-67, В23, и виКТ-б-положительных клеток (в %) в лимфоидных клетках больных лимфопролиферативными заболеваниями.

Диагноз Источник лимфоидных клеток Антигены

П^ёгт БиЯЯ-б В23

1 Хронический лимфолейкоз кровь 2 35 45

2 Т-клеточная лимфома лимфоузел 42 55 40

3 Лимфома маргинальной зоны кровь 4 22 45

Из рисунка 12 и таблицы 5 видно, что результаты иммуноцитохимического окрашивания и иммуноблотов находятся в хорошем соответствии друг с другом. Так, максимальная экспрессия РСЫА и ЗиИР-б на иммуноблотах и максимальное число Кл-67-позитивных (42%) и ЗиЯР-б-

положительных (55%) клеток наблюдались в лимфоцитах больного с диагнозом Т-клеточная лимфома. Таким образом, уровень экспрессии PCNA и Ki-67 прямо коррелировал с содержанием белка SURF-6, что еще раз подчеркивает его диагностическое значение.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Таким образом, в результате изучения экспрессии ядрышковых белков фибрилларина, нуклеолина, В23 и SURF-6, в сопоставлении с известными маркерами пролиферирующих клеток Ki-67 и PCNA, в процессе искусственно вызванной пролиферации было обнаружено, что белок ядрышка SURF-6 является ранним маркером активации лимфоцитов к пролиферации и может иметь дополнительное диагностическое и прогностическое значение в клинико-лабораторный исследованиях.

Белок ядрышка SURF-6 на сегодняшний день был наиболее подробно изучен в клетках мыши (Magoulas and Fried, 1996; Magoulas et al., 1998). Именно поэтому в ходе работы первоначальные исследования были проведены на лимфоцитах селезенки мыши, активированных к пролиферации КонА. Обнаружено, что белок SURF-6 не выявляется в интактных лимфоцитах селезенки мыши, но его количество прогрессивно увеличивается после их активации. Следует отметить, что SURF-6 начинал выявляться в ядрышках активированных лимфоцитов уже через 16 ч после добавления КонА, что свидетельствует о том, что данный белок начинает экспрессироваться на стадиях, предшествующих активной клеточной пролиферации. Кроме того, были получены результаты, подтверждающие, что белок В23 является иммуноцитохимическим маркером последовательных стадий активации лимфоцитов млекопитающих к пролиферации.

Для дальнейших исследований уровня экспрессии ключевых белков ядрышка у человека был проведен анализ влияния разных способов фиксации клеток на выявление ядрышковых антигенов в клетках линии HeLa, в ходе которого обнаружено, что наиболее адекватным фиксатором для иммуноцитохимического мечения клеток антителами к известным ядрышковым антигенам является фиксация ацетоном. Этот вывод оказался справедливым также для культивируемых клеток человека Ramos и К562 и лимфоцитов.

Классической моделью для изучения изменений в содержании и локализации основных белков ядра и ядрышка при активации клеток к пролиферации и синтезу рибосом является активация лимфоцитов периферической крови с помощью ФГА (Булычева и др., 2000; Козинец и др., 2002). В качестве контрольного белка был использован Ki-67, широко применяемый в клинической практике. Все литературные данные неизменно свидетельствуют о том, что антиген Ki-67 присутствует в S- и 02-фазах клеточного цикла и митозе, но отсутствует в GO (Khoruzhenko et al., 2010). Однако некоторые авторы указывают на то, что уровень экспрессии Ki-67 в G1 фазе может быть минимальным (Bruno et al., 1992), в связи с чем, клетки, находящиеся в данном периоде, могут быть ошибочно идентифицированы, как

покоящиеся (Urruticoechea et al., 2005). Поэтому наше особое внимание при изучении динамики ключевых белков ядрышка в ходе ФГА-стимуляции было направлено на изучение ранних этапов активации лимфоцитов.

В проведенных нами исследованиях методами иммуноцитохимии и иммуноблоттинга было обнаружено, что в интактных лимфоцитах отчетливо выявляются белки ядрышка В23, нуклеолин и фибрилларин, сохраняясь в ядрышках на всех сроках пролиферации. При этом впервые показано, что белок SURF-6 не выявляется в покоящихся лимфоцитах периферической крови здоровых лиц, а его количество прогрессивно увеличивается по мере активации лимфоцитов к пролиферации с помощью ФГА. SURF-6-позитивные лимфоциты начинали выявляться на препаратах до появления Ki-67-позитивных клеток; на иммуноблотах SURF-6 проявлялся раньше PCNA, что позволяет сделать вывод о более ранней экспрессии SURF-6 по сравнению с известными маркерами клеточной пролиферации. Так же, как и в лимфоцитах селезенки мыши, в лимфоцитах человека, стимулированных к пролиферации, SURF-6 выявлялся в ядрышках уже через 16 ч после добавления митогена, т.е. на том сроке, когда еще не происходило значительного увеличения доли клеток в S-фазе клеточного цикла. По-видимому, это накопление белка SURF-6 связано с активацией ядрышек при вступлении клеток в G1-период. Уровень содержания SURF-6 в лимфоцитах достигал наибольшего значения к 72 ч стимуляции, когда, как было показано методом проточной цитофлуориметрии, пролиферативная активность лимфоцитов была максимальной, аналогичной клеткам культуры Jurkat.

К началу выполнения работы данные об относительном содержании SURF-6 в динамике клеточного цикла в клетках человека в литературе отсутствовали. Результаты настоящей работы, проведенной на митоген-стимулированных лимфоцитах мыши и человека, не только показывают, что уровень экспрессии белка SURF-6 находится в прямой зависимости от пролиферативного статуса клеток, но и свидетельствуют о том, что активация его экспрессии происходит до появления в клетках известных маркеров клеточной пролиферации Ki-67 и PCNA. Поскольку содержание белков ядрышка, участвующих в биогенезе рибосом, как правило, возрастает в динамике клеточного цикла (Sirri et al., 2000), в совокупности с литературными данными (Magoulas et al., 1998; Vernon and Gaston, 2000; Гурченков и др., 2005), это косвенно указывает на то, что белок SURF-6 принимает участие в биогенезе рибосом и регуляции клеточной пролиферации у млекопитающих.

Оценка пролиферативной активности лимфоидных клеток при лимфопролиферативных заболеваниях с использованием антител к ядерным антигенам, ассоциированным с клеточной пролиферацией, является одним из важных показателей в диагностике варианта заболевания и определении степени злокачественности процесса. Однако набор белковых маркеров активации лимфоцитов в настоящее время крайне ограничен, а белки, указывающие на ранние стадии активации лимфоцитов к пролиферации, которые могли бы найти применение в онкогематологии, отсутствуют.

Возможность подобного использования антител к белкам В23, фибрилларину и БиШ^-б в онкогематологии была изучена нами на клетках ограниченного числа больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями. Индекс клеточной пролиферации определяли по числу Кл-67-позитивных клеток.

Процент клеток, ядрышки которых окрашивались на фибрилларин, у больных существенно не отличался от числа фибрилларин-положительных лимфоцитов периферической крови здоровых лиц. Не было выявлено корреляции между экспрессией фибрилларина и Ю-67, а экспрессия фибрилларина у разных нозологических групп различалась незначительно. Эти результаты свидетельствуют о нецелесообразности использования данного белка в качестве диагностического или прогностического маркера в клинической онкогематологии.

Была подтверждена положительная корреляция между экспрессией В23 и Кл-67 (Булычева и др., 2003). Однако белок В23 выявлялся также и в интактных лимфоцитах, что снижает его диагностическое значение.

Количество БиШ^-б-позитивных клеток у больных варьировало в зависимости от варианта заболевания. Важно отметить, что ЗиЯР-б-позитивные клетки выявлялись у всех обследованных больных, в том числе и с неагрессивной формой заболевания, что принципиально отличает их от лимфоцитов периферической крови здоровых лиц. У больных с более благоприятным диагнозом (лимфоцитома) число БиЯР-б положительных клеток не превышало 30%. Характерно, что при неоплазиях высокой степени злокачественности (лимфосаркома, лимфома мантийной зоны) всегда наблюдали интенсивное окрашивание на БИЯР-б (> 45% БиЯТ-б-позитивных клеток). Статистически значимые различия по экспрессии БиЯР-б были выявлены между группами больных с лимфопролиферативными заболеваниями различной степени злокачественности. При этом содержание БиЯР-6-положительных клеток коррелировало с уровнем экспрессии К-67 и РСЫА, отражающих агрессивность течения заболевания. Следует отметить, что у подавляющего большинства больных число БиЯР-6-позитивных лимфоцитов превышало число Кь67-позитивных клеток. При этом методом двойного окрашивания выявлено, что у больных присутствуют лимфоидные клетки, которые содержали БЦЕР-б при отсутствии Ю-67, что свидетельствует о том, что стадии клеточного цикла, в течение которых выявляются данные белки, совпадают лишь частично. Это предположение находится в соответствии с полученными нами результатами по динамике БиЯР-6 и К1-67 в ФГА-стимулированных лимфоцитах и свидетельствует о том, что БЦЯР-6 появляется в клетках на более ранних стадиях активации к пролиферации, чем Кь67.

