Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Иммунобиологический статус свиней и возможности использования их в целях ксенотрансплантации

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Иммунобиологический статус свиней и возможности использования их в целях ксенотрансплантации"

•и-':

На правах рукописи

Станкова Наталия Владимировна

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СТАТУС СВИНЕЙ И ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИХ В ЦЕЛЯХ КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИИ

06.02.01 - Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□□3467688

п. Лесные Поляны, Московская область 2009 г.

003467688

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте племенного дела.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор заслуженный деятель науки РФ, Новиков Алексей Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Калашникова Любовь Александровна

доктор биологических наук, профессор Сердюк Григорий Николаевич

Ведущая организация: Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина.

Защита диссертации состоится « 28 » апреля 2009 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 220.017.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте племенного дела, по адресу: 141212, Московская область, Пушкинский район, п. Лесные поляны. Факс: 8 (495) 515-95-57.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института племенного дела.

Автореферат разослан « 20 » марта 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор .

Ерохин А.С.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из перспективных направлений трансплантологии специалисты считают пересадку человеку органов и тканей животных (ксенотрансплантация). Наиболее имму-нологически близкими человеку являются свиньи или высшие приматы. В настоящее время биоэтические аспекты не позволяют проводить эксперименты на крупных животных (собаки, приматы). Оптимальным объектом исследования для ксенотранспланта-ции являются лабораторные мини-свиньи. Преимуществом мини-свиньи по сравнению с приматами является ее беспроблемное выращивание и содержание. К тому же, изъятие свиных донорских органов, не вызывает возражений у защитников природы, поскольку свиней выращивают на мясо. Однако до последнего времени ксенотрансплантация рассматривалась только с теоретических позиций. Это связано с проблемой предотвращения отторжения пересаживаемых органов, т.к. иммунологическая несовместимость тканей животных с человеческими очень велика.

Следует отметить, что при пересадке органов от человека к человеку (аллотрансплантация), важную роль в развитии реакции отторжения играет совместимость по антигенам эритроцитов. Реципиент и донор должны иметь одинаковую группу крови. Это положение наиболее актуально при пересадке органов животных человеку. Работ по изучению совместимости по эритроцитарным антигенам свиней и человека практически нет. Это направление и стало темой наших исследований.

Цели и задачи исследований. Цель исследований заключалась в изучении иммунобиологического статуса свиней, степени его сходства с человеком и разработке методических подходов по созданию стад свиней в целях ксенотрансплантации.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследований:

- изучить биологические особенности свиней (физиологические параметры, интерьерные показатели)

- изучить степень биологического и физиологического сходства свиньи и человека

- определить генетический статус типов крови обычных и мини-свиней

- изучить динамику генетической структуры мини-свиней по группам крови в онтогенезе

- определить степень иммунологического сходства групп крови человека и свиней

- на основе результатов исследований разработать методические подходы по созданию стад свиней в целях ксенотрансплан-тации, на первоначальном этапе

Научная новизна работы состоит в том, что впервые в сравнительном аспекте исследованы интерьерные, физиологические и биохимические особенности мини-свиней, обычных свиней и человека. Проведены исследования по иммунологическому сходству свиной и человеческой крови, а так же исследования по выявлению эритроцитарных антигенов во внутренних органах мини-свиней.

Практическая значимость работы. Полученные результаты служат основой для разработки предложений по созданию стад свиней соответствующих требованиям ксенотрансплантации селекционными методами. Определены типы крови свиней, характеризующиеся наибольшей степенью сходства с типом крови человека. А так же выявлены эритроцитарные антигены во внутренних органах свиней.

Основные положения, выносимые на защиту:

- степень сходства и различия иммунологического статуса свиней и человека;

- методические подходы для создания стад свиней в целях ксенотрансплантации.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и одобрены:

- на ученом совете Всероссийского НИИ племенного дела (2008г);

- на межотдельских научных конференциях Всероссийского НИИ племенного дела (2007,2008,2009гг);

- на ученом совете Научного центра биомедицинских технологий РАМН (2009г).

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликованы 5 научных статей, в том числе в ведущих рецензируемых журналах ВАК РФ - 1.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах, иллюстрирована 25 таблицами, 2 схемами. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, собственных исследований, выводов, предложений и списка использованной литературы, который включает 150 источников, в том числе 51 на иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1 Материал исследований

В качестве объекта исследований были использованы мини-свиньи светлогорской популяции, обычные свиньи крупной белой породы и образцы крови человека.

Работа выполнена в лаборатории генетической экспертизы с/х животных ВНИИ племенного дела и в лаборатории «биомедицины» ГУ НЦ БМТ РАМН. Всего исследовано 156 голов мини-свиней, 160 голов обычных свиней и 16 образцов крови человека. Экспериментальная работа проводилась в соответствии с нижеприведенной схемой (Рис.1.)

2.2 Методы исследований

Определение групп крови мини-свиней было проведено по общепринятым методикам, с постановкой реакции агглютинации и гемолиза с использованием 47 реагентов групп крови по 10 основным системам А, В, D, Е, F, G, Н, К, L, М. Определение групп крови человека было проведено изогемагглютинирующими сыворотками, которые были предоставлены институтом гематологии РАН, по общепринятой методике (Башлай А. Г., Донсков С. И., 1998г). Пробы крови человека были типированы по следующим генетическим системам: ABO, Резус, Kell и MNss.

Обработка данных проводилась методами вариационной статистики с использованием пакета анализа данных программы MS Office Excel.

Схема исследований

Сравнительное изучение иммунобиологического статуса _свиней и человека_

^ г _

Биологические особенности свиней и человека

Физиологические, интерьерные и биохимические показатели

Сравнительный анализ типов крови мини-свиней и обычных свиней

Тип крови свиней и человека

1

Иммунобиологическое сходство крови свиней и человека

Лабораторные исследования

Перекрестное определение групп крови мини-свиней и человека

С использованием методики определения групп крови свиней С использованием методики определения _групп крови человека

Антигены эритроцитов Антитела (реагенты) Антигены эритроцитов Антитела (реагенты)

свиней свиней человека человека

свиней человека свиней человека

человека свиней человека свиней

Выявление эритроцитарных антигенов во внутренних органах мини-свиней

В сердечной мышце

В ткани почек

Методические подходы создания стад свиней в целях ксенотранс-

плантации

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Биологические особенности свиней и человека

3.1.1 Интерьерные показатели организма мини-свиней, обычных свиней и человека

Из интерьерных показателей мини-свиней была измерена масса основных внутренних органов (сердце, печень, легкие, селезенка, почки, надпочечники). Полученные данные сравнивались с аналогичными показателями обычных свиней и человека с целью установления наиболее схожих животных по этим показателям с человеком (табл. 1). Взвешивание внутренних обескровленных органов свиней проводилось непосредственно после убоя животного. Показатели массы внутренних органов человека приведены из литературных источников (Борзяк Э.И., Бочаров В.Я., Сапин М.Р., 1997г).

Таблица 1

Человек Мини-свиньи Обычные свиньи

Живая масса, кг 65-70 40-45 260-330

Сердце, кг 0,30 0,19 0,34

Легкие, кг 1,43 0,47 0,80

Печень, кг 1,50 0,88 1,6-2

Почки, кг 0,26 0,20 0,30

Селезенка, кг 0,18 0,06 0,21

По анатомическому и гистологическому строению внутренних органов и тканей мини-свиньи не отличаются от обычных свиней, различия наблюдаются лишь по массе. Исследованиями установлено некоторое сходство по строению и функциям различных органов свиньи с органами человека. Из данных таблицы следует, что мини-свиньи значительно уступают, а обычные свиньи превосходят взрослого человека по живой массе. По массе сердца обычные свиньи более схожи с человеком. Мини-свиньи же имеют более мелкое сердце. По массе легких человек на много превосходит не только мини-свиней, но и обычных свиней. Размеры печени обычных свиней и человека практически одинаковые, а вот почки человека наоборот, имеют практически одинаковые

размеры с почками мини-свиней. По размерам селезенки мини-свиньи уступают человеку в 3 раза, а обычные свиньи несколько превосходят по этому показателю человека. Таким образом, человек по размерам внутренних органов и живой массе занимает как бы промежуточное положение.

