Идентификация видового состава и изучение сезонной динамики бактериопланктона малых эвтрофных водохранилищ методами молекулярной генетики

Трусова, Мария Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Идентификация видового состава и изучение сезонной динамики бактериопланктона малых эвтрофных водохранилищ методами молекулярной генетики
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Идентификация видового состава и изучение сезонной динамики бактериопланктона малых эвтрофных водохранилищ методами молекулярной генетики"

На правах рукописи

Трусова Мария Юрьевна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИДОВОГО СОСТАВА И ИЗУЧЕНИЕ СЕЗОННОЙ ДИНАМИКИ БАКТЕРИОПЛАНКТОНА МАЛЫХ ЭВТРОФНЫХ ВОДОХРАНИЛИЩ МЕТОДАМИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ

03.00.02-Биофизика 03.00.18 - Гидробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск - 2004

Работа выполнена в Институте биофизики СО РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук М.И. Гладышев

кандидат биологических наук Б.А. Илларионов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А.И. Копылов

кандидат биологических наук СВ. Маркова

Ведущая организация: Лимнологический институт СО РАН

Защита диссертации состоится 2004 г. в часов на

заседании Диссертационного совета Д 003.007.01 при Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, Красноярск, Академгородок

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН

Автореферат разослан

2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-математических наук

Л.Г. Косолапова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Необходимой составляющей любого экологического исследования является определение видового состава организмов, населяющих экосистему. По образному выражению В.И.Вернадского, каждый биологический вид в природе выполняет уникальную, только ему присущую «геохимическую работу», т.е. потребляет определенные виды вещества и энергии и синтезирует из них другие специфические вещества, включая собственную биомассу. В экологической биофизике функциональная (биогеохимическая) роль видов в экосистеме формализуется в виде численных значений кинетических ростовых характеристик: удельной скорости роста и константы полунасыщения Они количественно выражают интегральную скорость биохимических реакций, которая заложена в генотипе организмов.

Важнейшим звеном любой экосистемы являются редуценты, представленные в водных экосистемах в основном бактериопланктоном. Однако, в отличие от фито- и зоопланктона, бактериопланктон практически во всех моделях природных водоемов представлен агрегированной компонентой (Адамович, 1992; Гладышев, 1999). Причиной этого является трудность идентификации видового состава бактериопланктона классическими микробиологическими методами. Основным методом определения видовой принадлежности бактерий в течение длительного периода было выращивание на твердых селективных средах. Однако, поскольку на твердых средах вырастает не более 1-3% планктонных бактерий, определяемых прямым счетом (Горленко и др., 1977; Cole, 1982; Amann et al., 1995), до недавнего времени видовой состав бактериопланктона оставался практически неизвестным. Данное обстоятельство существенно снижает прогностическую ценность динамических моделей. Появление в последнее десятилетие нового, молекулярно-генетического метода определения видовой принадлежности бактерий на основе анализа нуклеотидных последовательностей их рРНК (генов рРНК) дает возможность более полного описания бактериального звена водных экосистем, адекватного задачам экологической биофизики.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было качественное и количественное изучение бактериального звена двух пресноводных эвтрофных водохранилищ методами молекулярно-генетического анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК. Были поставлены следующие задачи:

1. Определить видовой состав бактериопланктона малых пригородных эвтрофных водохранилищ Бугач и Лесной.

2. Изучить сезонную динамику видового состава бактериопланктона этих водоемов.

3. Определить виды водных бактерий, использующих в качестве субстрата

биоразрушаемые полимеры

,1алканоатоР|

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

srsqssox

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые

определен видовой состав и сезонная динамика доминирующих видов некультивируемых бактерий малых эвтрофных водохранилищ. Обнаружено и зарегистрировано в международной базе данных 15 новых видов некультивируемых бактерий. Проведенное исследование имеет практическое значение для разработки методов определения специфических субстратов, утилизируемых некультивируемыми видами бактериопланктона в нестерильных условиях экспериментальных микроэкосистем. Положения, выносимые на защиту:

1. Получено свидетельство глобального распространения многих видов водных бактерий, что не имеет аналогов среди других эволюционно более молодых типов организмов.

2. Видовой состав доминирующих видов свободноживущего бактериопланктона «цветущего» и «нецветущего» цианопрокариотами водохранилищ не имеет ярко выраженных различий в течение вегетационного периода.

3. В нестерильных условиях экспериментальных МЭС возможно определение специфических субстратов, утилизируемых некультивируемыми видами бактериопланктона.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на VIII съезде Гидробиологического общества РАН (Светлогорск, 2001), конференции молодых ученых и специалистов Института биофизики СО РАН (Красноярск, 2002), I Конгрессе Европейских микробиологических обществ (Любляна, Словения, 2003), семинарах лаборатории экспериментальной гидроэкологии Института биофизики СО РАН (Красноярск, 2000-2002).

Публикации. По материалам работы опубликовано 3 статьи в рецензируемых научных журналах.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 123 страницах, содержит 12 рисунков и 10 таблиц. Список цитируемой литературы насчитывает 225 источников, в том числе 187 иностранных.

Представленные исследования были выполнены при поддержке Министерства образования Российской Федерации и Американского фонда гражданских исследований и развития для независимых государств бывшего Советского Союза (грант № REC-002), Министерства образования Российской федерации (фант «Университеты России» № УР-07-01-011), РФФИ<гранты № 01-04-49328 и 03-04-06075мас) и Красноярского краевого фонда науки (гранты № 11F028M И 13G074).

Благодарности. Автор благодарит сотрудников лаборатории водной микробиологии Лимнологического института СО РАН за помощь в проведении "однобуквенного" секвенирования, ДНК, а также Центр коллективного пользования по секвенированию. ДНК на базе НИБХ СО РАН и ИЦИГ СО РАН

(Новосибирск) и Центр коллективного пользования приборами НОЦ «Енисей» (КрасГУ, Красноярск) за предоставленную возможность пользования автоматическими секвенаторами и другим молекулярно-генетическим оборудованием.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 2. Объект и методы исследования

Материалы для исследования получены в 1999-2001 гг.

Водохранилище (местное название - пруд) Бугач - малый пригородный водоем рекреационного и рыбоводного назначения, образованный на вторичном притоке Енисея. Площадь поверхности около 21 га, максимальная глубина -8 м, средняя -5 м. Прозрачность по диску Секки - 0.25-0.8 м, значения pH - 7.9-9.5. Летом в п. Бугач доминируют крупные дафнии: Daphnia O.F. и В начале вегетационного

периода в водоеме происходит массовое развитие диатомовых и динофитовых водорослей. По биомассе доминирует Stephanodiscus hantzschii, субдоминантом является Cyclotella comta. В июне-августе в п. Бугач наблюдается «цветение» воды синезелеными водорослями (цианопрокариотами) - Anabaena flos-aquae, Aphanizomenon flos-aquae, Microcystis aeruginosa. В 2000 году в фитопланктоне пруда появился новый вид-вселенец

Пруд (малое водохранилище) Лесной расположен на ручье, впадающем в р. Бугач. Площадь около 0.3 га, средняя глубина 3 м, максимальная - до 9 м. Водоем «каньонного» типа, практически не имеет выраженной литоральной зоны. Пруд используется населением для забора воды на полив приусадебных участков, для купания и рыбной ловли. Прозрачность по диску Секки - 0.7-2.1 м, значения pH - 7.9-9.5. В п. Лесной доминируют мелкие кладоцеры, Bosmina longirostris O.F. Müller и Ceriodaphnia quadrangula O.F. Müller. В п. Лесной в начале вегетационного периода наблюдается полное доминирование S.

а затем появляются субдоминанты из представителей других родов диатомовых водорослей, которые затем доминируют до конца июня. С конца июня до конца июля происходит быстрая смена доминирующих видов эвгленовых, зеленых и синезеленых («нецветущий» Synechocystis salina) водорослей на фоне их низкой биомассы. Наиболее часто доминирует S. salina. Во второй половине лета развиваются microporum, Vol vox aureus.

Отбор проб воды для идентификации и анализа сезонной динамики видового состава бактериопланктона проводили в декабре 1999 г. однократно, с поверхностного горизонта из-подо льда. В 2000 г. - ежемесячно с июня по октябрь на п. Бугач и п. Лесной, и с мая по сентябрь 2001 г. на п. Бугач. Пробы воды в объеме 0.5-2 л отбирали батометром типа Дьяченко-Кожевникова на открытой части в центре водоемов в виде интегральной пробы с горизонтов 0-

1-2-3 м (п. Лесной) и 0-1-2 м (п. Бугач). Для гидробиологических исследований пробы воды в 1999 г. отбирали в п. Бугач еженедельно с мая по сентябрь. Общую численность бактерий (ОЧБ) в пробах оценивали методом эпифлуоресцентной микроскопии (Поглазова, Мицкевич, 1984). Данные 19971998 гг. предоставлены лабораторией экспериментальной гидроэкологии, данные по численности сапрофитных бактерий (СБ) и бактерий группы кишечной палочки (БГКП) - к.б.н., доц. Е.Я. Мучкиной.

После предварительной фильтрации через крупнопористые мембранные фильтры 2.5 мкм, бактериопланктон концентрировали на бактериальных фильтрах 0.22 мкм. Хромосомную ДНК бактерий выделяли с использованием лизиса клеток хаотропным реагентом с последующей сорбцией ДНК на стеклянном сорбенте (Vogelstein, Gillespie, 1979). Фрагменты гена 16S рРНК размером 894 п.н. амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В реакции использовали универсальные праймеры, комплементарные консервативным участкам гена 16S рРНК эубактерий: прямой 514F и обратный 1407R. Полученные ПЦР-продукты клонировали в клетки E.coli. Отбор клонов, содержащих вставку, проводили методом «бело-голубого» скрининга (Sambrook et al., 1989). Для выявления идентичных клонов проводили секвенирование вставок по одной букве. Полную нуклеотидную последовательность уникальных клонов определяли на автоматическом секвенаторе. Полученные последовательности сравнивали с последовательностями электронных баз данных EMBL и GenBank через Интернет. Эволюционные расстояния оценивали с помощью однопараметрической модели (1969), разрывы

последовательностей в анализе не учитывали. Построение филогенетических деревьев, основанных на сравнении последовательностей гена 16S рРНК, производили с помощью метода, реализованного в пакете

программ TREECON (Van de Peer, de Wachter, 1994).

Для анализа сезонной динамики видового состава бактериопланктона применяли метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ), позволяющий эффективно разделять фрагменты ДНК одинакового размера, различающиеся по нуклеотидной последовательности (Muyzer et al., 1993). Для анализа использовали 800 нг ДНК, амплифицированной с помощью праймеров GC341F и 926R. ДГГЭ выполняли на приборе DCode Universal Mutation Detection System (BioRad, США) в 6% полиакриламидном геле с градиентом денатурирующих агентов от 40% до 70% (100% денатурирующий реагент представляет собой смесь 7 М раствора мочевины и 40% деионизованного формамида). Электрофорез вели при 60°С в однократном трис-ацетатном буфере при напряжении 100 В в течение 17 часов. По окончании электрофореза гель окрашивали бромистым этидием и получали цифровые изображения в УФ свете (302 нм) на приборе Alphalmager (Alpha Innotech Corp., США). Цифровые изображения гелей обрабатывали в пакете программ AlphaEase v5.5 (Alpha

Innotech Corp., США), с использованием программы денситометрического анализа 1D-Multi.

Для выявления специфических групп некультивируемого бактериопланктона, использующих в качестве субстрата биодеградируемые полимеры гидроксиалканоатов, 5.09.-17.10. 2000 г. был проведен полевой эксперимент. В качестве субстрата использовали пленки сополимера (3-оксимасляной и Р-оксивалериановой кислот (ПОБ-со-ПОВ) (Волова и др. 2003). Бутыль, содержащая пленки сополимера, и контрольная бутыль экспонировались в течение 42 суток в п. Бугач на глубине 0.5 м от поверхности. По окончании эксперимента воду из контрольной и опытной бутылей, а также суспензию бактериальных клеток, смытых с поверхности пленок, обрабатывали и анализировали методом ДГГЭ.

Статистическую обработку результатов проводили стандартными методами (Плохинский, 1978) с использованием программного пакета Microsoft Excel с оригинальными макросами. Во внимание принимались только сильные (]г|> 0.50) и статистически достоверные корреляционные связи. Кластерный анализ результатов ДГТЭ выполняли методом одного звена с построением кратчайшего остовного дерева (Джефферс, 1981) по оригинальной программе, разработанной д.б.н. М.И. Гладышевым (ИБФ СО РАН).

