Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммобилизованные биокатализаторы для деструкции фосфорорганических соединений и продуктов их разложения

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Иммобилизованные биокатализаторы для деструкции фосфорорганических соединений и продуктов их разложения"

На правах рукописи

СИРОТКИНА МАРИЯ СЕРГЕЕВНА

ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ ДЛЯ ДЕСТРУКЦИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ И ПРОДУКТОВ ИХ РАЗЛОЖЕНИЯ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 02.00.15 - кинетика и катализ

4 АПР 2013

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2013

005051413

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ефременко Елена Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, Ямсков Игорь Александрович,

заведующий лабораторией физиологически активных биополимеров Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова

Российской академии наук

доктор биологических наук, профессор, Яненко Александр Степанович,

заместитель директора Государственного научного центра Российской Федерации федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции

промышленных микроорганизмов»

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

Защита состоится « 23 » апреля 2013 года в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « 22 » марта 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета, /V

кандидат химических наук Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В развитии современного мира большую роль играют фосфорорганические соединения (ФОС*), а также продукты их разложения (Табл. 1). Известно, что применение пестицидов сохраняет значительную часть (-35%) урожая, поэтому они интенсивно используются в сельском хозяйстве. Почти 40% от мирового производства всех пестицидов составляет производство фосфорорганических пестицидов (ФОП) (Табл. 1). Ежегодное применение ФОП в объеме сотен тысяч тонн для нужд сельского хозяйства наряду с низкими скоростями их разложения в условиях окружающей среды приводят к их накоплению в почвогрунтах, откуда далее они вымываются и попадают в грунтовые и речные воды или продукты сельского хозяйства.

Таблица 1. Структурные формулы ФОС.

№ Субстрат Структура № Субстрат Структура

1 параоксон, ФОП о С2Н50-Р-0— ОС2Н5- 6 хлорпири-фос, ФОП С1 з 14—( II // \ч с2н5о—Р—О—(' V—С1 1 \—/ ос,н5 >— 1 5 С1

2 паратион, ФОП ¡5 С2Н50-Р-0— ОС2Н5Х- 7 деметон-Б, ФОП э С2Н53-(СН2)23-Р-ОС2Н5 ОС2Н5

3 метил-паратион, ФОП в сн3о-р-о— осн3 — 8 диметоат, ФОП О Б II II сн3-мн-с-сн2—Э-Р—осн3 сн3о

4 малатион, ФОП 3 1 1 25 осн3 СН2-СООС2Н5 9 вещество типа Ух, ФОВ ° ,с2н5 (СН3)2СНСН20—Р-Э—(СН2)2 N. СН3 С2Н5

5 диазинон, ФОП сн3 э г^и С2Н50-Р-0—^ ос,н. ™ Т 2 ! сн3 10 метилфос-фоновая кислота 0 II НО—Р-ОН 1 сн3

В почвогрунты также могут попадать фосфорорганические отравляющие вещества (ФОВ) во время проведения мероприятий по их уничтожению, а также запрещенные к применению и устаревшие ФОП, длительное хранение которых может приводить к нарушению герметичности их тары.

Список сокращений: ФОС - фосфорорганические соединения; ФОП -фосфорорганические пестициды; ФОВ - фосфорорганические отравляющие вещества; ИФБК - иммобилизованный ферментный биокатализатор; ИМК - иммобилизованный микробный консорциум; ОРН - органофосфатгидролаза; Швб-ОРН -гексагистидинсодержащая органофосфатгидролаза; ПДК — предельно допустимая концентрация; АГЛ - 1Ч-ацилгомоссринлактоны; АЫА - М-ацилгомосеринлактоназа из клеток К. егуЛгороШ \У2; Г(-)-клетки бактерий - грамотрицательные клетки бактерий; Г(+)-клетки бактерий - грамположительные клетки бактерий; ПНФ - п-нитрофенол; ПВС -поливиниловый спирт.

ФОС являются высокотоксичными кумулятивными ядами, оказывающими мутагенное воздействие на живые организмы. В процессе биоаккумуляции, как правило, происходит многократное повышение концентрации таких ядов в тканях животных и растений, которые, поступая в качестве продуктов питания в организм человека, вызывают различные заболевания.

В связи с этим разработка эффективных и неагрессивных для человека и окружающей среды способов элиминирования ФОС из почвогрунтов становится чрезвычайно актуальной задачей и представляет большой практический интерес.

Наиболее целесообразным, с экологической точки зрения, является разложение ФОС в почвах in situ с использованием биокатализаторов в виде ферментов и клеток микроорганизмов, обладающих деструктивной активностью по отношению к токсичным ФОС. Интерес к ферментам определяется возможностью их применения для быстрой детоксификации сильнозагрязненных почвогрунтов, а к клеткам микроорганизмов - способностью деградировать ФОС в умеренных концентрациях с одновременной деструкцией продуктов их разложения.

Перспективным ферментным биокатализатором является

органофосфаттидролаза (ОРН, ЕС 3.1.8.1), содержащая гексагистидиновую последовательность (His6-OPH) на N-конце молекулы белка. His6-OPH осуществляет эффективный гидролиз различных ФОС и обладает значительно улучшенными каталитическими характеристиками по сравнению с нативной ОРН. Наряду с этим, в лаборатории экобиокатализа Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова были оптимизированы условия получения Hise-OPH в высокоактивной растворимой форме [Гудков Д.А., 2009], что обеспечивает возможность масштабной наработки этого фермента для применения на практике.

Потенциальными микробными биокатализаторами разложения ФОС являются бактерии родов Rhodococcus и Pseudomonas, широко распространенные в различных почвогрунтах. Бактерии рода Pseudomonas являются известными деструкторами различных ксенобиотиков, в том числе пестицидов, а бактерии рода Rhodococcus — известными деструкторами углеводородов нефти и продуктов разложения ФОС. В предварительном исследовании было показано, что клетки Pseudomonas sp. 78Г эффективно деградируют продукты разложения ФОВ: метилфосфоновую кислоту и ее эфиры. В связи с этим данный микроорганизм использовался при разработке микробных биокатализаторов для детоксификации почвогрунтов, загрязненных ФОС. Помимо этого в работе использовались клетки бактерий Pseudomonas esterophilus, осуществляющие деструкцию эфирных соединений в системах очистки воды, а также клетки Rhodococcus ruber AC-1513D и Rhodococcus erythropolis АС-1514D [Murygina V., 2000], которые разрешены к масштабному применению для очистки почв от нефтепродуктов и могут в потенциале деградировать продукты разложения ФОС.

Применение ферментных и микробных биокатализаторов в иммобилизованном виде выглядит наиболее предпочтительным, поскольку позволяет рассчитывать на увеличение длительности их пребывания в месте введения в почвогрунт, что особенно важно в случае применения на практике при выпадении осадков. При этом иммобилизация направлена на стабилизацию биокатализаторов и часто

обеспечивает возможность их многократного использования в условиях высоких концентраций токсичных субстратов.

Целью данной работы являлась разработка биокаталитических систем на основе иммобилизованных биокатализаторов в виде ферментов и клеток микроорганизмов, предназначенных для деструкции ФОС и продуктов их разложения в почвогрунтах и водных средах.

В ходе работы предполагалось решить ряд основных задач:

- разработать иммобилизованный биокатализатор на основе фермента His6-OPH для гидролиза ФОС в почвогрунтах и определить его основные каталитические характеристики;

- оценить практический потенциал разработанного иммобилизованного биокатализатора на основе фермента His6-OPH (ИФБК) при проведении детоксификации различных образцов почвогрунтов, сильнозагрязненных ФОС;

- разработать иммобилизованный биокатализатор на основе клеток микроорганизмов для детоксификации почвогрунтов, загрязненных ФОС, оптимизировать условия, обеспечивающие получение наиболее эффективного микробного биокатализатора, и проанализировать природу ФОС-деградирующей активности клеток микроорганизмов;

- показать практический потенциал разработанного иммобилизованного биокатализатора на основе клеток микроорганизмов при проведении детоксификации почвогрунтов, загрязненных ФОС.

Научная новизна работы. Впервые создан оригинальный ИФБК на основе фермента His6-OPH и целлюлозосодержащих материалов, предназначенный для введения в почвогрунты, загрязненные высокими концентрациями различных ФОС, с целью их быстрой и высокоэффективной детоксификации.

Впервые разработан искусственный консорциум на основе грамотрицательных (P. esterophilus) и грамположительных (R. ruber AC-1513D) клеток бактерий, предназначенный для очистки водных систем и почвогрунтов от ФОС. Подобраны условия получения наиболее активной иммобилизованной формы этого консорциума, и впервые показана эффективная деградация разных ФОС под действием такого искусственного консорциума, а на примере параоксона продемонстрировано разложение не только самого пестицида, но и продукта его гидролиза - п-нитрофенола (ПНФ).

Впервые выявлена лактоназная и ОРН-активность у грамположительных клеток бактерий R. erythropolis AC-1514D и R. ruber AC-1513D. Показана возможность увеличения этих активностей у клеток при внесении N-ацилгомосеринлактонов (АГЛ) в среды для их культивирования и при использовании сред, полученных после выращивания грамотрицательных клеток Pseudomonas sp. 78Г и Р. esterophilus, продуцирующих АГЛ.

Высказано научно обоснованное предположение о причине успешного действия иммобилизованного микробного консорциума (ИМК), созданного на основе клеток Р. esterophilus и R. ruber AC-1513D и предназначенного для деградации ФОС и детоксификации экосистем. Причина заключается в индукции лактоназной, а следовательно, и ОРН-активности у клеток R. ruber AC-1513D под действием АГЛ, синтезируемых клетками Р. esterophilus при их сокультивировании.