Следует отметить, что среди пациентов с диагнозами, характеризующимися низким содержанием белка Кь67, как, например, начальная стадия хронического лимфолейкоза, встречались больные с повышенным уровнем белка БиЯР-б. Эти наблюдения говорят о том, что лимфоциты этих больных характеризуются повышенным уровнем биогенеза рибосом и, возможно, находятся на ранних стадиях активации к пролиферации,

не выявляемых с помощью Ki-67. Поэтому наблюдение за такими больными может иметь существенное прогностическое значение.

Учитывая полученные данные по динамике экспрессии SURF-6 в лимфоцитах периферической крови доноров, активированных к пролиферации in vitro, эти наблюдения позволяют рассматривать белок ядрышка SURF-6 в качестве нового - раннего - маркера активированных лимфоцитов у онкогематологических больных. Полученные на ограниченном количестве больных результаты исследования говорят в пользу диагностической, а, возможно, и прогностической значимости SURF-6 и необходимости дальнейшего изучения уровня экспрессии этого ядрышкового белка у больных.

Большой интерес представляет продолжение исследований в этом направлении с дальнейшим накоплением количественных данных, результатом которого может стать повышение достоверности начальных результатов исследования, а также выявление более тонких различий между отдельными нозологическими группами с помощью антител к SURF-6. Однако уже данное исследование, выявившее определенные корреляции между обследуемыми группами больных, свидетельствует о том, что оценка количества SURF-6-позитивных клеток может быть важной для диагностики различных злокачественных заболеваний системы крови, а также использоваться при прогнозировании течения заболевания.

ВЫВОДЫ.

1. Установлено, что ядрышковый белок SURF-6, в отличие от других изученных в работе белков ядрышка - В23, нуклеолина и фибрилларина, не выявляется в покоящихся (неактивированных) лимфоцитах периферической крови человека.

2. На модели ФГА-стимулированных лимфоцитов человека выявлено, что экспрессия SURF-6 начинается раньше экспрессии известных маркеров клеточной пролиферации белков Ki-67 и PCNA, что позволяет рассматривать белок ядрышка SURF-6 в качестве раннего маркера активации лимфоцитов человека.

3. Показано, что содержание SURF-6, В23, нуклеолина и фибрилларина увеличивается при активации пролиферации лимфоцитов с помощью ФГА in vitro, что свидетельствует в пользу участия данных белков в регуляции клеточного цикла лимфоцитов человека.

4. На ограниченном числе больных лимфопролиферативными заболеваниями выявлено, что в ядрышках лимфоидных клеток всех больных обнаруживается белок SURF-б, содержание которого коррелирует с уровнем экспрессии белков Ki-67 и PCNA, что может иметь дополнительное диагностическое значение.

5. Установлено, что в покоящихся лимфоцитах селезенки мыши белок SURF-6, в отличие от В23, не выявляется. Однако содержание обоих белков увеличивается при активации клеток к пролиферации in vitro.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Зацепина О.В., Малышева М.В. Способ фиксации клеток человека HeLa и НЕр-2 для иммуноцитохимического выявления ядерных аутоантигенов. Положительное заключение о выдаче патента №2362583 от 27.07.2009 г.

2. Моралева A.A., Малышева М.В., Магоулас X., Ползиков М.А., Зацепина О.В. Ранняя экспрессия белка ядрышка SURF-6 в лимфоцитах селезенки мыши, активированных к пролиферации in vitro. Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины (2009) №5, Т. 147 . С. 507-511.

3. Малышева М.В., Моралева A.A., Дейнеко Н.Л., Булычева Т.Н., Зацепина О.В. Сравнительный анализ экспрессии ключевых белков ядрышка в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров, активированных к пролиферации in vitro. Иммунология (2010) №1, Т. 31. С. 13-17.

4. Малышева М.В., Григорьев A.A., Булычева Т.И., Зацепина О.В. Повышенная чувствительность ядрышек пролиферирующих клеток человека к ингибированию синтеза белка анизомицином. Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины (2010) №8, Т. 150. С. 223-228.

5. Малышева М.В., Моралева A.A., Булычева Т.И., Ползиков М.А., Зацепина О.В. Белок ядрышка SURF-6 - новый и ранний маркер активированных лимфоцитов млекопитающих. XVIII Международная конференция "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии", Ялта-Гурзуф (Украина), 2010, с.32-34.

6. Малышева М.В., Дейнеко Н.Л., Булычева Т.И., Ползиков М.А., Зацепина О.В. Сравнительный анализ экспрессии ключевых белков ядрышка в лимфоцитах периферической крови здоровых лиц и больных лимфопролиферативными заболеваниями. III Всероссийская научно-практическая конференция «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты», Москва, 2010, с. 42-44.

7. Малышева М.В., Моралева A.A., Дейнеко Н.Л., Булычева Т.И., Зацепина О.В. Сравнительный анализ экспрессии ключевых белков ядрышка в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров, активированных к пролиферации in vitro. XXII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2010, с. 40.

8. Малышева М.В., Моралева A.A., Зацепина О.В. Ранняя экспрессия белка ядрышка SURF-6 в лимфоцитах селезенки мыши, активированных к пролиферации in vitro. XXI зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2009, с. 38.

9. Моралева A.A., Зубрицкий A.B., Малышева М.В., Булычева Т.И., Ползиков М.А., Зацепина О.В. Белок ядрышка SURF-6 - новый маркер пролиферирующих лимфоцитов здоровых доноров и больных гемобластозами. IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», Казань, 2009, с. 389.

10. Малышева М.В., Моралева A.A., Ползиков М.А., Булычева Т.И., Зацепина О.В. Белки ядрышка - новые возможные маркеры клеточной

пролиферации. VII Международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток», Звенигород, 2009, с. 29-30.

11. Жарская О.О., Андрющенко A.C., Малышева М.В., Зацепина О.В. Разработка и внедрение отечественных тест-систем для клинико-лабораторной диагностики системных аутоиммунных заболеваний человека. Симпозиум «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств, Москва, 2008, с.63-64.

12. Малышева М.В., Андрющенко A.C., Жарская О.О., Александрова E.H., Зацепина О.В. Разработка технологии и создание отечественных препаратов для первичного скрининга аутоиммунных сывороток. Научно-практическая конференция «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине». Ростов-на-Дону, 2007, с. 147-148.

13. Моралева A.A., Малышева М.В., Зубрицкий A.B., Григорьев A.A., Ползиков М.А. Особенности состояния белков ядрышка в клетках млекопитающих с разным уровнем транскрипции рибосомных генов. II Съезд общества клеточной биологии, Ст-Петербург, 2007, Цитология 49: 778-779.

Подписано в печать: 19.10.2010

Заказ № 4323 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Малышева, Марина Владимировна

Список используемых сокращений

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ядрышко - основной структурный домен клеточного ядра

1.2. Основные белки ядрышка

1.3. Особенности организации и состояния ядрышек лимфоцитов млекопитающих

1.4. Структура и белки ядрышек лимфоцитов при опухолевом росте

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Локализация и содержание белков ядрышка ЗТЖР-б и В23 в лимфоцитах селезеньей мыши, активированных к пролиферации конканавалином А

3.1.1. Подбор оптимального метода фиксации клеток мыши

3.1.2. Контроль активации пролиферации лимфоцитов селезенки мыши

3.1.3. Локализация БШ^Е-б и В23 в лимфоцитах селезенки мыши на разных сроках после активации пролиферации

3.1.4. Количественное содержание белков 8ЦЕЕ-6 и В23 в лимфоцитах селезенки мыши на разных сроках после активации Кон А

3.2. Локализация и содержание ключевых белков ядрышка в лимфоцитах периферической крови человека, активированных к пролиферации фитогемагглютинином

3.2.1. Подбор оптимального метода фиксации клеток человека

3.2.2. Контроль активации пролиферации лимфоцитов периферической крови здоровых лиц

3.2.3. Локализация белков ядрышка в лимфоцитах периферической крови человека на разных сроках активации пролиферации

3.2.4. Количественное содержание ключевых белков ядрышка в лимфоцитах периферической крови человека на разных сроках после ФГА-стимуляции

3.3. Содержание белков ядрышка 81ЖБ-6, фибрилларина и В23 в лимфоидных клетках больных лимфопролиферативными заболеваниями

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммуноцитохимическая характеристика ядрышковых белков в лимфоидных клетках человека и мыши"

Актуальность темы исследования

Оценка пролиферативной активности лимфоидных клеток при лимфопролиферативных заболеваниях является одним из важных показателей в диагностике варианта заболевания и определении степени злокачественности процесса. Этот показатель используется для прогнозирования скорости опухолевого роста и выбора адекватного курса лечения.

Одним из важнейших свойств ядрышка является его высокая структурная и функциональная изменчивость, которая отражает общий уровень метаболизма и способность клеток к пролиферации. В пролиферирующих клетках ядрышки обладают более крупными размерами, чем ядрышки клеток, находящихся в состоянии пролиферативного покоя.

Изменение функционального состояния ядрышка в ходе клеточного цикла сопровождается также изменением количественного содержания его белков.

К таким белкам относятся, в частности, аргентофильные белки, а также В23 и нуклеолин. Количественный анализ содержания аргентофильных белков в 5 настоящее время используется для оценки скорости пролиферации клеток, а также в диагностических и прогностических целях. Установлено, что размеры аргентофильных зон в ядрышках варьируют в зависимости от формы острого лейкоза и прямо коррелируют со злокачественностью процесса.