Глава 3. Бактериопланктон пруда Бугач и его связь с гидробиологическими и гидрохимическими показателями экосистемы

По результатам анализа данных 1997-1999 гг. в динамике общей численности бактериопланктона (рис. 1) в течение вегетационного сезона выделены два периода: первый - с максимальными значениями и резкими колебаниями численности (в начале и середине сезона) и второй - с небольшими флуктуациями численности при ее относительно низком среднем значении. Средняя биомасса бактерий в 1997 г. составила 1.0±0.09 мг-л"1, в 1998 г. - 1.010.14 мг-л"1, в 1999 г.-0.9±0.11 мг-л"1.

Для выявления связей ОЧБ, численностей СБ и БГКП с различными гидробиологическими и гидрохимическими компонентами экосистемы п. Бугач был проведен корреляционный анализ. Статистический анализ данных не выявил повторяющихся из года в год корреляций ОЧБ с основными экологическими факторами. Это могло быть вызвано несколькими причинами. Основной причиной могла быть неконтролируемая при учете ОЧБ смена видового состава, которая, в свою очередь, определяется как абиотическими, так и биотическими компонентами экосистемы. Так, важной причиной отсутствия стойкой корреляции бактериопланктона с остальными компонентами экосистемы могла быть смена лимитирующего фактора, вызванная спецификой гидрологических условий каждого года.

Рис. 1. Динамика ОЧБ, численности СБ и БГКП пр. Бугач в 1997-1999 гг.

При выделении более узких систематических групп бактерий стало возможным выявление большего числа устойчивых связей их численности с факторами среды, чем при учете ОЧБ. Установлено, что из изученных абиотических факторов на сезонную динамику СБ п. Бугач положительное и ежегодно повторяющееся влияние оказывало содержание общего азота (коэффициенты корреляции 0.67 в 1998 и 0.68 в 1999 гг). Важен выявленный факт связи СБ и БГКП с зоопланктоном. В течение двух лет наблюдений была зафиксирована прямая положительная корреляция СБ с биомассой коловраток (0.80 и 0.65 в 1998 и 1999 гг., соответственно). В 1999 г. зарегистрированы отрицательные коэффициенты корреляции между СБ и биомассой зоопланктона, циклопов и науплиев (коэффициенты корреляции, соответственно, -0.75, -0.72, -0.79), была выявлена высокая степень корреляции как зоопланктона в целом, так и кладоцер (фильтраторов) и копепод (хищников) с БГКП (коэффициенты корреляции 0.83, 0.78 и 0.78, соответственно). При этом отмечено взаимное стимулирующее влияние, т.е. наличие кросс-корреляционных связей со сдвигом в 1-2 недели. Это может быть связано как с выеданием этих бактерий ракообразными, так и с активизацией бактериальных клеток при прохождении через пищеварительный тракт рачков, так называемый "viable gut passage" (King et al., 1991). He исключено, что часть БГКП является собственной кишечной микрофлорой рачков, по тем или иным причинам выделяющейся во внешнюю среду. Отсутствие устойчивой корреляции ОЧБ и выявление высоких коэффициентов корреляции небольшой группы бактериального сообщества (БГКП) с отмеченными факторами указывает на необходимость определения видового

состава бактериопланктона, в том числе - с применением современных молекулярно-генетических методов.

Результаты проведенных исследований позволяют заключить, что в малом рекреационном пруду Бугач однозначные устойчивые связи динамики бактериопланктона в целом с абиотическими и биотическими компонентами экосистемы в период 1997-1999 гг. отсутствовали. В то же время, выделение отдельных групп бактериопланктона позволило выявить наличие комплекса их взаимодействий с другими компонентами водной экосистемы. Таким образом, определение видовой структуры звена бактериопланктона с применением молекулярно-генетических методов анализа представляется логичным и необходимым шагом для изучения взаимосвязей трофических компонентов экосистемы пруда Бугач.

Глава 4. Определение видового состава зимнего бактериопланктона двух эвтрофных прудов по последовательностям гена 16S рРНК

Анализ 151 нуклеотидной последовательности клонированных генов 16S рРНК выявил 48 групп уникальных клонов. Данные о генетически наиболее близких им последовательностях приведены в табл. 1. Среди полученных клонов обнаружено 15 последовательностей гена 16S рРНК, гомология которых с ранее известными последовательностями составила менее 97%, что позволяет отнести данные клоны к новым видам бактерий (Cohan, 2002). Эти 15 последовательностей были депонированы в Интернет-базе данных EMBL/GenBank/DDBJ под номерами: AJ320487, AJ320489, AJ344195, AJ344197, AJ344200-344205, AJ344207, AJ344208, AJ507787, AJ507789, AJ507792.

Из 33 клонов с высокой гомологией (>97%) с известными последовательностями гена 16S рРНК 18 имели сходство с различными штаммами культивируемых бактерий, 15 - с некультивируемыми бактериями, выявленными только по последовательностям 16S рРНК. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей (рис. 2) выявил 7 отдельных кластеров: a-, ß-, у-, и е-Протеобакгерии, Актиномицеты (грамположительные бактерии с высоким содержанием ГЦ-пар), Verrucomicrobia и группа Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB). В качестве наиболее многочисленных в обоих водоемах идентифицированы актиномицеты (24.8% в п. Бугач и 28.2% в п. Лесной) и ß-протеобактерии (22.9% и 26.1%, соответственно). Следующей по численности была группа CFB (21.9% и 19.6%, соответственно). Подобная картина распределения филогенетических групп бактерий получена при сходных исследованиях преимущественно олиго- и мезотрофных пресноводных водоемов (Glöckner et al., 2000; Urbach et al., 2001; Zwart et al., 2002).

Таблица 1

Бактерии из банка данных, наиболее родственные по последовательности гена _^ рРНК бактериям прудов Бугач и Лесной (декабрь 1999 г.)_

№ Клон Длина, п.н. Ближайший родственник % сходства Группа

1 BUG-52 655 Uncultured bacterium GKS2-106 95.4 Группа СРВ'

2 BUG-54 470 Variovorax paradoxus str. VAI-C 98.2 (5-Протеобактерии

3 BUG-57 645 Uncultured bacterium 404-57 97.9 Актиномицеты

4 BUG-62 637 Pseudomonas sp. 2N1-1 98.3 у-Протеобактерии

5. BUG-65 647 Unidentified eubacterium clone sipK57 96.4 Группа СРВ

6 BUG-67 534 Uncultured bacterium CL120-10 96.3 УеггисоткгоЫа

7 BUG-82 635 Cytophaga sp. PI 96.7 Группа СРВ

8 BUG-89 640 Uncultured bacterium, isolate LD12 99.7 а-Протеобакгерии .-

9 BUG-90 569 Uncultured proteobacterium Wubal39 98.4 Р-Протеобактерии

10 BUG-91 501 Uncultured eubacterium, clone GKS98 99.4 Р-Протеобактерии >

11 BUG-92 598 Acidovorax sp. UFZ-B517 99.3 Р-Протеобактерии

12 BUG-102 487 Flavobaeterium xantum 97.5 Группа СРВ

13 BUG-103 496' Cytophagales clone PRD01 aOO 1В 98.6 Группа СРВ

14 BUG-107 505 Proteobacterium PRD01a007B' 99.8 Р-Протеобактерии

15 BUG-113 624 Caulobacter henricii 97.9 а-Протеобактсрии

16 BUG-114 615 Methylocaldum gracile 88.6 у-Протеобактерии

17 BUG-120 426 Acinetobacter sp. str. ATCC 17905 97.7 у-Протеобактерии

18ь BUG-124 368 Unidentified bacterium strain rJ7 90.8 Актиномицеты

19 BUG-126 488 Variovorax paradoxus Str. MBIC3839 100 Р-Протеобактерии

20 BUG-136 478 Methylobacterium sp. V3 97.7 а-Протеобактерии

21 BUG-153 571 Uncultured bacterium GKS2-103 98.6 Актиномицеты

22 BUG-156 590 Uncultured Verrucomicrobium DEV009 99.7 Уетгисот1сгоЫа

23 BUG-161 594 Acidoihermus cellulolyticus • 88.9 Актиномицеты

24 BUG-171 579- Novosphingobium hassiacum 96.2 о-Протеобактерии

25 BUG-175 540 Uncultured bacterium KF-Gitt2-34 100 Группа СРВ

26 BUG-177 624 Acinetobacter sp. str. 78 100 у-Протеобактерии

27 BUG-2I1 338 Uncultured eubacterium clone GKS16 99.4 Р-Протеобактерии

28 BUG-2I4 283 Uncultured bacterium FukuN36 97.5 Группа СРВ.

29. BUG-2I9 619 Uncultured eubacterium MC-2 89.7 Группа СРВ

30 BUG-221 617 Uncultured proteobacterium P30U-7 98.4 а-Протеобактерии

31 BUG-232 432 Methylobacterium sp. G296-I5 99.8 а-Протеобактерии

32 BUG-236 604 Uncultured proteobacterium UP3 93.0 а-Протеобактерии

33 LES-45 627 Uncultured proteobacterium 1006 ■ 90.9 е-Протеобактерии

34 LES-50 632 Pseudomonas mandeiii 100 у-Протеобактерии 1

35 LES-57 620 Cytophagales clone PRD01b007B 96.1 Группа СРВ

36 LES-129 631 Brevundimonas variabilis 99.4 а-Протеобактерии

37 LES-130 625 Sphingomonas sp. A3 100 а-Протеобактерии

38 LES-132 613 Zoogloea ramigera 99.7 Р-Протеобактерии

39 LES-138 638 Uncultured bacterium CL500-95 98.0 Актиномицеты

40 LES-153 610 Methylobacterium sp. Fl 5 100 а-Протеобактерии

41 LES-154 631 Pseudomonas sp. 99.8 у-Протеобактерии

42 LES-155 627 Variovorax sp. HAB-30 99.0 Р-Протеобактерии.

43 LES-165 625 Unidentified proteobacterium arc31 99.5 Р-Протеобактерии

44 LES-167 621 Tuber borchii sy mbiont b-1 BO 95.5 Группа СРВ

45 LES-171 603 Uncultured bacterium ARFS-2 92.7 Актиномицеты

46 LES-175 621 Uncultured proteobacterium clone 13 100 Р-Протеобактерии

47 LES-184 653 Acidovorax sp. UFZ-B530 99.5 р-Протеобакгерии

48 LES-I85 650 Cytophagales bacterium clone 26 94.6 Группа СРВ

0.1

_i Uncultured bacterium Wuba139 t BUG-90 r LES-184

"Aadcmraxsp UFZ-BS30

I, Uncultured proteobactenum done 13

"lLES-175

Uncultured bacterium PRD01a007a I T-BUG-107

_■ Uncultured bactenum done GKS16

I i- BUG-211 |r LES-155

T , Vanovorax paradoxus L BUG-126

_i Uncultured bactenum done GKS98

I— BUG-91 i Zoogloea ramigora "1- LES-132

_i Unidentified proteobactenum arc31 "i-LES-165

- Proteobactenum clone 1006

ß-Протеобактерии

- LES-45

_] Actnatobacter sp str 78

~1BUG-177

- Methykxaldum graato * BUG'114

rOü

I ■"

8UG-62 LES-154

Pseudomonas mandate LES-50

. Methylobactonum sp V3

BUG-13S LES-1S3 Methylobactenum sp G296-15 BUG-232

£-Протеобактерии

у-Протеобактерии

Caulobactar hennat BUG-113 Brevundimonas vanabtbs LES-129

_, Sphingomonas sp A3

-1 LES-130

_I Environmental sample isolate LD12

I BUG-89

_, Uncultured Cytophagales PRDQ1a001B '

I— BUG-103

_I Uncultured bactenum done KF-Gitt2-34

i BUG-17S

r— Uncultured bactenum done GKS2-106 ~f— BUG-S2

r Ftavobactenum xantum

P-BUG-102

P- Cytophaga sp PI

-1— BUG-82

11— LES-57

H_, Uncultured bactenum done FukuN36

—I-BUG-214

_I Uncultured bactenum done DEV009

' BUG-156

C- Uncultured bactenum done 01120-10 BUG-67

а-Прогеобактерии

■ Uncultured bacterium done ARFS-2

— LES-171

— Uncultured bactenum done rJ7 -BUG-124

_— Uncultured bacterium done 404-57

I IBUG-57

--—I _>- Uncultured bactenum done CL500-95

In- LES-138 [r- BUG-1S3

Uncultured bacterium done GKS2-103

СЯВ-группа

Verrucomicrobia

Актиномицеты

Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное согласно

последовательностям гена 168 рРНК бактерий прудов Бугач и Лесной

(выделены жирным шрифтом). В дерево включены наиболее близкородственные бактерии из базы данных ОепБапк/ЕМБЬ

Среди 48 выявленных клонов 41 был обнаружен в п. Бугач, 20 клонов - в п. Лесной, 13 клонов были обнаружены и в обоих водоемах. В п. Лесной было идентифицировано 7 клонов, характерных только для этого водоема и не характерных для п. Бугач, их доля составила 17.5% от общего количества клонов п. Лесной. В п. Бугач было определено 28 клонов, не встречающихся в п. Лесной, составивших 39.1% от общего числа клонов в п. Бугач. Количество каждого из таких уникальных клонов редко превышало 1-2, хотя клон BUG-89, и клоны BUG-90, BUG-113 были представлены тремя и четырьмя соответственно. Таким образом, удалось установить, что видовое разнообразие бактерий в пруду Бугач выше, чем в пруду Лесной.