3.1.2 Физиологические параметры свиней и человека

В таблице 2 приведены основные физиологические параметры свиней и человека.

Таблица 2

Основные сравнительные параметры крови человека и свиней

Показатели: человек мини-свиньи обычные свиньи

Физиологические показатели:

Артериальное давление, мм рт.ст. 120/80 155/45 155/45

Кол крови, % от массы 7,86 5,4 4,6-6,0

Частота пульса, уд/мин 70 60-80 60-80

Температура тела, С 36,6 39 38-39

Частота дыхательных движений 20 15-20 10-18

Биохимические показатели крови:

Гемоглобин, г/л 120-160 129-135 92-117

гематокрит, % 40-48 43,1 40

Эритроциты, млн. в мм3 4-5,1 5,9 5,9

Лейкоциты, тыс. в мм3 4-8,8 15-20 11,6

Лимфоциты, % 19-37 18,7-61,7 18,7-61,7

Моноциты, % 0,3-11 0,3-4,0 0,3-4,0

Нейтрофилы, % 48-78 32-78,7 32-78,7

Эозинофилы, % 0,5-5 0-6,0 0-6,0

Базофилы, % 0-1 0-1,3 0-1,3

Билирубин, мг/дл 0,5-1,2 0,2-1,1 0,2-1,1

Глюкоза, мг% 120-140 63-73 40-250

Креатинин, мг/дл 0,5-1,5 0,5-1,37 0,5-1,37

Тромбоциты, тыс. мм3 180-320 200-500 175-450

Из данных таблицы видно, что по физиологическим показателям мини-свиньи и обычные свиньи имели одинаковые значения артериального давления, этот показатель у них был выше, чем у человека. У человека такое давление характеризовалось бы как повышенное.

Количество крови в % от массы тела было больше у человека, чем у мини-свиней и обычных свиней. Можно сделать вывод о том, что при большей живой массе обычные свиньи имеют меньше крови, чем человек при меньшей массе тела. По частоте пульса свиньи имели практически одинаковые показатели с человеком. По температуре тела животные имели на 2,4 градуса большие показатели, чем человек. Частота дыхательных движений у мини-свиней и человека практически была одинаковой. У обычных свиней этот показатель был ниже.

Биохимические показатели крови: содержание в крови эритроцитов, лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов, эозинофилов, ба-зофилов, билирубина и креатинина у мини-свиней и обычных свиней было одинаковым. По содержанию эритроцитов и лимфоцитов мини-свиньи и обычные свиньи превосходили человека. Содержание в крови хмоноцитов у человека было больше, чем у мини-свиней и обычных свиней. Содержание в крови нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, билирубина и креатинина у обычных свиней и мини-свиней было практически одинаковым с аналогичными показателями у человека.

По уровню гемоглобина мини-свиньи были более схожи с человеком, чем обычные свиньи. Обычные свиньи имели более низкий уровень гемоглобина. То же самое можно отметить по показателям гематокрита.

Количество лимфоцитов в крови мини-свиньи превосходило данный показатель человека в 2 раза, а обычных свиней на 3,4-8,4 тыс. мм3.

По количеству тромбоцитов мини-свиньи имели большие показатели, чем человек и обычные свиньи. В тоже время обычные свиньи имели большее количество тромбоцитов, чем человек.

Уровень глюкозы в крови мини-свиней был в 2 раза меньше, чем в крови человека. У обычных свиней этот показатель имел очень широкие пределы, а среднее его значение соответствовало таковому у человека.

g

На основе проведенных исследований, выявленные сходства и различия по физиологическим и биологическим показателям мини-свиней, обычных свиней и человека, являются не значительными и не могут быть препятствием при ксенотрансплантации.

3.2 Тип крови мини-свиней и обычных свиней

С целью изучения генетической структуры по группам крови были проведены исследования обычных свиней и мини-свиней. Задачей данных исследований было сравнительное изучение типов крови обычных свиней и мини-свиней на примере светлогорской популяции.

Результаты проведенных исследований светлогорской популяции мини-свиней и обычных свиней по 10 локусам групп крови с использованием панели из 47 стандартных реагентов представлены в таблице 3.

Данные таблицы 3 показывают, что изучаемые типы крови различаются между собой лишь по частоте встречаемости определенных аллелей.

Так, аллель Е deg hjmnr у мини-свиней встречается чаще аналога у крупной белой на 15 %. Отличия наблюдаются и по частоте встречаемости аллелей Е aeg ils, Е bdf kmp так же в сторону увеличения.

В тоже время аллели Е bdf kmp и Е bdg kmnps, выявленные у мини-свиней встречаются в 2-3 раза реже, по сравнению с крупной белой. Очень резко отличается F- локус мини-свиней от обычных свиней, причём по всем аллелям. Аллель Fa у свиней крупной белой не встречается совсем , у мини-свиней же светлогорской популяции составляет 61%, и наоборот Fb- 100% у крупной белой, а мини-свиньи данный антиген выявляют гораздо меньше - 39%.

Так же значительные различия отмечены и по сложной полиморфной системе L, где частота основных аллелей La и Ьв отличается намного от сравниваемых аналогов у обычных свиней. Характерно, что по открытым генетическим системам А, Н, К, т.е. у которых выявляется помимо известных неизвестный антиген, концентрация аллелей примерно одного уровня.

Таблица 3

Частота встречаемости аллелей по группам крови у мини-свиней и обычных свиней

Локус Аллели Частота встречаемости аллеля Достоверность разницы

Мини-свиньи КБ Минисвиньи-КБ

п=156 п=160

А а 0,142 0,224

о 0,236 0,201

неизвестный 0,622 0,575

В а 1 1

Ь 0 0

И а 0,05 0,162 КБ***

Ь 0,95 0,838

Е 0,242 0,098

аеПп 0,009 0,003

deg Щтпг 0,377 0,224 М**

def ктИрэ 0,222 0,201 КБ***

bdf крт 0,01 0,201 КБ***

bdg ктпрз 0,14 0,273 КБ***

Б а 0,608 0

Ь 0,392 1

в а 0,151 0,578 КБ***

Ь 0,849 0,422 М*

Н а 0,4 0,273 М*

Ь 0,32 0,302

неизвестный 0,28 0,425 КБ***

К а 0,495 0,273 М***

Ь 0,231 0,302

неизвестный 0,274 0,425 КБ***

Ь а 0,608 0,097

Ь 0,392 0,903

м а 0,14 0,196 М***

а 0,03 0,05

неизвестный 0,83 0,754

Р<0,05; ** -Р<0,0] ; ***-Р<0,001

Таким образом, изучение генетической структуры по аллелям групп крови в популяции обычных свиней и мини-свиней показало, что по набору аллелей, а значит и антигенов эритроцитов, мини-свиньи не отличаются от обычных свиней, вместе с тем выявлены значительные различия по частоте встречаемости аллелей групп крови в системах Е, в, К, Ь, М.

3.3 Динамика генетической структуры мини-свиней

светлогорской популяции по группам крови в онтогенезе

Для изучения динамики генетической структуры мини-свиней светлогорской популяции был отобран племенной молодняк (35 гол.) в возрасте 2-х месяцев и аттестован по 26 эрит-роцитарным антигенам 10 систем групп крови. Через 2,5 года эти же животные были тестированы повторно по тем же системам групп крови, теми же антисыворотками-реагентами.

Результат аттестации был одинаковым, несмотря на возраст животных. Таким образом, группы крови благодаря кодоми-нантной форме наследования и неизменности в течение всей жизни представляют собой удобную генетическую модель для изучения иммуногенетического сходства крови свиней и человека и создания стад свиней наиболее подходящих для ксе-нотрансплантации.

3.4 Генетический статус свиней и человека

Целью исследований этого раздела было выявление сходств и различий по эритроцитарным антигенам между человеком и свиньями путем постановки перекрестных реакций с использованием методики определения групп крови свиней и методики определения групп крови человека.

3.4.1 Определение степени сходства крови свиней и человека

Объектом исследований послужили 25 проб крови полученых от светлогорских мини-свиней (лаборатория «биомедицины» НЦ БМТ РАМН) и 16 проб крови человека предоставленные нам вместе с диагностическими реагентами институтом гематологии РАН.

Для определения сходств и различий использовалась перекрестная постановка реакции агглютинации и гемолиза антигенов эритроцитов и антител свиней и человека. При проведении исследований были использованы методики определения групп крови человека и групп крови свиней.

Для сравнения были взяты наиболее иммуногенные системы групп крови:

- у человека: ABO (антигены: А, В); Резус (антигены: D, Cw,c(rh'),e(hr"),E(rh"),C(rh')); Kell (антигены: К, к (Челлано))и ■ MNss (антигены: М, N).

- у мини-свиней: А (антигены Аа,Ао); В (антигены: Ва, Bb); D (антигены: Da, Db); Е (антигены: Ea,Eb,Ed,Ee,Ef,Eg); F (антигены: Fa,Fb), G (антигенв: Ga,Gb) и L (антигены: La,Lb).

Иммунологическое сходство проводили по схеме 2.

Схема перекрестной реакции определения групп крови мини-свиней и человека.

Методика определения групп крови свиней

Эритроциты X Реагенты

свиней человека

X

Реагенты X Эритроциты

свиней человека

Методика определения групп крови человека

Эритроциты свиней

Реагенты свиней

X X

Реагенты человека

Эритроциты человека

Схема опыта включала выявление эритроцитарных антигенов в крови мини-свиней реагентами (антителами) человека и выявление эритроцитарных антигенов в крови человека реагентами (антителами) свиней. При этом каждый вариант реакций был выполнен по методике определения групп крови свиней и по методике определения групп крови человека. Реакции по выявлению эритроцитарных антигенов в крови мини-свиней реагентами свиней и выявление эритроцитарных антигенов в крови человека реагентами человека по соответствующим методикам были контрольными.

Результаты проведенных исследований представлены в таблицах 4, 5.

Таблица 4

Наличие положительной реакции при постановке реакции (эритроциты свиней х реагенты человека), %_

Эр-ты свиней х реагенты человека Реагенты групп крови человека

А В АВ К чел-лано Kell М N Cw c(rh) 1 e(hr' )' E(rhT D C(rh)'

Методика медиков 44 0 44 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Методика ВНИИ плем 64 12 12 0 0 0 0 0 0 8 0 0 0

- при постановке реакции (эритроциты свиней х человеческие реагенты) (табл. 4) по обеим методикам, результаты большей частью были отрицательными. При сравнении с контрольной реакцией (эритроциты свиней х реагенты свиней) по системе ABO была выявлена положительная реакция по антигену А, что в свою очередь совпадает с аналогичной реакцией в системе А у мини-свиней по антигену Аа. По методике ВНИИ плем в двух случаях была отмечена положительная реакция по антигену e(hr')' системы Rh это совпадает с аналогичной реакцией в системе Е у мини-свиней по антигену Еа и Ее. Остальные пробы по этим системам сходства не показали.

Таблица 5

Наличие положительной реакции при постановке реакции

(эритроциты человека х реагенты свиней), %

Эр-ты чел.х реагенты свиней Реагенты групп крови свиней

Ао Аа Ва ВЬ Da Db Еа Eb Ed Ее Eg Ef Va Fb Ga Gb La Lb

методика медиков 25 69 38 13 69 6 44 0 44 38 31 7 0 0 0 31 69 63

методика ВНИ И плем 100 10 0 10 0 56 10 0 6 10 0 56 75 56 81 9 81 94 94 94 10 0 81

Диаграмма наличие положительной реакции при постановке реакции (эритроциты человека х реагенты свиней),%

Ао Ва Da Еа Ее Ef Fb Gb Lb

- при постановке реакции (эритроциты человека х свиные реагенты) (табл. 5) по методике определения групп крови свиней практически во всех пробах реакция была положительная. Сравнение результатов с контрольной реакцией подтвердило полученные результаты. Наглядно таблица 5 представлена на диаграмме.

- при постановке реакции (эритроциты человека х свиные реагенты) по методике определения групп крови человека, получены довольно интересные результаты. Реакции проб были как положительные, так и отрицательные. При сравнении с контрольной реакцией было выявлено четкое сходство между антигеном А системы ABO у человека и антигеном Аа системы А у свиней, а так же между антигеном e(hr')' системы Rh у человека и антигенами Еа и Ее системы Е у мини-свиней. По остальным антигенам сходства не обнаружено. Интересно, что по всем антигенам системы Rh (за исключением e(hr')'), антигену К (система Kell) у человека и антигенам: ЕЬ (система Е), Fa и Fb (система F), Ga и Gb (система G) у свиней во всех пробах реакция была отрицательной.

На основании проведенных исследований, путем постановки перекрестных иммунных реакций антигенов и антител человека и свиней, установлена высокая степень сходства эритроцитарных систем ABO у человека и А у свиней, а так же системам Rh у человека и Е у свиней. По остальным исследованным системам человека (Kell и MNs) и системам свиней (B,D,F,G,L) иммунологического сходства не установлено.

Можно предположить, что постановке реакции (эритроциты свиней х реагенты человека) результат был отрицательным в связи с отсутствием на эритроцитах свиней антигенов схожих с человече-

сними по исследованным системам. Следует отметить, что при постановке реакции (эритроциты человека х реагенты свиней), если расписать генотип по номенклатуре принятой для обозначения групп крови свиней, генотип человека был представлен одним генотипом Ао/а, а при постановке реакции (эритроциты свиней х реагенты человека), если брать номенклатуру принятую для обозначения групп крови человека, то у свиней отсутствуют группы В(Ш) и AB(IV). Это говорит об отсутствии антигена В человека на эритроцитах мини-свиней. При этом следует учитывать, что система А у свиней остается открытой. На основании этого, с учетом совместимости групп крови по системе ABO можно предположить, что свиньи с генотипами А./., Аа/. и Ао/. могут быть совместимы с человеком обладающим А(И) группой или AB(IV) группой. Также можно предположить, что свиньи с генотипом А./, могут быть совместимы с 0(1) группой крови человека.

Известно, что при переливании крови у человека важную роль играет также система резус-фактор Rh. Также эта система влияет на иммунологический конфликт между матерью и плодом. При изучении патогенеза гемолитической болезни поросят никому из исследователей не удалось до сих пор установить, какой же эрит-роцитарный антиген, подобно Rh (D) - фактору у человека, несет основную ответственность за проявление этой болезни у поросят. В наших исследованиях при постановке реакции (эритроциты свиней х реагенты человека) выявлен антиген системы резус-фактор Rh e(hr')\ Остальные антигены системы резус-фактор Rh (Cw, c(rh)', E(rh')', D, C(rh)') не выявлены.

3.4.2 Выявление эритроцитарных антигенов во внутренних органах светлогорских мини-свиней

Проведен опыт по выявлению эритроцитарных антигенов во внутренних органах светлогорских мини-свиней.

Для выявления эритроцитарных антигенов во внутренних органах мини-свиней были взяты 7 образцов ткани сердечной мышцы и 7 образцов ткани почек мини-свиней (табл. 6,7). Для опыта были взяты реагенты наиболее известных систем групп крови. Каждый образец был обескровлен, измельчен и разбавлен физиологическим раствором. Пробирки с образцами были заморожены

и доставлены в лабораторию ВНИИ племенного дела. Далее образцы были разморожены и откручены 3 раза на центрифуге при 3000 об/с. Полученный материал (надосадочная жидкость) был окрашен и изучен при помощи специфических сывороток реагентов по методике определения групп крови свиней.

По системе А отмечается наличие эритроцитарного антигена Аа как на сердечной, так и на почечной ткани, Ао только на почечной. Присутствие антигена Аа на внутренних органах, возможно, является одной из причин отторжения ткани при ксе-нотрансплантации.

Таблица 6

Выявление эритроцитарных антигенов на сердечной мышце

по методике ВНИИ плем

X» пробы Реагенты свиней

(сердце) Ао Аа Ва ВЬ Оа оъ Еа Ей ЕЬ Ее ЕЙ ЕГ Жа ЕЬ ва О) Ьа ьь

1 _ _ + _ + _ + ±

2 _ + + _ + _ ± _ _ + _

3 _ + + + + + _ + _ + + _

4 _ _ + _ + + +

5 + + + ± +

6 + + _ + + + + + _

7 - - ± - + + + + - - - -

Таблица 7

Выявление эритроцитарных антигенов на почечной ткани по _методике ВНИИ плем_

№ пробы Реагенты свиней

(почки) Ао Аа Ва ВЬ Ба Ш) Еа Е<1 ЕЬ Ее ЕГ Еа ЕЬ вь Ьа ЬЬ

1 _ + + _ + + + + + _ + _ + + _ +

2 _ + + _ + + + + _ „ + + + + _ _

3 + + + „ + + + + + + _ _ + + + +

4 _ _ + ± + + _ + + + _ + ± _ +

5 + + + + + ± + + +

6 + + _ +

7 - - ± - - - + + - - - - - + - + - -

Антиген «Ва» выявлен на всех образцах, «Вв» - присутствовал только в одном случае, при том в сердечной и почечной ткани. Интересно, что по E-системе антигены е, g, f не были обнаружены ни в одном из исследуемых образцов, так же как и по L-системе не было La.

По некоторым образцам реакции были не чёткими, но в тоже время нельзя было утверждать их отсутствие. Здесь нужно провести дальнейшее исследование.

В результате проведенных исследований по методике ВНИИ плем в ткани сердечной мышцы мини-свиней были выявлены антигены Аа, Ва, Da, Db, Еа, Fa, Fb, Ga и Gb. В ткани почек были выявлены антигены Аа, Bb, Ва, Da, Db, Еа, Eb, Ее, Eg, Ef, Fa, Fb, Ga и Gb. Из опыта видно, что сердечная мышца более свободна от антигенов групп крови нежели ткани почек. В литературных источниках нет данных о концентрации антигенов групп крови свиней на различных тканях, за исключением антигена Аа. Учитывая результаты полученные выше об отсутствие на эритроцитах мини-свиней антигенов схожих с человеческими, за исключением системы А у мини-свиней и систем ABO и резус-фактор Rh у человека. В дальнейших исследованиях следует обратить особое внимание на условия и причины концентрации антигена Аа в тканях внутренних органов мини-свиней.

Так же был проведен опыт по выявлению эритроцитарных антигенов человека во внутренних органах светлогорских мини-свиней с помощью реагентов для определения групп крови человека по методике медиков (табл. 8).

Таблица 8

Наличие эритроцитарных антигенов человека _во внутренних органах свиней_

№ пробы Се рдце Почки

Антиген А Антиген В Антиген А Антиген В

1 отсутствует отсутствует обнаружен отсутствует

2 отсутствует отсутствует обнаружен отсутствует

3 отсутствует отсутствует обнаружен обнаружен

4 отсутствует отсутствует обнаружен обнаружен

5 отсутствует отсутствует обнаружен отсутствует

6 отсутствует отсутствует отсутствует отсутствует

7 отсутствует отсутствует ± ±

В результате исследований по методике медиков установлено, что сердечная мышца практически свободна от антигенов. На почечной ткани антиген «А» был обнаружен четко у пяти образцов, антиген «В» выявлен у двух (3 и 4). Два образца почечной ткани (3 и 4) показали наличие обоих антигенов: и «А» и «В», один образец под № 6 полностью свободен от указанных антигенов, как в сердечной, так и в почечной ткани.

3.5 Методические подходы для создания стад свиней в целях ксенотрансплантации

Изучение возможности использования свиней в целях ксенотрансплантации основывалось на следующей рабочей гипотезе: сходство свиней и человека по многим биологическим и физиологическим показателям предопределяет реальную возможность пересадки органов от свиньи к человеку. Однако основным препятствием является иммунологическая несовместимость. Главным объектом при этом рассматривалась кровь, пронизывающая все ткани и клетки. Антигенный состав крови определяет иммунологический статус организма, в том числе и гистосовместимость. Естественно, что степень сходства типов крови будет отражать степень иммуносовместимости. В настоящей работе изучалась в данном аспекте красная кровь. Результаты исследований показали сходство антигенов наиболее иммуногенных систем свиней (А и Е системы) и человека (ABO и Rh системы). Исходя из этого основные методические подходы по созданию, методами селекции, стад свиней наиболее пригодных к ксенотрансплантации будут следующие:

1. Исходными объектами для селекции являются не мини-свиньи, а обычные свиньи, т.к. они наиболее подходят по интерь-ерным, биологическим и физиологическим параметрам к человеку.

2. Селекция свиней должна быть направлена на получение животных свободных от иммуногенных антигенов Аа, Еа и Ее. При этом по результатам исследований должны отбираться животные с соответствующими генотипами, а при подборе прово-

дится заказные спаривания с целью получения желательных генотипов.

3. Наиболее «подходящими» для целей ксенотрансплантации будут особи с повышенным уровнем гомозиготности и пониженным генетическим разнообразием по аллелям групп крови.

4. Мини-свиньи могут быть подходящим объектом для моделирования селекционного процесса при создании стад свиней в целях ксенотрансплантации.

ВЫВОДЫ

1. По большинству внутренних органов (сердце, почки, печень, селезенка) свиньи имеют схожие размеры с человеком. Наибольшее сходство выявлено по размерам почек, печени и сердца.

2. Установлена высокая степень сходства мини-свиней, обычных свиней и человека по физиологическим и биологическим показателям.

3. Мини-свиньи и обычные свиньи не различаются по набору аллелей и антигенов групп крови, различия наблюдаются лишь по частоте встречаемости.

4. Установлена высокая степень сходства эритроцитарных систем ABO у человека и АО у свиней и Rh у человека и Е у свиней. По остальным исследованным системам человека (Kell и MNs) и свиней (B,D,F,G,L) иммунологического сходства не установлено.

5. В ткани сердечной мышцы и почек мини-свиней выявлены изоантигены: Аа, Ва, Da, Db, Еа, Fa, Fb, Ga и Gb. В ткани почек кроме того были выявлены изоантигены Bb, ЕЬ, Ее, Eg и Ef. Таким образом, в почках выявлено большее количество антигенов, чем в ткани сердца. Что говорит о более высокой гомологии ткани почек свиньи и человека.

6. Реагентами групп крови человека в ткани почек свиней выявлен эритроцитарный антиген А системы ABO. В сердце антигены А и В не обнаружены.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. При разработке технологии ксенотрансплантации рекомендуем использовать в качестве объекта исследований обычных свиней, т.к. они наиболее подходят по интерьерным параметрам к человеку.

2. В целях снижения степени иммунологической несовместимости донора-реципиента при ксенотрансплантации использовать сходных по типу крови свиней и человека по системам А и ABO, Е и Rh соответственно.

3. Мини-свиней целесообразно использовать для моделирования селекционного процесса при создании стад свиней наиболее сходных по интерьерным и иммунологическим показателям с человеком.

Список работ опубликованных по теме диссертации:

1. Станкова Н.В. Типы крови человека и мини-свиней светлогорской популяции. /Станкова Н.В./ Вестник РАСХН. - 2008,-№6,-с. 81.

2. Чернова Н.В. Генотипы по группам крови светлогорских мини-свиней./ Капанадзе Г. Д., Чернова Н.В./- М.: Доклады ТСХА. . 2007. - Вып. 279, ч. 2. - с. 41-44.

3. Чернова Н.В. Способы многократного взятия крови у лабораторных мини-свиней./Капанадзе Г.Д., Чернова Н.В./ Доклады ТСХА,- 2007.- Вып. 279, ч. 2. - с. 146-149.

4. Чернова Н.В. Группы крови светлогорских мини-свиней.

/ Капанадзе Г.Д., Чернова Н.В., Ревякин А.О., Юшкова Л.Г./ Сборник научных трудов XIV международной научной конференции по свиноводству - «Современные проблемы интенсификации производства свинины». Ульяновск 2007. - с. 381-382.

5. Чернова Н.В., Светлогорские мини-свиньи /Капанадзе Г.Д., Ревякин А.О., Юшкова Л.Г./ Сборник научных трудов XIV международной научной конференции по свиноводству - «Современные проблемы интенсификации производства свинины». Ульяновск 2007. - с. 275-276.

Заказ № 2_Объем 1.0 п.л._Тираж 60 экз.

Типография ВНИИплем

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Станкова, Наталия Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава. 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Мировой генофонд мини-свиней и использование их в биомедицинских исследованиях.

1.2. Системы групп крови свиней и их использование в практике.

1.3. Генетические системы групп крови человека.

1.4. Состояние ксенотрансплантации на современном этапе.

Глава. 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Материал и методы исследований.

2.2. Методика определения групп крови свиней.

2.3. Методика определения групп крови человека.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХС ИССЛЕНДОВАНИЙ.

3.1. Биологические особенности светлогорских мини-свиней.

3.1.1. Экстерьер и конституция светлогорских мини-свиней.

3.1.2. Рост и развитие светлогорских мини-свиней.

3.1.3. Физиологические параметры организма мини-свиней.

3.1.4. Интерьерные показатели организма мини-свиней.

3.1.5. Степень сходства биологии свиньи и человека.

3.2. Иммуногенетическая характеристика светлогорских мини-свиней.

3.3. Динамика генетической структуры светлогорских мини-свиней по группам крови в онтогенезе.

3.4. Сравнение иммунологического статуса светлогорских мини-свиней и человека.

3.4.1. Схема лабораторных исследований.

3.4.2. Сходство и различия по генотипам групп крови между мини-свиньями и человеком.

3.4.3. Выявление эритроцитарных антигенов во внутренних органах мини-свиней.

3.5. Методологические подходы для создания стад свиней в целях ксенотрансплантации.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Иммунобиологический статус свиней и возможности использования их в целях ксенотрансплантации"

Одним из перспективных направлений трансплантологии специалисты считают ксенотрансплантацию, или межвидовую трансплантацию — трансплантация органов и тканей от животного другого биологического вида, чем человек. Ксенотрансплантация является актуальнейшей проблемой, и во многих странах мира сейчас изучаются возможности преодоления отторжения органов, возникающего из-за реакции иммунной системы. Даже при очень сильной иммуносупрессии организма реципиента ксенотрансплантат от животного не выживает в организме человека более нескольких минут в результате сверхострой реакции отторжения, сопровождающейся массивным гемолизом, агглютинацией эритроцитов и тромбоцитов и множественным тромбозом сосудов пересаженного ксенооргана. Наиболее иммунологически близкими человеку являются свиньи или высшие приматы.

Преимуществами свиньи, по сравнению с приматами, являются ее широкая распространенность, беспроблемное выращивание и содержание, сходство свиных органов с человеческими по размерам и физиологии. К тому же, изъятие свиных донорских органов, не вызывает возражений у защитников природы, поскольку свиней все равно выращивают на мясо. Свиньи схожи с человеком по строению, функциям и физиологии сердечнососудистой системы, пищеварения, строение зубов, почек, кожи, глаза, свиньи имеют сходный с человеком состав крови и цифры артериального давления, а так же существует значительное сходство между многими болезнями человека и свиньи. Для удобства проведения исследований в лабораторных условиях были выведены мини-свиньи, которые не отличаются от обычных свиней основными анатомо-морфологическими признаками. Они удобны при работе в условиях вивария ввиду своих маленьких размеров, быстрой смене поколений, неприхотливости в кормлении и содержании, и добром нраве. Мини-свиньи являются удобной моделью в исследованиях по фармакологии, иммунологии, токсикологии, дерматологии, стоматологии, радиобиологии, в исследованиях алкоголизма, ожирения и вирусных заболеваний.

Так первые опыты по использованию сердечных клапанов свиней для людей были отработаны на сибирских лабораторных мини-свиньях. Разведение этих животных сейчас осуществляется в специальных экспериментальных хозяйствах и интерес к ним растет. Свиные сердечные клапаны очень хорошо подошли человеку по совместимости и морфологии, что подтверждено многими ведущими кардиоцентрами у нас в стране и за рубежом.

Важную роль в развитии реакции отторжения, при пересадке органов от человека к человеку (аллотрансплантация - внутри одного биологического вида), играет совместимость по антигенам эритроцитов. Реципиент и донор должны иметь одинаковую группу крови (восемь из десяти людей умирают, потому что не находят вовремя донора с подходящей группой крови), т.е. необходимы идеальные условия для приживления органа. Это положение наиболее актуально при пересадке человеку органов животных. Работ по изучению совместимости по эритроцитарным антигенам свиней и человека практически нет. Это направление и стало темой наших исследований.

Цели и задачи исследований. Цель исследований заключалась в изучении иммунобиологического статуса свиней, степени его сходства с человеком и разработке методических подходов по созданию стад свиней в целях ксенотрансплантации.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследований:

- изучить биологические особенности свиней (физиологические параметры, интерьерные показатели)

- изучить степень биологического и физиологического сходства свиньи и человека

- определить генетический статус типов крови обычных и мини-свиней

- изучить динамику генетической структуры мини-свиней по группам крови в онтогенезе

- определить степень иммунологического сходства групп крови человека и свиней

- на основе результатов исследований разработать методические подходы по созданию стад свиней в целях ксенотрансплантации, на первоначальном этапе

Научная новизна работы состоит в том, что впервые в сравнительном аспекте исследованы интерьерные, физиологические и биохимические особенности мини-свиней, обычных свиней и человека. Проведены исследования по иммунологическому сходству свиной и человеческой крови, а так же исследования по выявлению эритроцитарных антигенов во внутренних органах мини-свиней.

Практическая значимость работы. Полученные результаты служат основой для разработки предложений по созданию стад свиней соответствующих требованиям ксенотрансплантации селекционными методами. Определены типы крови свиней, характеризующиеся наибольшей степенью сходства с типом крови человека. А так же выявлены эритроцитарные антигены во внутренних органах свиней.

Основные положения, выносимые на защиту:

- степень сходства и различия иммунологического статуса свиней и человека; методические подходы для создания стад свиней в целях ксенотрансплантации.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и одобрены:

- на ученом совете Всероссийского НИИ племенного дела (2008г);

- на межотдельских научных конференциях Всероссийского НИИ племенного дела (2007, 2008, 2009гг);

-.на ученом совете Научного центра биомедицинских технологий РАМН (2009г).

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликованы 5 научных статей, в том числе в ведущих рецензируемых журналах ВАК РФ - 1.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах, иллюстрирована 27 таблицами, 3 схемами. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, собственных исследований, выводов, предложений и списка использованной литературы, который включает 150 источников, в том числе 51 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных", Станкова, Наталия Владимировна

ВЫВОДЫ

1. По большинству внутренних органов (сердце, почки, печень, селезенка) свиньи имеют схожие размеры с человеком. Наибольшее сходство выявлено по размерам почек, печени и сердца.

2. Установлена высокая степень сходства мини-свиней, обычных свиней и человека по физиологическим и биологическим показателям.

3. Мини-свиньи и обычные свиньи не различаются по набору аллелей и антигенов групп крови, различия наблюдаются лишь по частоте встречаемости.

4. Установлена высокая степень сходства эритроцитарных систем АВО у человека и А у свиней и Rh у человека и Е у свиней. По остальным исследованным системам человека (Kell и MNs) и свиней (B,D,F,G,L) иммунологического сходства не установлено.

5. В ткани сердечной мышцы и почек мини-свиней выявлены изоантигены: Аа, Ва, Da, Db, Еа, Fa, Fb, Ga и Gb. В ткани почек кроме того были выявлены изоантигены Bb, ЕЬ, Ее, Eg и Ef. Таким образом, в почках выявлено большее количество антигенов, чем в ткани сердца. Что говорит о более высокой гомологии ткани почек свиньи и человека.

6. Реагентами групп крови человека в ткани почек свиней выявлен эритроцитарный антиген А системы АВО. В сердце антигены А и В не обнаружены.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При разработке технологии ксенотрансплантации рекомендуем использовать в качестве объекта исследований обычных свиней, т.к. они наиболее подходят по интерьерным параметрам к человеку.

2. В целях снижения степени иммунологической несовместимости донора-реципиента при ксенотрансплантации использовать сходных по типу крови свиней и человека по системам А и АВО, Е и Rh соответственно.

3. Мини-свиней целесообразно использовать для моделирования селекционного процесса при создании стад свиней наиболее сходных по интерьерным и иммунологическим показателям с человеком.

126

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Станкова, Наталия Владимировна, п. Лесные Поляны Московской обл.

1. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика, тт. 1-3, М., 1988. с.97-99.

2. Бажов Г.М., Комлацкий В.И. Биотехнология интенсивного свиноводства. М.: Росагропромиздат, 1989. - С. 206-221.

3. Бахирева, Л.А. Селекционные и биотехнические приёмы и методы повышения продуктивности свиней: автореф. дис. . д-ра с.-х. наук / Бахирева Л.А. Персиановка, 1999. - с.52-87.

4. Башлай А. Г. кмн, Донсков С. И. дмн. ИММУ НО СЕРОЛОГИЯ (Нормативные документы) ТОО "Гемостандарт", 1998г. ООО Союзинформбиология "Калина" ВИНИТИ РАН, 1998г. ЛР № 021074 — 02/09.96 г.

5. Бекенев, В.А. Селекция свиней / В.А. Бекенев. Новосибирск: РАСХН, Сиб. отделение, - 1997. - с. 183-189.

6. Болотских Л.А. Опыт получения и выращивания безантигенных миниатюрных поросят для медико-биологических исследований// Вестник АМН СССР, 1981, N5, с.42-43.

7. Борзяк Э.И., Бочаров В.Я., Сапин М.Р. и др. Анатомия человека. В 2-х томах. Т. 2.; Под ред. М.Р. Сапмина. 4-е изд., стереотипное. - М.: Медицина, 1997. - с. 560-568.: ил. - ISBN 5-225-4444-1.

8. Борзяк Э.И., Волкова Л.И., Добровольская Е.А. и др.; Анатомия человека: В двух томах. Т. 1/ Под ред. М.Р. Сапина. — 4-е изд., стереотипное. М.: Медицина, 1997. - с. 544-561.: ил.

9. Быков В.Л. Цитология и общая гистология (функциональная морфология клеток и тканей человека). СПб.: СОТИС, 2002 с.65-72.

10. Воробьев Э.Г., Трубаев В.М., Вепренцев А.А., Наумов А.П. Методические указания по определению групп крови у сельскохозяйственных животных. ВНИИплем, 141212. п/о Лесные поляны, Пушкинский р-н, Московская обл., 1993. с. 3 -11.

11. Гаврилов O.K. Пособие по трансфузиологии, с. 113, М., 1980;

12. Галактионов В. Г. Иммунология: Учебник. М.: Нива России, 2000. -488 е.: ил. - С. 332-336.

13. Георгиевский В.И. Физиология сельскохозяйственных животных. -М.: Агропромиздат, 1990. с.510-556.

14. Герасименко, В.В. Иммуногенетическая структура стада свиней украинской степной белой породы по частоте комплексных генотипов в связи с некоторыми параметрами продуктивности / В.В. Герасименко // Цитология и генетика, 2002. Т.36. - № 2. - С. 44-52

15. Горелов И. Г. Иммуногенетическое изучение полиморфизма по группам крови у свиней. Новосибирск, 1975. - 145 с.

16. Горелов И. Г. Миниатюрные свиньи минисибс как объект получения реагентов групп крови. Научно-техн. бюл. - ВАСХНИЛ. Сибирское отделдение, 1985 Т. 12, с. 42-47.

17. Горелов И. Г., Савина М. А. // Генетика. 1997. - Т. 33, № 10. - С. 1441 - 1443.

18. Горелов И. Г., Савина М. А., Новиков А. А. Свиньи как объект для медико-биологических исследований. // Аграрная Россия. 2002. - №5. - С. 21-26.

19. Горелов И.Г., Ермолаев В.И. Иммуногенетический мониторинг лабораторных мини-свиней светлогорской популяции. Лабораторные животные для медико-биологических и биотехнологических исследований.

20. Академия медицинских наук СССР. Тезисы конференции. Москва, 20 22 ноября 1990. с. 10-13.

21. Горелов, И.Г. Группы крови и биохимический полиморфизм у диких кабанов сибирского подвида / И.Г. Горелов, Г.В. Орлова // Тезисы докладов VI съезда украинского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова. -М., 1987. Т.З. - С. 57-58.

22. Гостищев В.К. Общая хирургия. Издание третье, перервботанное и дополненное. Гэотар-мед. Москва, 2002. С. 145-176.

23. Даренская Н.Г., Ушаков И.Б., Иванов И.В. и др. Экстраполяция экспериментальных данных на человека: принципы, подходы, обоснование методов и их использование в физиологии и радиобиологии (Руководство) — М.- Воронеж: ИСТОКИ, 2004. С. 10-35.

24. Жуков Б. Реконструкция сердца. Журнал «Вокруг света», январь 2007г. с. 196-204.

25. Жукова О.В., Шереметьева В.А., Тихомирова Е.В. Генофонд и геногеография народонаселения / Под ред. Ю. Г. Рычкова: Том 1. Генофонд населения России и сопредельных стран. СПб.: Наука, 2000. с. 611-612.

26. Жукова О.В., Шереметьева В.А., Тихомирова Е.В. Генофонд и геногеография народонаселения http://pc60 ls.vigg.ru/Atlas/Cl2l .htm

27. Захаров И. А. Успехи современной генетики. Вып. 19. М.: Наука, 1994. с. 133-200.

28. Калашникова J1.A., Рыжова Н.В., Гупалов Н.В. Генная диагностика стрессчувствительности свиней //тезисы докладов 2-ой Международной конференции «Молекулярно-генетические маркеры животных». Киев, 1996. -с.10.

29. Капанадзе Г.Д., Ашуев Ж.А. Светлогорская популяция мини-свиней. Научный журнал «Биомедицина» ГУ НЦ БМТ РАМН, №6 2007. С. 71-80.

30. Капанадзе Г. Д., Чернова Н.В. Генотипы по группам крови светлогорских мини-свиней. Доклады ТСХА. Вып.279, ч. 2. В 2-х ч. М.: ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА им. К.А. Тимирязева, 2007. - 520 с.

31. Каркищенко В.Н., Мартынов В.В. фармакология, генополиморфизм и клонирование генов NAT у человека и животных-моделей. Научный журнал «Биомедицина» ГУ НЦ БМТ РАМН, №4 2006. С. 85-87.

32. Каркищенко Н. Н. Основы биомоделирования. М.: Межакадемическое издательство "ВПК", 2004. - 704 с.

33. Каркищенко Н.Н. Классические и альтернативные модели в лекарственной токсикологии. Биомедицина №4, 2006г. с.6

34. Кейзер С.А. Количественная и качественная характеристика биологического эффекта при хроническом облучении животных ионизирующим излучением. /В кн.: Тр.8-го Всесоюзного съезда рентгенологов и радиологов. М.: Медицина, 1996. С. 373-376.

35. Кейзер С.А., Иванов К.В., Завалишина О.А. Изменение митотической активности эпителиальных клеток роговицы у экспериментальных животных при хроническом у-облучении в малых дозах. //Радиобиология. 1967. - Т.7, вып.6. - С. 857-859.

36. Козловский В., Ю. Лебедев, В. Медведев и др.. Племенное дело в свиноводстве М.: Колос. - 1982. - С.78-132.

37. Косяков П. Н. Иммунология изоантигенов и изоантнтел, М., 1965 с.29-52.

38. Котиков Е.А. Антигенные системы человека и гомеостаз, М., 1982;

39. Коштоянц Х.С. Основы сравнительной физиологии. М.: Наука. — 1957.-Т.2.-321 с.

40. Красовский Г.Н., Егорова Н.А. Экспериментальные модели в генетических исследованиях. /В сб.: Гигиеническая наука и практика на рубеже XXI века. Материалы IX Всероссийского съезда гигиенистов и санитарных врачей. T.I. М.: 2001. - С. 476-479.

41. Кукес В.Г. Метаболизм лекарственных средств: клинико-фармакологические аспекты. М.,2004. С. 29-43.

42. Лесли, Д.Ф. Генетические основы селекции сельскохозяйственных животных / Д.Ф. Лесли. М.: Колос, 1982. - 392 с.

43. Марданова Г.В. Ультраструктурные особенности некоторых внутренних органов миниатюрных поросят в норме и при антенатальном воздействии этанола// Сб. трудов научн. Конфер. «Вопросы экспериментальной и клинической медицины», Куйбышев, 1990, с.18-22.

44. Марданова Г.В., Осипов В.В., Кострюков Г.Н. Ультраструктурные особенности миокарда новорожденных мини-свиней при длительной алкоголизации родительской пары// Бюлл. экспер. би- ол- и медицины, 1990, N4, с.398-400.

45. Марданова Г. В. Миниатюрная свинья в экспериментальной биологии и медицине. Москва, 2004. 90 с.

46. Марданова Г.В. Использование миниатюрной свиньи в экспериментальной биологии и медицине. Ламинология №1, 1993. с. 17 — 21.

47. Мацеевский, Я. Генетика и методы разведения животных / Я. Мацеевский, Ю. Земба; под ред. Платонова Е.С. М.: Высшая школа, 1988. -448 с.

48. Машурова A.M. «Генетические маркеры в селекции животных». М., Наука, 1980. с. 29 -43.

49. Мур Ф. История пересадки органов. Под ред. д-ра мед. наук проф. Р. В. Петрова, 1973. С. 220-223.

50. Новгородов, А.А. Влияние уровня гомозиготности и генотипов групп крови на продуктивность свиней породы ландрас / А.А. Новгородов // Свиноводство. 2004. - №5. - С. 11-12.

51. Новиков, А.А. Использование генетических маркеров для контроля направленности селекционных процессов / А.А. Новиков и др. // Тез. докл. 3 межд. конференции « Молекулярно-генетические маркеры животных». -Киев,1999. С.109.

52. Познахирев П. Р. Мини-свиньи как объект биомедицинских экспериментов. /Сб. науч. тр.: Основные принципы организации биомедицинских экспериментов на животных. М.: АМН СССР, 1979. -С.32-36.

53. Полищук Н. Трансплантология: вчера, сегодня, завтра. Трансплантация органов и тканей//Вестник Российской АМН, 1999, № 9, с. 46-47.

54. Понд У. Дж., Хауп Т.К.А. Биология свиньи// М., Колос, 1983, с.334.

55. Свечин К. Б., Индивидуальное развитие сельскохозяйственных животных, К., 1976; Костин А. П., Мещеряков Ф. А., Сысоев А. А., Физиология сельскохозяйственных животных, М., 1983.

56. Селье Г. На уровне целого организма. М.: Наука, 1972. - 122с.

57. Селье Г. Стресс без дистресса: Пер. с англ./ Общ. ред. Е.М.Крепсаю -2-е изд. М.: Прогресс, 1982. - 124с.

58. Сердюк Г.Н. Иммуногенетика свиней: теория и практика. Санкт-Петербург: Лекс-Стар, 2002. 390 с.

59. Сердюк, Г.Н. Иммуногенетический контроль в селекционной практике / Г.Н. Сердюк и др. // Зоотехния. № 10.- 2000.- С. 8.

60. Соколов, Н.В. Теория и практика селекции и использования свиней мясного типа продуктивности: автореф. дисс. докт. с.-х. наук./ Соколов Н.В. Краснодар, 2001. - 44с.

61. Станкова Н.В. Типы крови человека и мини-свиней светлогорской популяции. Вестник РАСХН. № 6.- 2008.-С. 81.

62. Сухова, Н.О. Связь групп крови с откормочными и мясными качествами свиней / Н.О. Сухова, В.А Бекенев, В.А. Коломников и др. // докл. ВАСХНИЛ, 1989. №2. - С. 24-26.

63. Тарасов С.А. Стрессовый синдром у свиней // Сельское хозяйство за рубежом. 1982. - №4. - С. 46-49.

64. Тимофеев, JI.B. Объем и качество спермопродукции хряков разных пород и линий в зависимости от иммуногенотипов по системам групп крови / J1.B. Тимофеев, М.А. Шкатов, Н.М. Шкатова // Сельскохозяйственная биология. №4. - 2004. - С.73-76.

65. Тихонов В. Н. Генетика мини-свиней. Новосибирск: ИциГ АН СССР, 1990. - 156 с.

66. Тихонов В. Н. Генетические системы групп крови животных, Новосиб., 1966. с.73-96.

67. Тихонов В. Н. Иммуногенетика и биохимический полиморфизм домашних и диких свиней/Тихонов В. Н. Новосибирск: Наука. Сиб. отделение, 1991. - 304 с.

68. Тихонов В. Н. Использование групп крови при селекции животных. Издательство «Колос». Москва, 1967. 113-191 с.

69. Тихонов В. Н., Ратиани Д. П. Выведение лабораторных миниатюрных свиней для медико-биологических исследований. /Сб. науч. тр.: Вопросы теоретической и прикладной генетики. Новосибирск: Наука, 1975. - С. 93-97.

70. Тихонов В.Н. Формирование генофоеда миниатюрных сибирских свиней «МИНИСИБС» и их использование в медико-генетических исследованиях. http://www.karapuz.org/?id=a29art

71. Тихонов В.Н., Никитин С.В. Картирование локуса системы G групп крови на идентифицированной хромосоме домашних и диких свиней. // Докл. АН СССР. 1983. - т.272. -№1. - С. 214-216.

72. Тихонов, В.И. Иммуногенетика и биохимический полиморфизм домашних и диких свиней. / В.Н. Тихонов. Новосибирск, «Наука», 1991.-С. 51-56.

73. Тихонов, В.Н. Связь системы L групп крови с многоплодием и жизнеспособностью свиней / В.Н. Тихонов, С.В. Никитин // Разведение с.-х. животных в Сибири, Новосибирск, 1984. С. 41-45.

74. Трошенкова JI.В. Возможность использования групп крови для определения стрессчувствительности свиней. // Тр. Бел.НИИКСа. — Зоотехническая наука Белоруссии. 1986. — т.27 - С. 8-12.

75. Устинов Д.А. Стресс-факторы в промышленном свиноводстве. М.: Россельхозиздат, 1976.— 166с.

76. Федоров В. И. Возрастная физиология животных, под ред. К. Б. Свечина и А. В. Квасницкого, М., 1967; Рост, развитие и продуктивность животных, М., 1973.

77. Филатов А. Н Руководство по применению крови и кровезаменителей, 1965. с.210.

78. Фогель Ф., Мотульски А. Генетика человека http://www.ki-ugosvet.ru/articles/65/1006528/1006528a3.htm

79. Фогель Ф., Мотульски А. Генетика человека, тт. 1-3, М., 1990

80. Чемоданов, С. В. Изменение иммуногенетической структуры у свиней в результате селекции по хозяйственно-полезным признакам / С. В. Чемоданов // Сб. науч. тр. / Кубанский СХИ. 1989. - В.300 - С. 36-42.

81. Шарго М. И. Трансплантационный иммунитет. К., «Наукова думка», 1978. 208с.-С. 3-5.

82. Эфроимсон В. П., Введение в медицинскую генетику, 2 изд., М., 1968. с. 76-112.

83. Эфроимсон, В.П. Иммуногенетика / В.П. Эфроимсон // М.: Медицина, 1971.-333с.

84. Agarval О.Р., Arora R.B. Blood lipid levels in pigs and their possible role in development of aortic atherosclerosis// Indian J. Exp. Biol., 1973, N11, p.343.

85. Andersen E., Jensen P., Jonsson P., Staun H. Malignant hyperthermia syndrome (MHS) in pigs. // Z. Tierz.ucht. und Zuchtungbiol. 1980. - N. - P. 210-216.

86. Anderson D.B., Kaufmann R.G. Ctllular and enzymatic changes inh porcine adipose tissue during growth// J.Lipid Res., 1973, 14, p. 160.

87. Archibald A.L., Imlah P. The halotane sensitivity locus and its relationships. // Anim. Blood Groups and Biochem. Genetics. 16. 1985. - Р/ 253 -263.

88. Arrias P.J., Aller R.M.A., Estebanez S.J. et al. Alteraciones bioqumicas peroperatorias an el transplante ortotopico de Rigato en cerdo// Rev. esp. enferm. Apar. Digest, 1985, 68, N1, p. 1-9.

89. Avery J.K. New concepts concerning the development of the teeth of domestic pigand man// Thesis Univ. of Rochester, Rochester N.Y., 1952, p.324.

90. Barnes R.H., Moore A.U., Pond W.G. Behaviorale abnormalities in young adult pigs coused by malnutrition inerlylife// J. Nutr., 1970, 100, p.49.

91. Berge E., Westhues M., Siller W.G. et al. Veterinary operative surgery// Copenhagen, Medical Book Co, 1966.

92. Boogerd W., Boudewyn P.A.C. A simple method for obtaining cerebrospinal fluid from a pig model of Herpes encephalitis// Lab. Anim. Sci., 1986,36, N4, p.386-388.

93. Buch D.L., Jump E.B., Weaver M.E. Orthodontic tooth movement in miniature swine// L.A.D.R. 43rd General Meeting Abs., 1965, p.80.

94. Carlyle J.R., The use of swine in brain interstitial radiation studies// Lab. Anim. Sci., 1986,36, N4, p.381-385.

95. Chaput R.L., Wise D. Miniature pig incapacitation and performance decrement after mixed gamma-neutron irradiation// Armed Forces, Radiobiol. Res. Inst., SR69-12, Bethesda, Md., 1969, p.24.

96. Dienhart G.B., Tubbleson M., Hicklin K.W. et al. Plasma lactic acid and pyruvic acid concentrations following intragastric infusion of ethanol in adult miniature swine (sus scrofa)// Intemat. J. Biohem., 1975, N6 p.211.

97. Eisele G.R., Bernard S.R., Nestor C.W. Gastrointestinal absorbtion of Americium-241 by orally exposed swine: comparison of experimental results with prediction of metabolic models// Radiat. Res., 1987, 112, p.62-73.

98. Ekman L. Distribution and excretion of radiocesium in goats, pig and hens// Acta Vet. Scand., 1961, N2, suppl.4, p. 15.

99. Frank E.R. Veterinary surgery// Minneapolis, Burgess Publishing Co., 1964.

100. George R.E., Chaput R.L., Verrelli D.M. et al. The relative effectiveness offission neutrons for miniature pig performance decrement// Radiat. Res., 1971, 48, p.332.

101. Glonert G.A., Mott J., Lee J. Aetiology of malignant hipertermia // Brit. J. Anaesth.-60.-1988.-P. 253-267.

102. Gomes W.R., Herchler R.C., Erb R.E. Progesterone levels in ovarian venous effluent of the non-pregnant sows// J.Anim. Sci., 1965, 24, p.723.

103. Harbitz I., Chowdhay B. Assignment of the porcine calcium release channel gene. // Genomics. 8. - 1990. P, 243-248.

104. Hatfield P.J., Cameron J.S., Cadenhead A. Renal biopsy in the pig// Res. Vet. Sci., 1975, 19, p.88.

105. Jonson A.C. Occurrence of men-enkephalin, met-enlcefalin-Arg6 -Phe7 and metenkephalin-Arg6 -Gly7 -Leu8 in gastrin cells of hod antral mucosa// Cell and Tissue Res., 1985, 240, N2, p.361-365.

106. Jump E.B., Weaver M.E. The miniature pig in dental research// In: Swine in biomedical research// eds. L.K. Bustad, R.O. McClellan, M.P. Burns, Richland, Wash. Pasific North-west Lab., 1966, p. 543-557.

107. Kerrigan C.L., Zelt G., Thomson J.G. et al. The pig as an experimental animal in plastic surgery for the study of skin flaps, myocutaneus flaps and fasciocutoneus flaps// Lab., Anim. Sci., 1986, 36, N4, p.408-412.

108. Koukai M.I., Trebichavsky I., Smolova M. et al. Pig as a model for Ruman viral diseases// Z. Versuchsterk, 1987, 30, N1-2, p.53.

109. Lidzke L.F., Berg R. Quantitativ-morphologische unter- suchungen am herzen das miniaturschweines MINI-LEWE// Arch., Exper. Vet. Med., Leipzig, 1977, 4, N8, p.547-556.

110. Lloyd W.E., Buck W.B. Technique for semipermanent cannulation of ureters in bovine, ovine, porcine and canine species// Am. J. Vet. Res., 1971, 32, p.817.

111. Lohse W., Winkler H., Nerlings J. Zur vermindlerung der transplantatschadigung bei lebertansplantation// Z. Klin. Med., 1986, 41, N7, p.518-520.

112. Lygidakis N.J. Segmental auxiliare liver transplantation: a new approach to an old problem// J. Surg. Res., 1985, 38, N3, p.246-251.

113. Marino I.R., Dehuca G. Orthotopic liver transplantation in pigs. An evaluation of different methods of avoiding the revascularization syndrome// Transplantation, 1985, 40, N5, p.494-498.

114. Mersmann H.J., Phinneg G., Brown L.Y. et al. Factors influencing the lipolytic respons in swine (sus domesticus) adipose tissue// Gen. Pharmac., 1975, 6, p.193.

115. Millikan L.W., Molon J.L., Hook R.R. Melanoma in Sinclair swine: a new animal model// J. Invest. Dermatol., 1974, 92, p.20.

116. Montagna W., Yun J.S. The skin of the domestic pig// J. Internat. Coll. Surg., 1964, 43, p.l 1.

117. Mullen Y., Yoneda K., Fujiva H.et al. Survival of cultured fetal pancreas transplants in miniature pigs// Transplantant. Proc., 1986, 17, N1, Book 1, p.417-419.

118. Pescovitz M.D., Thistlethwaite J.R., Sharp T. et al. Class II majorhistocompatibilitycomplex-matched renal allografts in swine: summary of currents and continuing stadies// Transplant. Proc., 1985, 17, N1, Book 1, p.686-688.

119. Pond W.G., Snyder W., Walker E.F. et al. Comparative utilization of casein, fish protein concentrate and isolated soybean in liquid diets for growth on baby pigs//J. Anim. Sci., 1971, 33, p.587.

120. Prichard Th.J., Madara J.L., Tapper D.W. et al. Failure of cyclosporine to prevent small bovel allograft rejection in pigs// J. Surg. Res., 1986, 38, N6, p.553-558.

121. Rasmussen Ben. A., Christian L.L. H- blood tepes in pigs as predictors of

122. Saks P., Bendix Kn., Lunng N.I. et al. Autologons splenic implantation in pigs. A comparison of two methods// Acta chir. Scand., 1985, 151, N5, p.409-411.

123. Sasaki Nobuo, Yoneda Kumiko, Bigger Ch. Et al. Fetal pancreas transplantation in miniature swine. I. Developmental characteristics of fetal pig pancreas// Transplantation, 1984, 38, N4, p.335-340.

124. Schmidt W., Bocher R., Wolff W. et al. Morphologisch strukturelle differenzierung denaturierter orthotoper osteoimplantate in reaction mit dem lagerknochen// Wiss.Z. Friedrich-Schiller-Univ., Jena, Naturviss. R., 1986, 35, N3, p.340-341.

125. Simenovic Ch.J., Dhall D.P., Wilson J.D. et al. A comparative stady of transplant sites for endocrine tissue transplantation in the pig// Austral. J. Exp. Biol. And Med. Sci., 1986, 64, N1, p.37-41.

126. Still N.C., Frobish L.T., Keeney M. Lipogenesis andcellularity of adipose tissue from genetically lean and olese swine// J. Anim. Sci., 1974, 39, p.712.

127. Swindle M.M., Horneffer P.J., Gardner T.J. et al. Anatomic and anesthetic considerations in experimental cardiopulmonary surgery in swine// Lab. Anim. Sci., 1986,36, N4, p.357-361.

128. Vogeli P., Gerwig C., Schneebeli H. The A-O and Y blood group system and halotane sensitivity of two divergent lines of landrace pigs using index selection procedures. // Livestock Product. Se. 1983. - Vol. 10, N 2. - P. 159169.

129. White F.C., Roth D.M., Bloor C.M. The pig as a model for myocardial ischemia and exercise// Lab. Anim. Sci., 1986, 36, N4, p.351-356.

130. Wingate M.B., Wingate L. Experimental ileotubal anastomosis in the sow//Am. J. Obstet. Gynecol., 1969, 105, p.176.

131. Wise M.H., Gordon C., Jonson R.W.G. Intraportal autotransplantation of cryopreserved porcine islets of langerhans// Criobiol., 1985, 22, N4, p.359-366

132. Wood J.D. Fat mobilization in large white pigs// Proc. Nutr. Soc., ser. A., 1974, 33, p.61.

133. Woodle E.S., Hunter G.C., Eisele P. et al. Ortotopic porcine liver transplantation. Operative technique// J. Sung. Res., 1985, 39, N6, p.483-488.