Впервые выявлена лактоназная активность у His6-OPH, проявляющаяся в расщеплении С-О связи в молекулах АГЛ, и предложен механизм действия фермента по отношению к данным субстратам. Установлено, что константы эффективности действия His6-OPH в этих реакциях выше, чем у большинства известных N-ацилгомосеринлактоназ.

Установленная высокая гомология, идентичность активных центров и перекрестная субстратная специфичность N-ацилгомосеринлактоназ из клеток рода Rhodococcus и ОРН позволили обосновать гипотезу эволюционного происхождения ОРН из N-ацилгомосеринлактоназ и сделать вывод о локализации эволюционно изменчивых областей в молекулах данных ферментов в области субстрат-связывающего сайта.

Практическая значимость работы. Предложен технически легко реализуемый способ получения иммобилизованной формы фермента His6-OPH, эффективно действующей при детоксификации почвогрунтов, загрязненных ФОС. Способ представляет собой сорбционную иммобилизацию неочищенного ферментного препарата His6-OPH на целлюлозосодержащих носителях - отходах сельского хозяйства.

Показано, что разработанный ИФБК, полученный на основе делигнифицированной пшеничной соломы и фермента His6-OPH, позволяет эффективно (до 100%) и быстро (< 12,5 сут) проводить разложение различных ФОС (параоксона, диазинона, паратиона, метилфосфоновой кислоты - продукта разложения ФОВ) в концентрации до 850 мг/кг в составе разных по характеристикам природных почвогрунтов. Использование ИФБК предполагает введение в почвогрунты до 59 раз меньшего количества биокатализатора по сравнению с известными аналогами. При этом установлено, что разработанный ИФБК стабилен при длительном хранении в высушенном виде (период полуинактивации 295 сут.).

Показано, что созданный иммобилизованный микробный консорциум (ИМК), состоящий из клеток P. esterophilus и R. ruber АС-1513D, осуществляет деструкцию различных ФОП (параоксона, паратиона, малатиона, диазинона, диметоата, деметона-S) как в водных системах, так и в почвогрунтах, содержащих ФОП до 150 мг/кг почвы-

Показано, что разработанный искусственный ИМК способен проводить эффективную комплексную очистку водных систем с двойным загрязнением - ФОС и углеводородом нефти и, в частности, осуществлять одновременную деградацию параоксона, продукта его разложения - ПНФ и гексадекана с высокими степенями конверсии.

Выявленная лактоназная активность у His6-OPH позволяет рассматривать этот фермент не только как биокатализатор для разложения ФОС, но и как потенциальное средство, способное повышать эффективность действия антимикробных препаратов, направленных против ассоциаций патогенных грамотрицательных клеток бактерий, вырабатывающих АГЛ, как фактор собственной устойчивости. Это свойство фермента может быть использовано для целей биомедицины, в ветеринарии и для решения вопросов химической и биологической безопасности.

Обнаруженные N-ацилгомосеринлактоназы с ОРН-активностью, присутствующие в клетках бактерий рода Rhodococcus, открывают новые возможности активного применения природных штаммов данных микроорганизмов в процессах деградации ФОС. При этом уровень ОРН-активности у клеток бактерий может регулироваться путем внесения АГЛ в среды их культивирования (в том числе и в почвы), как виде чистых веществ, так и в составе сред, полученных после культивирования грамотрицательных клеток бактерий.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный иммобилизованный биокатализатор на основе His6-OPH с высокой эффективностью действия при детоксификации почвогрунтов, загрязненных ФОС.

2. Разработанный искусственный иммобилизованный микробный консорциум на основе клеток бактерий родов Rhodococcus и Pseudomonas, осуществляющих деградацию ФОС, а также одновременную деструкцию ФОП, продукта его разложения и углеводорода нефти (гексадекана). Наличие внутренней регуляции ОРН-активности консорциума.

3. Наличие лактоназной и ОРН-активности у клеток R. eryíhropolis AC-1514D и R. ruber AC-1513D. Индукция биосинтеза N-ацилгомосеринлактоназы с ОРН-активностью в клетках бактерий рода Rhodococcus. Способность клеток R. eryíhropolis AC-1514D и R. ruber АС-1513D осуществлять деструкцию различных ФОП.

4. Наличие лактоназной активности у His6-OPH по отношению к различным АГЛ. Гипотеза эволюционного происхождения ОРН от N-ацилгомосеринлактоназ и локализация эволюционно вариабельных областей в молекулах N-ацилгомосеринлактоназ.

Личный вклад автора состоял в планировании экспериментов, обработке экспериментальных данных, их анализе и трактовке. При этом в ходе выполнения работы автор применил различные современные подходы и методы исследования ферментов и клеток микроорганизмов. Также автор принимал активное участие в подготовке к публикации полученных результатов работы и их популяризации на международных научных форумах.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на: XVIII Mendeleev Congress on General and Applied Chemistry (Russia, Moscow, 2007), VIII Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика» (Россия, Москва, 2009), 6-ой Международной конференции «Сотрудничество для решения проблемы отходов» (Украина, Харьков, 2009), XVIII International conference on Bioencapsulation (Portugal, Porto, 2010), Всероссийской научной конференции «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в агропромышленном комплексе России» (Россия, Москва, 2010), Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Россия, Москва, 2009), Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Россия, Москва, 2010), 5-ой Научно-практической конференции «Научно-технические аспекты обеспечения безопасности при уничтожении, хранении и транспортировке химического оружия»

(Россия, Москва, 2010), XIX International conference on Bioencapsulation (France, Amboise, 2011), XI Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы (Россия, Москва, 2011), Выставке «Технологии специального назначения» МГУ имени М.В. Ломоносова (Россия, Москва, 2012), Девятом московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Россия, Москва, 2013). Работа отмечена стипендией Президента РФ в 2012 г.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 статей из списка ВАК, 2 Патента РФ и 12 тезисов докладов на международных и российских конференциях.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 171 страницу печатного текста, 59 рисунков, 44 таблицы, 235 ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Экспериментальная часть

Объекты и методы исследования

Для получения фермента His6-OPH в работе использовались клетки бактерий Е. coli SG13009[pREP4], трансформированные плазмидой pTES-His6-OPH [Патент РФ № 2255975]. Биомасса клеток-продуцентов подвергалась ультразвуковой дезинтеграции, клеточный дебрис отделялся центрифугированием. Полученный супернатант, содержащий 15% His6-OPH от массы всех белков, использовался для разработки ИФБК и для выделения целевого фермента. Для получения ИФБК применялся клеточный супернатант, разбавленный в 50 раз, со следующими характеристиками: органофосфатгидролазная активность - 200±10 Ед/мл, концентрация общего белка - 240±20 мг/л.

Для получения ИФБК при выборе носителей клеточный супернатант, содержащий His6-OPH (200 Ед/мл, 0,1 М фосфатный буфер, pH 7,4), смешивался с сухим носителем, и полученная смесь выдерживалась в течение определенного периода времени. Определение сорбционной емкости носителей проводилось на основании данных по концентрации общего белка (метод Брэдфорд), остающегося в растворе над носителем, и на основании электрофоретического анализа этих растворов с оценкой доли (%) His6-OPH (программа UN-SCAN-II gel 6.1).

ОРН-активность ИФБК и растворимого фермента определялась спектрофотометрически (Agilent UV-853, Германия) по накоплению продукта 4-нитрофенолят аниона (£=18500 М"1см"1, pH 10,5, X = 405 им). За единицу ферментативной активности принимали концентрацию фермента, осуществляющую гидролиз 1 мкмоля субстрата в минуту при 20°С.

Для получения ИМК в работе использовались клетки микроорганизмов: R. erythropolis AC-1514D, R. ruber AC-1513D [Murygina V., 2000], Pseudomonas species 78Г [Харечко А.Т., 2000], Pseudomonas esterophilus VKM V-1436D [Доронина H.B., 2006; Синяк Ю.Е, 2010].

Для проведения иммобилизации осадок влажной биомассы выращенных клеток смешивался с 10%-ным водным раствором поливинилового спирта (ПВС, ~84 кДа) и

суспендировался до получения однородной гомогенной 10-30% (по массе) суспензии клеток [Efremenko E.N., 2007]. Для формирования гранул разного размера приготовленная смесь в разных объемах вносилась в ячейки 96-луночных планшетов, которые затем замораживались при -20°С, выдерживались при этой температуре в течение 24 ч, а затем размораживались, и сформировавшиеся гранулы использовались в экспериментах.

Изменение концентрации ФОС в почвогрунтах и водной среде контролировалось хроматографически (ВЭЖХ-хроматограф Knauer Smartline Pump 1000 со спектрофотометрическим детектором, колонка NUCLEODUR С!8 РАН (5мкм, 4,0x250мм), элюент - ацетонитрил:вода (60:40)) с предварительной экстракцией исследуемых соединений органическими растворителями.

Определение лактоназной активности у клеток и фермента проводилось спектрофотометрически согласно известной методике [Chow J.Y., 2006] с использованием рН-индикатора крезолового красного (е = 13000 М~'см X = 570 нм) в 0,625 мМ бициновом буфере, содержащем 0,1 М NaCl (pH 8,2).

Наличие АГЛ в средах, полученных после культивирования клеток бактерий Pseudomonas sp. 78Г, Pseudomonas esterophilus, определялось известным из литературы методом с использованием микроорганизма-биоиндикатора [Steindler L. 2007; Zhu J., 2003], в качестве которого применялись светящиеся клетки бактерий Photobacterium phosphoreum АТСС 11040. Помимо этого проводилось хроматографическое определение АГЛ в исследуемых средах согласно [Li X., 2006].