В обоих водоемах доминировал клон LES-184, ближайшим родственником которого является -протеобактерия UFZ-B530

(табл. 1). Представители рода Acidovorax распространены во многих водных экосистемах, в том числе - подверженных антропогенному загрязнению (Schweitzer et al., 2001; Zwisler et al., 2003).

Следующим по встречаемости в обоих водоемах был клон LES-138, гомологичный некультивируемому актиномицету CL500-95, впервые обнаруженному в незагрязненном холодноводном олиготрофном горном озере Кратер-Лэйк, США (Urbach et al., 2001).

В пруду Лесной субдоминантом также являлся клон LES-50, близкородственный виду выделенному из французского

минерального источника. Значительную долю от общего числа клонов в обоих прудах составили клоны BUG-153, ближайшим родственником которого является некультивируемая бактерия GKS2-103, выделенная ранее из холодноводного высокогорного альпийского озера Госсенколлезее (Glöckner et al., 2000), и BUG-57 - клон, гомологичный некультивируемой бактерии 404-57, выделенной с четырехсотметровой глубины озера Байкал (Денисова и др., 1999).

Из клонов с менее чем 97% гомологии к известным последовательностям значительную долю среди бактерий, идентифицированных в обоих водоемах, составляли клоны BUG-52 и BUG-82. Клон BUG-52 гомологичен некультивируемой бактерии GKS2-106, выделенной из уже упоминавшегося озера Госсенколлезее и относящейся к группе CFB. Клон BUG-82 гомологичен бактерии Cytophaga sp. Р1, описанной в Интернет-базе данных как «адаптированная к холоду бактерия».

Таким образом, доминирующими по численности среди всех клонов, выделенных из прудов Бугач и Лесной, были одни и те же клоны. Это может свидетельствовать в пользу предположения о том, что в зимний период в отсутствие «цветения» цианопрокариот и пресса консументов видовой состав бактериопланктона в обоих водоемах практически одинаков.

Оказалось, что многие из бактерий, близкородственных клонам, обнаруженным в прудах Бугач и Лесной, относятся к организмам, обитающим в низкотемпературных условиях. Так, например, штамм Flavobacterium xantum выделен из антарктических озер (McCammon, Bowman, 2000), штаммы Methylobacterium sp. G296-15 и V3 - из толщи ледяного покрова антарктического озера Восток (Christner et ah, 2001), некультивируемая (3-протеобактерия агс31 - из арктического озера Тулик (Bahr et al., 1996). Клоны некультивируемых бактерий GKS16, GKS98, GKS2-103 и GKS2-106 выделены, из высокогорного альпийского озера Госсенколлезее, которое замерзает на 7 месяцев в году, а в остальное время температура воды в нем не превышает 15 °С (Pernthaler et al., 1998). Некультивируемая. бактерия Cytophaga sp. PI, упомянутая выше, в базе данных описана исследователями как "адаптированная к холоду бактерия". К холодолюбивым формам можно отнести некультивируемых бактерий CL120-10 и CL500-95, выделенных с глубин 120 и 500 м высокогорного озера Кратер-Лэйк (Urbach et al., 2001), а также байкальскую бактерию 404-57, выделенную с глубины 400 м (Денисова и др., 1999). Доля холодолюбивых клонов в зимнем бактериопланктоне изученных водоемов составила в дату наблюдения 39.1% в пруду Лесной и 43.1% в пруду Бугач. Вероятнее всего, это связано с сезоном пробоотбора, но в то же время свидетельствует о том, что указанные выше холодолюбивые бактерии распространены не только в уникальных экосистемах, в которых они были обнаружены, но также и в обычных водоемах средних широт.

Таким образом, определение видовой принадлежности бактерий по последовательностям гена 16S рРНК выявило принципиальное сходство видового состава зимнего бактериопланктона двух небольших эвтрофных водохранилищ и разнообразных пресноводных экосистем, в том числе таких уникальных как озеро Байкал, высокогорные холодноводные озера Европы и Северной Америки, озера Аляски и Антарктики. Это означает, что бактерии-обладают широчайшей адаптационной способностью, не свойственной эволюционно более молодым группам организмов.

Глава 5. Изучение сезонной динамики видового состава бактериопланктона прудов Бугач и Лесной методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза

Результаты исследования сезонной динамики видового состава бактериопланктона прудов Бугач и Лесной методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГТЭ) представлены в табл. 2. Всего было выявлено 53 различных ДГГЭ-фрагмента ДНК, соответствующих разным бактериальным видам, обозначенным в тексте как sp-1, sp-2 и т.д. Результаты кластерного анализа сезонных проб видового состава бактериопланктона прудов Бугач и Лесной, согласно ДГТЭ, представлены на рис. 3. Среди 17 проанализированных проб бактериопланктона прудов Бугач и Лесной, взятых в разные сезоны 1999-2001 гг., было выявлено 3 четких

кластера. В целом, качественный и количественный состав бактериопланктона п. Бугач и Лесной за исследованный период имел как сходные черты, так и различия. Ближе всех по видовому составу оказались зимние пробы 1999 г. прудов Бугач (В 12-99) и Лесной (Ь12-99), июльская проба п. Лесной ^07-00) и июньская проба п. Бугач (В06-00) 2000 г., а также июньская (В06-01) и сентябрьская (В09-01) пробы п. Бугач 2001 г. Сходство проб В06-00 и L07-00, отобранных в июне и июле 2000 г. в п. Бугач и Лесной, позволяет предположить, что стартовые условия - после прогревания водоемов (в связи с особенностями своего месторасположения пруд Лесной прогревается позже п. Бугач) и до начала массового развития цианопрокариот - для развития бактериопланктона в обоих водоемах являются одинаковыми. Сходство проб В06-01 и В09-01 (начало и конец летнего сезона), вероятно, также можно объяснить влиянием температурного фактора в отсутствие «цветения» цианопрокариот на развитие бактериопланктона пруда Бугач.

Отсутствие кластеризации в остальных пробах сезонной динамики позволяет предположить отсутствие прямого влияния «цветения» цианопрокариот на видовой состав бактериопланктона, в противном случае летние пробы Бугача и Лесного попадали бы в разные кластеры. Однако необходимо отметить, что число видов, зафиксированных в отдельные сезоны изученного периода в каждом из водоемов, изменялось (табл. 2). Отмечена тенденция к увеличению числа видов в п. Бугач в летние месяцы по сравнению с началом и концом вегетационного периода. Также отмечено, что в среднем в летние месяцы 2000 г. число видов в п. Бугач выше такового в п. Лесной. Это позволяет утверждать, что «цветение» цианопрокариот все же вызывает изменение видового состава бактериопланктона, не приводя при этом к смене доминирующих видов бактерий.

Среди доминирующих видов бактериопланктона, сезонная динамика которых в течение исследуемого периода 2000-2001 гг. отслеживалась методом ДГГЭ (табл. 2), можно выделить несколько групп. Первую группу составляют виды, которые обитают в обоих водоемах и составляют при этом значительную долю сообщества. К этой группе видов относятся sp-20, sp-32, sp-35. Сезонная динамика доли этих видов в сообществе бактериопланктона обоих водохранилищ приведена на рис. 4. Для вида sp-20 характерно совпадение динамики в обоих водохранилищах в начале лета 2000 г. С середины лета до конца сезона колебания его доли в общей численности бактериопланктона Бугача и Лесного носили противоположный характер. В 2001 г. сезонная динамика sp-20 в Бугаче имела иной характер, чем в 2000 г, а именно отсутствовало резкое снижение его доли в августе (рис. 4).

Таблица 2

Графическое представление результатов ДГГЭ амплифицироваиных фрагментов гена ^ рРНК образцов бактериопланктона из прудов Лесной и Бугач, сезонная динамика 2000-2001 гг. Для каждой пробы представлена относительная плотность отдельных полос ДНК в % от их суммарной плотности. Пробы п. Лесной обозначены буквой L, п. Бугач - В; цифры в названии обозначают год и месяц отбора пробы

Клон Ь99- 1,00- ЬОО- ЬОО- ьоо- ьоо- В99- воо- воо- воо- воо- ВОО- В01- В01- В01- В01- В01- ЭК ЭО ЭС

12 06 07 08 09 10 12 06 07 08 09 10 05 06 07 08 09

*р-1 1.6

$р-2 4 1.4

вр-3 1.2 1.5 1.6 0.5

вр-4 1.5 2

$р-5 1.9 19.1

Бр-6 1.2 1

0.8 1.5 2.2

Бр-8 1 1.2

вр-9 2.4 3.4

5р-10 1.8 2

вр-1 1 5.4 1 1.6 2.5 2

яр-12 1.6 1.8 3.5 2.9 1.9

5Р-13 5.3 5.9 6 2.5 3.7 3 2

Бр-14 1.9 3.9

вр-15 3 2.2

5р-16 7.9 3.3 3.6 22.2 41.4

ер-! 7 3.7 2.7 4 3 2.9 8.2

яр-18 9.1 7.2 113 7.6

яр-19 11.4 7.6 9.6 26.6 10.5 8.4 11.2 5.6 8.1 8.1 4 11.4 5.9 8 123 6.3 5.1

ер-го 9.1 4 8 5.1 8.2 5.5 8 6.1 4.8 5.6 4.9 4.1 5.1 3.1 5.6 3.7 3.5 5.4

эр-г! 4.6 6.7 2.9

5Р-22 18.2 7.7

вр-23 3.9 5.8 5.7 3.1 3.7 3.5 8

вр-24 5.1 3.7 5.2 5.5 5.9 5.6 6.5 8.1 3.5 7.7 3.2 3.1 11.9

«р-25 4.5 5.3

вр-26 6 5.9 13.6 4.8 4.2 6.1 3.1 5.4 5.7 4.7 6.1 2.9 3.6 5 3.8

Продолжение таблицы 2

Клон L99- LOO- L00- L00- L00- LOO- B99- B00- B00- B00- BOO- UOO- BOI- BOI- BOI- BON BOI- ЭК ЭО ЭС

12 06 07 08 09 10 12 06 07 08 09 10 05 06 07 08 09

sp-27 6 7.3 4.5 2 6.4 4.7 4.4 5.9 3 3.7 3.3 5.4 3.1 2.1

sp-28 4.1 9.6 5.1 4.8 3.4 3.5 2.3

sp-29 4 6 4.9 3.9 3 3.7 5.2

sp-30 10.7 5.3 5.6 3.9 9.8

sp-3l 7.5 6.8 6.5 4.4 8.8 6.6 46 7.5

sp-32 7.4 12.1 7.6 9.8 8.4 8.8 8.4 8.5 8 4.7 7.8 11.3 9.3 7.5 5.7 6.6 8.8 9.2

sp-33 7.5 ll.S - 11 10 6.8 1.5

sp-34 10.2 7.8 14.3 10 16 10.6 10.1 14.8 16.3 10.1 7.4 17.7 17.4 11.2 4.8

sp-35 17.5 19.4 13.1 17.1 22 14.9 12.5 14.9 16.8 12.2 20.7 22.8 21.7 18.2 10.6 13.6 20.1 21.6 8.3

sp-36 3.8 6.9 11 4.5 5.2 3.8 5.3 6 4 7 7.2 4 4.2 7.5 3.2

sp-37 3.6 4.6 14.1 4.1 4.6 6 4.6 7.8 5.2 3.5 4.4 5.5 5.5 2.4

sp-38 3.1 5.2 2.3 3.8 2 2.5 3.4 4 3.7 2.1 1.7

sp-39 6.2 3.7 4.4 3.3 3.6 1.8 1.7 2 4 2.2 2.1 1.9 1.6

sp-40 2.8 1 2.3 1.9

sp-41 2.6 1.7 1.6 3.1 1.5 1.8

sp-42 1.2 1.3 1.5 2.8 1.9 1.8 1.9 1.3 2.5

sp-43 1.6 1.2 2.6 4 2.8

sp-44 2 3.1 1 2.2

sp-45 2

sp-46 3.8 1 1.9 2.4 1.7 4.3 4.8 26 1.1 4.7

sp-47 2.7 2.4 1 1.3 0.9 2

sp-48 2.4

sp-49 1.6

sp-50 1 1.7 2.9

sp-51 1 2.5

sp-52 1.4

sp-53 1

Всего

клон 16 18 15 15 14 14 18 14 21 23 16 12 12 22 25 24 20 12 16 12

О»

Рис. 3. Дендрограмма кластерного анализа сезонной динамики видового состава бактериопланктона прудов Бугач и Лесной на основе ДГГЭ фрагментов гена ^ рРНК, 2000-2001 гг. Горизонтальная ось -евклидовы расстояния (уровни кластеризации). Обозначения проб соответствуют обозначениям в табл. 2

Динамика вида sp-32 в бактериопланктоне Лесного и Бугача носила противоположный характер в течение всего периода исследований в 2000 г. Однако, отличие от sp-20, сезонная динамика этого вида в Бугаче в 2000 и 2001 г. была практически одинаковой (рис. 5).

