Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунобиологические свойства полиреактивно трансформированных иммуноглобулинов

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммунобиологические свойства полиреактивно трансформированных иммуноглобулинов"

На правах рукописи

Химии Наталья Владимировна

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОЛИРЕАКТИВНО ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О АРГ

т

0055614»°

Пущино - 2015

005561488

Работа выполнена в отделе экспериментальной и клинической иммунологии Центральной научно-исследовательской лаборатории Медицинской академии

имени С.И. Георгиевского Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского»

Научные руководители: Кубышкин Анатолий Владимирович

доктор медицинский наук, профессор

Гордиенко Андрей Иванович кандидат биологических наук

Официальные оппоненты: Винокуров Максим Григорьевич

доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки РАН, заведующий лабораторией микроспектрального анализа клеток и клеточных систем

Белослудцев Константин Николаевич кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, ведущий научный сотрудник лаборатории митохондриального транспорта

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов имени К.Г. Скрябина РАН

Защита диссертации состоится « 12 » ноября 2015 года в 15 ч. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 002.038.01 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биофизики клетки РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Пущинского научного центра РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан августа 2015 года. Ученый секретарь диссертационного совета, /

кандидат биологических наук Смолихина Татьяна Ивановна

/ )

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. К настоящему времени установлена ведущая роль антитело-зависимых иммунных механизмов в защите организма человека от целого ряда инфекционных заболеваний бактериальной природы (Davies В. et al., 2011; Lopez-Collazo Е. et al., 2013; Esteban E. et al., 2013; Morris M.C. et al., 2015). В структуре возбудителей этих болезней важное место занимают условно-патогенные грамотрицательные энтеробактерии (Anwar M.A. et al., 2014; Putker F. et al., 2015). Ведущим фактором патогенности этих микроорганизмов является липополисахарид (ЛПС, эндотоксин), который обладает разнонаправленной биологической активностью и относится к числу наиболее мощных индукторов воспаления (Mohammadi Z., 2011; Morris M.C. et al., 2012; Zhang G. et al., 2013; Anwar M.A. et al., 2014; Rhee S.H., 2014; Schedlowski M. et al, 2014; Wyns H. et al., 2015). У больных с хирургической абдоминальной патологией ЛПС играет важную роль в развитии местных и системных воспалительных реакций, проявляющихся в виде нагноения раны, послеоперационной пневмонии, перитонита, сепсиса, полиорганной недостаточности (Мавзютов А.Р. и др., 2011; Дибиров М.Д. и др., 2012; Kohno Y. et al, 2013). При этом основной причиной попадания ЛПС в организм считается нарушение барьерной функции кишечника и усиление бактериальной транслокации (Sperandeo P. et al., 2009; Whitfield С. et al., 2014; Sang H.R., 2014; Putker F. et al., 2015). Попадая в кровь, ЛПС при участии липополисахарид-связывающего белка (LBP) взаимодействует с рецепторными мембранными белками клеток-мишеней (CD14, MD2 и TLR-4) и формирует с ними гетеродимерный рецепторный комплекс, обеспечивающий транедукцию сигнала. Обусловленная этим сигналом активация клеток-мишеней сопровождается синтезом провоспалительных цитокинов (TNF-a, IL-ip и др.), а также целого ряда биоактивных медиаторов небелковой природы, включая активные формы кислорода (АФК) (Mussap M et al., 2011; Scior T. et al., 2013; Bohannon J.K. et al., 2013; Park B.S. et al., 2013; Liaunardy-Jopeace A. et al., 2014; Sender V. et al., 2014; Plociennikowska A. et al., 2015). По данным литературы, в очагах воспаления in vivo АФК могут воздействовать на нативные иммуноглобулины класса G, вызывая значительные изменения их свойств. Одним из результатов такого воздействия является полиреактивная трансформация иммуноглобулинов, под которой понимается увеличение их способности к связыванию с самыми различными антигенами (Бобровник С. А., 1999). В системе in vitro полиреактивная трансформация иммуноглобулинов происходит в присутствии высоких концентрация хаотропных реагентов, к которым, в частности, относится тиоцианат калия (Бобровник С.А., 2004; Bouvet J.P. et al., 2001).

Взаимодействие полиреактивно трансформированных иммуноглобулинов с различными модельными белками на сегодняшний день изучено достаточно хорошо (Бобровник С.А., 2002; Bouvet J.P. et al., 1998). Исследования, характеризующие взаимодействия полиреактивно трансформированных иммуноглобулинов с ЛПС различных грамотрицательных энтеробактерий, до настоящего времени не проводились. Между тем оценка потенциальной роли

таких антител в нейтрализации биологической активности и клиренсе энтеробактериальных ЛПС представляет значительный интерес.

Цель_работы: исследовать связывание полиреактивно

трансформированных иммуноглобулинов (ПРИГ), полученных в системе in vitro, с ЛПС некоторых видов грамотрицательных энтеробактерий, и оценить биологическую активность таких ПРИГ.

Задачи исследования.

1. Изучить связывание ПРИГ с ЛПС грамотрицательных энтеробактерий Escherichia coli К235, Salmonella minnesola Re 595 и Salmonella enteritidis. Оценить вклад электростатических и гидрофобных взаимодействий во взаимодействии ПРИГ с ЛПС энтеробактерий Е. coli К235, S. minnesola Re 595 и S. enteritidis.

2. Изучить влияние ПРИГ на поглотительную способность гранулоцитов периферической крови; на индуцированную зимозаном продукцию АФК нейгрофильными гранулоцитами; на ЛПС-связывающий' потенциал гранулоцитов и моноцитов.

3. Сравнить способность к полиреактивной трансформации нативных иммуноглобулинов класса G, выделенных из сыворотки крови здоровых людей и больных с хирургической абдоминальной патологией (долихосигма, злокачественные новообразования).

Научная новизна. В работе охарактеризованы иммунобиологические свойства ПРИГ. Впервые показано, что предварительная обработка нативных иммуноглобулинов класса G тиоцианатом калия ведет к усилению их связывания с ЛПС энтеробактерий Е. coli К235, S. minnesota Re 595 и S. enteritidis. Установлено, что основной вклад во взаимодействие ПРИГ с ЛПС энтеробактерий вносят электростатические связи, тогда как гидрофобные связи менее значимы.