Анализ ферментов, присутствующих в клетках рода Rhodococcus, проводился с использованием программного обеспечения BLASTP 2.2.27 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Для этого проводились выравнивание аминокислотной последовательности ОРН (Uniprot, code Р0А434) и аминокислотных последовательностей белков, содержащихся в клетках рода Rhodococcus (taxID:1827).

Множественное выравнивание проводилось с использованием программного обеспечения T-Coffee (http://tcoffee.crg.cat/).

Результаты и обсуждение

1. Разработка иммобилизованного биокатализатора на основе фермента HiSfi-OPH и применение его для детоксификации почвогрунтов

При разработке иммобилизованного ферментного биокатализатора (ИФБК) для разложения ФОС в почвогрунтах в качестве носителей использовались природные материалы, обладающие низкой стоимостью, экологичностью, возможной биодеградируемостью и способностью обеспечить простой и технически легко реализуемый способ иммобилизации с минимальным количеством стадий. В связи с этим для получения иммобилизованного биокатализатора проводилась сорбция неочищенного ферментного препарата, содержащего His6-OPH, на природных носителях (Рис. 1).

Анализ показал, что максимальной активностью обладали образцы ИФБК, полученные на основе целлюлозосодержащих материалов, среди которых наиболее активные биокатализаторы формировались с использованием пшеничной и рисовой соломы. Такая закономерность, в первую очередь, была связана с сорбционной

емкостью носителей и их влиянием на сорбированный фермент. В дальнейших исследованиях в качестве носителя применялась пшеничная солома, поскольку она представляет собой наиболее доступное сырье на территории РФ.

100 806040 20

0

fi

I 1 - аи-ивность ИФБК У//Л - концентрация фермента на носителе

Рз

1

г *

70

5

60 | 50 \

О

S

40.1."

ta

30 s ь 20 g s

10 u в

За 100% принята активность ИФБК, полученного на основе рисовой СОЛОМЫ (162±8 Ед/гсухого носителя)

Рис. 1. Активность ИФБК и концентрация Швб-ОРН, иммобилизованной на различных носителях

(21±1°С):

1 - пшеничная солома

2 - рисовая солома

3 - дубовые опилки

4 - березовые опилки

5 - еловые опилки

6 - сосновые опилки

7 - вермикулит

8 - активированный уголь

9 - сибунит

10 - кварцевый песок

11 - диатомовая мука

С целью повышения гидрофильности носителя и увеличения площади поверхности для иммобилизации фермента была проведена щелочная делигнификация пшеничной соломы (обработка 1% NaOH в течение 1 ч при 100иС). Помимо этого были установлены условия получения наиболее активного ИФБК на основе такого предобработанного носителя (Рис. 2): 10 г делигнифицированной пшеничной соломы смешивались с 30 мл клеточного супернатанта (плотность 1 г/мл), содержащего His6-OPH, с активностью 200 Ед/мл, длительность формирования наиболее активного биокатализатора составляла 0,5 ч. Объем раствора с иммобилизуемым ферментом соответствовал влагоемкости сухого носителя. Активность получаемого биокатализатора составляла 412±10 Ед/гсух0Г0 носителя, при этом рассчитанное количество His6-OPH на носителе было ~108 мкг/гсухого носителя- С учетом описанного выше метода иммобилизации можно заключить, что на основе 1 г сухого носителя может быть получено 4 г влажного ИФБК, активность которого составляет 103±3 Ед/гифбк-

Разработанный ИФБК в концентрации 3 Гифбк/кг использовался для детоксификации различных почвогрунтов (Табл. 2), загрязненных параоксоном (630 мг/кгпочвогрунта), диазиноном (850 мг/кгпочвогрунта), паратионом (185 мг/кгПОчвогрунта), и в концентрации 5 Гифбк/кт - для гидролиза метилфосфоновой кислоты (100

мг/кгп,

а), которая является продуктом разложения ФОБ. Для этих же целей в

почвогрунты вводился нативный фермент в составе клеточного супернатанта с той же суммарной Швб-ОРН-активностью (—300 и 500 Ед/кгПОчвогрунта)- Для данного эксперимента были взяты сильнозагрязненные почвогрунты, содержащие ФОС в концентрациях, превышающих ПДК (~0,5 мг/кг) до 1700 раз. Было установлено, что введение ИФБК в такие почвогрунты обеспечивало 100% разложение всех указанных концентраций ФОС менее, чем за 12,5 суток (Рис. 3). При этом в таких

же условиях свободный фермент, по-видимому, инактивировался достаточно быстро.

Рис. 2. Внешний вид ИФБК, созданного на основе делигнифицированной пшеничной соломы и ЬШб-ОРН.

Таблица 2. Характеристики образцов почвогрунтов, загрязненных ФОС.

Тип почвы pH Влажность, % Гумус, %

Песчаная 7,4±0,2 90±3 0,0±0,2

Серая лесная 6,5±0,3 71±4 5,1±0,3

Каштановая 8,0±0,2 82±5 2,1±0,1

Чернозем 7,0±0,2 75±5 6,7±0,4

Рис. 3. Разложение 185 мг/кг паратиона (А), 850 мг/кг диазинона (Б), 630 мг/кг параоксона (В), 100 мг/кг метилфосфоновой кислоты (Г) под действием разработанного

ИФБК (—) и нативного фермента His6-OPH (---) в почвогрунтах: ▲ - песчаной почве,

Д - каштановой почве, о- серой лесной почве, ■ - черноземе, 21±1°С. Среднее отклонение определяемых величин не превышало 5%.

На примере параоксона было показано, что повторное загрязнение песчаной почвы, уже содержащей введенный ИФБК, тем же количеством пестицида (630 мг/кг) приводило к его 100% разложению за тот же период времени. Это

свидетельствовало о возможности многократного применения in-situ разработанного биокатализатора для деградации ФОС.

Кроме успешного гидролиза ФОС, также была показана возможность длительного хранения высушенных образцов ИФБК при 8°С, период полуинактивации (Т1/2) которых составил 295 сут.

Исследование изменения активности ИФБК при длительном промывании, имитирующем природные осадки, показало, что происходит лишь незначительное (~ 10%) элюирование целевого фермента, и активность биокатализатора сохраняется достаточно высокой (72±5 Ед/гифбк)-

Исследование зависимости активности ИФБК от pH и температуры реакционной среды показало, что происходит расширение (до 10%) pH- и температурного оптимумов действия иммобилизованной His6-OPH по сравнению с нативным ферментом. Таким образом, следует ожидать, что созданный ИФБК может быть успешно применен в теплое время года (15-30°С) в условиях реальных почвогрунтов (pH 6,0-9,0).

2. Микроорганизмы и консорциумы на основе микроорганизмов для детоксификации ночвогрунтов и водных систем, загрязненных ФОС

2.1. Деградация ФОС и продуктов их разложения под действием иммобилизованных клеток бактерий

Анализ литературных данных показал, что большинство клеток, осуществляющих разложение ФОС, используются в высоких концентрациях (106108 кл/гпочвы). Это позволяет не только увеличить начальную скорость деградации ФОС, но и стабилизировать микроорганизмы в неблагоприятных условиях за счет их перехода в устойчивое состояние «кворума» (Quorum sensing). Состояние кворума связано с генетическим ответом клеток бактерий на увеличение их концентрации и, как правило, выражается в изменении биохимического состава клеток и формировании повышенной устойчивости микроорганизмов к различным внешним неблагоприятным факторам. Суть этого явления для Г(-)-бактерий, которые являются наиболее известными деструкторами ФОС, состоит в том, что в процессе роста и накопления биомассы они синтезируют N-ацилгомосеринлактоны (АГЛ), которые являются автоиндукторами экспрессии «молчащих» генов, отвечающих за формирование резистентности у данных бактерий.

Стоит отметить, что иммобилизация клеток микроорганизмов направлена на создание и поддерживание высоких концентраций клеток бактерий, что может искусственно приводить их к состоянию «кворума» [Ефременко E.H., 2009] и тем самым способствовать повышению их стабильности при последующем функционировании.

Таким образом, использование иммобилизованных клеток бактерий в состоянии «кворума» должно обеспечить наиболее эффективную детоксификацию почвогрунтов, загрязненных ФОС.

В этой связи Г(-)-клетки бактерий Pseudomonas esterophilus и Pseudomonas sp. 78Г и Г(+)-клетки бактерий Rhodococcus ruber AC-1513D и Rhodococcus erythropolis AC-1514D были иммобилизованы в криогель поливинилового спирта (ПВС) (10%-

ный раствор полимера, содержание биомассы 10% масс.) и далее использованы для деградации параоксона (Табл. 3).

Применение именно криогеля ПВС в качестве носителя для иммобилизации клеток бактерий было обусловлено его превосходными характеристиками: механической прочностью, макропористостью, химической стабильностью. Помимо этого важными достоинствами криогеля ПВС являются доступность полимера, его нетоксичность и биосовместимость, а также относительная простота методики формирования носителя (процедура замораживания-оттаивания) [Лозинский В.И., 1998].

Было установлено, что все иммобилизованные в криогель ПВС клетки микроорганизмов, используемые в работе, способны осуществлять деградацию параоксона, при этом Г(-)-клетки бактерии деградируют пестицид более эффективно (Табл. 3). Также было показано, что все исследованные клетки бактерий утилизируют продукт разложения параоксона - п-нитрофенол (ПНФ).

Таблица 3. Параметры деградации 0,15 мМ параоксона и образующегося ПНФ (24 ч) в водной среде под действием иммобилизованных в криогель ПВС клеток микроорганизмов (20 г^^оц/л), 21±1°С. У0 - начальная скорость деградации._

Vo параоксона, мкМ/ч Степень Степень

Микроорганизм деградации деградации

параоксона, % ПНФ, %

Г(-)-клетки бактерий

P. esterophilus 7,2 ± 0,2 74 ±3 45 ±3

Pseudomonas sp. 78Г 7,4 ± 0,3 78 ±4 68 ±4

Г(+)-клетки бактерий

R. ruber AC-1513D 2,0 ± 0,2 34 ±3 27 ±3

R. erythropolis AC-1514D 2,0 ± 0,2 13±3 20 ±3

Способность клеток R. ruber AC-1513D и R. erythropolis AC-1514D деградировать параоксон была обнаружена впервые. В связи с этим была исследована их каталитическая активность в отношении других пестицидов (Табл. 4), и впервые было установлено, что и те, и другие клетки способны деградировать различные ФОП.

Таблица 4. Параметры деградации ФОП (0,2 мМ) в водной среде за 24 ч под действием иммобилизованных клеток (20 Гю^о/п) Я. егуЛгороНэ и Я.гиЬег( 21±1°С).

Пестицид R. erythropolis AC-1514D R. ruber AC-1513D

V0, мкМ/ч Степень деградации, % V0, мкМ/ч Степень деградации, %

малатион 8,4 ± 0,4 89 ±5 12,0 ±0,4 95 ±5

деметон-S 3,6 ± 0,2 26 ±4 2,4 ± 0,2 27 ±4

диазинон 2,4 ± 0,2 24 ±4 7,8 ±0,2 60 ±5

диметоат 1,8 ±0,1 14 ±4 2,4 ±0,1 16 ± 4

2.2. Иммобилизованный консорциум на основе клеток бактерий, осуществляющих деградацию ФОС

Поскольку клетки бактерий родов Pseudomonas и Rhodococcus широко распространены и успешно сосуществуют в различных почвогрунтах, то для деструкции ФОС было решено создать консорциум на их основе. При этом ожидалось, что созданные консорциумы позволят решить ряд комплексных задач по одновременной деградации различных загрязнителей, а также смогут осуществить более глубокую деградацию ФОС и продуктов их разложения.

Иммобилизованные микробные консорциумы (ИМК) были составлены в виде смеси гранул с индивидуально иммобилизованными в криогель ПВС клетками бактерий Pseudomonas sp. 78Г, Р. esterophilus, R.erythropolis AC-1514D, R.ruber AC-1513D, взятыми в различных сочетаниях. Для определения ФОС-деградирующей способности созданные ИМК вводились в среду, содержащую 0,15 мМ параоксона. Общая концентрация иммобилизованных клеток в отдельном эксперименте составляла 20 Гщеток/л (Рис. 4).

100

. 90

Нп

rh

dh

rfi

r*i

rh

cb

Нл

1. Ps2 + Rh,

2. Rh, + Rh2

3. Psi + Rh,

4. P. esterophilus + R. ruber AC-1513D

5. Ps2 + Psi

6. Ps, + Rh2

7. Ps,+ Rh, +Rh2

8. Ps2 + Rh,+Rh2

9. Ps, + Ps2 + Rh,

10. Ps, + Ps2 + Rh2

11. Rh, + Rh2 + Ps, +Ps2

Рис. 4. Степень деградации 0,15 мМ параоксона (24 ч) под действием созданных ИМК (20 Гшеток/л), 21±1°С. Обозначения: Pseudomonas sp. (Ps,), P. esterophilus (Ps2), R. erythropolis AC-1514D (Rh,), R.ruber AC-1513D (Rh2). Серым выделены теоретически ожидаемые степени деградации, жирными линиями - экспериментальные.

Варьирование состава консорциума показало, что наибольшая степень деградации параоксона (84±5%) наблюдалась для ИМК, полученного на основе клеток R. ruber AC-1513D и P. esterophilus (Рис. 4). Для данного ИМК также была получена наибольшая разница (-31%) между экспериментальной и теоретически ожидаемой степенями деградации. Теоретически ожидаемая степень деградации -это сумма степеней деградации пестицида отдельными культурами, входящими в состав консорциума. Наряду с этим начальная скорость деградации параоксона данным ИМК была в 1,2 раз выше теоретической величины и составила 7,2±0,2 мкМ/ч.

Также произошло увеличение в 2,2 раза степени деградации ПНФ, образующегося в процессе разложения параоксона, по сравнению с теоретически ожидаемой величиной.

Таким образом, очевидно, что клетки бактерий R. ruber 1513D и P. esterophilus, находясь в единой ассоциации, оказывали взаимовыгодное влияние друг на друга, в результате чего степени деградации параоксона и ПНФ увеличивались при их совместном использовании в составе консорциума.

Далее был проведен подбор условий получения наиболее активного ИМК, взятого изначально в виде смеси гранул с отдельно иммобилизованными культурами R. ruber AC-1513D и P. esterophilus (Рис. 5, Стадия 1). С целью уменьшения диффузионных ограничений клетки бактерий были иммобилизованы в одну гранулу криогеля ПВС, что привело к увеличению скорости деградации параоксона на 30% (Рис. 5, Стадия 2). Изменение соотношения клеток внутри носителя показало, что наибольшая скорость деградации (увеличение на 67% по сравнению с начальной величиной) той же концентрации параоксона соответствовала варианту, когда клетки P. esterophilus и R. ruber AC-1513D были взяты в соотношении 2:1 по массе (Рис. 5, Стадия 3). С увеличением биомассы иммобилизованных клеток с 10% до 30% (масс.) скорость деградации параоксона не изменялась (Рис. 5, Стадия 4), но увеличилась операционная стабильность получаемого ИМК, для которого также была показана возможность многократного использования. С целью дальнейшего снижения диффузионных ограничений размер гранул криогеля ПВС с консорциумом был уменьшен с 250±20 до 50±10 мкл, при этом скорость деградации параоксона увеличилась суммарно на 108% по сравнению с начальным уровнем (Рис. 5, Стадия 5).

16

V

S 14

Я s

я 12 К

0

1 10

cd о.

с 8 >°

п.

+

Рис. 5. Изменение начальной

скорости деградации 0,15 мМ параоксона в водной среде под

действием ИМК (20 гклеток/л) в

процессе подбора условий

получения наиболее активного консорциума (21±1°С).

1 2 3 4 5 Стадия

Таким образом, условия получения наиболее активного ИМК были следующие: клетки бактерий P.esterophilus и R. ruber AC-1513D, взятые в соотношении 2:1, иммобилизовались в концентрации 30% (масс.) в одну гранулу криогеля ПВС, объем которой составлял 50±10 мкл. Скорость деградации параоксона таким ИМК увеличилась в 2,1 раза по сравнению с исходным значением.

Было показано, что разработанный ИМК способен осуществлять высокоэффективную деградацию различных ФОП, при этом уже через сутки степень деградации большинства из пестицидов была больше 90% (Табл. 5).

Разработанный ИМК был использован для решения комплексной задачи по одновременной деградации различных загрязнителей в водной системе: параоксона (0,50 мМ), как пестицида, и гексадекана (56,2 мМ), как углеводорода нефти. Оказалось, что по сравнению с иммобилизованными клетками отдельных культур P. esterophilus и R. ruber AC-1513D, входящих в состав данного ИМК, консорциум

осуществлял намного более полную и эффективную утилизацию всех исследованных соединений: параоксона, гексадекана и ПНФ (Табл. 6).

Также было показано, что созданный ИМК успешно функционировал в различных системах, в которых одновременно варьировались концентрации пестицида (0,16-0,5-0 мМ) и углеводорода нефти (14,2-56,3 мМ).

Таблица 5. Параметры деградации 0,15 мМ ФОП под действием созданного ИМК (20 Гклеток/л) в водной среде за 24 ч, 21±1°С. ___

ФОП Vo, мкМ/ч Степень деградации, % ФОП V0, мкМ/ч Степень деградации, %

паратион 12,0±0,3 96±4 малатион 24,0±0,4 100±4

метил-паратион 10,2±0,3 83±5 хлор-пирифос 18,0±0,3 100±4

диазинон 19,2±0,3 100±4 деметон-S 13,2±0,3 91±5

диметоат 8,4±0,2 74±4 параоксон 15,0±0,3 95±5

Таблица 6. Степень деградации параоксона (0,50 мМ, 2 сут.), гексадекана (56,3 мМ, 2 сут.) и образующегося ПНФ (6 сут.) под действием иммобилизованных клеток P. esterophilus, R. ruber AC-1513D и составленного на их основе ИМК (21±1°С).

Степень деградации, %

Соединение Р. R. ruber АС- ИМК

esterophilus 1513D (P. esterophilus : R. ruber = 2:1)

параоксон 71± 5 28 ±4 97 ±5

гексадекан - 82 ±5 88 ±5

ПНФ 41 ±3 23 ±3 82 ±5

Разработанный ИМК был использован для детоксификации песчаной почвы (рН 7,5), искусственно загрязненной параоксоном в концентрации 150 мг/кг, превышающей ПДК (~0,5 мг/кг) в 300 раз. Введенный в почвогрунт ИМК (108 кл/Гпочвы) полностью деградировал параоксон в течение 20 суток (Рис. 6), тогда как в контроле (без клеток) разложение параоксона было не более 11%.

Время, сут

Рис. 6. Деградация параоксона (150 мг/кг) в песчаной почве (рН 7,5) под действием ИМК (о) на основе клеток P. esterophilus и R. ruber AC-1513D (21±1°С). В качестве контроля (Ж) использовалась песчаная почва (рН 7,5), содержащая параоксон (150 мг/кг) без внесения клеток бактерий.

3. Природа каталитической активности клеток рода Rhodococcus в отношении различных ФОС

3.1. Анализ аминокислотных последовательностей, присутствующих в клетках рода Rhodococcus

Поскольку в рамках этой работы впервые была установлена способность клеток R. erythropolis AC-1514D и R. ruber AC-1513D деградировать различные ФОП (Табл. 4), то с целью определения ферментов, ответственных за деградацию пестицидов данными клетками, был проведен сравнительный анализ (BLASTP 2.2.27, E-value в диапазоне 10"52-10"33) аминокислотных последовательностей белков, присутствующих в клетках рода Rhodococcus, согласно известной базе данных http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, и фермента ОРН (ЕС 3.1.8.1) (Табл. 7).

Таблица 7. Клетки рода Rhodococcus, содержащие ферменты, гомологичные ОРН.

Микроорганизм Предполагаемый фермент

R. equi 103S, R. equi АТСС 33707, R. opacus М213, Rhodococcus sp. JVH1 R. imtechensis RKJ300, R. opacus PD630 R. jostii RHA1 ферменты, подобные N-ацилгомосерин-лактоназам

R. opacus PD630, R. erythropolis SK121, Rhodococcus sp. MP50, R. erythropolis PR4, Rhodococcus sp. SQ1, Rhodococcus sp. 3008, R. pyridinivorans AK37 N-ацилгомосерин-лактоназа

Анализ белков, обнаруженных в различных клетках бактерий рода Rhodococcus показал, что эти микроорганизмы содержат ферменты N-ацилгомосеринлактоназы, катализирующие гидролиз тех самых N-ацилгомосеринлактонов (АГЛ), которые синтезируются Г(-)-клетками бактерий, в частности, рода Pseudomonas, в качестве компонентов системы «кворума»:

О н N-ацилгомосерин- о ^

S. —rRl + H+

N—< о r2

R,:- О или Н; Rji СН3 - С10Н21

Эти ферменты в сравнении с ОРН характеризовались высокой идентичностью (28-33%) и гомологией (46-51%) с полным совпадением всех аминокислотных остатков, формирующих активный центр ОРН (Н55, Н57, Ki69, Н2оь Н2зо, D30i).

На данный момент единственной N-ацилгомосеринлактоназой, выделенной из клеток рода Rhodococcus, является фермент AhlA из клеток R. erythropolis W2. Из литературы известно, что AhlA способна осуществлять медленный гидролиз параоксона с Кэфф, равной 0,5 M'V [Afriat L., 2006].

В этой связи в работе было выдвинуто предположение о том, что именно N-ацилгомосеринлактоназы, присутствующие в клетках Rhodococcus, могут быть ответственны за деградацию ФОП данными клетками.

Учитывая это, была исследована лактоназная активность у клеток R. erythropolis AC-1514D и R. ruber AC-1513D, использованных в этой работе (Табл. 8). Оказалось, что гидролитическая активность клеток по отношению к

различным по строению АГЛ была в 129-418 раз выше их активности по отношению к параоксону. Это позволило предположить, что данные клетки содержат именно N-ацилгомосеринлактоназы, обладающие ОРН-активностью.

Таблица 8. Гидролиз лактонов (0,625 мМ) и параоксона (0,625 мМ) под действием клеток (30 г клеток/л) R. erythropolis AC-1514D и R. ruber AC-1513D (21±1°С). Обозначение лактонов: С0 - L-гомосеринлактон гидрохлорид, С4-АГЛ - N-6yrapmi-D,L-гомосеринлактон, С6-АГЛ - Ы-гексил-Ь-гомосеринлактон, С8-АГЛ - N-(3-okcookthji)-L-гомосеринлакгон, Сю-АГЛ - Ы-(3-оксодецил)-Ь-гомосеринлактон, С12-АГЛ - N-(3-оксододецил)-Ь-гомосеринлактон._

Субстрат Обозначение Активность, Ед/гСу,и, клеток

R. erythropolis AC-1514D R. ruber AC-1513D

о Со 1,5 ±0,2 2,2 ±0,1

° н с4-агл 4,6 ±0,1 6,0 ±0,1

О н o^-sr—— сб-агл 4,4 ± 0,2 6,1 ±0,2

8 V W о о с8-агл 4,6 ±0,1 6,2 ±0,1

о н О^м^-^------------ Woo сш-агл 4,0 ± 0,2 5,5 ±0,1

О н \—Г о о с12-агл 3,9 ± 0,2 4,7 ± 0,2

о qhso-p-o—^л-мо, осгн5 пара-оксон 0,011 ±0,001 0,017 ±0,002

На примере R. ruber AC-1513D было показано, что наибольшая лактоназная активность у клеток (7,0±0,2 Ед/гсухих клеток, Cg-АГЛ) проявляется при добавлении в среду их культивирования 0,1 мМ ионов Zn2+. Эти данные коррелируют с известными из литературы, согласно которым N-ацилгомосеринлактоназа AhlA проявляет наибольшую лактоназную активность при наличии иона Zn2+ в активном центре фермента [Afriat L., 2006].

Далее было установлено, что введение различных АГЛ (50 мкМ) в среду культивирования (с 0,1 мМ Zn2+) клеток R. ruber AC-1513D (при OD540 = 0,1) приводило к увеличению их лактоназной и ОРН-активности (до 1,5 раз) по сравнению с активностью клеток, выращенных в среде (с 0,1 мМ Zn2+) без добавления АГЛ. Так, лактоназная активность индуцированных клеток была равна 10,2, 11,0, 10,7, 9,9, 8,5 Ед/гсухих кле™, а ОРН-активность 0,022, 0,026, 0,024, 0,024, 0,022 Ед/гсухихклеток для С4-, С6-, С8-, Сю-, Cn-АГЛ, соответственно.

Следует отметить, что, согласно протеомной и геномной базе данных (http://www.uniprot.org), масса N-ацилгомосеринлактоназ, присутствующих в клетках рода Rhodococcus, равна -34-35 кДа. С учетом этого был проведен электрофоретический анализ образцов супернатантов, полученных после

ультразвуковой дезинтеграции клеток R. ruber AC-1513D, выращенных в среде, содержащей (дорожка I) и не содержащей (дорожка II) Cg-АГЛ. Интенсивность окраски белковых полос полученной электрофореграммы была проанализирована с использованием программы UN-SCAN-II gel 6.1. При этом доля белка в препарате (%) приравнивалась к интенсивности окраски его полосы. Было установлено, что при относительном постоянстве общего белкового состава супернатантов полоса на 34 кДа была в 1,5 раза интенсивнее на дорожке I, чем на дорожке II. Это свидетельствовало о том, что Cg-АГЛ, присутствовавший в среде культивирования, индуцировал биосинтез N-ацилгомосеринлактоназы в клетках R. ruber AC-1513D, что приводило к увеличению их ОРН- и лактоназной активности в те же 1,5 раза. Вероятно, аналогичным образом на клетки R. ruber AC-1513D действовали все исследованные АГЛ.

Таким образом, показано, что различные по строению АГЛ могут осуществлять индукцию биосинтеза N-ацилгомосеринлактоназы в клетках R. ruber AC-1513D.

С учетом результатов предыдущего эксперимента было выдвинуто предположение о том, что биосинтез N-ацилгомосеринлактоназ в клетках R. erythropolis AC-1514D и R. ruber AC-1513D могут индуцировать не только чистые АГЛ, а также АГЛ, выделяемые Г(-)-клетками бактерий Pseudomonas sp. 78Г и P. esterophilus, которые использовались в этой работе при создании консорциума.

Предварительные эксперименты показали, что эти бактерии обладают системой «кворума» и секретируют АГЛ, которые накапливаются в среде их культивирования. Данные среды, отделенные от клеток Pseudomonas sp. 78Г и Р. esterophilus, использовались для экспонирования (в течение 15 ч) в них иммобилизованных в криогель ПВС клеток R. erythropolis AC-1514D и R. ruber АС-1513D в концентрации 5 Гклс-шк/л. В результате, лактоназная и ОРН-активность экспонированных клеток R. erythropolis AC-1514D увеличивалась до 2,0 раз, а клеток R. ruber AC-1513D - до 3,0 раз по сравнению с неэкспонированными клетками. При этом синхронное увеличение обеих активностей в одинаковое количество раз подтверждало предположение о том, что ОРН-активность клеток R. erythropolis AC-1514D и R. ruber AC-1513D связана с присутствием в них N-ацилгомосеринлактоназ.

Таким образом, было показано, что образцы сред, полученные после культивирования клеток рода Pseudomonas, способны индуцировать биосинтез N-ацилгомосеринлактоназ в клетках рода Rhodococcus.

3.2. Анализ принципа функционирования консорциума, состоящего из клеток Р. esterophilus и R. ruber AC-1513D

Полученные данные позволили предположить принцип, по которому функционирует созданный в этой работе консорциум, состоящий из клеток Р. esterophilus и R. ruber AC-1513D. Стоит напомнить, что степени деградации параоксона и ПНФ увеличивались при совместном использовании этих бактерий в составе консорциума. Синергетический эффект от взаимодействия данных микроорганизмов, заключался, очевидно, в следующем: клетки бактерий Р. esterophilus секретировали в среду АГЛ, которые индуцировали биосинтез N-ацилгомосеринлактоназы с ОРН-активностью в клетках R. ruber AC-1513D.

Результатом такого взаимодействия являлось увеличение общей ОРН-активности консорциума в процессах деградации ФОС (Рис. 7).

Г(-)-клетки бактерий P. esterophilus секретируют АГЛ

I

Г(+)-клетки бактерий R. ruber АС-\5\ЪТ>

Увеличение биосинтеза N-ацилгомосеринлактоназы с ОРН-активностью

Рис. 7. Схема, отображающая принцип взаимодействия Г(+)-клеток бактерий R. ruber АС-1513D и Г(-)- клеток бактерий P. esterophilus.

4. Взаимосвязь ОРН и N-ацилгомосеринлактоназ

4.1. Активность His<;-OPH по отношению к различным N-ацилгомосери нлактонам

Поскольку были обнаружены высокая гомология и идентичность N-ацилгомосеринлактоназ и ОРН с полным совпадением аминокислотных остатков, формирующих активный центр ОРН, а также из литературы стала известна способность фермента AhlA катализировать гидролиз параоксона, то исследование наличия лактоназной активности у His6-OPH по отношению к различным АГЛ представляло большой научно-практический интерес.

Анализ литературных данных показал, что ОРН способна катализировать гидролиз С-О связи в молекулах лактонов, но не ряда АГЛ (Рис. 8).

В данной работе впервые было показано, что фермент His6-OPH катализирует гидролиз различных по строению АГЛ, и для всех исследованных субстратов были определены каталитические константы гидролиза (Табл. 9).

/ О О О /

cxf <1 OL <i

Рис. 8. Лактоны, гидролизующиеся под дейтвием ОРН [Айа1 Ь., 2006; 11оос1уе1<11 С., 2005]. 1 - дигидрокумарин, 2 - тиобутиролактон, 3 - 4-тио-этилбутиролактон, 4 - 4-тио-бутилбутиролактон. Стрелками показана связь, расщепляемая под действием фермента.

Субстрат* Ки, мкМ VMaKc/Eo5 с1 (VMaKC/E0)/ К„, М"1*^1

Со 306 ± 10 4,69 ± 0,07 (1,53 ± 0,07)*104

с4-агл 412 ± 6 2,62 ± 0,02 (6,35±0,14)*103

с6-агл 526 ±9 3,17 ±0,02 (6,35 ± 0,15)*103

с8-агл 608 ±8 4,66 ± 0,03 (7,66 ± 0,15)* 103

сю-агл 184 ±4 2,67 ± 0,03 (1,45 ± 0,15)*104

С, 2-агл 101 ± 7 1,83 ±0,05 (1,81±0,16)*104

* Структура субстратов представлена в Табл. 8.

С учетом известного механизма гидролиза ФОС под действием His6-OPH [Ефременко E.H., 2004] была предложена схема механизма гидролиза АГЛ под действием данного фермента (Рис. 9), согласно которой в ходе реакции один ион Со2+ активного центра координирует оксогруппу лактонного кольца молекулы АГЛ и повышает электрофильность углеродного центра, а другой ион Со2+ служит промотором нуклеофила (гидроксид-иона), который генерируется из мостиковой молекулы воды между двумя ионами металла и осуществляет атаку активированного атома углерода. В результате реакции происходит разрушение С-О связи.

о н

«¿Ут

R. К.

Asp 301

/^.NH ~[ His 55

His 5O^O

н'о

-NH

У \

fj-N H20 His 201 NH

-His 230

Asp 301

HisST^X /7 9^0 y-Hh

О- V NH„. + / о» TT NH=C о

169 о С О—

His 55

Lys 169

;он

-N' \ '\\

// u h:o ^nh

230

His 201

NH

+ H20-kci

(

HO

>°VSrR+ н+ )

о

Рис. 9. Схема предполагаемого механизма действия фермента Жэ^-ОРН в реакциях гидролиза АГЛ.

4.2. Гипотеза эволюционного происхождения_ОРН от

¡Ч-ацнлгомосерннлактоназ

При дальнейшем сравнительном анализе ферментов ОРН и Ы-ацилгомосеринлактоназ, в частности известного фермента АЫА, было решено руководствоваться тремя рекомендованными в литературе стратегиями, используемыми для установления эволюционного родства между различными ферментами [вегИ 1.А., 2003]:

1 - общее строение активного центра,

2 - высокая гомология аминокислотных последовательностей (для дивергентной эволюции),

3 - субстратная специфичность; эволюционный «прародитель» и его «потомственный» фермент могут катализировать одинаковые химические реакции, но обладать разной субстратной специфичностью.

Как показал проведенный сравнительный анализ, ферменты ОРН и AhlA удовлетворяют всем выбранным стратегиям. Согласно полученным выравниваниям, положение аминокислотных остатков активного центра в ОРН полностью совпадает с их положением в AhlA. При этом степени гомологии и идентичности ферментов достаточно высокие и составляют 47% и 28%, соответственно. Ферменты ОРН и AhlA обладают общей установленной субстратной специфичностью и способны катализировать одинаковые химические реакции. При этом в случае ОРН и His6-OPH наибольшие константы эффективности действия ферментов были получены для фосфотриэфира - параоксона (3,0*108 М"'с"' и 5,1*108 М"'с~', соответственно), однако, ОРН также осуществляла катализ гидролиза лактонов, а His6-OPH - АГЛ. В свою очередь фермент AhlA обладает наибольшей активностью по отношению к АГЛ (КЭфф ~ 105 М_1с"') и осуществляет медленный гидролиз параоксона (КЭфф. = 0,5 М"'с") [Afriat L., 2006; Uroz S., 2008]. Таким образом, по-видимому, ферменты ОРН и AhlA могут быть эволюционно родственными, при этом N-ацилгомосеринлактоназа может выступать в роли «прародителя», а ОРН -потомственного фермента.

Данный вывод крайне важен, так как АГЛ являются широко распространенными в природе соединениями, а природный субстрат ОРН до сих пор неизвестен [Raushel F.M., 2000].

С целью определения локализации эволюционно вариабельных участков в составе молекул N-ацилгомосеринлактоназ, изменения в которых могли привести к возникновению ОРН, было проведено множественное выравнивание ОРН и ферментов (Рис. 10), обнаруженных ранее в клетках бактерий рода Rhodococcus (Табл. 7).

Полученное выравнивание характеризовалось высокой степенью согласованности, при этом области высокой согласованности чередовались с областями с инсерциями и делециями, обозначенные как Область 1,2,3 и 4. Согласно проведенным в работе исследованиям (данные представлены в диссертации), оказалось, что Области 1,3,4 соответствуют участкам, отвечающим за организацию субстрат-связывающего сайта в молекуле ОРН, а также в молекуле известной N-ацилгомосеринлактоназы AhlA.

Таким образом, наибольшим эволюционным изменениям оказались подвержены области, отвечающие за связывание субстрата в молекулах N-ацилгомосеринлактоназ, и изменения именно в этих областях могли привести к возникновению ОРН с субстратной специфичностью, отличной от N-ацилгомосеринлактоназ.

T-COFFEE, Version_9.03.Г1318 Cedric Notredame CPU TIME:0 sec.

score=9i сигнальный пептид

■VhlA I HS-----------

MT-----------

(2012-07-12 19:05:45 - Revision 1318 - Build 366)

H55 H57

♦ 4

BAD AVG GOOD

Область 1

AK37 HKJ I M213 1 I03S OPII PD 2

COI1S

I ...............S---VQTVRGPVDTADLGICVI1MHEHVFVLGE--ELRQNYPDYPEPWDEEVRV

T---------------S---VDTVRGPLDTGRLGRVmHEHVFVLGE—BIRTMFPDYPSPWDEDERV

HM-

HQTRRWLKSAAAAGTLLGGLAGCASVAGSIGTGDR

HS-------------------------------

iHVFVLTP- -DVQQNYPDEW- -GSEDERV IHIFVTSP- -BVQQNWPDYPEOWDEETQI IHEHIVTADW--SMRMAFGENY- -YEHDVIV 'LTHEHICGSSA- -GFLRAWPEFF- -GSRKALA HEHIGYGMPGSELDTRWWKT-----PEERV

Область 2

DPTVIGLGRYIPRIVRINEQV-DLNIIVATGIYTYN-DIPFQFHYTGPGLL----FDGPEPMVELFVK I-1"

---rTCLGRYIPRIQRVAERV-DlSIWÄTGLYTYN-DLPFQFHNVGPGLL----VDGPEPLTELFVK 1 30

7VGLGRY1PRIQRVAEQLPELNIVAATGLYTYD-DVPFFFHYRGPALDAIVGAEVPDPMVDMFVK 133

_-EGFDTLVDLTVIGLGRYVPRVARVAEQS-NIHIVVATGAYVLS-ELPVYFHYRGPGTA----AGGPDRLAEFFIR 133

ARESGVRTWDGTPVNMGRDIGLIREVSERT-GLEFWSSGFYYQE-EVFLNWR-------------SEDEIHAWLSR И К

EKAVRGLRRARAAGVRTIVDVSTFDIGRDVSLLAEVSRAA-DVHIVAAXGLHFD-PPLSMRL--R.........- -SVEELTQFFLR 152

47 EETVPKLRKFHQYGGGTFVDVTGICNGRDVDYYKSLSAKT-GVHIVACTGFVGGDTALPFFER-A-----------SVEYLTRQFVH |20

ks

лыл ЛК37 RKJ I M2I3 I io3s OPH PD 2

COI1S

AhlA ЛК37 RKJ I M2I3 1 103S OPII

PI) 2 cons

К169 H201 H230

♦ 4 *

1 3 1 DIREGIAGTGVRASFLKCAIEEPGL-TPGVERVMRAVGiiSQVETGVPITVHTNPHTESGLVAQKVL-AEEGADLTKVVIi

131 DIREGIAGTGVRAGMLKCAIEIPGL-TPGVERVMRAVGQAHVETGVPITVHTNPHTGSGQVAQRVL-,------------

134 DIEEGIADTGVRAG1LKCAIDHQGP-TPGVERVMRAVAKAHRRTGVPITVHTHPGSEAGI--------

1 DXTEGITGTGIRAAILKCVTDEAGL-TKDVDRVLRSVAHAHRETGAPITTHTHSGLRRG]

1 ]() ECEDGIAGTGVRPGIMKAACADDGI-TPILDRVFRAIGRVAAEQRLPVFCHHHPDVGNGEGILDLF____________________

| < , EIQYGIEDTGIRAGIIKVATTG-KA-TPFQELVLKAAARASLATGVPVTTHTAASQRPGEQQAAIF-ESEGLSPSRVCIGHSDDTDD

m EITVGIGDTGSRAGVIKVGVSRGGRMTELDKRIYRAAARAALSTGVPILTHLAIDAEN---AIAIF KEEGLPLDRVLFGKVDDGVN

| 175 fc " *...:* *.:::.: ♦: * . * :: ¡». .. : 2(,|

D301

__| Область 4

2I(. LDYL--CALADAGSLLGMDRFGLEP-F------------------LSFEDRVNTWEHARRGYAEKHVIAHDASCFIDYF----PSA 277

2 Ifi LDYL RRIAOAGSILGMDRFGLDL L------------------LPFEQRVDTWALVEAGYTERHVLSHDASCFIDWF----PHD 277

220 lEHL—TSLAEAGFVLGMDRFGINL-E------------------TTFEARADTLVEMCRRGFAGQMVLSQDASCYIDW1----DPN 2KI

214 TOYL - - ЕЕ LADAGS YLGMDRFG LNT--------------------VPFDKRVEIVAEMCRRGYADRHVLSHDTSCFSDMS----DPV 274

204 LGYL--ETMLRRGCYLGHDRFGHCAVG------------------NSLAARVRTIVELCARGHGDRXLLSHDLATYFGVFESWQDFK ?7n

247 LSYL--TALAARGYLIGLDHIFHSA-I----GLEDNASASALLGIRSWOTRALLIKAblDQGYMKOILVSNDWLFGFSSYV---TNI ,

,jl4 AEKTRJ3TWIAEQGGRVGFDTFGYET-ELEDPPFW........--ARPRKERlDHFLRFLGAGHLDKAIAeVDAHCSPLGW----PSV

261 ЕГ.Я » :*:* :

Область 3

AhlA ЛК37 RKJ I M213 1 I03S OPII

PD 2

27* - -AREVALPHWNYTHISDDVIPALLERGVTEDQVKAHLVDNPRRYFE-----S 323

27X —VKQTAVPNWNYNHISDEVbPALRERGVTDEQITTMLVDNPRRIFE-----R 323

1Ц-, — L-MAALPQWHYLHIENDVIPYVRERGVTEKMITEMLVEVPRRYFEN-VDPY 330

2((0 --RRREMNPCHRHTHIPQDWPALLDRGVSQD2IDVMLIENPARIFAH-BGGY 120

--DDESNDPAVDFTFVNRQWPALEASGLDPETVRAMLEDNPAEFLE----VR i!7

HDVMDRVNP-DGMAFIPLRVIPFLREKGVPQETLAGITVTNPARFLSPTLRAS

,7Й - KG------HTVNYLFEDLIPDLREAGIDEATITKLFVENPABFLTI---QH J|7

: : * : *: : * I 401

tm

Рис. 10. Выравнивание аминокислотных последовательностей ферментов АЫА из Я. егуЛгороШ \У2 (АЫА), ферментов из клеток Я. рупЛтуогапэ АК37 (АК37), Я. готгеейегам ЫОЗОО (МС1_1), К. орасш М213 (М213_1), Л. едш ЮЗБ (ЮЗв), Д. орасш РОбЗО (РО_2) и ОРН (ОРН). Стрелками выделены аминокислотные остатки активного центра ОРИ, а также сигнальный пептид в составе ОРН.

Выводы

1. Впервые получен эффективный иммобилизованный биокатализатор на основе фермента Швб-ОРН и целлюлозосодержащих носителей, предназначенный для

детоксификации почвогрунтов, сильно загрязненных ФОС (до 850 мг/кгПОчвогрунта) и обладающий высокой операционной стабильностью и стабильностью при длительном хранении. По сравнению с аналогами созданный ИФБК может применяться в существенно меньшем количестве (до 59 раз) и обеспечивать деградацию ФОС в разных по составу почвогрунтах.

2. Разработан оригинальный искусственный консорциум на основе клеток бактерий P. esterophilus и R. ruber AC-1513D, способный деградировать различные ФОП (параоксон, паратион, малатион, диазинон, диметоат, деметон-S, хлорпирифос) в водных системах и детоксифицировать почвогрунт (параоксон, 150 мг/кгпесчаНой почвы)- Данный консорциум способен решать комплексную задачу по одновременному глубокому разложению различных концентраций углеводорода нефти (гексадекан, до 56,3 мМ) и ФОП (параоксон, до 0,50 мМ) в водной системе.

3. Впервые выявлена лактоназная и ОРН-активность у клеток R. erythropolis АС-1514D и R. ruber AC-1513D. Показано, что АГЛ индуцируют биосинтез N-ацилгомосеринлактоназы с ОРН-активностью в клетках R. ruber AC-1513D. Аналогичным образом на клетки R. erythropolis AC-1514D и R. ruber AC-1513D действуют образцы сред, полученные после культивирования грамотрицательных клеток бактерий Pseudomonas sp. 78Г и P. esterophilus, продуцирующих АГЛ.

4. Выдвинуто предположение о существовании внутренней регуляции в микробном консорциуме, созданном на основе клеток P. esterophilus и R. ruber АС-1513D. Синергетический эффект от взаимодействия клеток этих микроорганизмов в процессах деградации ФОС обусловлен тем, что клетки бактерий P. esterophilus секретируют в среду АГЛ, которые осуществляют индукцию биосинтеза N-ацилгомосеринлактоназы с ОРН-активностью в клетках R. ruber AC-1513D. Результатом такого взаимодействия является увеличение начальной скорости и степени деградации ФОС под действием консорциума.

5. Впервые обнаружена лактоназная активность у фермента His6-OPH по отношению к различным по строению АГЛ, рассчитаны константы эффективности действия фермента в этих реакциях и предложен механизм, описывающий гидролиз АГЛ под действием His6-OPH.

6. Установлено наличие в клетках бактерий рода Rhodococcus ферментов, которые гомологичны и идентичны ОРН на 46-51% и 28-34%, соответственно, и имеют аналогичную ОРН локализацию всех консервативных аминокислотных остатков, входящих в состав активного центра. Эти данные и установленная перекрестная субстратная специфичность ОРН и N-ацилгомосеринлактоназ из клеток Rhodococcus позволили обосновать гипотезу эволюционного происхождения ОРН от N-ацилгомосеринлактоназ и установить, что основные эволюционно изменчивые области в молекулах данных ферментов отвечают за организацию субстрат-связывающего домена.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. M. Sirotkina. I. Lyagin, Е. Efremenko. Hydrolysis of organophosphorus pesticides in soil: new opportunities with ecocompatible immobilized His6-OPH // Int. Biodeter. Biodegr., 2012, V. 68, p. 18-23.

2. E.H. Ефременко, И.В. Лягин, O.B. Сенько, М.С. Сироткина. Н.В. Завьялова. Иммобилизованные гетерогенные биокатализаторы для разложения С-Р-связи в продуктах уничтожения фосфорорганических отравляющих веществ // Ж. Вестник РУДН, сер. «Экология и безопасность жизнедеятельности», 2011, №1, с. 61-66.

3. Е. Ефременко, И. Лягин, Д. Гудков, М. Сироткина. Н. Завьялова, В. Завьялов, С. Варфоломеев, В. Холстов. Иммобилизованные биокатализаторы на основе органофосфатгидролазы в процессах разложения ФОВ и продуктов их деструкции в различных объектах детоксификации // Ж. Теоретическая и прикладная экология, 2011, № 4, с. 26-31.

4. E.H. Ефременко, Н.В. Завьялова, Д.А. Гудков, И.В. Лягин, О.В. Сенько, М.А. Гладченко, М.С. Сироткина. A.B. Холстов, С.Д. Варфоломеев, В.И. Холстов. Экологически безопасная биодеградация реакционных масс, образующихся при уничтожении фосфорорганических отравляющих веществ // Рос. хим. ж. (Ж.. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 2010, Т. LIV(4), с. 19-24.

5. Е. Efremenko, I. Lyagin, Y. Votchitseva, M. Sirotkina. S. Varfolomeyev. Polyhistidine-containing organophosphorus hydrolase with outstanding properties // Biocatal. Biotransfor., 2007, V. 25(1), p. 103-108.

6. E.H. Ефременко, М.С. Сироткина. И.В. Лягин. Способ ферментативного гидролиза фосфорорганических соединений в почвогрунте// Патент РФ на изобретение № 2451077 опубл. 20.05.2012, Бюл. №14.

7. E.H. Ефременко, Н.В. Завьялова, И.В. Лягин, О.В. Сенько, Д.А. Гудков, A.B. Аксенов, H.A. Степанов, М.С. Сироткина. О.В. Спиричева, Р.В. Иванов, В.И. Лозинский, С.Д. Варфоломеев, В.Б. Кондратьев, В.И. Холстов. Способ биоразложения фосфорорганических соединений в составе реакционных масс, получаемых после химического уничтожения вещества типа Vx. // Патент РФ на изобретение № 2408724 опубл. 10.01.2011, Бюл. №1.

8. E.H. Ефременко, И.В. Лягин, М.С. Сироткина, Н.Л. Клячко, A.B. Кабанов. Препараты на основе органофосфатгидролазы для бионаномедицины // Девятый московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, Россия, 2013, 20 марта, с. 128.

9. E.H. Ефременко, И.В. Лягин, М.С. Сироткина. Д.А. Гудков, Н.В. Завьялова, В.И. Холстов, A.B. Кабанов, С.Д. Варфоломеев. Биокаталитические технологии для разложения фосфорорганических отравляющих веществ и пестицидов в различных объектах // Выставка «Технологии специального назначения» МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва, Россия, 2012, 27 ноября, с. 74-76.

10.М. Sirotkina. Е. Efremenko. A novel method of soil bioremediation with immobilized enzyme preparation // XIX International conference on Bioencapsulation, Amboise, France, 2011, October 5-8, p. 50-51.

11.M.C. Сироткина. E.H. Ефременко. Псевдомонады, осуществляющие в свободном и иммобилизованном виде разложение фосфорорганических соединений // XI ежегодная междунар. молодежная конф-ция ИБХФ РАН-ВУЗы, Москва, Россия, 2011, 9 - 11 ноября, с. 178-179.

12.М.С. Сироткина. Д.А. Гудков, Е.А. Подорожко, В.И. Лозинский, E.H. Ефременко. Деструкция фосфорорганических соединений под действием

иммобилизованной органофосфатгидролазы в почвах // Москов. междунар. научно-практич. конф-ция «Биотехнология: экология крупных городов», Москва, 2010, 15-17 марта, с. 144-145.

13.E.H. Ефременко, В.И. Лозинский, И.В. Лягин, Д. Гудков, М.С. Сироткина, A.B. Холстов, Е.А. Подорожко, О.В. Сенько, H.A. Степанов, О.В. Спиричева. Биоремедиация почв, загрязнённых фосфорорганическими соединениями, основанная на применении иммобилизованных нано- и микробиокатализаторов // Всерос. научн. конф-ция. «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в агропромышленном комплексе России», Москва, 2010, 14-15 апреля, с.148-153.

14.М. Sirotkina. D. Gudkov, Е. Efremenko. Enzyme immobilization for destruction of pesticides in soils // XVIII International conference on Bioencapsulation, Porto, Portugal, 2010, October 1-2, p. 168-169.

15.И.В. Лягин, М.С. Сироткина. E.H. Ефременко, С.Д. Варфоломеев. Установление механизма разложения С-Р связи в метилфосфоновой кислоте под действием фермента HiSô-OPH // 5 научно-практич. конф-ция «Научно-технические аспекты обеспечения безопасности при уничтожении, хранении и транспортировке химического оружия», Москва, 2010, 6 октября, с.23-26.

16.И.В. Лягин, Д.А. Гудков, О.В. Сенько, М.С. Сироткина. E.H. Ефременко, В.В. Верхуша. Разложение токсичных фосфорсодержащих соединений под действием ферментативных и микробных иммобилизованных биокатализаторов // 6-я Междунар. конф-ция «Сотрудничество для решения проблемы отходов», Харьков, Украина, 2009, 8-9 апреля,с. 54-56.

17.М.С. Сироткина. И.В. Лягин, E.H. Ефременко. Органофосфатгидролаза -биокатализатор процесса гидролиза Р-С связи в молекулах метилфосфоновой кислоты и ее эфирах // VIII Ежегодная междунар. молод, конф-ция ИБХФ РАН -ВУЗы «Биохимическая физика», Москва, Россия, 2009, 9-11 ноября, с. 114-115.

18.М.С. Сироткина, О.В. Сенько, E.H. Ефременко. Деструкция фосфорорганических соединений под действием клеток микроорганизмов при биоремедиации почв // Всероссийский симпозиум «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов», Москва, 2009, 24 - 27 декабря, с. 54.

19.I.V. Lyagin, M.S. Sirotkina. E.N. Efremenko, S.D. Varfolomeyev. Enzymatic cleavage of C-P bond in organophosphorous compounds // XVIII Mendeleev Congress on General and Applied Chemistry. Moscow, Russia, 2007, September 23-28, p. 554.

Заказ № 49-П/03/2013 Подписано в печать 21.03.2013 Тираж 150 экз. Усл. п.л. 1,25

"Цифровичок", тел, (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Сироткина, Мария Сергеевна, Москва

96. V. Minovska, E. Winkelhausen, S. Kuzmanova. Lipase immobilized by different techniques on various support materials applied in oil hydrolysis // J. Serb. Chem. Soc., 2005, V. 70(4), pp. 609-624.

97. R.J. Dombrowski, D.R. Hyduke, C.M. Lastoskie. Pore size analysis of activated carbons from argon and nitrogen porosimetry using density functional theory // Langmuir, 2000, V. 16, pp. 5041-5050.

98. В.Ф. Суровикин, Ю.В, Суровикин, M.C. Цеханович. Новые направления в технологии получения углерод-углеродных материалов. Применение углерод-углеродных материалов // Рос. хим. ж., 2007, Т. LI(4), с. 111-118.

99. М. Valaskova, G.S. Martynkova. Vermiculite: structural properties and examples of the use // In book: Clay minerals in nature - their characterization, modification and application, 2012, Chapter 11, pp. 210-238.

100. Вермикулит вспученный. ГОСТ СССР № 12865-67.

101. W.-T. Tsai, C.-W Lai, K.-J. Hsien. Characterization and adsorption properties of diatomaceous earth modified by hydrofluoric acid etching // J. Colloid Interface Sci., 2006, V. 297, pp. 749-754.

102. E. Ефременко, С. Варфоломеев. Ферменты деструкции фосфорорганических нейротоксинов // Усп. биол. хим., 2004, Т. 44, с. 307-340.

103. J. Vanhooke, М. Benning, F. Raushel, Н. Holden. Three-dimensional structure of the zinc-containing phosphotriesterase with the bound substrate analog diethyl 4-methylbenzylphosphonate // Biochemistry, 1996, V. 35(19), pp. 6020-6025.

104. M. Benning, J. Kuo, F. Raushel, H. Holden. Three-dimensional structure of the binuclear metal center of phosphotriesterase // Biochemistry, 1995, V. 34(25), pp. 7973-7978.

105. M. Benning, H. Shim, F. Raushel, H. Holden. High resolution X-ray structures of different metal-substituted forms of phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta II Biochemistry, 2001, V. 40, pp. 2712-2722.

106. H. Shim, F. Raushel. Self-assembly of the binuclear metal center of phosphotriesterase // Biochemistry, 2000, V. 39, pp. 7357-7364.

107. S.-B. Hong, J. Kuo, L. Mullins, F. Raushel. CO2 is required for the assembly of the binuclear metal center of phosphotriesterase // J. Am. Chem. Soc., 1995, V. 117, pp. 75807581.

108. Sh.-L. Chen, W.-H. Fang, F. Himo. Theoretical study of the phosphotriesterase reaction mechanism // J. Phys. Chem. B, 2007, V. 111(6), pp. 1253-1255.

Экологически безопасная биодеградация реакционных масс, образующихся при уничтожении фосфорорганических отравляющих веществ // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 2010, Т. LIV (4), с. 19-24.

210. Е.Н. Ефременко, И.В. Лягин, О.В. Сенько, М.С. Сироткина, Н.В. Завьялова. Иммобилизованные гетерогенные биокатализаторы для разложения С-Р-связи в продуктах уничтожения фосфорорганических отравляющих веществ // Вестник РУДН, сер. Экология и безопасность жизнедеятельности, 2011, №1, стр. 61-66.

211. S.Y. Park, B.J. Hwang, М.Н. Shin, J.A. Kim, H.K. Kim, J.K. Lee. N-acylhomoserine lactonase-producing Rhodococcus spp. with different AHL-degrading activities // FEMS Microbiol. Lett., 2006, V. 261, pp. 102-108.

212. M. Elias, J. Dupuy, L. Merone, L. Mandrich, E. Porzio, S. Moniot, D. Rochu, C. Lecomte, M. Rossi, P. Masson, G. Manco, E. Chabriere. Structural basis for natural lactonase and promiscuous phosphotriesterase activities // Mol. Biol., 2008, V. 379, pp. 1017-1028.

213. L. Merone, L. Mandrich, M. Rossi, G. Manco. Enzymes with phosphotriesterase and lactonase activities in archaea // Curr. Chem. Biol., 2008, V. 2, pp. 237-248.

214. J.Y. Chow, L. Wu, W.S. Yew. Directed evolution of a quorum-quenching lactonase from Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis k-10 in the amidohydrolase superfamily // Biochem., 2009, V. 48, pp. 4344-4353.

215. M.A. Veselova, V.A. Lipasova, O.B. Astaurova, E.E. Atamova, M.A. Protsenko, N.L. Buza, A.Z. Metlitskaya, N.N. Danilova, L.S. Chernin, I.A. Khmel. Quorum-sensing regulation in soil Pseudomonads II Conference proceedings, Microbiology, 2006, V. 75(4), pp. 398^100.

216. V. Venturi. Regulation of quorumsensing in Pseudomonas 11 FEMS Microbiol. Rev., 2006, V. 30, pp. 274-291.

217. L. Steindler, V. Venturi. Detection of quorum-sensing N -acyl homoserine lactone signal molecules by bacterial biosensors // FEMS Microbiol. Lett., 2007, V. 266, p. 1-9.

218. J. Zhu, Y. Chai, Z. Zhong, S. Li, S.C. Winans. Agrobacterium bioassay strain for ultrasensitive detection of N-acylhomoserine lactone-type quorum-sensing molecules: detection of autoinducers in Mesorhizobium huakirii II Appl. Environ. Microb., 2003, V. 69(11), pp. 6949-6955.

219. L. Merone, L. Mandrich, M. Rossi, G. Manco. A thermostable phosphotriesterase from the archaeon Sulfolobus solfataricus: cloning, overexpression and properties // Extremophiles, 2005, V. 9, pp. 297-305.

220. P. Del Vecchio, M. Elias, L. Merone, G. Graziano, J. Dupuy, L. Mandrich, P. Carullo, B. Fournier, D. Rochu, M. Rossi, P. Masson, E. Chabriere, G. Manco. Structural determinants