% 25 -20 -15 -10 -5 -О -

Зр-20

V*.

ар-24

% 25 -20 -15 -10 -5 -0 -

зр-26

зр-27

V; У-

% 25 -20 -15 -10 -5 -

зр-28

Гт-г

I I I

вр-30

аоооаооон^ннин оосроооосрооооо

Ш&ШШЬ&й

Рис. 4. Динамика относительной доли (в % от суммарной) отдельных видов бактерий, выявленных методом ДГГЭ, в прудах Бугач (темные кружки) и Лесной (полые квадраты) в 1999-2001 гг.

Рис. 5. Динамика относительной доли (в % от суммарной) отдельных видов бактерий, выявленных методом ДГТЭ, в прудах Бугач (темные кружки) и Лесной (полые квадраты) в 1999-2001 гг.

Динамика содержания вида sp-35, в Бугаче и Лесном, подобно предыдущим двум видам, находилась в противофазе. Динамика его в Бугаче летом 2000 и 2001 г., в целом была одинаковой, как и у sp-32.

Вторую группу составляют виды, которые встречались лишь в одном из водоемов. Sp-ЗЗ был обнаружен только в Лесном водохранилище. Этот вид присутствовал в большинстве проб, его доля достигала 12% (рис. 5).

Исключительно в Бугаче был обнаружен вид sp-18, он встречался лишь в три даты в весенне-осенний период, но при этом достигал высокого содержания 7-11% от общей численности (биомассы) бактериопланктона (рис. 4).

Сезонная динамика остальных видов, доля которых в бактериопланктоне обоих водохранилищ составляла в среднем не менее 5%, не имела каких-либо ярко выраженных закономерностей (рис. 4 и рис. 5). Можно лишь отметить, что максимальное содержание (26%) было зарегистрировано для вида sp-19 в октябре 2000 г. в Лесном водохранилище. Вид sp-ЗО был обнаружен только в 1999-2000 г., а в пробах из Бугача, взятых в 2001 г., он отсутствовал.

Остальные виды, определенные методом ДГГЭ, встречались в пробах единично, составляли лишь незначительную часть от микробного сообщества в целом, поэтому выделить какие-либо закономерные или характерные черты в их сезонной динамике в настоящее время не представляется возможным.

Для идентификации некоторых из вышеуказанных доминирующих видов бактерий была определена нуклеотидная последовательность фрагментов гена 16S рРНК, вырезанных из соответствующих участков ДГГЭ-геля (табл. 3). Последовательности были депонированы в Интернет-базе данных EMBL/GenBank/DDBJ под номерами: AJ583806, AJ583807, AJ583809, AJ5838011-AJ583815.

Таблица 3

Филогенетическая принадлежность некоторых видов бактериопланктона прудов Бугач и Лесной, выявленных методом ДГГЭ

№ Клон Длина' Ближайший родственник ^ Группа _п^н._г___сходства__

1 sp-5 578 Uncultured Haliscomenobacter sp. 95.3 CFB

2 sp-16 585 Pseudomonas putida KT2440 98.1 у-Протеобактерии

3 sp-18 585 Uncultured bacterium cloneSJA-109 96.6 ß-Протеобактерии

4 sp-19 586 Uncultured bacterium clone WY09bC 87.8 у-Протеобактерии

5 sp-22 582 Leptothrix sp. L18 96.9 ß-Протеобактерии

6 sp-24 343 Uncultured bacterium clone Spb54 97.7 ß-Протеобактерии

7 sp-25 418 Uncultured Variovorax sp. KL-93-1-6 97.1 ß-Протеобактерии

8 sp-26 567 Uncultured clone TLM06/TLMdgge30 97.4 Актиномицеты

9 sp-27 567 Uncultured bacterium isolate WL5-10 97.4 Актиномицеты

10 sp-34 562 Uncultured bacterium clone s41 98.2 не определено

11 sp-35 567 Uncultured bacterium CL500-95 97.0 Актиномицеты

12 sp-37 568 Actinobacterium isolate MWH-Dar4_97.5 Актиномицеты

Установлено, что бактерии, близкородственные выявленным клонам, за исключением актиномицета MWH-Dar4 с неуточненным систематическим положением и штамма Pseudomonas putida, являются некультивируемыми микроорганизмами (табл. 3). Виды sp-18 и sp-19 имели менее 97% сходства с наиболее близкородственными организмами, при этом гомология sp-19 с

клоном WYO9bC составляла менее 88%. По принятым в настоящее время представлениям (Cohan, 2002), клон sp-19 с уверенностью можно отнести к новому виду или даже роду. Вид sp-34 имел высокую степень гомологии с некультивируемой бактерией s41, таксономическое положение которой в базе данных не определено. Однако расположение соответствующей полосы ДНК на ДГГЭ-геле позволяет отнести этот вид к группе бактерий с высоким содержанием ГЦ-пар. Остальные клоны отнесены к филогенетическим группам Р-протеобактерий и актиномицетов. Из ранее обнаруженных клонов в данном анализе выявлен только близкий родственник некультивируемого актиномицета CL500-95 - вид sp-35.

Для выявления сходства и различия в сезонной динамике содержания видов бактериопланктона в п. Бугач и Лесной, была рассчитана корреляционная матрица. Высокое и статистически достоверное положительное значение коэффициента корреляции получено лишь для двух видов, - sp-32 и sp-35: г = 0.64 ± 0.20 при числе пар п = 17.

Таким образом, впервые изучена динамика видового состава бактериопланктона прудов Бугач и Лесной методом ДГГЭ. Кластерный анализ выявил три пары близких по составу проб: пробы Бугача и Лесного (декабрь/декабрь 1999 и июнь/июль 2000 г.), пробы Бугача (июнь/сентябрь 2001 г.). Выявлены доминирующие виды бактерий, присутствовавшие в обоих водоемах в течение всего периода наблюдений: sp-20, sp-32, sp-35. Анализ динамики видового состава бактериопланктона обоих водоемов позволяет предположить, что «цветение» цианопрокариот в летний период может влиять на изменение числа видов бактериопланктона, не приводя при этом к смене доминирующих видов бактерий. Определено филогенетическое положение вида sp-35 и некоторых других видов, характерных для бактериальных сообществ изученных водоемов.

Глава 6. Идентификация видового состава водных бактерий, потребляющих полигидроксиалканоаты

Для выявления бактерий, способных в естественных условиях утилизировать полигидроксиалканоаты, проведен полевой эксперимент (5 сентября - 17 октября 2000 г.). Масса пленок, определенная до и после эксперимента составила, соответственно, 1.7080 и 1.5847 г. Таким образом, за 42 суток масса пленок уменьшилась на 0.1233 г. или 7.2%. Эта величина сопоставима со скоростью распада сополимера на этом же водоеме в летний период 2000 г. (Волова и др., 2003).

Результаты денситометрического анализа ДГГЭ экспериментальных проб отражены в табл. 2. Как видно из рис 6, контрольная проба ЭК имеет значительное сходство с образцом бактериопланктона, отобранным из пруда Бугач в тот же день (В00-10). Различия между этими пробами, возможно, связаны с тем, что бактерии из пробы ЭК были в течение длительного периода изолированы от притока органического субстрата. Вероятно, виды sp-19, sp-24,

sp-35, присутствующие в обеих пробах в одинаковых количествах, являются наиболее неприхотливыми к условиям обитания.

Анализ проб бактериопланктона из эксперимента (ЭО и ЭС) выявил их существенные отличия друг от друга, а также от проб ЭК и В00-10. В первую очередь, отмечено появление на ДГГЭ полос ДНК, не характерных ни для одной из проб сезонной динамики бактериопланктона п. Бугач. Это были клоны ¡р-5, sp-9, sp-22, sp-25 и sp-45 (табл. 2 и рис. 6). Остальные клоны были зафиксированы как в пробах сезонной динамики бактериопланктона пруда Бугач, так и в экспериментальных пробах. Вид ¡р-16 не был выявлен в Бугаче в 2000 г., однако зафиксирован в пробах мая-июля 2001 г. (табл. 2). Вид ¡р-18 присутствовал в пробах В00-10 и ЭО, но отсутствовал в пробах ЭК и ЭС. Вид ¡р-19 присутствовал во всех пробах в различных количествах.

Рис. 6. ДГТЭ амплифицированных фрагментов гена 168 рРНК образцов бактериопланктона из пруда Бугач (В00-10) и эксперимента по распаду пленок гетерополимера ПОБ-со-ПОВ, октябрь 2000 г. ЭК - контроль, ЭО - опыт, ЭС -смыв с пленок

Вид ¡р-24 присутствовал в пробах В00-10 и ЭК, и отсутствовал в пробах ЭО и ЭС. Виды ¡р-34 и ¡р-35 присутствовали в пробах В00-10, ЭК и ЭО, причем доля вида ¡р-34 в пробах ЭК и ЭО резко снизилась по сравнению с пробой В00-10, и полностью отсутствовали в пробе ЭС. Результаты позволяют с уверенностью сделать вывод о том, что виды бактерий ¡р-5, ¡р-9, ¡р-22, ¡р-25

ВОО-М ЭК ЭО ; ЭС

■: ' . -

$р-18 ер-19

Бр-24

вр-34 ¿р-35

■

и sp-45, зафиксированные только в экспериментальных пробах ЭО и ЭС, утилизируют сополимер ПОБ-со-ПОВ в качестве субстрата. К этой же группе можно отнести и вид sp-16, который отсутствовал в пробах при анализе сезонной динамики бактериопланктона п. Бугач в 2000 г. и в пробе ЭК.

Для идентификации клонов sp-5, sp-16, sp-22 и sp-25 определена нуклеотидная последовательность фрагментов гена 16S рРНК, вырезанных из соответствующих участков ДГГЭ-геля. Последовательности были депонированы в Интернет-базе данных EMBL/GenBank/DDBJ под номерами: AJ583816, AJ583805, AJ583808, AJ583810. Результаты филогенетического анализа всех видов, обнаруженных в экспериментальных пробах и в октябрьской пробе пруда Бугач 2000 г., представлены в табл. 3.

Анализ полученных данных дал следующие результаты. Из четырех видов, рост которых был связан с добавкой ПОБ-со-ПОВ, только два - sp-16 и sp-25 - имели более 97% гомологии с близкородственными бактериями. Представители близких им по последовательности 16S рРНК бактерий родов

способны утилизировать ПОБ и сополимеры ПОБ-со-ПОВ (Suyama et al., 1998; Ruiz et al., 2001; Khan et al., 2002). Большинство бактерий рода Leptothrix (ближайшего родственника клона sp-22) могут накапливать, а, следовательно, и утилизировать, ПОБ (данные Определителя бактерий Берджи). Участие бактерий группы Cytophaga-Flavobacterium-(вид sp-5) в деградации полиоксиалканоатов отмечается довольно редко (Khan et al., 2002).

Можно отметить значительное увеличение относительной доли видов sp-5, sp-16 и sp-25 - в два и более раза - в пробе ЭС (бактерии, смытые с поверхности пленок) по сравнению с пробой ЭО (рис. 6 и табл. 2). Такой характер динамики позволяет предположить, что указанные виды ведут преимущественно прикрепленный образ жизни, осуществляя первичную деградацию полимера прямо на поверхности пленок с помощью внеклеточных деполимераз. В то же время обратный характер динамики видов sp-18 и sp-22 свидетельствует в пользу предположения о том, что эти виды являются скорее свободноживущими, планктонными бактериями, которые, вероятно, не имеют внеклеточных деполимераз и используют продукты первичной деградации сополимера - тетра-, три-, ди- и мономеры ß-гидроксимасляной и ß-гидроксивалериановой кислот (Волова и др., 2003).

Таким образом, результаты исследования показали, что применение молекулярно-генетических методов позволяет в нестерильных условиях экспериментальных микроэкосистем выделять в бактериальном сообществе группы бактерий, специализирующихся на определенных субстратах. Такой подход потенциально может быть использован для определения кинетических характеристик отдельных видов некультивируемых бактерий.

Выводы

1.По нуклеотидным последовательностям гена 16S рРНК впервые определен видовой состав зимнего бактериопланктона двух эвтрофных водохранилищ Бугач и Лесной. Обнаружено 48 уникальных клонов, среди которых 18 имели сходство с различными штаммами культивируемых бактерий, 15 - с некультивируемыми бактериями, выявленными только по последовательностям 16S рРНК. Отмечено 15 новых, ранее неизвестных последовательностей.

2. Выявлено сходство видового состава зимнего бактериопланктона изученных эвтрофных водохранилищ и разнообразных пресноводных экосистем, в том числе таких уникальных как озеро Байкал, озера Европы, Америки, Арктики и Антарктиды. Полученные данные свидетельствуют о глобальном распространении многих видов водных бактерий, что не имеет аналогов среди других эволюционно более молодых типов организмов.

3. Молекулярно-генетическими методами изучена динамика видового состава бактериальных сообществ водохранилищ Бугач и Лесной в течение вегетационного периода 2000-2001 гг. и выявлены одни и те же доминирующие виды свободноживущих некультивируемых бактерий. Это позволяет предположить отсутствие существенного влияния «цветения» цианопрокариот на видовой состав доминантов свободноживущего бактериопланктона. Влияние «цветения» потенциально проявляется в увеличении числа видов бактериопланктона.

4. На примере экспериментального изучения деградации ПОБ-со-ПОВ показана принципиальная возможность выявления и определения субстратной специфичности отдельных видов бактерий без выделения в чистую культуру, в нестерильных условиях экспериментальных микроэкосистем. Определены виды (клоны) бактерий, осуществляющие деградацию гетерополимера ПОБ-со-ПОВ в условиях пресноводного водоема.

Публикации по теме диссертации

1. Трусова М.Ю., Гладышев М.И. Видовой состав зимнего бактериопланктона двух сибирских прудов, определенный по последовательностям 16S рРНК // Доклады АН.-2002.-Т.382, №4.-С.570-573.

2. Trusova M.Yu., Gladyshev M.I. Phylogenetic diversity of winter bacterioplankton of eutrophic Siberian reservoirs as revealed by 16S rRNA gene sequences // Microb. Ecol. - 2002. - 44. - №3. - P. 252-259.

3. Мучкина Е.Я., Трусова М Ю., Гладышев М.И., Колмаков В И., Дубовская О.П., Сущик Н.Н. Бактериопланктон пригородного рекреационного пруда и его связь с гидробиологическими, гидрохимическими и санитарно-эпидемиологическими показателями // Сиб. экол. журн. - 2003. - Т. 3. - С. 257-266.

Подписано в печать 20.04.04. Формат бумаги 60x84 1/16 Усл. печ. л. 2,1 Тираж 100 экз. Заказ 96

Отпечатано на ризографе КГТУ 660074, Красноярск, Киренского 26

(I- ß7 3 4

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Трусова, Мария Юрьевна

Введение.

Глава 1. Проблемы и методы определения видового состава бактериопланктона: обзор литературы.

1.1. Основные подходы к изучению водной микрофлоры.

1.2. Развитие методов идентификации бактерий.

1.3. Использование рРНК для создания молекулярной филогенетической систематики прокариот.

1.4. Основные методы анализа последовательностей рРНК для изучения некультивируемых водных бактерий.

1.4.1. Определение нуклеотидной последовательности рРНК.

1.4.2. Гибридизация рРНК с олигонуклеотидными зондами.

1.4.3. Различные варианты ПЦР для качественного и количественного анализа бактериальных сообществ.

1.4.4. Методы мониторинга динамики структуры бактериального сообщества.

1.4.5. Ограничения методов, использующих рРНК-подход.

1.5. Применение методов молекулярно-генетического анализа для изучения бактериальных сообществ водных экосистем.

Глава 2. Объекты и методы исследований.

2.1. Характеристика района исследований.

2.2. Материал и методика.

2.2.1. Методика гидробиологических исследований пруда Бугач.

2.2.2. Методика отбора и обработки проб воды для анализа видового состава бактериопланктона.

2.2.3. Выделение геномной ДНК бактерий.

2.2.4. Амплификация и клонирование генов 16S рРНК бактерий.

2.2.5. Определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов гена 16S рРНК.

2.2.6. Анализ сезонной динамики видового состава бактериопланктона методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза.

2.2.7. Схема постановки и проведения эксперимента по изучению субстратов некультивируемого бактериопланктона пруда

Бугач.

2.2.8. Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК.

2.2.9. Статистическая обработка результатов.

Глава 3. Бактериопланктон пруда Бугач и его связь с гидробиологическими и гидрохимическими показателями экосистемы.

Глава 4. Определение видового состава зимнего бактериопланктона двух эвтрофных прудов по последовательностям гена 16S рРНК.

Резюме.

Глава 5. Изучение сезонной динамики видового состава бактериопланктона прудов Бугач и Лесной методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза.

Обсуждение.

Резюме.

Глава 6. Идентификация видового состава водных бактерий, потребляющих полигидроксиалканоаты.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация видового состава и изучение сезонной динамики бактериопланктона малых эвтрофных водохранилищ методами молекулярной генетики"

В.И. Вернадский (1978) писал в 20-е годы, что человек как масштаб явлений бесконечно мал по сравнению с живой природой и легко постигает свойства ее элементов - организмов, но лишь путем трудной и долгой абстракции может подняться до понимания свойств их совокупности — живого вещества. Таким образом, осознание необходимости системного подхода в экологии произошло уже давно, фактически с момента зарождения ее как самостоятельной науки. Но если теоретико-философские представления о целостности экологических систем, их интегральном функционировании достаточно развиты, то решение конкретных задач описания динамики частных экосистем, установление количественных закономерностей и законов их функционирования сталкивается с трудностями, имеющими принципиальный методологический характер.

Необходимым компонентом любых экологических исследований является измерение интегральных функций экосистем, их изучение в воспроизводимых экспериментах и формализация в прогностических и оптимизационных математических моделях. Для достижения подобных целей необходима специальная аппаратура, работающая с объектами, масштабы которых существенно больше масштабов индивидуального человеческого восприятия, и методы практической абстракции: физическое и математическое моделирование. Именно это и является областью биофизики экосистем как научной дисциплины, развивающейся на стыке экологии и биофизики. Задачи и предмет экологической биофизики состоят в следующем (Гительзон и др., 1993): 1) изучение физических процессов, являющихся отражением интегральных свойств экосистем, и создание соответствующих методов мониторинга; 2) осуществление практической абстракции — физическое и математическое моделирование; 3) изучение роли живых организмов в физических процессах экосистемного масштаба.

В экологической биофизике функциональная (биогеохимическая) роль видов в экосистеме формализуется в виде численных значений кинетических ростовых характеристик: ji(S) и Ks. Они количественно выражают интегральную скорость биохимических реакций, которая заложена в генотипе организмов. Эти биохимические константы с учетом температурных и других поправок могут быть включены в модели любого водоема, где обитают данные виды (Гладышев, 1999). Важно отметить, что кинетические характеристики не могут быть достоверно определены на основании изучения одних лишь временных рядов (Дегерменджи, Гладышев, 1995). Они определяются в независимых от сезонной и годовой динамики численности лабораторных экспериментах на чистых культурах организмов (например, Болсуновский и др., 1990; Гладышев и др., 1994; Гладышев и др., 1996; Губанов и др., 1996). Однако, если для фито- и зоопланктона полученные значения констант - это действительно видовые характеристики, бактериопланктон практически во всех моделях природных водоемов представлен агрегированной компонентой (Адамович, Межевикина, 1986; Адамович, 1992). В то же время, хорошо известно, что природные сообщества водных бактерий представляют собой чрезвычайно гетерогенную систему отдельных видов, выполняющих различные геохимические функции и по-разному взаимодействующих с другими звеньями экосистемы (Горленко и др., 1977; Романенко, 1985). Исследователи неоднократно указывали на необходимость дезагрегации бактериального звена с целью повышения адекватности описания трофического взаимодействия бактерий с компонентами экосистем (Адамович, 1992; Гладышев и др., 1997). Понятно, что в идеальном случае определение кинетических характеристик необходимо проводить для отдельных видов водных бактерий, однако классические методы водной микробиологии не обеспечивали такой возможности. Основным методом определения видовой принадлежности бактерий в течение длительного периода было выращивание на твердых селективных средах. Однако, как известно (Горленко и др., 1977; Cole, 1982; Amann et al.,

1995), на твердых средах вырастает не более 1-3% планктонных бактерий, определяемых прямым счетом. Поэтому до недавнего времени видовой состав бактериопланктона оставался практически неизвестным. Появление методов молекулярно-генетической идентификации бактерий позволяет надеяться, что методические трудности описания бактериального звена водных экосистем будут преодолены и описание микробного звена водных экосистем будет отвечать требованиям эколого-биофизического подхода.

Целью диссертационной работы явилось качественное и количественное изучение бактериопланктона двух пресноводных водоемов методами мо-лекулярно-генетического анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК. Были поставлены следующие задачи:

1. Определить видовой состав бактериопланктона эвтрофных водохранилищ Бугач и Лесной.

2. Изучить сезонную динамику видового состава бактериопланктона этих водоемов.

3. Определить виды водных бактерий, использующих в качестве субстрата биоразрушаемые полимеры гидроксиалканоатов.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Трусова, Мария Юрьевна

выводы

1.По нуклеотидным последовательностям гена 16S рРНК впервые определен видовой состав зимнего бактериопланктона двух эвтрофных водохранилищ Бугач и Лесной. Обнаружено 48 уникальных клонов, среди которых 18 имели сходство с различными штаммами культивируемых бактерий, 15 - с не-культивируемыми бактериями, выявленными только по последовательностям 16S рРНК. Отмечено 15 новых, ранее неизвестных последовательностей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, результаты, полученные в данной работе, подтвердили, что применение современных молекулярно-генетических методов анализа видового состава бактерий может оказаться весьма важным для мониторинга динамики бактериальных сообществ водных экосистем и изучении их роли в процессах экосистемного масштаба. Определение видовой принадлежности бактерий по последовательностям гена 16S рРНК выявило принципиальное сходство видового состава зимнего бактериопланктона двух небольших эвтрофных водохранилищ и разнообразных пресноводных экосистем, в том числе таких уникальных как озеро Байкал, высокогорные холодноводные озера Европы и Северной Америки, озера Аляски и Антарктики. Это может означать, что бактерии обладают широчайшей адаптационной способностью, не свойственной эволюционно более молодым организмам.

Двумя различными методами, базирующимися на сравнении нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК показано, что бактериопланктон исследованных водоемов в отдельные периоды имел сходный видовой состав. Идентифицированы доминирующие виды бактерий, присутствовавшие в обоих водоемах в течение всего периода наблюдений.

Отмечена тенденция к увеличению числа видов в п. Бугач в летние месяцы по сравнению с началом и концом вегетационного периода. Также отмечено, что в среднем в летние месяцы 2000 г. число видов в п. Бугач выше такового в п. Лесной. Это позволяет предположить, что «цветение» цианопрокариот вызывает изменение видового состава бактериопланктона, но не приводит к смене доминирующих видов бактерий.

Сопоставление сезонной динамики отдельных видов бактериопланктона прудов Бугач и Лесной позволило получить результаты, которые послужат отправной точкой для последующих экспериментов на водоемах или в МЭС. Отмечено, что для выявления взаимосвязи временной динамики видового состава бактериопланктона с остальными компонентами экосистемы необходимо ее более детальное изучение, в частности, увеличение частоты пробоотбора.

Показана принципиальная возможность определения субстратной специфичности отдельных видов бактерий в естественных условиях (нестерильных МЭС), без выделения их в чистую культуру. В водохранилище Бугач экспериментально выявлены бактерии, способные утилизировать сополимер Р-гидроксибутирата и Р-гидроксивалерата.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Трусова, Мария Юрьевна, Красноярск

1. Адамович В.В. Экспериментальное определение параметров функционирования микрофлоры Красноярского водохранилища // Водные ресурсы. -1992.-№2.-С. 106-114.

2. Беликов С.И., Грачев М.А., Земская Т.И., Манакова Е.Н., Парфёнова В.В. Определение таксономического положения бактерий из озера Байкал методом анализа последовательностей фрагментов 16S рРНК // Микробиология. 1996. - Т. 65, № 6. - С. 855-864.

3. Болсуновский А.Я. Экспериментальное моделирование экосистемы эв-трофного водоема / А.Я. Болсуновский, Н.И. Звегинцева, Е.Б. Хромечек и др. Красноярск, 1990. - 54 с. - (Препринт / СО АН СССР, Ин-т физики им. Л.В. Киренского; № 139 Б).

4. Вернадский В.И. Живое вещество / В.И. Вернадский. М.: Наука, 1978. — 358 с.

5. Волова Т.Г. Полиоксиалканоаты (ПОА) биоразрушаемые полимеры для медицины / Т.Г. Волова, В.И. Севастьянов, Е.И. Шишацкая. - Новосибирск, Издательство СО РАН, 2003. - 330 с.

6. Гительзон И.И., Гладышев М.И., Дегерменджи А.Г., Левин Л.А., Сидько Ф.Я. Экологическая биофизика и ее роль в изучении водных экосистем // Биофизика. 1993. - Т. 38, № 6. - С. 1069-1078.

7. Гладышев М.И., Темерова Т.А., Щур Л.А., Дегерменджи А.Г., Толомеев А.П. Истинный и мнимый микроводорослевый спектр питания Simocepha-lus sp. в проточных и закрытых культиваторах // Докл. РАН. 1994. - Т. 336, №6.-С. 843-846.

8. Гладышев М.И., Грибовская И.В., Калачева Г.С., Сущик Н.Н. Экспериментальное изучение скорости самоочищения как интегральной функциональной характеристики водных экосистем различных типов // Сиб. экол. журн. 1996. - Т. 3, № 5. - С. 419-431.

9. Гладышев М.И., Сущик Н.Н., Калачева Г.С., Щур Л.А. Специфические свободные жирные кислоты поверхностной пленки воды как возможныеиндикаторы смертности бактериопланктона // Докл. РАН. 1997. - Т. 352, №3.-С. 427-430.

10. Гладышев М.И. Основы экологической биофизики водных систем / М.И. Гладышев. Новосибирск: Наука, 1999. - 113 с.

11. Головлёв ЕЛ. О старых проблемах новой систематики бактерий // Микробиология. 1998. - Т. 67, № 2. - С. 281-286.

12. Гольд В.М., Попельницкий В.И. Определение фотосинтеза водорослей флуоресцентным методом // Методические вопросы изучения первичной продукции планктона внутренних водоемов. СПб.: Гидрометеоиздат, 1993.- С. 25-29.

13. Горбенко Ю.И. О наиболее благоприятном количестве сухого питательного агара для культивирования морских микроорганизмов // Микробиология.-1961.-Вып. 1.-С. 168-172.

14. Горленко В.М. Экология водных микроорганизмов / В.М. Горленко, Г.А. Дубинина, С.И. Кузнецов. М.: Наука, 1977. - 288 с.

15. ГОСТ 24849-81. Полевые методы санитарно-микробиологического анализа. Вода питьевая. М. Госстандарт. - 1989.

16. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология Электронный ресурс. 3-е издание. М., Изд-во МГУ. [1992-2001]. — Режим доступа: http://l.cellimm.bio.msu.ru/edocs/micro/index.html. - Загл. с экрана.

17. Дегерменджи А.Г., Гладышев М.И. Природные воды, математические модели // Веста. РАН. 1995. - Т. 65, № 9. - С. 807-810.

18. Денисова Л.Я., Белькова Н.О., Тулохонов И.И., Зайчиков Е.Ф. Биоразнообразие бактерий на различных глубинах южной котловины озера Байкал,выявленное по последовательностям 16S рРНК // Микробиология. 1999. -Т. 68, № 4. - С. 547-556.

19. Джефферс Дж. Введение в системный анализ: применение в экологии: Пер. с англ. / Дж. Джефферс. М.: Мир., 1981. - 252 с.

20. Дубовская О.П., Гладышев М.И., Есимбекова Е.Н., Морозова И.И., Гольд З.Г., Махутова О.Н. Изучение связи сезонной динамики естественной смертности зоопланктона в водоеме с изменением токсичности воды // Биол. внутр. вод. 2002. - № 3. - С. 39-43.

21. Колмаков В.И., Анищенко О.В., Иванова Е.А., Кравчук Е.С. Закономерности сезонной динамики вертикального распределения фитопланктона малого лесного пруда (окрестности г. Красноярска, Россия) // Альгология. -2002. Т. 12, № 2. - С. 207-221.

22. Копылов А.И., Косолапое Д.Б. Характеристика различных биотопов Рыбинского водохранилища по общей численности и количеству бактерий, содержащих нуклеоиды // Микробиология. 1998 - Т. 67, № 6. - С. 859864.

23. Кравчук Е.С., Иванова Е.А., Гладышев М.И. Сезонная динамика численности акинет Anabaena flos-aquae (Lyngb.) Breb. в поверхностном слое донных отложений и в толще воды // Доклады АН. 2002. - Т. 384, № 2. -С. 281-282.

24. Методические рекомендации по сбору и обработке материалов при гидробиологических исследованиях на пресноводных водоемах. Зоопланктон и его продукция.- Л.: 1984.- 32 с.

25. Методические рекомендации по сбору и обработке материалов при гидробиологических исследованиях на пресноводных водоемах. Фитопланктон и его продукция.- Л.: 1984.- 34 с.

26. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т.: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Хо-улта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. М.: Мир, 1997. — 800 е., ил.

27. Плохинский Н.А. Алгоритмы биометрии / Н.А. Плохинский. М.: МГУ, 1980.-150 с.

28. Поглазова М.Н., Мицкевич И.Н. Применение флуорескамина для определения количества микроорганизмов в морской воде эпифлуоресцентным методом // Микробиология. 1984. -Т. 53, № 5. - С. 850-857.

29. Ратнер В.А. Молекулярная эволюция //Соросовский образовательный журнал. 1998. - № 3. - С. 41-47.

30. Романенко В.И. Микробиологические процессы продукции и деструкции органического вещества во внутренних водоемах / В.И. Романенко. Л.: Наука, 1985.-295 с.

31. Смирнова О., Солдатов А. Приготовление Т-вектора Электронный ресурс. / О. Смирнова, А. Солдатов. [24 сентября 2002]. - Режим доступа: http://molbiol.ru/protocol/1205.html. - Загл. с экрана.

32. Смирнова О., Солдатов А. Выделение ДНК из агарозного геля с помощью glass milk Электронный ресурс. / О. Смирнова, А. Солдатов. [16 января 2003]. - Режим доступа: http://molbiol.ru/protocol/0802.html. - Загл. с экрана.

33. Сущик Н.Н., Гладышев М.И., Калачева Г.С., Дубовская О.П., Кравчук Е.С., Иванова Е.А., Трусова М.Ю. Сезонная динамика зоопланктона и содержания незаменимых жирных кислот в сестоне небольшого пруда // Биол. внутр. вод. 2002. - № 2. - С. 60-68.

34. Турова Т.П., Кузнецов Б.Б., Новикова Е.В., Полтараус А.Б. Назина Т.Н. Гетерогенность нуклеотидных последовательностей генов 16S рибосом-ной РНК типового штамма Desulfotomaculum kuznetsovii И Микробиология. 2001. - Т. 70, № 6. - С. 788-795.

35. Унифицированные методы анализа вод.- М.: Химия, 1971.- 316 с.

36. Acinas S.G., Anton J., Rodriguez-Valera F. Diversity of free-living and attached bacteria in offshore western Mediterranian waters as depicted by analysis of genes encoding 16S rRNA // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - 65. - № 2.-P. 514-522.

37. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. 1997. - 25. - P. 3389-3402.

38. Amann R., Ludwig W., Schleifer K.H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiol. Rev. -1995. 59. - № l. - p. 143-169.

39. Amann R., Glockner F.-O., Neef A. Modern methods in subsurface microbiology: in situ identification of microorganisms with nucleic acid probes // FEMS Microbiol. Rev. 1997. - 20. - P. 191-200.

40. Amann R. Methodological aspects of fluorescence in situ hybridization // Bio-sci. Microflora. 2000a. -19. - № 2. - P. 85-91.

41. Amann R. Who is out there? Microbial aspects of biodiversity // System. Appl. Microbiol. 2000b. - 23. - P. 1-8.

42. Andreatta S., Wallinger M.M., Posch Т., Psenner R. Detection of subgroups from flow cytometry measurements of heterotrophic bacterioplankton by image analysis // Cytometry. 2001. - 44. - P. 218-225.

43. Bahr M., Hobbie J.E., Sogin M.L. Bacterial diversity in an arctic lake: a freshwater SARI 1 cluster // Aquat. Microb. Ecol. 1996. - 11. - P. 271 -277.

44. Baker J.A., Neilan B.A., Entsch В., McKay D.B. Identification of Cyanobacte-ria and their toxigenicity in ebvuronmental samples by rapid molesular analysis // Environ. Toxicology. 2001. - 16. - P. 472-782.

45. Bansal A.K., Meyer Т.Е. Evolutionary analysis by whole-genome comparisons // J. Bacterid. 2002. - 184. - № 8. - P. 2260-2272.

46. Bernard L., Schafer H., Joux F., Courties C., Muyzer G., Lebaron P. Genetic diversity of total, active and culturable marine bacteria in coastal seawater // Aquat. Microb. Ecol. 2000b. - 23. - P. 1-11.

47. Bourne D.G., Riddles P., Jones G.J., Smith W., Blakeley R.L. Characterisation of a gene cluster involved in bacterial degradation of the cyanobacterial toxin microcystin LR // Environ. Toxicol. 2001. - 16. - P. 523-534.

48. Brosius J., Dull T.J., Sleeter D.D., Noller H.F. Gene organization and primary structure of a ribosomal RNA operone from Escherichia coli II J. Mol. Biol. — 1981.-148.-P. 107-127.

49. Bruns A., Cypionka H., Overmann J. Cyclic AMP and acyl homoserine lactones increase the cultivation efficiency of heterotrophic bacteria from the Central Baltic Sea // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - 68. - P. 3978-3987.

50. Casamayor E.O., Calder6n-Paz J.I., Mas J., Pedr6s-Alio C. Identification of phototrophic sulfur bacteria through the analysis of ImwRNA band patterns // Arch. Microbiol. 1998. - 170. - P. 269-278.

51. Cases I., de Lorenzo V. The grammar of (micro)biological diversity // Environ. Microbiol. 2002. - 4. - № 11. - P. 623-627.

52. Christner B.C., Mosley-Thompson E., Thompson L.G., Reeve J.N. Isolation of bacteria and 16S rDNAs from Lake Vostok accretion ice // Environ. Microbiol. 2001. - 3. - № 9. - P. 570-577.

53. Cilia V., Lafay В., Christen R. Sequence heterogeneities among 16S ribosomal RNA sequences and their effect on phylogenetic analyses at the species level // Mol. Biol. Evol. 1996. - 13. - № 3. - P. 451-461.

54. Cole J.J. Interactions between bacteria and algae in aquatic ecosystems // Ann. Rev. Ecol. Syst. 1982. - 13. - P. 291-314.

55. Cohan F.M. What are bacterial species? // Annu. Rev. Microbiol. 2002. - 56. -P. 457-487.

56. Connon S.A., Giovannoni S.J. High-throughput methods for culturing microorganisms in very-low-nutrient media yield diverse new marine isolates // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - 68. - P. 3878-3885.

57. Conte C., Mutti I., Puglisi P., Ferrarini A., Regina G., Maestri E., Marmiroli N. DNA fingerprinting analysis by a PCR based method for monitoring the geno-toxic effects of heavy metals pollution // Chemosphere. 1998. - 37. - P. 27392749.

58. Crump B.C., Armbrust E.V., Baross JA. Phylogenetic analysis of particle-attached and free-living bacterial communities in the Columbia river, its estuary, and the adjacent coastal ocean // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - 65. -№7.-P. 3192-3204.

59. Degans H., Z6llner E., Van der Gucht K., De Meester L., Jurgens K. Rapid Dap/ima-mediated changes in microbial community structure: an experimental study // FEMS Microbiol. Ecol. 2002. - 42. - P. 137-149.

60. Dojka M.A., Harris J.K., Pace N.R. Expanding the known diversity and environmental distribution of an uncultivated phylogenetic division of Bacteria // Appl. Environ. Micrbiol. 2000. - 66. - № 4. - P. 1617-1621.

61. Dominik K., Hofle M.G. Changes in bacterioplankton community structure and activity with depth in a eutrophic lake as revealed by 5S rRNA analysis // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - 68. - P. 3606-3613.

62. Don R.H., Сох P.T., Wainwright B.J., Baker K., Mattick J.S. "Touchdown" PCR to circumvent spurious priming during gene amplification // Nucleic Acids Res. 1991. - 19. - № 14. - P. 4008.

63. Ercolini D., Moschetti G., Blaiotta G., Coppola S. Behavior of variable V3 region from 16S rDNA of lactic acid bacteria in denaturing gradient gel electrophoresis // Cur. Microbiol. 2001. - 42. - P. 199-202.

64. Farrelly V., Rainey F.A., Stackebrandt E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species 11 Appl. Environ. Microbiol. 1995. - 61. - № 7. - P. 2798-2801.

65. Felip M., Pace M.L., Cole J.J. Regulation of planktonic bacterial growth rates: the effects of temperature and resources // Microb. Ecol. 1996. - 31. - P. 1528.

66. Field K.G., Gordon D., Wright Т., Rappe M., Urbach E., Vergin K., Giovan-noni S.J. Diversity and depth-specific distribution of SARI 1 cluster rRNA genes from marine planktonic bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 1997. -63.-№ 1.- P. 63-70.

67. Fogel G.B., Collins C.R., Li J., Brunk C.F. Prokaryotic genome size and SSU rDNA copy number: estimation of microbial relative abundance from a mixed population // Microb. Ecol. 1999.-38. - P. 93-113.

68. Fricker C.R. From media to molecules: new approaches to the detection of microorganisms in water // Water, Air and Soil Pollution. 2000. - 123. - P. 3541.

69. Fuhrman J.A., Comeau D.E., Hagstrom A., Chan A.M. Extraction from natural planktonic organisms of DNA suitable for molecular biological studies // Appl. Environ. Microbiol. 1988. - 54. - № 6. - P. 1426-1429.

70. Garcia-Pichel F., Prufert-Bebout L., Muyzer G. Phenotypic and phylogenetic analyses show Microcoleus chthonoplastes to be a cosmopolitan cyanobacte-rium // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - 62. - № 9. - P. 3284-32911

71. Gille C., Gille A., Booms P., Robinson P.N., Nurnberg P. Bipolar clamping improves the sensitivity of mutation detection by temperature gradient gel electrophoresis // Electrophoresis. 1998. - 19. - P. 1347-1350.

72. Giovannoni S.J., Britschgi T.B., Moyer C.L., Field K.G. Genetic diversity in Sargasso Sea bacterioplankton // Nature (London). 1990. - 345. - P. 60-63.

73. Giovannoni S.J., Rapp£ M.S., Vergin K.L., Adair N.L. 16S rRNA genes reveal stratified open ocean bacterioplankton populations related to the green non-sulfur bacteria // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - 93. - P. 7979-7984.

74. Giovannoni S.J., Rappe M.S. Evolution, diversity, and molecular ecology of marine prokaryotes // In D.L. Kirchman, ed., Microbial ecology of the oceans. -Wiley-Liss, Inc. 2000. - P. 47-84.

75. Gladyshev M.I., Gribovskaya I.V., Adamovich V.V. Disappearance of phenol in water samples taken from the Yenisei river and the Krasnoyarsk reservoir // Wat. Res. 1993. - 27. - № 6. - P. 1063-1070.

76. Glockner F.-O., Fuchs B.M., Amann R. Bacterioplankton compositions of lakes and oceans: a first comparison based on fluorescence in situ hybridization // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - 65. - № 8. - P. 3721-3726.

77. Gonzalez J.M., Saiz-Jimenez C. A fluorimetric method for the estimation of G+C mol% content in microorganisms by thermal denaturation temperature // Environ. Microbiol. 2002. - 4. - № 11. - P. 770-773.

78. Gordon D.A., Giovannoni S.J. Detection of stratified microbial populations related to Chlorobium and Fibrobacter species in the Atlantic and Pacific oceans // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - 62. - № 4. - P. 1171-1177.

79. Gray M.W., Sankoff D., Cedergren R.J. On the evolutionary descent of organisms and organelles: a global phylogeny based on a highly conserved structural core in small subunit ribosomal RNA // Nucleic Acids Res. 1984. - 12. - № 14.-P. 5837-5852.

80. Gray N.D., Head I.M. Linking genetic identity and function in communities of uncultured bacteria // Environ. Microbiol. 2001. - 3. - № 8. - P. 481-492.

81. Gutell RR., Larsen N., Woese C.R. Lessons from an evolving rRNA: 16S and 23 S rRNA structures from a comparative perspective // Microbiol. Rev. 1994. - 58. - № 1.-P. 10-26.

82. Hahn M.W., Hofle M.G. Grazing of protozoa and its effect on populations of aquatic bacteria// FEMS Microbiol. Ecol. 2001. - 35. - P. 113-121.

83. Hastings R.C., Saunders J.R., Hall G.H., Pickup RW., McCarthy A.J. Application of molecular biological techniques to a seasonal study of ammonia oxidation in a eutrophic freshwater lake // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - 64. -№10.-P. 3674-3682.

84. Head I.M., Saunders J.R, Pickup RW. Microbial evolution, diversity, and ecology: a decade of ribosomal RNA analysis of uncultivated microorganisms // Microb. Ecol. 1998. - 35. - P. 1-21.

85. Heidelberg J.F., Heidelberg K.B., Colwell R.R Seasonality of Chesapeake Bay bacterioplankton species // Appl. Environ. Microbiol. — 2002a. 68. - № 11.-P. 5488-5497.

86. Heidelberg J.F., Heidelberg K.B., Colwell R.R. Bacteria of the y-subclass Pro-teobacteria associated with zooplankton in Chesapeake Bay // Appl. Environ. Microbiol. 2002b. - 68. - № 11. - P. 5498-5507.

87. Higgins D., Thompson J., Gibson T. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice // Nucleic Acids Res. 1994. -22. P. 4673-4680.

88. Hiorns W.D., Methe B.A., Nierzwicki-Bauer S.A., Zehr J.P. Bacterial diversity in Adirondack mountain lakes as revealed by 16S rRNA gene sequences // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - 63. - № 7. - P. 2957-2960.

89. Hiraishi A., Furuhata K., Matsumoto A., Koike K.A., Fukuyama M., Tabuchi K. Fenotypic and genetic diversity of chlorine-resistant Methylobacteriumstrains isolated from various environments // Appl. Environ. Microbiol. 1995. -61.- №6. -P. 2099-2107.

90. Hofle M.G. Bacterioplankton community structure and dynamics after large-scale release of nonindigenous bacteria as revealed by low-molecular-weight-RNA analysis // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - 58. - № 10. - P. 33873394.

91. H6fle M.G. Taxonomic diversity and metabolic activity of microbial communities in the water column of the central Baltic Sea // Limnol. Oceanogr. 1995. -40.-№5.-P. 868-874.

92. Hofle M.G., Haas H., Dominik K. Seasonal dynamics of bacterioplankton community structure in a eutrophic lake as determined by 5S rRNA analysis // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - 65. - № 7. - P. 3164-3174.

93. Jackson C.R., Roden E.E., Churchill P.F. Denaturing gradient gel electrophoresis can fail to separate 16S rDNA fragments with multiple base differences // Mol. Biol. Today. 2000. - 1. - № 2. - P. 49-51.

94. Jukes Т.Н., Cantor C.R. Evolution of protein molecules / In: Munro H.H. (ed.), Mammalian protein metabolism. Academic Press, New York, 1969. P. 21132.

95. Jurgens K., Pernthaler J., Schalla S., Amann R. Morphological and compositional changes in a planktonic bacterial community in response to enhancedprotozoan grazing // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - 65. - № 3. - p. 12411250.

96. King C.H., Sanders R.W., Shotts E.B. Jr., Porter K.G. Differential survival of bacteria ingested by zooplankton from a stratified eutrophic lake // Limnol. Oceanogr. 1991. -36. - № 5. - P. 829-845.

97. Kirchman D.L., Yu L., Fuchs B.M., Amann R. Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR // Aquat. Microb. Ecol. 2001. -26.-P. 13-22.

98. Klappenbach J.A., Dunbar J.M., Schmidt T.M. rRNA operon copy number reflects ecological strategies of bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - 66. - № 4. - P.1328-1333.

99. Manefield M., Whiteley A.S., Griffiths R.I., Bailey M.J. RNA Stable isotope probing, a novel means of linking microbial community function to phylogeny // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - 68. - P. 5367-5373.

100. Massana R:, Murray A.E., Preston C.M., DeLong E.F. Vertical distribution and phylogenetic characterization of marine planktonic Archaea in the Santa Barbara Channel // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - 63. - № 1. - P. 50-56.

101. Massana R., Taylor L.T., Murray A.E., Wu K.Y., Jeffrey W.H., DeLong E.F. Vertical distribution and temporal variation of marine planktonic Archaea in the Gerlache Strait, Antarctica, during early spring // Limnol. Oceanogr. 1998. -43.-№4.-P. 607-617.

102. McMahon K.D., Stahl D.A., Raskin L. A comparison of the use of in vitro-transcribed and native rRNA for the quantification of microorganisms in the environment // Microb. Ecol. 1998. - 36. - p. 362-371.

103. Miskin I.P., Farrimond P., Head I.M. Identification of novel bacterial lineages as active members of microbial populations in a freshwater sediment using a rapid RNA extraction procedure and RT-PCR // Microbiology. 1999. - 145. -P. 1977-1987.

104. Moeseneder M.M., Winter C., Herndl G.J. Horizontal and vertical complexity of attached and free-living bacteria of the eastern Mediterranean Sea, determined by 16S rDNA and 16S rRNA fingerprints // Limnol. Oceanogr. 2001. -46.-3 1.-P. 95-107.

105. Molin S., Givskov M. Application of molecular tools for in situ monitoring of bacterial growth activity // Environ. Microbiol. 1999. - 1. - № 5. - P. 383391.

106. Monciardini P., Sosio M., Cavaletti L., Chiocchini C., Donadio S. New PCR primers for the selective amplification of 16S rDNA from different groups of actinomycetes // FEMS Microbiol. Ecol. 2002. - 42. - P. 419-429.

107. Mullins T.D., Britschgi T.B., Krest R.L., Giovannoni S.J. Genetic comparison reveal the same unknown bacterial lineages in Atlantic and Pacific bacterioplankton communities // Limnol. Oceanogr. 1995. - 40. - № 1. - P. 148-158.

108. Murray A.E., Blakis A., Massana R., Strawzewski S., Passow U., Alldredge A., DeLong E.F. A time series assessment of planktonic archaeal variability in the Santa Barabara Channel // Aquat. Microb. Ecol. 1999. - 20. - P. 129-145.

109. Murrell J.C., McDonald I.R., Bourne D.G. Molecular methods for the study of methanotroph ecology // FEMS Microbiol. Ecol. 1998. - 27. - P. 103-114.

110. Muttray A.F., Mohn W.W. Quantitation of the population size and metabolic activity of a resin acid degrading bacterium in activated sludge using slot-blot hybridization to measure the rRNA:rDNA ratio // Microb. Ecol. 2000. - 38. — P. 348-357.

111. Muyzer G., Smalla K. Application od\f DGGE and TGGE in microbial ecology // Antonie van Leeuwenhoek. 1998. - 73. - P. 127-141.

112. Niederhauser C., Hofelein C., Wegmuller В., Candrian U. Reliability of PCR decontamination systems // PCR Methods Appl. 1994. - 4. - P. 117-123.

113. Nystrom Т. Not quite dead enough: on bacterial life, culturability, senescence, and death // Arch. Microbiol. 2001. - 176. - P. 159-164.

114. Oliver J.D., Nilsson L., Kjelleberg S. Formation of nonculturable Vibrio vulnificus cells and its relationship to the starvation state // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - 57. - P. 2640-2644.

115. Osborn A.M., Moore E.R.B., Timmis K.N. An evaluation of terminal-restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) analysis for the study of microbial community structure and dynamics // Environ. Microbiol. 2000. -2. -№ 1.-P. 39-50.

116. Overmann J., Coolen M.J.L., Tuschak C. Specific detection of different phylogenetic groups of chemocline bacteria based on PCR and denaturing gradient gel electrophoresis of 16S rRNA gene fragments // Arch. Microbiol. 1999. -172.-P. 83-94.

117. Park H.-D., Sasaki Y., Marayama Т., Yanagisawa E., Hiraishi A., Kato K. Degradation of the cyanobacterial hepatotoxin mycrocystin by a new bacterium isolated from a hypertrophic lake // Environ. Toxicol. -2001. 16. - P. 337-343.

118. Pearce D.A., Van der Gast C.J., Lawley В., Ellis-Evans J.C. Bacterioplankton community diversity in a maritime Antarctic lake, determined by culture-dependent and culture-independent techniques // FEMS Microbiol. Ecol. -2003.-45.-P. 59-70.

119. Pernthaler J., Glockner F.-O., Unterholzner S., Alfreider A., Psenner R., Amann R. Seasonal community and population dynamics of pelagic bacteria and ar-chaea in a high mountain lake // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - 64. - № 11.-P. 4299-4306.

120. Phillips C.J., Paul E.A., Prosser J.I. Quantitative analysis of ammonia-oxidizing bacteria using competitive PCR // FEMS Microbiol. Ecol. 2000. - 32. - P. 167-175.

121. Pinhassi J., Hagstrom A. Seasonal succession in marine bacterioplankton // Aquat. Microb. Ecol.-2000.-21.-P. 245-256.

122. Qiu X., Wu L., Huang H., McDonel P.E., Palumbo A.V., Tiedje J.M., Zhou J. Evaluation of PCR-generated chimeras, mutations, and heteroduplexes with 16S rRNA gene-based cloning // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - 67. - № 2. -P. 880-887.

123. Rappd M.S., Kemp P.F., Giovannoni S.J. Phylogenetic diversity of marine coastal picoplankton 16S rRNA genes cloned from the continental shelf of Cape Hatteras, north Carolina // Limnol. Oceanogr. 1997. - 42. - № 5. - P. 811-826.

124. Rapp£ M.S., Vergin K.L., Giovannoni S.J. Phylogenetic comparisons of a coastal bacterioplankton community with its counterparts in open ocean and freshwater systems // FEMS Microbiol. Ecol. 2000. - 33. - P. 219-232.

125. Rashidan K.K., Bird D.F. Role of predatory bacteria in the termination of a cyanobacterial bloom // Microb. Ecol. 2001. - 41. - P. 97-105.

126. Ravenschlag K., Sahm K., Knoblauch C., J0rgensen B.B., Amann R. Community structure, cellular rRNA content, and activity of sulfate-reducing bacteria in marine arctic sediments // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - 66. - № 8. -P. 3592-3602.

127. Reysenbach A.-L., Giver L., Wickham G.S., Pace N.R. Differential amplification of rRNA genes by polymerase chain reaction // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - 58. - № 10. - P. 3417-3418.

128. Rheims H., Stackebrandt E. Application of nested polymerase chain reaction for the detection of as yet uncultured organisms of the class Actinobacteria in environmental samples // Environ. Microbiol. 1999. - 1. - № 2. - P. 137-143.

129. Riemann L., Winding A. Community dynamics of free-living and particle-associated bacterial assemblages during a freshwater phytoplankton bloom // Microb. Ecol. 2001. - 42. - P. 274-285.

130. Ritchie N.J., Schutter M.E., Dick RP., Myrold D.D. Use of length heterogeneity PCR and fatty acid methyl ester profiles to characterize microbial communities in soil // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - 66. - № 4. - P. 1668-1675.

131. Rosell6-Mora R., Amann R. The species concept for prokaryotes // FEMS Microbiol. Rev. 2001. - 25. - P. 39-67.

132. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Schrf S.J., Higuchi R, Horn G.T., Mullis K.B., Ehrlich H.A. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science. 1988. - 239. - P. 487-491.

133. Sait M., Hugenholtz P., Janssen P.H. Cultivation of globally distributed soil bacteria from phylogenetic lineages previously only detected in cultivation-independent surveys//Environ. Microbiol.-2002. -4. -№ ll.-P. 654-666.

134. Sambrook J. Molecular Cloning. A laboratory manual / J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. - V. 2.

135. Schauer M., Massana R., Pedros-Ali6 C. Spatial differences in bacterioplankton composition along the Catalan coast (NW Mediterranean) assessed by molecular fingerprinting // FEMS Microbiol. Ecol. 2000. - 33. - P. 51-59.

136. Schmidt T.M., DeLong E.F., Pace N.R. Analysis of a marine picoplankton community by 16S rRNA gene cloning and sequencing // J. Bacterid. 1991. — 173.-P. 4371-4378.

137. Schweitzer В., Huber I., Amann R., Ludwig W., Simon M. a- and p-Proteobacteria control the consumption and release of amino acids on lake snow aggregates // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - 67. - № 2. - P. 632-645.

138. Selje N., Simon M. Composition and dynamics of particle-associated and free-living bacterial communities in the Weser estuary, Germany // Aquat. Microb. Ecol. 2003. - 30. - P. 221-237.

139. Sheu D.-S., Wang Y.-T., Lee C.-Y. Rapid detection of polyhydroxyalkanoate-accumulating bacteria isolated from the environment by colony PCR // Microbiology. 2000. - 146. - P. 2019-2025.

140. Sicheritz-Ponten Т., Andersson S.G.E. A phylogenomic approach to microbial evolution // Nucleic Acids Res. 2001. - 29. - № 2. - P. 545-552.

141. Siefert J.L., Fox G.E. Phylogenetic mapping of bacterial morphology // Microbiology. 1998. - 144. - P. 2803-2808.

142. Simek K., Hornak K., MaSm M., Christaki U., Nedoma J., Weinbauer M.G., Dolan J.R. Comparing the effects of resource enrichment and grazing on a bacterioplankton community of a meso-eutrophic reservoir // Aquat. Microb. Ecol. -2003. -31. -P. 123-135.

143. Spanggaard В., Huber I., Nielsen J., Nielsen Т., Appel K.F., Gram L. The microflora of rainbow trout intestine: a comparison of traditional and molecular identification // Aquaculture. 2000. - 182. - P. 1-15.

144. Stahl D.A., Lane D.J., Olsen G.J., Pace N.R. Characterization of a Yellowstone hot spring microbial community by 5S rRNA sequences // Appl. Environ. Microbiol. 1985.-49.-P. 1379-1384:

145. Staley J.T., Gosink J .J. Poles apart: biodiversity and biogeography of sea ice bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 1999. - 53. - P. 189-215.

146. Stanier R.Y., Adelberg E.A., Ingraham J.L. General microbiology / The McMillan Press, 1981. P. 502-526.

147. Stein J.L., Marsh T.L., Wu K.Y., Shizuya H., DeLong E.F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genomefragment from a planktonic marine archaeon // J. Bacterid. 1996. - 178. - № 3.-P. 591-599.

148. Stein L.Y., Jones G., Alexander В., Elmund K., Wright-Jones C., Nealson K.H. Intriguing microbial diversity associated with metal-rich particles from a freshwater reservoir // FEMS Microbiol. Ecol. 2002. - 42. - p. 431-440.

149. Suyama Т., Tokiwa Y., Ouichanpagdee P., Kanagawa Т., Kamagata Y. Phylogenetic affiliation of soil bacteria that degrade aliphatic polyesters available commercially as biodegradable plastics // Appl. Environ. Microbiol. 1998. -64. -№ 12.-P. 5008-5011.

150. Suzuki M.T., Giovannoni S.J. Bias caused by template annealing in the amplification of mixtures of 16S rRNA genes by PCR // Appl. Environ. Microbiol. -1996. 62. - № 2. - P. 625-630.

151. Takai K., Horikoshi K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - 55. - № 11. - P. 5066-5072.

152. Thamdrup В., Rossell6-Mora R., Amann R. Microbial manganese and sulfate reduction in Black Sea shelf sediments // Appl. Environ. Microbiol. 2000. 66. -№ 7.-P. 2888-2897.

153. Thompson J.R., Marcelino L.A., Polz M.F. Heteroduplexes in mixed-template amplifications: formation, consequence and elimination by "reconditioning PCR" // Nucleic Acids Res. 2002. - 30. - № 9. - P. 2083-2088.

154. Toze S. PCR and the detection of microbial pathogens in water and wastewater // Wat. Res. 1999. - 33. - № 17. - P. 3545-3556.

155. Tsai Y.-L., Olson B.H. Rapid method for separation of bacterial DNA from humic substances in sediments for polymerase chain reaction // Appl. Environ. Microbiol. -1992. 58. - № 7. - P. 2292-2295.

156. Ueda К., Seki Т., Kudo Т., Yoshida Т., Kataoka M. Two distinct mechanisms cause heterogeneity of 16S rRNA // J. Bacteriol. 1999. - 181. - № 1. - P. 7882.

157. Urbach E., Vergin K.L., Young L., Morse A. Unusial bacterioplankton community structure in ultra-oligotrophic Crater Lake // Limnol. Oceanogr. 2001. -46. -№3.-P. 557-572.

158. Vandamme P., Pot В., Gillis M., De Vos P., Kersters K., Swings J. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics // Microbiol. Rev. -1996. 60. - № 2. - P. 407-438.

159. Van de Peer Y., Chapelle S., de Wachter R. A quantitative map of nucleotide substitution rates in bacterial rRNA // Nucleic Acids Res. 1996. - 24. - 24. -№ 17. -P. 3381-3391.

160. Ward D.M., Weller R., Bateson M.M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms in a natural community // Nature (London). 1990. -345.-P. 63-65.

161. Weller R., Glockner F.-O., Amann R. 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes for in situ detection of members of the phylum Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides II System. Appl. Microbiol. 2000. - 23. - P. 107-114.

162. Wikstrom P., Andersson A.-C., Forsman M. Biomonitoring complex microbial communities using random amplified polymorphic DNA and principal component analysis // FEMS Microbiol. Ecol. 1999. - 28. - P. 131-139.

163. Wilson I.G. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification // Appl. Environ. Microbiol. 1997.-63. - № 10. - P. 3741-3751.

164. Woese C.R., Fox G.E. Phylogenetical structure of the procaryotic domain: the primary kingdoms // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - 74. - № 11. - P. 5088-5090.

165. Woese C.R. Bacterial evolution // Microbiol. Rev. 1987. - 51. - № 2. - P. 221-271.

166. Worm J., Gustavson K., Garde K., Borch N.H., Sondergaard M. Functional similarity of attached and free-living bacteria during freshwater phytoplankton blooms // Aquat. Microb. Ecol. 2001. - 25. - P. 103-111.

167. Yokomaku D., Yamaguchi N., Nasu M. Improved direct viable count procedure for quantitative estimation of bacterial viability in freshwater environments // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - 66. - № 12. - P. 5544-5548.

168. Zengler K., Toledo G., Rappe M.S., Elkins J., Mathur E.J., Short J.M., Keller M. Cultivating the uncultured // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - 99. - № 24.-P. 15681-15686.

169. Zwart G., Crump B.C., Kamst-van Agterveld M.P., Hagen F., Han S.-K. Typical freshwater bacteria: an analysis of available 16S rRNA gene sequences from plankton of lakes and rivers // Aquat. Microb. Ecol. 2002. - 28. - P. 141-155.

170. Zwisler W., Selje N., Simon M. Seasonal patterns of the bacterioplankton community composition in a large mesotrophic lake // Aquat. Microb. Ecol. -2003.-31.-P. 211-225.

Информация о работе

Трусова, Мария Юрьевна
кандидата биологических наук
Красноярск, 2004
ВАК 03.00.02

Диссертация

Идентификация видового состава и изучение сезонной динамики бактериопланктона малых эвтрофных водохранилищ методами молекулярной генетики - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы