Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунодиагностическая оценка белков, продуцируемых штаммами Bacillus anthracis с различным профилем плазмид вирулентности

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Иммунодиагностическая оценка белков, продуцируемых штаммами Bacillus anthracis с различным профилем плазмид вирулентности"

На правах рукописи

чГ-

БАРКОВА ИРИНА АНАТОЛЬЕВНА

Иммунодиагностическая оценка белков, продуцируемых штаммами Bacillus anthracis с различным профилем плазмид вирулентности

03 00 07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ВОЛГОГРАД 200";

003174081

Работа выполнена в ФГУЗ «Волгоградский научно - исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Алексеев Владимир Валерьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Попов Юрий Алексеевич

доктор медицинских наук,

профессор Ерёменко Евгений Иванович

Ведущая организация:

Иркутский научно - исследовательский противочумный институт

диссертационного совета Д 208 078 01 по присуждению ученой степени доктора (кандидата) наук при ФГУЗ «Российский научно - исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г Саратов, ул Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ «Микроб»

Автореферат разослан «^*~>> 200Тг

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Слудский А А

Защита состоится »

в

часов на заседании

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сибирская язва относится к группе особо опасных зоонозных инфекций и до сих пор продолжает оставаться актуальной проблемой для здравоохранения и ветеринарии многих стран

Вспышки сибирской язвы у животных и людей связаны с существованием стойких почвенных очагов, в которых споры возбудителя, обладая высокой устойчивостью во внешней среде, способны сохраняться десятилетиями (Соркин ЮИ, Родзиковский А.В, 1997, Ипатенко НГ, Выдрин ВН, 1998, Бакулов И А с соавт, 2000, Hauwaert Th , 2002) На территории Российской Федерации зарегистрировано значительное количество почвенных очагов (Федотова Ю М , Уланова А Л , 1970, Жуков А Н с соавт, 2000, Еременко Е И с соавт, 2001) Ежегодно регистрируются случаи заболевания людей и животных сибирской язвой (Лебединская И С с соавт , 1974, Черкасский Б Л , 2002, Онищенко Г Г, 2003).

Стационарность почвенных очагов связана не только со стойкостью спор, но и с накоплением микроба за счет вегетаций (Буравцева Н П с соавт, 1983, Завирюха А И , 1990)

Со времен второй мировой войны В anthracis считался наиболее вероятным агентом бактериологического оружия События 2001 года в США служат подтверждением возможности использования спор возбудителя сибирской язвы как орудия биотерроризма (Жуков А Н с соавт , 2000, Черкасский Б Л , 2002, Perkins В, 2003)

Бактериологические методы считаются основными при диагностике сибирской язвы и идентификации возбудителя заболевания (Буравцева Н П с соавт, 1983, Маринин Л И с соавт, 1999) Однако они не всегда могут быть использованы, что обусловливает необходимость применения иммунологических и других методов Видоспецифические методы иммунологической диагностики сибирской язвы и идентификации возбудителя этого заболевания в настоящее

3

С

время разработаны недостаточно, в связи с известной антигенной схожестью сибиреязвенного микроорганизма с близкородственными сапрофитами

Использование сывороток к вегетативным клеткам или спорам как основы для получения диагностических препаратов оказалось малоперспективным из-за низкой видоспецифичности

Возможности идентификации возбудителя сибирской язвы значительно возросли в связи с получением монорецепторных сывороток и в частности с получением сывороток или моноклональных антител к белкам 8 - слоя С этой целью чаще всего применяли экстракты вегетативных клеток авирулентных штаммов В апЖгаси (ЕггеП ] , АЬзсЫге Т , 1988, Ег2е11 I е1 а!, 1990, Безносое МВ, 1997, Эе ВКе1 а!, 2002, Свешников П.Г с соавт, 2004) Результаты исследований свидетельствуют о возможности использования антигенов культуральных фильтратов В атИгааз для разработки видоспецифических диагностикумов Так, из культурального фильтрата В апШгаах СТИ при разделении на сефакриле Э - 300 был выделен белок, который элюировался в свободном объеме Сыворотка к этому белку позволяла дифференцировать В амкгаси от близкородственных сапрофитов Однако его выход был незначительным, что затрудняло препаративное накопление (Евтеева Е В, 2003)

В связи с изложенным, представлялось перспективным исследование антигенов В ашИгаси с учетом поиска штаммов - продуцентов и новых подходов к выделению белков этого микроорганизма

Цель исследования — антигенный анализ и идентификация отдельных белков, продуцируемых авирулентными штаммами В амкгааь, и определение их роли в иммунодиагностике сибирской язвы

Задачи исследования:

1 Выделить и сравнить антигенные свойства белков, которые элюируются в свободном объеме (фракция 1) при разделении на сефакриле S - 300 культу-ральных фильтратов авирулентных штаммов В anthracis СТИ (рХОГ, рХ02), Davies (рХОГ, рХ02"), 81/lTR(pXOr, рХ02")

2 Установить принадлежность выделенных белков к антигенам S - слоя В anthracis

3 Определить видоспецифические свойства сывороток к фракциям 1 культуральных фильтратов авирулентных штаммов В anthracis

4 Оценить возможности МФА и ТИФМ с антигенами S - слоя и сыворотками к ним для иммунодиагностики сибирской язвы

Научная новизна:

1 Впервые в сравнительном аспекте исследованы антигенные свойства культуральных фильтратов штаммов В anthracis СТИ (рХО]+, рХ02"), Davies (рХОГ, рХ02+), 81/lTR(pX01", рХ02") и белков, которые элюировались в свободном объеме (фракция 1) при разделении культуральных фильтратов на сефакриле S — 300 Установлено, что антигенный спектр культуральных фильтратов обусловлен межштаммовыми различиями В anthracis, одним из которых может быть содержание в штамме плазмид вирулентности

2 Впервые селекционирован и охарактеризован бесплазмидный штамм В anthracis 81/1TR, использование которого позволяет выделять из культуралыюго фильтрата белок S - слоя в препаративном количестве Новизна исследования подтверждена патентом на изобретение № 2230570 от 4 ноября 2002г

3 Впервые установлено, что белки, которые элюировались в свободном объеме (фракция 1) при разделении культуральных фильтратов штаммов В anthracis СТИ и 81/1TR на сефакриле S - 300, не идентичны по антигенным свойствам и относятся к белкам S - слоя сибиреязвенного микроба

4 Иммуноглобулины сывороток к фракциям 1, выделенным соответственно из культуральных фильтратов токсинпродуцирующего штамма В anthracis СТИ и бесплазмидного штамма В anthracis 81/1 TR, позволяют дифференцировать вегетативные клетки и споры В anthracis от близкородственных сапрофи-тов в методе флуоресцирующих антител, а также в реакции иммунодиффузии с растущими культурами

5 С помощью ТИФМ установлено наличие антител к антигенам S - слоя, наряду с антителами к протективному антигену, в сыворотках выживших после заражения В anthracis животных и больных сибирской язвой людей, что свидетельствует о целесообразности использования антигенов S - слоя для диагностики сибирской язвы

Практическая значимость

На основании проведенных исследований разработаны, одобрены ученым советом, утверждены директором Волгоградского научно-исследовательского противочумного института

«Методические рекомендации по выделению гсльхроматографией отдельных внеклеточных антигенов Bacillus anthracis» (протокол № 14, от 28 12 2001г) Приоритетность способа защищена патентом №2230570 от 4 11 2002г «Способ выделения высокомолекулярного соматического антигена»