Белки ядра и ядрышка - В23, РСМА, Кл-67, содержание которых возрастает при переходе от состояния пролиферативного покоя к делению, относят к маркерам клеточной пролиферации, а антитела к некоторым из них используют в клинической диагностике для прогностической оценки скорости роста злокачественного клона. Однако, набора белковых маркеров активации лимфоцитов в настоящее время крайне ограничен, а белки, указывающие на» ранние стадии активации лимфоцитов к пролиферации, которые могли бы найти применение в онкогематологии, на сегодняшний день отсутствуют.

Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение экспрессии ключевых бeлкoвí ядрышка в лимфоидных. клетках человека в различные периоды пролиферативного процесса, а также выявление ранних маркеров активированных лимфоцитов человека и мыши.

Задачи исследования:

1. Изучить содержание ключевых белков ядрышка БТ-ЖР-б и В23 при активации лимфоцитов мыши к пролиферации с помощью конканавалина А (Кон А).

2. Изучить, уровень экспрессии ЗТЖБ-б в лимфоцитах селезенки мыши, активированных к пролиферации Кон А.

3. Изучить экспрессию белков ядрышка - фибрилларина, В23, нуклеолина и БЦИР-б - при активации лимфоцитов периферической крови человека к пролиферации с помощью фитогемагглютинина (ФГА) методом иммуноцитохимии.

4. Оценить количественное содержание этих же белков в процессе ФГА-стимуляции на иммуноблотах.

5. Проанализировать экспрессию В23, фибрилларина и 81ЖЕ-б в лимфоидных клетках ограниченного числа больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями.

6. Сопоставить уровень экспрессии вышеназванных белков с уровнем пролиферации лимфоидных клеток, определяемым маркерными белками Ел-67 и РСМА.

Новизна исследования

На модели ФГА-стимулированной культуры лимфоцитов1 человека показаны изменения в- содержании и уровне экспрессии^ белков ядрышка фибрилларина и нуклеолина. Впервые на этой' же модели показано,' что белок ЗиКЕ-б не выявляется в покоящихся- лимфоцитах, а его экспрессия' в ФГА-активированных лимфоцитах начинается до экспрессии известных маркеров клеточной пролиферации белков Кл-67 и РСКА. Выявлена положительная корреляция между экспрессией белка БШ^Е-б и белками Кл-67 и* РСИА , в лимфоидных клетках* больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями. Эти наблюдения впервые показали, что- белок ядрышка БИКЕ-б может служить маркером ранней активации лимфоцитов человека к пролиферации, а также иметь прогностическое и, возможно, диагностическое значение. Показано, что, так же, как и в лимфоцитах периферической крови человека, 81ЖЕ-6* не выявляется в лимфоцитах, выделенных из селезенки мышей. Таким образом, на сегодняшний день белок БТ-ЖЕ-б является единственным белком ядрышка, который, не выявляясь в ядрышках покоящихся лимфоцитов млекопитающих (на примере человека и мыши), начинает экспрессироваться в митоген-стимулированных лимфоцитах раньше известных маркеров клеточной пролиферации (К1-67 и PCNA).

Научное и практическое значение

Полученные результаты расширяют существующие фундаментальные представления о белках ядрышка как маркерах клеточной пролиферации. Возможность выявления по состоянию ядрышкового белка БТ-ЖР-б ранней стадии пролиферативной активности лимфоцитов (по-видимому, С1-фазы), не выявляемой общеизвестным антигеном Кл-67, позволяет рекомендовать его анализ для лабораторных исследований в клинической практике с целью ранней диагностики злокачественной транформации лимфоцитов. Выявленная корреляция экспрессии белков Кл-67 и ЭЦКР-б у больных с лимфопролиферативными заболеваниями, с повышением их экспрессии при нарастании злокачественности процесса, позволяет рассчитывать на широкое клиническое применение антител к БТЖР-б.

Положения выносимые на защиту:

1. С использованием первичной культуры лимфоцитов селезенки мыши, активированных к пролиферации конканавалином А, показано, что уровень белков БИШ^-б и В23 возрастает при активации клеток к пролиферации, при этом ЗЦЕР-б не выявляется в неактивированных лимфоцитах.

2. На модели стимулированной ФГА культуры лимфоцитов здоровых лиц показано, что белок БТ-Л^Р-б является надежным маркером последовательных стадий активации лимфоцитов человека к пролиферации. БиКР-б отсутствует в неактивированных лимфоцитах и начинает выявляться в клетках раньше маркеров клеточной пролиферации - белков Кл-67 и РС^.

3. Существует положительная корреляция между экспрессией белка 8ТЖР-6 и белков Кл-67 и РСИА в лимфоидных клетках больных различными лимфопролиферативными заболеваниями. и

4. Белок ядрышка ЗЦЕР-б может служить новым маркером активации лимфоцитов млекопитающих к пролиферации и иметь дополнительное диагностическое и прогностическое значение.

Апробация работы:

2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), XXI и XXII зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009 и 2010 гг.), XVIII Международной конференции "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" (Украина, Гурзуф, 2010), III Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва,

2010).

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК и 9 тезисов. Получено положительное заключение о выдаче патента.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Малышева, Марина Владимировна

выводы.

4. На ограниченном числе больных лимфопролиферативными заболеваниями выявлено, что в ядрышках лимфоидных клеток всех больных обнаруживается белок SURF-6, содержание которого коррелирует с уровнем экспрессии белков Ki-67 и PCNA, что может иметь дополнительное диагностическое значение.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в проведенных исследованиях впервые показано, что белок БиКЕ-б не выявляется в покоящихся лимфоцитах человека. При ФГА-стимуляции его экспрессия начинается до экспрессии известных маркеров клеточной пролиферации белков Кл-67 и РСЫА. Выявлена положительная корреляция между экспрессией белка БиКЕ-б и белков Кь67 и РСЫА в лимфоидных клетках больных различными лимфопролиферативными заболеваниями. Эти наблюдения впервые показали, что белок ядрышка 81ЖР-6 может служить маркером ранней активации лимфоцитов человека к пролиферации, а также иметь прогностическое и, возможно, диагностическое значение. Показано, что в лимфоцитах, выделенных из селезенки мышей, как и в лимфоцитах периферической крови человека, 81ЖР-6 не выявляется. Таким образом, на сегодняшний день белок 8ТЖР-6 является единственным белком ядрышка, который, не выявляясь в ядрышках покоящихся лимфоцитов млекопитающих (на примере человека и мыши), начинает экспрессироваться в митоген-стимулированных лимфоцитах раньше известных маркеров клеточной пролиферации - белков Кл-67 и РСЫА.

В дальнейшем представляется целесообразным продолжение исследований, направленных на выяснение прогностической и диагностической оценки содержания 81ЖР-6 у большего количества больных лимфопролиферативными заболеваниями с применением не только поликлональных, но и более специфичных моноклональных антител.

К моменту завершения настоящего исследования в ИБХ РАН были получены мышиные моноклональные антитела к ЗиКР-б человека, не имеющие коммерческих аналогов (Ползиков М.А., Кордюкова М.Ю.,

Зацепина О.В. // Заявка на изобретение 2010113717, приоритет от 8.04.2010 г.). Предварительные результаты иммуноцитохимического анализа лимфоцитов, полученные при использовании данных антител, оказались сходными с результатами, полученными в работе с помощью поликлональных антител к ЗЦЕР-б. Наличие высокоспецифичных

89 моноклональных антител к SURF-6 человека открывает дополнительные возможности не только для изучения особенностей состояния этого белка у онкогематологических больных, но и у больных другими формами онкологических заболеваний.

Одно из направлений будущих исследований может быть также связано с изучением механизмов, приводящих к повышению содержания белка SURF-6 при таких формах лимфопролиферативных заболеваний, как лимфосаркома и лимфома из клеток мантийной зоны селезенки. Представляется целесообразным использовать для этих целей методы цитогенетического анализа, основанные на использовании зондов, комплементарных последовательности гена SURJF-6 и реакции гибридизации in situ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Малышева, Марина Владимировна, Москва

1. Андреева C.B., Дроздова В.Д., Поночевная Е.В. и др. Перестройки хромосомы 9 при различных гематологических неоплазиях. // Цитология и Генетика, 2008, 42(5):72-79.

2. Афанасьев Ю.И., Кузнецова С.Л., Юрина H.A. Гистология, цитология, эмбриология. // Изд. «Медицина», 2004.

3. Булычева Т.И., Артеменко Е.Г., Дергунова H.H. и др. Анализ пролиферативной активности клеток с помощью новых моноклональных антител к ядрышковому белку В23/нуклеофозмину // Цитология. 2000, 3(10):944.954.

4. Булычева Т.И., Артеменко Е.Г., Дергунова H.H. и др. Новые моноклональные антитела к антигену клеточной пролиферации — ядрышковому белку В23/нуклеофозмину. // Проблемы гематологии^ и переливания крови, 2003, 2:34-35.

5. Булычева Т.И., Дейнеко Н.Л., Артеменко А.Г. и др. Диагностическое значение ядрышкового белка В23/нуклеофозмина при хронических лимфопролиферативных заболеваниях. // Terra Medica, Лабораторная диагностика, 2006, 2(10): 16-21.

