Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб методом полимеразной цепной реакции

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб методом полимеразной цепной реакции"

УДК 619 639 3 091 577 2

На правах рукописи

КОЛБАСОВ НИКИТА ВЛАДИМИРОВИЧ

Идентификация возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб методом полимеразной цепной реакции

03 00 06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ООЗ170956

Покров, 2008

003170956

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ)

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Цыбанов Содном Жамьянович

Официальные оппоненты*

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Пономарев Виктор Николаевич

кандидат ветеринарных наук Пичугина Татьяна Дмитриевна

Ведущее учреждение - ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г Владимир

Защита диссертации состоится 20 июня 2008 г в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 006 003 01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу 601120, Владимирская обл, г Покров, ГНУ ВНИИВВиМ Тел/факс (49243)62125

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ

Автореферат разослан » мая 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

1 Общая характеристика работы 1 1 Актуальность темы

Вирусная геморрагическая септицемия (ВГС) рыб - заразная болезнь, поражающая пресноводных и морских рыб Гибель рыб, в зависимости от возраста, может достигать 50 - 70%

Переносчиками возбудителя являются беспозвоночные Распространению заболевания способствует ввоз живой икры и мальков из эпизоотически неблагополучных зон Этиологический агент, вызывающий ВГС рыб, относится к роду ЫоУ1г1шЬёоУ1гиз семейства Р11шЬ(1оУ1П(]ае По классификации Международного эпизоотического бюро ВГС рыб относится к категории особо опасных, декларируемых болезней рыб

Возбудитель вирусной геморрагической септицемии распространен на территории США, Канады и ряда европейских стран, таких как Дания, Финляндия, Норвегия, Швеция и в странах Балтии Резервуары инфекции существуют в Балтийском и Северном морях, а так же в Тихом океане ВГС рыб была широко распространена на Украине, отмечена в Прибалтике и Грузии Сегодня ВГС рыб в России не установлена, однако угроза заноса инфекции вполне реальна в связи с ввозом рыбы из мест, неблагополучных по данному заболеванию

Диагноз на ВГС рыб ставят на основании выполнения комплекса исследований, включающих анализ эпизоотологических данных, клинических признаков заболевания и патологоанатомических изменений, результаты вирусологических исследований по выделению и серологической идентификации вируса с последующей постановкой биопробы

Высокая контагиозность и смертность рыб при данной вирусной инфекции обуславливают необходимость разработки экспресс методов диагностики ВГС рыб с целью быстрого и своевременного принятия карантинных мер и профилактических мероприятий Одним из таких методов является полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая уже нашла применение в диагностических исследованиях в ветеринарии

Избирательная амплификация отдельных участков вирусного генома с помощью полимеразной цепной реакции, дополняя серологические и вирусологические методы, открывает новые возможности для быстрой идентификации возбудителя ВГС рыб

1.2 Цель и задачи исследования Целью данной работы являлась идентификация генома возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб на основе полимеразной цепной реакции

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

1 Изучить культурапьные и биологические свойства штамма ЧФ 1 2/К возбудителя ВГС рыб в различных перевиваемых клеточных линиях и на годовиках радужной форели Депонировать данный штамм в коллекцию микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ,

2 Провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов структурных белков различных штаммов и изолятов возбудителя ВГС рыб, подобрать специфические праймеры для идентификации данного возбудителя,

3 Отработать методы выделения суммарной рибонуклеиновой кислоты (РНК) из инфицированных культур клеток и проб органов экспериментально зараженных ВГС рыб, оптимизировать условия синтеза кДНК и постановки ПЦР для выявления и дифференциации возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб от штаммов близкородственных представителей рабдовирусов рыб,

4 Разработать тест-систему на основе ПЦР для идентификации возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб и оценить ее пригодность для диагностики болезни,

5 Провести филогенетический анализ отечественного штамма ЧФ 1 2/К ВГС рыб

1 3 Научная новизна работы

Изучены культуральные и биологические характеристики отечественного штамма ЧФ 1 2 возбудителя ВГС рыб, который депонирован в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ под названием штамм ЧФ 1 2/К

Подобраны праймеры, комплементарные различным участкам генома возбудителя ВГС рыб, позволяющие выявлять и дифференцировать его от близкородственных представителей рабдовирусов рыб (вирусов весенней виремии карпа и инфекционного некроза гемопоэтической ткани) методом ПЦР

Проведенный филогенетический анализ участка гена штамма ЧФ 1 2/К возбудителя ВГС рыб показал, что уровень гомологии этого участка с таковыми европейских генотипов ВГС рыб составляет 96-99% 1 4. Практическая значимость

Практическая ценность работы состоит в том, что на основании экспериментальных данных разработана тест-система для идентификации возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб методом полимеразной цепной реакции, которая успешно прошла комиссионные испытания Акт комиссионных испытаний рассмотрен на заседании ученого совета (протокол № 6 от 14 07 2006) и утвержден директором института 18 07 2006

Предложенная тест-система рекомендована для включения в схему лабораторных исследований при диагностике болезни, в настоящее время используется в практической работе и позволяет обнаруживать РНК возбудителя ВГС рыб в инфицированных культурах клеток и пробах органов от больных рыб

Депонированный в коллекции микроорганизмов института штамм ЧФ 1 2/К ВГС рыб (инв №2601 от 10 02 2005) используют в ГНУ ВНИИВВиМ при проведении НИР

1.5. Основные положения, выносимые на защиту

1 Культуральные и биологические свойства штамма ЧФ 1 2/К возбудителя ВГС рыб, репродуцированного в культурах клеток ЕРС (перевиваемая линия клеток эпидермальных новообразований больного оспой карпа) и КТС2 (перевиваемая линия клеток гонад радужной форели),

2 Специфичность ПЦР с использованием подобранных праймеров к участку генов для обнаружения и идентификации возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб,

3 Результаты филогенетического анализа отечественного штамма ЧФ 1 2/К вируса ВГС рыб,

1.6. Личный вклад соискателя

Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, анализ полученных результатов выполнены автором самостоятельно В проведении исследований диссертации практическую и консультативную помощь оказывали сотрудники ГНУ ВНИИВВиМ заведующий лабораторией «Здоровье гидробионтов», кандидат биологических наук Щелкунов И С (раздел Определение патогенности вируса) и старший научный сотрудник этой же лаборатории Щелкунова Т И (раздел Репродукция возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб), старший научный сотрудник лаборатории «Биофизика», кандидат биологических наук Жигалева О Н (раздел Филогенетический анализ штамма ЧФ 1 2/К возбудителя ВГС рыб)

1.7. Апробация результатов исследований Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ в 2004-2007 гг , международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (ВНИТИБП, Щелково, 2005)

1.8 Публикации научных исследований

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 1 в журнале «Ветеринария»

1.9. Структура и объем работы Диссертация изложена на 105 страницах и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, собственные исследования, в т ч результаты исследований и обсуждение, выводы, практические предложения, дополнена приложением Список литературы включает 147 источника Работа иллюстрирована 8 рисунками и 16 таблицами В приложении представлены 3 документа, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость

2 Собственные исследования

2 1 Материалы

Вирусы*

S Кучыпуральныи вирус вирусной геморрагической септицемии рыб штамм «DK-5151», штамм «DK-5131», штамм «DK-9695303», штамм «DK-F1», штамм «DK-3592B», штамм «DK-8076», штамм «RU-F Р18», штамм «FR-23/75», штамм «9695377», штамм «DK-5727», штамм «ЧФ 1 2/К» S Кулътуралъный вирус инфекционного некроза гемопоэтической ткани

изолят «№18», изолят «№17», штамм «FUI», штамм «ФР1/00» S Кучыпуральныи вирус весенней виремии карпа штамм «ZL-4», штамм «Fijan»

Вирусы болезней рыб были любезно представлены И С Щелкуновым из ВНИИПРХ (г Дмитров), S Вакцинный штамм вируса бешенства «ТС-80», полученный из музея микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ (инв № 1033)

Органный материал. Суспензия селезенки, жабр и других интактных органов годовиков радужной форели, суспензия селезенки и пула органов годовиков радужной форели, инфицированных вирусом ВГС рыб (изолят ЧФ 1 2/К)

Ферменты M-MLV обратная транскригтгаза (АмплиСенс), Taq-полимераза, «Fermentas», «СибЭнзим», Москва

Культуры клеток Для культивирования и титрования вирусов использовали перевиваемые культуры клеток эпидермальных новообразований больного оспой карпа (ЕРС), полученную из ВНИИПРХ (г Дмитров) и гонад радужной форели (RTG2), которая получена из лаборатории Культуры клеток с музеем клеточных штаммов ГНУ ВНИИВВиМ (кат №50)

2 2.Методы 2.2 1 Культивирование вируса

Клетки RTG2, ЕРС выращивали при 20-21 °С на питательной среде Игла MEM (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов, Москва) с добавлением 10% фетапьной сыворотки крови теленка Инокулированные вирусом клетки инкубировали при 15°С

2 2.2.Титрование вируса Титр вируса определяли по ЦПД в культуре клеток RTG2, ЕРС методом конечного разведения по Риду и Менчу 2.2 З.Выделение РНК Из инфицированных вирусом культур клеток и проб органов экспериментально зараженных рыб суммарную РНК выделяли с использованием сорбента Silica (Gibco)

При выделении методом нуклеосорбции к пробе объемом 150 мкл добавляли 600 мкл лизирующего буфера, содержащего гуанидин тиоционат (ГТЦ) К полученной смеси добавлялся сорбент (20 мкл) и пробу инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин, после чего сорбент осаждали центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 сек Супернатант удаляли, сорбент ресуспендировали в отмывочном буфере, содержащем ГТЦ, после чего проводили центрифугирование при тех же режимах и супернатант удаляли Сорбент ресуспендировали в 70% этаноле, осаждали при тех же условиях, супернатант удаляли, после чего его сушили в

пробирке с открытой крышкой при температуре 56°С в течение 5 мин Затем к сорбенту добавляли 40 мкл деионизованной воды и выдерживали при температуре 56°С в течение 5 мин После чего пробу центрифугировали и супернатант использовали для синтеза кДНК и постановки ПЦР 2 2 4 Синтез кДНК Синтез кДНК проводили с использованием наборов для синтеза кДНК фирм «Promega», «Fermentas», ФГУ ВНИИЭ РОСПОТРЕБНАДЗОРА и «СибЭнзим», согласно рекомендациям производителя В качестве затравок использовали олигонуклеотиды длиной 19-30 оснований, комплементарные последовательностям генов вируса

2.2 5.Постановка ПЦР Раствор кДНК (5 мкл) вносили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 10 рМ каждого праймера, 0,1 тМ смеси dNTP, 10х буфер (50 тМ Трис НС1 рН 8,0-9,2, 50 mM КС1, 1,0 -4,0 mM MgCl2 ), 1 ед Taq-полимеразы Амплификацию проводили в термоциклере «Терцик» ДНК-Технология (г Москва)

2.2.6.0пределение первичных нуклеотидных последовательностей Определение первичных нуклеотидных последовательностей проводили с использованием автоматического секвенатора Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer и набора BigDye Terminator v3 1 согласно инструкции производителя

2 2.7 Анализ первичной структуры Анализ первичной структуры генома возбудителя ВГС рыб проводили с использованием пакетов прикладных программ DNASIS/PROSIS, версия 3 00 BioEdit Расчет вероятных схем спаривания праймеров осуществляли по методу определения оптимальных вторичных структур нуклеиновых кислот с использованием соответствующих энергетических правил по программе OLIGO 6 0

2 З.Результаты исследований 2.3.1.Репродукция возбудителя вирусной геморрагической септицемии

рыб

Перевиваемая линия клеток гонад радужной форели RTG 2 была получена в 1980 году из ФРГ После 20-ти лет хранения при температуре минус 196°С культура клеток была взята нами с целью оценки ее чувствительности к возбудителю вирусной геморрагической септицемии рыб Жизнеспособность клеток по тесту витального окрашивания трипановым синим составлила 79% При выращивании в условиях стационарного монослоя на чашках Карреля в среде Игла MEM с добавлением 10% фетальной сыворотки крови телят культура клеток восстановила основные свойства в течение трех пассажей после размораживания

Культуру клеток RTG2 выращивали в пристеночных культурах при температуре 21°С Для диспергирования клеточного пласта при пересевах использовали теплую смесь (37,0±1,0°С) 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 1 1 При пересеве этих клеток с коэффициентом 12-13 монослой формировался на 3-4 сутки культивирования и сохранялся при +4°С без смены среды до 40 дней

Исследованиями установлено, что клетки гонад радужной форели чувствительны к вирусу ВГС рыб На 2-3 сутки после заражения в дозе 0,1 -0,01ТЦД5() /клетка учитывали цитопатическое действие вируса, которое проявлялось в округлении клеток с последующим формированием своеобразных гроздьев, с дальнейшим образованием «окон» в монослое, гибелью клеток и отслоением их от стекла На уровне 5-го пассажа вирус достигал максимального уровня накопления в культуральной жидкости 7,07,5 lg ТЦД50/см3

Перевиваемая линия клеток эпидермапьных новообразований больного оспой карпа ЕРС была получена в 2004 г из ВНИИПРХ В соответствии с паспортными данными, представленными сотрудниками ВНИИПРХ, клетки

линии EPC культивировали в питательной среде Игла MEM с двойным набором аминокислот и витаминов (Игла 2МЕМ) с добавлением L-глутамина, 10 % фетальной сыворотки крови телят В процессе подбора оптимальных условий культивирования клеточной линии ЕРС мы столкнулись с проблемой необходимости стабильного поддержания нужного значения рН питательной среды в течение 14 суток

В результате проведенных исследований было установлено, что добавление 1М HEPES-буфера до конечной концентрации 0,02 М обеспечивает поддержание значения рН среды в строгих пределах 7,0-7,2 При других значениях рН клеточная линии ЕРС либо не образовывала сплошного монослоя, либо клетки не прикреплялись к стенкам культуральной посуды

Пассирование клеток проводили методом последовательных пересевов в условиях стационарного монослоя с коэффициентом пересева 14-15 каждые 10 - 14 дней Диспергирование клеточного пласта осуществляли смесью растворов версена (0,02 %) и трипсина (0,25%) в соотношении 7 5

Возбудитель ВГС рыб проявлял цитопатическое действие в клетках ЕРС на 2-4 сутки и достигал максимального уровня накопления в культуральной жидкости 8,0-8,5 lg ТЦД5о/см3 2.3 2.0пределение стабильности культуральных свойств возбудителя ВГС рыб при пассировании в культурах клеток ЕРС и RTG2 Для оценки стабильности культуральных свойств при пассировании

возбудителя ВГС рыб (шт ЧФ 1 2/К) в культуре клеток ЕРС и RTG2 было

проведено 7 последовательных пассажей Результаты исследований

представлены в табл 1

Таблица 1

Инфекционная активность штамма ЧФ 1 2/К возбудителя ВГС рыб в

клеточных культурах в стационарном монослое

п=3

Культура клеток Штамм вируса Титр вируса (1£ ТЦД^/см")

1 пассаж 4 пассаж 7 пассаж

ЕРС ЧФ 1 2/К 8,0±0,11 8,25±0,15 8,5±0,12

ЯТС 2 ЧФ 1 2/К 6,7±0,13 7,0±0,25 7,0±0,15

Из данных табл 1 видно, что в результате проведенной работы установлено, что инфекционная активность возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб в культуре клеток ЕРС на протяжении 7 последовательных пассажей была стабильной и составила 8,0-8,5 ТЦД50/см3 в культуре клеток ЕРС, а в культуре клеток ЯТС2 6,7 - 7,0 1ц ТЦЦ50/см' Результаты исследования показали, что штамм ЧФ 12/К возбудителя ВГС рыб накапливается в стационарном монослое клеток ЕРС в более высоких титрах, чем в клетках ЯТв2

Таким образом, при культивировании в стационарном монослое клеток ЯТС2 и ЕРС штамма ЧФ 1 2/К возбудителя ВГС рыб наблюдали стабильное его накопление в титрах от 7,0 до 8,5 ТЦЦу/см1 соответственно в течение 7 последовательных пассажей (срок наблюдения)

2.3.3 Определение патогенности вируса Сравнительное изучение стабильности патогенных свойств возбудителя ВГС рыб (шт ЧФ 1 2/К), полученного в клетках ЕРС и ЯТС2, проводили на годовиках радужной форели путем заражения их методом ванн

С этой целью использовали культуральный вирус (6 пассаж), полученный в клеточной линии ЕРС (ВНИИПРХ) и ЯТС2 (ГНУ ВНИИВВиМ) Сто годовиков форели помещали в 200-300-литровый бассейн (аквариум) с 50 литрами активно аэрируемой воды с температурой около

8°С В воду внесли 50 мл культурального вируса с активностью 7 0^ ТЦДад/см\ полученного на разных культурах клеток В этих условиях рыбу выдерживали в течение одного часа Далее рыбу содержали при температуре воды 8-9°С при активной аэрации и кормлении карповым комбикормом с гранулами соответствующего размера в количестве 1% от ихтиомассы (за сутки в два приема)

В результате проведенной работы установлено, что у большинства экспериментально зараженных рыб вирусом ВГС (шт ЧФ 1 2/К), полученным как на клетках ЕРС, так и КТ02, на четвертые сутки после заражения отмечали угнетение и анорексию Гибель рыб начиналась на 6-е сутки и продолжалась более 2-х месяцев На начальных стадиях заболевания рыба погибала с признаками, типичными для острой формы течения ВГС рыб От рыб с острым течением болезни вирус в титрах 5,5-6,5 ТЦД50/см' реизолировали из всех образцов отобранных материалов (жабры, почка, селезенка или общий пул органов) От рыб с хроническим течением и нервной формой болезни реизолировать вирус удалось спустя 45 суток только из головного мозга (2,75 ^ ТЦД50/смЗ)

Таким образом, сравнительная оценка патогенных свойств на годовиках радужной форели возбудителя ВГС рыб (шт ЧФ 1 2), полученных на клетках ЕРС и ЯТв2 показала, что они остаются стабильными

2 3 4 Разработка набора препаратов для выявления возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб методом полимеразной цепной реакции 2.3 4.1.Подбор праймеров для выявления возбудителя ВГС рыб при

помощи ПЦР

Специфические праймеры были подобраны на основе анализа опубликованных в СепВапк первичных последовательностей геномов штаммов и изолятов ВГС рыб (рис 1)

и

Рис 1 Схема расположения внутренних и наружных праймеров, кодирующих участки нуклео- (1М) и гликопротеин (в) генома вируса ВГС рыб

Для идентификации ВГС рыб выбраны две пары праймеров, комплементарных Ы-гену (ген нуклеопротеина), и три пары праймеров - в-гену (ген гликопротеина) ПЦР - продукты имели размеры от 181 до 512 п о При определении специфичности рассчитанных нами праймеров было установлено, что две пары праймеров (Ш-Ы2 и №-Ы4), комплементарных гену, кодирующему нуклеопротеин, взаимодействовали с РНК вирусов ВГС рыб, весенней виремии карпа (ВВК) и инфекционного некроза гемопоэтической ткани (ИНГТ), относящихся к роду МоУ1гЬаЬс1оУ1ги5 семейства ШшЬс1оУ1пс1ае

Праймеры (в1 - С2), комплементарные гену, кодирующему ген гликопротеина, позволяли выявлять 7 штаммов из 11 исследованных европейских штаммов ВГС рыб, но не связывались с РНК отечественного штамма ЧФ 1 2/К (табл 2)

На основе анализа первичной последовательности гена гликопротеина штаммов ВС99-001, ВС99-010, МЕОЗ и ВС99-292, опубликованных в 2006 г

в ОепВапк, была подобрана другая пара праймеров для постановки гнездовой ПЦР (наружные 03 - 04, внутренние 05 - 06), которые гибридизовались со всеми исследованными штаммами возбудителя ВГС рыб

Таблица 2

Выявление РНК различных штаммов возбудителя ВГС рыб с праймерами (01- 02)

п=3

№ Название штаммов Результаты ПЦР с праймерами (01- в2)

1 ОК-5151 +

2 ОК-5131 +

3 DK.F1 +

4 ОК-3592В -

5 ОК-6137 +

6 ОК-9695303 +

7 Ш-РР18 +

8 РЯ-23/75 -

9 ОК-8076 +

10 ОК9695377 -

11 ЧФ 1 2/К -

Примечание

«+» - РНК выявлена, «-» - РНК не выявлена Для синтеза кДНК и постановки первого раунда ПЦР были использованы наружные праймеры (03- 04), фланкирующие ампликон размером 309 п о Для исследования материалов с низким содержанием вирусной РНК проводили второй раунд ПЦР с внутренними праймерами 05-Об, синтезирующими фрагменты длиной 218 п о

В ходе исследований были апробированы и предложены оптимальные температурные режимы амплификации, количества и концентрации компонентов реакционной смеси

2.3 4 2 Определение специфичности и чувствительности ПЦР

При проверке специфичности ПЦР с вышеуказанными праймерами в качестве матриц были использованы препараты РНК штаммов и изолятов возбудителя ВГС рыб, выделенные из инфицированных клеток, а также РНК, выделенная из проб органов экспериментально зараженных вирусом рыб, нуклеиновые кислоты близкородственных вирусов - вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани (ИНГТ), вируса весенней виремии карпа (ВВК), штамм «ТС-80» вируса бешенства Результаты исследований приведены в табл 3 и на рис 2

II И I1 Ь К I 1.1 1.

218 по

реамплификация

309 по

Рис 2 Результаты определения специфичности метода ПЦР Треки 1-11 - внутренние праймеры, 12-18 - наружные праймеры Треки 1 - Незараженная культура клеток RTG-2, 2 - Незараженная культура клеток ЕРС, 3 - ВГС рыб шт ЧФ 1 2/К, 4 - ВГС рыб шт DK-5131, 5 -ВГС рыб шт DK-9695303, 6 - ВГС рыб шт RU-F Р18, 7 - ВГС рыб шт FR-23/75, 8 - жабры зараженных ВГС рыб, 9 - пул органов зараженных ВГС рыб, 10 - жаберные крышки зараженных ВГС рыб, 11 - вирус некроза гемопоэтической ткани шт FR2/00, 12 - ВГС рыб шт DK-8076, 13 - ВГС рыб шт DK-5151, 14 - ВГС рыб шт ЧФ 1 2/К, 15 - ВГС рыб шт RU-F Р18, 16 -ВГС рыб шт DK-9695303, 17 - вирус весенней виремии карпа шт ZL 4, 18 -вирус бешенства, шт ТС-80

Таблица 3

Результаты определения специфичности праймеров, комплементарных гену

гликопротеина

п=3

Образцы вирусного материала Результаты ПЦР

Внешние праймеры 03-04 Внутренние праймеры 05-06

Культуральный вирус ВГС

ОК-5151 + +

ЭК-5131 + +

ОК-Р1 + +

ОК-3592В + +

ЭК-6137 + +

ЭК-9695303 + +

Яи-Р Р18 + +

РЯ-23/75 + +

ОК-8076 + +

ЭК9695377 + +

ЧФ 1 2/К + +

Контрольные образцы

ВВК шт 4 - -

ВВК изолят М2 - -

ИНГТ шт РЯ2/00 - -

ИНГТ изолят №18 - -

Вирус бешенства шт ТС-80 - -

Культура клеток ЯТС-2 - -

Культура клеток ЕРС - -

Примечание

«+» - РНК выявлена, «-» - РНК не выявлена Представленные данные (табл 3 и рис 2) свидетельствуют о том, что рассчитанные праймеры, комплементарные гену гликопротеина, специфически амплифицируют фрагменты генома размерами 309 и 218 п о и позволяют проводить идентификацию всех исследованных штаммов возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб

С образцами РНК, выделенной из близкородственных вирусов, неинфицированных клеток ЕРС и пула органов неинфицированных рыб, данные праймеры не гибридизуются

Для определения чувствительности метода была использована серия последовательных 10-ти кратных разведений препаратов культурального вируссодержащего материала отечественного штамма ЧФ 1 2/К и европейского штамма ОК-5151 с исходным титром 8,0 ^ ТЦД50/смл

Из полученных проб выделяли РНК согласно разработанным и утвержденным Методическим указаниям по выявлению возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб методом полимеразной цепной реакции Методические указания рассмотрены ученым советом ГНУ ВНИИВВиМ, 14 07 2006, протокол №6 Пределом чувствительности считали последнее разведение, при котором регистрировали положительный результат в обратнотранскриптазной (ОТ) ПЦР Чувствительность тест-системы для выявления РНК ВГС рыб методом ОТ-ПЦР составляла 100 ТЦД50/см^ и выше

Тест-система была испытана для обнаружения вирусной РНК в пробах органов экспериментально зараженных рыб (почки, селезенка, кишечник, жабры, и общий пул органов) Было показано, что РНК возбудителя ВГС рыб выявлялась во всех исследованных органах Установлено, что наиболее пригодными образцами для обнаружения РНК возбудителя ВГС рыб являются пробы селезенки, жаберных крышек, либо их пул

Таким образом, в результате оптимизации условий проведения ОТ-ПЦР для определения РНК ВГС рыб, была создана чувствительная и специфичная тест-система для выявления и дифференциации возбудителя ВГС рыб в инфицированных культурах клеток и различных пробах органов, полученных от экспериментально зараженных рыб

Были проведены внутриинститутские комиссионные испытания тест-системы, разработанные методические рекомендации утверждены директором института 18 июля 2006 г и академиком-секретарем отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии А М Смирновым (протокол №3 от 27 сентября 2007 г)

2 3 4 З.Филогенетический «анализ штамма ЧФ 1 2/К возбудителя ВГС рыб

Фрагмент в 309 нуклеотидных пар, соответствующий участку гена гликопротеина штамма ЧФ 1 2/К, был амплифицирован при помощи наружных праймеров (03-04) Полученный ПЦР-продукт был очищен методом гель-электрофореза и использован для секвенирования

При сравнительном анализе нуклеотидной последовательности гена гликопротеина исследованного штамма ЧФ 1 2/К с последовательностями, опубликованными в различных базах и банках данных, было установлено, что уровень гомологии участка гена гликопротеина данного штамма с таковыми европейскимх штаммов составляет от 96 до 99%

Таблица 4

Уровень гомологии гена гликопротеина штамма ЧФ 1 2/К возбудителя ВГС рыб с последовательностями, опубликованными в генбанке

Кластер Уровень гомологии, (%) Изоляты

ЧФ 1 2/К 99 JP96KRRV9601, SE-SVA32, DK-6p403, DK-5е59, SE-SVA14, strain Cod Ulcus, NO-A16368G

97 Hededam, NO-A16368G, DK-4p37, DK-2835

96 DK-4p37, FiA15 02, FI-ka422, DK-3946,23-75 France, DK-9895174, AU-8/95

Из данных, представленных в табл 4, видно, что отечественный штамм ЧФ 1 2/К возбудителя ВГС рыб относится к европейскому генотипу и наиболее близок к изолятам JP96KRRV9601, SE-SVA32, DK-6p403, DK-5e59, SE-SVA14, strain Cod Ulcus, NO-A16368G

ВЫВОДЫ

1 При изучении чувствительных к возбудителю ВГС рыб клеточных систем установлено, что наиболее перспективной для получения вирусного материала является перевиваемая культура клеток ЕРС (эпидермальных новообразований больного оспой карпа),

2 Инфицирование перевиваемых клеточных линий 1Ш32 (гонад радужной форели) и ЕРС (эпидермальных новообразований больного оспой карпа) в дозе 0,1-0,01 ТЦД50/клетка обеспечивает накопление на 2-4 сутки штамма ЧФ 1 2/К возбудителя ВГС рыб в титрах 6,7-7,0 и 8,0-8,5 ТЦД50/мл соответственно,

3 Установлено, что при пассировании в течение 7 последовательных пассажей в чувствительных клеточных системах патогенные для годовиков радужной форели свойства штамма ЧФ 1 2/К возбудителя ВГС рыб сохраняются,

4 Отработаны оптимальные условия постановки полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, комплементарных нуклеотидным последовательностям гена гликопротеина, позволяющие при температуре отжига 54° С выявлять РНК возбудителя ВГС рыб,

5 Разработанная «Тест-система для идентификации РНК возбудителя ВГС рыб методом ПЦР» обеспечивает минимальную чувствительность 100 ТЦД50/см3,

6 На основании филогенетического анализа участка генома отечественного штамма ЧФ 1 2/К с последовательностями, опубликованными в генбанках, установлено, что он относится к европейскому генотипу при уровне гомологии 96-99%

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1 Разработаны и утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ и академиком-секретарем отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии А М Смирновым «Методические рекомендации по применению тест-системы для выявления РНК возбудителя ВГС рыб методом полимеразной цепной реакции»,

2 Разработанная тест-система на основе полимеразной цепной реакции может быть использована для идентификации штаммов и полевых изолятов возбудителя ВГС рыб и рекомендована для включения в схему лабораторных исследований при диагностике болезни,

3 Депонированный отечественный референс-штамм ЧФ 1 2/К в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ (инв №2601 от 10 февраля 2005 г), может использоваться для проведения научно-исследовательской работы

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Колбасова, О Л Очистка и выделение РНК возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб / О Л Колбасова, Л Ю Апасова, Н В Колбасов // Научные основы призводства ветеринарных биологических препаратов материалы Междунар науч -практ конф, посвященной 35-летию института, 26-27 мая 2005 г / ГНУ ВНИТИБП - Щелково, 2005 -С 233-236

2 Жигалева, О Н Обнаружение возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб методом ПЦР /ОН Жигалева, Н В Колбасов // Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммуноглогии животных материалы Междунар науч-практ конф /ГНУВИЭВ-М Изографъ, 2006 - С 218-219

3 Апасова, Л Ю Получение вируснейтрализующей антисыворотки против возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб / Л Ю Апасова, Н В Колбасов, О Л Колбасова //Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных материалы Междунар науч-практ конф /ГНУВИЭВ-М Изографъ, 2006 - С 154-155

4 Культивирование вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани в культуре клеток ЕРС / Л Ю Апасова, Н В Колбасов, О Н Жигалева, Ю С Дармаева // Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных материалы Междунар науч конф / Ульяновская ГСХА - Ульяновск, 2006 - С 25-27

5 Выявление РНК возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб методом ПЦР/О Н Жигалева, О Л Колбасова, С Ж Цыбанов, Н В Колбасов, И С Щелкунов, Т И Щелкунова // Ветеринария -2006 -№9 -С 24-26

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ, г Покров Владимирской области Тираж 75 экз

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Колбасов, Никита Владимирович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность темы.

1.2. Цель и задачи исследования.

1.3. Научная новизна работы.

1.4. Практическая значимость.

1.5. Основные положения выносимые на защиту.

1.6. Личный вклад соискателя.

1.7. Апробация результатов исследований.

1.8. Публикации научных исследований.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Характеристика вирусной геморрагической септицемии рыб.

2.2. Клинические признаки.

2.3. Патологоанатомические изменения.

2.4. Морфология и физические свойства вириона.

2.5. Структура генома.

2.6. Устойчивость вируса.

2.7. Патогенные свойства вируса ВГС рыб.

2.8. Эпизоотическая ситуация по вирусной геморрагической септицемии рыб.

2.9. Профилактика и меры борьбы.

2.10. Методы диагностики вирусной геморрагической септицемии рыб.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб методом полимеразной цепной реакции"

1.1.Актуальность темы

Вирусная геморрагическая септицемия (ВГС) рыб - заразная болезнь, поражающая пресноводных и морских рыб. Гибель рыб, в зависимости от возраста, может достигать 50 - 70%.

Переносчиками возбудителя являются беспозвоночные. Распространению заболевания способствует ввоз живой икры и мальков из эпизоотически неблагополучных зон. Этиологический агент, вызывающий ВГС рыб, относится к роду МоуиЪаЬскмгиз семейства ШгаЬсктпёае. По классификации Международного эпизоотического бюро ВГС рыб относится к категории особо опасных, декларируемых болезней рыб.

Возбудитель вирусной геморрагической септицемии распространен на территории США, Канады и ряда европейских стран, таких как Дания, Финляндия, Норвегия, Швеция и в странах Балтии. Резервуары инфекции существуют в Балтийском и Северном морях, а так же в Тихом океане. ВГС рыб была широко распространена на Украине, отмечена в Прибалтике и Грузии. Сегодня ВГС рыб в России не установлена, однако угроза заноса инфекции вполне реальна в связи с ввозом рыбы из мест, неблагополучных по данному заболеванию.

Диагноз на ВГС рыб ставят на основании выполнения комплекса исследований, включающих: анализ эпизоотологических данных, клинических признаков заболевания и патологоанатомических изменений, результаты вирусологических исследований по выделению и серологической идентификации вируса с последующей постановкой биопробы.

Высокая контагиозность и смертность рыб при данной вирусной инфекции обуславливают необходимость разработки экспресс методов диагностики ВГС рыб с целью быстрого и своевременного принятия карантинных мер и профилактических мероприятий. Одним из таких методов является полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая уже нашла применение в диагностических исследованиях в ветеринарии.

Избирательная амплификация отдельных участков вирусного генома с помощью полимеразной цепной реакции, дополняя серологические и вирусологические методы, открывает новые возможности для быстрой идентификации возбудителя ВГС рыб.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Колбасов, Никита Владимирович

6. выводы

1. При изучении чувствительных к возбудителю ВГС рыб клеточных систем установлено, что наиболее перспективной для получения вирусного материала является перевиваемая культура клеток ЕРС (эпидермальных новообразований больного оспой карпа);

2. Инфицирование перевиваемых клеточных линий ЯТ02 (гонад радужной форели) и ЕРС (эпидермальных новообразований больного оспой карпа) в дозе 0,1-0,01 ТЦД50/клетка обеспечивает накопление на 2-4 сутки штамма ЧФ 1.2/К возбудителя ВГС рыб в титрах 6,7-7,0 и 8,0-8,5 ^ ТЦД5о/мл соответственно;

3. Установлено, что при пассировании в течение 7 последовательных пассажей в чувствительных клеточных системах патогенные для годовиков радужной форели свойства штамма ЧФ 1.2/К возбудителя ВГС рыб сохраняются;

4. Отработаны оптимальные условия постановки полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, комплементарных нуклеотидным последовательностям гена гликопротеина, позволяющие при температуре отжига 54° С выявлять РНК возбудителя ВГС рыб;

5. Разработанная «Тест-система для идентификации РНК возбудителя ВГС рыб методом ПЦР» обеспечивает минимальную чувствительность 100 ТЦДзо/см3;

6. На основании филогенетического анализа участка генома отечественного штамма ЧФ 1.2/К с последовательностями, опубликованными в генбанках, установлено, что он относится к европейскому генотипу при уровне гомологии 96-99%.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработаны и утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ и академиком-секретарем отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым «Методические рекомендации по применению тест-системы для выявления РНК возбудителя ВГС рыб методом полимеразной цепной реакции»;

2. Разработанная тест-система на основе полимеразной цепной реакции может быть использована для идентификации штаммов и полевых изолятов возбудителя ВГС рыб и рекомендована для включения в схему лабораторных исследований при диагностике болезни;

3. Депонированный отечественный референс-штамм ЧФ 1.2/К в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ (инв. №2601 от 10 февраля 2005 г.), может использоваться для проведения научно-исследовательской работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Колбасов, Никита Владимирович, Покров

1. Адаме, Р. Методы культуры клеток для биохимиков / Р. Адаме. -М.:Мир, 1983,- С.258.

2. Бирман, Б .Я. Современные средства оздоровления прудового карпа в рыбхозах республики Беларусь / Б.Я. Бирман, Т.В. Безнос, Р.Н. Даниленко // Ветеринарная наука производству: материалы Междунар. науч.- практ. конф. - Вып. 38.- Минск, 2005.- С. 94-100.

3. Болезни рыб: обзор эпизоотической ситуации за 2006 год // Ветеринарная жизнь.- 2007.- № 14.- С. 2-3.

4. Бучацкий, Л.П. Вирусные инфекции морских и пресноводных животных / Л. П. Бучацкий .- Киев, 1994.- 130 с.

5. Бауер, О.Н. Вопросы паразитологии и патологии рыб / О.Н. Баер // Тр. Зоол. ин-та АН СССР. М.: Наука, 1987. - Т. 171. - С. 47-67.

6. Витакер, А. Среды для культивирования клеток млекопитающих / А. Витакер // Новые методы культуры животных тканей; под ред. Фридлянского.-М.:Мир, 1976,- С. 18.

7. Грищенко, Л.И. Болезни рыб и основы рыбоводства / Л.А. Грищенко и др. М.:Колос,1999.- 456 с.

8. Дьяконов, Л. П. Культуры клеток животных. Современные аспекты биотехнологии и взаимодействия клеток с инфекционными патогенами / Л.П. Дьяконов // Цитология.- 1994.- Т.36.- С. 503-504.

9. Ю.Дьяконов, Л. П. Животная клетка в культуре / Л.П. Дьяконов, В.И. Ситьков // Москва, 2000.- С.102-140.

10. Здоровье рыб, качество и безопасность рыбной продукции в России и ее соответствие международным требованиям / Н.Л Зуев В. В., Юрков С. Г., Курносов А. Н. Зимин и др. // Ветеринарная жизнь.- 2004.- № 5.-С. 4-5.

11. Зуев, B.B. Коллекция культур клеток / В.В. Зуев, С.Г. Юрков, А Н. Курносов // Вестник Рос. акад. сельск. наук.- 1997.- № 2.- С. 69-70.

12. Инфекционные болезни животных / Б.Ф. Бессарабов и др.; под. ред. A.A. Сидорчука.- М.: КолосС, 2007. 671с.

13. Казарникова, A.B. Заболевания осетровых рыб в замкнутой системе водоснабжения/ A.B. Казарникова //Ветеринария.-2007.-№3.-С.25-29

14. Козлов, В.И. Аквакультура / В.И. Козлов, JI.A. Никифоров-Никишин, A.JI. Бородин. М.: КолосС, 2006.-445 с.

15. Ламберт, К. Дж. Среды для выращивания клеток / К. Дж. Ламберт, Дж. Р. Берг // Биотехнология клеток животных; под ред. Р. Е. Спиера.- М., Мир, 1989.- С. 98-125.

16. Литвиненко, В.В. Выявление антител против Rhabdovirus carpio в сыворотке крови рыб при помощи люминесцентной микроскопии /В.В. Литвиненко, Ю.Д. Тимниханов // Рыбное хозяйство. 1989.- Вып.43.-С.62-64.

17. Линпик, В.Я. Состояние и перспективы профилактики основных болезней рыб в прудовых хозяйствах Беларуси / В.Я. Линник, М.П. Голенкова // Ветеринарная наука производству:материалы Междунар. науч.- практ. конф. Вып. 38,- Минск, 2005.- С.322-323.

18. Пичугина, Т. Д. Влияние вирусных инфекций на развитие аквакультуры в России / Т.Д. Пичугина, Е.А. Завьялова // Ветеринарная медицина: Междунар. тематический науч. сб. Вып. 85. - Харьков, 2005,- Т. 2.-С. 906-912.

19. Прудников, B.C. Болезни прудовых рыб монография / B.C. Прудников, A.B. Мясоедов, Б .Я. Бирман.- Минск:Технопринт, 2003.- 96 с.

20. Пичугина, Т.Д. Весенняя виремия карпов / Т.Д. Пичугина и др. // Ветеринария. 2004. - №5. - С.28-30.

21. Рудиков, Н.И. Диагностика весенней вирусной болезни рыб/ Н.И. Рудиков // Новые методы лечения инфекционных болезней рыб: тез. докл. 11 Всес. симпоз. М., 1975. - С.93-95

22. Рудиков, Н.И. Особенности течения вспышек весенней вирусной болезни рыб в зависимости от погодных условий / Н.И. Рудиков, Т.Д. Пичугина // Тез.докл. V Всес. симп. по инфекционным болезням рыб.-М.,1986. С.86-87.

23. Самуйленко, А. Я., Рубан Е. А. Основы технологии производства ветеринарных биологических препаратов / А.Я. Самуйленко, Е.А. Рубан. М, 2000.- Т. 1.- С. 199-202.

24. Сергеев, В. А. Репродукция и выращивание вирусов / В.А. Сергеев -М.:Колос, 1976.- С. 15-125.

25. Спиер, Р. Е. Биотехнология клеток животных / P.E. Спиер, Дж.Б. Гриффите. -М., 1989.-34 с.

26. Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб. М.: Отдел маркетинга АМБ-агро, 1998.- 310 с. (Библиотека консультанта информ.- консульт. службы Минсельхозпрода России).

27. Смирнова, И.Р. Ветеринарно-санитарная и экологическая оценка продукции водоемов комплексного назначения / И.Р. Смирнова и др. // Ветеринария,- 2004.- № 11,- С. 39-44.

28. Щелкунов, И.С. Эпизоотическая ситуация по вирусным болезням культивируемых рыб / И.С. Щелкунов // Ветеринария.- 2006.- № 4.- С. 22-25.

29. Щелкунов, И.С. Rhabdovirus carpió у растительноядных рыб (выделение, идентификация, патогенность) / И.С. Щелкунов, Т.И.

30. Щелкунова // Сборник науч. трудов ВНИИПРХ. 1987. - Т.53. - С. 311.

31. Щелкунов, И.С. Гибридизационная тест-система для экспресс-диагностики весенней виремии карпа / И.С. Щелкунов и др. // Избранные труды ВНИИПРХ. 2002. - Т.2. - С. 471-473.

32. Щелкунов И.С. Разработка тест-систем для идентификации возбудителя весенней виремии карпа на основе методов анализа генома: автореф. дис. . канд. наук / Щелкунов Игорь Степанович. -Покров.-2005.- 26с.

33. Щелкунов, И.С. Карповые гипериммунные антисыворотки для идентификации возбудителя весенней виремии карпа / И.С. Щелкунов, Т.И. Щелкунова//Эспресс-информ. ВНИИПРХ, 1991.-Вып. 1. С. 1-6.

34. Юрков, С. Г, Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ / С.Г. Юрков и др. // Покров, Россельхозакадемия, ВНИИВВиМ, 2000. 78с.

35. Ahne W. Occurrence of VHS in wild white fish (Coregonus sp.) / W.Ahne, I.Thomsen // Journal of Veterinary Medicine. 1985. - P.75.

36. Basurco, B. Distant strains of the fish rhabdovirus VHSV maintain a sixth functional cistron which codes for a nonstructural protein of unknown function / B. Basurco, A. Benmansour // Virology. 1995. - Vol.212, N2.-P.741-745.

37. Basurco, B. Genetic diversity and phylogenetic classification of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) / B. Basurco et al. // Vet Res. -1995. -Vol.26, N5-6. -P.460-463.

38. Basurco, B. The free nucleocapsids of the viral haemorrhagic septicaemia virus contain two antigenically related nucleoproteins / B. Basurco et al. // Arch Virol. 1991 .- Vol.119, N 3-4. - P. 153-163.

39. Bearzotti, M. The glycoprotein of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV): antigenicity and role in virulence / M. Bearzotti et al. // Vet Res.-1995. Vol. 26, N 5-6. - P. 413-422.

40. Benmansour, A. Sequence variation of the glycoprotein gene identifies three distinct lineages within field isolates of viral haemorrhagic septicaemia virus, a fish rhabdovirus / A. Benmansour et al. // J Gen Virol. 1997. -Vol. 78, N 11.-P. 2837-2846.

41. Bernard, J. Cloning and sequencing the messenger RNA of the N gene of viral haemorrhagic septicaemia virus / J. Bernard et al. // J Gen Virol. -1990. Vol.71, N 8. - P. 1669-1674.

42. Bernard, J. Molecular biology of fish viruses: a review / J. Bernard, M. Bremont//Vet Res. 1995. - Vol. 26, N5-6. - P. 341-351.

43. Bernard, J. Nucleocapsid gene sequence of a North American isolate of viral haemorrhagic septicaemia virus, a fish rhabdovirus / J. Bernard , M. Bremont, J. Winton // J. Gen. Virol.-1992 .- Vol. 73, N 4.- P. 1011-1014.

44. Betts, A.M. Nucleotide sequence analysis of the entire coding regions of virulent and avirulent strains of viral haemorrhagic septicaemia virus/ A.M. Betts, D.M. Stone // Virus Genes. 2000. - Vol. 20, N 3. - P.259-262.

45. Bowden, T.J. A study of the susceptibility of Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus (L.), to viral haemorrhagic septicaemia virus isolated from turbot, Scophthalmus maximus (L.) / T.J. Bowden // J. Fish Dis. 2003. -Vol.26, N4.-P. 207-212.

46. Bruchhof, B. Differential diagnosis of fish pathogenic rhabdoviruses by reverse transcriptase-dependent polymerase chain reaction / B. Bruchhof, O. Marquardt, P.J. Enzmann // J. Virol. Methods. 1995. - Vol.55, N1. -P.l 11119.

47. Brudeseth, B.E. Occurrence of viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) in wild marine fish species in the coastal regions of Norway/ B.E. Brudeseth, O. Evensen // Dis. Aquat.Organ. 2002. - Vol.52, N1. - P. 21-28.

48. Chico, V. Rapid detection and quantitation of viral hemorrhagic septicemia virus in experimentally challenged rainbow trout by real-time RT-PCR / V. Chico, N. Gomez, A. Estepa // J. Virol. Methods. 2006. - Vol.132, N1-2. -P.154-159.

49. Chilmonczyk, S. Pathogenesis of viral haemorrhagic septicaemia virus: cellular aspects / S. Chilmonczyk, I. Voccia, D. Monge // Vet Res. 1995. -Vol.26, N5-6.-P.505-511.

50. Cupit, P.M. Neutralisation and binding of VHS virus by monovalent antibody fragments/ P. M. Cupit, N. Lorenzen, G. Strachan // Virus Res. -2001. Vol. 81, N1-2. - P.47-56.

51. Dixon, P.F. Four years of monitoring for viral haemorrhagic septicaemia virus in marine waters around the United Kingdom / P.F. Dixon et al. // Dis Aquat Organ. 2003. - Vol.54, N3. - P. 175-186.

52. Dopaz, C. P. Isolation of viral hemorrhagic septicemia virus from Greenland halibut Reinhardtius hippoglossoides caught at the Flemish Cap / C.P. Dopaz et al. //Dis. Aquat. Organ. 2002. - Vol.50, N3. - P. 171-179.

53. Dorson, M. Selection of rainbow trout resistant to viral haemorrhagic septicaemia virus and transmission of resistance by gynogenesis / M. Dorson, E. Quillet, M.G. Hollebecq // Vet Res. 1995. - Vol. 26, N 5-6. -P. 361-368.

54. Einer-Jensen, K. Evolution of the fish rhabdovirus viral haemorrhagic septicaemia virus/ K. Einer-Jensen, P. Ahrens, R. Forsberg // J. Gen. Virol.- 2004. Vol.85, N5. - P.l 167-1179.

55. Einer-Jensen, K. Genotyping of the fish rhabdovirus, viral haemorrhagic septicaemia virus, by restriction fragment length polymorphisms / K. Einer-Jensen, J. Winton, N. Lorenzen // Vet. Microbiol. 2005. - Vol.106, N 3-4.- P.167-178.

56. Estepa, A. Detection of trout haemorrhagic septicaemia rhabdovirus by capture with monoclonal antibodies and amplification with PCR / A. Estepa, C. De Blas, F. Ponz // Vet Res. 1995. - Vol. 26, N 5-6. - P. 530-532.

57. Fabregas, J. In vitro inhibition of the replication of haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) and African swine fever virus (ASFV) by extracts from marine microalgae / J. Fabregas et al. // Antiviral Res. 1999. - Vol. 44, N 1. - P. 67-73.

58. Fernandez-Alonso, M. Mapping of linear antibody epitopes of the glycoprotein of VHSV, a salmonid rhabdovirus / M. Fernandez-Alonso et al. // Dis. Aquat. Organ. 1998. - Vol.34, N3. - P. 167-176.

59. Fichtner, D. Characterization of viral hemorrhagic septicemia (VHS) virus isolates in Trout/ D. Fichtner et al. // Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. 1998. -H.111,N3. - S. 93-99.

60. Fijan, N Fish biology / N. Fijan et al. //Ann Virol(Inst.Pasteur).-1983.-143 E.

61. Gagne, N. Isolation of viral haemorrhagic septicaemia virus from mummichog, stickleback, striped bass and brown trout in eastern Canada / N. Gagne et al. //J. Fish Dis. 2007. - Vol. 30, N 4. - P. 213-23.

62. Gaudin, Y. Mutations in the glycoprotein of viral haemorrhagic septicaemia virus that affect virulence for fish and the pH threshold for membrane fusion /Y. Gaudin , P. de Kinkelin , A. Benmansour // J. Gen. Virol. 1999. -Vol. 80, N5.-P. 1221-1229.

63. Hedrick, R.P. Host and geographic range extensions of the North American 1 strain of viral hemorrhagic septicemia virus / R. P. Hedrick et al. // Dis. Aquat Organ. 2003. - Vol.55, N 3. - P. 211-220.

64. Hershberger, P.K. Epizootiology of viral hemorrhagic septicemia virus in Pacific herring from the spawn-on-kelp fishery in Prince William Sound, Alaska, USA / P.K. Hershberger et al. // Dis. Aquat. Organ. 1999. - Vol. 37, N1. - P.23-31.

65. Hoffmann, B. Fish rhabdoviruses: molecular epidemiology and evolution / Hoffmann B., Beer M., Schutze H. // Curr Top Microbiol Immunol. 2005. -Vol. 292.-P. 81-117.

66. Kim, D.H. Complete nucleotide sequence of the hirame rhabdovirus, a pathogen of marine fish / D.H. Kim et al. // Virus Res. 2005. - Vol. 107, N1. -P. 1-9.

67. King, J.A. Distribution of viral haemorrhagic septicaemia virus in wild fish species of the North Sea, north east Atlantic Ocean and Irish Sea / J.A. King, M. Snow, D.A. Smail // Dis. Aquat Organ. 2001. - Vol. 47, N 2. - P. 8186.

68. Knuesel, R. A survey of viral diseases in farmed and feral salmonids in Switzerland / R. ICnuesel, H. Segner, T. Wahli // J. Fish Dis.-- 2003. -Vol.26, N3.-P. 167-182.

69. Kurath, G. Distribution and variation of NV genes in fish rhabdoviruses / G. ICurath, K.H. Higman, H.V. Bjorklund // J. Gen. 1997. - Vol.78, N 1.-P.113-117.

70. LaPatra, S.E. Protection of rainbow trout against infectious hematopoietic necrosis virus four days after specific or semi-specific DNA vaccination / S.E. LaPatra et al. // Vaccine. 2001. - Vol. 19, N28. - 29. - P/ 4011-4019.

71. Lopez-Vazquez, C. Development of a rapid, sensitive and non-lethal diagnostic assay for the detection of viral haemorrhagic septicaemia virus / C. Lopez-Vazquez et al. // J. Virol. Methods. 2006. - Vol. 133, N2. - P. 167-174.

72. Lorenzen, E. Inter-laboratory comparison of cell lines for susceptibility to three viruses: VHSV, IHNV and IPNV / E. Lorenzen, B. Carstensen, N. J. Olesen // Dis. Aquat Organ. 1999. - Vol. 37, N 2. - P.81-88.

73. Lorenzen, N. Multiplication of VHS virus in insect cells / N. Lorenzen , N.J. Olesen // Vet. Res. 1995. - Vol. 26, N5-6. - P.428-432.

74. Lorenzen, N. Neutralization of Egtved virus pathogenicity to cell cultures and fish by monoclonal antibodies to the viral G protein / N. Lorenzen, N.J. Olesen, P.E. Jorgensen // J. Gen. Virol. 1990. - Vol.71, N. 3. -P.561-567.

75. Lorenzo, G. Fast neutralization/immunoperoxidase assay for viral haemorrhagic septicaemia with anti-nucleoprotein monoclonal antibody / G. Lorenzo, A. Estepa, J.M. Coll // J. Virol. Methods. 1996. - Vol.58, N1-2. -P.l-6.

76. Lorenzo, G.A. Mapping of the G and N regions of viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) inducing lymphoproliferation by pepscan / G. A. Lorenzo, A. Estepa, S. Chilmonczyk // Vet. Res. 1995. - Vol.26, N 5-6. -P.521-525.

77. Marroqui, L. Assessment of the inhibitory effect of ribavirin on the rainbow trout rhabdovirus VHSV by real-time reverse-transcription PCR /L. Marroqui, A. Estepa, L. Perez // Vet. Microbiol. 2007. - Vol.122, N1-2. -P. 52-60.

78. Mas, V. Reversible inhibition of spreading of in vitro infection and imbalance of viral protein accumulation at low pH in viral hemorrhagic septicemia rhabdovirus, a salmonid rhabdovirus / V. Mas et al. // J. Virol. -2004. Vol.78, N4. - P. 1936-44.

79. McAllister, K.W. Salmonid fish viruses / In:Fish Medicine, edited by M.K.Stoslcopf.- Philadelphia:W.B.Saunders Co, 1993.- 380-408p.

80. Micol, V. The olive leaf extract exhibits antiviral activity against viral haemorrhagic septicaemia rhabdovirus (VHSY) / V. Micol et al. // Antiviral Res. 2005. - Vol.66, N2-3. - P.129-136.

81. Mortensen, H.F. Isolation of viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) from wild marine fish species in the Baltic Sea, Kattegat, Skagerrak and the North Sea /H.F. Mortensen et al.// Virus Res.-1999.- Vol.63,N1-2.-P.95-106.

82. Mourton, C. Antigen-capture ELISA for viral haemorrhagic septicaemia virus serotype I / C. Mourton et al. // J. Virol. Methods. 1990. -Vol.29, N3.-P.325-333.

83. Muroga, K. Experimental horizontal transmission of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) in Japanese flounder Paralichthys olivaceus/ K. Muroga // Dis. Aquat Organ. 2004. - Vol.58, N 2-3. - P. 111115.

84. Nishizawa, T. Genetic relatedness among Japanese, American and European isolates of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) based on partial G and P genes / T. Nishizawa et al. // Dis. Aquat Organ. 2002. -Vol.48, N2.-P.143-148.

85. Nishizawa, T. Genotyping and pathogenicity of viral hemorrhagic septicemia virus from free-living turbot (Psetta maxima) in a Turkish coastal area of the Black Sea / T. Nishizawa et al. // Appl. Environ. Microbiol. -2006. Vol.72, N4. - P.2373-2378.

86. Nishizawa ,T. Nucleotide sequence of the 2 matrix protein-genes (Ml and M2) of hirame rhabdovirus (HRV), a fish rhabdovirus/ T. Nishizawa,

87. G. Kurath, J.R. Winton // Vet Res. 1995. - Vol.26, N5-6. - P.408-412.th

88. OIE Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals, 4 ed. Office1.ternational des Epizooties, Paris, 2003.

89. Perez, L. Purification of the glycoprotein G from viral haemorrhagic septicaemia virus, a fish rhabdovirus, by lectin affinity chromatography / L. Perez L, A. Estepa, J.M. Coll // J. Virol. Methods. 1998. - Vol.76, N 1-2. -P.1-8.

90. Quillet, E. In vitro viral haemorrhagic septicaemia virus replication in excised fins of rainbow trout: correlation with resistance to waterborne challenge and genetic variation / E. Quillet et al. // Dis. Aquat Organ. -2001.- Vol.45, N3.-P.171-82.

91. Quillet, E. Wide range of susceptibility to rhabdoviruses in homozygous clones of rainbow trout / E. Quillet // Fish Shellfish Immunol.-2007. -Vol.22, N5. P.510-519.

92. Raja-Halli, M. Viral haemorrhagic septicaemia (VHS) outbreaks in Finnish rainbow trout farms / M. Raja-Halli et al. // Dis Aquat Organ. -2006 -Vol.72, N3.-P. 201-11.

93. Rehulka, J. Haematological analyses in rainbow trout Oncorhynchus mykiss affected by viral haemorrhagic septicaemia (VHS) / J. Rehulka // Dis. Aquat Organ. -2003. -Vol.56, N 3. P. 185-193.

94. Rocha, A. Antibody response to a fragment of the protein G of VHS rhabdovirus in immunised trout / A. Rocha et al. // Vet. Immunol. Immunopathol. 2002. - Vol. 86, N1-2. - P. 89-99.

95. Rocha, A. Characterisation of the syncytia formed by VHS salmonid rhabdovirus G gene transfected cells / A. Rocha et al. // Vet; Immunol Immunopathol. 2004. - Vol.99, N 3-4. - P.143-152.

96. Said, T. An RNA-binding domain in the viral haemorrhagic septicaemia virus nucleoprotein / T. Said et al. // J. Gen. Virol. 1998. -Vol.79, N l.-P. 47-50.

97. Sanz, F. Neutralizing-enhancing monoclonal antibody recognizes the denatured glycoprotein of viral haemorrhagic septicaemia virus / F. Sanz, J.M. Coll // Arch Virol. 1992.-Vol. 127, N 1-4. - P.223-232.

98. Schutze, H. Complete genomic sequence of viral hemorrhagic septicemia virus, a fish rhabdovirus / H. Schutze, E. Mundt, T.C. Mettenleiter // Virus Genes. 1999. - Vol.19, N 1.- P. 59-95.

99. Schutze, H. Identification of the non-virion (NV) protein of fish rhabdoviruses viral haemorrhagic septicaemia virus and infectious haematopoietic necrosis virus / H. Schutze et al. // J. Gen. Virol. 1996. -Vol. 77, N6. - P. 1259-1263.

100. Slcall, H.F. Experimental infection of rainbow trout Oncorhynchus mykiss with viral haemorrhagic septicaemia virus isolates from European marine and farmed fishes / H. F. Slcall et al. // Dis. Aquat Organ. 2004. -Vol.58, N2-3. -P.99-110.

101. Slcall, H.F. Prevalence of viral haemorrhagic septicaemia virus in Danish marine fishes and its occurrence in new host species / H.F. Slcall, N.J. Olesen, S. Mellergaard // Dis. Aquat Organ. 2005. - Vol.66, N2. -P.145-151.

102. Slcall, H.F. Viral haemorrhagic septicaemia virus in marine fish and its implications for fish farming—a review / H.F. Slcall, N.J. Olesen, S. Mellergaard // J. Fish Dis. 2005. - Vol.28, N9. - P. 509-29.

103. Snow, M. Analysis of the nucleoprotein gene identifies distinct lineages of viral haemorrhagic septicaemia virus within the European marine environment / M. Snow M, et al. // Virus Res. 1999. - Vol.63J N 1-2. - P. 35-44.

104. Snow, M. Comparative susceptibility of turbot Scophthalmus maximus to different genotypes of viral haemorrhagic septicaemia virus / M. Snow et al.// Dis. Aquat Organ. 2005. - Vol.67, N 1-2. - P. 31-38.

105. Snow, M. Experimental susceptibility of turbot Scophthalmus maximus to viral haemorrhagic septicaemia virus isolated from cultivated turbot / M. Snow, D. Smail // Dis. Aquat Organ. 1999. - Vol. 38, N3. -P.163-168.

106. Snow, M. Genetic population structure of marine viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) / M. Snow et al. // Dis. Aquat Organ. 2004. -Vol.61, N 1-2. - P. 11-21.

107. Snow, M. Virulence and nucleotide sequence analysis of marine viral haemorrhagic septicaemia virus following in vivo passage in rainbow trout Onchorhynchus mykiss / M. Snow, C.O. Cunningham // Dis. Aquat Organ. -2000.-Vol. 42, N1.-P. 17-26.

108. Soliman, H. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS) / H. Soliman, M. El-Matbouli // Vet. Microbiol. -2006. Vol.114, N 3-4. - P. 205-213.

109. Thiery, R. Phylogenetic analysis of viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) isolates from France (1971-1999) / R. Thiery et,al. // Dis. Aquat Organ. 2002. - Vol. 52, N1. - P. 29-37.

110. Thiry, M. Molecular cloning of the mRNA coding for the G protein of the viral haemorrhagic septicaemia (VHS) of salmonids / M. Thiry et al. // Vet. Microbiol. 1990. -Vol. 23, N1-4. - P. 221-226.

111. Vautherot, D. Expression of viral hemorrhagic septicemia virus structural proteins in the baculovirus expression system / D. Vautherot et al. // Vet. Res. 1995. - Vol.26, N5-6. - P.548-549.

112. Walker, P.J. et al.: In:van Regenmortel M.H.V., Fauquet C.M., Bishop D.H.L., Carstens E.B., and 7 others (Eds.), The 7th Report of the International Committee for Taxonomy of Viruses. Academic Press, San Diego, CA. 2000.

113. Williams, K. Multiplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection of three fish viruses / K. Williams et al. // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37, N12. - P.4139-4141.

114. Wolf, K. Fish viruses and fish viral diseases / K. Wolf. Cornell University Press, 1988. - 476 p.