Впервые установлено, что ПРИГ усиливают поглотительную способность гранулоцитов периферической крови по отношению к различным тест-объектам; повышают продукцию АФК нейгрофильными гранулоцитами при использовании в качестве корпускулярного стимула зимозана, опсонизированного ПРИГ; снижают связывание ЛПС энтеробактерий с гранулоцитами и моноцитами.

Впервые показано, что нативные иммуноглобулины класса G больных с хирургической абдоминальной патологией (долихосигма, злокачественные новообразования) подвержены полиреактивной трансформации в меньшей степени, чем нативные иммуноглобулины класса G здоровых людей.

Научная и практическая значимость. Результаты исследований расширяют представления о вкладе ПРИГ в поддержание антигенного гомеостаза организма. Разработан методический подход, позволяющий выявлять индивидуальные особенности полиреактивной трансформации

иммуноглобулинов, что может быть использовано для характеристики изменений их свойств при различных патологических состояниях. Предложен метод оценки опсонизирующей активности ПРИГ с помощью проточной цитофлуориметрии. Разработан метод оценки влияния ПРИГ на взаимодействие ЛПС энтеробактерий

с ЛПС-связывающими рецепторами гранулоцитов и моноцитов периферической крови.

Основные научные положения, выносимые на защиту:

1. Кратковременная инкубация нативных иммуноглобулинов класса G в растворе тиоцианата калия, резко усиливает их связывание с ЛПС условно-патогенных энтеробактерий ЛПС Е. coli К235, S. Minnesota Re 595 и 5. enteritidis.

2. В связывание ПРИГ с ЛПС Е. coli К235, S. minnesota Re 595 и S. enteritidis основной вклад вносят электростатические взаимодействия.

3. ПРИГ усиливают поглотительную способность гранулоцитов периферической крови; повышают продукцию АФК нейтрофильными гранулоцитами и снижают уровень связывания ЛПС с гранулоцитами и моноцитами.

4. У больных с хирургической абдоминальной патологией нативные иммуноглобулины класса G в меньшей степени подвержены полиреактивной трансформации.

Апробация работы. Основные положения диссертации были освещены на: III международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и военно-морской медицины. Достижения, перспективы» (г. Севастополь, 2005 г.), IV открытой научно-практической конференции 2-го медицинского факультета ГУ «Крымский государственный медицинский университет имени С.И. Георгиевского» «Человек и микроорганизмы -параллельные миры», посвященная 70-летию со дня рождения профессора Ю.С. Кривошеина (г. Симферополь, 2009 г.), VIII международной научно-практической конференции «Юбилейные Пироговские чтения», посвященные 200-летию со дня рождения Н.И. Пирогова (г. Севастополь, 2010 г.), научно-практической конференции ГУ «Крымский государственный медицинский университет имени С.И. Георгиевского» «Клиническая эндотоксинология: итоги 10-летних достижений и дальнейшие перспективы (г. Симферополь, 2010 г.), открытой научно-практической конференции «Человек и микроорганизмы -параллельные миры», посвященная 125-летию со дня основания Института микробиологии и иммунологии имени И.И. Мечникова НАМИ Украины (г. Симферополь, 2012 г.), VI Конгрессе патофизиологов Украины «От экспериментальных исследований к клинической патофизиологии» (г. Ялта. Мисхор, 2012 г.).

Связь работы с научными программами, планами и темами. Диссертационная работа выполнена в рамках научно-исследовательских работ «Разработка и внедрение методов иммуноанализа липополисахаридов (эндотоксинов) грамотрицательных бактерий, антител к эндотоксинам и эндотоксин-связывающих рецепторов при инфекционной и неинфекционной патологии» (№ госрегистрации 0100U002155, шифр 2.116, срок выполнения 2000-2004 г.г.); «Разработка и внедрение методов диагностики состояния клеточного и гуморального антиэндотоксинового иммунитета в физиологии и патологии человека» (№ госрегистрации 0105U002205, шифр 02/1, срок выполнения 2005-2009 г.г.).

Публикации. По теме кандидатской диссертации опубликовано 8 научных статей, из них 5 - статьи в рецензируемых научных журналах, 1 статья в сборнике, 3 информационных письма, 6 материалов и тезисов докладов на научных конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 136 страницах печатного текста (119 страниц основного текста) и включает введение, обзор литературы, методы, результаты, обсуждение, выводы и практические рекомендации. Материал иллюстрирован 40 рисунками и 7 таблицами. Библиографический указатель содержит 181 источник.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты исследования

Нативные иммуноглобулины класса G выделяли из пулированной сыворотки крови 40 доноров Крымской республиканской станции переливания крови (г. Симферополь). В экспериментах по изучению способности к полиреактивной трансформации нативных иммуноглобулинов класса G здоровых людей и больных с хирургической абдоминальной патологией (ХАП) использовали индивидуальные образцы сыворотки крови здоровых людей и больных с ХАП (пациенты, нуждающиеся в операциях на толстой кишке в связи с наличием хронической толстокишечной непроходимости - долихосигма и злокачественных новообразований).

Сыворотку крови получали общепринятым способом и хранили в течение всего периода выполнения экспериментов при +4—8°С в присутствии 0,1 % азида натрия (Лифшиц В.М. и др., 2009).

При проведении экспериментов по изучению влияния ПРИГ на поглотительную способность гранулоцитов периферической крови; на индуцированную зимозаном продукцию АФК нейтрофильными гранулоцитами и ЛПС-связывающий потенциал гранулоцитов и моноцитов использовали лейкоциты, которые выделяли из стабилизированной цитратом натрия крови здоровых людей после предварительного лизиса эритроцитов в присутствии хлорида аммония (Current Protocols in Cytometry, 1997).

Методы исследования

Получение нативных иммуноглобулинов класса G. Нативные иммуноглобулины класса G (ИГ) выделяли из сыворотки крови четырехкратным осаждением сульфатом аммония (40 % от насыщения). Качественный состав полученных ИГ контролировали методом электрофореза в полиакриламидном геле, с последующим окрашиванием геля белковым красителем Coomassie R-250 (Остерман Л.А., 1981); количественное содержание белка определяли методом Бредфорд (Bradford М.М., 1976).

Получение ПРИГ. ИГ трансформировали в ПРИГ путем 10-минутной инкубации в присутствии 3,5 М тиоцианата калия при комнатной температуре (18-25°С) с последующим удалением хаотропного реагента гель-фильтрацией на

колонке (13x1,4 см) с Акрилексом Р-6 (Reanal, Hungary), уравновешенной 0,01 M фосфатным буфером (pH 7,4), содержащем 1 % NaCl (PBS) (Бобровник С.А., 2001). Концентрацию белка в полученных препаратах ГТРИГ определяли методом Бредфорд (Bradford М.М., 1976). Во время всего периода выполнения экспериментов ПРИГ хранили при +4-8°С в присутствии 0,1 % азида натрия.

Связывание ПРИГ с ЛПС энтеробактерий. Оценивали методом иммуноферментного анализа (ИФА). В качестве твердой фазы использовали 96-луночные полистироловые планшеты (Costar 9017; RIA/EI A, medium binding). ЛПС Е. coli К235, S. minnesota Re 595 и 5. enteritidis (Sigma Chem. Co., USA) иммобилизовали на внутренней поверхности 96-луночных полистироловых планшетов. Сорбцию ЛПС (10 мкг/мл) проводили при 37°С в течение 12 часов из 0,05 M карбонатного буфера (pH 9,6), содержащего 70 % сульфат аммония (Гордиенко А.И., 2004). После промывки лунок 0,01 M фосфатным буфером (pH 7,4), содержащим 1 % NaCl и 0,05 % Tween-20 (PBS-T) в них вносили ПРИГ или же ИГ с начальной концентрацией 100 мкг/мл в PBS-T, выполняли серию разведений с 2-кратным шагом и инкубировали в течение 60 мин при 37°С. Затем лунки промывали PBS-T, вносили в них рабочее разведение козьих аффинно очищенных антител к IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена (Sigma Chemicals Co., USA). В лунки, предназначенные для негативного контроля, вместо этого реагента вносили PBS-T. После инкубации в течение 60 мин при 37°С лунки снова промывали PBS-T. Затем в лунки вносили субстратно-буферный раствор (0,02 % перекись водорода и 0,33 мг/мл о-фенилендиамин в 30 мМ фосфатно-цитратном буфере, pH 5,0) и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Развитие окрашивания останавливали прибавлением в лунки 3 M серной кислоты. Оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм с помощью иммуноферментного анализатора Stat Fax 2100 (Awareness Tech. Inc., USA).

Анализ конкурентного ингибировання связывания ПРИГ. Оценивали методом ИФА. После иммобилизации ЛПС Е. coli К235 (10 мкг/мл) в лунки вносили в равных объемах PBS-T, содержащий ПРИГ или же ИГ (0,063 мг/мл), и PBS-T, содержащий соответствующий антиген (ЛПС £ coli К235, Е. coli К30, Е. coli К12, S. minnesota Re 595, S. enteritidis, овальбумин и высокомолекулярная нативная ДНК) с начальной концентрацией 100 мкг/мл. Серийные разведения выполнялись так, чтобы обеспечить уменьшение концентрации антигена с 2-кратным шагом при неизменной концентрации ПРИГ или ИГ. Дальнейший ход анализа не отличался от приведенной выше схемы проведения ИФА.

Вклад гидрофобных и электростатических взаимодействий в связывании ПРИГ с ЛПС Е. coli К235. Оценивали методом ИФА, который проводили по ' приведенной выше общей схеме. После иммобилизации соответствующего антигена (ЛПС Е. coli К235 или овальбумин, 10 мкг/мл) в лунки вносили ПРИГ или же ИГ (100 мкг/мл), растворенные в 0,01 M фосфатном буфере (pH 7,4), содержащем неионный детергент Tween-20 (максимальная концентрация 0,2 %) или NaCl (максимальная концентрация 1 М). Серийные разведения выполнялись так, чтобы обеспечить уменьшение концентрации Tween-20 или NaCl с 2-кратным шагом при неизменной концентрации ПРИГ или

ИГ. Дальнейший ход анализа не отличался от приведенной выше схемы проведения ИФА.

Взаимодействие ПРИГ со стафилококковым белком А. Оценивали методом ИФА. Растворы ПРИГ или же ИГ с начальной концентрацией 10 мкг/мл в 0,01 М фосфатном буфере (pH 7,4), содержащем 1 % NaCl, разводили с 2-кратным шагом, вносили в лунки полистироловых планшетов и инкубировали в течение 12 часов при комнатной температуре (18-25°С). После промывки лунок PBS-T в них вносили рабочий раствор конъюгата белка А с пероксидазой хрена (Пептос, Россия) и инкубировали в течение 60 мин при 37°С. Измерение ассоциированной с твердой фазой пероксидазной активности проводили, как указано в приведенной выше схеме проведения ИФА.

Определение_поглотительной_способности_гранулоцитов

периферической крови. К лейкоцитам (1x10 кл/мл) в PBS прибавляли суспензию Escherichia coli КЗО или же Staphilococcus aureus, конъюгированных с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) (1х107 бактерий/мл). В опытные пробирки вносили раствор ПРИГ или же ИГ в PBS (2,4 мг/мл), в контрольные - только PBS. После 30-минутной инкубации в темноте при 37°С фагоцитоз останавливали прибавлением PBS, содержащего 5 мМ ЭДТА, после чего образцы анализировали на проточном цитофлуориметре PAS-III (Partee Gmb, Germany) и определяли процент клеток, поглотивших объект фагоцитоза (Мазуров Д.В. и др., 2000).

Оценка ЛПС-связывающего потенциала гранулоцитов и моноцитов. К суспензии лейкоцитов (1x10 кл/мл) в PBS прибавляли конъюгат ЛПС-ФИТЦ в PBS в концентрации 50 мкг/мл (Гордиенко А.И., 2007, 2008). В опытные пробирки вносили раствор ПРИГ или ИГ в PBS (2,4 мг/мл); в контрольные -только PBS. После 30-минутной инкубации в темноте при 18-25°С образцы анализировали на проточном цитофлуориметре PAS-III (Partee Gmb, Germany). С помощью программного обеспечения FloMax V. 2.4d (Partee Gmb, Germany) определяли уровень флуоресценции моноцитов или гранулоцитов, связавших конъюгат ЛПС-ФИТЦ.

Продукция АФК нейтрофнльными гранулоцитамн. Оценивали методом люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ). В качестве корпускулярного стимула образования АФК использовали зимозан (12,5 мг/мл) (Sigma Chem. Co., USA), предварительно опсонизированный ПРИГ (ОЗ-ХЛ-ПРИГ) или же ИГ (ОЗ-ХЛ-ИГ) (2,9 мг/мл). Для определения показателей продукции АФК в термостатированный (37°С) кюветодержатель люминометра БХЛ-06 (Нижний Новгород, Россия) помещали пластиковую измерительную кювету с суспензией лейкоцитов в растворе Хенкса (1x106 кл/мл), содержащем 0,5 мМ люминола (Sigma Chem. Co., USA). Спонтанную ХЛ регистрировали в течение 15 мин при 37°С. Затем в кювету прибавляли суспензию ОЗ-ХЛ-ПРИГ или ОЗ-ХЛ-ИГ и в течение 30 мин регистрировали активированную ХЛ при 37°С (Владимиров Ю.А. и др., 1989).

Статистическая обработка данных. Экспериментальные данные анализировали с помощью Microsoft Excel 97 из пакета Microsoft Office 97. Все эксперименты выполняли в 3-кратной повторности, а полученные результаты

усредняли. Достоверность различий между соответствующими показателями оценивали с помощью Т-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Взаимодействие ПРИГ с ЛИС энтеробактерий, овальбумином, денатурированной однонитевои (вв-ДНК) и высокополимерной нативной ДНК (ф-ДНК). 10-минутная инкубация ИГ с 3,5 М тиоцианатом калия приводит к существенному изменению их свойств. Полученные таким образом ПРИГ связываются с ЛПС Е. соН К235, 5. пйптзо1а Яе 595 и 5. еМегШсИз, овальбумином, бб-ДНК и сЬ-ДНК соответственно в 6,4, 2,6, 8,0, 9,3, 5,2 и 2,5 раза сильнее, чем ИГ (Табл. 1).

Таблица 1. Связывание нативных иммуноглобулинов класса G и ПРИГ с различными антигенами.

Антиген Нативные иммуноглобулины класса G Полиреактнвно трансформированные иммуноглобулины

Д, отн. ед.

ЛПС Е. coli К235 0,184 ±0,02 1,178 ± 0,11

ЛПС S. minnesota Re 595 0,105 ±0,01 0,269 ± 0,03

ЛПС S. enteritidis 0,151 ±0,04 1,195 ±0,09

Овальбумин 0,100 ±0,02 0,925 ± 0,07

ss-ДНК 0,028 ±0,01 0,146 ±0,03

ds-ДНК 0,367 ±0,05 0,921 ±0.06

Нативные иммуноглобулины класса G выделяли из пулированной сыворотки крови 40 доноров, трансформировали в ПРИГ путем 10-минутной инкубации в присутствии 3,5 М тиоцианата калия. Уровень связывания нативных иммуноглобулинов класса G и ПРИГ с указанными антигенами определяли методом ИФА; приведены значения уровня связывания для концентрации нативных иммуноглобулинов класса G и ПРИГ 100 мкг/мл. Эксперименты выполняли в 3-кратной повторности, полученные результаты усредняли.

Изучение изменения активности ПРИГ во времени показало, что связывание ПРИГ с ЛПС Е. coli К235, S. minnesota Re 595, S. enteritidis и овальбумином постепенно уменьшается. На 29 день с момента получения ПРИГ уровень их связывания с указанными антигенами снижается соответственно 27 %, 13 %, 31 % и 6 % от первоначальных значений (Рис. 1).

1,60

S 1,20 -

X н п 0,80 • t i г— —$- i —i

0,40 ■ 0,00 • I

1 8 15 22 29

Время от момента получения ПРИГ, дни

• ЛПС Е. coli К 235 ' Овальбумин

1 8 15 22 29

Время от момента получения ПРИГ, дни ' ЛПС S. minnesota Re 595 ' ЛПС S. enteritidis

Рис. 1. Динамика изменений активности ПРИГ во времени.

Активность ПРИГ изучали на 1. 4, 8, 15, 22 и 29 день от момента их получения. Нативные иммуноглобулины класса в выделяли из пулированной сыворотки крови 40 доноров, трансформировали в ПРИГ путем 10-минутной инкубации в присутствии 3,5 М тиоцианата калия. Уровень связывания ПРИГ с указанными антигенами определяли методом ИФА; приведены значения уровня связывания для концентрации ПРИГ 100 мкг/мл. Эксперименты выполняли в 3-кратной повторное™, полученные результаты усредняли.

Одной из наиболее важных характеристик реакции взаимодействия антител с антигенными детерминантами поливалентного антигена считается их авидность (Глинн Л. и др., 1983). Нами была проведена сравнительная оценка авидности ПРИГ, полученных путем полиреактивной трансформации ИГ, выделенных из пулированной сыворотки крови здоровых людей и сывороточных антител класса в (анти-ЛПС-^в), которые образуются у больных с ХАП в результате адаптивного иммунного ответа на ЛПС энтеробактерий (Рис. 2.).

2,7

ё 2,0 о

1,4 ■

0,7

0,0

1,65 1

2,51»

н-

1,48

Низкоавидные Высокоавидные Анти-ЛПС-IgG

ПРИГ

Рис. 2. Индекс авидности анти-ЛПС-IgG и ПРИГ при использовании в качестве антигена ЛПС Е. coli К235.

Средний уровень анти-ЛПС-IgG в сыворотке крови больных с ХАП (п=50) составлял 1,786±0,147 отн. ед. Индекс авидности соответствует молярной концентрации тиоцианата аммония, вызывающей 50 % уменьшение оптической плотности конечного продукта ферментативной реакции на заключительном этапе ИФА (Pullen G.R. et al., 1986). У 5 больных ХАП анти-ЛПС-IgG в крови были низкоавидными, у 45 - высокоавидными. Индекс авидности ПРИГ сравнивали с низкоавидными и высокоавидными анти-ЛПС-IgG. * - достоверность различий (р<0,001).

Предварительным скринингом в сыворотке крови этих больных были выявлены высокие уровни анти-ЛПС-IgG (среднее значение 1,786±0,147 отн. ед.). По величине индекса авидности анти-ЛПС-IgG сыворотки крови больных ХАП были разделены на содержащие низкоавидные анти-ЛПС-IgG (п=5, средний индекс авидности равен 1,65±0,09), и содержащие высокоавидные анти-ЛПС-IgG (п=45, средний индекс авидности равен 2,51±0,12). Оказалось, что индекс авидности ПРИГ по отношению к ЛПС Е. coli К235 (1,48±0,06) был достоверно ниже величины данного показателя для низкоавидных и высокоавидных анти-ЛПС-IgG соответственно на 10,3% (р<0,01) и 41,0% (р<0,001) (Рис. 2.).

Эксперименты по конкурентному ингибированию связывания ПРИГ и ИГ с иммобилизованным на твердой фазе ЛПС Е. coli К235 присутствующими в инкубационной среде ЛПС Е. coli К235, Е. coli КЗО, Е. coli К.12, 5. minnesota Re 595, S. enteritidis, овальбумином и ds-ДНК показали, что эти антигены оказывают различное ингибирующее влияние. При максимальной концентрации (100 мкг/мл) в инкубационной среде ЛПС Е. coli К235, Е. coli КЗО, Е. coli К12, S. minnesota Re 595, S. enteritidis, овальбумина и ds-ДНК ингибирование связывания ПРИГ с иммобилизованным ЛПС Е. coli К235 было значительно меньше (соответственно в 1,8, 5,1 3,7, 2,6, 2,5, 2,7 и 5,1 раз), чем для ИГ. По всей видимости, это определяется конформационными перестройками, которые возникают в молекулах антигена при иммобилизации на твердой фазе.

Влияние Tween-20 и хлорида натрия на взаимодействие ПРИГ с ЛПС энтеробактерий н овальбумином. По данным литературы, трансформация ИГ в ПРИГ сопровождается резким усилением роли гидрофобных взаимодействий в процессах межбелкового комплексообразования (Бобровник С.А., 2004). Результаты выполненных нами экспериментов по изучению особенностей связывания ПРИГ с ЛПС Е. coli К235, S. minnesota Re 595, S. enteritidis и овальбумином (этот белок был выбран из-за того, что он является гликопротеином и содержит в составе молекулы углеводный компонент) в присутствии достаточно высоких концентраций неионного детергента Tween-20 свидетельствуют, что вклад гидрофобных связей в реализацию механизмов взаимодействия ПРИГ с указанными лигандами незначителен. Действительно, снижающиеся в геометрической прогрессии концентрации Tween-20 (от 0,2 % до 0,003 %) в инкубационной среде практически не влияли на связывание ПРИГ с ЛПС Е. coli К235 и овальбумином. В то же время связывание ПРИГ с ЛПС Е. coli К235 и овальбумином существенно зависело от концентрации NaCI в инкубационной среде. При максимальной (1 М) концентрации NaCI в инкубационной среде связывание ПРИГ с ЛПС Е. coli К235 и овальбумином снижалось соответственно в 8,0 раза и 7,0 раза по сравнению с аналогичными значениями при минимальной (0,02 М) концентрации NaCI в инкубационной среде (Рис. 3). Полученные результаты указывают, что связывание ПРИГ с ЛПС Е. coli К235 и овальбумином в основном обеспечивают электростатические взаимодействия.

1,80

1,35 -

£ ё 0,90 -

et 0,45 -

0,00 -

ЛПС E. coli K235 —5---*__

S

1,80 1,35 -0,90 0,45 -

0,00

Овальбумин

0,00

0,20

0,05 0,10 0,15 Концентрация Tween 20, %

-Нативные иммуноглобулины класса G - Полиреактивно трансформированные иммуноглобулины

ЛПС Е. coli К235

0,00

0,20

0,05 0,10 0,15 Концентрация Tween 20, % -Нативные иммуноглобулины класса G - Полиреактавно трансформированные иммуноглобулины

1,80 п

Овальбумин

0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Концентрация хлорвда натрия, М

- Нативные иммуноглобулины класса G

- Полиреактивно трансформированные иммуноглобулины

0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Концентрация хлорвда натрия, М

-Нативные иммуноглобулины класса О -Полиреактивно трансформированные иммуноглобулины

Рис. 3. Влияние Tween-20 и хлорида натрия в инкубационной среде на взаимодействие ГТРИГ с ЛПС Е. coli К235 и овальбумином.

Нативные иммуноглобулины класса G выделяли из пулированной сыворотки крови 40 доноров, трансформировали в ПРИГ путем 10-минутной инкубации в присутствии 3,5 М тиоцианата калия. Уровень связывания нативных иммуноглобулинов класса G и ПРИГ с указанными антигенами определяли методом ИФА; ПРИГ и нативные иммуноглобулины класса G использовались при концентрации 100 мкг/мл. Инкубационная среда — 0,01 М фосфатный буфер (pH 7,4), содержащий неионный детергент Tween-20 (от 0,2 % до 0,003 %) или NaCl (от 1 М до 0,02 М). Первая точка на рисунке соответствует 0,003 % концентрации Tween-20 или 0,02 М концентрации NaCl. Эксперименты выполняли в 3-кратной повторности, полученные результаты усредняли.

Влияние мочевины на связывание ИГ с ЛПС энтеробактерий и овальбумином. Проведенные эксперименты показали, что 10-минутная инкубация ИГ в присутствии 1 М и 3,5 М мочевины не ведет к достоверному усилению их связывания с ЛПС Е. coli К235, S. minnesota Re 595, 5. enteritidis и овальбумином. В тоже время 10-минутная экспозиция ИГ с 3,5 М тиоцианатом калия ведет к их трансформации в ПРИГ и существенному усилению взаимодействия с ЛПС Е. coli К235, S. minnesota Re 595, S. enteritidis и овальбумином (Рис. 4).

Из проведенных экспериментов следует, что полиреактивная трансформация является особенностью, характерной для молекул иммуноглобулинов. Эксперименты, проведенные с человеческим сывороточным альбумином (ЧСА) показали, что 10-минутная инкубация данного белка с 3,5 М тиоцианатом калия (4CA-KSCN) не вызывает заметного усиления его взаимодействия с ЛПС энтеробактерий (Рис. 5).

ЛПС Е. coli К235 ЛПС S. minnesota ЛПС S. enteritiüis Овальбумин Re 595

П Нативные иммуноглобулины класса G

□ Нативные иммуноглобулины класса G, обработанные 1 М мочевиной

□ Нативные иммуноглобулины класса G, обработанные 3,5 М мочевиной

Я Нативные иммуноглобулины класса G, обработанные 3.5 М тиоцианатом калия

Рис. 4. Влияние обработки нативных иммуноглобулинов класса G мочевиной на связывание с ЛПС энтеробактерий и овальбумином.

Нативные иммуноглобулины класса G выделяли из пулированной сыворотки крови 40 доноров, инкубировали 10 минут в присутствии 1 М мочевины, 3,5 М мочевины и 3,5 М тиоцианата калия. Уровень связывания с указанными антигенами приведен для концентрации нативных иммуноглобулинов класса G 100 мкг/мл. Эксперименты выполняли в 3-кратной повторности. полученные результаты усредняли.

1,90

1,43 -

I 0,95 -

Ч

0,48 ■

0,00

ЛПС Е. coli К235 ЛПС S. minnesota ЛПС S. enteritidis Овальбумин Re 595

□ Человеческий сывороточный альбумин

■ Человеческий сывороточный альбумин, обработанный 3,5 М тиоцианатом калия

Рис. 5. Влияние тиоцианата калия на связывание человеческого сывороточного альбумина с ЛПС энтеробактерий и овальбумином.

Оценивали методом ИФА с использованием биотинилированных анти-ЧСА-антител и коньюгата стрептавидин-пероксидаза. ЧСА (Sigma Chem. Co., USA) инкубировали 10 минут в присутствии 3,5 М тиоцианата калия. Уровень связывания ЧСА и 4CA-KSCN с указанными антигенами приведен для концентрации ЧСА и 4CA-KSCN 10 мкг/мл. Эксперименты выполняли в 3-кратной повторности. полученные результаты усредняли.

I .

Изучение биологической активности ПРИГ. Проведенные эксперименты показали, что ПРИГ сохраняют способность связывать белок A S. aureus на том же уровне, что и ИГ. При концентрации 10 мкг/мл уровень связывания стафилококкового белка А с иммобилизованными на твердой фазе ПРИГ и ИГ был соответственно 2,08210,150 и 1,997±0,130 отн. ед.

Методом проточной цитофлуориметрии изучено влияние ПРИГ на поглотительную способность гранулоцитов периферической крови, проявляемую в отношении Е. coli К30 и S. aureus, которые предварительно были инактивированы прогреванием и обработаны ФИТЦ для введения флуоресцентной метки. В присутствии ПРИГ поглотительная способность гранулоцитов периферической крови статистически достоверно возрастает. Поглотительная способность гранулоцитов в отношении Е. coli КЗО и S. aureus, предварительно опсонизированных ПРИГ, была выше в среднем соответственно в 2,0 раза (р<0,001) и 1,7 раза (р<0,001) этого показателя для неопсонизированного фагоцитоза и соответственно в 1,7 раза (р<0,001) и 1,6 раза (р<0,001) выше, чем при опсонизации указанных тест-объектов ИГ (Рис. 6).

Escherichia coli КЗО Staphilococcus aureus

П Опсонизация нативными иммуноглобулинами класса G ■ Опсонизация полиреактивно трансформированными иммуноглобулинами ЭНеопсонизированный фагоцитоз

Рис. 6. Влияние ПРИГ на поглотительную способность гранулоцитов периферической крови.

Лейкоциты выделяли из стабилизированной цитратом натрия крови здоровых людей (п=50) после предварительного лизиса эритроцитов в присутствии хлорида аммония. В опытные пробирки вносили суспензию лейкоцитов (1х106 кл/мл), раствор ПРИГ или же нативных иммуноглобулинов класса G в PBS (2,4 мг/мл); в контрольные - суспензию лейкоцитов (!х106 кл/мл) и PBS. Инкубационная среда содержала 5 мМ глюкозы. Сравнивали поглотительную способность гранулоцитов (процент клеток, поглотивших объект фагоцитоза) при использовании тест-объектов, опсонизированных ПРИГ с неопсонизированным фагоцитозом (PBS) и при опсонизации нативными иммуноглобулинами класса G. Полученные результаты представлены в виде М±т. * - достоверность различий (р<0,001).

Установлено, что ПРИГ проявляют выраженные опсонизирующие свойства в отношении зимозана - дрожжевого полисахарида, являющегося стимулятором продукции АФК нейтрофильными гранулоцитами. Так, при опсонизации зимозана ПРИГ время достижения нейтрофильными гранулоцитами максимальной продукции АФК сокращается в среднем в 1,9 раза (р<0,001) по сравнению с опсонизацией зимозана ИГ (Рис. 7.).

m 100-,

Время, мин

Рис. 7. Результаты типичного эксперимента по оценки продукции активных форм кислорода нейтрофильными гранулоцитами при их стимуляции зимозаном, опсонизированным ПРИГ.

Метод люминол-зависимой хемилюминесценции. Лейкоциты выделяли из стабилизированной цитратом натрия крови здоровых людей (п=15) после предварительного лизиса эритроцитов в присутствии хлорида аммония. Эксперименты проводили с суспензией лейкоцитов (1х106 кл/мл) в растворе Хенкса, содержащем 0,5 мМ люминола. В качестве корпускулярного стимула образования АФК использовали зимозан (12,5 мг/мл, Sigma Chem. Co.. USA), опсонизированный ПРИГ или же нативными иммуноглобулинами класса G (2,9 мг/мл). Мах - максимальная интенсивность хемилюминесценции.

Методом проточной цитофлуориметрии изучено влияние ПРИГ на ЛПС-связывающий потенциал гранулоцитов и моноцитов периферической крови здоровых людей. Показано, что при добавлении в инкубационную среду ПРИГ уровень связывания ЛПС-ФИТЦ с гранулоцитами и моноцитами периферической крови был достоверно ниже (р<0,001), чем при добавлении ИГ. По-видимому, в результате связывания ПРИГ с ЛПС возникают стерические препятствия для последующего взаимодействие ЛПС с ЛПС-связывающими рецепторами гранулоцитов и моноцитов. Можно предположить, что in vivo ПРИГ также способны предотвращать ЛПС-зависимую активацию клеток и синтез разнообразных медиаторов воспаления, тем самым защищая организм от развития ЛПС-зависимых патофизиологических реакций (Рис. 8).

100 100

Гранулоциты Моноциты

□ Нативные иммуноглобулины класса G ■ Полиреактивно трансформированные, иммуноглобулины § Инкубационная среда

Рис. 8. Влияние ПРИГ на ЛПС-связывающий потенциал гранулоцитов и моноцитов периферической крови здоровых людей.

Лейкоциты выделяли из стабилизированной цитратом натрия крови здоровых людей (п=50) после предварительного лизиса эритроцитов в присутствии хлорида аммония. В опытные пробирки вносили суспензию лейкоцитов (1х106 кл/мл), раствор ПРИГ или же нативных иммуноглобулинов класса G в PBS (2,4 мг/мл); в контрольные — суспензию лейкоцитов (1x10 кл/мл) и PBS. Сравнивали уровень флуоресценции гранулоцитов или моноцитов, связавших конъюгат ЛПС-ФИТЦ (50 мкг/мл) в присутствии ПРИГ и нативных иммуноглобулинов G. * - достоверность различий (р<0,001).

Индивидуальные особенности полиреактивной трансформации ИГ при патологии. Проведена сравнительная оценка антиген-связывающих свойства ПРИГ, полученных путем полиреактивной трансформации ИГ здоровых людей и больных с ХАП. Установлено, что ИГ, выделенные из сыворотки крови больных с ХАП, в меньшей степени подвержены полиреактивной трансформации в присутствии 3,5 М тиоцианата калия, нежели ИГ здоровых людей. Уровень связывания таких ПРИГ с ЛПС Е. coli К235, S. minnesota Re 595 и S. enteritidis был ниже соответственно на 16,5 % (р<0,001), 37,2 % (р<0,001) и 25,2 % (р<0,001), чем для ПРИГ, полученных путем полиреактивной трансформации ИГ здоровых людей (Рис. 9). Исходя из выдвинутого ранее предположения о возможной протективной роли ПРИГ, образующихся in vivo в очагах воспаления под влиянием АФК (Бобровник С.А., 1999), можно полагать, что повышенная устойчивость к полиреактивной трансформации ИГ у больных с ХАП является негативным фактором, который может способствовать развитию локальных воспалительных реакций в условиях нарушения целостности кишечного барьера и усиления бактериальной транслокации.

1,80

1,20

0,60 -

0,00

ПРИГ

ЛПС Е. coli К235 ЛПС S. minnesota Re 595 ЛПС S. enteritidis

□ Здоровые люди

■ Больные с хирургической абдоминальной патологией

Рис. 9. Уровень взаимодействия образцов нативных иммуноглобулинов класса G сыворотки крови и полученных из них ПРИГ с различными антигенами для здоровых людей и больных с хирургической абдоминальной патологией. Нативные иммуноглобулины класса G выделяли из индивидуальных образцов сыворотки крови здоровых людей (п=30), и больных с ХАП (п=30; в эту группу вошли пациенты, нуждающиеся в операциях на толстой кишке в связи с наличием хронической толстокишечной непроходимости). Трансформирование нативных иммуноглобулинов класса G в ПРИГ проводили путем 10-мтгутной инкубации в присутствии 3,5 М тиоцианата калия. При проведении ИФА ПРИГ и нативные иммуноглобулины класса G использовали в концентрации 100 мкг/мл. Полученные результаты представлены в виде М±т.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований установлено, что ПРИГ, получаемые путем кратковременной инкубации ИГ здоровых людей в 3,5 М растворе тиоцианата калия, обладают способностью к низкоавидному взаимодействию с ЛПС условно-патогенных энтеробактерий. Результаты выполненных экспериментов свидетельствуют о том, что значительный вклад в обеспечение связывания ПРИГ с указанными антигенами вносят электростатические взаимодействия. Вместе с тем ПРИГ сохраняют многие эффекторные свойства, которыми характеризуются специфические антитела, образующиеся в организме при адаптивном иммунном ответе на бактериальные антигены гликолипидной природы. Показано, что одним из биологически важных свойств ПРИГ является их опсонизирующая активность в отношении различных корпускулярных "объектов, что оказывает позитивное влияние на поглотительную функцию фагоцитов периферической крови. Кроме того, одним из возможных механизмов протективного действия ПРИГ может быть блокирование связывания ЛПС с ЛПС-связывающими клеточными рецепторами, что снижает ЛПС-зависимую активацию клеток-мишеней и синтез ими разнообразных медиаторов воспаления.

Разработанный в работе подход позволяет изучать in vitro особенности полиреактивной трансформации ИГ в индивидуальных образцах сыворотки

крови, что может быть использовано для углубленной характеристики свойств иммуноглобулинов при различных патологических процессах. Показано, что в системе in vitro ИГ больных с ХАП более устойчивы к полиреактивной трансформации, чем ИГ здоровых людей. In vivo образование ПРИГ может происходить в очагах воспаления под действием АФК (Бобровник С.А., 1999, 2002; Кулинский В.И., 1999), а ЛПС является мощным индуктором АФК (Heine Н. et al., 2001). В проведенных нами экспериментах показано, что ПРИГ заметно повышают поглотительную способность гранулоцитов. Это может иметь существенное значение в условиях нарушения барьерной функции кишечника, усиления бактериальной транслокации и попадания избытка ЛПС в портальный и системный кровоток - патофизиологических процессов, типичных для пациентов, страдающих ХАП (Дибиров М.Д. и др., 2012; Тимербулатов М.В. и др., 2013; Sperandeo Р. et al., 2009; Kohno Y. et al, 2013; Whitfield C. et al., 2014; Sang H.R., 2014; Putker F. et al., 2015). В связи с этим большая устойчивость ИГ больных с ХАП к полиреактивной трансформации может рассматриваться в качестве негативного фактора, способствующего развитию послеоперационных инфекционных осложнений.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что кратковременная экспозиция нативных иммуноглобулинов класса G в присутствии тиоцианата калия усиливает их взаимодействие с ЛПС Е. coli К235, S. minnesota Re 595, S. enteritidis, овальбумином, денатурированной однонитевой и высокополимерной нативной ДНК соответственно в 6,4, 2,6, 8,0, 9,3, 5,2 и 2,5 раза.

2. Установлено, что авидность ПРИГ по отношению к ЛПС энтеробактерий существенно ниже авидности сывороточных антител класса G, образующихся в результате адаптивного иммунного ответа на эти же ЛПС.

3. Впервые показано, что основной вклад в связывание ПРИГ с ЛПС Е. coli К235, S. minnesota Re 595, S. enteritidis и овальбумином вносят электростатические взаимодействия.

4. ПРИГ усиливают поглотительную способность гранулоцитов периферической крови, повышают в 1,9 раз продукцию активных форм кислорода гранулоцитами в ответ на корпускулярный стимул, снижают связывание ЛПС энтеробактерий с гранулоцитами и моноцитами.

5. Впервые установлено, что нативные иммуноглобулины класса G у больных с хирургической абдоминальной патологией (долихосигма и злокачественные новообразования) в меньшей степени подвержены полиреактивной трансформации in vitro, нежели нативные иммуноглобулины класса G здоровых людей.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах

1. Гордиенко А.И., Химич Н.В. Хаотропно модифицированные иммуноглобулины по-разному взаимодействуют с белковыми и гликолипидными антигенами // Укр. бюхш. журнал - 2006.- 78, №6 - С. 78-85.

2. Химич Н.В.. Гордиенко А.И. Влияние тиоцианата калия на взаимодействие иммуноглобулинов и сывороточного альбумина с белковыми и гликолипидными антигенами // 1мунолопя та алерголопя- 2008- №3-С. 50-54.

3. Гордиенко А.И., Химич Н.В. Дальнейшее изучение свойств хаотропно модифицированных иммуноглобулинов // Таврический медико-биологический вестник.-2009 - 12, №4,-С. 222-227.

4. Гордиенко А.И., Химич Н.В.. Белоглазов В.А. Влияние некоторых физико-химических факторов на взаимодействие полиреактивных иммуноглобулинов с белковыми и гликолипидными антигенами // 1мунолопя та алерголопя.— 2011.-№2.-С. 38-13.

5. Химич Н.В.. Гордиенко А.И. Изучение авидности и конкурентного ингибирования связывания нативных и хаотропно модифицированных иммуноглобулинов с белковыми и гликолипидными антигенами // Укр. 6ioxiM. журнал,- 2012,- 84, №3.- С. 26-30.

Статьи в сборниках

1. Химич Н.В.. Гордиенко А.И. Индивидуальные особенности полиреактивной трансформации иммуноглобулинов в норме и при патологии // Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения. Труды Крымского государственного медицинского университета. Симферополь: Изд. центр КГМУ, 2007- 143, №6,-С. 148-153.

Тезисы докладов

1. Гордиенко А.И., Химич Н.В. Динамика взаимодействия полиреактивно трансформированных иммуноглобулинов с гликолипидными и белковыми антигенами // III международная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы клинической и военно-морской медицины. Достижения, перспективы».— Севастополь, 2005 — С. 231.

2. Гордиенко А.И., Химич Н.В. Дальнейшее изучение свойств хаотропно модифицированных иммуноглобулинов // IV открытая научно-практическая конференция 2-го медицинского факультета ГУ «Крымский государственный медицинский университет им. С.И. Георгиевского» «Человек и микроорганизмы — параллельные миры», посвященная 70-летию со дня рождения профессора Ю.С. Кривошеина,-Симферополь, 2009- С. 162-163.

3. Гордиенко А.И., Химич Н.В. Влияние IgG-антител, специфичных к липополисахариду Escherichia coli К30, на фагоцитарную активность гранулоцитов периферической крови // VIII международная научно-практическая конференция «Юбилейные Пироговские чтения», посвященные 200-летию со дня рождения Н.И. Пирогова.- Севастополь, 2010,- С. 98-101.

4. Химич H.B. Полиреактивность является одним из важных свойств у-глобулинов // Науково-практична конференщя ДУ «Кримський державний медичний ушверситет ¡м. C.I. Георпевського» «Юпшчна ендотоксинолопя: шд сумки 10-р1чних дослщжень та подалыш перспективи»».— С1мферополь,

2010,-С. 246-247.

5. Химич Н.В. Полиреактивность как одно из свойств молекулы иммуноглобулинов // Научно-практическая конференция «Человек и микроорганизмы — параллельные миры», посвященная 125-летию со дня основания Института микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова НАМИ Украины - Симферополь, 2012 - С. 159-162.

6. Химич Н.В.. Гордиенко А.И. Сравнительный анализ хаотропной модификации IgG-антител условно здоровых людей и больных с хирургической абдоминальной патологией // VI Конгресс патофизиологов Украины «От экспериментальных исследований к клинической патофизиологии».- Ялта. Мисхор, 2012-С. 390.

Статьи в других изданиях

1. Гордиенко А.И., Химич Н.В. Влияние IgG-антител, специфичных к липополисахариду Escherichia coli К30, на фагоцитарную активность гранулоцитов периферической крови // Вестник морского врача.- 2010 - №9-С. 98-101.

2. Химич Н.В. Полиреактивность как одно из свойств молекулы иммуноглобулинов // Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины.-2012,-2, №1-2 (5-6).-С. 159-162.

Информационные письма.

1. Гордкнко A.I, Бшоглазов В.О., XiMi4 Н.В. Метод визначення поглинальноТ активност1 нейтрофьгпв i монощтв периферичноГ кровь 1нформацшний лист.-КиТв, 2009,- №112,- С. 1-4.

2. Горд1енко A.I., Бшоглазов В.О., Х1м1ч Н.В. Метод визначення ендотоксин-зв'язуючих рецептор1в на моноцитах i гранулоцитах периферичноТ Kpoßi. 1нформацшний лист- Khib, 20Ю.-№122 — С. 1-3.

3. Горд1енко A.I., Биюглазов В.О., Х1м1ч Н.В. Метод визначення концентрацп ¡муноглобул1н1в основних классе у сироватщ Kpoei. 1нформащ'йний лист - КиУв,

2011.-№255,-С. 1-4.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Анти-ЛПС-IgG......................антитела класса G,

специфичные к липополисахариду Е. coli К235

.АФК....................................... активные формы кислорода

ИГ...........................................нативные иммуноглобулины класса G

ИФА....................................... иммуноферментный анализ

ЛПС.......................................липополисахарид, эндотоксин

ОЗ-ХЛ-ИГ............................. зимозан, опсонизированный нативными

антителами класса G

ОЗ-ХЛ-ПРИГ........................ зимозан, опсонизированный полиреактивными

иммуноглобулинами

ПРИГ..................................... полиреактивно трансформированные

иммуноглобулины

ФИТЦ.................................... флуоресцеинизотиоцианат

ХАП....................................... хирургическая абдоминальная патология

ХЛ.......................................... хемилюминесценция

ЧСА....................................... человеческий сывороточный альбумин

4CA-KSCN...........................человеческий сывороточный альбумин,

обработанный 3,5 М тиоцианатом калия

ds-ДНК.................................. высокополимерная нативная ДНК

ss-ДНК................................... денатурированная однонитевая ДНК

Подписано в печать 24.06.2015 г. Формат 60x90/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Физ. печ. л. 0.9. Усл.-печ. л. 1,9. Тираж 100 экз. Зак. № 81.

Отпечатано в ООО «Эльиньо» г. Симферополь, бул. Ленина, 5/7