6. Вейко H.H., Ляпунова H.A., Косякова Н.В. и др. Элементы структурной организации транскрибируемой обласи рибосомного повтора (рДНК) в лимфоцитах периферической крови человека. // Мол. Биол. 2001, 1(35):52-65.

7. Гублер Е. В., Генкин А. А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. — Л.: Медицина, 1973.

8. Гурченков В.В., Ползиков М.А., Магоулас К.Б. и др. Свойства и функции нового белка ядрышка SURF-6 в клетках мыши ЗТЗ. // Биоорганическая химия. 2005, 31:578-585.

9. Епифанова О.И. Лекции о клеточном цикле. // КМК Scientific Press. Москва, 2003.

10. Кинетические аспекты гемопоэза. Под ред. Козинца Г.И., Гольдберга Е.Д.-Томск, 1982.

11. П.Козинец Г.И., Гольдберг В.Е. Цитофотометрия и микрофлюорометрия лимфоцитов в краткосрочных культурах с фитогемагглютинином. //Лаб. Дело, 1983, 1:24-26.

12. Козинец Г.И., Котельников В.М., Гольдберг В.Е. Цитофотометрия гемопоэтических клеток // Томск, 1986.

13. Козинец Г.И., Погорелов В.М., Шмаров Д.А. и др. Клетки крови -современные технологии их анализа. // Триада-Фарм, 2002.

14. Криволапов Ю.А., Леенман Е.Е. Морфологическая диагностика лимфом. //«Издательско-полиграфическая компания «КОСТА», 2006.

15. Левитский С.А., Мухарьямова К.Ш., Вейко В.П. Выявление сигнальных последовательностей в молекуле фибрилларина, определяющих его специфическую локализацию в ядрышках клеток HeLa. // Молекулярная биология, 2004,38:1-10.

16. Лорие Ю.Ю. Лимфома из клеток мантийной зоны: клинические особенности и возможности терапии. // Современная Онкология, 2006, 8(1): 13-20.

17. Малашенко О.С., Булычева Т.И., Дудник O.A. Штамм культивируемых клеток мышиной гибридомы, используемый для получениямоноклональных антител к ядрышковому антигену, ассоциированному с клеточной пролиферацией. // Патент на изобретение №2145634 от 2000 г.

18. Мухарьямова К.Ш., Дудник O.A., Сперанский А.И. и др. Сравнительная локализация основных белков ядрышка фибрилларина и В23 в делящихся клетках млекопитающих. // Биологические мембраны, 1998, 15:657-669.

19. Никулин Б.А., Шмаров Д.А., Першин В.Н. и др. Проточно -цитофлюорометрический анализ пролиферативной активности лимфоцитов в культуре с фитогемагглютинином. // Лаб. Дело, 1989, 4:34-38.

20. Погорелов В.М. Морфологические особенности нуклеологенеза лимфоидных клеток в норме, при лимфосаркомах и остром лимфобластцрм лейкозе. // Автореф. дис. на соискание степени доктора мед. наук. М., 1992.

21. Погорелов В.М., Байдурин С.А., Капланская И.Б. и др. Морфометрические параметры злокачественных клеток при нелейкемических гемобластозах с первичным поражением лимфатических узлов // Гематология и трансфузиология. 1992, 37(3):5-10.

22. Погорелов В.М. Оценка Ag-положительных ядрышкообразующих районов хромосом в нуклеолах интерфазных злокачественных клеток. // Гематол. Трансфузиол., 1994, 39(6): 19-21.

23. Ползиков М.А., Вейко H.H., Жарская О.О. и др. Сверхпродукция белка ядрышка SURF-6 в фибробластах мыши NIH/3T3 приводит кстабилизации внутригенных транскрибируемых спейсеров пре-рРНК. // Биоорганическая химия, 2010, 36(5):661-671.

24. Самойлова Р.С., Булычева Т.И. Иммунофенотипирование в диагностике хронических лимфоидных заболеваний. // Клиническая Лабораторная диагностика. 2003, 11:35-39.

25. Сауткина Е.Н., Потапенко Н.А., Владимирова Н.М. Состояние ядрышковых белков В23/нуклеофозмина и UBF в клетках HeLa при апоптозе, индуцируемом фактором некроза опухолей. // Биохимия. 2006, 6:786-797.

26. Челидзе П.В., Зацепина О.В. Морфофункциональная классификацияfядрышек. // Успехи современной биологии. 1988, 105:252-268.

27. Ченцов Ю.С. Введение в клеточную биологию. // Издательство «Академкнига», 2005.

28. Шмаров Д.А., Козинец Г.И. Лабораторно-клиническое значение проточно-цитометрического анализа крови. // Медицинское информационное агентство, 2004.

29. Ahmad Y., Boisvert F.M., Gregor P. et al. NOPdb: Nucleolar Proteome Database—2008 update. //Nucleic Acids Res. 2009; 37(Database issue):D181-l&4.

30. Albano F., Anelli L., Zagaria A. et al. Non random distribution of genomic features in breakpoint regions involved in chronic myeloid leukemia cases with variant t(9;22) or additional chromosomal rearrangements. Mol Cancer. 2010, 25;9:120.

31. Andersen J.S., Lyon C.E., Fox A.H. et al. Directed proteomic analysis of the human nucleolus // Curr. Biol. 2002, 12:1-11.95

32. Andersen J.S., Lam Y.W., Leung A.K., Ong S.E., Lyon C.E., Lamond A.I., Mann M. Nucleolar proteome dynamics. // Nature. 2005, 433(7021):77-83.

33. Angelov D., Bondarenko V.A., Almagro S. et al. Nucleolin is a histone chaperone with FACT-like activity and assists remodeling of nucleosomes. // Embo J. 2006, 25:1669-1679.

34. Arabi A., Wu S., Ridderstrale K. et al. c-Myc associates with ribosomal DNA and activates RNA polymerase I transcription. // Nat. Cell Biol. 2005, 7:303-310.

35. Arber D.A., Chang K.L., Lyda M.H. et al. Detection of NPM/MLF1 fusion in t(3;5)-positive acute myeloid leukemia and myelodysplasia. // Hum Pathol. 2003, 34(8):809-813.

36. Arden K.C., Johnston D.A., Cork A. et al. Differential nucleolus organizer activity in normal and leukemic bone marrow. // Am. J. Hematol. 1989, 30(3):164-173.

37. Armes N. and Fried M. Surfeit locus gene homologs are widely distributed in invertebrate genomes. // Mol. Cell Biol. 1996, 16:5591-5596.

38. Armes N., Gilley J., Fried M. The comparative genomic structure and sequence of the surfeit gene homologs in the puffer fish Fugu rubripes and their association with CpG-rich islands. // Genome Res. 1997, 7:1138-1152.

39. Azum-Gelade M.C., Noaillac-Depeyre J., Caizergues-Ferrer M. et al. Cell cycle redistribution of U3 snRNA and fibrillarin. Presence in the cytoplasmic nucleolus remnant and in the prenucleolar bodies at telophase. // J.Cell Sci. 1994, 107:463-475.

40. Ball L., Pope J., Howard C.V. et al. PCNA and Ki-67 dissociation in childhood acute lymphoblastic leukemia. An immunofluorescent laser confocal scanning microscopical study. // Cell Biol. Int. 1994; 18(9):869-874.

41. Biggiogera M., Fakan S., Kaufmann S.H. et al. Simultaneous immunoelectron microscopic visualization of protein B23 and C23 distribution in the HeLa cell nucleolus. // J. Histochem Cytochem. 1989, 37(9): 1371-1374.

42. Boisvert F.M., van Koningsbruggen S., Navascues J. et al. The multifunctional nucleolus. //Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2007, 8:574-585.

43. Borer R.A., Lehner C.F., Eppenberger H.M. et al. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. // Cell. 1989, 56(3):379-390.

44. Branco M.R., Branco T., Ramirez F. et al. Changes in chromosome organization during PHA-activation of resting human lymphocytes measured by cryo-FISH. // Chromosome Res. 2008, 16(3):413-426.

45. Broyde A., Boycov O., Strenov Y. et al. Role and prognostic significance of the Ki-67 index in non-Hodgkin's lymphoma // Am. J. Hematol. 2009, 84(6):338-343.

46. Bruno S., Darzinkievwicz Z. Cell Cycle dependent expressin and stability of the nuclear protein detected by Ki-67 antibody in HL-60 cells. // Cell Prolif. 1992, 25(1):31-40.

47. Bubân T., Tôth L., Tanyi M., Kappelmayer J. et al. Ki-67 new faces of an old player. // Orv. Hetil. 2009, 150(23):1059-1070.

48. Buchinskaia L.G., Polishchuk L.Z., Ganina K.P. The functional characteristics of the chromosomal nucleolus organizer regions of patients with endometrial cancer. // Tsitol Genet. 1995, 29(4):32-37.

49. Canet V., Montmasson M.P., Usson Y. et al. Correlation between silver-stained nucleolar organizer region area and cell cycle time. // Cytometry. 2001, 43(2): 110-116.

50. Carloni M., Meschini R., Ovidi L. et al. PHA-induced cell proliferation rescues human peripheral blood lymphocytes from X-ray-induced apoptosis. // Mutagenesis. 2001, 16(2): 115-120.

51. Carmo-Fonseca M., Mendes-Soares L., Campos I. To be or not to be in the nucleolus. //Nat.Cell Biol. 2000, 2(6):107-112.