Практическое значение имеет полученный результат по выживанию в течение 35 суток (срок наблюдения) морских свинок, которым перед заражением вводили неполный адъювант Фрейнда Эта модель может быть использована для получения сывороток к антигенам вирулентного штамма Bacillus anthracis и изучения факторов неспецифической резистентности при сибирской язве Приоритетность способа защищена патентом на изобретение №2252031 от 24 09 2003г «Способ получения иммунной сыворотки к антигенам вирулентного штамма Bacillus anthracis »

«Инструкция по применению иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных моноспецифических жидких для обнаружения и идентификации вегетативных и споровых форм В anlhracis» (протокол № 1, 12 01 200бг)

Материалы диссертации включены в научно - исследовательские работы № Г Р 0120 0 407 953 «Разработка и изучение диагностических препаратов на основе моноклональных антител против антигенов спор сибирской язвы» (2004 - 2006г), № ГР 0120 0 600 850 «Серодиагностика сибирской язвы, сапа, мелоидоза и туляремии в условиях чрезвычайных ситуаций» (2005 - 2009г), в которых автор является исполнителем

Материалы диссертации включены в лекционный материал курсов при Волгоградском научно-исследовательском институте для постдипломной переподготовки и повышения квалификации врачей - бактериологов, биологов и лаборантов учреждений санитарно-эпидемиологического профиля и клинических диагностических лабораторий по вопросам специфической индикации, лабораторной диагностики особо опасных заболеваний и противодействию биотерроризму

Положения, выносимые на защиту:

1 Штаммы В anthracis СТИ, Davies, 81/1 TR при выращивании в R - среде, обогащенной казаминовыми кислотами, различаются по продукции отдельных белков токсинпродуцирующий штамм В anthracis СТИ продуцирует преимущественно протективный антиген и в меньшей мере белки S - слоя, бес-плазмидный штамм В anthracis 81/1TR и капсулообразующий штамм В anthracis Davies продуцируют главным образом белки S - слоя

2 Сыворотки к белкам, которые элюируются в свободном объеме (фракция 1) при разделении культуральных фильтратов В anthracis СТИ и В anthracis 81/1TR на сефакриле S - 300, содержат антитела к различным антигенам S - слоя Эти сыворотки сходны по видоспецифическим свойствам, они в

отличие от сыворотки к фракции 1 капсулообразующего штамма В шикгааз ОаушБ не содержат антител к антигенам близкородственных микроорганизмов

3 Использование сыворотки к фракции 1 КФ ВатНгаш 81/1ТЯ для идентификации в МФА В аШкгасм целесообразно в связи с ее видоспецифичностью и наличием штамма-продуцента (В аткгаск 81/1ТЯ), который позволяет накапливать, достаточно очищенный, антиген в препаративном количестве

4 В ТИФМ с сыворотками зараженных В атИгас^ морских свинок и больных сибирской язвой людей наряду с антителами к протективному антигену содержатся антитела к антигенам Б - слоя, что свидетельствует о целесообразности использования этих антигенов в диагностике сибирской язвы

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 14 рисунками, 10 таблицами Состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, выводов Список литературы включает 192 работы, из них 68 отечественных и 124 зарубежных авторов

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на IV Межгосударственной научно - практической конференции государств - участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003), научной конференции с международным участием «Современные средства иммунодиагностики, иммуно - и экстренной профилактики актуальных инфекций» (Санкт - Петербург, 2004), межгосударственной научно - практической конференции «Санитарная охрана территорий государств - участников содружества независимых государств проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях»

(Волгоград, 2005), результаты работы доложены на ежегодных межлабораторных научных конференциях Волгоградского научно-исследовательского института (2003 - 2005). Материалы диссертации обсуждены и одобрены на расширенной конференции лаборатории сибирской язвы Волгоградского научно-исследовательского института

Публикации

Основное содержание диссертации отражено в 7 опубликованных работах

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первая глава - обзор литературы, где изложено систематическое положение и антигенные особенности Bacillus anthracis, методы лабораторной идентификации Bacillus anthracis и диагностика заболевания

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве штаммов - продуцентов белков S - слоя были изучены одноплазмидный токсинпродуцирующий В anthracis СТИ (лиофилизированный штамм серия 35, получен из НИИ микробиологии Министерства обороны г Киров), одноплазмидный капсулообразующий штамм В anthiacis Davies, получен из коллекционного центра Волгоград НИПЧИ, селекционированный нами из типичного вирулентного штамма В anthracis 81/1(коллекционный центр Волгоград НИПЧИ) бесплазмидный штамм В anthracis 81/1 TR

При оценке тестов для идентификации возбудителя сибирской язвы использованы семнадцать вирулентных штаммов В anthracis (штаммы - 81/1, 508/201, 522/3, 591/2, 486/50, 560/258, 619/42, 574/122, 614/217, 27/81, 298/22, 2-7, 356/90, 12/16, 624/216, 248/22, З-БК-2 (все - tox\ сар+), авирулентные штаммы - СТИ (серия 35), Sterne, СТИ (серия 145) (tox+, cap"), Davies (tox\ cap+), 81/1R (tox+, cap-), 81/1TR (tox-, cap-), и 18 штаммов бацилл - В cereus (штаммы - UHA, 1, 8035, VRRL569, АТСС 6464), В thuringiensis (штаммы -

vtuhr Gallería, vtuhr Pasteur), В subtilis (штаммы -6051, 6633, BD202), В megaterium (штаммы -5, 216, 1), В anthracoides (штаммы -96, 9), В mycoides 2, В mesenterial 6, В stearotermophilius BKMB718 Штаммы получены из коллекционного центра Волгоград НИПЧИ

В качестве питательных сред использовали агар Хоттингера рН 7,2±0,2, содержащий 130 мг% аминного азота и 2 % агара микробиологического (ГОСТ 17206 - 96), сердечно - мозговой агар и сердечно - мозговой бульон «Difco», а также эти среды с нормальной лошадиной сывороткой и бикарбонатом натрия

Для выделения внеклеточных антигенов штаммы В anthracis выращивали в жидкой питательной R - среде, предложенной для получения сибиреязвенного токсина (Risthroph J D, Ivins В ,1989) и в R - среде с казаминовыми кислотами «Difco» из расчета 4г на 1л питательной среды, при 37 °С, в течение 22ч, с шуттелированием (72об/мин) Стерилизовали культуральную жидкость фильтрованием через фильтр ДР045, проверяли на стерильность, концентрировали 1800 мл культуральной жидкости на установке ДС-2 «Amicon» с волоконным фильтром HLP10 до 100 мл, затем - на ультрафильтре РМ10 до 10-12 мл

Фракционирование культуральных фильтратов (КФ) осуществляли на колонке 2x72 см с сефакрилом S - 300 SF («Pharmacia»), которую уравновешивали 0,2 M трис - НС1 - буфером рН 8,4 Выход фракций регистрировали при \=280нм с помощью спектрофотометра «Uvicord S - II» (LKB) Затем фракции концентрировали, диализовали на ультрафильтре РМ10, хранили при температуре - 20 °С

Определяли концентрацию белка в исходных, концентрированных культуральных фильтратах и их фракциях на спектрофотометре «Perkm - Elmer 550», при Х=280нм, в качестве стандарта использовали альбумин сыворотки крупного рогатого скота «Реахим»

Токсичность фракций определяли в тесте отекогенности при внутрикожном введении их нелинейным морским свинкам (массой 250 - 350 г)

(Федотова ЮМ, Уланова AJ1, 1970) Протективные свойства оценивали по проценту выживших животных после иммунизации фракциями с последующим заражением вирулентным штаммом В cmthracis 81/1

Для получения сывороток кроликов породы «Шиншилла» (массой 3 кг) трижды иммунизировали возрастающими дозами антигена с неполным адъю-вантом Фрейнда (НАФ) с промежутками в две недели 250 мкг, 500 мкг, 750 мкг белка на одно животное Раствор антигена и адъюванта смешивали в равных количествах по 1,5мл Вводили внутрикожно, паравертебрально по 0,1мл -1,5мл и в оба паха по 0,75 мл

Через семь дней после последнего введения антигенов у кроликов брали кровь из вены уха Активность сывороток определяли в реакции иммунодиф-фузии (РИД) с КФ и их фракциями При титре антител 1 8 - 1 16 у животных брали кровь из вены уха в объеме 30мл, что позволяло получить 15-20мл сыворотки. Сыворотки консервировали мертиолятом 1 10 000, хранили при температуре +4 °С

При более низких титрах антител после месячного перерыва проводили второй цикл иммунизации, который заключался в двукратном введении антигенов с НАФ по описанной методике

Спектр внеклеточных антигенов и специфичность сывороток определяли в реакции иммунодиффузии в геле (Фримель Г,1987) и в реакции иммунодиффузии в питательном агаре с антигенами растущих культур (РИД РК)

Спектр белков культуральных фильтратов и экстрактов клеток определяли в электрофорезе и иммуноблоттинге

Белки культуральных фильтратов осаждали ацетоном Для этого смешивали равные объёмы (0,3мл) охлажденного ацетона и КФ в 1,5мл микроцентрифужных пробирках Пробирки помещали в морозильник бытового холодильника на 16 ч, после формирования осадка центрифугировали 5мин при 12000 об/мин (центрифуга «Sigma 202М») Надосадочную жидкость удаляли, к осадку

добавляли лизирующий буфер, состоящий из 5мМ трис - гидрохлорида, 5мМ 2 - меркаптоэтанола, 1 % SDS (pH 9,8) Лизирующую смесь добавляли из расчета Юмкл на 1 мг осадка, растворяли осадок в течение ЗОмин при 70 °С и хранили в замороженном состоянии до использования

Клеточные экстракты В anthracis и близкородственных микроорганизмов получали после выращивания этих микроорганизмов в 2мл сердечно -мозгового бульона, при 37 °С 22ч Клетки осаждали центрифугированием, к осадку добавляли экстрагирующий буфер (0,125 М трис-гидрохлорида pH 6,8, 4% SDS, 20% глицерина, 10% 2 - меркаптоэтанола) из расчета 1мл на 100мг бактериальной массы, перемешивали, прогревали при 70 °С ЗОмин, центрифугировали при 12000 об/мин Осадки удаляли, к надосадочной жидкости добавляли по Юмкл 0,03мМ бромфенолового синего (pH 6,8), хранили в замороженном состоянии до использования

Иммуноблоты инкубировали с антикроличьими пероксидазными конью-гатами («Медгамал», Россия), визуализировали О - диаминобензидином («Serva») Электрофореграммы и иммуноблоты сканировали или фотографировали цифровой камерой «Dimage 323 Konica»

При приготовлении флуоресцирующих антител иммуноглобулины кроличьих сывороток, полученные к фракциям, осаждали полиэтиленгликолем 6000 а е м «Ferak» (Шаханина К Л , 1977), метили флуоресцеинизотционатом (ФИТЦ) «Олайн» (Фримель Г, 1987) Подготовленные мазки микроскопирова-ли в люминесцентном микроскопе «Люмам И - 2» (Россия) под иммерсионным объективом МЛ90 с окуляром х7 Мазки фотографировали цифровой камерой «Dimage 323 Konica»

Антитела в сыворотках экспериментальных животных и больных сибирской язвой людей определяли в непрямом твердофазном иммуноферментном методе (ТИФМ) (Кэтти Д, Райкундалина Ч, 1991) В качестве субстрата использовали тетраметилбензидин «Serva» Результаты учитывали на приборе «Stat Fax 2100 Awareness Technology»

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Выделение и характеристика белков, продуцируемых штаммами B.anthracis с различным профилем плазмид вирулентности.

I 1 Получение и характеристика одно- и бесплазмидных штаммов В anthracis Одно- и бесплазмидные варианты получены из типичного вирулентного сибиреязвенного штамма В anthracis 81/1 (Коготкова О И с соавт, 2005)

Температурная элиминация плазмнд вирулентности осуществлена путем выращивания данного штамма в сердечно - мозговом бульоне при 42,5 °С с ежесуточными пересевами (Green BD et al, 1985) Селективными признаками являлись отсутствие капсулообразования и токсигенности

Путем температурной элиминации получены одноплазмидный токсинпро-дуцирующий штамм В anthracis 81/1R (LDso>5xl03) и бесплазмидный вариант В anthracis 81/1TR (LD50>5xl03), сохранившие типичные фенотипические признаки, подтвержденные плазмидным анализом

I 2 Выделение из кулътуралъных фильтратов белков, продуцируемых одно - и бесплазмидным штаммами В anthracis

В качестве продуцентов белковых антигенов были отобраны следующие авирулентные штаммы

В anthracis СТИ - штамм, используемый в настоящее время для вакцинации людей

В anthracis Davies - авирулентный, капсулообразующий штамм использован как продуцент внеклеточных антигенов, изучение которых ранее не проводилось

Бесплазмидный штамм В anthracis 81/1 TR использован как возможный продуцент белков S-слоя В anthracis (Farchaus J et al, 1995, Lamonica J M et al, 2005)

Все штаммы, использованные в работе, проявляли типичные фенотипиче-ские свойства, которые подтверждены плазмидным анализом

Жидкая питательная R - среда была выбрана для получения внеклеточных антигенов в связи с тем, что она обеспечивает не только внутриклеточный синтез белка, но и выделение его во внеклеточное пространство Кроме того, высокий показатель рН 8,2 - 8,4 снижает действие протеаз (Risthroph J D, Ivms В , 1989; Онищенко Г Г с соавт, 1999) Однако, такая среда оказалась малопродуктивной для выделения белка ЕА1 Этот белок продуцировался в значительно большем количестве при выращивании токсинпродуцирующего и бесплазмид-ного штаммов В anthracis Sterne в богатой питательной среде, включающей дрожжевой экстракт и триптон Но успешное выделение белка из этого культу-рального фильтрата во многом зависело от полноты удаления пигмента (Farchaus J et al, 1995) В нашем случае обогащение дрожжевым экстрактом R - среды, хотя и повышало выход антигенов фракции 1 В anthracis СТИ, однако исключало регистрацию при Х=280нм других компонентов КФ в связи с элю-цией пигмента в объемах выхода других фракций Поэтому для выделения про-тективного антигена мы использовали оригинальную методику Risthroph J D et al (Risthroph J D , Ivins В , 1989) Использование R-среды, обогащенной ка-заминовыми кислотами, и увеличение посевной дозы до 1х104-1х105 мк/мл В anthracis обусловило повышение выхода белков S-слоя Концентрирование культуралъных фильтратов на ультрафильтрах HLP10 и РМ10 позволило получать культуральные фильтраты, пригодные для фракционирования гельхрома-тографией При концентрировании КФ в 270-300 раз концентрация белка увеличивалась в 7-7,5 раз (1,5-1,7 мг/мл белка в исходном КФ, до 10,5-12,8 мг/мл белка в концентрированных КФ)

Изучение антигенного спектра культуральных фильтратов авирулентных штаммов В anthracis в РИД с коммерческим сибиреязвенным глобулином показало, что они различаются по содержанию антигенов, характерных для каждого штамма

РИС, 1. Антигены культуральных фильтратов штаммов В.ашИгаси',, выявляемые в РИД. 1,2,3 - КФ В.апфгаа* СТИ вразведениях 1:5, 1:10, 1:20; 4,5- КФ В.амИгасЫ 81/1 77? - цельный и в разведении 1:2; 6,7,8- КФ В.ашИгаш Оа\\ез в разведениях 1:8, 1:4, 1:2; 9 - коммерческий сибиреязвенный глобулин.

Культуральные фильтраты трёх штаммов получены с использованием Я - среды с казаминовыми кислотами.

Так, доминантный антиген, продуцируемый В.аШЪгааз 81/1ТК, определялся в культуральных фильтратах штаммов II ап1Игас1.ч СТИ и В.атНгас1$ Оау!ез, которые содержали также антигены, характерные только для культуральных фильтратов этих штаммов.

Следовательно, антигенный спектр культуральных фильтратов обусловлен межштаммовыми различиями В.ашИгаси, одним из которых может быть содержание в штамме плазмид вирулентности.

I .¡.Фракционирование методом гельхроматографии на сверхтонком сефакриле Б-300 культуральных фильтратов штаммов В.аШкгас'к

Для фракционирования культуральных фильтратов был выбран сверхтонкий сефакрил Б - 300 (пределы фракционирования 600 - 1500000 кДа), так как он позволял эффективно и с большей скоростью разделять белки с высокой молекулярной массой.

Обращало внимание наличие сходных по м.м. белков,'которые элюирова-лись в свободном объёме (фракция 1) при разделении на сефакриле 8 - 300 культуральных фильтратов токсинпродуцируюшего, капсулообразующего и бесплазмидного штаммов (рис. 2).

Для КФ бесплазмидного штамма В.ашИгаси 81/1ТЯ белок фракции 1 был доминирующим, а белки других фракций содержались в незначительном количестве и выявлялись непостоянно. При разделении 15мл этого КФ с концентрацией белка 10,9 мг/мл получена фракция 1 объёмом 11мл с концентрацией бел- 1 ка 1,2 мг/мл. ■ - •■ .

Для КФ капсулообразующего штамма В.атНгаш Эау^ез доминирующими также были белки фракции 1, которые элюировались в виде трёх неразде- I лившихся пиков. Кроме белков фракции 1 КФ В.апЛгаах Оауч'ея содержал белки меньшей м.м., которые в отличие от культуральных фильтратов В.апШгаЫз 81/1ТЯ и В.атИгас\& СТИ постоянно регистрировались в виде пиков 2,3,4,6. При разделении 15мл КФ В.апЛгаЫз Вачаеэ с концентрацией белка 12,8мг/мл получали 10,5мл фракции 1 с концентрацией белка 1,2 мг/мл.

Особенностью КФ токсинпродуцирующего штамма В.амЪгаЫь СТИ было наличие в нем белков, которые элюировались как фракции 5 и 7. По объёму выхода маркерных белков эти фракции отнесены к протективному антигену и его фрагменту (м.м. 23кДа).

РИС.2. Хроматограммы культуральных фшьтратов штаммов B.anthracis.

А - кулыпурильный фильтрат B.anthracis СТИ; ,

В - культуральный фильтрат B.anthracis Davies; С-культуральный фильтрат B.anthracis 81/1 TR.

Объём геля 2*72см; объёмы культуральных фильтратов, наносимых на гель, 2,5мл; скорость

элюирования 25мл/ч, объём одной пробирки 1мл.

Элюирование маркеров; Д - декстран голубой (81проб.), Ф - ферритин (114 проб.), К -каталаза (128 проб.), А - апъбумин бычий (141 проб.), X- химотрипсиноген (165 проб.).

! Т

ОП 280нм

1 2 3 4 5 6 7 фракции

На выход белков фракции 5 посевная доза не оказывала существенного влияния Концентрация белка в исходном КФ составила 1,5мг/мл при посевной дозе 1*103и 1,7 мг/мл при посевной дозе 2Х104

Выход белков фракции 1 КФ В anthracis СТИ был значительно ниже, чем фракций 1 культуральных фильтратов В anthracis Davies и В anthracis 81/1TR С увеличением посевной дозы до 1x104- Iх 105 м к/мл выход белка фракции 1 КФ В anthracis СТИ увеличивался более чем в 2 раза Из 15мл КФ В anthracis СТИ с концентрацией белка 10,5мг/мл (посевная доза 1 * 103 м к /мл) и 12,5мг/мл (посевная доза 2х104 м к/мл) получали по 10 мл фракции 1 с концентрацией белка соответственно 0,110мг/мл и 0,280мг/мл

Фракция 3 КФ В anthracis СТИ элюировалась в объеме ферритина (м м 440кДа), что совпадало с м м белка, идентифицированного как белок ЕА1, продуцируемого бесплазмидным штаммом В anthracis Sterne (Farchaus J et al, 1995) Концентрация белка во фракции 3 КФ В anthracis СТИ существенно не зависела от посевной дозы и составила, соответственно, 0,750мг/мл и 0,780мг/мл Полученные результаты подтвердили целесообразность использования посевной дозы 1 х 103 м к/мл для выделения ПА, которая обусловливала преимущественное содержание его в культуральном фильтрате относительно других белков, продуцируемых В anthracis СТИ

Следовательно, профиль хроматограмм культуральных фильтратов трех авирулентных штаммов, как и антигенный спектр этих КФ обусловлен межштаммовыми различиями, одним из которых может быть содержание плазмид вирулентности в этих штаммах

1 5 Изучение токсичности и протективиых свойств хроматографическах фракций культуральных фильтратов штаммов В anthracis

Для установления различий между внеклеточными антигенами, секрети-руемыми штаммами В anthracis СТИ, Davies, 81/1TR, были изучены отекоген-

ные и протективные свойства фракций, выделенных из культуральных фильтратов

В результате было установлено, что при внутрикожном введении морским свинкам 0,1 мл фракций 1 культуральных фильтратов (28 - 125мкг) этих штаммов и фракций Ъ, 5,1 В агЛкгаш СТИ (44 - 175 мкг) утолщение кожной складки примерно в два раза отмечено только в месте введения фракции 5 Это свидетельствовало о принадлежности фракции 5 к сибиреязвенному токсину

При изучении иммуногенных свойств морским свинкам подкожно вводили 50мкг и через две недели 100 мкг фракций 1 культуральных фильтратов трех штаммов В апЛгаш и фракций 3,5,7 КФ В апМгаск СТИ с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ) Через 21 день после иммунизации животных заражали подкожным введением от 2 х 103 до 2 х 105 спор В ашИгаа.ч 81/1 Морских свинок, получивших только НАФ по схеме иммунизации, и интактных животных заражали 2^101 -2*103 спор В апЛгасм 81/1

После заражения интактные морские свинки пали в течение 3-4 суток, 1ЛЭ5о для них составила 25 спор При заражении примерно 100Ь050 ВамИгаси 81/1 иммунизированных морских свинок и морских свинок, которым по схеме иммунизации вводили НАФ, выживало соответственно 100% и 66 % животных, в течение 35 дней (срок наблюдения)

При заражении животных более высокими дозами (2х 105 спор) выживало 80% морских свинок, иммунизированных только фракцией 5 культурального фильтрата ВаыНгаст СТИ, что подтвердило принадлежность фракции 5 к протективному антигену

При вскрытии павших животных отмечали кровенаполнение и кровоизлияние в печени и селезёнке При бактериологическом обследовании выделяли штамм В ап!кгаа$, который идентифицировали по чувствительности к фагу «К» и тесту «жемчужное ожерелье» У выживших животных на 21 - 35 сутки после заражения патологии со стороны внутренних органов не отмечено Возбудитель сибирской язвы не выделен.

По - видимому, фракции 1 и 3, выделенные из культуральных фильтратов, относятся к белкам Б - слоя В апАгаси Основанием для такого утверждения может быть сходство этих белков по молекулярной массе с белками 8 -слоя (РагсЬаиБ 1 е! а1, 1995) При культивировании В апАгас/х белки Б - слоя выделяются в жидкую питательную среду (РагсЬаиз Л й а!, 1995, Ьашошса IМ е1 а1, 2005) и в отличие от ПА не обладают высокими иммуногенными свойствами (Микшис Н И с соавт, 2004)

16 Получение и характеристика сывороток к отдельным фракциям культуральных фильтратов штаммов В ашИгасш

Для получения сывороток использованы фракции 1, так как они были характерны для культуральных фильтратов трех авирулентных штаммов В апАгаси Получение сывороток к этим фракциям обусловлено необходимостью идентифицировать антигены этих фракций

Фракция 3 КФ В амИгааз СТИ использована для получения сыворотки, так как м м белка этой фракции соответствовала молекулярной массе белка ЕА1 (РагсЬаиэ J е! а1, 1995), а сыворотка могла быть использована для идентификации антигенов Б - слоя В апАгаск

Фракции 5 и 7 КФ ВапАгаш СТИ использованы для получения сывороток к протективному антигену и его фрагменту

Специфичность сывороток к фракциям КФ ВапАгаш СТИ изучена в РИД с антигенами этого КФ Установлено, что сыворотка к фракции 1 выявляет антиген, который не содержится или содержится в незначительных количествах в других фракциях КФ

Сыворотка к фракции 3 содержит антитела преимущественно к антигену не идентичному фракции 1

РИС.3. Реакция иммунодиффузии в геле сывороток к фракциям КФ В. агаИгаса СТИ. 1,3,5,7 - сыворотки к фракциям 1.3,5 и 7 КФ В.атИгаЫз СТИ; 2 - КФ В.ап^гасЫ СТИ в разведении 1:4.

Сыворотки к фракциям 5 и 7 содержат антитела к антигенам характерным для этих фракций (Г1А и его фрагменту м.м.23 кДа), а также антитела к антигенам фракции 3 (рис.3).

При сравнении сывороток к фракциям 1 культуральных фильтратов штаммов В.ап1кгас1з с различным профилем плазмид вирулентности установлена не идентичность антигена, выявляемого сывороткой к фракции 1 КФ В.ап^гааз СТИ к одному из двух антигенов, выявляемых сывороткой к фракции 1 КФ В.апМгааэ 81/1ТЯ.

Сыворотка к фракции 1 5.аи/йгас/х Оахчев содержала антитела к антигенам, один из которых идентичен фракции 1 КФ В.ди//ггасг'5 СТИ, второй - антигену Яая/Лгаем 81/1ТИ.

Сыворотка к фракции 5 В.ап1Игас15 СТИ выявляла два антигена, один из которых специфичен для этой фракции, другой - частично идентичен антигену фракции 1 КФ В.аткгас15 81/1ТК (рис.4).

РИС.4. Реакция иммунойиффузии антигенов культурального фипынрата В.ап1Игас15 СТИ с сыворотками к фракциям культуральных фшыпратов штаммов В.аЫЬгасгз 1 ~ куяьтуралькьш фильтрат В.агиНгаЫх СТИ б разведении 1:4;

2,3,5- сыворотки к фракциям 1 культуральных фильтратов штаммов В.апШгасЫ СТИ, В.ашИгасй 81/1ТЯ, В.амЬкааз [)ач1еь;

4 - сыворотка к фракции 5 культурального фильтрата В.атИгаЫь СТИ.

Наличие антител к не идентичным антигенам в сыворотках к фракциям 1 КФ В.атИгат СТИ и 81/1ТК подтверждено в РИДРК (рис. 5).

РИС.5. РИДРК антигенов В.ап1Игас1з СТИ с сыворотками к фракциям культуральных фильтратов штаммов В.апгИгас^з

1,2,3 - соответственно сыворотки к фракциям 1 культуральных фильтратов В.ап1Игас1.<: СТИ, 81 /1ТЯ, Оау1ез; 4 - сыворотка к фракции 3 культурального фильтрата В.ояйгасы СТИ.

При этом антитела к идентичным антигенам содержали сыворотки к фракциям 1 КФ В.ап1ИгаЫ$ 81/1ТЯ, Оау1ез и сыворотка к фракции 3 КФ В.ашИгасн СТИ.

1.7. Определение принадлежности к антигенам Б - слоя белков, выделенных из культуральных фильтратов

Принадлежность белков, выделенных из культуральных фильтратов, к антигенам Б - слоя В.аткгаЫз определяли по молекулярной массе, способу выделения и антигенным свойствам.

С этой целью проведено сравнение электрофоретической подвижности белков культуральных фильтратов с белком, экстрагированным из клеток и охарактеризованным как белок ЕА1 [ЕггеП .1., АЬэсЫге Т., 1988].

Электрофорез белков для окраски Кумасси и для анализа в иммуноблот-тинге проводили в одном блоке 10 % полиакриламидного геля с ДСН толщиной 1мм, высотой 140мм, шириной 160мм. Электроперенос на нитроцеллюлёз-ную мембрану осуществляли в камере с электродами из нержавеющей стали размером 1><140х160мм при силе тока 180мА, напряжении 42В в течение 2 ч. При этом температура буферных растворов в камере повышалась до +22 °С -+25 °С при температуре окружающей среды +18 °С.

'»да:

97 * 94

■ -84

66,2 »

45

41

. ■ :

33 * :

- г

21,5 Л.; -,,,«22

1 2 3 4 5

РИС.6 Молекулярные массы белков культуральных фильтратов штаммов В. ашИгисг^.

1 - маркеры:

97кДА - фосфорилаза В; 66,2кДа - бычий сывороточный альбумин; 45кДа - овальбумин; ЗЗкДа - карбоангидраза; 21,5кДа - ингибитор трипсина.

2 -экстракт клеток В.апШгас^я СТИ.

Белки культуральных фильтратов штаммов: 3 - В.амИгас15 Оаугез; 4 - В.амИгаС1$ 81/1ТИ; 5 - В.апЛгаси СТИ.

Электрофоретическое разделение белков культуральных фильтратов В.аЫЬгаш 81/1ТК и Ба\ае5 показало, что они представлены белками с м.м.

94кДа, которые по электрофоретической подвижности сходны с белком, экстрагированным из клеток B.anthracis СТИ, что свидетельствовать о принадлежности данных белков к антигенам S - слоя. Известно, что белок ЕА1 прочно связан с клеточной стенкой и в культуральном фильтрате обнаруживаться не может (Mignot Т. et al., 2002; Микшис Н.И., 2004). Обращало внимание небольшое содержание в КФ B.anthracis СТИ белка м.м. 94кДа и преимущественное - белка м.м. 84кДа, характерной для протективного антигена. Белки с м.м. 51, 41, 22 кДа этого КФ, возможно, являются фрагментами протективного антигена, образовавшимися в результате действия собственных протеаз B.anthracis СТИ (Носков А.Н. с соавт., 1997) (рис. 6).

Рис. 7. Антигены В. anthracis, выявляемые в иммуноблоттинге сыворотками к фракцшш.

1 -экстракт кпеток B.anthracis 81/1 TR;

2 -экстракт клеток B.anthracis СТИ;

3 - белки культурального фильтрата B.anthracis СТИ.

А - с сывороткой к фракции 5 культурального фильтрата B.anthracis СТИ; Б -с сывороткой к фракции 1 культурального фильтрата B.anthracisSJ/I TR; В -с сывороткой к фракции I культурального фильтрата B.anthracis СТИ

В иммуноблоттинге сыворотки к фракциям 1 штаммов B.anthracis СТИ и 81/1TR выявляли антигены м.м. 94 кДа, выделенные из культуральных фильтратов (белок Sap) и экстрагированные из клеток (белок ЕА1). Учитывая, что эти сыворотки в РИДРК выявляли различные антигены (рис. 4, 5), следовательно, в экстрактах клеток и культуральных фильтратах содержатся два белка с м.м. 94кДа (оба белка S - слоя). Сыворотка к фракции 5 КФ B.anthracis СТИ кроме белка м.м. 94кДа, выявляла белок м.м. 84кДа, который

не определялся в экстрактах клеток штаммов B.anthracis СТИ, 8I/1TR. Из чего следует, что эта сыворотка главным образом содержит антитела к ПА (анти-ПА сыворотка) и в меньшей мере к белкам S - слоя (рис. 7).

По - видимому, при культивировании штаммов B.anthracis с шуттелированием в течение 22 часов, в стационарной фазе роста в питательную среду наряду с белком Sap диффундирует белок ЕА1.

Известно, что продукция белков S - слоя кодируется хромосомными генами (Mesnage S., 1999; Mignot Т., 2003). С целью определения принадлежности антигенов, выявляемых сыворотками к фракциям 1 КФ B.anthracis СТИ и 81/1TR к антигенам S - слоя, они были исследованы в РИДРК со штаммами B.anthracis с различным профилем плазмид вирулентности (рис.8).

РИС.8. Реакция иммунодиффузии в геле внеклеточных антигенов различных генотипов В. anlhracis 1,2,3,4 - соответственно: В. anlhracis 81/1(рХОГ, рХОГ), СТИ (рХОГ, рХ02~), 81/1 TR (рХОГ, рХОГ), 81/1 R (рХОГ, рХ02~);

5,6 - соответственно сыворотки к фракциям 1 кулыпуральных фильтратов В. anlhracis 81/1 TR и В. anlhracis СТИ.

Эти сыворотки выявляли антигены B.anthracis, диффундирующие в питательную среду, экспрессия которых не связана с плазмидами вирулентности, что подтверждает наличие в них антител к белкам S - слоя. Учитывая, что сыворотки к фракциям 1 B.anthracis СТИ и 81/1TR содержат антитела к различным антигенам, следовательно в плотную питательную среду могут диффундировать как белок Sap так и ЕА 1.

Учитывая, что сыворотка к фракции 1 КФ В.ап1кгаш СТИ обладала видоспецифическими свойствами (Евтеева Е.В., 2003), представляло интерес изучить видоспецифические свойства сывороток к фракциям I других штаммов В. аШИгасгя.

1.8.Изучение видоспецифических свойств сывороток к отдельным фракциям культуральных фильтратов В.амИгасгя.

Сыворотки к фракциям 1 культуральных фильтратов В.аШкгас15 СТИ и 81/1ТЯ в РИДРК характеризовались видоспецифичностью и в отличие от сывороток к фракциям 1 КФ В.ап1Игас1Я Оау1ек и фракции 3 КФ В.ап1кгас\$ СТИ, не выявляли антигены, продуцируемые в питательный агар В.сегет и ВлУшг'т&ет'м (рис.9).

РИС.9. Специфичность сывороток в РИД РК.

1,2,3 - соответственно сыворотки к фракциям 1 культуральных фильтратов В.атИгас1з СТИ, 81/1ТЯ, ОаУ1ез; 4 - сыворотка к фракции 3 культурального фильтрата В.апШгаЫй СТИ.

Видоспецифические свойства сывороток к фракциям 1 В.ашИгаш СТИ и В.ап1ИгаС1А- 81/1ТЯ подтверждены в иммуноблоттинге с экстрактами клеток штаммов В.сегеиз и В.(Ииг'т^етгн, у которых в РИДРК с помощью сывороток к фракции 3 КФ В.аМкгаск СТИ и фракции 1 КФ ВмпгИгаах Оау1ев выявлены перекрестно реагирующие антигены. Белки В.сегеиз м.м. 94кДа и белки В.1Ииг^1епз1й м.м. 97кДа не реагировали с сыворотками к фракциям 1 штаммов В.аМкгас1$ СТИ и В.атИгаая ЪШТЯ (рис.10).

шШшш ' 12 3 4 А

вживи

I 2 3 В

1 2 3 Б

РИС.10. Электрофорез и иммуноблоттинг клеточных экстрактов В. anlhracis и близкородственных микроорганизмов

А ~ электрофорез: клеточных экстрактов 1 - B.lhuringiensis v. Gallería: 2 - B.cereus VRRL 569: 3 - В. anlhracis 81/1 TR; 4 - белков культурального фильтрата В.anlhracis СТИ.

Иммуноблоттинг меточных экстрактов и культуральных фильтратов с сыворотками к фракциям 1:

Б - сыворотка к фракции 1 КФ В. anlhracis 81/1 TR в разведении 1:300: В - сыворотка к фракции 1 КФ В.anlhracis СТИ в разведении 1:200

Известно, что белки Sap и ЕА1 ассоциированы с клеточной поверхностью В.anlhracis (Ezzel J.W., et al., 1989; Mesnage S., et al., 1998), а сыворотки к фракциям 1 культуральных фильтратов B.anthracis СТИ и 81/1TR содержат антитела к антигенам S - слоя и характеризуются видоспецифичностью. Поэтому было целесообразным изучение этих сывороток для идентификации B.anthracis методом флуоресцирующих антител.

2. Иммунологическая диагностика сибирской язвы и идентификация B.anthracis

2.1. Сравнительная характеристика в методе флуоресцирующих антител иммуноглобулинов к антигенам S - слоя штаммов B.anthracis

Основная цель данного раздела - изучение видоспецифических свойств и специфической активности иммуноглобулинов сывороток к фракциям 1 штаммов B.anthracis СТИ, Davies, 81/1TR.

Иммуноглобулины этих сывороток, меченные ФИТЦ, были достаточно чувствительными. Они окрашивали бескапсульные и инкапсулированные клет-

ки вирулентного штамма В атЪгаш в одинаковых титрах (1 32-1 128), а споры - в два раза меньшем разведении

Иммуноглобулины сывороток к фракциям 1 этих штаммов В ашкгаа.ч обладали специфической активностью В рабочих титрах они окрашивали 23 штамма В атИгаск независимо от профиля плазмид вирулентности Исключение составили три вирулентных штамма В ашИгаш, у которых значительное количество клеток окрашивались неспецифически рабочими разведениями иммуноглобулинов, а также штамм В амИгаск СТИ (серия 145 Тбилисского института вакцин и сывороток) Вегетативные клетки и споры этого штамма не окрашивались иммуноглобулинами сыворотки к фракции 1 В аыИгаси СТИ Однако клетки этого штамма окрашивались иммуноглобулинами сывороток к фракциям 1 В апШгаая 81/1ТЯ и Оаушв в более низких титрах, чем рабочее разведение Полученные результаты свидетельствовали, что популяции клеток штаммов В аМИгасм могут быть неоднородны по продукции белков 8 - слоя (Микшис Н И с соавт , 2006)

Иммуноглобулины сывороток к фракциям 1 штаммов В аМЬгааэ СТИ, ОаУ1еБ, 81/1ТЯ характеризовались видоспецифичностью Они в рабочих разведениях не окрашивали вегетативные клетки и споры близкородственных микроорганизмов Исключение составили иммуноглобулины сыворотки к фракции 1 В ашИгаск ОаушБ, которые в рабочих разведениях окрашивали споры двух из пяти штаммов В сегеи$ и два штамма В thurmglens^s на 2+ По - видимому, перекрестные реакции с близкородственными микроорганизмами обусловлены иммуноглобулинами к антигенам с м м менее 94кДа

Оценивая возможности получения диагностических препаратов для идентификации штаммов В атИгезс/х, предпочтение отдано иммуноглобулинам сыворотки к фракции 1 КФ ВамЪгааз 81/1ТЯ в связи с ее видоспецифичностью и наличием штамма - продуцента, позволяющего получать достаточно очищенный антиген в препаративном количестве

Приоритетность метода защищена патентом на изобретение №2230570 «Способ выделения высокомолекулярного соматического сибиреязвенного антигена», от 20 июня 2004года

В МФА иммуноглобулины сыворотки к фракции 1 штамма В апАгасш 81/1Т11 оказались пригодными для обнаружения В апАгаы.ч в объектах внешней среды и в органах павших животных, зараженных В апАгасм 81/1

В осадках, полученных после центрифугирования жидких проб почвы и смывов при 12000об/мин в течение Юмин , обнаруживали споры в концентрации 1X1 о3 - 1х105 мк/мл

В мазках - отпечатках, окрашенных иммуноглобулинами, с бычьим сывороточным альбумином, меченным родамином, наблюдали отдельные клетки с широкой светящейся периферией При бактериологическом посеве отпечатков органов на сердечно - мозговом агаре обычно вырастала типичная сибиреязвенная культура

Таким образом, использование иммуноглобулинов сывороток к фракции

1 КФ В апАгаси 81/1ТЛ для идентификации В апАгаси возможно в чистых культурах, в пробах внешней среды и в биологическом материале

Специфическая активность и специфичность иммуноглобулинов сыворотки к фракции 1 штамма В апАгааз 81/1ТЯ проверена комиссионно в Волгоград НИПЧИ в соответствии с приказом директора института № 81 от 12 2005г Результаты комиссионных испытаний подтвердили данные, полученные авторами

2 2 Использование твердофазного иммуноферментного метода для обнаруже-

ния антител к антигенам Б-слоя и протективному антигену В апАгаая

Одной из основных задач данного раздела была сравнительная оценка антигенов Б - слоя и протективного антигена для диагностики сибирской язвы

С этой целью в твердофазном иммуноферментном методе (ТИФМ) изучены КФ В апАгаск СТИ и фракция 5 КФ В апАгаыз СТИ, как неочищенный

и очищенный ПА Культуральные фильтраты В ашкгаси Оа\'1е5 и 81/1ТЯ использованы в ТИФМ как антигены Б - слоя

Сенсибилизирующие свойства антигенов определены в ТИФМ с сыворотками кроликов, иммунизированных различными фракциями культу-ральных фильтратов

Было установлено, что при сенсибилизации планшет КФ В амЬгаси СТИ, адсорбируется преимущественно ПА (титр с сывороткой к фракции 5 КФ В ап(Ьгасм СТИ 1 64000) При сенсибилизации планшет культуральными фильтратами штаммов В апОпасш 81/1ТЯ, Оэушб на них адсорбируются антигены 5 - слоя, которые обусловливают титр антител 1 16000 с сыворотками к фракциям 1 гомологичных культуральных фильтратов Перекрестные титры в ТИФМ свидетельствовали о различном содержании антител к антигенам Б-слоя в этих сыворотках

ТИФМ был использован для определения антител к антигенам В амИгасю в сыворотках зараженных животных В результате было установлено, что сыворотки иммунизированных и не иммунизированных морских свинок, выживших после заражения, содержали антитела к ПА и антигенам 8 - слоя

В сыворотках морских свинок, иммунизированных антигенами Б - слоя и выживших после заражения спорами В аыИгасн 81/1 (2x10' - 2*103), титры антител к антигенам КФ В амИгааь СТИ колебались в пределах 1 200 - 1 1600 в (среднем 611±16), к антигенам Б - слоя - 1 200 - 1 800 (в среднем 400±8) и 1 100- 1 800 (в среднем 320±6) соответственно при исследовании культуральных фильтратов штаммов В аШЬасгз 81/1ТК и В спмкгаа.ч ПаУ1е5

Сыворотки животных, иммунизированных ПА и выживших после заражения 2x101 - 2x105 спор В аМИгаси 81/1, содержали антитела к ПА в более высоком титре 1 200 - 1 6400 (в среднем 3678±70), чем к антигенам Б - слоя Титры сывороток этих животных были 1 100- 1 800 (в среднем 344±8) при исследовании с КФ В амИгася 81/1ТЯ и 1 100- 1 800 (в среднем 350±7) - при исследовании с КФ В апЛгааз ОаугеБ

6000 5000 4000 3000 2000 1000 0

i

-¡Г

, ГЪл , Пtt*\, ЙП

1 2 3 4 5

□ КФ. B.anthracis CTV1 ■ КФ. B.anthracis 81/1TR □ КФ. B.anthracis Davies

РИС.11. Наличие антител в сыворотках морских свинок, выживших после

заражения B.anthracis 81/1

Сыворотки:

1-нормальных морских свинок:

2-морских свинок, которым перед иммунизацией вводили НАФ;

3-морских свинок, иммунизированных антигенами S - слоя:

4-морских свинок, иммунизированных ПА;

5-ыорских свинок, иммунизированных B.anthracis 81/1 Rftox' cap'). ' ' ;

Сыворотки морских свинок, иммунизированные одноплазмидным ток-синпродуцирующим штаммом B.anthracis 81/1 R(tox* ,сар") и выжившие после заражения 2x103 - 2x105 спор B.anthracis 81/1 содержали антитела к ПА в титрах 1:1600 - 1:6400 (в среднем 5055±251), к антигенам S - слоя - 1:400 -1:800 (в среднем - 614±21 с КФ B.anthracis 81/1TR и 600±35 с КФ B.anthracis Davies).

Особый интерес представляли результаты исследования в ТИФМ сывороток морских свинок, которым по схеме иммунизации вводили только НАФ, выживших до 35 суток (срок наблюдения) после заражения 2х 10' - 2х 103 спор B.anthracis 81/1. Сыворотки этих животных содержали антитела к ПА в титре 1:200- 1:3200 (в среднем 711 ±113), к антигенам S - слоя - в титре 1:100- 1:800 (в среднем 322±24 с КФ B.anthracis 81/1TR и 377±20 с КФ B.anthracis Davies). Эти сыворотки в РИД реагировали с ПА и антигенами S - слоя.

Наличие антител в сыворотках выживших животных, которым вводили НАФ до заражения, свидетельствовало о последовательном развитии факторов

неспецифической и специфической резистентности, что может быть использовано для изучения патогенеза сибиреязвенной инфекции

Антитела к антигенам Б - слоя, как и антитела к протективному антигену, обнаружены в сыворотках больных с диагнозом кожная форма сибирской язвы

Титры антител сывороток трех больных с клиническим диагнозом кожной формы сибирской язвы составили 1 800 - 1 6400 к ПА и 1 400 - 1 1600 - к антигенам Б - слоя Титры антител у этих больных зависели от срока заболевания

Специфичность ТИФМ с фракцией 5 КФ В амИгаск СТИ и КФ В аШИгааз 81/1ТЯ, была подтверждена при исследовании 56 сывороток лиц контрольной группы, оказалось одинаковой (92,8% отрицательных результатов) Эти реакции превосходили по специфичности ТИФМ с КФ В ашИгаск СТИ (85,7% отрицательных результатов), что свидетельствовало о более низком содержании перекрестнореагирующих антигенов во фракции 5 КФ В аШИгааз СТИ и в КФ В агикгаа.ч 81/1ТЯ, чем в КФ В аткгаш СТИ При исследовании сывороток людей в ТИФМ с фракцией 5 КФ В агаИгаск СТИ и КФ В атНгааз 81/1ТЯ был установлен диагностический титр, соответствующий разведению сывороток 1 400 при ОП>0,2

Таким образом, исследование сывороток зараженных В ашИгааз животных и больных людей свидетельствовало о наличии антител преимущественно к ПА, а также о наличии антител к антигенам Б - слоя на 6- 35 дни развития сибирской язвы Результаты данного исследования подтвердили, что ТИФМ с ПА наиболее перспективен для диагностики заболевания на ранних этапах Для окончательного установления диагностического значения антигенов Б - слоя необходимо изучение динамики антител в различные сроки заболевания и после выздоровления

выводы

1 Культуральные фильтраты и экстракты клеток штаммов В атИгоаэ СТИ, В ашИгаск Оаушэ, В амкгаст 81/1ТЯ содержат белки с м м 94 кДа, что характеризует их как белки 8 - слоя Культуральные фильтраты бесплазмидного и капсулообразующего штаммов отличаются от КФ токсинпродуцирующего штамма преимущественным содержанием этих белков

2 Штаммы В аткгаах СТИ, В амИгасю ЭауюБ, В амИгасш 81/1ТЛ при культивировании в жидкой питательной среде в стационарной фазе роста продуцируют белки в - слоя, которые элюируются в свободном объеме (фракция 1) при разделении этих культуральных фильтратов на сефакриле Б - 300

3 Сыворотки к белкам фракций 1 культуральных фильтратов штаммов

В амктаь СТИ и 81/1ТЯ содержат антитела преимущественно к одному из двух белков Б-слоя

4 Сыворотки к фракциям 1 культуральных фильтратов В агикгаая СТИ и В ашИгаск 81/1 ТЯ отличаются достаточной видоспецифичностью Антитела этих сывороток в иммуноблоттинге не реагируют с белком м м 94кДа В сегеин и белками В thurmglensls, дифференцируют растущие культуры штаммов В амИгасн от близкородственных микроорганизмов по антигенам, диффундирующим в питательный агар

5 Для видоспецифической идентификации штаммов В ашИгаси в методе флуоресцирующих антител могут быть использованы иммуноглобулины сыворотки к фракции 1 КФ бесплазмидного штамма В апАгаыв 81/1

6 С целью обнаружения специфических иммуноглобулинов в сыворотках экспериментально зараженных животных и больных людей в твердофазном иммуноферментном методе наряду с протективным антигеном целесообразно применение антигенов Б - слоя В ашИгаси

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы диссертации отражены в 7 публикациях, в 5 из которых автор является первым

1 Баркова И А , Липницкий А В , Барков А М , Евтеева Е В Выделение гельхроматографией компонентов культуральных фильтратов различных генотипов Bacillus anthracisll Сб Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане

- Казахстан, Алма - Ата, 2002, С 23

2 Евтеева Е В , Барков А М , Липницкий А В , Баркова И А Эколого -эпидемиологический мониторинг сибирской язвы с помощью новых диагностических препаратов // Поволжский экологический вестник - Волгоград, 2002, №9 - С 223 - 225

3 Баркова И А , Евтеева Е В , Липницкий А В , Барков А М Использование в РНГА внеклеточных антигенов из штаммов различных генотипов Bacillus anthracisll Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней Матер межгосуд науч - практ конф государств - участников СНГ - Саратов, 2003 - С 32 - 33

4 Барков А М , Липницкий А В , Баркова И А , Шумакевич Г В , Лазо-ренко В В Внеклеточные антигены Bacillus anthracis в диагностике сибирской язвы// Современные средства иммунодиагностики, иммуно-и экстренной профилактики актуальных инфекций Матер науч конф с междунар участием 22

- 23 апреля 2004г - Санкт- Петербург, 2004, С 223

5 Баркова И А , Липницкий А В , Барков А М , Евтеева Е В Использование иммуноглобулинов к отдельным внеклеточным антигенам Bacillus anthracis СТИ для идентификации сибиреязвенного микроба// Биотехнология 2005 -№2 - С 91 -95

6 Баркова И А , Липницкий А В , Барков А М Антителообразование у морских свинок, инфицированных В anthracis II Санитарная охрана территорий государств участников Содружества Независимых Государств проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных ус-

ловиях' материалы VI межгосуд науч -практ конф государств - участников СНГ, Волгоград, 2005 - С 123-124

7 Баркова И А , Алексеев В В , Липницкий А В , Барков А М Использование антисывороток S - слоя Bacillus anthracis для идентификации возбудителя сибирской язвы // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт - Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств - участников Содружеств Независимых Государств Матер VII Межгосуд научно - практической конф государств - участников СНГ, Оболенск, 2006 - С 182-183

БАРКОВА ИРИНА АНАТОЛЬЕВНА

Иммунодиагностическая оценка белков, продуцируемых штаммами Bacillus anthracis с различным профилем плазмид вирулентности

03 00 07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Формат 60x84 1/16 Печать офсетная Бумага офсетная №65 гарнитура «Тайме» Тираж 100 экз Заказ №2142 Уел печ л 2,12 Уел -изд л 1,98

Отпечатано с готового оригинал-макета

в ООО «Бланк» Лиц №3550 400131, г Волгоград, ул Скосырева, 2а