52. Ceccarelli C., Trere D., Santini D. et al. AgNORs in breast tumours. // Micron. 2000; 31(2): 143-149.

53. Chan P.K., Aldrich M., Busch H. Alterations in immunolocalization of the phosphoprotein B23 in HeLa cells during serum starvation. // Exp. Cell Res. 1985, 161(1):101-110.

54. Chan W.Y., Liu Q.R., Borjigin J. et al. Characterization of the cDNA encoding human nucleophosmin and studies of its role in normal and abnormal growth. // Biochemistry. 1989, 28(3):1033-1039.

55. Chen C.M., Chiang S.Y., Yeh N.H. Increased stability of nucleolin in proliferating cells by inhibition of its self-cleaving activity. // J. Biol. Chem. 1991, 266(12):7754-7758.

56. Chen M., Rockel T., Steinweger G. et al. Subcellular recruitment of fibrillarin to nucleoplasmic proteasomes: implications for processing of a nucleolar autoantigen. // Molecular Biology of the Cell, 2002, 13(10):3576-3587.

57. Chi Y., Lindgren V., Quigley S. et al. Acute myelogenous leukemia with t(6;9)(p23;q34) and marrow basophilia: an overview. // Arch. Pathol. Lab. Med. 2008, 132(11):1835-1837.

58. Chiarle R., Gong J.Z., Guasparri I. et al. NPM-ALK transgenic mice spontaneously develop T-cell lymphomas and plasma cell tumors. // Blood, 2003, 101(5): 1919-1927.

59. Chou Y.H., Yung B.Y. Cell cycle phase-dependent changes of localization and oligomerization states of nucleophosmin/B23. // Biochem.Biophys.Res.Commun. 1995, 217:313-325.

60. Cmarko D., Smigova J., Minichova L. et al. Nucleolus: the ribosejne, factory//Histol. Histopathol. 2008, 23(10):1291-1298.

61. Colombo E., Marine J.C., Danovi D. et al. Nucleophosmin regulates the stability and transcriptional activity of p53. //Nat. Cell Biol. 2002, 4(7):529-533.

62. Cosimi M.F., Casagranda I., Porta C. et al. Correlation between the grade of histological malignancy and nuclear positivity using the AgNOR technique in 6 cases of isolated bone NHL. // Sangre. 1992, 37(5):399-402.

63. Derenzini M., Ploton D. Interphase nucleolar organizer regions in cancer cells. // Int. Rev. Exp. Pathol. 1991, 32:149-192

64. Derenzini M., Trere D. Importance of interphase nucleolar organizer regions in tumor pathology. // Virchows. Arch. B Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 1991, 61(1): 1 -8.

65. Derenzini M., Farabegoli F., Trere D. Relationship between interphase AgNOR distribution and nucleolar size in cancer cells. // Histochem J. 1992, 24:951-956.

66. Derenzini M., Sirri V., Trere D. et al. The quantity of nucleolar protoins nucleolin and protein B23 is related to cell doubling time in human cancer cells. // Lab. Invest. 1995, 73(4):497-502.

67. Derenzini M., Trere D., Pession A. et al. Nucleolar function and size in cancer cells. //Am. J. Pathol. 1998, 152(5):1291-1297.99

68. Derenzini M. The AgNORs. // Micron. 2000, 31:117-120.

69. Derenzini M., Trere D., Pession A. et al. Nucleolar size indicates the rapidity of cell proliferation in cancer tissues. // J. Pathol. 2000, 191:181-186.

70. Derenzini M., Pasquinelli G., O'Donohue M. et al. Structural and functional organization of ribosomal genes within the mammalian cell nucleolus. //Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 2006, 54(2):131-145.

71. Derenzini M, Montanaro L, Trere D. What the nucleolus says to a tumour pathologist. Histopathology. 2009, 54(6):753-62.

72. Dergunova N.N., Bulycheva T.I., Artemenko E.G. et al. A major nucleolar protein B23 as a marker of proliferation activity of human peripheral lymphocytes. // Immunology Letters. 2002, 83:67-72.

73. Destouches D., El Khoury D., Hamma-Kourbali Y. et al. Suppression of tumor growth and angiogenesis by a specific antagonist of the cell-surface expressed nucleolin. // PLoS One. 2008, 3(6):2518.

74. Dickinson L.A., Kohwi-Shigematsu T. Nucleolin is a matrix attachment region DNA-binding protein that specifically recognizes a region with high base-unpairing potential.//Mol.Cell Biol. 1995, 15:456-465.

75. Diop S., Letestu R., Orsolani D. et al. Expression of proliferation marker Ki 67 in chronic lymphocytic leukemia // Dakar Med. 2005, 50(2):65-68.

76. Duchrow M., Schlüter C., Key G. et al. Cell proliferation-associated nuclear antigen defined by antibody Ki-67: a new kind of cell cycle-maintaining proteins. //Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 1995, 43(2): 117-121.

77. Duchrow M., Schlüter C., Wohlenberg C. et al. Molecular characterization of the gene locus of the human cell proliferation-associated nuclear protein defined by monoclonal antibody Ki-67. // Cell Prolif. 1996, 29(1):1-12.

78. Duhig T., Ruhrberg C., Mor O. et al. The human Surfeit locus. // Genomics. 1998, 52:72-78.

79. Dumbar T.S., Gentry G.A., Olson M.O. Interaction of nucleolar phosphoprotein B23 with nucleic acids. //Biochemistry. 1989, 28:9495-9501.

80. Dundr M., Leno G.H., Lewis N. et al. Location of the HIV-1 Rev protein during mitosis: inactivation of the nuclear export signal alters the pathway for postmitotic reentry into nucleoli. // J.Cell Sci. 1996, 109:2239-2251.

81. Endl E., Gerdes J. The Ki-67 protein: fascinating forms and an unknown function. // Exp. Cell Res. 2000, 257(2):231-237.

82. Escande-Geraud M.L., Azum M.C., Tichadou J.L. et al. Correlation between rDNA transcription and distribution of a 100 kD nucleolar protein in CHO cells. //Exp. Cell Res. 1985, 161(2):353-363.

83. Falini B., Flenghi L., Fagioli M. et al. Evolutionary conservation in various mammalian species of the human proliferation-associated epitope recognized by Ki-67 monoclonal antibody. // J. Histochem. Cytochem. 1989, 37(10):1471-1476.

84. Falini B., Mecucci C., Tiacci E. et al. Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype. // N. Engl. J. Med. 2005, 352(3):254-266.

85. Feuerstein N., Mond J.J., Kinchington P. R. et al. Evidence for DNA binding activity of numatrin (B23), a cell cycle-regulated nuclear matrix protein. // Biochim. Biophys. Acta. 1990, 1087(2): 127-136.

86. Fonatsch C., Duchrow M., Rieder H., et al. Assignment of the human Ki-67 gene (MK167) to 10q25-qter. // Genomics 1991, 11:476-477.

87. Frahm SO, Zott B, Dworeck C. et al. Improved ELISA proliferation assay (EPA) for the detection of in vitro cell proliferation by a new Ki-67-antigen directed monoclonal antibody (Ki-S3). // J Immunol Methods. 1998, 211(l-2):43-50.

88. Frehlick L.J., Eirin-Lopez J.M., Ausio J. New insights into the nucleophosmin/ nucleoplasmin family of nuclear chaperones. // Bioessays. 2007, 29(l):49-59.

89. Galand P., Del Bino G., Morret M. et al. PCNA immunopositivity index as a substitute to 3H-thymidine pulse-labeling index (TLI) in methanol-fixed human lymphocytes//Leukemia. 1995, 9(6): 1075-1084.

90. Gautier T., Robert-Nicoud M., Guilly M.N. et al. Relocation of nucleolar proteins around chromosomes at mitosis. A study by confocal laser scanning microscopy. //J. Cell Sci. 1992, 102(4):729-37.

91. Gerdes J., Lemke H., Baisch H. et al. Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67.//J. Immunol. 1984, 133(4):1710-1715.

92. Gerlach C., Sakkab D.Y., Scholzen T. et al. Ki-67 expression duringjat liver regeneration after partial hepatectomy. // Hepatology. 1997, 26(3):573-578.

93. Giacomelli L., Nicolini C. Gene expression of human T lymphocytes cell cycle: experimental and bioinformatic analysis. "// J. Cell Biochem. 2006, 99(5):1326-1333.

94. Ginisty H., Amalric F., Bouvet P. Nucleolin functions in the first step of ribosomal RNA processing. // Embo J. 1998, 17:1476-1486.

95. Ginisty H., Sicard H., Roger B. et al. Structure and functions of nucleolin. //J. Cell Sci. 1999,112:761-772.

96. Gorczyca W., Smolewski P., Grabarek J. et al. Morphometry of nucleoli and expression of nucleolin analyzed by laser scanning cytometry in mitogenically stimulated lymphocytes. // Cytometry. 2001,45(3):206-213.

97. Grisendi S., Bernardi R., Rossi M. et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis. // Nature. 2005, 437(7055): 147-153.

98. Grisendi S., Mecucci C., Falini B. et al. Nucleophosmin and cancer. // Nat. Rev. Cancer 2006, 6(7):493-505.

99. Heine M.A., Rankin M.L., DiMario P.J. The Gly/Arg-rich (GAR) domain of Xenopus nucleolin facilitates in vitro nucleic acid binding and in vivo nucleolar localization.// Mol. Biol. Cell. 1993,4(11):1189-1204.

100. Hernandez-Verdun D., Louvet E. The nucleolus: structure, functions, amd associated diseases. //Med. Sci. 2004, 20(l):37-44.

101. Hernandez-Verdun D. The nucleolus: a model for the organization of nuclear functions. //Histochem. Cell Biol. 2006, 126(2): 135-148.

102. Herrera J.E., Savkur R., Olson M.O. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. // Nucleic. Acids Res. 1995, 23(19):3974-3979.

103. Hidalgo Grau L.A., Badia J.M. et al. Gallbladder carcinoma: the role of p53 protein overexpression and Ki-67 antigen expression as prognostic markers. // HPB (Oxford). 2004, 6(3): 174-80.

104. Horky M., Kotala V., Anton M. et al. Nucleolus and apoptosis. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2002, 973:258-264.

105. Huxley C., Fried M. The mouse surfeit locus contains a cluster of six genes associated with four CpG-rich islands in 32 kilobases of genomic DNA. // Mol.Cell Biol. 1992, 10(2):605-614.

106. Izban K.F., Alkan S., Singleton T.P. et al. Multiparameter immunohistochemical analysis of the cell cycle proteins cyclinDl, Ki-67, p21WAFl, p27KIPl, and p53 in mantle cell lymphoma. // Arch. Pathol. Lab. Med. 2000, 124(10): 1457-1462.

107. Jansen R.P., Hurt E.C., Kern H. et al. Evolutionary conservation of the human nucleolar protein fibrillarin and its functional expression in yeast. // J. Cell Biol. 1991,113(4):715-729.

108. Jiang P.S., Chang J.H., Yung B.Y. Different kinases phosphorylate nucleophosmin/B23 at different sites during G(2) and M phases of the cell cycle. // Cancer Lett. 2000,153(1-2):151-160.

109. Kalir T., Chan K.S., Liu Z. et al. Semi-automatic quantitation of nucleolar organizer regions in non-Hodgkin's lymphomas. // Pathol. Res. Pract. 1994; 190(2): 124-128.

110. Kalousek I., Krizkova P. Lymphocyte mitogenic transformation is accompanied by phosphorylation of the nucleolar transcription factor UBF. // Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 2000, 46(7):1163-1171.104

111. Khorazhenko A., Kukharchuk V., Cherednyk O. et al. Monoclonal antibodies to Ki-67 protein suitable for immunohistochemical analysis. // Hybridoma (Larchmt). 2010, 29(4):301-304.

112. Khurts S., Masutomi K., Delgermaa L. et al. Nucleolin interacts with telomerase. //J. Biol. Chem. 2004, 279(49):51508-51515.

113. Kill I.R. Localisation of the Ki-67 antigen within the nucleolus: Evidence for a fibril 1 arin-deficient region of the dense fibrillar component. // J. Cell Sci. 1996, 109:1253-1263.

114. Koberna K., Malinsky J., Pliss A. et al. Ribosomal genes in focus: new transcripts label the dense fibrillar components and form clusters indicative of "Christmas trees" in situ. // J. Cell Biol. 2002,157(5):743-748

115. Kondo T., Minamino N., Nagamura-Inoue T. et al. Identification and characterization of nucleophosmin/B23/numatrin which binds the anti-oncogenic transcription factor IRF-1 and manifests oncogenic activity. // Oncogene. 1997, 15(11):1275-1281.

116. Kreitz S., Fackelmayer F.O., Gerdes J. et al. The proliferation-specific human Ki-67 protein is a constituent of compact chromatin. // Exp .Cell Res. 2000, 261(l):284-292.

117. Kriiger T., Zentgraf H., Scheer U. Intranucleolar sites of ribosome biogenesis defined by the localization of early binding ribosomal proteins. // J. Cell Biol. 2007,177(4):573-578.

118. Kute T., Quadri Y. Measurement of proliferation nuclear and membrane markers in tumor cells by flow cytometry. // J. Cytochem. Histochem. 1991, 39(8): 1125-1130.

119. Lapeyre B., Mariottini P., Mathieu C. et al. Molecular cloning of Xenopus fibrillarin, a conserved U3 small nuclear ribonucleoprotein recognized byantisera from humans with autoimmune disease. // Mol. Cell Biol. 1990, 10(l):430-434.

120. Leonardi E., Girlando S., Serio G. et al. PCNA and Ki-67 expression in breast carcinoma. Correlations with clinical and biological variables. // J. Clin. Pathol. 1992, 45(5): 416-419.

121. Leoncini L., Del Vecchio M., Megha T. et al. Correlations between apoptotic and proliferative indices in malignant non-Hodgkin's lymphomas. // Am. J. Pathol. 1993; 142(3): 755-763.

122. Leung A.K., Trinkle-Mulcahy L., Lam Y.W. et al. NOPdb: Nucleolar Proteome Database. // Nucleic Acids Res. 2006, 34:218-20.

123. Liu Q.-R., Chan P.K. Characterization of seven processed pseudogenes of nucleophosmin/B23 in the human genome. // DNA and Cell Biol. 1993, 12:149156.

124. Liu L., Wen Y.M., Li L.J. et al. Expression of nucleolar organizer regions associated proteins of T lymphocytes in the patients with oral and maxillofacial tumors. // Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 2004, 22(l):38-39, 42.

125. Liu X., Liu Z., Jang S.W. et al. Sumoylation of nucleophosmin/B23 regulates its subcellular localization, mediating cell proliferation and survival. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007, 104(23):9679-9684.

126. Lo S.J., Lee C.C., Lai H.J. The nucleolus: reviewing oldies to have new understandings. // Cell Res. 2006, 16:530-538.

127. Loidl P., Eberharter A. Nuclear matrix and the cell cycle. // Int. Rev. Cytol. 1995, 162B:377-403.

128. Lopez F., Belloc F., Lacombe F. et al. Modalities of synthesis of Ki67 antigen during the stimulation of lymphocytes // Cytometry. 1991, 12(l):42-49.

129. Lorand-Metze I., Metze K. AgNOR clusters as a parameter of cell kinetics in chronic lymphocytic leukaemia. // Clin. Mol. Pathol. 1996, 49(6):357-360.

130. Lorand-Metze I., Carvalho M.A., Metze K. Relationship between morphometric analysis of nucleolar organizer regions and cell proliferation in acute leukemias. //Cytometry. 1998, 32(1): 51-56.

131. MacCallum D.E., Hall P.A. Biochemical characterization of pKi67 with the identification of a mitotic-specific form associated with hyperphosphorylation and altered DNA bindin. // Exp. Cell Res. 1999, 252(1): 186-198.

132. MacCallum D.E., Hall P.A. The location of pKi67 in the outer dense fibrillary compartment of the nucleolus points to a role in ribosome biogenesis during the cell division cycle. // J. Pathol. 2000, 190(5):537-544.

133. Magoulas C., Fried M. The Surf-6 gene of the mouse surfeit locus encodes a novel nucleolar protein. // DNA Cell Biol. 1996, 15(4):305-316.

134. Magoulas C., Zatsepina O.V., Jordan P.W. et al. The SURF-6 protein is a component of the nucleolar matrix and has a high binding capacity for nucleic acids in vitro. // Eur.J.Cell Biol. 1998, 75(2): 174-183.

135. Magoulas C., Fried M. Isolation and genomic analysis of the human surf-6 gene: a member of the Surfeit locus. // Gene. 2000, 243(1-2): 115-123.

136. Marandola P., Lardennois B., Ploton D. et al. A new marker for early detection and indicator of progression of cancer of the bladder. Preliminary results with Ag-NOR index in 38 cases of superficial bladder cancer. // Eur. Urol. 1992, 21(1): 31-33.

137. Marandola P., Lardennois B., Ploton D. et al. Nucleolar organizer regions: preliminary results of the clinical use of a new marker for prostatic carcinoma (40 cases). //Eur. Urol. 1992, 21(1): 71-74.

138. Martínez J.C., Piris M.A., Sánchez-Beato M. et al. Retinoblastoma (Rb) gene product expression in lymphomas. Correlation with Ki67 growth fraction. // J. Pathol. 1993, 169(4):405-412.

139. Mateo M.S., Saez A.I., Sanchez-Beato M. et al. Expression of p21WAFl/CLPl in fetal and adult tissues: simultaneous analysis with Ki67 and p53. // J. Clin. Pathol. 1997, 50(8):645-653.

140. Maxwell E.S., Fournier MJ. The small nucleolar RNAs. // Annu. Rev. Biochem.1995, 64:897-934.

141. Mayer C., Grummt I. Cellular stress and nucleolar function. // Cell Cycle. 2005,4:1036-1038.

142. McKeown P.C., Shaw P.J. Chromatin: linking structure and function in the nucleolus. // Chromosoma. 2009, 118(1): 11-23.

143. Medina F.J., Cerdido A., Fernandez-Gomez M.E. Components of the nucleolar processing complex (Pre-rRNA, fibrillarin, and nucleolin) colocalize during mitosis and are incorporated to daughter cell nucleoli. // Exp.Cell Res. 1995, 221(1):111-125.

144. Mehes G., Pajor L. Nucleolin and fibrillarin expression in stimulated lymphocytes and differentiating HL-60 cells. A flow cytometric assay. // Cell Prolif. 1995, 28(6):329-336.

145. Menezes H.L., Jucä M.J., Gomes E.G. et al. Analysis of the immunohistochemical expressions of p53, bcl-2 and Ki-67 in colorectal adenocarcinoma and their correlations with the prognostic factors. // Arq Gastroenterol. 2010,47(2): 141-147.

146. Mitani S., Tango T., Sonobe Y. et al. Expression of three cell proliferation-associated antigens, DNA polymerase alpha, Ki-67 antigen and transferring receptor in nodal and cutaneous T-cell lymphomas. // Int. J. Hematol. 1991, 54(5):385-393.

147. Montanaro L., Trere D., Derenzini M. Nucleolus, ribosomes, and cancer. // Am. J. Pathol. 2008, 173(2):301-310.

148. Nozawa Y., Van Beizen N., Van der Made A.C. et al. Expression of nucleophosmin/B23 in normal and neoplastic colorectal mucosa. // J. Pathol. 1996, 178(l):48-52.

149. Niewiadomska H., Mirowski M., Kulczycka D. et al. Some oncogene and tumour suppressor gene protein products expression in B-cellchronic lymphocytic leukaemia. // Cytobios. 2000,103(404): 159-168.

150. Nishimura Y., Ohkubo T., Furuichi Y. et al. Tryptophans 286 and 288 in the C-terminal region of protein B23.1 are important for its nucleolar localization. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002, 66(10):2239-2242.

151. Noaillac-Depeyre J., Dupont M.A., Tichadou J.L. et al. The effect of adenosine analogue (DRB) on a major nucleolar phosphoprotein nucleolin. // Biol. Cell. 1989, 67(l):27-35.

152. Ochs R., Lischwe M., O'Leary P. et al. Localization of nucleolar phosphoproteins B23 and C23 during mitosis. // Exp.Cell Res. 1983, 146(1): 139149.

153. Ochs R.L., Lischwe M.A., Spohn W.H. et al. Fibrillarin: a new protein of the nucleolus identified by autoimmune sera. // Biol. Cell. 1985, 54(2): 123-133.109

154. Ochs R.L., Smetana K. Detection of fibrillarin in nucleolar remnants and the nucleolar matrix.//Exp. Cell Res. 1991, 197(2):183-190.

155. Okuda M. The role of nucleophosmin in centrosome duplication. // Oncogene. 2002, 21(40):6170-6174.

156. Okuda M., Horn H.F., Tarapore P. et al. Nucleophosmin/ B23 is a target of CDK2/cyclin E in centrosome duplication. // Cell. 2000, 103:127-140.

157. Okuwaki M., Matsumoto K., Tsujimoto M. et al. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone. // FEBS Lett. 2001, 506(3):272-276.

158. Olson M.O., Hingorani K., Szebeni A. Conventional and nonconventional roles of the nucleolus. // Int. Rev. Cytol. 2002, 219:199-266.

159. Olson M.O., Dundr M. The moving parts of the nucleolus. // Histochem. Cell Biol. 2005, 123:203-216.

160. Orian A., van Steensel B., Delrow J. et al. Genomic binding by the Drosophila Myc, Max, Mad/Mnt transcription factor network. // Genes Dev. 2003, 17(9):1101-1114.

161. Oskarsson T., Trumpp A. The Myc trilogy: lord of RNA polymerases. // Nat. Cell Biol. 2005, 7(3):215-217.

162. Oster S.K., Ho C.S., Soucie E.L. et al. The myc oncogene: MarvelouslY Complex. //Adv. Cancer Res. 2002, 84:81-154.

163. Otake Y., Soundararajan S., Sengupta T.K. et al. Overexpression of nucleolin in chronic lymphocytic leukemia cells induces stabilization of bcl2 mRNA. // Blood. 2007, 109(7):3069-3075.

164. Ozdemir B.H., Ozdemir O.G., Sertcelik A. The prognostic importance of the nucleolar organizer region (AgNOR), Ki-67 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in primary nonurachal bladder adenocarcinoma. // APMIS. 2001, 109(6):428-434.

165. Pelusi G., Trere D., Formelli G. et al. AgNOR protein quantity of cervical smears correlates with that of histological sections in cervical intraepithelial neoplasia.//Eur. J. Histochem. 1997,41(2): 105-110.

166. Pession A., Farabegoli F., Trere D. et al. The Ag-NOR proteins and transcription and duplication of ribosomal genes in mammalian cell nucleoli. // Chromosoma. 1991, 100(4):242-250.

167. Pich A., Chiusa L., Audisio E. et al. Nucleolar organizer region counts predict complete remission, remission duration, and survival in adult acute myelogenous leukemia patients. // J. Clin. Oncol. 1998, 16(4): 1512-1518.

168. Ploton D., Menager M., Jeannesson P. et al. Improvement in the staining and in the visualization of the argyrophilic proteins of the nucleolar organizer region at the optical level. // Histochem J. 1986, 18(1):5-14.

169. Polzikov M., Magoulas Ch., Zatsepina O. The nucleolar protein SURF-6 is essential for viability in mouse NIH/3T3 cells. // Mol. Biol. Rep. 2007, 34:155160.

170. Popp W., Wachtler F. Changes in nucleolar structure, number and size in cellular activation and inactivation. Observations in human phytohaemagglutinin-treated lymphocytes. // Cell Tissue Res. 1983, 234(2):377-388.

171. Redner R.L. Variations on a theme: the alternate translocations in APL. //Leukemia. 2002,16(10): 1927-1932.in

172. Reish O., Brosh N., Gobazov R. et al. Sporadic aneuploidy in PHA-stimulated lymphocytes of Turner's syndrome patients. // Chromosome Res. 2006, 14(5):527-534.

173. Romanova L.G., Anger M., Zatsepina O.V. et al. Implication of nucleolar protein SURF6 in ribosome biogenesis and preimplantation mouse development. // Biol. Reprod. 2006, 75:690-696.

174. Roussel P., Sirri V., Hernandez-Verdun D. Quantification of Ag-NOR proteins using Ag-NOR staining on western blots. // J. Histochem Cytochem. 1994, 42(11):1513-1517.

175. Ruggero D., Pandolfi P. Does the ribosome translate cancer? // Nat. Rev. Cancer. 2003, 3(3): 179-192.

176. Sarafoleanu D., Postelnicu V., Iosif C. et al. The role of p53, PCNA and Ki-67 as outcome predictors in the treatment of laryngeal cancer. // J. Med. Life. 2009, 2(2):219-226.

177. Savino T.M., Gebrane-Younes J., De Mey J. et al. Nucleolar assembly of the rRNA processing machinery in living cells. // J. Cell Biol. 2001, 153(5): 10971110.

178. Savkur R.S., Olson M.O. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease. // Nucleic Acids Res. 1998, 26(19):4508-4515.

179. Scheer U., Weisenberger D. The nucleolus. // Curr. Opin. Cell Biol. 1994, 6(3):354-359.

180. Scherl A., Coute Y., Deon C. et al. Functional proteomic analysis of human nucleolus. //Mol. Biol. Cell. 2002, 13(11):4100-4109.

181. Schlosser I., Holzel M., Murnseer M. et al. A role for c-Myc in the regulation of ribosomal RNA processing. // Nucleic Acids Res. 2003, 31(21):6148-6156.

182. Schmidt-Zachmann M.S., Nigg E.A. Protein localization to the nucleolus: a search for targeting domains in nucleolin. // J. Cell Sci. 1993, 105(3):799-806.

183. Scholzen T., Gerdes J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. //J. Cell Physiol. 2000, 182(3):311-322.

184. Schwarzacher H.G., Wachtler F. The nucleolus. // Anat. Embryol. 1993, 188(6):515-536.

185. Schwarzacher H.G., Mosgoeller W. Ribosome biogenesis in man: current views on nucleolar structures and function. // Cytogenet Cell Genet. 2000, 91(l-4):243-252.

186. Shaw P.J., Jordan E.G. The nucleolus. // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1995, 11:93-121.

187. Shome D.K., Khurana N. Distinctive AgNOR patterns of myeloid and lymphoid blasts in acute leukemia. // Am. J. Hematol. 1999, 61(2): 149-152.

188. Sirri V., Roussel P., Trere D. et al. Amount variability of total and individual Ag-NOR proteins in cells stimulated to proliferate. // J. Histochem. Cytochem. 1995, 43(9):887-893.

189. Sirri V., Roussel P., Gendron M.C. et al. Amount of the two major AgNOR proteins, nucleolin, and protein B23 is cell-cycle dependent. // Cytometry. 1997, 28(2): 147-156.

190. Sirri V., Urcuqui-Inchima S., Roussel P. et al. Nucleolus: the fascinating nuclear body. // Histochem. Cell Biol. 2008, 129(1): 13-31.

191. Smetana K., Gyorkey F., Gyorkey P. et al. Comparative Studies on the Ultrastructure of Nucleoli in Human Lymphosarcoma Cells and Leukemic Lymphocytes'.//CancerRes. 1970, 30(4): 1149-1155.

192. Smetana K., Daskal I., Busch H. Cytochemistry of the microtrabecular network in compact nucleoli of hepatocytes treated with cycloheximide. // Histochemistry. 1980, 65(3):301-308.

193. Smetana K., Matejkova E., Likovsky Z. et al. Nucleoli of lymphocytes in the peripheral blood of patients with gastric cancer and gastric ulcer. // Neoplasma. 1980; 27(6):717-21.

194. Smetana K., Ochs R., Lischwe M.A. et al. Immunofluorescence studies on proteins B23 and C23 in nucleoli of human lymphocytes. // Exp Cell Res. 1984, 152(1): 195-203.

195. Smetana K., Jiraskova I., Perlaky L. et al. The silver reaction of nucleolar proteins in the main structural compartments of ring-shaped nucleoli in smear preparations. // Acta Histochem. 1999, 101(2): 167-183.

196. Snaar S., Wiesmeijer K., Jochemsen A.G. et al. Mutational analysis of fibrillarin and its mobility in living human cells. // J. Cell Biol. 2000, 151(3):653-662.

197. Srivastava M., Pollard H.B. Molecular dissection of nucleolin's role in growth and cell proliferation: new insights. // FASEB J. 1999, 13(14): 1911-1922.

198. Stahl A., Wachtler F., Hartung M. et al. Nucleoli, nucleolar chromosomes and ribosomal genes in the human spermatocyte. // Chromosoma. 1991, 101 (4):231-244.

199. Storck S., Shukla M., Dimitrov S. et al. Functions of the histone chaperone nucleolin in diseases. // Subcell. Biochem. 2007, 41:125-144.

200. Subong E.N., Shue M.J., Epstein J.I. et al. Monoclonal antibody to prostate cancer nuclear matrix protein (PRO:4-216) recognizes nucleophosmin/B23. //Prostate. 1999, 39(4):298-304.

201. Takagi M., Absalon M.J., McLure K.G. et al. Regulation of p53 translation and induction after DNA damage by ribosomal protein L26 and nucleolin. //Cell. 2005,123(l):49-63.

202. Tarapore P., Okuda M., Fukasawa K. A mammalian in vitro centriole duplication system: evidence for involvement of CDK2/cyclin E and nucleophosmin/B23 in centrosome duplication. // Cell Cycle. 2002, 1(1):75-81.

203. Tollervey D., Lehtonen H., Carmo-Fonseca M. et al. The small nucleolar RNP protein NOP1 (fibrillarin) is required for pre-rRNA processing in yeast. // EMBO J. 1991,10(3):573-583.

204. Tominaga K., Yamaguchi Y., Nozawa Y. et al. Proliferation in non-Hodgkin's lymphomas as determined by immunohistochemical double staining for Ki-67.//Hematol. Oncol. 1992, 10(3-4):163-169.

205. Trere D., Melchioni C., Chieco P. et al. Interphase AgNOR quantity and DNA content in endometrial adenocarcinoma. // Gynecol. Oncol. 1994; 53(2): 202207.

206. Trere D., Pession A., Basso G. et al. Prognostic relevance of pretreatment proliferative rapidity of marrow blast cells in childhood acute lymphoblastic leukemia. //Br. J. Cancer. 1994; 70(6): 1198-1202.

207. Trott R.L., Kalive M., Karandikar U., Rummer R. et al. Identification and characterization of proteins that interact with Drosophila melanogaster protein kinase CK2. // Mol. Cell Biochem. 2001, 227(l-2):91-98.

208. Tungekar M., Gatter K., Dunnill M. et al. Ki-67 immunostaining and survival in operable lung cancer. // Histopathology. 1991, 19(6):545-550.

209. Tyc K., Steitz J.A. U3, U8 and U13 comprise a new class of mammalian snRNPs localized in the cell nucleolus. // EMBO J. 1989, 8(10):3113-3119.

210. Ugrinova I., Monier K., Ivaldi C. et al. Inactivation of nucleolin leads to nucleolar disruption, cell cycle arrest and defects in centrosome duplication. // BMC Mol Biol. 2007, 10(8):66.

211. Urruticoechea A., Smith I.E., Dowsett M. Proliferation marker Ki-67 in early breast cancer. J Clin Oncol. // 2005, 23(28):7212-7220.

212. Van Vlierberghe P., van Grotel M. Tchinda J. et al. The recurrent SET-NUP214 fusion as a new HOXA activation mechanism in pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia.//Blood. 2008, lll(9):4668-4680.

213. Vandelaer M., Thiry M., Goessens G. Ultrastructural Distribution of DNA within the Ring-Shaped Nucleolus of Human Resting T-Lymphocytes. // Experimental Cell Research. 1996, 205(2):430-432.

214. Veronese S., Gambacorta M. Detection of Ki-67 proliferation rate in breast cancer. Correlation with clinical and pathologic features. // Am. J. Clin. Pathol. 1991, 95(l):30-34.

215. Virgili A., Nacheva E.P. Genomic amplification of BCR/ABL1 and a region downstream of ABL1 in chronic myeloid leukaemia: a FISH mapping study of CML patients and cell lines. // Mol. Cytogenet. 2010, 1;3:15.

216. Voit R., Hoffmann M., Grummt I. Phosphorylation by Gl-specific Cdk-cyclin complexes activates the nucleolar transcription factor UBF. // EMBO J. 1999, 18(7): 1891-1899.

217. Wachtler F., Ellinger A., Schwarzacher H.G. Nucleolar changes in human phytohaemagglutinin-stimulated lymphocytes. // Cell Tissue Res. 1980, 213(2):351-360.

218. Wang D., Baumann A., Szebeni A. et al. The nucleic acid binding activity of nucleolar protein B23.1 resides in its carboxyl-terminal end. // J. Biol. Chem. 1994, 269(49):30994-30998.

219. Wang J.Y., Rong T.H., Liang Y.R. et al. Diagnostic application of detecting AgNOR in peripheral blood T lymphocyte in patients with esophageal carcinoma. // Ai. Zheng. 2004, 23(5):577-580.

220. Wang K.K., Jiang L., E S.M. et al. Effect of nucleolin down-regulation on the proliferation and apoptosis in C2C12 cells. // Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2005, 30(2): 125-129.

221. Wolff C.M., Nguyen V.K., Remy P. Cloning and expression of the surfeit locus member Surf-6 during embryogenesis in Xenopus laevis. // DNA Seq. 2002, 13(3):149-152.

222. Wu H.L., Hsu C.Y., Liu W.H. et al. Berberine-induced apoptosis of human leukemia HL-60 cells is associated with down-regulation ^ of nucleophosmin/B23 and telomerase activity. // Int. J. Cancer. 1999, 81(6):923-929.

223. Xia Z.B., Dai M.S., Magoulas C. et al. Differentially expressed genes during in vitro differentiation of murine embryonic stem cells transduced with ahuman erythropoietin receptor cDNA. // J. Hematother. Stem Cell Res. 2Q00, 9(5):651-658.

224. Xu W., Li J.Y., Wu Y.J. et al. Expressions of ki-67 and bcl-2 in 29 cases of chronic lymphocytic leukemia and their clinical significance. // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2006, 14(3):464-467.

225. Yang T.H., Tsai W.H., Lee Y.M. et al. Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor. // Mol. Cell Biol. 1994, 14(9):6068-6074.

226. Yee H.T., Ponzoni M., Merson A. et al. Molecular characterization of the t(2;5) (p23; q35) translocation in anaplastic large cell lymphoma (Ki-1) and Hodgkin's disease. //Blood. 1996, 87(3): 1081-1088.

227. Yoneda-Kato N., Look A.T., Kirstein M.N. et al. The t(3;5)(q25.1;q34) of myelodysplasia syndrome and acute myeloid leukemia produces a novel fusion gene, NPM-MLF1. // Oncogene. 1996, 12(2):265-275.

228. You B.J., Huang I.J., Liu W.H. et al. Decrease in nucleophosmin/B23 mRNA and telomerase activity during indomethacin-induced apoptosis of gastric KATO-III cancer cells. // Arch. Pharmacol. 1999, 360(6):683-690.

229. Yu Y., Maggi L.B.Jr., Brady S.N. et al. Nucleophosmin is essential for ribosomal protein L5 nuclear export. // Mol. Cell Biol. 2006, 26(10):3798-3809.

230. Yun J., Liew C.T., Chew E.Q., Chan J.Y. Expression and relocation of B23 in the process of rat liver cell hyperplasia and liver regeneration // Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2002, 82(14):974-978.

231. Yung B.Y., Busch H., Chan P.K. Translocation of nucleolar phosphoprotein B23 (37 kDa/pI 5.1) induced by selective inhibitors of ribosome synthesis. //Biochim. Biophys. Acta. 1985, 826(4): 167-173.

232. Zatsepina O.V., Chelidze P.V., Chentsov Y.S. Changes in the number and volume of fibrillar centres with the inactivation of nucleoli at erythropoiesis. // J. Cell Sci. 1988, 91:439-448.

233. Zatsepina O.V., Todorov I.T., Philipova R.N. et al. Cell cycle-dependent translocations of a major nucleolar phosphoprotein, B23, and some characteristics of its variants. // Eur. J. Cell Biol. 1997, 73(l):58-70.1. БЛАГОДАРНОСТИ

234. Отдельную благодарность выражаю моим близким за то, что они верили в меня и всесторонне поддерживали на научном пути.

Информация о работе

Малышева, Марина Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Иммуноцитохимическая характеристика ядрышковых белков в лимфоидных клетках человека и мыши - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы